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JP2002540814A - 転移性前立腺腫瘍の診断および処置のための方法 - Google Patents

転移性前立腺腫瘍の診断および処置のための方法

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JP2002540814A
JP2002540814A JP2000611075A JP2000611075A JP2002540814A JP 2002540814 A JP2002540814 A JP 2002540814A JP 2000611075 A JP2000611075 A JP 2000611075A JP 2000611075 A JP2000611075 A JP 2000611075A JP 2002540814 A JP2002540814 A JP 2002540814A
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ノースウエスト バイオセラピューティクス，インコーポレイティド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、血管内皮成長因子−Ｃおよび−Ｄ（「ＶＥＧＦ−Ｃ」、「ＶＥＧＦ−Ｄ」）の細胞レセプターであるｆｌｔ−４の発現についてスクリーニングすることにより、転移性の可能性を有する前立腺腫瘍細胞もしくはそれに由来する細胞または二次前立腺腫瘍転移性である細胞を同定するための方法に関する。本発明はまた、ｆｌｔ−４の発現または機能を阻害すること（例えば、治療薬の投与によりｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体形成（結合）を阻害すること）により、ｆｌｔ−４などの発現または活性を阻害することにより二次前立腺腫瘍転移を処置、阻害または予防するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、血管内皮増殖因子−Ｃ（「ＶＥＧＦ−Ｃ」）および血管内皮増殖因
子−Ｄ（「ＶＥＧＦ−Ｄ」）の細胞レセプターであるｆｌｔ−４の発現または活
性についてスクリーニングすることによって、転移性の可能性を有する前立腺癌
細胞または二次前立腺腫瘍転移である細胞、あるいはそれに由来する細胞の同定
のための方法に関する。本発明はまた、ｆｌｔ−４の発現または活性を阻害する
こと（例えば、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ複合体またはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−
Ｄ複合体形成（結合）を阻害すること）によって、二次前立腺腫瘍転移を処置、
妨害または予防するための方法に関する。そのような方法において有用である組
成物もまた提供される。
【０００２】 （２．発明の背景） 前立腺癌の発症および進行はあまり理解されないままである。新生物形質転換
は、ｐ５３またはｒａｓの変異および／または増殖制御因子の非平衡のような多
重機構を含む。
【０００３】 ＶＥＧＦは、ヘパリン結合性の二量体ポリペプチド増殖因子であって、元来は
、その血管透過性増強活性に基づいて精製され、そして続いて、内皮細胞に対す
る強力な有糸分裂活性であることが示された（以下に概説される：Ｓｈｉｂｕｙ
ａ，１９９５，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：２８１−３１６）。ＶＥ
ＧＦは、固形腫瘍における脈管形成および血管透過性の両方に影響を与（Ｆｅｒ
ｒａｒａ，１９９５，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３６
：１２７−１３７；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２１１−８．；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９６，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．７：２５９
−７０）。月経周期の間に特に、正常な組織のいくつか（Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ
ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２３５−２２４３
）、および創傷治癒（Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０：１２６０７−１２６１３），によってもまた生成され、そして
糖尿病網膜症および関節障害の血管病理において重要な役割を果たすと考えられ
ている（Ｆｅｒｒａｒａ，１９９５，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔ
ｒｅａｔ．３６：１２７−１３７）。
【０００４】 前立腺において、ＶＥＧＦの発現は、非悪性上皮細胞（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５４：５７６−５７９；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７：２３２３−２３２８）および癌
細胞（Ｆｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７：２３２
９−２３３３；Ｆｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｕｒｏｌｏｇｙ ５１
：１６１−１６７；Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ７４：９１０−９１６；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ
．Ｕｒｏｌ．１５７：２３２３−２３２８）での両方で報告されている。位置決
め研究によって、ＶＥＧＦの存在は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベル
で、前立腺癌細胞、腫瘍関連間質、および良性前立腺過形成（「ＢＲＨ」）上皮
細胞の一部において示された（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．
Ｕｒｏｌ．１５７：２３２３−２３２８）。正常のおよび形質転換した前立腺上
皮におけるＶＥＧＦの相対レベルは、問題が多くかつ不明確のままである（Ｗｏ
ｅｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．６５
：３７−５２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，１９９７，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７：２０４
０−２０４１）。前立腺癌において、微小血管密度の増加が疾患段階および転移
と相関付けられたことが見出された（Ｂｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，
Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２４：２２０−６；Ｂｒａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
９４，Ｃａｎｃｅｒ ７３：６７８−６８７．；Ｄｅｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．
