JP2002281974A - カルシトニン遺伝子関連ペプチドレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 新規のＣＧＲＰポリペプチド、ならびに生物
学的に活性なかつ診断上または治療上有用なそのフラグ
メント、アナログ、および誘導体、ならびにＣＧＲＰレ
セプターポリペプチドをコードする単離された核酸分
子、ならびに生物学的に活性かつ診断上または高カルシ
ウム血症、骨粗しょう症等の治療上有用なそのフラグメ
ント、アナログ、および誘導体を提供すること。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）特定の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドあ
るいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは
誘導体をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）ＡＴＣＣ
寄託番号７５８２４に含有されるｃＤＮＡによりコード
されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは該
ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体
をコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択さ
れる、単離されたポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本出願は、１９９４年８月１
６日に提出された、係属中のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／
ＵＳ９４／０９２３５号の一部継続出願である。

【０００２】本発明は、新たに同定したポリヌクレオチ
ド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの生成に関する。より特定すると、本
発明のポリペプチドは、ヒト７−膜貫通レセプターであ
り、その７−膜貫通レセプターは、カルシトニン遺伝子
関連ペプチドレセプターとして同定され、本明細書中以
後時々「ＣＧＲＰ」という。本発明はまた、このような
ポリペプチドの作用を阻害することに関する。

【０００３】

【従来の技術】医学的に重要な多数の生物学的プロセス
が、Ｇタンパク質および／またはセカンドメッセンジャ
ー（例えば、ｃＡＭＰ）を含むシグナル伝達経路に関与
するタンパク質により媒介されることは、十分に確立さ
れている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５
１：３５３−３５４（１９９１））。本明細書中では、
これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関
与するタンパク質またはＰＰＧタンパク質という。これ
らのタンパク質のいくつかの例は、Ｇタンパク質共役レ
セプター（ＧＰＣＲ）（例えば、アドレナリン作動性薬
剤およびドーパミンに対するＧタンパク質共役レセプタ
ー（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，ＰＮＡＳ，８４：４
６−５０（１９８７）；Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：６５０−６５６（１９８
７）；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３
６：７８３−７８７（１９８８）））、Ｇタンパク質そ
れ自体、エフェクタータンパク質（例えば、ホスホリパ
ーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラ
ーゼ）、ならびにアクチュエータータンパク質（ａｃｔ
ｕａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、プロテインキ
ナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ（Ｓｉｍｏｎ，
Ｍ．Ｉ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８０２−８（１
９９１）））を含む。

【０００４】例えば、シグナル伝達の１つの形態では、
ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸
シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性
化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、そしてＧＴ
Ｐはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質
は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結
させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活
性化されると、ＧＴＰを結合ＧＤＰに変換することが示
された。次いで、ＧＴＰを有する形態は、活性化された
アデニル酸シクラーゼに結合する。ＧＴＰのＧＤＰへの
加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、Ｇ
タンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタ
ンパク質は、シグナルをレセプターからエフェクターに
中継する中間物として、およびシグナルの持続時間を制
御する時計としての２つの役割を果たす。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明のレセプターの
推定アミノ酸配列は、Ｇタンパク質共役レセプターに特
有な７つの疎水性領域の存在を実証する。またそれは、
セクレチン／グルカゴンファミリーのペプチドに属する
さらなるホルモンに対するレセプターを含むＧタンパク
質共役レセプターの明らかなファミリーのメンバーであ
り得る。セクレチン／グルカゴンファミリーのペプチド
はまた、ヒトカルシトニンレセプターと有意な配列の同
一性を表すことが示されている。このファミリーのペプ
チドのメンバーはまた、血管作用性腸ペプチド（ＶＩ
Ｐ）（Ａｉｓｈｉｈａｒａら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１０：
１６３５−１６４１（１９９１））、成長ホルモン放出
ホルモン（ＧＨＲＨ）（Ｍａｙｏ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｍｏ
ｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，６：１７３４−１７４４
（１９９２））、およびグルカゴン様ペプチド１（Ｔｈ
ｏｒｎｅｓ，Ｂ．Ｐｎａｓ，ＵＳＡ，８５：８６４１−
８６４５（１９９２））に対するレセプターを含む。こ
のリガンドファミリーの他のメンバーの間の交差反応性
は、胃抑制性ペプチド（ＧＩＰ）、下垂体アデニル酸シ
クラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ヒスチジンの
Ｎ末端およびイソロイシンのＣ末端を有するペプチド
（ＰＨＩ）ならびにヘロデルミン（ｈｅｌｏｄｅｒｍｉ
ｎ）を含み、これらのリガンドに対するレセプターもこ
のファミリーに属するようであることを示唆する。

【０００６】この新規レセプターファミリーの構造上特
色の分析により、７つの膜貫通モチーフならびに保存さ
れたシステインおよび数カ所のＮ結合グリコシル化部位
を含む長いアミノ末端細胞外領域、ならびにリーダー配
列として機能し得るアミノ末端疎水性ストレッチを含む
いくつかの保存された構造モチーフが示される。

【０００７】調節ペプチドのカルシトニンファミリー
は、５つの既知のメンバーを含む：カルシトニン（Ｃ
Ｔ）、２つのカルシトニン遺伝子関連ペプチド（αおよ
びβ−ＣＧＲＰ）、小島アミロイドポリペプチド（ＩＡ
ＰＰまたはアミリン）、サケカルシトニン（ｓＣＴ）お
よびアドレノメジュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｉ
ｎ）。これらのペプチドはそれぞれ骨粗鬆症、高血圧
症、および成人発症型糖尿病の病態生理学に関係してい
る。ＣＧＲＰは異なる作用の多血症を伴うペプチドであ
る。神経伝達物質は心臓血管系および胃腸管に対する効
果を有するため、数秒以内に効果を生じ得る。神経モデ
ュレーターは神経系中に存在するため、数分にわたり効
果を生じる。炎症において神経モデュレーターはオータ
コイド因子として作用し、数時間以上の期間、血管拡張
を生じる。栄養因子はＣＮＳ内および骨格筋において作
用するので、何日間も変化が続く。ＣＧＲＰもまた、１
つのセカンドメッセンジャー経路以上に刺激し得る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明のＣＧＲＰポリペ
プチドは、ＣＧＲＰに特異的に結合することが見出さ
れ、そしてヒトカルシトニンレセプターと５５％のアミ
ノ酸配列の同一性を有する。

【０００９】本発明の１つの局面によれば、新規のＣＧ
ＲＰポリペプチド、ならびに生物学的に活性なおよび診
断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログ、
および誘導体が提供される。本発明のＣＧＲＰレセプタ
ーは、ヒト起源のものである。

【００１０】本発明の別の局面によれば、ＣＧＲＰレセ
プターポリペプチドをコードする単離された核酸分子
（ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含
む）、ならびに生物学的に活性なおよび診断上または治
療上有用なそのフラグメント、アナログ、および誘導体
が提供される。

【００１１】本発明のさらなる局面によれば、このよう
なポリペプチドを組換え技術により生成するためのプロ
セスが提供される。このプロセスは、ＣＧＲＰレセプタ
ーの核酸配列を含有する組換え原核生物および／または
真核生物宿主細胞を、このタンパク質の発現およびその
後のこのタンパク質の回収を促進する条件下で培養する
工程を包含する。

【００１２】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。

【００１３】別の実施形態によれば、レセプターアンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストならびに／あるいは
レセプターリガンドをスクリーニングするために、ＣＧ
ＲＰレセプターポリペプチドを用いるためのプロセスが
提供される。

【００１４】本発明のさらに別の実施形態によれば、こ
のようなアゴニストを治療上の目的、例えば、高カルシ
ウム血症、骨粗鬆症、パジェット病、高血圧症、肥満
症、冠状動脈疾患、悪性腫瘍における高カルシウム血症
を治療するため、免疫反応、脈管形成を刺激するため、
およびスーパーオキシドラジカル産生の阻害に用いるプ
ロセスが提供される。

【００１５】本発明の別の局面によれば、このようなア
ンタゴニストを疼痛伝達（ｐａｉｎｔｒａｎｓｍｉｓｓ
ｉｏｎ）、関節炎、成人発症型糖尿病、慢性炎症、片頭
痛、および一定のガンの治療に用いるプロセスが提供さ
れる。

【００１６】本発明の別の局面によれば、ＣＧＲＰレセ
プター配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さ
の核酸分子を含む核酸プローブを提供する。

