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JP2002540176A - 自己骨髄の心筋内注入 - Google Patents

自己骨髄の心筋内注入

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JP2002540176A
JP2002540176A JP2000607671A JP2000607671A JP2002540176A JP 2002540176 A JP2002540176 A JP 2002540176A JP 2000607671 A JP2000607671 A JP 2000607671A JP 2000607671 A JP2000607671 A JP 2000607671A JP 2002540176 A JP2002540176 A JP 2002540176A
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autologous bone
stimulated
injected
autologous
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Abstract

(57)【要約】 心臓または心筋の状態を治療する方法は、有効量の自己骨髄の投与を含む。骨髄は、任意的に刺激され、および／または、脈管形成増殖因子の骨髄製造を増大させ、および／または内皮細胞の増殖もしくは移動もしくは血管形成を促進することができる薬剤、タンパク質、遺伝子もしくは他の因子または治療と組合せて、投与されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自己骨髄の注入法に関する。より詳細には、本発明は、側副枝血管
形成および組織灌流を増すための自己骨髄の心筋内注入に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】
組換え遺伝子または増殖因子を使用して心筋側副枝血管機能を高めることは、
心臓血管の疾患の治療への新たなアプローチを示し得る。コルノウスキー(Korno
wski)ら、「治療上の心筋脈管形成のためのデリバリー手法(Delivery strategie
s for therapeutic mycocardial angiogenesis)」、Circulation 2000; 101:454
-458。概念の証明は、心筋虚血の動物モデルで証明され、臨床上の試みが進行中
である。アンガー(Unger),E.F.ら、「基本線維芽細胞増殖因子が、イヌモデルに
おいて心筋側副枝流を増大させる(Basic fibroblast growth factor enhances m
yocardial collateral flow in a canine model)」, Am J Physiol. 1994; 266:
H1588-1595；バナイ(Banai), S.ら、「イヌにおける脈管内皮増殖因子による、
虚血心筋層への側副枝血流の、脈管形成により誘発された増大(Angiogenic-indu
ced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascu
lar endothelial growth factor in dogs)」、Circulation, 1994; 83-2189；ラ
ザラス(Lazarous), D.F.ら、「イヌ心臓における側副枝発生への、基本線維芽細
胞増殖因子の長期間全身投与の効果(Effects of chronic systemic administrat
ion of basic fibroblast growth factor on collateral development in the c
anine heart)」、Circulation, 1995; 91:145-153；ラザラス(Lazarous), D.F.
ら、「基礎的発生および傷害への動脈応答の比較効果(Comparative effects of
basic development and the arterial response to injury)」、Circulation,19
96; 94:1074-1082；ジョルダノ(Giordano), F.J.ら、「線維芽細胞増殖因子-5の
冠状動脈内遺伝子移動は、心臓の虚血領域における血流および収縮機能を増加さ
せる(Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor-5 increases
blood flow and contractile function in an ischemic region of the heart)
」、Nature Med 1996; 2:534-9。血管新生因子のカテーテル経由のデリバリー(t
rans-catheter delivery)のためのほとんどの方法が、冠状動脈内経路を使用し
ていたが、これは、遺伝子またはタンパク質の不正確な局在化および、心臓でな
い組織への全身デリバリーの故に、限界を有し得る。かくして、心臓全体よりむ
しろ、心筋層の正確に規定された領域への血管新生因子または遺伝子の直接デリ
バリーの能力を有し、かつ全身暴露の可能性を最小にすることが望ましい。グジ
マン(Guziman), R.J.ら、「アデノウィルスベクターの直接注入による、心筋層
への有効な遺伝子移動(Efficient gene transfer into myocardium by direct i
njection of adenovirus vectors)」、Circ Res 1993; 73:1202-7：マック(Mack
), C.A.ら、「VEGF-121について相補的デオキシリボ核酸のアデノウィルス仲介
遺伝子移動を用いる生物バイパスは、虚血のブタ心臓における心筋の灌流および
機能を改善する(Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene
transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for VEGF-121, improv
es myocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart)」, J
Thorac Cardiovasc Surg 1998; 115:168-77。
【０００３】 血管新生因子の直接手術内心筋内注入の側副枝機能への効果を、心筋虚血の動
物モデルにおいて研究した。脈管形成ペプチドをエンコードするトランスジーン
を含むアデノウィルスベクターの、開胸の心外膜経由の(transepicardial)投与
は、側副枝機能の増進をもたらした（マック(Mack)ら、前出）。脈管形成はまた
、患者の開胸心臓手術中に、脈管形成ペプチドまたはプラスミドベクターの直接
心筋内注入を用いて生じることが報告された。シュマッカー(Schumacher)B.ら、
「ヒト増殖因子による虚血心筋層における新脈管形成の誘発。冠状動脈心臓疾患
の新しい治療の最初の臨床結果(Induction of neoangiogenesis in ischemic my
ocardium by human growth factors. First clinical results of a new treatm
ent of coronary heart disease)」、Circulation 1998; 97:645-650；ロソルド
(Losordo), D.W.ら、「心筋の脈管形成のための遺伝子治療：心筋虚血のための
単独治療として、ph VEGF165の直接心筋注入を用いた最初の臨床結果(Gene ther
apy for mycocardial angiogenesis: initial clinical results with direct m
yocardial injection of ph VEGF165 as sole therapy for myocardial ischemi
a)」、Circulation 1998; 98:2800。
【０００４】 冠状動脈疾患の患者を治療するための新しい治療様式(modality)として治療的
な脈管形成についての見込みのある希望にもかかわらず、どのような特定の手法
が最適に臨床的に関連のある治療的脈管形成応答を促進するかに関して、なお大
きな欠陥がある。その上、多数の脈管形成増殖因子のうちのどの１つ（またはそ
れ以上）が利益をもたらす脈管形成応答と関連があり得るのか明らかではない。
さらには、最適な脈管形成応答を促進するために、異なる組織デリバリープラッ
トフォーム（例えばタンパク質、アデノウィルスまたは「そのままの(naked)」D
NA）の使用は、未解決のままである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、自己の骨髄を注入して、注入された組織における脈管形成を
促進させる、新規な治療様式を提供することである。 本発明の目的はまた、側副枝血管形成および組織灌流を増進させるための、心
筋内注入の新規な方法を提供することである。 本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の議論においてさらに明らかに
なろう。
【０００６】 最も最近に試験された治療上のアプローチは、虚血組織に送られる単一の脈管
形成増殖因子（例えば、VEGF、FGF、アンジオポエチン-1(angiopoietin-1)）に
焦点を当てた。これは、最終生成物（例えばタンパク質）のデリバリーまたは、
種々のベクターを使用する遺伝子移動によって達成することができる。しかしな
がら、幾つかの増殖因子系の間の複雑な相互作用が、新しい血管の形成の開始お
よび維持のためにおそらく必要であると思われる。より詳細には、新しい血管の
形成および機能を開始し、かつ維持するために、協力して、かつ時間適正な(tim
e-appropriate)やり方で相互作用する種々の脈管形成サイトカインを用いて、特
定の局在化した脈管形成環境を誘発することが重要であると思われる。
【０００７】 骨髄(BM)は、脈管形成プロセスの調節に関係のある、広範囲のサイトカインお
よび細胞の天然の供給源である。したがって、これらの細胞が時間適正な(time-
appropriate)やり方で多くの血管新生因子を分泌する自然能力を利用することに