，１９９５，前立腺２６：１１１−１１５．；Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１
９９５，Ｃａｎｃｅｒ ７５：２５４５−２４５１；Ｗｅｉｄｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６，Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ａｄｖ．Ｏｎｃｏｌ．１６７−１９０．
）。新血管形成の増加もまた、前立腺上皮内腫瘍形成（「ＰＩＮ」）において見
出されている（Ｂｒａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ ７３：
６７８−６８７；Ｆｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５
７：２３２９−２３３３；Ｆｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｕｒｏｌｏ
ｇｙ ５１：１６１−１６７；Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｒ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４：９１０−９１６）ａｎｄ ｌａｔｅｎｔ ｃａｒｃｉ
ｎｏｍａ（Ｆｕｒｕｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ ７０：１２４４−１２４６）。上昇したレベルの脈管形成が、ヌードマウス
に移植されるときにヒト細胞株ＰＣ−３およびＤＵ−１４５由来の腫瘍において
見出されている（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｕｒｏｌ．
１６０：９３２−９３６）。まとめると、これらの研究によって、腫瘍増殖の脈
管形成を介したＶＥＧＦについての栄養的役割が示唆される。
【０００５】 ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦと３２％のアミノ酸同一性を有する別の内皮増殖因
子であり、そしてもともと、ヒト前立腺ホルモン無反応性細胞株ＰＣ３からクロ
ーニングされた（Ｊｏｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．１７３：２１１−２１５；Ｊｏｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９６
，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：２９０２９８；Ｊｏｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９
７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：３８９８−３９１１）。ＶＥＧＦがけつっかんの内皮
細胞に特異的であるが、ＶＥＧＦ−Ｃは、リンパ血管原性因子（ｌｙｍｐｈａｎ
ｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）である。ＶＥＧＦ−Ｃに対するレセプターで
あるｆｌｋ−１ およびｆｌｔ−４の両方は、リンパ内皮細胞および黒色腫にお
いて発現する（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１７８：２０７７−２０８８）。トランスジェニックマウスを用いた実験
によって、ＶＥＧＦ−Ｃの発現が正常組織のリンパ血管の発生と関連することが
見いだされた（Ｊｅｌｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７６：１４２３−１４２５）。ＶＥＧＦ−Ｃは、ニワトリの漿尿膜におけるリン
パ管の成長を誘導する（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１
８８：９６−１０９）。
【０００６】 Ｆｌｔ−４は、レセプター型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、他のＶＥＧ
Ｆレセプターに類似する７つのＩｇ様ドメインを伴う。ｆｌｔ−４の発現は、最
初に、初期胚における血管芽細胞および小静脈に局在していた。これは、発生後
期の間に、リンパ内皮細胞に限定されるようになり、そしてヒト成体組織におい
ていくつかの高度の内皮小静脈に限定される（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ
．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３５６
６−３５７０；Ｋａｉｐａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１７８：２０７７−２０８８）。Ｆｌｔ−４の発現は、ヒト皮膚において
公知のリンパ血管パターンにおいて一致している（Ｌｙｍｂｏｕｓｓａｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：３９５−４０３）。
この発現パターンは、Ｆｌｔ−４は、リンパ血管形成の調節において役割を果た
し得ることを示唆する（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３５６６−３５７０；Ｋａｉ
ｐａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：２０７
７−２０８８；Ｍｕｓｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．１２９：８９５−８９８）。Ｆｌｔ−４の発現はまた、黒色腫において
見出されている（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９０：７０２−７０８）。
ＶＥＧＦ−Ｃに加えて、ＶＥＧＦ−Ｄはまた、ｆｌｔ−４についてのリガンドで
ある（Ａｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：５４８−５５３；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９
７，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４２：４８３−４８８）。
【０００７】 第２節または本願の他の任意の節における任意の参考文献の引用または表示は
、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承諾とは
解釈されるべきではない。
【０００８】 （３．発明の要旨） 本発明は、部分的に、前立腺細胞におけるｆｌｔ−４の発現がそのような前立
腺細胞が癌性前立腺細胞であって、転移性の可能性または原発性前率性腫瘍の二
次腫瘍転移物であるか、それらに由来するものであることを示すという驚くべき
発見に基づく。
【０００９】 本発明は、前立腺癌細胞においてｆｌｔ−４の発現または活性を検出する工程
を包含する、転移性の可能性の検出のための方法に関する。ここで、ｆｌｔ−４
の発現または活性は、その細胞が転移性の可能性を有することを示す。本発明は
また、転移性の可能性の検出のための方法に関する。この方法は、被検体から得
られた体液サンプルにおける前立腺細胞を同定する工程、およびその細胞におけ
るｆｌｔ−４の発現もしくは活性を検出する工程を包含する。ここで、ｆｌｔ−
４の発現は、その細胞が、転移性の可能性を有するか、または二次腫瘍転移性で
あるか、あるいはそれらに由来する、前立腺癌細胞であることを示す。前立腺細
胞は、前立腺細胞特異的マーカーを用いて同定され得、そして体液サンプル（例