【００１７】本発明の別の局面によれば、ＣＧＲＰレセ
プター核酸配列およびこのような核酸配列によりコード
されるレセプター内の変異に関連する疾患またはこのよ
うな疾患に対する罹病性を診断する方法を提供する。

【００１８】本発明のなおさらなる局面によれば、科学
的研究（ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造）
に関するインビトロの用途のために、このようなポリペ
プチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを利用するためのプロセスを提供する。

【００１９】１つの局面において、本発明は、単離され
たポリヌクレオチドであって、以下：（ａ）配列番号２
の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドあるいはこの
ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは誘導体を
コードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号
７５８２４に含有されるｃＤＮＡによりコードされるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいはこのポリペ
プチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコー
ドするポリヌクレオチド、からなる群より選択される、
単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【００２０】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、ＤＮＡである。

【００２１】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、ＲＮＡである。

【００２２】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、ゲノムＤＮＡである。

【００２３】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする。

【００２４】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、ＡＴＣＣ寄託番号７５８２４のｃＤＮＡによ
りコードされるポリペプチドをコードする。

【００２５】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、配列番号１に示されるコード配列を有する。

【００２６】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、ＡＴＣＣ寄託番号７５８２４として寄託され
るコード配列を有する。

【００２７】さらなる局面において、本発明は、上記Ｄ
ＮＡを含有するベクターを提供する。

【００２８】さらなる局面において、本発明は、上記の
ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞を提供す
る。

【００２９】さらなる局面において、本発明は、ポリペ
プチドを生産するプロセスであって、上記宿主細胞か
ら、上記ＤＮＡによりコードされる上記ポリペプチドを
発現させる工程を包含する、プロセスを提供する。

【００３０】さらなる局面において、本発明は、ポリペ
プチドを発現する能力を有する細胞を生成するプロセス
であって、上記のベクターを用いて細胞を遺伝子操作す
る工程を包含するプロセスを提供する。

【００３１】さらなる局面において、本発明は、上記の
ＤＮＡとハイブリダイズ可能であり、かつＣＧＲＰレセ
プター活性を有するポリペプチドをコードする、単離さ
れたＤＮＡを提供する。

【００３２】本発明は、別の局面において、ポリペプチ
ドであって、（ｉ）配列番号２の推定アミノ酸配列を有
するポリペプチドならびにそのフラグメント、アナログ
および誘導体、および（ｉｉ）ＡＴＣＣ寄託番号７５８
２４のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド、なら
びにこのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび
誘導体、からなる群より選択される、ポリペプチドを提
供する。

【００３３】１つの実施形態において、上記のポリペプ
チドは、配列番号２の推定アミノ酸配列を有する。

【００３４】なお別の局面において、本発明は、上記の
ポリペプチドに対する抗体を提供する。

【００３５】なお別の局面において、本発明は、上記の
ポリペプチドを活性化する化合物を提供する。

【００３６】なお別の局面において、本発明は、上記の
ポリペプチドの活性化を阻害する化合物を提供する。

【００３７】なおさらなる局面において、本発明は、上
記のポリペプチドの活性化の必要性を有する患者を処置
する方法であって、上記のポリヌクレオチドを活性化す
る化合物の治療的有効量をこの患者に投与する工程を包
含する方法を提供する。

【００３８】なおさらなる局面において、本発明は、上
記のポリペプチドの活性化を阻害する必要性を有する患
者を処置する方法であって、上記のポリペプチドの活性
化を阻害する化合物の治療的有効量をこの患者に投与す
る工程を包含する方法を提供する。

【００３９】１つの実施形態において、上記ポリペプチ
ドは、ＣＧＲＰレセプターポリペプチドの可溶性フラグ
メントであり、かつこのレセプターに対するリガンドを
結合する能力を有する。

【００４０】なお別の局面において、本発明は、上記の
ＣＧＲＰレセプターポリペプチドのアンタゴニストおよ
びアゴニストを同定するためのプロセスであって、以下
の工程：細胞表面上でレセプターポリペプチドを発現さ
せる工程；この細胞をレセプターリガンドおよびスクリ
ーニングされるべき化合物に接触させる工程；２次シグ
ナルがこのリガンドおよびこのレセプターポリペプチド
の相互作用から生じるかどうかを決定する工程；および
このスクリーニングされるべき化合物がアゴニストまた
はアンタゴニストであるかどうかを同定する工程、を包
含するプロセスを提供する。

【００４１】なお別の局面において、本発明は、ＣＧＲ
Ｐレセプターに結合する能力を有することが既知でない
リガンドが、それに結合し得るかどうかを決定するプロ
セスであって、以下の工程：ＣＧＲＰレセプターを発現
する哺乳動物細胞を潜在的なリガンドと接触させる工
程；このレセプターに結合するリガンドの存在を検出す
る工程；およびこのリガンドがこのＣＧＲＰレセプター
に結合するかどうかを決定する工程、を包含するプロセ
スを提供する。

【００４２】なお別の局面において、本発明は、上記Ｃ
ＧＲＰレセプター核酸配列内の変異に関連する疾病また
はこのような疾病に対する罹病性を診断するプロセスで
あって、宿主由来のサンプル中の上記ＣＧＲＰレセプタ
ー核酸配列内の変異を決定する工程を包含するプロセス
を提供する。

【００４３】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、異種ポリヌクレオチドに融合している。

【００４４】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、異種ポリペプチドをコードする。

【００４５】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、上記ポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチドに融合されている。

【００４６】１つの実施形態において、本発明は、上記
ポリヌクレオチドが調節制御配列に作動可能に連結され
ているベクターを提供する。

【００４７】１つの実施形態において、本発明は、原核
生物細胞、真核生物細胞、脊椎動物細胞、Ｃｏｓ細胞、
ＣＨＯ細胞またはＥ．ｃｏｌｉ細胞である上記宿主細胞
を提供する。

【００４８】１つの実施形態において、上記ポリペプチ
ドは、標識されたか、改変されたかまたはポリエチレン
グリコールに融合されている。

【００４９】１つの実施形態において、上記ポリペプチ
ドは、異種ポリペプチドに融合されている。

【００５０】１つの実施形態において、上記ポリペプチ
ドは、Ｎ末端メチオニンを欠く。

【００５１】１つの実施形態において、上記ポリペプチ
ドは、Ｎ末端メチオニンを有する。

【００５２】１つの実施形態において、上記抗体は、上
記ポリペプチドに特異的に結合する。

【００５３】１つの実施形態において、上記抗体は、ポ
リクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ヒト抗
体、ヒト化抗体またはＦａｂフラグメントである。

【００５４】さらに別の局面では、本発明は、上記ポリ
ヌクレオチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含
む薬学的組成物を提供する。

【００５５】さらに別の局面では、本発明は、上記ポリ
ペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬
学的組成物を提供する。

【００５６】さらに別の局面では、本発明は、上記抗体
および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物
を提供する。

【００５７】さらに別の局面では、本発明は、医薬の調
製の際の、上記ポリヌクレオチドの使用を提供する。

【００５８】さらに別の局面では、本発明は、医薬の調
製の際の、上記ポリペプチドの使用を提供する。

【００５９】さらに別の局面では、本発明は、医薬の調
製の際の、上記抗体の使用を提供する。

【００６０】本発明のこれらの局面および他の局面は、
本明細書中の教示から当業者には明らかであるべきであ
る。

【００６１】

【発明の実施の形態】本発明の局面によれば、図１（配
列番号２）の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプ
チドをコードするか、またはＡＴＣＣ寄託番号７５８２
４として１９９４年６月２４日にアメリカンタイプカル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたクローン
のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコー
ドする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供され
る。アメリカンタイプカルチャーコレクションは、１０
８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ．
Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２
２０９に所在する。

【００６２】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、肺、心臓および腎臓において見出され得
る。本発明のポリヌクレオチドが、ヒト滑膜由来のｃＤ
ＮＡライブラリーにおいて発見された。これは、Ｇタン
パク質共役レセプターファミリーに構造的に関係する。
これは、４６１アミノ酸残基のタンパク質をコードする
オープンリーディングフレームを含む。このタンパク質
の最初の約２１アミノ酸残基は推定のリーダー配列であ
り、それゆえ、成熟タンパク質は４４０アミノ酸を含
む。このタンパク質は、ラットカルシトニン様レセプタ
ーに全アミノ酸配列にわたり８８％の同一性および９３
％の類似性で、最も高い程度の相同性を示す。

【００６３】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡ
は二本鎖または一本鎖であり得る。そして、一本鎖の場
合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり
得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図
１（配列番号１）に示すコード配列と同一であり得る
か、または寄託したクローンのコード配列と同一であり
得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、コード配列
が、遺伝コードの重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）または
縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）の結果として、図１（配
列番号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟
ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得
る。

