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JP2002262716A - 株化細胞を用いて家畜個体を作出する方法 - Google Patents

株化細胞を用いて家畜個体を作出する方法

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JP2002262716A
JP2002262716A JP2001063088A JP2001063088A JP2002262716A JP 2002262716 A JP2002262716 A JP 2002262716A JP 2001063088 A JP2001063088 A JP 2001063088A JP 2001063088 A JP2001063088 A JP 2001063088A JP 2002262716 A JP2002262716 A JP 2002262716A
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JP
Japan
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cells
cell line
cloned
cell
livestock
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Application number
JP2001063088A
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English (en)
Inventor
Hisashi Aso
久 麻生
Norikazu Miyashita
範和 宮下
Takahito Takenouchi
敬人 竹之内
Kyohei Kozutsumi
恭平 小堤
Yasuo Shiotani
康生 塩谷
Tadayoshi Mihashi
忠由 三橋
Norio Saito
則夫 斉藤
Shuji Kobayashi
修司 小林
Kanako Kanayama
佳奈子 金山
Toshiyuki Kojima
敏之 小島
Shigeru Katamine
茂 片峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Agriculture and Food Research Organization
National Livestock Breeding Center
Original Assignee
National Agriculture and Food Research Organization
National Livestock Breeding Center
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Publication date
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2517/04—Cells produced using nuclear transfer

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 クローン家畜を効率的に作出するための技術
開発をすること。 【解決手段】 均一な培養細胞株を核移植用ドナー細胞
として用いることを特徴とするクローン家畜の作出方
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、株化細胞により家
畜個体を作出する方法に関し、詳しくは均一な培養細胞
株を核移植用ドナー細胞として用いてクローン家畜を作
出する方法に関する。より詳しくは、均一な培養細胞株
として、樹立した牛筋肉内脂肪前駆細胞株（以下、ＢＩ
Ｐ細胞と略記することがある。）を核移植用ドナー細胞
として用いてクローン牛を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、クローン家畜の作出は、不均一な
体細胞をドナー細胞として核移植することにより行われ
てきた。すなわち、耳あるいは卵丘などから、その由来
が不明な細胞を無作為に選抜し、これを核移植に用いて
いた。しかし、このような方法では、同様な実験条件を
反復継続しても、常に効率よくクローン家畜を作出する
ことは極めて困難であった。また、体細胞の核を卵細胞
に移植しても、受精卵と同様な卵割が起こる機構につい
て正確に解析することはできなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来は、クローン家畜
の作出には、新鮮な生細胞が必要であると認識されてお
り、そのため、上記したように、特定の家畜の体細胞を
核移植することが一般に行われていた。しかし、常に効
率よくクローン家畜を作出するためには、クローン家畜
作出への応用が可能な同一種の細胞を培養し、株化する
ことが必要である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は、上
記課題を解決するため、家畜、特に牛における筋肉内脂
肪細胞の培養技術並びに細胞株樹立方法について鋭意研
究を重ねた後、核移植用ドナー細胞として利用可能な牛
筋肉内脂肪前駆細胞株（ＢＩＰ細胞株）を樹立すること
に成功し、この細胞株の核移植用ドナー細胞としての適
正について検討した結果、ＢＩＰ細胞株がクローン牛の
作出に有用であることを見出し、本発明に到達した。
【０００５】請求項１記載の本発明は、均一な培養細胞
株を核移植用ドナー細胞として用いることを特徴とする
クローン家畜の作出方法である。請求項２記載の本発明
は、均一な培養細胞株が、牛筋肉内脂肪前駆細胞株であ
