JP2002214232A

JP2002214232A - 選択結合性物質固定化フィルム及びそれを用いた被検物質の測定方法

Info

Publication number: JP2002214232A
Application number: JP2001005285A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Tsunekawa; 哲也恒川; Takashi Mimura; 尚三村; Hiroshi Nagai; 啓史長井
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2001-01-12
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2002-07-31

Abstract

(57)【要約】【課題】測定結果を正確かつ迅速に読みとることに適
した、被検物質の測定に用いられる、核酸等の選択結合
性物質を固定化したフィルム及びそれを用いた被検物質
の測定方法を提供すること。【解決手段】選択結合性物質を固定化した領域が１ｃ
ｍ^２あたり１個以上、１００個未満の密度で複数形成さ
れているフィルムであって、フィルム表面の中心線表面
粗さが１ｎｍ以上、１５０ｎｍ未満である、選択結合性
物質固定化フィルムを提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、選択結合性物質固
定化フィルム及びそれを用いた被検物質の測定方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】近年、各種生物におけるゲノムプロジェ
クトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多
数の核酸、蛋白、糖鎖などのポリマーが急速に明らかに
されつつある。配列の明らかにされたポリマーの機能に
ついては、各種の方法で調べることができるが、その有
力な方法の一つとして、明らかにされたポリマー配列情
報を利用して生体機能発現との関係を調べることが進め
られている。

【０００３】しかし、極めて多数の遺伝子から構成され
る複雑な反応系全体からみると、遺伝子の総合的・系統
的解析を行うことは困難である。そこで、マイクロアレ
イ又はチップと呼ばれる平面基板片上に、多数の核酸が
高密度に整列固定化されたものが用いられることにより
総合的・系統的解析が進められている。多数かつ複雑な
反応系の解析を行うためには、測定の高速化、高感度化
の開発が重要な位置づけにある。

【０００４】このような方法の具体的例としては、例え
ば研究対象細胞の発現生体成分等を蛍光色素等で標識し
たサンプルを平面基板片上で相互作用させ、その箇所を
蛍光色素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読み
とる方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞ
れの生体成分量を迅速に推定できる。即ち、この新しい
方法の本質は、基本的には反応試料の微量化と、その反
応試料を再現性よく多量・迅速・系統的に分析、定量し
うる形に配列・整列する技術との統合である。

【０００５】核酸を基板上に固定するための技術として
は、ナイロンメンブレン等の上に高密度に固定化する方
法の他、更に密度を高めるため、ガラス等の基板の上に
ポリリジン等をコーティングして固定化する方法、核酸
を固定化した繊維を束ねて三次元構造体としての繊維束
を作成し、切片化プロセスを経て二次元配列体を得る方
法、あるいはシリコン等の基板の上に短鎖の核酸を直接
固相合成していく方法などが開発されている。しかし、
従来の手法は、いずれも核酸を高密度に固定化すること
を基本思想としているため、一般に核酸のスポット径が
小さく、複数の核酸が隣接するため、検出精度を高めに
くく、再現性の良いデータが必ずしも得られないという
問題があった。この問題は核酸の鎖長が長い場合により
顕著であった。また、シート法においてスポット密度を
低くした場合、ハイブリダイゼーション反応を進行させ
る際に多量の検体溶液が必要になるため検査効率が悪化
するという問題があり、スポット密度を低くした場合で
も、検体溶液を核酸に効率良く接触させ、ハイブリダイ
ゼーションを効率良く行う手法が確立されていなかっ
た。

【０００６】高解像度解析装置で高速に読みとるために
は、例えば宝酒造株式会社製ＤＮＡチップ解析装置Ｇ
ＭＳTM４１８ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒのように、基
板表面で励起放射光を走査させて標識材料からの蛍光を
検出する方法が採られており、基板の形状としては一般
的には四角形で、その上を効率よく、高速に励起放射光
を走査することが工夫されている。しかし、このような
検出方法においても、前記のように核酸を高密度に固定
化していることに起因する検出エラーの発生を克服でき
ていないのが当該分野の現状である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、測定結果を正確かつ迅速に読みとることに適した、
被検物質の測定に用いられる、核酸等の選択結合性物質
を固定化したフィルム及びそれを用いた被検物質の測定
方法を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の如
き課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた。その結果、中
心線表面粗さが１ｎｍ以上、１５０ｎｍ未満であるフィ
ルム上に、選択結合性物質を固定化した領域が１ｃｍ^２
あたり１個以上、１００個未満の密度で複数形成するこ
とにより、上記目的を達成することができることを見出
し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、選択結合性物質を固
定化した領域が１ｃｍ^２あたり１個以上、１００個未満
の密度で複数形成されているフィルムであって、フィル
ム表面の中心線表面粗さが１ｎｍ以上、１５０ｎｍ未満
である、選択結合性物質固定化フィルムを提供する。ま
た、本発明は、前記本発明のフィルム上に固定化された
選択結合性物質を、標識化された被検物質と接触させる
工程と、固定化物質と被検物質を相互作用させる工程
と、フィルムを走行させ、標識材料からの信号を検出す
る工程を含む被検物質の測定方法を提供する。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、支持体として用いられるフィルムは、
有機または無機材料からなるフィルムであれば、如何な
るフィルムでも良いが、入手簡便性、コストの観点か
ら、有機高分子からなるフィルムが好ましい。具体的に
は、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフ
タレート、ポリエチレン−２，６−ナフタレート、ポリ
シクロヘキサンテレフタレートなどのポリエステル系フ
ィルム、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１２等の
ナイロン系フィルム、ポリエチレン、ポリプロピレン等
のポリオレフィン系フィルム、ポリフェニレンスルフィ
ド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリ芳香族アミ
ド、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン等
のエンプラ系フィルム、液晶ポリマー系フィルムおよび
ポリ乳酸などの生分解ポリマーからなるフィルムが挙げ
られるが、本発明では、熱寸法安定性、コスト等の観点
からポリエステル系フィルムが好ましく、エチレンテレ
フタレートを主成分とするポリエステルフィルムが最も
好ましい。本発明のフィルムは、無延伸でも延伸フィル
ムでも良いが、少なくとも一方向に延伸配向させたフィ
ルムが好ましく、二軸配向フィルムがより好ましい。