えば、血液、尿、精液）から得られ得る。好ましい実施形態において、その前立
腺細胞は、ｆｌｔ−４発現について、フローサイトメーターにおいて、前立腺細
胞特異的マーカーについて特異的な抗体およびｆｌｔ−４に特異的な抗体を用い
て同時に同定され得、そしてスクリーニングされ得る。別の好ましい実施形態に
おいて、レーザ走査サイトメーターを用いて、前立腺特異的マーカーに対して特
異的な抗体およびｆｌｔ−４について特異的な抗体を用いてその前立腺細胞が同
時に同定され得そしてスクリーニングされ得る。
【００１０】 本発明はまた、被検体において転移性前立腺癌を診断するための方法に関する
。この方法は、その被検体から得られた体液サンプル前立腺癌を検出する工程、
およびその前立腺癌におけるｆｌｔ−４の発現もしくは活性を検出する工程を包
含する。ここで、その細胞におけるｆｌｔ−４の発現または活性は、その被検体
が転移性前立腺癌を有することを示す。本発明はまた、前立腺癌を有する被検体
の予後を判定するための方法に関する。この方法は、前立腺癌を有する被検体か
ら得られた体液サンプルにおける前立腺癌を同定する工程、およびその前立腺細
胞におけるｆｌｔ−４の発現もしくは活性を検出する工程を包含する。ここで、
その被検体から得られた前立腺癌におけるｆｌｔ−４の発現または活性は、その
被検体が、前立腺癌がｆｌｔ−４の発現または活性が検出されない第二の被検体
に比較してより悪い予後を有することを示す。転移性前立腺癌の処置または妨害
の方法の効力をモニターするための方法もまた提供される。
【００１１】 本発明は、被検体における二次前立腺主張転移を、処置、妨害または予防する
ための方法に関する。この方法は、ｆｌｔ−４発現または活性を阻害する、１つ
以上の化合物または分子を、投与することによる。そのような化合物または分子
の例示的な例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ｆｌｔ−４
のフラグメントまたはそれをコードする核酸分子、ｆｌｔ−４の発現を阻害する
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｆｌｔ−４またはｆｌｔ−４とそのリガンド
ＶＥＧＦ−Ｃとの複合体もしくはそのＶＥＧＦ−Ｄに特異的な抗体など。本発明
はさらに、本明細書において上記の方法において使用され得る組成物に関する。
【００１２】 本発明はさらに、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ複合体またはｆｌｔ−４：ＶＥＧ
Ｆ−Ｄ複合体の活性を阻害するための方法に関する。ｆｌｔ−４発現または活性
を阻害する分子を同定する方法が提供される。ｆｌｔ−４の発現もしくは活性ま
たはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ もしくはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｄ複合体のモ
ジュレーター（すなわち、アゴニストおよびアンタゴニスト）について動物モデ
ルおよび方法もまた提供される。
【００１３】 （５．発明の詳細な説明） 本発明は、一部前立腺細胞におけるｆｌｔ−４の発現がそのような前立腺細胞
が転移性の可能性を有するか、または原発性前立腺腫瘍の二次腫瘍転移であるか
、あるいはそれらに由来することを示すという驚くべき発見に基づく。特定の作
用均衡には限定されることを意図しないが、ＶＥＧＦ−Ｃおよびその細胞表面レ
セプターであるｆｌｔ−４は、リンパ血液生成の促進に相関付けられたことが、
本発明の前に知られていたものの、ＶＥＧＦ−Ｃおよびｆｌｔ−４は、オートク
ラインフィードバックループに関与し、二次前立腺腫瘍転移の促進および形成を
生じることは知られていなかった。さらに、本発明者らは、ｆｌｔ−４の別のリ
ガンドであるＶＥＧＦ−Ｄおよびｆｌｔ−４もまたオートクラインフィードバッ
クループに関与し、二次前立腺腫瘍転移の促進および経製に関与すると考える。
【００１４】 本発明は、転移性の可能性の検出のための方法に関する。この方法は、前立腺
細胞におけるｆｌｔ−４の発現または活性を検出する工程であって、ｆｌｔ−４
の発現または活性は、その細胞が転移性の可能性を有することを示す。本発明は
また、転移性の可能性の検出のために方法に関する。この方法は、被験体から得
られた体液サンプル中に前立腺細胞を同定する工程、および該細胞においてｆｌ
ｔ−４の発現または活性を検出する工程を包含する。ここで、ｆｌｔ−４の発現
は、該細胞が転移性の可能性を有するかまたは二次腫瘍転移性であるかあるいは
、それらに由来する前立腺細胞であることを示す。この前立腺細胞は、前立腺特
異的マーカーを用いて同定され得、そして体液サンプルから得られ得る（例えば
、血液、尿、精液）。好ましい実施形態において、フローサイトメーターにおい
て前立腺細胞特異的マーカーに特異的なおよびｆｌｔ−４について特異的な抗体
を用いて、その前立腺細胞がｆｌｔ−４発現について同時に同定され得、そして
スクリーニングされ得る。
【００１５】 二次前立腺腫瘍転移を処置、阻害または予防するための方法が提供される。こ
れは、ｆｌｔ−４の発現または活性を阻害する分子の処置、妨害または予防的な
そのような投与を必要とする被験体に投与することによる。そのような分子の例
としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：そのリガンドであるＶＥ
ＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄに結合するｆｌｔ−４の競合インヒビターとして作
用するｆｌｔ−４のフラグメント、ｆｌｔ−４に対する抗体、アンチセンス核酸
など。二次前立腺腫瘍転移のための診断、予後およびスクリーニングのための方
法もまた提供される。そのような方法を実施するための組成物もまた、本発明に
おいて提供される。例えば、そのような方法は、転移性の可能性を有する前立腺
細胞についての病理学者のスクリーニング組織生検（例えば、前立腺組織または
リンパ節組織検生検）によって使用され得る。
【００１６】 本発明はまた、前立腺癌の診断および／または予後のために、ｆｌｔ−４：Ｖ
ＥＧＦ−Ｃ複合体またはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｄ複合体（「ｆｌｔ−４：ＶＥ
ＧＦ−Ｃ／Ｄ」）の存在についてアッセイする方法に関する。本願において使用
される「ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ」は、ｆｌｔ−４とＶＥＧＦ−Ｃとの複
合体またはｆｌｔ−４とＶＥＧＦ−Ｄとの複合体を示す。
【００１７】 開示の明確さのために、そして例示の目的ではなく、本発明の詳細な説明は、
以下の節（亜節）に分割される。
【００１８】 （５．１ 前立腺細胞におけるｆｌｔ−４発現） 前立腺細胞におけるＦｌｔ−４発現は、その前立腺癌細胞が転移性の可能性を
有することを示すか、またはその前立腺癌細胞が二次前立腺癌腫瘍転移性である
か、あるいはそれらに由来することを示す。従って、ｆｌｔ−４の発現は、前立
腺癌細胞の転移性の可能性を評価するにおいて、および原発性前立腺腫瘍に由来
する二次腫瘍転移性の存在についてスクリーニングするにおいて、診断および予
後の有用性を有する。
【００１９】 本発明の１つの実施形態において、前立腺細胞は、前立腺細胞特異的マーカー
の発現によって同定され、そしてその同定された前立腺細胞は、ｆｌｔ−４発現
についてスクリーニングされる。本発明の別の実施形態において、前立腺癌は、
前立腺細胞特異的マーカーの発現によって同定され、そしてその同定された前立
腺細胞は、ｆｌｔ−４発現についてスクリーニングされる。本発明の別の実施形
態において、その前立腺細胞は、前立腺細胞特異的マーカーに特異的な抗体およ