よる、自己(A)BMの心筋内注入は、虚血心筋層における治療的な側副枝の発達を
達成するために最適な介入を提供すると思われる。
【０００８】 本発明に従い、「自立の」治療剤として、または、脈管形成増殖因子の骨髄製
造を増進することができ、および／または内皮細胞の増殖、移動および血管形成
を促進することができる、任意の薬理学的薬剤、タンパク質もしくは遺伝子もし
くは任意の他の化合物もしくは仲介物と組合せて、自己骨髄が注入される。「合
わせた」剤を、患者または標的組織に直接投与することができ、または骨髄を患
者に注入する前に骨髄と共にイクス ビボ(ex-vivo)でインキュベートすること
ができる。これらの「合わせた」剤の非限定的な例は、顆粒球-単球コロニー刺
激因子(GM-CSF)、単球化学誘引タンパク質-1(MCP-1)および低酸素誘発性因子-1(
HIF-1)である。血管新生因子の骨髄製造を増進することができる仲介物の例は、
骨髄細胞の低酸素へのイクス ビボ(ex-vivo)暴露である。自己骨髄は、単独ま
たは「合わせた」剤と共に、虚血および／または非虚血心筋層への心内膜経由ま
たは心外膜経由のアプローチによって直接に患者に供給するか、または、直接任
意の他の虚血器官（末梢肢を含む）へ供給して、側副枝血管形成の発達および、
したがって、虚血心筋層または虚血肢への側副枝流を増進および／または促進す
ることができる。このアプローチはまた、心臓の筋発生のプロセスによる、新た
に移植された脱分化および／または分化した心筋細胞の発達を促進するために使
用することができる。
【０００９】 本発明は、脈管形成および／または筋発生を促進し、それによって、虚血心筋
層または下方肢への新しい血管の発達を促進するための、種々の自己骨髄移植手
法を含む。本発明の別の態様は、「脈管形成遺伝子発現の最適化」の手法に関す
る。この手法は、HIF-1と自己骨髄との同時投与を使用する。HIF-1は、低酸素に
よって誘発され、活性化されることが知られていて、かつ低酸素への応答に関連
する多数の遺伝子の発現を誘発することが知られている転写因子である。同様の
アプローチは、自己骨髄を内皮のPASドメインタンパク質１(EPAS1)にさらすこと
を含む。EPAS1は、HIF-1と高い構造および機能の相同性を分かつ。この手法はま
た、心臓または任意の末梢の虚血組織への直接注入の前に、骨髄を低酸素にイク
ス ビボ(ex-vivo)でさらして、脈管内皮増殖因子(VEGF)発現または与えられた
脈管形成活性を有する他のサイトカイン（例えばMCP-1）の製造を増加させるこ
とを含む。かくして、本発明は、自己骨髄；刺激された自己骨髄、例えばHIF-1
、EPAS1、MCP-1、MG-CSFまたは、低酸素もしくは他のエネルギー形態、例えば超
音波、RF、電磁気もしくはレーザーエネルギーへの一時の暴露によって刺激され
た自己骨髄；または、ならし培地から誘導された自己骨髄産物（培養した骨髄の
無細胞成分）の直接心筋内（心外膜経由または心内膜経由）または末梢筋肉内注
入を包含する。骨髄の刺激は、骨髄をタンパク質形態の因子に直接さらすことに
よることができるか、または、骨髄細胞を、関連遺伝子を有するベクターを用い
てトランスフェクトすることができる。例えば、骨髄を、HIF-1またはEPAS1トラ
ンスジーンを有する、プラスミドベクターを用いて、またはアデノウィルスベク
ターを用いて、トランスフェクトすることができる。
【００１０】 骨髄は、脈管形成および炎症プロセスの調節に関係のある広範囲のサイトカイ
ンの天然の供給源である。発現されるサイトカインは、初期および後期の造血の
維持に関与することが知られている仲介物（IL-1アルファおよびIL-1ベータ、IL
-6、IL-7、IL-8、IL-11およびIL-13；コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エ
リスロポエチン、幹細胞因子、発作3-リガンド(fit 3-ligand)、肝細胞増殖因子
、腫瘍壊死因子アルファ、白血病阻止因子、形質転換増殖因子ベータ１およびベ
ータ３；およびマクロファージ炎症タンパク質１アルファ）、血管新生因子（線
維芽細胞増殖因子１および２、脈管内皮増殖因子）ならびに、その通常の標的（
および供給源）が結合性組織形成細胞（血小板誘導増殖因子A、表皮増殖因子、
形質転換増殖因子アルファおよびベータ２、オンコスタチン(oncostatin)Mおよ
びインスリン様増殖因子-1）またはニューロン細胞（神経増殖因子）である仲介
物を含む。センセブ(Sensebe), L.ら、Stem Cells 1997; 15:133-43。さらに、V
EGFポリペプチドが血小板および巨核球に存在し、ベータ-トロンボグロブリン(b
eta-thromboglobulin)の放出と共に、活性化された血小板から放出されることが
示された。ワーショバーラ(Wartiovaara), U.ら、Thromb Haemost 1998; 80:171
-5；モール(Mohle), R., Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:663-8。
【００１１】 骨髄機能ならびに、循環に入り、傷の治療および／または虚血の部位に標的を
定め得る造血細胞（幹細胞および前駆細胞を含む）の発達を支持し、ついには、
新しい血管形成に寄与するのに、脈管形成が必要とされるという概念を支持する
指標がまたある。成人ヒト骨髄から分離された未分化の間葉前駆細胞を特異的に
認識するモノクローナル抗体は、発達している微小血管系の細胞表面マーカーを
認識することが示されており、証拠が、そのような細胞が胚の脈管形成において
役割を演じ得ることを示唆する。フレミング(Fleming), J.E., Dev Dyn 1998; 2
12:119-32。
【００１２】 骨髄の脈管形成は、骨髄の脈管形成がヒト多発性骨髄腫細胞の進行と同時に増
加することが示された悪性細胞（例えば多発性骨髄腫）によって骨髄が活性化さ
れている病理学的状態で顕著になり得る。リバッティ(Ribatti), D.ら、Br J Ca
ncer 1999; 79:451-5。さらに、脈管内皮増殖因子(VEGF)は、パラクリンまたは
オートクリンメカニズムによって、造血新生物、例えば多発性骨髄腫の増殖に役
割を演じることが示された。ベラミー(Bellamy), W.T., Cancer Res 1999; 59:7
28-33；フィードラー(Fiedler), W., Blood 1997; 89:1870-5。独特の本来の体
液性および細胞性の特性を有する自己の骨髄は、種々の脈管形成化合物の潜在的
供給源であると思われる。「混合」脈管形成サイトカインのこの天然の供給源は
驚くべきことに、効力のある相互作用性増殖因子の混合物として使用して、治療
的脈管形成および／または筋発生を生じることができ、細胞それ自体の使用は、
これらの天然の脈管形成剤のより持続した供給源を提供し得る。
【００１３】 虚血に応答して脈管形成を開始するのに最も関係しそうな因子の１つは、HIF-
1であり、これは、低酸素に対する応答に関連する幾つかの遺伝子のプロモータ
ーに結合し、かつこれを刺激する、効力のある転写因子である。HIF-1の誘発お
よび活性化は組織pO2によってしっかりと調節され、pO2が減少するにつれて、HI
F-1発現は指数的に増加し、それによって、pO2の減少が、低酸素環境への適応応
答として働く遺伝子産物の発現の増加を引き起こす正のフィードバックの輪を提
供する。HIF-1の活性化は、例えばエリスロポエチン、解糖に関係する遺伝子の
誘発をもたらし、かつVEGFの発現をもたらす。それはまたおそらく、低いpO2濃
度への適応応答に関連する多くの他の遺伝子の発現を調節する。HIF-1が低酸素
への応答に関係するタンパク質の濃度を調節するメカニズムは、低いpO2に応答
する遺伝子の転写調節による。かくして、そのような遺伝子は、HIF-1結合部位
を含むプロモーターまたはエンハンサー領域内に短いDNA配列を有し、低酸素応
答性要素(HRE)と呼ばれる。HIF-1は、サブユニットHIF-1αおよびHIF-1βからな
る、基本のヘリックス-ループ-ヘリックス モティーフを有するヘテロ２量体で
ある。その濃度は、転写かつ転写後の両方で、pO2によって調節される。HIF-1誘
発は低酸素により増加され、その半減期は、pO2濃度が増加するにつれて著しく
減少する。
【００１４】 HIF-1の発現（ヒーラ細胞(HeLa cell)中で測定された）は、指数的にかつ逆比
例してpO2に関連するが、曲線の変曲点は、５％の酸素飽和で生じ、最大活性は0
.5％で、1/2最大活性は1.5〜2.0％で生じることが関連性がある。これらは比較
的低濃度の低酸素であり、そのような濃度は、極端でないレベルの心筋もしくは
下肢の虚血の存在下で、すなわち、組織の壊死なしに存在するレベルで（それぞ
れ心筋の梗塞形成および脚の潰瘍形成）生じるかどうかは明らかでない。かくし
て、骨髄細胞は、血管新生因子を分泌し、それによって側副枝の発達を促進する
能力を有することができる。しかしながら、さらなる刺激が存在しなければ、治
療された特定の組織環境において、そのような活性が明らかになり得ないことが
可能である。したがって、必要なら、骨髄移植片をHIF-1と共に同時投与するこ
とが、本発明の好ましい態様である。HIF-1が、骨髄移植片に存在する多くの低
酸素誘発性脈管形成遺伝子の最適発現を与えることが予想される。HIF-1は、タ
ンパク質として、または遺伝子として注入することができる。後者の場合には、
プラスミドもしくはウィルスベクターで、または、機能的に関連するタンパク質
濃度をもたらす任意の他のやり方で、注入することができる。例えば、骨髄は、
HIF-1またはEPAS1トランスジーンを有するプラスミドベクターを用いて、または
アデノウィルスベクターを用いて、イクス ビボ(ex-vivo)でトランスフェクト
することができる。しかしながら、HIF-1は、骨髄による脈管形成物質の製造を
増進することができる仲介物の例として、この節で使用されることが強調される
。本発明はまた、HIF-1活性を増大させる（すなわち、その半減期を延長する）
ことにより、またはHIF-1と同様の効果を生じることにより、骨髄を刺激して血
管新生因子の発現を増加させる他の剤の使用を包含する。同様のアプローチは、
自己骨髄を内皮PASドメインタンパク質(EPAS1)にさらすことを含む。EPAS1は、H
IF-1と高い構造および機能の相同性を分かつ。
【００１５】 VEGFプロモーター活性はHIF-1により高められるので、本発明はまた、培養骨