【００１１】支持体フィルムの厚みは、特に限定されな
いが、加工性、測定時のフィルムの取扱性の観点から、
１μｍ以上、１ｍｍ以下が好ましい。より好ましいフィ
ルム厚みは、５μｍ以上、２００μｍ以下であり、１０
μｍ以上、１５０μｍ以下が最も好ましい。

【００１２】支持体フィルムの形状は、特に限定されな
いが、テープ状であることが好ましく、テープ状のフィ
ルムを適宜巻取り、また巻出して使用すると、選択結合
性物質の固定化ならびに測定時に有効である。この場
合、テープは巻き取れるように連続的なものであっても
よく、短冊状に不連続であっても良い。テープのサイズ
は幅０．３〜１０ｃｍが好ましく、テープの長さは１０
〜５００００ｃｍが好ましい。

【００１３】選択結合性物質を固定化する、支持体フィ
ルム表面の中心線表面粗さは１ｎｍ以上、１５０ｎｍ未
満であるある。ここでいう「フィルム表面」とは、フィ
ルムの表面と裏面の内、選択結合性物質を固定した側の
フィルム表面全体の平均表面粗さＲａである。表面粗さ
が１ｎｍ未満ではフィルムの滑り性が不十分であるた
め、本発明のフィルム走行時にシワが発生して、標識物
質の検出に支障を来す場合がある。また、フィルムの中
心線表面粗さが１５０ｎｍ以上であると、固定化した選
択結合性物質と標識化された検体を接触させる工程で多
量の検体溶液が必要となり、またテープ状のフィルムを
走行させた時にフィルムの表面突起によって固定化した
選択結合性物質に破損が生じたりするので好ましくな
い。フィルム表面の中心線表面粗さは３ｎｍ以上、５０
ｎｍ未満がより好ましい。

【００１４】フィルムの中心線表面粗さは、無機粒子や
有機粒子をフィルムに添加することにより制御可能であ
る。無機粒子の具体例としては、酸化ケイ素、酸化アル
ミニウム、酸化マグネシウム、酸化チタンなどの酸化
物、カオリン、タルク、モンモリロナイトなどの複合酸
化物、炭酸カルシウム、炭酸バリウムなどの炭酸塩、硫
酸カルシウム、硫酸バリウムなどの硫酸塩、チタン酸バ
リウム、チタン酸カリウムなどのチタン酸塩、リン酸第
３カルシウム、リン酸第２カルシウム、リン酸第１カル
シウムなどのリン酸塩などを用いることができるが、こ
れらに限定されるわけではない。また、これらは目的に
応じて２種以上用いてもかまわない。有機粒子の具体例
としては、ポリスチレンもしくは架橋ポリスチレン粒
子、スチレン・アクリル系およびアクリル系架橋粒子、
スチレン・メタクリル系およびメタクリル系架橋粒子な
どのビニル系粒子、ベンゾグアナミン・ホルムアルデヒ
ド、シリコーン、ポリテトラフルオロエチレンなどの粒
子を用いることができるが、これらに限定されるもので
はなく、粒子を構成する部分のうち少なくとも一部がポ
リエステルに対して不溶の有機高分子微粒子であれば如
何なる粒子でも良い。また有機粒子は、易滑性、フイル
ム表面の突起形成の均一性から粒子形状が球形状で均一
な粒度分布のものが好ましい。本発明のフィルムには、
前記粒子以外に各種添加剤、例えば酸化防止剤、帯電防
止剤、結晶核剤などを本発明の効果が損なわれない程度
の少量であれば添加することができる。上記粒子の粒
径、配合量、形状などは適宜選ぶことが可能であるが、
平均粒子径としては０．０１μｍ以上、３μｍ以下が好
ましく、０．０３μｍ以上、１．０μｍ以下がさらに好
ましい。粒子の添加量は、フィルム全体の重量の０．０
１重量％以上、１０重量％以下が好ましく、０．０３重
量％以上、３重量％以下がさらに好ましい。

【００１５】本発明では、フィルムの構成は単膜、積層
のいずれの構成でも良いが、フィルム中の粒子の粒径、
添加量を適宜変更して、フィルム表裏の表面粗さを制御
する場合には、積層構成を好ましく使用することができ
る。