【００６４】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドま
たは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは：成熟ポリペプチ
ドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列お
よび付加的なコード配列（例えば、リーダー配列）；成
熟ポリぺプチドのコード配列（および必要に応じて付加
的なコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イン
トロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’およ
び／または３’の非コード配列）を包含し得る。

【００６５】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列お
よび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包
含する。

【００６６】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したク
ローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、
フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本
明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポ
リヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に
存在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天
然に存在しない変異体であり得る。

【００６７】従って、本発明は、図１（配列番号２）に
示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポ
リヌクレオチドの変異体を包含する。これらの変異体
は、天然のスプライシング変異体または組換えＤＮＡ技
術由来の変異体のいずれかであり、図１（配列番号２）
のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによ
りコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、
またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド
変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または
挿入変異体を包含する。本明細書中上記で示したよう
に、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコ
ード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に
存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得
る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体
は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を
有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これ
はコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化さ
せない。

【００６８】本発明はまた、成熟ポリペプチドをコード
する配列がポリヌクレオチド配列に同じリーディングフ
レーム内で融合され得るポリヌクレオチドを包含する。
このポリヌクレオチド配列は、宿主細胞からのポリペプ
チドの発現および分泌を助ける（例えば、細胞からのポ
リペプチドまたはポリペプチドの一部の輸送を制御する
ための分泌配列として機能するリーダー配列）。ポリヌ
クレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる５’
アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。プ
ロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であ
り、そしてそれは不活性型のタンパク質である。一旦プ
ロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。
ＣＧＲＰレセプターの可溶性形態は、推定のリーダー配
列または成熟ポリペプチドの膜に結合しない別の部分を
欠く成熟ポリペプチドであり得る。

【００６９】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポ
リペプチドの精製を提供するｐＱＥ−９ベクターにより
供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、
例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞）が使用される場合、ヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザヘマ
グルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗ
ｉｌｓｏｎ， Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７ （１
９８４））。

【００７０】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％および好ましくは７０％の同一性が存在する場合、本
明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌ
クレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用す
る用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なく
とも９５％および好ましくは少なくとも９７％の同一性
が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが生じる
ことを意味する。好ましい実施形態において本明細書中
上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドは、図１（配列番号１）のｃＤＮＡまたは寄託
したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実
質的に同じ生物学的機能または生物学的活性のいずれか
を保持するポリペプチドをコードする。すなわちこのポ
リペプチドは、ＣＧＲＰレセプターとして機能するか、
またはこのポリペプチドがＣＧＲＰレセプターとして機
能しない（例えばレセプターの可溶性形態）場合でも、
レセプターに対してリガンドが結合する能力を保持す
る。

【００７１】本明細書中でいう寄託物（単数または複
数）は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。
これらの寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そし
て米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされること
を容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用
されており、そして本明細書中の配列のいかなる記載と
のいかなる矛盾の場合も制御している。寄託物を製造、
使用、または販売するためには実施許諾が必要とされ
得、そしてこのような実施許諾は本明細書によって与え
られるわけではない。

【００７２】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有する、または寄託したｃＤＮＡによ
りコードされるアミノ酸配列を有するＣＧＲＰレセプタ
ーポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体に関する。

【００７３】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチ
ド、または寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドをいう場合は、このようなポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能または生物学的活性のいずれかを保
持するポリペプチドを意味する。すなわちこのポリペプ
チドは、ＣＧＲＰレセプターとして機能するか、または
このポリペプチドがＣＧＲＰレセプターとして機能しな
い（例えばレセプターの可溶性形態）場合でも、リガン
ドまたはレセプターに結合する能力を保持する。アナロ
グは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活
性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包
含する。

【００７４】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドで
あり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。

【００７５】図１（配列番号２）のポリペプチド、また
は寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
の、フラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）
その中で１つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存ア
ミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換さ
れ、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝
コードによりコードされるアミノ酸残基であるかもしれ
ないかまたはないかもしれないフラグメント、誘導体、
またはアナログ、あるいは（ｉｉ）その中で１つ以上の
アミノ酸残基が置換基を含有するフラグメント、誘導
体、またはアナログ、あるいは（ｉｉｉ）その中で成熟
ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合
物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化
合物に融合されているフラグメント、誘導体、またはア
ナログ、あるいは（ｉｖ）その中でリーダー配列または
分泌配列あるいは成熟ポリペプチドの精製に用いられる
配列のようなさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融
合されるフラグメント、誘導体、またはアナログであり
得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナロ
グは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると
考えられる。

【００７６】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。

【００７７】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは単離されていないが、天然系において共存する
物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、単離されている。この
ようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、お
よび／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは、組成物の一部であり得、そしてこのようなベ
クターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないの
でなお単離され得る。

【００７８】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポ
リペプチドを生成することに関する。

【００７９】宿主細胞は、本発明のベクター（これは例
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換ま
たはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、
プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり
得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化
し、形質転換体を選択し、またはＣＲＴ遺伝子を増幅す
るために適切に改変された従来の栄養培地中で培養され
得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現の
ために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であ
り、そして当業者には明らかである。

【００８０】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、お
よび合成ＤＮＡ配列を包含し、例えば、ＳＶ４０の誘導
体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイ
ルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮ
Ａの組み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ
（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、および仮性狂犬病など）である。しかし、宿主にお
いて複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他
のベクターが使用され得る。

【００８１】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野
で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
（単数または複数）に挿入される。このような手順およ
び他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられ
る。

【００８２】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（１つまたは複数）（プロモーター）に作動
可能に連結され、ｍＲＮＡの合成を指示する。このよう
なプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ
得る：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰ_Lプロモータ
ー、および原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウ
イルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他
のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のため
のリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有
し得る。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な
配列を含み得る。

【００８３】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ． ｃｏｌｉにお
けるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を
提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。

【００８４】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。

【００８５】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイル
ス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。

【００８６】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施形態の好ましい局面によれば、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベ
クターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そ
して市販されている。以下のベクターが例として提供さ
れる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔ
ｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐ
ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核
性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸ
Ｔ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可
能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも
使用され得る。

【００８７】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られ
た細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λＰ_R、Ｐ_L、およびｔｒｐを含む。真核プ
ロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナー
ゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイルス
由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを包含
する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十
分に当業者のレベルの範囲内にある。

【００８８】さらなる実施形態では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞
（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞
は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の
宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェク
ションまたはエレクトロポレーションにより達成され得
る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔ
ｅｙ，Ｉ．、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，（１９８６））。

【００８９】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、
従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。

【００９０】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタン
パク質を生成するために、本発明のＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核宿主および真
核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび
発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ、Ｎ．Ｙ．，（１９８９））（この開示は、本明細
書中に参考として援用されている）に記載されている。

【００９１】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増加させる。例としては、複製起点ｂｐ１００〜
２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーが挙げられる。

【００９２】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点
および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー
（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子お
よびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）お
よび下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由
来するプロモーターを含有する。このようなプロモータ
ーは、特に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由
来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終
止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質または
その一部を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌すること
を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられ
る。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、
発現された組換え産物の安定化または簡略化された精
製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質
をコードし得る。

【００９３】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適切な翻訳開始
シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、お
よび所望により宿主内での増幅を提供するために複製起
点を含有する。形質転換のための適切な原核宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種々
の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いら
れ得る。

【００９４】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝
子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マ
ーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。このような
市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐ
ｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）
を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。

【００９５】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモータ
ーは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。

【００９６】細胞は、代表的には遠心分離により収集さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。

【００９７】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得、このような方法は、当業者に周知
である。

【００９８】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ、２３： １
７５（１９８１）に記載されているサル腎臓線維芽細胞
のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る
他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅ
Ｌａ、およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現
ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエン
ハンサー、およびまた任意の必要なリボソーム結合部
位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位および
スプライスアクセプター部位、転写終結配列、および
５’フランキング非転写配列を含有し得る。ＳＶ４０ス
プライスおよびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配
列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために
使用され得る。

【００９９】ＣＧＲＰレセプターポリペプチドは、以下
に挙げる方法により組換え細胞培養物から回収され、そ
して精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿または
エタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロ
マトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが
包含される。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ
（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の配置
を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程
に用いられ得る。

【０１００】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞によ
り）から組換え技術により生成され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化さ
れ得ない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニ
ンアミノ酸残基を含み得る。