髄をイクス ビボ(ex-vivo)で、低酸素または他のエネルギー形態、例えば超音
波、RFまたは電磁気エネルギーにさらすことを含む。この仲介物は、VEGFおよび
他の遺伝子発現を増加させる。この効果によって、骨髄が脈管形成を刺激する能
力を増加することができる。
【００１６】 本発明の別の態様は、HIF-1（または、HIF-1の効果を増加させるか、もしくは
骨髄へのHIF-1と同様の効果を生じる生成物）による、吸引された自己骨髄のイ
クス ビボ(ex-vivo)刺激または、骨髄を低酸素へ直接暴露し、次いで活性化さ
れた骨髄細胞を虚血心筋層または末梢器官（例えば虚血肢）へ供給して、心臓お
よび／または末梢虚血組織における側副枝依存性灌流を増大させることを包含す
る。骨髄の刺激は、骨髄をタンパク質の形態の因子に直接さらすことによること
ができ、または、骨髄細胞を、関連遺伝子を有するベクターを用いてトランスフ
ェクトすることができる。例えば、骨髄を、HIF-1またはEPAS1トランスジーンを
有する、プラスミドベクターを用いて、またはアデノウィルスベクターを用いて
トランスフェクトすることができる。
【００１７】 最近のデータは、側副枝機能を高めるために、単球により誘導されるサイトカ
インの重要性を示す。単球は、イン ビボ(in vivo)での側副枝増殖中に活性化
され、単球走化性タンパク質１(MCP-1)は、イン ビトロ(in vitro)での剪断応
力によって上へ調節(upregulate)される。単球は、側副枝脈管増殖（動脈形成(a
rteriogenesis)）および毛細管発芽（脈管形成）中に脈管壁に付着することが示
された。MCP-1はまた、ウサギ慢性後肢虚血モデルにおいて大腿部動脈閉塞後に
側副枝増殖を増加させることが示された（イトウ(Ito)ら、Circ Res 1997; 80:8
29-3）。単球の活性化は、側副枝増殖ならびに毛細管発芽において重要な役割を
演じると思われる。LPSによる増加された単球補充は、実験的な動脈閉塞の７日
後の、増加された毛細管密度ならびに増大された側副枝および末梢導管に関連す
る（アラス(Arras), M.ら、J Clin Invest 1998;101:40-50）。
【００１８】 本発明のさらなる態様は、MCP-1による、吸引された自己骨髄のイクス ビボ(
ex-vivo)刺激、次いで、活性化された骨髄細胞を虚血心筋層または末梢器官（例
えば虚血肢）へ直接供給して、心臓および／または末梢虚血組織における側副枝
依存性灌流および筋肉機能を高めることを包含する。骨髄の刺激は、骨髄を、タ
ンパク質の形態のMCP-1への直接暴露によることができ、または、骨髄細胞を、M
CP-1遺伝子を有するベクターを用いてトランスフェクトすることができる。例え
ば、骨髄を、MCP-1トランスジーンを有する、プラスミドベクターを用いて、ま
たはアデノウィルスベクターを用いてトランスフェクトすることができる。
【００１９】 顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)および顆粒球-コロニー刺激
因子(G-CSF)は、単球成熟のための刺激サイトカインであり、多効力の(multipot
ent)造血増殖因子であり、これらは、種々の血液学病理、例えば、癌患者におい
て通常免疫抑制療法もしくは化学療法に応答して生じる、低下した白血球細胞数
（すなわち、白血球減少症または顆粒球減少症または単球減少症）のための臨床
上の実施において使用される。GM-CSFはまた、赤血球バースト形成単位(burst f
orming unit)、好酸球コロニー形成単位(CSF)および多型潜在性(multipotential
)(CSF)ならびに顆粒球-マクロファージCSFおよび顆粒球CFUからの、イン ビト
ロ(in vitro)でのコロニー形成を誘発する多系統(multilineage)増殖因子として
記載された（ボット(Bot), F.J., Exp Hematol 1989, 17:292-5）。GM-CSFへの
イクス ビボ(ex-vivo)暴露は、CD-34+前駆細胞の急速増殖を誘発することが示
された（イーゲランド(Egeland), T.ら、Blood 1991; 78:3192-9）。これらの細
胞は、脈管内皮細胞に分化する可能性を有し、天然には出産後の脈管形成に関連
し得る。さらに、GM-CSFは、マクロファージ／単球の増殖、分化、運動性および
生存（減じられたアポトーシス速度）に対する多刺激効果を有する。骨髄誘導の
内皮前駆細胞および単球への合わせた公知の効果と一致して、本発明の別の態様
は、GM-CSFを、虚血した心臓血管系器官における新しい血管形成および分化を誘
発することを意図した自己骨髄注入に対して補助的治療として使用することであ
る。その上、GM-CSFはさらに、骨髄の効果を増加させることによって、またはイ
ン ビボ(in vivo)もしくはイン ビトロ(in vitro)で投与された骨髄をさらに
刺激することによって（骨髄はまた、、HIF-1、EPAS1、低酸素またはMCP-1のよ
うな剤で刺激されている）、骨髄により引き起こされる治療的心筋脈管形成を増
大させることができる。
【００２０】 以下の実施例において、本発明の態様に関するある種の試験が示される。これ
らの実施例は非限定的である。
【実施例】実施例１ 内皮細胞増殖への骨髄培養培地の効果 得られた、吸引されたブタ自己骨髄細胞が、VEGF、効力のある血管新生因子お
よびMCP-1（最近、重要な脈管形成補助因子として同定された）を分泌したかど
うかを決定するための研究を行った。骨髄をイン ビトロ(in vitro)で４週間培
養した。ならし培地を、培養したブタ大動脈内皮細胞(PAEC)に添加し、４日後に
増殖を査定した。ならし培地中のVEGFおよびMCP-1濃度を、ELISAを用いてアッセ
イした。４週間培養中、BM細胞は、それらの濃度が時間と相関する仕方で増加す
るように、VEGFおよびMCP-1を分泌した。得られたならし培地は、投与量と相関
する仕方で、PAECの増殖を増大させた。この結果は、BM細胞が、効力のある脈管
形成サイトカイン、例えばVEGFおよびMCP-1を分泌することができ、かつ脈管内
皮細胞の増殖を誘発することができるということを示す。
【００２１】ブタ骨髄の培養 慢性心筋虚血のブタから、滅菌条件下で、防腐剤を含まないヘパリン（20単位
／ml BM細胞）中に、骨髄(BM)細胞を採取し、300μおよび200μのステンレス鋼
のメッシュフィルターを用いて逐次ろ過した。次にBM細胞を、フィコール-ハイ
パーク(Ficoll-Hypaque)濃度勾配遠心分離により分離し、長期培養培地(LTCM)（
ステム セル テク(Stem Cell Tech)、バンクーバー、ブリティッシュ コロン
ビア、カナダ）中で、330℃、５％CO2にて、T-25培養フラスコで培養した。各培
地中のBMCの接種密度は7ｘ106／mlであった。毎週、培地の半量を除去し、新た
なLTCMと取り替えた。除去した培地をろ過（0.2μフィルター）し、次の酵素-結
合イムノソルベントアッセイ(ELISA)および細胞増殖アッセイのために‐200℃で
貯蔵した。
【００２２】ブタ大動脈内皮細胞の分離および培養 新鮮なブタ動脈内皮細胞(PAEC)を、慣用の方法を用いて分離した。２％FBS、
ヒドロコルチゾン、ヒトFGF、VEGF、ヒトEGF、IGF、ヘパリンおよび抗生物質を
含む、内皮細胞増殖培地（EGM-2培地、クロネティックス(Clonetics)、サン デ
ィエゴ、カリフォルニア州）、37℃で５％二酸化炭素にて。約７日に、細胞が融
合性になったときに、2.5％トリプシンにより分離し、その後10％FBSを有する培
地199中で培養した。その同一性は、典型的内皮細胞の形態によって、かつ因子I
IIについての免疫組織化学染色法によって、確認した。増殖の研究のために、継
代３〜10を使用した。
【００２３】動脈内皮細胞へのならし培地の効果 細胞増殖アッセイ：PAEC（継代３〜10）を、トリプシン処理(trypsinization)
により、培養フラスコから除いた。分離した細胞を96-ウェルの培養プレートに
移し、接種密度5,000細胞／ウェルにて培養した。細胞を、増殖およびDNA合成実
験に使用する前の２〜３日間培養した。BM細胞培養物のならし培地を４週間で集
め、７つの培養フラスコからの培地を貯めて、生物アッセイに使用した。一定分
量（10μL、30μL、100μLまたは200μL）の貯めておいたならし培地またはLTCM
（200μL、対照として）を、トリプル実験の96-ウェルプレート中の融合性PAEC
に添加した。ならし培地または対照培地での培養後４日に、PAECをトリプシン処
理し、細胞計数器（コールター カウンター(Coulter Counter)、ベックマン(Be
ckman)社、マイアミ、フロリダ州）を用いて数えた。
【００２４】PAEC DNA合成へのならし培地の効果 一定分量（10μL、30μL、100μLまたは200μL）の、貯めておいた試料からの
ならし培地または対照培地（LTCM、200μL）を、トリプル実験の96-ウェルプレ
ート中のPAEC（上記と同じ接種密度）に添加した。２日後、１μCiのトリチウム
化したチミジンを各ウェルに加えた。48時間後、PAEC中のDNAを、細胞採取器(ce
ll harvester)（Mach III M、トムテック(Tomtec)、ハムデン(Hamden)、コネチ
カット州）を用いて採取し、液体シンチレーションカウンター（多検出器液体シ
ンチレーションルミネセンスカウンター(Multi-detector Liquid Scintillation
Luminescence Counter)、EG&Gワラック(Wallac)、ツルク(Turku)、フィンラン
ド）によって、放射能活性をカウントした。
【００２５】ELISA VEGFによる、ならし培地中のVEGFおよびMCP-1の測定 ならし培地中のVEGFの濃度を、サンドウィッチELISAキット（ケミコン イン
ターナショナル社(Chemicon International Inc.)、テメキュラ(Temecula)、カ
リフォルニア州）を用いて測定した。簡単には、抗-ヒトVEGF抗体で予めコーテ
ィングされたプレートを使用して、ならし培地中のVEGFまたは、公知濃度の組換
えVEGFを結合した。複合体を、捕獲されたVEGFに結合するビオチン化した(bioti
nylated)抗-VEGF抗体によって検出した。ビオチン化した(biotinylated) VEGF抗