びｆｌｔ−４に対して特異的なマーカーを同時の用いて同定およびスクリーニン
グされる。
【００２０】 ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体またはｆｌｔ−４タンパク質発現のレベ
ルを検出すること、あるいは前立腺細胞におけるｆｌｔ−４をコードするｍＲＮ
Ａのレベルを検出することは、その前立腺細胞が転移性の可能性を有するか否か
、またはその前立腺細胞が二次前立腺腫瘍転移性であるか、それらに由来するか
否かを決定するために使用され得る。さらに、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複
合体またはｆ１ｔ−４発現の前立腺細胞における検出は、前立腺癌の予後に使用
して、前立腺癌の経過を追跡し得、治療応答を追跡し得、他のことをし得る。
【００２１】 前立腺細胞は、当業者に公知の任意の方法によって検出され得る。例えば、前
立腺細胞は、前立腺細胞特異的マーカーに特異的な抗体を用いるか、または前立
腺細胞マーカーに特異的な抗体の結合ドメインを含むフラグメントを用いて検出
され得る。好ましくは、使用される抗体は、モノクローナル抗体である。
【００２２】 前立腺細胞特異的マーカーは公知であり、そして前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）
、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ）、前立腺
酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、およびヒト腺カリクレイン２ （ＨＫ−２）を含
む。Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７３５により同定された別の前立腺細胞特異的マーカ
ーは、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。なお別の前立腺細胞特異的マーカ
ーは、ＰＴＩ−Ｉ（Ｓｈｅｎｅｔａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６７７８により同定された前立腺癌オンコージー
ン）である。前立腺細胞特異的マーカーの一般的な概説については以下を参照の
こと：Ｎｅｌｓｏｎｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｏｒｎｉｃｓ ４７：１２
。
【００２３】 好ましい実施形態において、前立腺細胞は、ＰＳＭＡに特異的なモノクローナ
ル抗体を用いることにより検出される。ＰＳＭＡは、前立腺組織において発現さ
れるおよそ１２０ｋＤａの分子量のタンパク質であり、そしてもともと、７ＥＩ
１ −Ｃ５と称されるモノクローナル抗体との反応性によって同定された。Ｈ
ｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．７．９２７−９３５；米国特許第５，１６２，５０４号。ＰＳＭＡは、精製
形態（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎ
ｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ ３：Ａｂｓｔｒａｃｔ １９３）で入手され、そしてトランスフェリンレセ
プターといくらかの配列同一性を有し（Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９
４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１８０７−１８１ １）そしてＮＡＡＬＡＤ
ａｓｅ活性 （Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７４９−７５３）を有するＩＩ型膜貫通タン
パク質として特徴付けられた。より重要には、ＰＳＭＡは、正常前立腺、良性前
立腺過形成および前立腺癌において発現され、ＰＳＭＡは、増加した量で前立腺
癌において発現され、そして上昇したレベルのＰＳＭＡはまた、これらの前立腺
癌患者の血清において検出可能である。Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．
，１ ５ １９８７，前出；Ｒｏｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，前立腺２
５：２１９−２２３；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｓｔａｔ
ｅ２６：１６４−１６８；ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａ
ｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１４７３。ＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡ
がクローニングされている。Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７−２３０。
【００２４】 ＰＳＭＡ特異的抗原が公知であり、そして以下を含む：７Ｅ１ ＬＣ５（ＡＴ
ＣＣ受託番号 ＨＢ １ ０４９４）；３１７５ＡＧ６（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ
１２０６０）；３Ｄ７−１．１（ＡＴＣＣ受託番号 ＨＢ １２３０９）；４
Ｅ １ ０−１．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １２３ １ ０）；１ Ｇ３（
ＡＴＣＣ受託番号 ＨＢ−１２４８９）；１Ｇ９（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２
４９５）；２Ｃ７（ＡＴＣＣ受託番号 ＨＢ−１２４９０）；３Ｃ４（ＡＴＣＣ
受託番号ＨＢ−１２４９４）；３Ｃ６（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４９１）；
３Ｃ９（ＡＴＣＣ受託番号１１１３−１２４８４）；３Ｅ６（ＡＴＣＣ受託番号
ＨＢ−１２４８６）；３Ｅ １１（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４８８）；３
Ｇ６（ＡＴＣＣ受託番号１２４８ ５）；４Ｄ４（ＡＴＣＣ受託番号 ＨＢ−１
２４９３）；４Ｄ８（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４８７）；または４Ｃ８Ｂ９
（ＡＴＣＣ受託番号 ＨＢ−１２４９２）。以下もまた参照のこと：ＷＯ９７／
３５６１６。本発明において使用され得る他のＰＳＭＡ特異的抗原としては以下
が挙げられる：Ｅ９９（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２ １ ０ １）；Ｊ４１５
（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２１０９）；Ｊ５３３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１
２１２７）；および Ｊ５９１（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１ ２１２６）。これ
らは各々、Ｂａｎｄｅｒ，国際特許公開ＷＯ ９８／０３８７３により単離され
た。さらなる非限定的な例のＰＳＭＡ特異的抗体であって、本発明の方法におい
て使用され得るものは、表１に提示する。表１に提示される抗体はすべて、マウ
スＩｇＧモノクローナル抗体であり、これは、ネイティブＰＳＭＡに反応性であ