【０１０１】本発明のレセプターはＣＧＲＰと結合し、
そしてカルシトニンレセプターと高度のアミノ酸配列の
相同性を有する。それゆえ、本発明のレセプターは、レ
セプターのアンタゴニストおよび／またはアゴニスト
（共に天然のペプチドおよび非ペプチド）のスクリーニ
ングのプロセスに用いられ得る。

【０１０２】一般に、このようなスクリーニング手順は
細胞表面上にレセプターを発現する適切な細胞を提供す
る工程を包含する。特に、本発明のレセプターをコード
するポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトする
ために用いられ、それにより、細胞表面上にＣＧＲＰレ
セプターを発現する。このようなトランスフェクション
は本明細書中上記のような手順によって達成され得る。

【０１０３】１つのこのようなスクリーニング手順は、
本発明のＣＧＲＰレセプターを発現するようにトランス
フェクトされたメラニン細胞の使用を包含する。このよ
うなスクリーニング技術は１９９２年２月６日に公開さ
れたＰＣＴ ＷＯ ９２／０１８１０中に記述される
（本明細書中に参考として援用される）。

【０１０４】従って、例えば、このようなアッセイは、
ＣＧＲＰレセプターをコードするメラニン細胞をレセプ
ターリガンドおよびスクリーニングされる化合物の両方
と接触させることにより、レセプターアンタゴニストの
スクリーニングに用いられ得る。リガンドによって生じ
るシグナルの阻害は、化合物がレセプターの潜在的なア
ンタゴニストであること、すなわち、化合物がレセプタ
ーの活性化を阻害することを示す。

【０１０５】このスクリーニング法は、このような細胞
とスクリーニングされる化合物とを接触させることによ
りアゴニストを決定するために用いられ得、かつこのよ
うな化合物がシグナルを生じるか否かを決定する、すな
わち、このような化合物がレセプターを活性化しｃＡＭ
Ｐの蓄積を刺激するか否かを決定するために用いられ得
る。

【０１０６】他のスクリーニング技術としては、レセプ
ターの活性化により引き起こされる細胞外のｐＨ変化を
測定する系において、ＣＧＲＰレセプターを発現する細
胞（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用が挙
げられる。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６巻、１８１
〜２９６頁（１９８９年１０月）に記載される。この開
示内容は本明細書中に参考として援用される。例えば、
潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストは、ＣＧＲＰ
レセプターを発現する細胞と接触され得、そしてセカン
ドメッセンジャー応答（例えば、シグナルトランスダク
ションまたはｐＨ変化）またはレポーター遺伝子系（例
えば、ルシフェラーゼ）を使用することが、潜在的アゴ
ニストまたはアンタゴニストが効果的か否かを決定する
ために測定され得る。

【０１０７】別のこのようなスクリーニング技術は、Ｃ
ＧＲＰレセプターをコードするＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ
卵母細胞に導入し、一過的にレセプターを発現させるこ
とを包含する。次いでそのレセプター卵母細胞はレセプ
ターリガンドおよびスクリーニングされる化合物と接触
され得、続いて、アンタゴニストスクリーニングの場合
にはカルシウムまたはｃＡＭＰシグナルの阻害の検出が
行われ、あるいはアゴニストの場合にはカルシウムまた
はｃＡＭＰシグナルの刺激の検出が行われる。

【０１０８】別のスクリーニング技術は、そのレセプタ
ーがホスホリパーゼＣまたはＤと連結されるＣＧＲＰレ
セプターの発現を包含する。このような細胞の代表例と
しては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが述べ
られ得る。アンタゴニストまたはアゴニストのスクリー
ニングは、本明細書中上記のように、ホスホリパーゼの
２次シグナルによるレセプターの活性化またはレセプタ
ーの活性化の阻害の検出により達成され得る。

【０１０９】別の方法は、その表面にレセプターを有す
る細胞または膜への標識リガンドの結合の阻害を決定す
ることによるＣＧＲＰレセプターインヒビターのスクリ
ーニングを包含する。このような方法は、細胞がその表
面にレセプターを発現するようにＣＧＲＰレセプターを
コードするＤＮＡで真核細胞をトランスフェクトする工
程、および標識形態の公知のリガンドの存在下で潜在的
なアンタゴニストと細胞とを接触させる工程を包含す
る。リガンドは、例えば、放射活性により標識され得
る。標識リガンドがレセプターに結合する量は、例え
ば、レセプターの放射活性の測定により測定される。レ
セプターに結合する標識リガンドの減少により決定され
るように潜在的なアンタゴニストがレセプターに結合す
る場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害され
る。

【０１１０】別の方法は、ＣＧＲＰ媒介ｃＡＭＰおよび
／またはアデニル酸シクラーゼの蓄積の阻害を決定する
ことによりＣＧＲＰインヒビターをスクリーニングする
工程を包含する。このような方法は真核細胞をＣＧＲＰ
レセプターでトランスフェクトし、細胞表面上にレセプ
ターを発現させる工程を包含する。次いで、この細胞は
ＣＧＲＰの存在下で潜在的なアンタゴニストに曝露され
る。ｃＡＭＰの蓄積量を続いて測定する。潜在的なアン
タゴニストがレセプターに結合し、そしてそれゆえＣＧ
ＲＰの結合を阻害するならば、ＣＧＲＰ媒介ｃＡＭＰの
レベル、またはアデニル酸シクラーゼ活性は減少され
る。

【０１１１】本発明はまた、ＣＧＲＰレセプターと結合
し得ることが知られてないリガンドが、このようなレセ
プターと結合し得るか否かを決定する方法を提供する。
この方法は、リガンドのＣＧＲＰレセプターへの結合が
可能な条件下で、ＣＧＲＰレセプターを発現する哺乳動
物細胞とリガンドとを接触させる工程、レセプターに結
合するリガンドの存在を検出する工程、およびそれによ
りリガンドがＣＧＲＰレセプターと結合するか否かを決
定する工程を包含する。アゴニストおよび／またはアン
タゴニストを決定するための本明細書中上記の系はま
た、レセプターに結合するリガンドの決定のために用い
られ得る。

【０１１２】一般に、ＣＧＲＰレセプターのアゴニスト
は、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、尿停留、
および骨粗鬆症の処置のような治療目的に用いられる。

【０１１３】ＣＧＲＰレセプターのアンタゴニストは、
多様な治療目的に用いられ得る。例えば、このようなア
ンタゴニストは、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、
喘息、アレルギー、精神病、鬱病、片頭痛、嘔吐、およ
び良性前立腺肥大の処置に用いられている。

【０１１４】潜在的ＣＧＲＰレセプターアンタゴニスト
の例としては、抗体、またはいくつかの場合オリゴヌク
レオチドが挙げられ、これはＧタンパク質共役レセプタ
ーと結合するが、Ｇタンパク質共役レセプターの活性を
阻害するようなセカンドメッセンジャー応答を誘起しな
い。

【０１１５】潜在的なアンタゴニストはまた、ＣＧＲＰ
レセプターのリガンドに密に関連するタンパク質、すな
わち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物学的
機能を損失し、そしてＣＧＲＰレセプターに結合すると
きに応答を全く誘起しない。

【０１１６】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス技術の使用により調製されるアンチセンス構築物を含
む。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチ
センスＤＮＡもしくはＲＮＡを介した遺伝子発現を制御
するために用いられ得る。これらの方法の両方はポリヌ
クレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することに基づ
いている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長さ約
１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレ
オチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補的に設計さ
れ（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；および
Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０
（１９９１）を参照のこと）、それにより、転写および
ＣＧＲＰレセプターの産生を阻害する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡとハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＣＧＲＰレセプター
への翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６：５６０ （１９
９１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ （１９８
８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達
され得、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで
発現され得、ＣＧＲＰレセプターの産生を阻害する。

【０１１７】別の潜在的なアンタゴニストは、ＣＧＲＰ
レセプターに結合する小分子であり、ＣＧＲＰレセプタ
ーのリガンドへの接近を不可能にして、正常な生物学的
活性を阻害する。小分子の例としては、小ペプチドまた
はペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されな
い。

【０１１８】潜在的アンタゴニストはまた、ＣＧＲＰレ
セプターの可溶形態（例えば、レセプターのフラグメン
ト）を含み、これはリガンドに結合し、そしてリガンド
が膜結合ＣＧＲＰレセプターと相互作用することを阻害
する。