体を今度は、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよび発色溶液によっ
て検出した。抗-ヒトVEGF抗体は、ブタVEGFと交差反応する。
【００２６】ELISAによる、ならし培地中のMCP-1の測定 ならし培地中のMCP-1の濃度を、サンドウィッチ酵素イムノアッセイキット（R
&D システムズ(Systems)、ミネアポリス、ミネソタ州）によってアッセイした
：抗-ヒトMCP-1抗体で予めコーティングされたプレートを使用して、ならし培地
中のMCP-1または、公知濃度の組換えタンパク質を結合した。複合体を、捕獲さ
れたMCP-1に結合するビオチン化した(biotinylated)抗-MCP-1抗体によって検出
した。ビオチン化した(biotinylated) MCP-1抗体を今度は、ストレプトアビジン
アルカリホスファターゼおよび発色溶液によって検出した。抗-ヒトMCP-1抗体は
、ブタMCP-1と交差反応する。
【００２７】結果 ４週間で集めたBMならし培地は、投与量に相関する仕方で、PAECの増殖を増加
させた（図１）。このことは、細胞の数を直接数えることによって、およびトリ
チウム化したチミジンの取り込みを測定することによって（両方の測定について
、p＜0.001）、証明された。投与量相関応答は、下降する肢を証明し、増殖は、
30μL および100μL に比べて、200μLのならし培地を用いて減少した（両方の
比較について、P=0.003）。同様の投与量相関の結果が、トリチウム化したチミ
ジン取り込みの研究において観察された（それぞれ、200μLに比べて、30μLお
よび100μLについてP=0.03）。 限られた数（５±４％）の新たに吸引したBM細胞は、因子IIIについて陽性に
染色した。その結果を図２に示す。これを、57±14％の６週間培養したBM細胞の
付着層（その60±23％が内皮様の細胞であり、40±28％が巨核球であると思われ
た）と対比した。 ４週間にわたって、BMならし培地中のVEGFおよびMCP-1の濃度は、第１週の濃
度のそれぞれ10倍および3倍に徐々に増加した（両方の比較についてP＜0.001）
（図３）。比較すると、対照培養培地（BMにさらしていない）中のVEGFおよびMC
P-1の濃度は、図４に示したように、それぞれ0および11±２pg/mlであった。
【００２８】実施例２ 培養したブタ骨髄細胞によるVEGF分泌への低酸素の影響 低酸素が、培養した骨髄内皮細胞によるVEGFの発現を著しく増加させることを
証明し、結果は、低酸素へのイクス ビボ(ex-vivo)暴露は、低酸素誘発性の血
管新生因子の発現を増加させることにより、虚血筋肉組織に注入されるべき骨髄
細胞およびそのならし培地の側副枝増進効果をさらに増加させることができるこ
とを示した。ブタ骨髄を採取し、300μおよび200μのステンレス鋼のメッシュフ
ィルターを用いて逐次ろ過した。次にBMCを、フィコール-ハイパーク(Ficoll-Hy
paque)濃度勾配遠心分離により分離し、33℃、５％CO2にて、T-25培養フラスコ
で培養した。約７日に、細胞が融合性になったときに、トリプシン処理により、
1:3に分離した。４週間培養後、BMCを低酸素条件（1％酸素を含有する部屋に置
いた）に24〜120時間さらすか、または標準状態下に維持した。得られたならし
培地を集め、VEGF、MCP-1を、ELISAで分析した。 低酸素への暴露は、VEGF分泌を著しく増加させた：24時間では、VEGF濃度は、
酸素正常状態下での106±13pg/mlから、低酸素状態下での1,600±196 pg/mlへ増
加し（p=0.0002）；120時間後には、4,163±62 pg/mlから6,028±167 pg/mlへと
増加した（p＜0.0001）。新たに分離したBMCで別の研究を行い、同じ傾向が見出
された。低酸素はまた、BMCの増殖速度を遅くした。MCP-1発現は、低酸素によっ
て増加されず、これは、そのプロモーターが、HIF結合部位を有することが知ら
れていないので、予期しない発見ではない。
【００２９】実施例３ 内皮細胞管形成への骨髄培養培地の効果 ブタ内皮細胞および脈管平滑筋細胞の共存培養技術を用いて、骨髄細胞のなら
し培地が、イン ビトロ(in vitro)での構造的脈管の形成を誘発することを証明
した。脈管形成へのそのような効果は、骨髄ならし培地への暴露なしでは観察さ
れなかった。この結果は、骨髄細胞およびその分泌された因子が、前脈管形成効
果を発揮することを示唆する。
【００３０】実施例４ 慢性心筋虚血モデルにおける側副枝灌流および局所機能への自己骨髄の心内膜経 由(transendocardial)デリバリーの効果 左回旋冠状動脈の周りにアメロイド圧迫器(ameroid constrictor)を移植する
ことによって、慢性心筋虚血を、14匹のブタに生じさせた。移植４週間後に、７
匹の動物に、心内膜経由の注入用カテーテル（動物当たり2.4mlを12部位に注入
した）を用いて、新たに吸引したABMの虚血領域への心内膜経由の注入を受けさ
せ、７匹の対照動物は、ヘパリンを加えた塩水を注入された。ベースラインおよ
び４週間後に、動物を休息させ、ペーシング(pacing)心エコー図をとって、局所
収縮性（％心筋濃厚化）を査定し、微小球の研究を行って、側副枝依存性灌流を
、休息時およびアデノシン注入中に査定した。ABMの注入の４週間後に、側副枝
流（虚血／正常領域の比ｘ100として表した）は、ABM処置したブタで改善された
が、対照では改善されなかった（ABM: 休息時に95±13対81±11、P=0.017；アデ
ノシン注入中に85±19対72±10、P=0.046；対照：休息時に86±14対86±14、P=N
S；アデノシン注入中に73±17対72±14、P=0.63）。同様に、収縮性は、ABM処置
したブタで増加したが、対照では増加しなかった（ABM: 休息時に83±21対60±3
2、P=0.04；ペーシング中に91±44対35±43、P=0.056；対照：休息時に69±48対
64±46、P=0.74；ペーシング中に65±56対37±56、P=0.23）。 結果は、カテーテルに基づく、ABMの心内膜経由の注入は、虚血心筋層におい
て側副枝灌流および心筋機能を増加することができることを示し、この所見は、
このアプローチが、最適な治療的脈管形成を達成するための新規な治療法を構成
し得ることを示唆する。 体重約70kgの、14匹の特定の病原体を持たない家畜のブタに麻酔をかけ、挿管
し、２L／分で補足的なO2ならびにイソフルレン吸入を手順中にわたって受けた
。右大腿部動脈分離および８フレンチ シース(French sheath)の挿入によって
、動脈接近を得た。左側方の開胸術によって左回旋動脈を分離し、金属被覆した
アメロイド圧迫器(ameroid constrictor)を、動脈の非常に近位部分に移植した
。アメロイド圧迫器移植の４週間後に、すべてのブタが、(1) アメロイド圧迫器
の確認および側副枝流の査定のための、選択的な左右の冠状動脈血管造影；(2)
経胸腔的心エコー検査；および(3)局所的心筋血流査定を受けた。
【００３１】骨髄の吸引および調製ならびに心筋内注入 ベースライン査定の終了後直ぐに、すべての動物が、標準技術を用いて、左大
腿部長幹からBM吸引を受けた。防腐剤を含まないヘパリンを加えたガラス注射器
（20単位のヘパリン／1mlの新鮮なBM）を用いて、２部位から（部位当たり3ml）
BMを吸引した。吸引した骨髄を直ちに、300μおよび200μのステンレス鋼フィル
ターを用いて逐次マクロろ過した(macro-filtered)。次に、心内膜経由注入カテ
ーテルを用いて、骨髄を心筋層へ、虚血心筋領域およびその境界線領域に向けら
れた12部位で（全部で2.4mlで、注入部位当たり0.2ml）注入した。
【００３２】心エコー検査研究 中乳頭(midpapillary)筋肉レベルでの短軸および長軸視野の経胸腔的心エコー
検査像を、ベースラインおよびペーシング中の動物、ベースラインおよびABM移
植４週間後の追跡評価中の動物において記録した。％壁濃厚化［（収縮末期厚さ
）―（拡張末期厚さ）／（拡張末期厚さ）］ｘ100を測定することによって、分
別短縮測定(fractonal shortening measurement)を得た。それらの測定は、虚血
領域（側方領域）および遠方領域（前方中隔領域）から得た。次いで、一時的な
ペースメーカー電極を、右大腿部静脈鞘経由で挿入し、右房に配置した。動物は
、２分間、180／分のペースであり、心エコー検査像を同時に記録した。
【００３３】局所的心筋血流 休息時および最大冠状動脈血管拡張中に、多重蛍光着色微小球（インタラクテ
ィブ メディカル テクノロジーズ(Interactive Medical Technologies)、ウエ
スト ロサンゼルス、カリフォルニア州）を使用して、局所的心筋血流測定を行
い、対照試料法（ヘイマン(Heymann), M.A.ら、Prog Cardiovasc Dis 1977; 20:
55-79）によって定量した。蛍光微小球（0.8ml、5ｘ106微小球／ml、15μm直径
、0.01％Tween 80を含む塩水懸濁物中）を、6Fジャドキンス 左3.5診断カテー
テル(6F Judkins left 3.5 diagnostic catheter)によって、左房に注入した。
最大冠状動脈血管拡張は、一定速度140μg/kg/分でアデノシン（フジサワ(Fujis
awa)USA、ディアフィールド(Deerfield)、イリノイ州）を左大腿部静脈へ６分間
かけて注入することによって誘発された。注入の最後の２分間の間に、微小球注
入および血液対照の回収を、休息時と同じやり方で行った。 灌流査定を終えた後、動物を、過量のナトリウム ペントバルビタールおよび
KCLで殺した。心臓を取り出し、リンゲル ラクテート(Ringer Lactate)でフラ
ッシュ洗浄し、10〜15分間灌流-固定し、次いで、10％緩衝ホルムアルデヒドで
３日間浸漬-固定した。固定が終わった後、心臓を短軸に沿って切断し、7mm厚の
切片にした。２つの中心切片をそれぞれ８つのより小さい大きさのくさびに分け
、これをさらに、心内膜および心外膜サブセグメントに切断した。平均の８つの
側方虚血域および８つの中隔の正常域サブセグメントの測定を、心内膜および心
外膜領域心筋血流の査定のために使用した。相対的側副枝流をまた、虚血域／非
虚血域(IZ/NIZ)血流の比としてコンピュータ処理(compute)した。
【００３４】組織病理学 注入カテーテルを用いることによるBM吸引物の注入が機械的な細胞傷害に関係