るクローン牛の作出方法である。請求項３記載の本発明
は、牛筋肉内脂肪前駆細胞株として、凍結保存株を利用
する請求項２記載の方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の方法に用いることができ
る均一な培養細胞株としては、ＢＩＰ細胞株を挙げるこ
とができる。また、本発明の方法を適用できる家畜とし
ては、例えば牛、羊、山羊、豚などを挙げることができ
るが、これらの中では、特に牛が好ましい。ＢＩＰ細胞
株の樹立は、以下の方法により行った。まず、牛の胸最
長筋内脂肪交雑部より脂肪細胞及び脂肪前駆細胞を分離
し、初代培養を試みた。培養は、屠殺した牛の胸最長筋
より脂肪交雑部を採取し、これから脂肪組織を分離し、
細胞の増殖を確認したところ、脂肪前駆細胞のみに増殖
が認められた。そこで、脂肪組織を酵素処理して脂肪前
駆細胞を集めた。次いで、この脂肪前駆細胞を定法によ
り継代培養して、クローニングを行うことによって、増
殖能力を有する単一なＢＩＰ細胞株を得た。このＢＩＰ
細胞について検討したところ、これは血管周囲に存在す
るペリサイトと呼ばれる特殊な細胞であることが明らか
となった。ペリサイトは、これまでに株化されたことの
ない細胞である。
【０００７】以下において、本発明の１態様として、こ
のＢＩＰ細胞を核移植用ドナー細胞として用いるクロー
ン家畜の作出方法について説明する。クローン家畜の作
出にあたっては、従来の体細胞をドナー細胞として用い
て行う方法と基本的には同様に行えば良い。すなわち、
採取した卵巣から卵丘卵子複合体（ＣＯＣｓ）を取り出
し、これを体外成熟させ、ＣＯＣｓから卵丘細胞を分
離、除去して得た卵子より核を除去し、その卵子にＢＩ
Ｐ細胞を注入した後に電気パルスにより融合させ、核移
植卵とする。次いで、核移植された卵子を培養し、胚盤
胞を発生させ、この中から良好な胚を選抜して種牛に胚
移植を行う。このようにして仮親に移植した後、妊娠鑑
定を行い、胎子の状態を観察しながら、クローン牛の誕
生を待つ。
【０００８】ＢＩＰ細胞は、クローニングした均一な細
胞株であるから、性質が安定しており、どの世代の細胞
でも核移植に用いることができる。すなわち、本発明者
の実験によると、６０代以上の継代培養が可能であり、
６０代までの細胞には染色体異常は認められず、しかも
核移植による胚盤胞形成率が変わらない。また、このＢ
ＩＰ細胞は、既知の手法にしたがって凍結保存すること
ができることから、凍結保存した細胞株を必要なときに
融解して用いることができる。しかも、所望により、目
的とする遺伝子の導入や欠失を容易に行うことができる
ため、例えば狂牛病に感染しない牛を作出することが可
能である。
【０００９】
【実施例】本発明を実施例によって詳しく説明するが、
本発明はこれらによって限定されるものではない。 試験例１ ＢＩＰ細胞株の樹立 牛の胸最長筋内脂肪交雑部より脂肪細胞及び脂肪前駆細
胞を分離し、初代培養を試みた。すなわち、屠殺した黒
毛和種牛の胸最長筋より脂肪交雑部を採取し、これから
脂肪組織を分離し、酵素処理を行った後、遠心分離して
脂肪細胞と脂肪前駆細胞を分離した。このようにして得
た細胞を、コラーゲン処理プラスチックシャーレに入れ
た１０％牛胎児血清加Ｄ−ＭＥＭ培地にて培養し、５日
又は７日後に回収した細胞数を計測し、培養開始時に対
する増殖率を算出したところ、脂肪前駆細胞のみに増殖
が認められた。
【００１０】次いで、上記培養培地にインスリン（５０
ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタソン（０．２５μＭ）、酢酸
（１０ｍＭ）、ビオチン（３３μＭ）、パントテン酸塩
（１７μＭ）、アスコルビン酸塩（１００μＭ）及びオ
クタン酸塩を添加した分化誘導培地による培養を行い、
細胞内に蓄積された脂肪滴とトリグリセリドを定量する
ことにより、脂肪細胞への変化の度合い（分化能）を測
定した。
【００１１】増殖が認められた脂肪前駆細胞を用いて、
限界希釈法により単一な細胞株を得て、その増殖能と分
化能の検査からＢＩＰ細胞を樹立した。このＢＩＰ細胞
を０．１μｇ／ｍｌコルセミドを含む培養培地で３７℃
にて２時間培養した。次いで、培養物を遠沈管に移し、
細胞を生理食塩水で洗浄し、洗浄液も遠沈管へ移した。
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥がし、遠沈
管内の培地で懸濁し、遠沈管へ戻した。遠心分離後、上
清を捨て、遠沈管内の細胞を浮かせたのち、０．０７５
Ｍ 塩化カリウムを加え、軽くピペッテベングして３７
℃で２０分間保温した。次に、これに、そのまま固定液
（メタノール：氷酢酸＝３：１）を加え、ゆっくり、か
つ静かに混和した。遠心分離後、上清を捨て、再び固定
液を添加した。この操作を２回繰り返し、上清を捨てた
後、固定液に懸濁して細胞を浮遊させた。この懸濁液
を、−３０℃に保持した容器に入れておいたスライドグ
ラスに１滴たらし、風乾した。風乾したスライドグラス
を数日間室温に放置した後、４℃のトリプシン溶液に浸
し、３０秒〜２分間処理した。続いて、スライドグラス
をエタノールに浸し、トリプシンの反応を停止させた
後、蒸留水で洗い、ギムザ溶液で１０分間染色してか
ら、水洗、風乾後、封入した。このようにして作成され
たスライドグラスを顕微鏡下で観察し、染色体の本数を
数えた。その結果、６０代まで継代培養したＢＩＰ細胞
では、６０本の牛染色体において異常がないことが確認
された。
【００１２】実施例１ １）レシピエント卵の調製 食肉処理場において卵巣を採取し、２５℃の生理食塩水
に浸して研究室に搬送した。この卵巣から卵丘卵子複合
体（ＣＯＣｓ）を取り出し、体外成熟させるために、５
％牛血清を含むＴＣＭ１９９培地中で２０時間培養し