【０１１９】上記で概説したスクリーニング手順により
同定されたアゴニストは、ＣＧＲＰの神経調節機能を増
強し、高血圧症を処置するために用いられ得る。なぜな
ら、ＣＧＲＰは冠状動脈の血流を増加する効果的な血管
拡張神経薬であるからである。アゴニストはまた、閉塞
した心臓弁で冠状動脈の血流を増加させるためにも用い
られ得る。同様に、ＣＧＲＰは心収縮に強力な興奮作用
を有し、そして心収縮の刺激に用いられ得る。アゴニス
トはまた、成長ホルモン放出の減少により、巨大症の処
置にも用いられ得る。

【０１２０】アゴニストはまた、骨粗鬆症の処置に用い
られ得る。なぜなら、ＣＧＲＰは破骨細胞を介した骨の
再吸収を阻害し、そして骨生成を刺激するからである。
これと同様の形式で、高カルシウム血症も処置され得
る。同様に、アゴニストはパジェット病の処置に用いら
れ得る。

【０１２１】アゴニストはまた、内皮細胞増殖における
ＣＧＲＰの刺激作用を介して、血管形成の刺激および創
傷治癒の促進に用いられ得る。

【０１２２】アゴニストはまた、肥満の処置に用いられ
得る。なぜなら、ＣＧＲＰは食欲および腸運動の減衰に
より食物摂取挙動を制御するからである。

【０１２３】アゴニストはまた、神経再生の刺激に用い
られ得る。なぜなら、ＣＧＲＰはＣＮＳにおける栄養因
子であるからである。

【０１２４】アゴニストはまた、脈管透過性の増加によ
る免疫応答の増強に用いられ得る。

【０１２５】アゴニストはまた、スーパーオキシド生成
の阻害に用いられ得る。スーパーオキシド生成は、細胞
傷害を引き起こし、そしてガンのような疾患を誘発し得
ることが当該分野において公知である。

【０１２６】ＣＧＲＰレセプターアンタゴニストはま
た、ＣＮＳ疼痛伝達の阻害、長期血管拡張、関節炎、成
人発症型糖尿病、心血管疾患により引き起こされる慢性
炎症の処置、および片頭痛の処置に用いられ得る。

【０１２７】アンタゴニストはまた、肺のカルチノイド
腫瘍の抑制に用いられ得る。なぜなら上昇されたＣＧＲ
Ｐレベルが、この疾患の間、肺において見出されている
からである。

【０１２８】アンタゴニストおよびアゴニストは、例え
ば、本明細書中以下に記載の薬学的に受容可能なキャリ
アとともに組成物において用いられ得る。

【０１２９】ＣＧＲＰ核酸配列およびＣＧＲＰペプチド
はまた、科学的研究（ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクタ
ーの製造）に関連するインビトロでの目的のために、お
よびヒトの疾患を処置するための診断薬および治療薬の
生産のために用いられ得る。

【０１３０】全長ＣＧＲＰレセプター遺伝子のフラグメ
ントは、全長ＣＧＲＰレセプター遺伝子を単離する、お
よびその遺伝子に対する高い配列類似性または同様の生
物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、ｃＤ
ＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いられ得る。一般にこのタイプのプローブ
は、少なくとも２０塩基を有する。しかし、好ましく
は、プローブは少なくとも３０塩基を有し、そして一般
に、それらはより多くの数の塩基を有し得るが、１００
０塩基対を超えない。プローブはまた、ｃＤＮＡクロー
ン（全長転写物に対応する）およびゲノムクローン（単
数または複数）（調節領域およびプロモーター領域、エ
キソン、ならびにイントロンを含む完全ＣＧＲＰレセプ
ター遺伝子を含む）の同定に用いられ得る。スクリーニ
ング法の一例としては、オリゴヌクレオチドプローブを
合成するために公知のＤＮＡ配列を用いることによって
ＣＧＲＰレセプター遺伝子のコード領域を単離すること
が挙げられる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を
有する標識オリゴヌクレオチドは、ライブラリーのいず
れのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定
するために、ヒトのｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮ
ＡライブラリーまたはｍＲＮＡライブラリーのスクリー
ニングに用いられる。

【０１３１】このＣＧＲＰレセプターポリペプチドおよ
びアンタゴニストまたはアゴニスト（これらは、ポリペ
プチドである）は、本発明に従って、インビボでのこの
ようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これは
しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。

【０１３２】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞がこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。

【０１３３】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法
により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの
方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明
らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒク
ルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイ
ルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み
合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され
得る。

【０１３４】ＣＧＲＰレセプターポリペプチドおよびア
ンタゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キャリ
アと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、
治療有効量のポリペプチドまたはアンタゴニストまたは
アゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは
賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩
液、緩衝化生理食塩液、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げら
れるが、これらに限定されない。処方は、投与の形態に
合わせるべきである。

【０１３５】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
以上の成分で満たされた１以上の容器を含む薬学的パッ
クまたはキットを提供する。このような容器に関して、
薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統
制する政府機関により規定された形式の製品表示をし
得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使
用、または販売におけるこの機関による認可を表す。さ
らに、薬学的組成物は、他の治療化合物と併用して用い
られ得る。

【０１３６】薬学的組成物は、局所、静脈内、腹膜内、
筋肉内、鼻腔内、または皮内経路によるような好都合な
様式で投与され得る。薬学的組成物は、特異的適応の処
置および／または予防に効果的な量で投与される。一般
に、薬学的組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の
量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約８
ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多くの場
合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から約１ｍ
ｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮され
る。

【０１３７】本発明はさらに、細胞表面上のヒトＣＧＲ
Ｐレセプターポリペプチドと特異的に相互作用および結
合する薬物のスクリーニング法または同定法を提供す
る。この方法は、ＣＧＲＰレセプターをコードする単離
ＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞と多数の薬物とを接触さ
せる工程、哺乳動物細胞と結合するこれらの薬物を決定
する工程、およびその結果、本発明のＣＧＲＰレセプタ
ーポリペプチドと特異的に相互作用および結合する薬物
を同定する工程を包含する。

【０１３８】本発明はまた、ＣＧＲＰレセプターポリペ
プチドをコードするｍＲＮＡの存在を検出することによ
り、細胞表面上のＣＧＲＰレセプターの発現を検出する
方法を提供する。この方法は、細胞から全ＲＮＡを採集
する工程、そしてこのように得られたｍＲＮＡと核酸プ
ローブ（ハイブリダイズする条件下で、ヒトＣＧＲＰレ
セプターをコードする核酸分子の配列内に含まれる配列
と特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレ
オチドの核酸分子を含む）とを接触させる工程、そのプ
ローブとハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を検出する
工程、およびその結果、細胞によるＣＧＲＰレセプター
の発現を検出する工程を包含する。

【０１３９】本発明はまた、ＣＧＲＰレセプター核酸配
列中の変異の存在に関連する疾患の検出、またはこのよ
うな疾患に対する罹病性の検出のための診断アッセイの
一部としてのＣＧＲＰレセプター遺伝子の使用に関す
る。

【０１４０】ＣＧＲＰレセプター遺伝子中に変異を有す
る個体は、多様な技術によりＤＮＡレベルで検出され得
る。診断用の核酸は、患者細胞（例えば、血液、尿、唾
液、組織バイオプシーおよび解剖材料）より入手され得
る。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接用いられ得る
か、または分析前に、ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕ
ｒｅ，３２４：１６３−１６６（１９８６））の使用に
より酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもま
た同目的のために用いられ得る。一例として、ＣＧＲＰ
レセプターをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマ
ーは、ＣＧＲＰレセプターの変異の同定および分析に用
いられ得る。例えば、欠失物および挿入物は、正常な遺
伝子型との比較において、増幅産物のサイズの変化によ
り検出され得る。点変異は、増幅ＤＮＡと放射標識ＣＧ
ＲＰレセプターＲＮＡ配列との、あるいは放射標識ＣＧ
ＲＰレセプターアンチセンスＤＮＡ配列とのハイブリダ
イズにより同定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮ
ａｓｅ Ａ消化によりまたは融解温度の差異により生じ
たミスマッチ二重鎖と区別され得る。あるいは、点変異
は、ＰＣＲ産物の直接配列決定またはクローン化ＰＣＲ
産物の配列決定により検出され得る。

【０１４１】ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的試験は、
変性剤の存在下または非存在下でのゲル中でのＤＮＡフ
ラグメントの電気泳動における移動度の変化の検出によ
り達成され得る。小配列欠失物および挿入物は高解像度
ゲル電気泳動により可視化され得る。異なる配列のＤＮ
Ａフラグメントは変性ホルムアミドグラジエントゲル上
で区別され得、ここでは、異なるＤＮＡフラグメントの
移動度は、それらの特異的な融解温度または部分融解温
度により、ゲル中の異なる場所において遅延される（例
えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４
２ （１９８５）を参照のこと）。