するかどうかを評価するために、新たにろ過したABM吸引物を、イン ビボ研究
のときと同様の注入圧を用いて、針を通して押し出す前後で、標準のBM塗抹標本
を調製した。研究のプロトコールを知らされていない、独立した実験技術者によ
り、形態学的な評価を行った。 サンプリングした心臓組織について、組織病理学的評価を行った。試験的研究
において、7mm厚の短軸切片をUV光下で調べて、蛍光の付いた領域を同定した。
各同定領域を3つの全厚の隣接片（中心、右および左）に切断し、これを、10％
緩衝ホルムアルデヒド中で浸漬-固定した。次に、そのような各片を3つのレベル
に切断し、そのうちの２つは、ヘマトキシリン(Hematoxylin)およびエオジン(Eo
sin)(H&E)で染色し、１つはPASで染色した。さらに、各動物の虚血領域から１つ
の新しい蛍光標識組織片を得、OCTコンパウンド（サクラ ファインテク(Sakura
Fineteck)USA社、トランス(Trance)、カリフォルニア州）中に包埋し、液体窒
素中で凍結させた。これらの急速凍結した心筋組織の凍結切片を風乾し、アセト
ンで固定した。自動化されたダコ イムノ ステイナー(Dako immuno Stainer)
（ダコ(Dako)、カーペンテリア(Carpenteria)、カリフォルニア州）を用いて、
イムノペルオキシダーゼ染色を行った。固有のペルオキシダーゼおよび非特異的
取り込みは、0.3％水素ペルオキシダーゼおよび10％オボアルブミン(ovo-albumi
n)で封鎖した。CD-34に対するモノクローナルマウス抗体（ベクトン ディッキ
ンソン(Becton Dickinson)、サン ジョゼ(San Jose)、カリフォルニア州）を、
一次抗体として使用した。連結抗体は、ビオチン化したヤギ抗マウスIgG抗体で
あり、３次抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼを用いて、ストレパビジン(str
epavidin)コンジュゲート(conjugate)した。ジアミノベンジジン(DAB)を色原体
として使用し、切片を1％メチルグリーンで対比染色した。脱水および洗浄後、
スライドを乗せ、ニコン ラブフォト(Nikon Labphot)顕微鏡で調べた。 効力試験においては、虚血領域および非虚血領域からの、全厚の1.5平方セン
チメートルの切片を、パラフィン切片のために加工処理した。試料のそれぞれを
H&Eマッソン(Masson)のトリクロームおよび因子VIII関連抗原で染色した。イム
ノペルオキシダーゼ染色したスライドを、内皮細胞群の密度および脈管化につい
て調べた。後者は、管腔の存在によって前者と区別された。虚血および非虚血の
心筋層の内半分から得た、因子VIII染色したスライドの５つの顕微鏡写真試料を
用いて、脈管質を評価した。内皮細胞の密度は、同じ顕微鏡写真のデジタル化し
た像を用いて評価した。内皮群の密度は、シグマ スキャン プロ モルフォメ
トリー ソフトウェア(Sigma-Scan Pro morphometry software)によって、強度
閾値法を用いて決定した。各試料ならびに各標本についての全内皮領域を、相対
パーセント内皮領域［（内皮領域）／（調べた心筋層の領域）］と共に得た。全
内皮領域はまた、調べた心筋層の梗塞不形成（生存可能）領域の相対パーセント
として計算した。トリクローム染色した切片をデジタル化し、青色染色コラーゲ
ンによって占められた領域ならびに、心外膜によって占められた領域（正常にコ
ラーゲンを含んでいた）を除く全切片領域を、シグマ スキャン プロ(Sigma-S
can Pro)を用いて測定した。次に、梗塞形成領域を、青色染色によって占められ
た領域として計算した。
【００３５】手法によるデータ ABMまたはプラシーボを用いた心筋内注入は、平均血圧、心拍数または不整脈
の誘発における急変とはいずれも関連がなかった。すべての血流力学的パラメー
ターは、２つの群間で類似していた。ペーシングまたはアデノシン注入中の引き
続く差を有さない対照群（P=0.03）の追跡でのより高い初期の平均動脈血圧を除
く追跡手順と比べた指標で、対にした比較は、各群内で同様の血流力学的パラメ
ーターを示した。
【００３６】心筋機能 局所的心筋機能評価を以下の表Iに示す。休息時およびペ−シング中の、虚血
域対非虚血域(IZ/NIZ)の比ｘ100で表された、介入前の相対的部分壁濃厚化は、
群間で同様であった（それぞれ、P=0.86および0.96）。ABMの心筋内注入の４週
間後、改善された局所的壁濃厚化が、休息時およびペ−シング中に生じ、これは
、側副枝依存性虚血側方壁の壁濃厚化の〜50％増加によるものであった。追跡時
のペーシング中に壁濃厚化の改善への傾向が虚血領域で示されたけれども、対照
動物においては有意の変化は観察されなかった。
【００３７】
【表１】 心筋灌流データ 局所的心筋灌流評価を以下の表IIに示す。休息時およびアデノシン注入中の、
仲介前相対的経壁心筋灌流、IZ/NIZには、処置群および対照群間に差異はなかっ
た（それぞれP=0.42および0.96）。ABM注入４週間後に、休息時およびペーシン
グ中の相対的局所経壁心筋灌流は有意に改善した。これは、休息時（57％増加、
P=0.08）およびアデノシン注入中（37％、P=0.09）の両方で、虚血域における心
筋灌流の絶対的改善によるものであったが、一方、休息時（35％増加、P=0.18）
またはアデノシン注入中（25％増加、P=0.26）での非虚血域への絶対流に有意の
変化は示されなかった。虚血域において見出された局所的心筋血流の増加は、休
息時の心内膜（73％）および心外膜（62％）の局所的改善の両方からなり、アデ
ノシン注入中には幾らか少ない改善がみられた（両方の領域で40％）。４週間で
、対照群は、介入前の値と比べて、虚血域および非虚血域での経壁、心内膜また
は心外膜の灌流に差は示さなかった。
【００３８】
【表２】 組織病理学および脈管質の評価 ろ過した吸引物を注入カテーテルに通す前後のBM塗抹標本の評価は、正常構造
、、マクロ凝集物の不在、および細胞破片または変形した細胞形状の証拠がない
ことを示した。注入１日後の組織病理学は、分散された細胞浸潤を伴う、フィブ
リンおよび炎症領域によって特徴づけられる急性の病変を示した。浸潤物は、形
態学的にBM浸潤物から分化することができなかった単核細胞によって特徴づけら
れた。細胞質は、３日および７日に最大であり、時間中その後下降した。３週間
で、0.5ml注入部位に、0.2mlと比べて多い繊維過多がみられた。BM誘導前駆細胞
を同定するように設計された、CD-34イムノスタチニング(immunostatining)を、
最大細胞浸潤物を証明する切片に行った。全体的にみて、4〜6％の細胞浸潤物が
CD-34に対する陽性の免疫反応性を示すことが見積られた。
【００３９】 両群の虚血領域は、調べた虚血心筋層の全体的にみて＜10％を占めるむらのあ
る壊死の小領域によって特徴づけられた。非虚血領域は、正常な心筋構造を示し
た。２つの群の組織形態学的特徴の変化を比較した。いずれの血管によっても占
められている全面積ならびに直径＞50μmの血管の数に差はなかった。しかしな
がら、虚血領域対非虚血領域での、因子VIIIについて陽性に染色された全面積（
管腔を有する内皮細胞および管腔を有していない内皮細胞）の比較は、２つの群
間の差を示した。ABM群では、虚血側副枝依存性領域における全内皮細胞領域は
、非虚血領域で観察されたよりも100％高かった（11.6±5.0対5.7±2.3％面積、
P=0.016）が、それに対して、対照群では有意の差はなかった（12.3±5.5対8.2
±3.1％面積、P=0.11）。しかし、いずれの血管によっても占められている％面
積および＞50μmの血管の数を含む、脈管質の他のパラメーターは、両群におい
て、虚血領域および非虚血領域で同様であった。
【００４０】実施例５ 心筋虚血の動物モデルにおけるGM-CSFの予備投与によりイン ビボ(in vivo)で
刺激された自己骨髄の効果 左回旋冠状動脈の周りにアメロイド圧迫器(ameroid constrictor)の移植によ
って、慢性心筋虚血を、16匹のブタに生じさせた。アメロイド移植後４週間マイ
ナス３日に、８匹の動物が、連続した３日間（１日当たりの投与量10μg/kg）に
、GM-CSFの皮下注射を受け、次いで（第４日、正確に、アメロイド移植後４週間
に）、心内膜経由の注入用カテーテル（動物当たり2.4mlを12部位に注入した）
を用いて、新たに吸引したABMの虚血領域への心内膜経由の注入を受け、GM-CSF
刺激なしの８匹の対照動物は、ヘパリンを加えた塩水を注入された。ベースライ
ンおよび４週間後に、動物を休息させ、ペーシング(pacing)心エコー図をとって
、局所収縮性（％心筋濃厚化）を査定し、微小球の研究を行って、側副枝依存性
灌流を、休息時およびアデノシン注入中に査定した。ABMの注入の４週間後に、
側副枝流（虚血／正常領域の比ｘ100として表した）は、ABM処置したブタで改善
されたが、対照では改善されなかった（ABM: 休息時に85±11対72±16、P=0.026
；アデノシン注入中に83±18対64±19、P=0.06；対照：休息時に93±10対89±9
、P=0.31；アデノシン注入中に 73±17対75±8、P=0.74）。同様に、収縮性は、
ABM処置したブタで増加したが、対照では増加しなかった（ABM: 休息時に93±33
対63±27、P=0.009；ペーシング中に84±36対51±20、P=0.014；対照：休息時に
72±45対66±43、P=0.65；ペーシング中に70±36対43±55、P=0.18）。 結果は、カテーテルに基づく、３日間全身に投与されたGM-CSF によりイン
ビボ(in vivo)で前刺激されたABMの心内膜経由の注入は、虚血心筋層において側
副枝灌流および心筋機能を増加させることができることを示し、この所見は、こ
のアプローチが、最適な治療的脈管形成を達成するための新規な治療法を構成し
得ることを示唆する。
【００４１】実施例６ ヒト患者の治療 心臓の処置を開始する約60分前に、防腐剤を含まないヘパリンを加えたガラス
注射器（20単位のヘパリン／新鮮なBM 1ml）を用いて、腸骨稜から骨髄（~5ml
）を吸引する。吸引した骨髄を直ちに、300μおよび200μのステンレス鋼フィル
ターを用いて逐次マクロろ過する。経験のある血液学者が、滅菌条件下で処置を
行う。骨髄調製の正常な組織形態学を確かめるために、骨髄塗抹標本を評価する