【００１６】上記支持体フィルム上の複数の領域には、
選択結合性物質が固定されている（選択結合性物質が固
定されている領域を、便宜的に、以下「固定化領域」と
いうことがある）。ここで、「選択結合性物質」とは、
被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物
質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖
類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸
は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。特定の塩基配列を有す
る一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩
基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズし
て結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該
当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラ
グメントやF(ab')₂フラグメントのような、抗体の抗原
結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。
抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に
結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、
「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類
が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、
タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化す
ることもできる。「選択結合性物質」として、特に好ま
しいものは、核酸、抗体及び抗原である。本発明に用い
る選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細
胞などから得られたものでもよい。

【００１７】生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、
公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blinらの
方法（Ｂｌｉｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ．３：２３０３（１９７６））等によ
り、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏ
らの方法（ Favaloro etal., Methods Enzymol.65: 718
(1980)）等により行うことができる。固定化する核酸
としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡ
や染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学
的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成
されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等
を用いることもできる。

【００１８】支持体フィルム上に形成される上記固定化
領域の密度は、１ｃｍ^２あたり１個以上、１００個未満
であり、好ましくは２０個以上、８０個未満である。固
定化領域の密度が１ｃｍ^２あたり１個未満であると検体
溶液と選択結合性物質の接触が難しくなり、また一方、
固定化領域の密度を１ｃｍ^２あたり１００個以上に高く
すると、従来技術同様の問題が露呈し、検出精度・再現
性に問題が生じて本発明の目的を達成できなくなる。

【００１９】固定化領域１個当たりの面積は、検出感
度、検出再現性の観点から、０．００１ｍｍ^２以上、
２．０ｍｍ^２未満であることが好ましく、０．０１ｍｍ
^２以上、１．０ｍｍ^２未満がより好ましく、０．０２ｍ
ｍ^２以上、０．５ｍｍ^２未満が最も好ましい。尚、ここ
で言う面積とは、下記微少凹部を有したフィルムの場合
には、フィルム上面から見た場合の微小凹部の面積であ
る。また、１個の固定化領域の形状は特に限定されず、
円形、楕円形、角形および不定形のいずれの形状であっ
ても良い。また、固定化領域は、例えば図２中の７で示
すように整列して配置することができる。

【００２０】単一の固定化領域には、通常、１種類の選
択結合性物質が固定化されるが、例えば、変異を有する
複数種類の遺伝子を同一の固定化領域に結合させたい場
合等には、単一の固定化領域に複数種類の選択結合性物
質を固定化することも可能である。

【００２１】また、複数の固定化領域に固定される選択
結合性物質は、それぞれ異なる種類の選択結合性物質と
しても、同一の選択結合性物質としても構わない。ま
た、複数の固定化領域のうち、一部の複数の固定化領域
に１種類の選択結合性物質を固定化し、他の一部の複数
の固定化領域に他の１種類の選択結合性物質を固定化す
ることができる。選択結合性物質の種類、順序は位置に
よって限定されるものでない。同一の選択結合性物質を
複数箇所に固定化しておき、測定感度をより高くするこ
とも有効である。

【００２２】本発明では、フィルム表面において、検体
溶液と選択結合性物質の接触を効果的に進行させるため
に、フィルム表面の表面自由エネルギーに分布が形成さ
れるように表面処理することが好ましい。例えば、固定
化領域以外のフィルム表面の親水性を低下させて検体溶
液と接触しにくいようにしておくと、ハイブリダイゼー
ション反応や免疫反応をさせる際に検体溶液と選択結合
性物質が選択的に接触しやすくできるからである。具体
的には、フィルム表面全面を疎水化処理した後、マスク
を使用して選択結合性物質を固定化する部分のみをコロ
ナ処理、火炎処理したり、γ線、電子線、紫外線、レー
ザー、プラズマ等の照射によって表面を改質する方法が
挙げられるが、これらの方法に特に限定されない。ま
た、上記疎水化処理は、オレフィン系、シリコン系、フ
ッ素系などの疎水性表面形成ポリマーを有機溶媒あるい
は水に溶解あるいは分散させた材料をインラインおよび
オフラインで塗布する方法が一般的であるが、疎水性ポ
リマーを共押出法によってフィルム表面を疎水性とする
方法も好ましく用いることができる。ここで、塗布厚み
また積層厚みは０．０１μｍ以上、１０μｍ以下とする
ことが好ましい。疎水化処理後のフィルムの表面自由エ
ネルギーは、検体溶液を選択結合性物質と効果的に接触
させる観点から、４０ｍＮ／ｍ以下にしておくことが好
ましく、３５ｍＮ／ｍ以下がさらに好ましく、３０ｍＮ
／ｍ以下が最も好ましい。また、選択結合性物質を固定
化する位置と固定化しない位置との表面自由エネルギー
の差は、５ｍＮ／ｍ以上、５０ｍＮ／ｍ以下が好まし
く、１０ｍＮ／ｍ以上、３０ｍＮ／ｍ以下がより好まし
い。