【０１４２】特定の位置における配列の変化はまた、Ｒ
ＮａｓｅおよびＳ１保護または化学切断法のようなヌク
レアーゼ保護アッセイにより明示され得る（例えば、Ｃ
ｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８５：４３９７−４
４０１（１９８５））。

【０１４３】従って、特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直
接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限
フラグメント長多型（ＲＦＬＰ））、およびゲノムＤＮ
Ａのサザンブロッティングのような方法により達成され
得る。

【０１４４】より簡便なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列
決定に加えて、変異はまたインサイチュ分析により検出
され得る。

【０１４５】本発明はまた、種々の組織中のＣＧＲＰレ
セプタータンパク質の変化レベルを検出するための診断
アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織サ
ンプルと比較されたタンパク質の過剰発現は、例えば、
ガンのような疾患の存在または疾患に対する罹病性を検
出し得るからである。宿主由来サンプル中のＣＧＲＰレ
セプタータンパク質レベルの検出に用いられるアッセイ
は当業者に周知であり、そして、ラジオイムノアッセ
イ、競争結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬ
ＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイを包
含する。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＩｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，１（２），第６章，（１９９１））は、最初
に、ＣＧＲＰレセプター抗原に特異的な抗体（好ましく
はモノクローナル抗体）を調製する工程を包含する。さ
らに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して調
製される。レポーター抗体に、放射活性、蛍光色素、ま
たは、本実施例においては、西洋ワサビペルオキダーゼ
酵素のような検出試薬が付着される。サンプルは宿主か
ら除去され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する
固体支持体（例えば、ポリスチレン皿）上でインキュベ
ートされる。次いで、皿上の任意の遊離タンパク質結合
部位は、ＢＳＡのような非特異的タンパク質とともにイ
ンキュベートすることによってカバーされる。次に、モ
ノクローナル抗体は、モノクローナル抗体とポリスチレ
ン皿に付着された任意のＣＧＲＰレセプタータンパク質
とが付着する間、皿中でインキュベートされる。すべて
の非結合モノクローナル抗体は緩衝液で洗浄除去され
る。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合されたレポータ
ー抗体は皿中に入れられ、その結果、レポーター抗体と
ＣＧＲＰレセプタータンパク質に結合された任意のモノ
クローナル抗体との結合が生じる。次いで、非付着レポ
ーター抗体は洗浄除去される。ペルオキシダーゼ基質
を、次いで、皿に添加し、そして標準曲線を対比した場
合の一定時間の呈色量が、患者のサンプルの一定容量中
に存在するＣＧＲＰレセプタータンパク質の量の測定値
である。

【０１４６】競争アッセイ（ここで、ＣＧＲＰレセプタ
ーポリペプチドに特異的な抗体が固体支持体に付着さ
れ、そして標識ＣＧＲＰレセプターおよび宿主由来のサ
ンプルが固体支持体上を通され、そして検出される（例
えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーによ
る）標識量が、サンプル中のＣＧＲＰレセプタータンパ
ク質に量と相関し得る）が用いられ得る。「サンドイッ
チ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイと同様のアッセイ
である。「サンドイッチ」アッセイにおいて、ＣＧＲＰ
レセプタータンパク質に固体支持体上を通され、そして
固体支持体に付着された抗体と結合する。次いで、２次
抗体はＣＧＲＰレセプタータンパク質に結合される。標
識され、そして２次抗体に特異的な３次抗体は、次い
で、固体支持体上を通過され、そして２次抗体と結合さ
れ、次いで、定量され得る。

【０１４７】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
であり得る。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の
位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダ
イズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能
な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識
試薬はほとんどない。本発明による染色体へのＤＮＡの
マッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子と
の相関において、重要な第１工程である。

【０１４８】簡略に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。３’非翻訳領域
のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１つより多
いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化
しないプライマーを迅速に選択するために使用される。
次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含
有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使
用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有する
ハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。

【０１４９】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプラ
イマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメン
トのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて部分的位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするため
に同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイ
チュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメ
トリーで選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を
用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーショ
ンによるプレ選択を包含する。

【０１５０】ｃＤＮＡクローンの中期染色体展開物への
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用さ
れ得る。この技術は、５００または６００塩基ほどの短
いｃＤＮＡで使用され得る；しかし、２，０００ｂｐよ
りも大きいクローンの方が、簡便な検出のために十分な
シグナル強度で独特の染色体位置に結合しやすい。ＦＩ
ＳＨは、発現配列タグ（ＣＧＲＰレセプター遺伝子の短
いセグメント）が由来するクローンの使用を必要とし、
そしてこのクローンは長いほど好ましい。例えば、２，
０００ｂｐが良好であり、４，０００ｂｐはより良好で
あり、そして４，０００ｂｐを超える長さは、合理的な
割合の時間で（ａ ｒｅｓｏｎａｂｌｅ ｐｅｒｃｅｎ
ｔａｇｅｏｆ ｔｈｅ ｔｉｍｅ）良好な結果を得るた
めにはおそらく必ずしも必要でない。この技術の総説と
しては、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。

【０１５１】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐ
ｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄ
ｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能で
ある）に見出される。次いで、同一の染色体領域にマッ
プされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理
的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。

【０１５２】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変
異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正
常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因
因子であると思われる。

【０１５３】物理的マッピングおよび遺伝的マッピング
技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に
正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との間
の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メ
ガ塩基のマッピング解像度で、そして２０ｋｂあたり１
遺伝子と仮定する。） このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導
体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現す
る細胞は、それらに対する抗体を生成させるための免疫
原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗
体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ラ
イブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の
手順が、このような抗体およびフラグメントの生成のた
めに使用され得る。

【０１５４】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現す
る組織からそのポリペプチドを単離するために使用され
得る。

【０１５５】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の
技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎ
ａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技
術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、
１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７
２）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するための
ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．、７７−９６頁）が挙げられる。

【０１５６】単鎖抗体を生成するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスは、
本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体
を発現させるために用いられ得る。

【０１５７】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことを理解されたい。すべての部または量は、他
に明記しない限り重量基準である。

【０１５８】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載
する。

【０１５９】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／または後の大文字および／または数字により示され
る。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制
限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された
手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るか
のいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等
価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者
には明らかである。

【０１６０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを、約２単位の酵素ととも
に約２０μｌの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築
のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のために、
代表的には５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０単位の
酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素
のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特
定される。３７℃での約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って
変化し得る。消化後、反応溶液をポリアクリルアミドゲ
ル上で直接電気泳動し、所望のフラグメントを単離す
る。

【０１６１】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）に記載の８％ポリアク
リルアミドゲルを用いて行われる。

【０１６２】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかを言い、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でＡＴＰ
を用いてリン酸を添加しなければ別のオリゴヌクレオチ
ドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸
化されていないフラグメントに連結する。

【０１６３】「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、前出、１４６頁）。他
に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結される
べきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０単位のＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の
緩衝液および条件を用いて達成され得る。他に記載しな
い限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ
ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６
−４５７（１９７３）の方法に記載されるように行っ
た。

【０１６４】添付の図面は、本発明の実施形態の例示で
あり、および請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定
することを意味しない。