る。各抗体の結合エピトープのおよその位置ならびに各抗体のアイソタイプサブ
クラスもまた、表１にまとめる。
【００２５】 （表１）ネイティブＰＳＭＡおよびＰＳＭＡフラグメントに対するＰＳＭＡ特
異的抗体の結合特異性およびアイソタイプ
【００２６】
【表１】 aアイソタイプ特異性は、マウス抗体アイソタイプ決定のためにＩｓｏＳｔｒｉ
ｐ試験（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、決定し、これは
、製造者の指示書に従った。
【００２７】 別の実施形態において、前立腺細胞は、以下からなる群より選択される前立腺
細胞特異的マーカーに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて検出される：
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ）、前立腺酸ホス
ファターゼ（ＰＡＰ），ヒト腺カリクレイン２（ＨＫ−２），前立腺幹細胞抗原
（ＰＳＣＡ）、およびＰＴＩ。
【００２８】 なお別の実施形態において、前立腺細胞を、ＰＲ−１モノクローナル抗体（Ａ
ＴＣＣ受託番号ＨＢ−１１１４５；Ｐａｓｔａｎ、米国特許第５．４８９，５２
５号）を用いて検出する。
【００２９】 さらに、以下を含む抗原結合領域の少なくとも一部を有するモノクローナル抗
体の精製されたフラグメントを含む、前立腺細胞マーカーに対して特異的な抗体
の一部が本発明において用いられ得る：例えば、Ｆｖ，Ｆ（ａｂ），Ｆａｂフラ
グメント（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７
７８号）、キメラまたはヒト化された抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，
１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１；
Ｎｅｗｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎａｔｕｒｅ ８１：６８５
１）および相補性決定領域（ＣＤＲ）。抗体の模倣物もまた、本発明において
使用され得る。
【００３０】 次いで、前立腺細胞マーカー特異的抗体、またはその一部は、検出マーカーを
用いて直接または間接的に標識された抗体を有することによって検出され得る。
あるいは、前立腺細胞マーカー特異的抗体（「第一抗体」）は、前立腺細胞マー
カー特異的抗体に対して特異的である第二抗体と接触され得る。この第二抗体は
、直接または検出マーカーを用いて間接的に標識され得る。そのような検出マー
カーとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：放射性部分、基質変
換酵素、蛍光マーカー、ビオチンなど。一般的な概説としては、以下を参照のこ
と：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｊｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８
８，Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ。
【００３１】 代替的な実施形態において、前立腺細胞は、前立腺細胞特異的マーカーをコー
ドする配列ならびに関連する配列またはサブ配列（相補配列を含む）のレベルを
測定することによって検出され得る。例えば、ＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡが
クローニングされている。Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７。この前立腺細胞特異的マーカー核酸配列、または
そのサブ配列であって、８ヌクレオチドを含むものは、ハイブリダイゼーション
プローブとして使用され得る。ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、前
立腺細胞特異的マーカーの発現を検出し得、従って、前立腺細胞を検出し得る。
【００３２】 特に、そのようなハイブリダイゼーションアッセイは、ハイブリダイゼーショ
ンが生じ得る条件下でＰＳＭＡにハイブリダイズし得る核酸プローブに、核酸を
含むサンプルを接触させる工程、および任意の生じるハイブリダイゼーションを
測定する工程を包含する方法によって実施される。
【００３３】 一旦前立腺細胞が同定されると、前立腺細胞は、ｆｌｔ−４発現についてスク
リーニングされる。Ｆｌｔ−４発現は、当業者に公知の任意の方法によって検出
され得る。例えば、ｆｌｔ−４発現は、ｆｌｔ−４に対して特異的な抗体を用い
ることか、またはｆｌｔ−４について特異的な抗体の結合ドメインを含むフラグ
メントを用いて検出され得る。そのような抗体は、当該分野において周知であり
、そして過度な実験を伴うことなく、当該分野において周知の方法を用いて生成
され得る。下記第５．３節を参照のこと。好ましい実施形態において、ｆｌｔ−
４発現は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃｏｒｐ．（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）か
ら得られる抗ｆｌｔ−４抗体を用いて検出される。さらに、前立腺細胞マーカー
に特異的な抗体の一部（抗原結合領域の少なくとも一部を有するモノクローナル
抗体の精製されたフラグメント（例えば、Ｆｖ，Ｆ（ａｂ’）2，Ｆａｂフラグ
メント）を含む）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、単鎖抗体（米国特許第４，９
４６，７７８号）、キメラまたはヒト化の抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ
．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５
１；Ｎｅｗｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎａｔｕｒｅ ８１：
６８５ １）ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）が本発明において使用され得る
。抗体の模倣体はまた、本発明において使用され得る。
【００３４】 使用され得る免疫アッセイとしては以下が挙げられるがそれらに限定されない
：当該分野において公知の、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳ
Ａ（酵素連結免疫ソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫
沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッ
セイ、補体固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイ
ンＡ免疫アッセイなどのような技術を用いた競合アッセイおよび非競合アッセイ
系。
【００３５】 次いで、ｆｌｔ−４抗体またはその一部は、検出可能マーカーで直接または間
接的に標識された抗体を有することによって検出され得る。あるいは、前立腺細
胞マーカー特異的抗体（「第一抗体」）は、前立腺細胞マーカー特異的抗体に対
して特異的である第二抗体と接触され得る。この第二抗体は、直接または検出マ
ーカーを用いて間接的に標識され得る。そのような検出マーカーとしては、以下
が挙げられるがそれらに限定されない：放射性部分、基質変換酵素、蛍光マーカ