【００２３】本発明では、図１Ｂに示すように、選択結
合性物質を効率良く固定するためにフィルム表面に凹型
形状の微少な凹部を形成させておくことが好ましい。フ
ィルム表面にこのような微小凹部を形成しておくと、選
択結合性物質と検体溶液との接触を効果的に進めること
ができ、また、検出工程でフィルムを繰返し走行させる
際にも検体の損傷を抑制し、本発明で目的とするフィル
ムが得られ易くなる。微少凹部の形状は円形、楕円形、
角形および不定形のいずれの形状であっても良く、選択
結合性物質を固定化するに十分な容積を有していれば、
特に限定されない。この場合、図１Ｂに示すように、前
述の表面処理を併用して、選択結合性物質を固定化する
微小凹部以外のフィルム表面を疎水化しておき、検体溶
液に対する親和性を低下させておくと、検体溶液が微少
凹部部分に移動し易くなり、被検物質と選択結合性物質
の接触が効果的に進行するので有効である。フィルムに
微小凹部を作成する方法は特に限定されず、感熱ヘッ
ド、火炎処理による穿孔などの公知の手法を適用でき
る。本発明では、感熱ヘッドでフィルムを一部融解させ
て貫通孔を形成させた穿孔フィルムＢ（図１Ｂにおける
５）を基材フィルムＡ（図１Ｂにおける３）にラミネー
トして熱融着させる方法が好ましい。本手法によれば、
フィルムＡとフィルムＢの表面の滑り性および表面自由
エネルギーを個別に制御しやすく、微少凹部部とそれ以
外のフィルム表面の表面自由エネルギーに差異を付ける
ことが容易であるため有効である。なお、微小凹部の深
さは、特に限定されないが、通常、１〜５０μｍ程度が
好ましい。

【００２４】本発明のフィルムには、固定化領域の近傍
に、適宜、位置情報を記録することができる。この場
合、位置情報は選択結合性物質を固定するフィルム面と
は反対側のフィルム表面でも良く、位置情報は印字、凹
凸など如何なる形態でも構わない。このような位置情報
を記録しておくと、その固定化領域に何が固定化されて
いるのかが判定できる。

【００２５】支持体フィルムの表面は、無処理の状態で
そのまま用いてもよいが、必要に応じて、図１Ａに示す
ように、表面処理を施すのが好ましい。例えば、反応性
官能基を表面に導入したフィルムであってもよく、ま
た、プラズマ処理やγ線、電子線などの放射線処理を施
したフィルムであってもよい。これらフィルムに選択結
合性物質を固定する場合には、フィルムと選択結合性物
質との間における各種化学的又は物理的な相互作用、す
なわちフィルムが有している官能基と、選択結合性物質
を構成する成分との間の化学的又は物理的な相互作用を
利用することができる。

【００２６】選択結合性物質の支持体フィルム上への固
定は、公知の方法により行うことができ、適宜、位置決
めして選択結合性物質を固定できる。無修飾の選択結合
性物質をフィルムに固定する場合には、選択結合性物質
とフィルムとを作用させた後、ベーキングや紫外線照射
により固定できる。後述の実施例では、この方法により
ＤＮＡをポリエチレンテレフタレート(PET)に固定して
いる。また、アミノ基で修飾された選択結合性物質をフ
ィルムに固定する場合には、グルタルアルデヒドや１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド(EDC)等の架橋剤を用いてフィルムの官能基と結
合させることができる。選択結合性物質を含む試料をフ
ィルムに作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好まし
く、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５
分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。

【００２７】本発明では、選択結合性物質をそのままフ
ィルムに固定化してもよく、また、選択結合性物質に化
学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変性させた核
酸を固定化してもよい。核酸の化学的修飾には、アミノ
化、ビオチン化、ディゴキシゲニン化等が知られており
[Current Protocols In Molecular Biology, Ed.; Fred
erick M. Ausubel et al.(1990)、脱アイソトープ実験
プロトコール(1)ＤＩＧハイブリダイゼーション（秀潤
社）]、本発明ではこれらの修飾法を採用することがで
きる。一例として、核酸へのアミノ基導入に関して説明
する。アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本鎖核酸
との結合位置は特に限定されるものではなく、核酸の
５'末端または３'末端のみならず核酸の鎖中（例えば、
リン酸ジエステル結合部位または塩基部位）であっても
よい。この一本鎖核酸誘導体は、特公平3-74239号公
報、米国特許4,667,025号、米国特許4,789,737号等に記
載の方法にしたがって調製することができる。この方法
以外にも、例えば、市販のアミノ基導入用試薬［例え
ば、アミノリンクII（商標名）；ＰＥバイオシステムズ
ジャパン社、Amino Modifiers（商標名）；クロンテッ
ク社］などを用いて、又はＤＮＡの５'末端のリン酸に
アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知の方
法（Nucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983) ）にした
がって調製することができる。

【００２８】上述の方法により得られた選択結合性物質
固定化フィルムは、選択結合性物質を固定した後、適当
な処理をすることができる。例えば、熱処理、アルカリ
処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定され
た選択結合性物質を変性させることもできる。あるい
は、細胞、菌体などの生体材料から得られた選択結合性
物質を使用する場合は、不要な細胞成分などを除去して
もよい。そして、処理後のフィルムを選択結合性物質の
検出材料として用いることができる。なお、これらの処
理は別々に実施してもよく、同時に実施してもよい。ま
た、選択結合性物質を含む試料をフィルムに固定する前
に適宜実施してもよい。