【０１６５】

【実施例】（実施例１） （ＣＧＲＰレセプターの細菌発現および精製）ＣＧＲＰ
レセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号
第７５８２４号）を、まず、プロセスされた遺伝子配列
（シグナルペプチド配列を除く）の５’および３’末端
配列ならびにＣＧＲＰレセプター遺伝子に対して３’側
のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて増幅させる。ＣＧＲＰレセプターコー
ド配列に対応するさらなるヌクレオチドを、５’配列お
よび３’配列のそれぞれに付加する。５’オリゴヌクレ
オチドプライマーは、配列５’ ＧＡＣＴＡＡＡＧＣＴ
ＴＡＡＴＧＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴ ３’（配
列番号３）を有し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、続い
てプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸
から開始する１８ヌクレオチドのＣＧＲＰレセプターコ
ード配列を含む。３’配列、５’ ＧＡＡＣＴＴＣＴＡ
ＧＡＣＣＧＴＣＡＡＴＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＣ
３’（配列番号４）は、ＸｂａＩ部位に相補的な配列を
含み、続いて１８ヌクレオチドのＣＧＲＰレセプターコ
ード配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐ
ＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔ
ｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、
抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌の複製起点（ｏｒ
ｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーター／オペレーター
（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉ
ｓタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、ｐ
ＱＥ−９をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化する。
増殖配列をｐＱＥ−９に連結し、そしてヒスチジンタグ
およびＲＢＳをコードする配列にインフレームに挿入す
る。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍ１
５／ｒｅｐ４株（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＳａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
（１９８９）に記載の手順により形質転換する。Ｍ１５
／ｒｅｐ４は、プラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを
含み、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてカナマイ
シン耐性（Ｋａｎ^r）も与える。形質転換体をＬＢプレ
ート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてア
ンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プ
ラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認する。
所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／
ｍｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充した
ＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させ
る。Ｏ／Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２５０の比
で大量培養物に接種する。細胞を、６００の光学密度
（Ｏ．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４と０．６との間になるまで増
殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ
−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭの最終濃
度にする。ＩＰＴＧはｌａｃＩリプレッサーを不活性化
することにより、遺伝子発現を増加させるためのＰ／Ｏ
の解放（ｃｌｅａｒ）を誘導する。細胞をさらに３〜４
時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離により採集す
る。細胞ペレットをカオトロピック剤である６Ｍグアニ
ジンＨＣｌで可溶化する。澄明化後、可溶化物を、６−
Ｈｉｓタグを含むタンパク質により堅く結合させる条件
下でニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーに
よりこの溶液から精製する（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ４１１：１７７−１
８４（１９８４））。ＣＧＲＰレセプタータンパク質
を、６ＭグアニジンＨＣｌ ｐＨ５．０でカラムから溶
出し、そして再生の目的のために、３ＭグアニジンＨＣ
ｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオ
ン（還元型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に
調整する。この溶液で１２時間インキュベーションした
後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透
析する。

【０１６６】（実施例２） （バキュロウイルス発現系を用いるＣＧＲＰレセプター
のクローニングおよび発現）全長のＣＧＲＰレセプター
タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号
第７５８２４号）を、遺伝子の５’配列および３’配列
に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用い
て増幅させる：５’プライマーは、配列

【０１６７】

【化１】 （配列番号５）を有し、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（太
字）、続いて真核生物細胞における翻訳の開始に効率的
なシグナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１９
６，９４７−９５０，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）に類似する６
ヌクレオチドを含み、これはＣＧＲＰレセプター遺伝子
の最初の１８ヌクレオチドの直ぐ上流域に存在する（翻
訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を付す）。

【０１６８】３’プライマーは、配列５’ ＧＴＣＣＧ
ＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＴ
ＡＴＴＴ ３’（配列番号６）を有し、制限エンドヌク
レアーゼＢａｍＨＩの切断部位およびＣＧＲＰレセプタ
ー遺伝子の３’非翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチド
を含む。増幅配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅ
ａｎ」 ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルより単離す
る。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍ
ＨＩで消化し、そして１％アガロースゲルで精製する。
このフラグメントを、Ｆ２と称する。

【０１６９】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
の改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を用いるＣ
ＧＲＰレセプタータンパク質の発現のために用いる（総
説について、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔ
ｈ，Ｇ．Ｅ．１９８７，Ａｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａ
ｔｉｏｎ ＢｕｌｌｅｔｉｎＮｏ．１５５５を参照のこ
と）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰ
Ｖ）の強いポリヘドリンプロモーター、続いて制限エン
ドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シミアン
ウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的
なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容
易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシ
ダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化
シグナルが続くポリヘドリンプロモーターと同方向に挿
入する。ポリヘドリン配列は、コトランスフェクト野生
型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためにウイ
ルス配列により両端で隣接される。多くの他のバキュロ
ウイルスベクターが、ｐＲＧ１の代わりに用いられ得
る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃ
ＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍ
ｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−
３９）。

【０１７０】プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、上記のよう
に、ＤＮＡを単離し、１％アガロースゲル上で精製す
る。このベクターＤＮＡをＶ２と称する。

【０１７１】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ
る。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換
し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、ＣＧＲＰレセプタ
ー遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃＣＧＲＰ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ）を含む細菌を同定する。クローン化フラ
グメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。

【０１７２】５μｇのプラスミドｐＢａｃ−ＣＧＲＰレ
セプターを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
４：７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．
０μｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「Ｂａｃ
ｕｌｏＧｏｌｄ^TM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮ
Ａ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ．）とコトランスフェクトする。

【０１７３】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＣＧＲＰレセ
プターを、５０μｌの血清非含有グレース培地（Ｌｉｆ
ｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレート
の無菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌリポフェ
クチンと９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そ
して室温にて１５分間インキュベートする。次いで、そ
のトランスフェクション混合物を、血清非含有グレース
培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種
されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）
に滴下する。プレートを、新たに加えられた溶液を混合
するために、前後に振盪する。次いでプレートを、２７
℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフ
ェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウ
シ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加
する。プレートをインキュベーターに戻し、そして２７
℃で４日間培養を続ける。

【０１７４】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上述）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行う。改変法として、青く染色されたプ
ラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロース
ゲルを用いる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述は
また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細
胞培養法およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９
〜１０頁）においても見い出され得る）。

【０１７５】連続希釈４日後、ウイルスを細胞に加え、
そして青く染色されたプラークをエッペンドルフピペッ
トのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチ
ューブに再懸濁させる。寒天を、簡単な遠心分離により
除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を用
いて、３５ｍｍ皿に播種されたＳｆ９細胞を感染させ
る。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４
℃で保存する。

【０１７６】Ｓｆ９細胞を、１０％熱失活化ＦＢＳを補
充したグレース培地中で培養する。細胞を、感染多重度
（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ＣＧＲＰレ
セプターで感染させる。６時間後、その培地を除去し、
そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００
ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換える。４２
時間後、５μＣｉの ³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの
³⁵Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加する。細胞
を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠
心分離により採集し、そして標識タンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化す
る。

【０１７７】（実施例３） （培養細胞中での一過的および安定な発現）ＣＧＲＰレ
セプターポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣ
Ｃ寄託番号第７５８２４号）を、哺乳動物発現ベクター
ｐＣＤＮにおける発現（Ｃ末端ＤＥＴタグ（ＫＳＩＲＩ
ＱＲＧＰＧＲ）を付随してまたは付随しないで）のため
に再配置した。これは、発現に潜在的にネガティブに影
響し得る、選択されたメチオニンより上流に位置する推
定アミノ酸位置−１１および−１の２つの隠れたメチオ
ニン残基の欠失を伴う、完全な３’および５’非翻訳領
域の欠失を包含する。発現効率を増加させるために、フ
ランキングＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＣＣＡＣＣ）
を選択された開始メチオニン残基に付加した。得られた
構築物を、ＤＥＡＥデキストラン硫酸およびリポフェク
チン試薬プロトコルのそれぞれにより、別々に、ＣＯＳ
細胞およびヒト腎臓２９３細胞の両方にトランスフェク
トした。一過的発現のために、トランスフェクション後
７２時間に、細胞をリガンド曝露に応じたｃＡＭＰの蓄
積についてアッセイした。１回の試験において、２９３
細胞のみが発現を示した。安定な細胞株のために、トラ
ンスフェクトされた２９３細胞を４００μｇ／ｍｌのＧ
ｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８硫酸）の存在下で選択し、
そしてＣＧＲＰに応じたｃＡＭＰの蓄積についてアッセ
イした。

【０１７８】本発明の多くの改変および変形が、上記の
教示を考慮すれば可能であり、したがって、特に記載が
なければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施さ
れ得る。

【０１７９】ヒトＣＧＲＰレセプターポリペプチド、お
よびこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮ
Ａ）、ならびに組換え技術によりこのようなポリペプチ
ドを産生するための手順が、開示される。また、このよ
うなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニ
ストを同定するために、このようなポリペプチドを利用
する方法が開示される。このようなポリペプチドに対す
るアンタゴニストは、ガン、関節炎、疼痛、糖尿病、片
頭痛、および炎症を治療的に処置するために用いられ
得、そしてアゴニストは高カルシウム血症、肥満症、高
血圧症および骨再構築の疾患を処置するために用いられ
得る。レセプターポリペプチドをコードする核酸配列に
おける変異の存在を検出する診断アッセイもまた開示さ
れる。

【０１８０】

【発明の効果】本発明により、新規のＣＧＲＰポリペプ
チド、ならびに生物学的に活性なかつ診断上または治療
上有用なそのフラグメント、アナログ、および誘導体、
ならびにＣＧＲＰレセプターポリペプチドをコードする
単離された核酸分子、ならびに生物学的に活性かつ診断
上または治療上有用なそのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体が提供される。