ー、ビオチンなど。一般的な概説としては、以下を参照のこと：Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｊｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｈａｒｌｏｗ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【００３６】 Ｆｌｔ−４発現はまた、ｆｌｔ−４をコードする核酸配列、ならびに関連核酸
配列およびサブ配列（相補配列を含む）のレベルを測定することによって検出さ
れ得る。ｆｌｔ−４をコードするｃＤＮＡはクローニングされている（Ｇａｌｌ
ａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１３（２）：４７５−４７
８）。そしてｆｌｔ−４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、図１Ａ−Ｆ
（配列番号１および２）に示される。このｆｌｔ−４ 核酸配列またはそのサブ
配列（少なくとも８ヌクレオチドを含む）は、ハイブリダイゼーションプローブ
として使用され得る。ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、前立腺細胞
におけるｆｌｔ−４の発現を検出し得、そして従って、転移性の可能性を有する
前立腺細胞を検出し得る。特に、そのようなハイブリダイゼーションアッセイは
、ハイブリダイゼーションが生じ得る条件下でＰＳＭＡにハイブリダイズし得る
核酸プローブに、核酸を含むサンプルを接触させる工程、および任意の生じるハ
イブリダイゼーションを測定する工程を包含する方法によって実施される。
【００３７】 本発明の好ましい実施形態において、ｆｌｔ−４発現前立腺細胞は、フローサ
イトメーターを用いて検出され得る。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）
フローサイトメトリーは、抗体ベースの細胞検出および分離についての一般的な
技術である。代表的に、フローサイトメトリーによる検出および分離は、以下の
とおりである。目的の細胞を含むサンプルに、蛍光色素結合体化された抗体を接
触させる。これは、特異的細胞マーカー（例えば、ＰＳＭＡおよびｆｌｔ−４）
に対してその抗体の結合をさせる。次いで、結合した細胞を、１回以上の遠心分
離および再懸濁工程によって洗浄する。次いで、この細胞を、ＦＡＣＳにかけ、
これは、細胞を、細胞に結合した蛍光色素によって付与される異なる蛍光特性に
基づいて分離する。ＦＡＣＳシステムは、異なるレベルの性能および能力（本発
明において好ましい多色分析を含む）で入手可能である。例えば、以下を参照の
こと：Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｈａｐｔｅｒ ２９：Ｆｌｏｗ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）ｉｎ． Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅａｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ：Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂｌａｃｋｗ
ｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
Ａ。前立腺細胞は代表的に、体液サンプル（血液、精液および尿を含む）から入
手される。
【００３８】 本発明のこの実施形態の１つの局面において、体液サンプルにおける細胞は、
まず、前立腺細胞特異的マーカーに特異的な抗体に接触され、そしてｆｌｔ−４
に特異的な抗体に接触される。これらの「第一の」抗体は、例えば、蛍光マーカ
ーまたはビオチンで直接または間接的のいずれかで標識され得る。あるいは、こ
れらの「第一の」抗体は、その第一の抗体に対して特異的な「第二の」抗体と反
応され得、そしてこの第二の抗体は、例えば、蛍光マーカーで直接または間接的
にのいずれかで標識されている。別の局面において、ＰＳＭＡに特異的であるこ
の「第一の」抗体は、ビオチンで直接標識され、そしてビオチンに特異的な「第
二の」抗体は、蛍光マーカーで直接標識される；ｆｌｔ−４に対して特異的なこ
の「第一の」抗体は、蛍光マーカーで間接的に標識される。次いで、この抗体に
接触された細胞は、フローサイトメーターにおいてアッセイされる。
【００３９】 前立腺細胞に関連する蛍光標識およびｆｌｔ−４に関連する蛍光標識は、異な
る波長で蛍光する必要があり、その結果、前立腺細胞およびｆｌｔ−４を発現す
る前立腺細胞が識別され得る。フローサイトメーターを、それぞれの異なる波長
により検出される蛍光は、ｆｌｔ−４発現前立腺細胞をそのサンプルにおいて検
出することを、その蛍光に基づく細胞の前方散乱および側方散乱の特徴的なプロ
ファイルによって可能にする。
【００４０】 本発明のこの実施形態の１つの局面において、その体液が精液である場合、そ
のような精液サンプルからの細胞は、ＤＮＡに対して特異的な蛍光を用いて染色
され得、その結果、一倍体精子細胞が、二倍体前立腺細胞から識別され得る。次
いで、この一倍体細胞は、特定のゲート処理（すなわち、ＤＮＡシグナルヒスト
グラム）による分析によって除去され得る。しかし、細胞サンプルのＤＮＡ染色
は、常に必要というわけではなく、そして細胞数およびそのサンプルの品質（例
えば、存在する細胞の数）に関してそのサンプルに依存し得る。
【００４１】 フローサイトメトリーの他の検出および分離の方法もまた、ｆｌｔ−４発現前
立腺細胞を、迅速な様式で検出するために提供される。１つのそのような方法は
、アフィニティークロマトグラフィーによるビオチン−アビジンベースの分離で
ある。代表的には、そのような技術は、ＰＳＭＡおよびｆｌｔ−４のようなマー
カーに特異的な、ビオチン結合体化された抗体と、その細胞のサンプルとをイン
キュベートすること、続いてアビジンカラムを通過させることによって行われる
。ビオチン抗体細胞複合体は、ビオチン−アビジン相互作用を介してカラムに結
合し、他方で、他の細胞は、そのカラムを通過する。ビオチン−アビジン系の特
異性ヒア、迅速で陽性の検出および分離について充分に適切である。
【００４２】 本発明の別の好ましい実施形態において、ｆｌｔ−４発現前立腺細胞は、レー
ザ走査サイトメーターを用いて検出され得る。代表的には、レーザ走査サイトメ
ーターは、以下のとおりで行われる。目的のサンプルを含むサンプル（例えば、
前立腺生検またはリンパ節生検）を、スライドに固定し、そしてその細胞を蛍光
色素結合体化抗体に接触させ、これを、前立腺細胞特異的マーカーおよびｆｌｔ
−４に対して抗体を結合させる。これは、細胞に結合した蛍光色素によって付与
される異なる蛍光特性に基づいて、前立腺細胞、ｆｌｔ−４発現細胞およびｆｌ
ｔ−４を発現する前立腺細胞の同定を可能にする。
【００４３】 さらに別の方法は、抗体コーティングされた磁性ビーズを用いる磁性分離であ
る。Ｋｅｍｍｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ １４７：１９７−２００；Ｒａｃｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４５８９。
【００４４】 代替的な実施形態において、ｆｌｔ−４を発現する前立腺細胞は、ｆｌｔ−４
：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体に対して特異的な抗体に前立腺細胞を接触させること
によって検出され得る。特に、そのようなイムノアッセイは、抗ｆｌｔ−４：Ｖ
ＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体抗体に、免疫特異的結合が生じ得るような条件下で前立腺