【００２９】選択結合性物質を固定化した本発明のフィ
ルムは、固定化された選択結合性物質をプローブとして
被検物質と相互作用させることにより、検体中の特定の
被検物質を検出することができる。２種類の被検試料に
対して、下記に示す標識化（区別が付くように）を行
い、その差異を比較することもできる。

【００３０】相互作用した選択結合性物質を含む被検物
質の検出には、相互作用を特異的に認識することができ
る公知の手段を用いることができる。例えば、検体中の
選択結合性物質に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソ
トープなどの標識体を作用させ、この標識体を検出する
ことができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法
等に関しては、何ら制限されることはなく、従来公知の
各種手段を用いることができる。

【００３１】さらに、本発明は、フィルム上に固定化さ
れた選択結合性物質を、標識化された被検物質と接触さ
せる工程と、固定化物質と被検物質を相互作用させる工
程と、フィルムを走行させ、標識材料からの信号を検出
する工程を含む被検物質の測定方法をも提供するもので
あるが、これらの各工程で、適宜フィルムを走行させる
場合に本発明で開示するフィルムが有効である。各工程
でフィルムを移動走行させる速度は特に限定されず、例
えば検出工程でフィルムを走行させる速度は検出器の速
度応答限界以内であれば構わない。本発明におけるフィ
ルム走行速度は、各工程でのトラブル発生防止と検査効
率アップを両立する観点から、１ｍ／分〜１０００ｍ／
分が好ましく、５ｍ／分〜１００ｍ／分がより好まし
い。

【００３２】本発明の方法に供せられる被検物質として
は、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺
伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原
性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する
抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるも
のではない。また、これらの被検物質を含む検体として
は、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織
液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙
げることができるがこれらに限定されるものではない。
また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法によ
り抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型とし
て、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであっ
てもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させ
ることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場
合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の
存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識するこ
とが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合
には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識
してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合
性物質と結合させた後、フィルムを洗浄し、該抗原又は
抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応さ
せ、フィルムに結合した標識を測定することもできる。
このように、被検物質と特異的に結合する標識化物質を
後から反応させて被検物質を標識する場合も、結果的に
被検物質が標識されているのと同じことになるから、本
発明で言う「標識化された被検物質」に含めて解釈す
る。

【００３３】フィルムに固定化された選択結合性物質に
標識材料を付加した被検物質を接触させる方法は特に限
定されないが、本発明では検体溶液を塗布した後、カバ
ーシートやフィルムをラミネートし、選択結合性物質と
検体溶液を接触させる方法を適用するのが有効である。
検出溶液を本発明のフィルムに塗布する方法としては、
ダイコーター、バーコーター、ロールコーター、ディッ
プコーター、ナイフコーター、液だまりへの接触など、
公知の塗布方法を適用することができるが、本発明で
は、図３または図４に示すような高精度マイクロシリン
ジポンプを具備したコーティングダイによる塗布が少量
の検出溶液を無駄なく均一に塗布する観点で好ましい。
本発明では、図３または図４に示した枚葉型または連続
型塗工装置に公知のラミネート装置を組み合わせて、検
体溶液を塗布した直後にラミネートすることも好ましく
行うことができる。なお、図３及び図４中、８は選択結
合性物質固定化フィルム、９は高精度マイクロシリンジ
ポンプ、１０はコーティングダイ、１１は移動テーブ
ル、１２は巻出リール、１３は巻取リールを示す。

【００３４】固定化物質と被検物質を相互作用させる工
程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及
び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反
応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜
選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、
通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜数時間、免疫反応
の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間
程度である。

【００３５】標識材料には、例えば蛍光材料を用いるこ
とができる。この蛍光材料の励起波長の励起放射光を用
いることにより、高感度な検出が得られる。２種類以上
の蛍光材料を用いても構わない。この場合、励起放射光
もそれぞれに合わせた波長の光を用いることが望まし
い。

【００３６】また、本発明では、検出精度を高めるため
に、核酸のハイブリダイゼーションの前に、プレハイブ
リダイゼーション、すなわち、非特異的な吸着を抑える
ために検体とは異なるＤＮＡを入れてハイブリダイゼー
ションと同様なことを適宜行うこともできる。

【００３７】上記方法により、固定化された選択結合性
物質と選択的に結合する核酸や抗体、抗原等の被検物質
を測定することができる。すなわち、選択結合性物質と
して核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部
と相補的な配列を相補的な配列を有する核酸を測定する
ことができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗
原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応
する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明
細書でいう「測定」には検出と定量の両者が包含され
る。

【００３８】物性の評価方法１．中心線平均表面粗さＲａ（株）小坂研究所製の高精度薄膜段差計ＥＴ−１０を用
いて、測定してＪＩＳＢ０６０１に準じて中心線平均表
面粗さ（Ｒａ）を求めた。触針先端半径０．５μｍ、針
圧５ｍｇ、測定長１ｍｍ、カットオフ０．０８ｍｍとし
た。単位はｎｍで示す。