。 剤を心筋層に供給するための任意の幾つかの処置を使用することができる。こ
れらには、外科手術的なアプローチ（例えば、限定されることはないが、経胸腔
的切開術または針もしくは他のデリバリー装置の経胸腔的挿入または、胸腔鏡検
査法による）によって、または任意の幾つかの経皮の処置によって達成すること
ができるような、直接心外膜経由デリバリーが含まれる。以下は、経皮デリバリ
ーの１例である。以下の例は、デリバリーの選択を、例に記載した特定のカテー
テルに基づくプラットフォーム系に限定することを意味せず、任意のカーテーテ
ルに基づくプラットフォーム系が使用できることが、強調されるべきである。 経皮の冠状動脈血管形成術のための標準の処置を使用して、少なくとも8Fの導
入針鞘を、右または左の大腿部動脈に挿入する。動脈鞘の挿入後、処置のLVマッ
ピング(mapping)およびABM移植部分中に200〜250秒間ACTを維持するのに必要と
されるので、ヘパリンを投与し、補足する。30分より短い間隔で処置中に、かつ
処置の終わりに、ACTを調べて、この必要条件への一致を検証する。 標準のRAOおよび／またはLAO視野で、左心室機能造影法を行って、NOGA-STAR
（商標）および注入カテーテルの案内を助け、NOGA-STAR（商標）カテーテルを
用いて、LV電気機械地図を得る。8FのINJECTION-STARカテ−テルを、大腿部鞘を
通って大動脈弁へ逆行様式に置く。全先端反屈後、丸みのある遠位先端を、大動
脈弁を横切って穏やかに脱出させ、LV腔内で適当に一度まっすぐにする。 カテーテル（電磁気先端センサーを組み込む）を処置領域（例えば、前方、側
方、下方-後方または他）の１つに向ける。NOGA（商標）系の安全性特徴を用い
て、安定性シグナルがLS値＜３を明示したときのみに、針を挿入し、注入する。
0.2ccの新たに吸引したABMの１度の注入を、各注入部位間が５mmより近くないよ
うにし、２箇所までの処置領域に制限した、心内膜経由のアプローチによって供
給する。注入部位の密度は、個々の対象のLV心内膜心筋の解剖学的構造および、
カテーテルの置換または未成熟心室収縮(PVC)なしに心内膜表面での安定な位置
を達成する能力に依存する。 虚血心筋層へ移植された、その新たに吸引された自己骨髄は、悪影響なしに、
改善された側副枝流と関連しており、これは、幾つかの理由のために、臨床的重
要性を有し得る。上記に反映される方法は、骨髄が、有効かつ明らかに安全なや
り方で、局在化する脈管形成応答を誘発する自然の能力を利用した。そのような
脈管形成法はおそらく、多くの他の最近に試験されているものより費用がかから
ないであろう。また、それは、ウィルスベクターを使用する種々の遺伝子に基づ
くアプローチを用いてのわずかであるが明確な可能性である潜在的毒性に関連す
る結果を避けるであろう。
【００４２】 本発明は、自己骨髄が、細胞性要素（例は、心内膜前駆細胞であるが、骨髄中
の多くの他の細胞が、脈管形成効果に重要に寄与し得るので、本発明は、そのよ
うな細胞に限定されない）および、新しい血管増殖を促進し、別の組織、例えば
虚血した心臓または末梢肢に運ばれたときに機能を元に戻すのに必要な、分泌さ
れる要素、例えば脈管形成増殖因子のための最適な供給源であるという概念に基
づく。患者自身の骨髄を、動脈閉塞の故に障害を生じた血液灌流を有する虚血組
織、例えば心筋および／または虚血肢において、治療的脈管形成および／または
筋発生を誘発するための、鍵となる治療上の供給源として使用することができる
。患者自身の骨髄が吸引され（すなわち、自己骨髄の寄贈）、加工処理され、虚
血組織および／または隣接する非虚血組織、例えば心筋および／または虚血肢に
直接注入されて、血管増殖を促進させる。 自己の骨髄および／または骨髄産物が、心筋、例えば心筋層に、カテーテルに
基づく心内膜注入アプローチまたは、手術による（開胸または胸腔鏡検査法によ
る）心外膜経由の開胸術アプローチの使用によって、注入される。それら２つの
デリバリー手法は、標的器官組織、例えば心筋および／または虚血肢における脈
管形成骨髄要素の組み込みおよび統合を促進することによって、同じ治療上の目
標を達成するために使用することができる。
【００４３】 本発明によれば、有効量の自己骨髄を治療のために投与する。経験のある従業
者により正しく認識されるように、投与される量は、多くの要因に依存し、これ
には、限定されることはないが、意図される治療、治療される状態のひどさ、治
療されるべき領域の大きさおよび広がり等が包含される。本発明の治療に関して
、典型的なプロトコールは、全部で約2.4〜約6mlの、投与される自己骨髄につい
て、約12〜約25回の注入のそれぞれにおいて、約0.2〜0.5mlの量の自己骨髄を投
与することである。投与される各投与量は、好ましくは約１〜２体積％のヘパリ
ンまたは他の血液抗凝固剤、例えばクマジン(coumadin)を含むことができる。自
己骨髄が培養されたか、または刺激されたとき、および／または他の薬剤等と組
合せて投与されるときには、存在する自己骨髄の量は、各投与量においてほぼ同
じでなければならならず、および／または、投与される自己骨髄の全量は、上記
したのとほぼ同じでなければならない。各治療において投与される自己骨髄の全
細胞数は、約107〜5ｘ108の大きさでなければならないと思われる。
【００４４】 脈管形成遺伝子発現の最適化は、種々の脈管形成刺激剤と自己骨髄との同時投
与を必要とする。かくして、本発明に従い、自己骨髄移植は、「自立の」治療剤
として、または、脈管形成増殖因子の骨髄製造を増進し、かつ／または内皮細胞
の増殖、移動および血管形成を促進させることができる、任意の医薬、タンパク
質もしくは遺伝子または任意の他の化合物もしくは仲介物と合わせて、注入され
る。「合わせた」剤は、患者または標的組織に直接投与されることができ、また
は、患者への骨髄の注入前に骨髄と共にイクス ビボ(ex vivo)でインキュベー
トすることができる。これらの「合わせた」剤の例は、（これらの剤に限定され
ることはないが）顆粒球-単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、単球化学誘引タンパ
ク質-1(MCP-1)、EPAS1または低酸素誘発性因子-1(HIF-1)である。骨髄の刺激は
、骨髄の、タンパク質形状の因子への直接暴露によることができ、または、骨髄
細胞は、関連遺伝子を有するベクターを用いてトランスフェクトすることができ
る。例えば、骨髄を、HIF-1またはEPAS1トランスジーンを有する、プラスミドベ
クターを用いて、またはアデノウィルスベクターを用いて、トランスフェクトす
ることができる。血管新生因子の骨髄製造を増大させることができる仲介物の例
は、骨髄細胞の低酸素へのイクス ビボ(ex-vivo)暴露である。この仲介物は、
骨髄と共に単独で、または、先に概略を述べた任意の因子と組合せて使用するこ
とができる。これらの最適化の手法は、心臓または任意の末梢の虚血組織への骨
髄の直接注入の前に、脈管内皮細胞の増殖因子(VEGF)発現および／または、脈管
形成活性を有する他のサイトカインの製造を増加させるように設計される。広い
意味では、本発明は、骨髄の刺激および／または、骨髄またはその基質微環境(s
tromal microenvironment)による任意の血管新生因子の製造のイクス ビボ(ex-
vivo)もしくはイン ビボ(in-vivo)刺激を引き起こすのに利用可能になる任意の
剤と共に、自己骨髄を心筋内に注入することを含む。
【００４５】 患者へのデリバリーは、臨床的情況に依存して変化する。例えば、難治性の冠
状動脈疾患または虚血末梢血管症の患者は、骨髄吸引処置、次いで、治療的脈管
形成および／または筋発生の目的のために、虚血組織またはその境界領域および
／または、疾患組織への側副枝もしくは細胞供給のための供給源として働き得る
正常な組織へ向けられた、自己骨髄の心筋もしくは肢移植のための候補者であろ
う。この処置は、骨髄吸引処置、骨髄採取および加工処理、次いで、自己骨髄ま
たはその要素（患者自身の骨髄から分離されている増殖因子および／または細胞
性要素）を、そのデリバリー形態の任意のイクス ビボ(ex-vivo)刺激を用いて
、または用いないで、虚血もしくは非虚血心筋層および／または抹消虚血組織（
例えば肢虚血）へ注入することの使用を含む。骨髄は、標準の抗凝固／抗凝集溶
液（クエン酸ナトリウムおよびEDTAを含む）中に保持され、使用するときまで、
滅菌媒体中に４℃にて保持される。
【００４６】 使用されるなら、骨髄はろ過されて、残留する血液凝塊または巨大凝集を標的
組織へ注入することを避ける。 任意のそのデリバリー形態での刺激剤を用いて、もしくは用いないで、または
、骨髄の脈管形成効果を高めるように設計されているトランスジーンを有するベ
クターを用いてトランスフェクトされているか、またはされていない骨髄が、す
なわち治療的な心筋の脈管形成または治療的な筋発生において、任意のカテーテ
ルに基づく心内膜経由の注入装置を用いて、または手術（開胸）による心外膜経
由の開胸術アプローチによって、または、心外膜経由のデリバリーを考慮する任
意の他のアプローチによって、心筋へ注入される。肢虚血の処置の場合には、骨
髄は、任意のそのデリバリー形態のイクス ビボ(ex-vivo)もしくはイン ビボ(
in-vivo)刺激を用いて、または用いないで、骨髄またはその要素の脚の筋肉への
直接注入によって運ばれる。 処置部位当たりの注入の体積は、特定の骨髄産物および虚血状態のひどさおよ
び注入の部位に依存して、おそらく、注入部位当たり0.1〜5.0ccの範囲であろう
。注入の全回数は、おそらく、処置の期間当たり1〜50の注入部位の範囲であろ
う。
【００４７】 先に記載した特定の実施態様は、本発明の実施を説明するものである。しかし
ながら、当業者に公知であるかまたはここに開示した他の手段を、本発明の意図
または添付の特許請求の範囲から離れることなく使用することができることが理
解されるべきである。
【００４８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、PAECの増殖対ならし培地の量のグラフであり；
【図２】 図２は、内皮細胞の増殖対ならし培地の量のグラフであり；
【図３】 図３は、４週間にわたるならし培地中のVEGFの濃度のグラフであり
；かつ