細胞を含む患者に由来するサンプルを接触させること、ならびにその抗体による
任意の免疫特異的結合の量を検出または測定することを包含する方法によって実
施される。
【００４５】 使用され得る免疫アッセイとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されな
い：当該分野において公知の、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素連結免疫ソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集ア
ッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテ
インＡ免疫アッセイなどのような技術を用いた競合アッセイおよび非競合アッセ
イ系。
【００４６】 診断用途のためのキットもまた本発明において提供される。これは、１つ以上
の容器中に、抗ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体抗体または抗ｆｌｔ−４抗
体、または前立腺細胞特異的マーカーに指向される抗体、ならびに必要に応じて
、その抗体に対する標識された結合パートナーを含む。あるいは、その抗体は、
検出マーカー（例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分または放射部分）に
よって標識され得る。１つ以上の容器中にｆｌｔ−４および／または前立腺細胞
特異的マーカーをコードする核酸とハイブリダイズし得る核酸プローブ（例えば
、ＰＳＭＡ ｍＲＮＡ）を含むキットもまた提供される。特定の実施形態におい
て、キットは、１つ以上のよう期中に、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（例え
ば、以下を参照のこと：Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ ３２０，３０８）、Ｑβレプリカーゼの使
用、サイクルプローブ反応または他の当該分野において公知の方法により）、ｆ
ｌｔ−４および／または前立腺細胞特異的マーカーをコードする核酸の少なくと
も一部の適切な反応条件下でプライム刺激増幅し得る１対のプライマー（例えば
、各々６〜３０ヌクレオチドのサイズ範囲にある）を含み得る。キットは、必要
に応じて、容器中に、所定量の精製されたｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体
、またはｆｌｔ−４および／もしくは前立腺細胞特異的マーカーあるいはそれら
をコードする核酸を、例えば、標準またはコントロールとしてさらに含み得る。
【００４７】 （５．２．治療剤およびその使用） 本発明はまた、二次前立腺腫瘍転移の処置、妨害または予防のための方法を包
含する。これは、治療的分子または組成物（本明細書において「治療剤（Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」と称する）の投与による。この分子または組成物は、ｆ
ｌｔ−４遺伝子産物の発現を阻害するか、または野生型ｆｌｔ−４（例えば、Ｖ
ＥＧＦ−Ｃ／Ｄに対するｆｌｔ−４結合（ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体
形成）またはチロシンキナーゼ活性の機能を阻害する。そのような「治療剤」と
しては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ｆｌｔ−４タンパク質、な
らびにそれらのアナログおよび誘導体（フラグメントを含む）（下記のとおり）
；それらに対する抗体（下記のとおり）；ｆｌｔ−４をコードする核酸、ならび
にそれらのアナログまたは誘導体（例えば、下記のとおり）；ｆｌｔ−４アンチ
センス核酸、ならびにｆｌｔ−４発現または活性（例えば、ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ
および／またはチロシンキナーゼ活性）を阻害する薬剤（すなわち、アンタゴニ
スト）。特定の実施形態において、ｆｌｔ−４活性のアンタゴニストは、ｆｌｔ
−４に結合する、ペプチド模倣物またはペプチドアナログまたは有機分子である
。そのようなアンタゴニストは、当該分野において公知のもののなかから選択さ
れる結合アッセイによって同定され得る。
【００４８】 特定の作用機構に限定されることは意図しないが、本発明の基礎を部分的に形
成する驚くべき発見は、ＶＥＧＦ−Ｃおよびその結合レセプターｆｌｔ−４がリ
ンパ血管生成の促進に相関付けられているが、ＶＥＧＦ−Ｃおよびｆｌｔ−４が
オートクラインフィードバックループに関与することが知られていなかったとい
うことであり、これは、二次前立腺腫瘍転移の促進および経製を生じる。さらに
、本発明者らは、前立腺細胞におけるｆｌｔ−４の発現が、そのような前立腺細
胞が転移性の可能性を有するかまたは原発性の前立腺腫瘍の二次腫瘍転移物であ
るか、それらに由来する、癌性前立腺細胞であることを示すことを発見した。従
って、本発明に従って、二次前立腺腫瘍は、ｆｌｔ−４発現またはｆｌｔ−４活
性（例えば、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体形成）を阻害する治療剤に投
与によって妨害または予防され得る。特定の実施形態において、ｆｌｔ−４の発
現は、ｆｌｔ−４の細胞外ドメインに対する抗体の投与、またはｆｌｔ−４をコ
ードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸の投与によっ
て妨害され得る。別の実施形態において、ｆｌｔ−４機能は、ｆｌｔ−４タンパ
ク質またはＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ結合領域を含むを含むフラグメント、またはそのタ
ンパク質またはフラグメントをコードする核酸（このタンパク質またはフラグメ
ントは、ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ−ｆｌｔ−４結合の競合インヒビターとして作用する
）の投与によって妨害され得る。
【００４９】 ｆｌｔ−４発現またはｆｌｔ−４活性をアンタゴナイズ（すなわち、低減また
は阻害）する治療剤としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ｆｌｔ
−４またはｆｌｔ−４のアナログ、誘導体もしくはフラグメント、抗ｆｌｔ−４
：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体抗体（例えば、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体
に対して特異的な抗体、またはその結合領域を含む抗体のフラグメントもしくは
フラグメント、あるいは結合領域を含むそのような抗体のフラグメントもしくは
誘導体；ｆｌｔ−４；ｆｌｔ−４アンチセンス核酸をコードする核酸 ；ならび
に例えば、ｆｌｔ−４コード配列内への異種（非ｆｌｔ−４）挿入に起因して機
能不全のｌｔ−４核酸。例えば、以下を参照のこと：Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８
９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８。
【００５０】 別の実施形態において、本発明の治療剤は、癌ワクチンである。そのようなワ
クチンとしては以下が挙げられるがそれらに限定されない：樹状細胞または活性
化Ｔ細胞。樹状細胞は、ヒトドナーから入手され得、そして一回ｆｌｔ−４抗原
またはその抗原フラグメントに暴露され得、前立腺癌患者に投与されてインビボ