【００３９】２．表面自由エネルギーＪＩＳＫ−６７８８に従って測定した。単位はｍＮ／
ｍで示す。

【００４０】

【実施例】本発明を以下の実施例によって更に詳細に説
明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的
範囲が限定されるものではない。

【００４１】参考例１ここではＰＥＴによる基材フィルムの製法を示す。ポリ
エチレンテレフタレート（ＰＥＴ）（固有粘度０．６
５、平均粒径０．３μｍの球状架橋ポリスチレン粒子
０．２５重量％配合）を１８０℃で３時間真空乾燥し、
２８０℃に加熱された押出機に供給し、Ｔダイよりシー
ト状に吐出させた後、表面温度２５℃の冷却ドラム上に
静電気力で密着させて冷却固化し、未延伸フィルムを得
た。

【００４２】次いで、この未延伸フィルムを、加熱され
た複数のロール群からなる縦延伸機を用い、ロールの周
速差を利用して、９５℃の温度でフィルムの縦方向に
３．５倍の倍率で延伸した。その後、フィルムの両端部
をクリップで把持して、テンターに導き、延伸温度１０
０℃、延伸倍率３．７倍でフィルムの幅方向に延伸し、
２２５℃の温度で熱処理を行った。引き続いて、１００
℃にコントロールされた冷却ゾーンで幅方向に１％弛緩
処理を施した後、室温まで冷却し、フィルムエッジを除
去し、巻き取った。フイルム厚みは押出量を調節して７
５μｍとした。ここで得られたフィルムの中心線表面粗
さは１０ｎｍであった。

【００４３】参考例２長手方向に延伸したフィルムに、空気中でコロナ放電処
理を施し、その処理面に三井化学社製ポリオレフィン水
性ディスパージョン（ケミパールＭ−２００）の水溶
液（固形分濃度３％）を最終フィルム状態での積層厚み
が０．１μｍとなるように塗布した後に幅方向に延伸す
る以外は参考例１と同様に製膜し、フィルムの片面を疎
水化処理した厚み７５μｍの二軸配向フィルムを得た。
次いで、ＤＮＡ固定部を開孔部として有するマスクを使
用して、疎水化したフィルム表面をコロナ放電処理し
て、ＤＮＡ固定部を親水化した。ここで得られたフィル
ムの中心線表面粗さは１２ｎｍであった。また、疎水化
したフィルム表面の表面自由エネルギーは３８ｍＮ／ｍ
であり、フィルム表面の疎水部とＤＮＡ固定部の表面自
由エネルギー差は１２ｍＮ／ｍであった。

【００４４】参考例３ここではフィルムの片面を疎水化処理した穿孔フィルム
の製法を示す。ＰＥＴとポリエチレンイソフタレート
（ＰＥＴ／Ｉ）共重合体（ガラス転移点７５℃、融点２
１５℃、共重合比８０／２０、平均径０．８μｍの凝集
シリカを０．２重量％配合）のペレットを１２０℃で３
時間真空乾燥して予備結晶化した後、１８０℃で３時間
真空乾燥し、２７０℃に加熱された押出機に供給し、Ｔ
ダイよりシート状に吐出した。さらにこのシートを表面
温度２５℃の冷却ドラム上に静電気力で密着させて冷却
固化し、未延伸キャストフィルムを得た。次いで、この
未延伸フィルムを加熱された複数のロール群に導き、９
５℃の温度で長手方向に延伸し、空気中でコロナ放電処
理を施し、その処理面に三井化学社製ポリオレフィン水
性ディスパージョン（ケミパールＭ−２００）の水溶
液（固形分濃度３％）を最終フィルム状態での積層厚み
が０．１μｍとなるように塗布した後、フィルムをクリ
ップで把持してテンターに導き、延伸温度９０℃、延伸
倍率３．７倍でフィルムの幅方向に延伸し、１１０℃の
温度で熱処理を行った後、室温まで冷却し、フィルムエ
ッジを除去し、フイルム厚み２５μｍの二軸配向フィル
ムを得た。次いで、ここで得た二軸配向フィルムを印加
エネルギー０．３０ｍＪのサーマルヘッドにより穿孔し
て、孔径０．５ｍｍφの貫通孔を７０個／ｃｍ２の密度
で有する穿孔フィルムを得た。ここで得られたフィルム
の中心線表面粗さは３５ｎｍであり、疎水化した表面の
表面自由エネルギーは３７ｍＮ／ｍであった。

【００４５】実施例１まず参考例２のフィルムを用いてＤＮＡを固定化した。
それぞれ市販されているＤＮＡ溶液Ａ（ヒトβアクチン
遺伝子）、Ｂ（ヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水酵
素）、Ｃ（ヒトインターフェロン−β遺伝子）、Ｄ（ヒ
トインターロイキン−６遺伝子）、Ｅ（ヒトインターロ
イキン−８遺伝子）（各溶液中のＤＮＡ濃度：１mg/m
l）を９５℃で３分間熱処理後、宝酒造（株）製ＤＮＡ
チップ作製装置ＧＭＳTM４１７Ａｒｒａｙｅｒを用
いて、１０個ずつスポッティングした。この際のＤＮＡ
固定化領域は１ｃｍ^２あたり７０個で、大きさは０．２
５ｍｍφとし、参考例２記載の親水化処理した位置に合
わせて規則的にＤＮＡを固定化した。その後、空気中で
乾燥し、スポッティングしたＤＮＡの位置が０．５ｍｍ
φの開口部に一致するようにフォトマスクを充てて紫外
線を照射することにより、ＤＮＡサンプルを固定した。
ここで得られたＤＮＡ固定化フィルムのＤＮＡ固定側の
表面の中心線表面粗さは１２ｎｍであった。