た。成熟したＣＯＣｓを、０．５％ヒアルロニダーゼを
含むＭ２培地で５分間処理した後、卵丘細胞を緩やかな
ピペッティングで分離除去した。次いで、２０％牛血
清、５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含む生理食塩水中
で、卵子（denuded metaphase II oocyte)の透明帯を極
体付近でカットし、ガラスニードルを用いて核を含む細
胞質を細胞外に押し出すことによって除核した。蛍光試
薬（ヘキスト社製、３３３４２）により除核の確認を行
った。
【００１３】２）核移植 マイクロインジェクション用ガラスピペットを用いて、
除核された成熟卵子の卵黄と透明帯との空間の、卵黄側
に試験例１で得たＢＩＰ細胞株１個をドナー細胞として
注入した。ドナー細胞を注入した前記卵子は、Zimmerma
n 細胞融合培地に移し、ニードルタイプの電極を用いて
２５ボルトで、１０マイクロ秒間電気刺激を２回加えて
ドナー細胞と卵子を融合した。融合後、核移植された卵
子を５μＭのカルシウムイオノフォアで５分間処理し
た。続いて、核移植された卵子を、５％牛血清、１０μ
ｇ／ｍｌシクロヘキシイミドを含むＴＣＭ１９９培地中
で６時間培養した後、５％牛血清を含むＣＲｌａａ培地
で８日間培養した。核移植における融合率は８６／１６
１（５３．４％）であり、そのうちの初期発生率は８５
／８６（９８．８％）であった。最終的に、胚盤胞発生
率は５３／８６（６１．６％）で、これらのＢＩＰ細胞
由来核移植胚のランク付けを行い、良好なものを選択
し、ホルスタイン種牛１６頭に移植した。
【００１４】３）仮親に移植後の経過 超音波診断装置を用いた妊娠鑑定を行ったところ、１６
頭中５頭の受胎を確認した。この時点では、胎子の状態
も良好であり、心拍の確認も行えた。最終的には、５頭
中１頭が正常な雄牛（黒毛和種牛、生時体重３７ｋｇ）
を娩出した。他の４頭中、２頭では流産が発生し、また
１頭は分娩時に死産、１頭は母牛の事故死により死産で
あった。
【００１５】４）ＤＮＡ鑑定 ドナー細胞（ＢＩＰ細胞）及び誕生したクローン子牛の
白血球からＤＮＡを抽出した。多型性に富むマイクロサ
テライト領域のすぐ外側の配列をもとに設計されたプラ
イマーセット２３種類について、６−ＦＡＭやＨＢＸ、
ＴＥＴのいずれかの蛍光色素でラベルした。このような
蛍光プライマー各０．４μＭに、ＤＮＡ２０ｎｇ、１．
７ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ
ｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase （５０単位／ｍｌ）を
加えて合計１５μｌに調製した サーマルサイクラーを用いて、上記混合液を９４℃、２
０秒で２９サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物
を Perkin-Elmer 373A シークエンサーを用いて電気泳
動により分離し、ＧＥＮＥＳＣＡＮ ６７２ＴＭと Gen
otyper TM (Perkin-Elmer 社製) でバンドパターンの解
析を行った（参考文献：Inoue, M. et al. Indivisual
identification and paternity control of Japanese B
lack Cattle based on microsatellite polymorphism,
Anim. Sci. Technol., 68, 443-449, 1997) 。その結
果、ＢＩＰ細胞及び誕生したクローン子牛のバンドパタ
ーンが一致した。このことから、誕生した子牛がＢＩＰ
細胞由来のクローン牛であることが確認された。
【００１６】
【発明の効果】本発明によれば、安定的に、かつ効率よ
くクローン家畜を作出することができる。しかも、ドナ
ー細胞として均一な培養細胞株を使用するので、当該細
胞を凍結保存しておき、必要な時に融解することで、何
時でも同じ細胞を培養することができる。しかも、遺伝
子操作によって特定の遺伝子の導入、欠失を容易に行う
ことができ、さらに当該操作後に、その確認が可能であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竹之内 敬人 茨城県つくば市並木２−10−209−304 (72)発明者 小堤 恭平 茨城県つくば市桜２−49 (72)発明者 塩谷 康生 茨城県龍ヶ崎市藤が丘５−９−19 (72)発明者 三橋 忠由 茨城県つくば市松代４−26−405−501 (72)発明者 斉藤 則夫 福島県西白河郡西郷村大字小田倉字小田倉 原１ Ａ−301宿舎 (72)発明者 小林 修司 福島県西白河郡西郷村大字小田倉字小田倉 原１ 親牧寮201 (72)発明者 金山 佳奈子 福島県西白河郡西郷村大字小田倉字小田倉 原１ Ｄ−204宿舎 (72)発明者 小島 敏之 茨城県牛久市さくら台２−１−18 (72)発明者 片峰 茂 長崎県長崎市愛宕３−11−40 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BA22 BD09 CA60

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 均一な培養細胞株を核移植用ドナー細胞
    として用いることを特徴とするクローン家畜の作出方
    法。
  2. 【請求項２】 均一な培養細胞株が、牛筋肉内脂肪前駆
    細胞株であるクローン牛の作出方法。
  3. 【請求項３】 牛筋肉内脂肪前駆細胞株として、凍結保
    存株を利用する請求項２記載の方法。
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