【図４】 図４は、４週間にわたるならし培地中のMCP-1の濃度のグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 9/02 9/02 9/04 9/04 9/10 9/10 43/00 １０７ 43/00 １０７ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 レオン，マーテイン，ビー． アメリカ合衆国， ニューヨーク州 10021， ニューヨーク， パーク アベ ニュー 875 (72)発明者 コルノウスキ，ラン イスラエル国， 47204 ラマット ハシ ャロン， エイロン ストリート 10 (72)発明者 フーチズ，シュミュエル アメリカ合衆国， メリーランド州 20852， ロックビル， ロリンズ アベ ニュー 267 (72)発明者 エプスタイン，ステファン，イー． アメリカ合衆国， メリーランド州 20852， ロックビル， ダンビル ドラ イブ 11700 (72)発明者 レオン，マーテイン，ビー． アメリカ合衆国， ニューヨーク州 10021， ニューヨーク， パーク アベ ニュー 875 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA01 DA02 EA02 EA04 GA11 4B065 AA94X AB01 AC14 BA02 BB34 BB40 BC06 BC38 CA44 4C084 AA13 AA19 MA55 MA65 MA66 ZA36 ZA37 ZB22 4C086 AA01 EA27 MA02 MA04 MA55 MA56 MA65 MA66 ZA36 ZA37 ZB22 ZC75 4C087 AA01 AA03 BB44 MA02 MA55 MA56 MA65 MA66 NA14 ZA36 ZA37 ZC75

Claims (102)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 有効量の自己骨髄を所望の部位に直接投与する段階を含む、
    側副枝血管形成を増進させる方法。
  2. 【請求項２】 自己骨髄が注入される請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 自己骨髄が、心筋内に注入される請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 自己骨髄が、心外膜経由または心内膜経由で注入される請求
    項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 心内膜経由のアプローチを用いて、カテーテルに基づくアプ
    ローチが使用される請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 自己骨髄が、末梢的に肢へ筋肉内に注入される請求項１記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 自己骨髄が刺激されたものである請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 自己骨髄が、1つ以上のサイトカインまたは他のタンパク質
    または刺激剤との接触によって刺激されたものである請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 サイトカインが、HIF-1、EPAS1、MCP-1およびCM-CSFからな
    る群より選択される請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 自己骨髄が、関連遺伝子を有するベクターを用いてトラン
    スフェクトされたものである請求項７記載の方法。
  11. 【請求項１１】 自己骨髄が、HIF-1もしくはEPAS1トランスジーンもしくは
    、骨髄が脈管形成を誘発する能力を高めるのに有効であることが証明された任意
    の他のトランスジーンを有する、プラスミドベクターもしくはアデノウィルスベ
    クターまたは、遺伝子移動のために有効なことが証明された任意の他のベクター
    を用いてトランスフェクトされたものである請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 自己骨髄が、低酸素またはエネルギーの形態に一時的にさ
    らすことによって刺激されたものである請求項７記載の方法。
  13. 【請求項１３】 培地で増殖している自己骨髄から誘導されたならし培地を
    、虚血した心臓または肢に注入する請求項７記載の方法。
  14. 【請求項１４】 自己骨髄が、脈管形成増殖因子の骨髄製造を増進し、かつ
    ／または内皮細胞の増殖、移動または血管形成を促進させることができる、薬剤
    、タンパク質もしくは遺伝子または任意の他の化合物または治療と組合せて投与
    される請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを一緒に投与する
    請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを、投与の前に合
    わせる請求項１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 自己骨髄が刺激されたものである請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 虚血組織が治療される請求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 有効量の自己骨髄を直接投与する段階を含む、新たに移植
    された心筋細胞の発達を促進する方法。
  20. 【請求項２０】 自己骨髄が注入される請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 自己骨髄が、心筋内に注入される請求項１９記載の方法。
  22. 【請求項２２】 自己骨髄が、心外膜経由または心内膜経由で注入される請
    求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 心内膜経由のアプローチを用いて、カテーテルに基づくア
    プローチが使用される請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 自己骨髄が、末梢的に肢へ筋肉内に注入される請求項１９
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】 自己骨髄が刺激されたものである請求項１９記載の方法。
  26. 【請求項２６】 自己骨髄が、1つ以上のサイトカインまたは他のタンパク
    質または刺激剤との接触によって刺激されたものである請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 サイトカインが、HIF-1、EPAS1、MCP-1およびCM-CSFから
    なる群より選択される請求項２５記載の方法。
  28. 【請求項２８】 自己骨髄が、関連遺伝子を有するベクターを用いてトラン
    スフェクトされたものである請求項２５記載の方法。
  29. 【請求項２９】 自己骨髄が、HIF-1もしくはEPAS1トランスジーンもしくは
    、骨髄が脈管形成を誘発する能力を高めるのに有効であることが証明された任意
    の他のトランスジーンを有する、プラスミドベクターもしくはアデノウィルスベ
    クターまたは、遺伝子移動のために有効なことが証明された任意の他のベクター
    を用いてトランスフェクトされたものである請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 自己骨髄が、低酸素またはエネルギーの形態に一時的にさ
    らすことによって刺激されたものである請求項２５記載の方法。
  31. 【請求項３１】 培地で増殖している自己骨髄から誘導されたならし培地を
    、虚血した心臓または肢に注入する請求項２５記載の方法。
  32. 【請求項３２】 自己骨髄が、脈管形成増殖因子の骨髄製造を増進し、かつ
    ／または内皮細胞の増殖、移動または血管形成を促進させることができる、薬剤
    、タンパク質もしくは遺伝子または任意の他の化合物または治療と組合せて投与
    される請求項１９記載の方法。
  33. 【請求項３３】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを一緒に投与する
    請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを、投与の前に合
    わせる請求項３２記載の方法。
  35. 【請求項３５】 自己骨髄が刺激されたものである請求項３４記載の方法。
  36. 【請求項３６】 心臓の電気的経路の障害を有する患者の心臓の導電性を改
    善する方法であって、有効量の自己骨髄を投与する段階を含む方法。
  37. 【請求項３７】 自己骨髄が注入される請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 自己骨髄が、心筋内に注入される請求項３６記載の方法。
  39. 【請求項３９】 自己骨髄が、心外膜経由または心内膜経由で注入される請
    求項３８記載の方法。
  40. 【請求項４０】 心内膜経由のアプローチを用いて、カテーテルに基づくア
    プローチが使用される請求項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 自己骨髄が、末梢的に肢へ筋肉内に注入される請求項３６
    記載の方法。
  42. 【請求項４２】 自己骨髄が刺激されたものである請求項３６記載の方法。
  43. 【請求項４３】 自己骨髄が、1つ以上のサイトカインまたは他のタンパク
    質または刺激剤との接触によって刺激されたものである請求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 サイトカインが、HIF-1、EPAS1、MCP-1およびCM-CSFから
    なる群より選択される請求項４２記載の方法。
  45. 【請求項４５】 自己骨髄が、関連遺伝子を有するベクターを用いてトラン
    スフェクトされたものである請求項４２記載の方法。
  46. 【請求項４６】 自己骨髄が、HIF-1もしくはEPAS1トランスジーンもしくは