【００４６】一方、２種類の核酸蛍光標識化試薬Ｃｙ３
およびＣｙ５を用いて、ＤＮＡ溶液Ａの相補配列とＤの
相補配列を持つＤＮＡを標識化した。これらの標識化Ｄ
ＮＡを検体溶液とし、高精度マイクロシリンジポンプを
具備したコーティングダイを使用して、前記フィルムに
検体溶液を厚み１０μｍの厚さで塗布し、その後、続い
て、厚み５０ミクロンのポリエステル製カバーフィルム
をラミネートした。その後、このフィルムを６５℃、４
時間放置し、固定化選択結合性物質と検体試料をハイブ
リダイゼーションさせた後、カバーシートを取り除き、
フィルム表面を洗浄バッファーにより室温で数回洗浄
し、乾燥させた。

【００４７】このようにして得たフィルムを波長５３３
ｎｍおよび６３５ｎｍのレーザーヘッドを有するドライ
ブ（測定装置）にレーザー光が表面側になるように挿入
し、１０ｍ／分の速度でフィルムを走行させながら、固
定化領域からの蛍光強度を検出、測定した。

【００４８】得られた各蛍光強度の結果をデータ処理し
たところ、Ａの相補配列のＤＮＡは固定化Ａと、Ｄの相
補配列のＤＮＡは固定化Ｄと結合することを解析でき
た。従来一般的な四角形のチップ、ヘッド走査型の測定
方法に比べ、検出再現性が良好であり、測定時間はほぼ
半減し、感度も所望の位置を繰り返し積算する等により
３倍程度向上する。

【００４９】実施例２まず参考例１の基材フィルムの片面を窒素ガスを注入し
ながらプラズマ放電処理した。次いで、この表面処理し
たフィルム面に参考例３の穿孔フィルムを重ねてラミネ
ートし、その後、１２０℃で１分間処理して熱融着さ
せ、微少穿孔部を有するフィルムを得た。ここで、穿孔
フィルムの非疎水化処理面と基材フィルムのプラズマ処
理面をラミネート面とした。

【００５０】次いで、ここで得られたフィルムにＤＮＡ
を実施例１と同様に固定化した。市販のＤＮＡ溶液Ａ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを熱処理後、宝酒造（株）製ＤＮＡチッ
プ作製装置ＧＭＳTM４１７Ａｒｒａｙｅｒを用い
て、１０個ずつスポッティングした。この際のＤＮＡ固
定化位置は、実施例１と同様、１ｃｍ^２あたり７０個
で、大きさは０．２５ｍｍφとし、微少凹部にＤＮＡを
スポッティングし、その後、空気中で乾燥し、紫外線を
照射することによりＤＮＡを固定した。ここで得られた
ＤＮＡ固定化フィルムのＤＮＡ固定化側の表面の中心線
表面粗さは４０ｎｍであった。

【００５１】その後、実施例１同様に標識化したＤＮＡ
を検体溶液とし、高精度マイクロシリンジポンプを具備
したコーティングダイを使用して、前記フィルムに検体
溶液を厚み１０μｍの厚さで塗布し、その後、続いて、
厚み５０ミクロンのポリエステル製カバーフィルムをラ
ミネートした。その後、このフィルムを６５℃、４時間
放置し、固定化ＤＮＡと検体試料をハイブリダイゼーシ
ョンさせた後、カバーシートを取り除き、フィルム表面
を洗浄バッファーにより室温で数回洗浄し、乾燥させ
た。

【００５２】このようにして得たフィルムを実施例１同
様に固定化領域からの蛍光強度を検出、測定した。得ら
れた各蛍光強度の結果をデータ処理したところ、Ａの相
補配列のＤＮＡは固定化Ａと、Ｄの相補配列のＤＮＡは
固定化Ｄと結合することが解析できた。従来一般的な四
角形のチップ、ヘッド走査型の測定方法に比べ、検出再
現性が極めて良好であり、測定時間はほぼ半減し、感度
も所望の位置を繰り返し積算する等により約１０倍程度
向上する。

【００５３】比較例１、２フィルムに粒子を添加しないこと以外は参考例２と同様
に二軸配向フィルムを作成し、その後、実施例１と同様
の方法でＤＮＡを固定化して中心線表面粗さが０．４ｎ
ｍのＤＮＡ固定化フィルムを得た（比較例１）。また、
フィルムに添加する粒子の量を１１重量％に設定する以
外は、参考例２と同様に二軸配向フィルムを作成し、そ
の後、実施例１と同様の方法でＤＮＡを固定化して中心
線表面粗さが１６０ｎｍのＤＮＡ固定化フィルムを得た
（比較例２）。