【０１８１】

【配列表】

【０１８２】

【数１】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、本発明のＣＧＲＰレセプターポリ
ペプチドのｃＤＮＡ配列および対応する推定のアミノ酸
配列を示す図である。最初のメチオニンアミノ酸は、ス
レオニン（Ｔｈｒ）残基で終わる２１アミノ酸の推定の
リーダー配列の一部である。アミノ酸のための標準的な
１文字略記が用いられている。推定の真の開始コドンか
ら−１アミノ酸および−１１アミノ酸上流の位置に、２
つの隠れたＡＴＧコドン（下線）が存在する。

【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のＣＧＲＰレセプターポリ
ペプチドのｃＤＮＡ配列および対応する推定のアミノ酸
配列を示す図である。

【図２】図２は、推定されるタンパク質のハイドロパシ
ープロットは７つの疎水性（膜貫通）領域および推定の
Ｎ末端シグナル配列の存在を示す図である。

【図３】図３は、哺乳動物細胞におけるＣＧＲＰレセプ
タータンパク質の発現のために使用され得るベクターの
環状マップを示す図である。ｃＤＮＡのコード領域を哺
乳動物発現ベクターＣＤＮのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位
にクローン化し、構築物ｐＣＤＮＨＣＧＲＰｒを形成し
た。

【図４】図４は、ＣＧＲＰレセプター発現構築物である
ｐＣＤＮＨＣＧＲＰｒを用いて一過的にトランスフェク
トした２９３細胞内におけるｃＡＭＰ応答を示すグラフ
である。（Ａ）は、トランスフェクトしない細胞（コン
トロール）であり、０．３μＭヒトＣＧＲＰに対するｃ
ＡＭＰの応答において変化は観察されなかった。（Ｂ）
は、トランスフェクトした細胞であり、２回の別個の実
験においてｃＡＭＰの応答は１０〜１５倍に変化した。
値は平均＋／−標準誤差を示す。この結果は、組換えレ
セプターがＣＧＲＰへの曝露に応答してｃＡＭＰと機能
的に結合することを示す。

【図５】図５は、ＣＧＲＰレセプターｃＤＮＡを用いて
形質転換した個々の２９３安定細胞株におけるｃＡＭＰ
の応答を示すグラフである。細胞を０．３μＭのヒトＣ
ＧＲＰに曝露した。コントロールの２９３細胞の基底値
は、２９〜１３０ｐｍｏｌ／ウエルであった。クローン
番号２２はヒトＣＧＲＰ処理に対して最大の応答（約１
００倍の刺激）を示した。

【図６】図６は、ＣＧＲＰレセプターｃＤＮＡを用いて
安定に形質転換した２９３細胞（図５のクローン２２の
細胞）における、ヒトＣＧＲＰ媒介性ｃＡＭＰの蓄積の
用量応答を示すグラフである。各データポイントは、３
連の測定の平均を示す。トランスフェクトしないコント
ロールの２９３細胞は、１，０００ｎＭの濃度で２倍の
刺激を示した。計算されたＥＣ₅₀値は、０．９ｎＭであ
った。この結果は組換えレセプターがヒトＣＧＲＰと機
能的に結合することを示す。

【図７】図７は、ＣＧＲＰレセプターｃＤＮＡを用いて
安定に形質転換した２９３細胞における、ＣＧＲＰ媒介
性ｃＡＭＰの蓄積に対するＣＧＲＰレセプターアンタゴ
ニストであるＣＧＲＰ（８−３７）の効果を示すグラフ
である。６ウエルプレート内の細胞を３７℃で１０分
間、１００ ｎＭのヒトＣＧＲＰ（８−３７）の非存在
下（□）または存在下（■）において漸増濃度のヒトＣ
ＧＲＰと共にインキュベートした。サイクリックＡＭＰ
をＲＩＡによりアッセイした。データは２回の別個の実
験における３連の測定の平均として示される。ヒトＣＧ
ＲＰ（８−３７）（１００ ｎＭ）を含む場合、ＣＧＲ
Ｐ濃度反応曲線は競合的な様式で右にシフトする。ヒト
ＣＧＲＰ（８−３７）はそれ自体、ｃＡＭＰ蓄積に何の
影響も有しなかった（データは示さず）。計算されたｐ
Ａ₂値は７．８であった。この結果は組換えレセプター
が本質的にＣＧＲＰレセプターであることを確実にす
る。

【図８】図８は、飽和結合（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂ
ｉｎｄｉｎｇ）を示すグラフである。（Ａ）ＣＧＲＰレ
セプターｃＤＮＡを用いて安定に形質転換した２９３細
胞（クローン２２）由来の膜への［¹²⁵Ｉ］ヒトＣＧＲ
Ｐの結合。平衡結合を２５℃で６０分間測定した。特異
的な結合（■）を、０．１μＭの非標識ヒトＣＧＲＰの
非存在下（□）または存在下（◆）での結合の間の差と
して得た。データは２連で行った３つの独立した実験の
うちの１つの代表的な実験に由来する。（Ｂ）
［¹²⁵Ｉ］ＣＧＲＰ結合のスキャッチャードプロット。
観察されたＫｄは１８．６ｐＭおよびＢｍａｘは８９ｆ
ｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。この結果は高親和性
かつ低密度の結合を示す。

【図９】図９は、競合的結合のプロフィールを示すグラ
フである。ＣＧＲＰレセプターｃＤＮＡを用いて安定に
形質転換した２９３細胞（クローン２２細胞）から調製
した膜に結合する［¹²⁵Ｉ］ヒトＣＧＲＰに対する代表
的なＣＧＲＰアナログについての競合曲線。各曲線は、
それぞれ２連で行った２〜３の独立した実験を表す。競
合研究において、有効性の順位の順序は、ヒトＣＧＲＰ
（■）＞ヒトＣＧＲＰ（８−３７）（□）＞ヒトアドレ
ノメジュリン（ＡＤＭ）（●）＞＞＞＞サケカルシトニ
ン（ｓＣＴ）（○）、ヒトカルシトニン（ｈＣＴ）
（△）、ヒトアミリン（＊）、ブタ血管作用性腸ポリペ
プチド（ＶＩＰ）（田）、およびサケカルシトニン（８
−３２）（ｓＣＴ（８−３２））（▲）であった。これ
らの結果は、本ＣＧＲＰレセプターが天然のＣＧＲＰレ
セプターと類似した薬理学的プロフィールを有すること
を示す。

【図１０Ａ】図１０Ａは、ヒトカルシトニンレセプター
ポリペプチド（下段）に対するＣＧＲＰレセプターポリ
ペプチド（上段）のアミノ酸配列比較を示す図である。
これはアミノ酸レベルで７２％の類似性および５５％の
同一性を示す。

【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ヒトカルシトニンレセプター
ポリペプチド（下段）に対するＣＧＲＰレセプターポリ
ペプチド（上段）のアミノ酸配列比較を示す図であり、
図１０Ａの続きである。これはアミノ酸レベルで７２％
の類似性および５５％の同一性を示す。

【図１１Ａ】図１１Ａは、ラットカルシトニン様レセプ
ター（下段）に対するＣＧＲＰレセプターポリペプチド
（上段）のアミノ酸配列比較を示す図である。これはア
ミノ酸レベルで９１％の同一性を示す。

【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ラットカルシトニン様レセプ
ター（下段）に対するＣＧＲＰレセプターポリペプチド
（上段）のアミノ酸配列比較を示す図であり、図１１Ａ
の続きである。これはアミノ酸レベルで９１％の同一性
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (71)出願人 502039056 スミスクライン ビーカム アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19406 −0939， キング オブ プラシア， ピ ー．オー．ボックス 1539， スウェデラ ンド ロード 709 (72)発明者 ジョン アダモウ アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19087, セント デイビッズ， アイベン アベ ニュー 258−３ディー (72)発明者 ナンビ アイヤール アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19312, バーウィン， ラッドビル サークル 1430 (72)発明者 ダーク バーグスマ アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19312, バーウィン， アイリッシュ ロード 271 (72)発明者 ナビル エルショアバジー アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19380, ウエスト チェスター， ボウツリー ドライブ 1648 (72)発明者 リ イ アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザースバーグ， ホワード ランデ ィング ドライブ 16125 (72)発明者 ノーマン エイチ． リー アメリカ合衆国 メリーランド 21163, ウッドストック， ウェザーバーン ロ ード 10344 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 DA03 DA06 EA04 GA11

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドあ
   るいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは
   誘導体をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号７５８２４に含有されるｃＤＮ
   Ａによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチ
   ド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナロ
   グ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド、から
   なる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。