    、骨髄が脈管形成を誘発する能力を高めるのに有効であることが証明された任意
    の他のトランスジーンを有する、プラスミドベクターもしくはアデノウィルスベ
    クターまたは、遺伝子移動のために有効なことが証明された任意の他のベクター
    を用いてトランスフェクトされたものである請求項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 自己骨髄が、低酸素またはエネルギーの形態に一時的にさ
    らすことによって刺激されたものである請求項４２記載の方法。
  48. 【請求項４８】 培地で増殖している自己骨髄から誘導されたならし培地を
    、虚血した心臓または肢に注入する請求項４２記載の方法。
  49. 【請求項４９】 自己骨髄が、脈管形成増殖因子の骨髄製造を増進し、かつ
    ／または内皮細胞の増殖、移動または血管形成を促進させることができる、薬剤
    、タンパク質もしくは遺伝子または任意の他の化合物または治療と組合せて投与
    される請求項３６記載の方法。
  50. 【請求項５０】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを一緒に投与する
    請求項４９記載の方法。
  51. 【請求項５１】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを、投与の前に合
    わせる請求項４９記載の方法。
  52. 【請求項５２】 自己骨髄が刺激されたものである請求項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 心筋機能に障害のある患者において心筋機能を高める方法
    であって、有効量の自己骨髄を投与する段階を含む方法。
  54. 【請求項５４】 自己骨髄が注入される請求項５３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 自己骨髄が、心筋内に注入される請求項５３記載の方法。
  56. 【請求項５６】 自己骨髄が、心外膜経由または心内膜経由で注入される請
    求項５５記載の方法。
  57. 【請求項５７】 心内膜経由のアプローチを用いて、カテーテルに基づくア
    プローチが使用される請求項５６記載の方法。
  58. 【請求項５８】 自己骨髄が、末梢的に肢へ筋肉内に注入される請求項５３
    記載の方法。
  59. 【請求項５９】 自己骨髄が刺激されたものである請求項５３記載の方法。
  60. 【請求項６０】 自己骨髄が、1つ以上のサイトカインまたは他のタンパク
    質または刺激剤との接触によって刺激されたものである請求項５９記載の方法。
  61. 【請求項６１】 サイトカインが、HIF-1、EPAS1、MCP-1およびCM-CSFから
    なる群より選択される請求項５９記載の方法。
  62. 【請求項６２】 自己骨髄が、関連遺伝子を有するベクターを用いてトラン
    スフェクトされたものである請求項５９記載の方法。
  63. 【請求項６３】 自己骨髄が、HIF-1もしくはEPAS1トランスジーンもしくは
    、骨髄が脈管形成を誘発する能力を高めるのに有効であることが証明された任意
    の他のトランスジーンを有する、プラスミドベクターもしくはアデノウィルスベ
    クターまたは、遺伝子移動のために有効なことが証明された任意の他のベクター
    を用いてトランスフェクトされたものである請求項６２記載の方法。
  64. 【請求項６４】 自己骨髄が、低酸素またはエネルギーの形態に一時的にさ
    らすことによって刺激されたものである請求項５９記載の方法。
  65. 【請求項６５】 培地で増殖している自己骨髄から誘導されたならし培地を
    、虚血した心臓または肢に注入する請求項５９記載の方法。
  66. 【請求項６６】 自己骨髄が、脈管形成増殖因子の骨髄製造を増進し、かつ
    ／または内皮細胞の増殖、移動または血管形成を促進させることができる、薬剤
    、タンパク質もしくは遺伝子または任意の他の化合物または治療と組合せて投与
    される請求項５３記載の方法。
  67. 【請求項６７】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを一緒に投与する
    請求項６６記載の方法。
  68. 【請求項６８】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを、投与の前に合
    わせる請求項６６記載の方法。
  69. 【請求項６９】 自己骨髄が刺激されたものである請求項６８記載の方法。
  70. 【請求項７０】 患者の心臓における心房または心室の状態を治療する方法
    であって、有効量の自己骨髄を投与する段階を含む方法。
  71. 【請求項７１】 自己骨髄が注入される請求項７０記載の方法。
  72. 【請求項７２】 自己骨髄が、心筋内に注入される請求項７０記載の方法。
  73. 【請求項７３】 自己骨髄が、心外膜経由または心内膜経由で注入される請
    求項７２記載の方法。
  74. 【請求項７４】 心内膜経由のアプローチを用いて、カテーテルに基づくア
    プローチが使用される請求項７３記載の方法。
  75. 【請求項７５】 自己骨髄が、末梢的に肢へ筋肉内に注入される請求項７０
    記載の方法。
  76. 【請求項７６】 自己骨髄が刺激されたものである請求項７０記載の方法。
  77. 【請求項７７】 自己骨髄が、1つ以上のサイトカインまたは他のタンパク
    質または刺激剤との接触によって刺激されたものである請求項７６記載の方法。
  78. 【請求項７８】 サイトカインが、HIF-1、EPAS1、MCP-1およびCM-CSFから
    なる群より選択される請求項７６記載の方法。
  79. 【請求項７９】 自己骨髄が、関連遺伝子を有するベクターを用いてトラン
    スフェクトされたものである請求項７６記載の方法。
  80. 【請求項８０】 自己骨髄が、HIF-1もしくはEPAS1トランスジーンもしくは
    、骨髄が脈管形成を誘発する能力を高めるのに有効であることが証明された任意
    の他のトランスジーンを有する、プラスミドベクターもしくはアデノウィルスベ
    クターまたは、遺伝子移動のために有効なことが証明された任意の他のベクター
    を用いてトランスフェクトされたものである請求項７９記載の方法。
  81. 【請求項８１】 自己骨髄が、低酸素またはエネルギーの形態に一時的にさ
    らすことによって刺激されたものである請求項７６記載の方法。
  82. 【請求項８２】 培地で増殖している自己骨髄から誘導されたならし培地を
    、虚血した心臓または肢に注入する請求項７６記載の方法。
  83. 【請求項８３】 自己骨髄が、脈管形成増殖因子の骨髄製造を増進し、かつ
    ／または内皮細胞の増殖、移動または血管形成を促進させることができる、薬剤
    、タンパク質もしくは遺伝子または任意の他の化合物または治療と組合せて投与
    される請求項７０記載の方法。
  84. 【請求項８４】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを一緒に投与する
    請求項８３記載の方法。
  85. 【請求項８５】 自己骨髄および他の剤または剤の組合せを、投与の前に合
    わせる請求項８３記載の方法。
  86. 【請求項８６】 自己骨髄が刺激されたものである請求項８５記載の方法。
  87. 【請求項８７】 有効量の自己骨髄を含む、心臓または心筋状態の治療のた
    めの組成物であって、心臓または心筋状態が治療される組成物。
  88. 【請求項８８】 自己骨髄が刺激されたものである請求項８７記載の組成物
    。
  89. 【請求項８９】 自己骨髄が、1つ以上のサイトカインまたは他のタンパク
    質または刺激剤との接触によって刺激されたものである請求項８８記載の組成物
    。
  90. 【請求項９０】 サイトカインが、HIF-1、EPAS1、MCP-1およびCM-CSFから
    なる群より選択される請求項８９記載の組成物。
  91. 【請求項９１】 自己骨髄が、関連遺伝子を有するベクターを用いてトラン
    スフェクトされたものである請求項８８記載の組成物。
  92. 【請求項９２】 自己骨髄が、HIF-1もしくはEPAS1トランスジーンもしくは
    、骨髄が脈管形成を誘発する能力を高めるのに有効であることが証明された任意
    の他のトランスジーンを有する、プラスミドベクターもしくはアデノウィルスベ
    クターまたは、遺伝子移動のために有効なことが証明された任意の他のベクター
    を用いてトランスフェクトされたものである請求項９１記載の組成物。
  93. 【請求項９３】 自己骨髄が、低酸素にさらすことによって刺激されたもの
    である請求項８９記載の組成物。
  94. 【請求項９４】 培地で増殖している自己骨髄から誘導されたならし培地を
    、虚血した心臓または肢に注入する請求項８９記載の組成物。
  95. 【請求項９５】 自己骨髄が、脈管形成増殖因子の骨髄製造を増進し、かつ
    ／または内皮細胞の増殖、移動または血管形成を促進させることができる、薬剤
    、タンパク質もしくは遺伝子または任意の他の化合物または治療と組合せて投与
    される請求項８７記載の組成物。
  96. 【請求項９６】 ヘパリンまたは他の抗凝固剤を含む請求項８７記載の組成
    物。
  97. 【請求項９７】 側副枝血管形成を増進させるための請求項８７記載の組成
    物。
  98. 【請求項９８】 新たに移植された心筋細胞の発達を促進するための請求項
    ８７記載の組成物。
  99. 【請求項９９】 心臓の電気的経路の障害を有する患者の心臓の導電性を改
    善するための請求項８７記載の組成物。
  100. 【請求項１００】 心筋機能に障害のある患者において心筋機能を高めるた
    めの請求項８７記載の組成物。
  101. 【請求項１０１】 患者の心臓において障害のある心臓機能を引き起こす左
    心室または右心室の状態を治療するための請求項８７記載の組成物。
  102. 【請求項１０２】 患者の心臓の収縮性に影響を与えるための請求項８７記
    載の組成物。
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