【００５４】ここで得られたＤＮＡ固定化フィルムを使
用して、実施例１同様に、検体溶液と接触させ、ハイブ
リダイゼーションさせた場合、比較例１では、検出時に
シワが発生して検出精度が低下し、実施例１で得られた
効果が確認できなくなった。また比較例２では、多量の
検体溶液が必要となり、ハイブリダイゼーション反応の
効率が低下して検出感度が低下した。

【００５５】比較例３，４ＤＮＡ固定化領域の密度を１ｃｍ^２あたり、０．５個ま
たは１２０個とする以外は実施例２と同様にＤＮＡの固
定化、検体溶液との接触および相互作用、および標識物
質の検出を行った。ＤＮＡ固定化の密度が本発明の範囲
を外れる本比較例の場合には、検出の感度が低下して測
定時間も長くなり、実施例２で得られた検出感度が全く
得られなくなった。

【００５６】

【発明の効果】本発明の選択結合性物質固定化フィルム
は、検体との接触および相互作用を効果的に実施可能と
するものであり、励起放射光の下でフィルムを走行させ
て標識物質を検出する上でも有効である。本発明で開示
するフィルムおよびこれを用いた検出方法は、検体中の
被検物質の種類および量を高精度、高感度、高効率で測
定可能とするものであり、各種被検物質の検出および遺
伝子診断分野等において工業的価値が高く、当該分野に
おいて大いに活用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の好ましい実施態様の一例を模式的に示
す図（フィルム断面図、固定化選択結合性物質は一部分
のみを例示）

【図２】本発明の好ましい実施態様の一例を模式的に示
す図（フィルム断面図、固定化選択結合性物質は一部分
のみを例示）

【図３】本発明に用いられる好ましい枚葉型塗工装置の
一例を模式的に示す図

【図４】本発明の好ましい連続型塗工装置の一例を模式
的に示す図

【符号の説明】

１放射励起光２固定化選択結合性物質３フィルムＡ（基板フィルム）４表面処理層Ａ５フィルムＢ（穿孔フィルム）６表面処理層Ｂ７選択結合性物質固定化領域８選択結合性物質固定化フィルム９高精度マイクロシリンジポンプ１０コーティングダイ１１移動テーブル１２巻出リール１３巻取リール

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ｄ４Ｂ０６３ 33/543 ５０１ 33/566 33/566 35/02 Ｆ 35/02 35/04 Ｆ 35/04 37/00 １０２ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者長井啓史滋賀県大津市園山一丁目１番１号東レ株式会社滋賀事業場内Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 DA05 EA01 FA01 GA07 GB21 HA01 KA02 KA09 LA01 2G054 AA06 CA22 CE01 EA03 GA03 GA05 GE02 2G058 AA09 CC12 EA11 GA02 4B024 AA19 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB15 BB17 BB20 CC03 CC08 CC11 FA12 FA15 4B063 QA01 QA13 QA17 QA18 QA19 QQ42 QQ52 QQ79 QR32 QR35 QR38 QR48 QR56 QR84 QS33 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】選択結合性物質を固定化した領域が１ｃ
ｍ^２あたり１個以上、１００個未満の密度で複数形成さ
れているフィルムであって、フィルム表面の中心線表面
粗さが１ｎｍ以上、１５０ｎｍ未満である、選択結合性
物質固定化フィルム。
【請求項２】前記選択結合性物質が、核酸、タンパク
質、糖類又は抗原性化合物である請求項１記載のフィル
ム。
【請求項３】前記選択結合性物質が、核酸、抗体又は
抗原である請求項２記載のフィルム。
【請求項４】前記選択結合性物質を固定化した領域１
個当たりの面積が、0.001 mm²以上、2.0 mm²未満である
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のフィルム。
【請求項５】前記選択結合性物質を固定化した領域１
個当たりの面積が、0.01 mm²以上、1.0 mm²未満である
請求項４記載のフィルム。
【請求項６】フィルム表面の表面自由エネルギーに分
布がある請求項１ないし５のいずれか１項に記載のフィ
ルム。
【請求項７】前記選択結合性物質を固定化した領域
が、該領域以外の部分に比べて親水性が高い請求項６記
載のフィルム。
【請求項８】前記選択結合性物質を固定化した領域
が、凹型に形成されている請求項１ないし７のいずれか
１項に記載のフィルム。
【請求項９】選択結合性物質を固定化した複数の領域
のそれぞれには１種類ずつの選択結合性物質が固定化さ
れ、フィルム全体で複数の選択結合性物質が固定化され
ている請求項１ないし８のいずれか１項に記載のフィル
ム。
【請求項１０】請求項１ないし９のいずれか１項に記
載のフィルム上に固定化された選択結合性物質を、標識
化された被検物質と接触させる工程と、固定化物質と被
検物質を相互作用させる工程と、フィルムを走行させ、
標識材料からの信号を検出する工程を含む被検物質の測
定方法。
【請求項１１】前記標識材料は、蛍光物質であり、前
記信号の検出は、フィルムに励起放射光の下を走行させ
て行う請求項１０記載の方法。
【請求項１２】固定化物質と、標識化された被検物質
を接触させる工程は、被検物質を含む液をコーターによ
り前記フィルム上に塗布することにより行われる請求項
１０又は１１記載の方法。