で関連するＴ細胞応答を活性化する。あるいは、その樹状細胞がｆｌｔ−４抗原
または抗原フラグメントにインビトロで暴露され、そしてプライム刺激されたか
されていないＴ細胞とともにインキュベートされて、関連するＴ細胞応答をイン
ビボで活性化する。次いで、活性化されたＴ細胞は、前立腺癌患者に投与される
。いずれの代替物においても、樹状細胞は、転移性前立腺腫瘍に対する免疫治療
増殖阻害応答を惹起させるために用いられる。
【００５１】 本発明の特定の実施形態において、異なる遺伝子配列に隣接（５’および３’
の両方で）するｆｌｔ−４配列ｆｌｔ−４遺伝子の部分を含む核酸は、ｆｌｔ−
４アンタゴニストとして用いられるか、または相同組換えによるｆｌｔ−４不活
化を促進する（また、以下を参照のこと：Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉ
ｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９
３２−３ｏ ８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４２：４３５−４３８）。さらに、野生型ｆｌｔ−４よりもＶＥＧＦ−
Ｃ／Ｄ に対して高い親和性を有するｆｌｔ−４の変異体または誘導体は、ＶＥ
ＧＦ−Ｃ／Ｄ 結合に対する野生型ｆｌｔ−４タンパク質と競合するように投与
され得、それによって、野生型ｆｌｔ−４とのＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ 複合体のレベ
ルを減少させ、これは、オートクラインフィードバックループの疎外を生じる。
ｆｌｔ−４活性（例えば、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／複合体機能）を阻害する
他の治療剤は、それらがｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／結合（複合体形成）を疎外
する能力に基づいた、公知の簡便なインビトロアッセの使用によるか、または下
記第５．３節において記載されるように同定され得る。
【００５２】 特定の実施形態において、ｆｌｔ−４発現または活性をアンタゴナイズする治
療剤は、前立腺癌の処置または妨害において治療的に投与される（予防を含む）
。本発明のより特定された実施形態は、ｆｌｔ−４タンパク質を発現するｍＲＮ
Ａを標的化することによってｆｌｔ−４発現またはｆｌｔ−４活性を減少させる
方法に関する。ＲＮＡ治療は、現在、３つの分類に分かれる：アンチセンス種、
リボザイムまたはＲＮＡアプタマー（Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４５−５４）。
【００５３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、最も広汎に使用されている。例示のため
に、限定ではなく、ｆｌｔ−４発現を減少するアンチセンスオリゴヌクレオチド
方法論が、以下の第５．２節に提示されている。リボザイム治療は、特定のＲＮ
Ａを切断、結合または他の方法で不活化して特定のタンパク質の発現を低減また
は除去する、酵素能力を有するＲＮＡ低分子の投与、減少した発現などを包含す
る（Ｇｒａｓｓｉ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｉ，１９９６，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ ２８：４９９−５ １ ０；Ｇｉｂｓｏｎ，１９９６，Ｃａｎ
ｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５：２８７−２９
９）。現在、「ヘアピン」および「ハンマーヘッド」ＲＮＡリボザイムの設計は
、例えば、適合したＲＮＡアプタマーに対するもののような特定のｍＲＮＡを特
異的に標的化することを必要とし、その翻訳を特異的に阻害し得る、Ｔａｔおよ
びＲｅｖＲＮＡのような特定のＲＮＡリガンドタンパク質である（Ｇｏｏｄ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４５−５４）。ｆｌｔ
−４に対するアプタマーは、当該分野において周知の多くの方法によって同定さ
れ得る（例えば、以下の第５．１節において記載されるようなタンパク質同士の
相互作用アッセイにおいて複合体の形成に影響を与えることによる）。
【００５４】 別の実施形態において、ｆｌｔ−４の活性またはレベルは、ｆｌｔ−４に免疫
特異的に結合する抗体、その結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導
体の投与によって減少される。そのような抗体は、以下の第５．３節に記載され
る。好ましい実施形態において、抗ｆｌｔ−４抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得られる。
【００５５】 一般に、その患者のものと同じ種である種起源または種反応性（抗体の場合）
の産物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態において、ヒトｆｌｔ−４
タンパク質またはその誘導体、ホモログもしくはアナログ；ヒトｆｌｔ−４をコ
ードする核酸またはその誘導体、ホモログもしくはアナログ；ヒトｆｌｔ−４も
しくはヒトｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体に対する抗体、あるいはｆｌｔ
−４発現もしくは活性に影響を与える他のヒトの因子が、治療的または予防的に
ヒト患者に投与される。
【００５６】 好ましくは、適切なインビトロまたはインビボアッセイを利用して、特定の治
療剤の効果を決定し、そしてその投与が罹患した組織または個体の処置に適応さ
れるかどうかを判定する。
【００５７】 種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイは、患者の障害に関与す
る細胞型の代表的な細胞を用いて実施されて、治療剤がそのような細胞型に対し
て所望の効果を奏するか否かを判定し得る。
【００５８】 治療における使用のための治療剤は、ヒトにおける試験のために適切な動物モ
デル系において試験され得る。これには、以下が挙げられるがそれらに限定され
ない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。インビボ試験のた
めに、ヒトへの投与の前に、当該分野において公知の任意の動物モデル系が使用
され得る。これには、第５．１節において記載されるものが含まれる。例示され
非限定的な前立腺癌のモデルの例としては、以下が挙げられる：以下においてそ
れぞれ列挙される齧歯類モデル、ヒト異種移植片モデル、トランスジェニックモ
デルおよび再構成モデル、ならびにイヌおよび霊長類それらの自然前立腺癌モデ
ル：Ｗａｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ３６：
４７−４８；Ｌｕｃｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ
３６：４９−５５；Ｓｔｅａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓ
ｔａｔｅ３６：５６−５８；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｈｅ Ｐ
ｒｏｓｔａｔｅ ３６：５９−６３；ａｎｄ Ｗａｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１
９９８，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：６４−６７。
【００５９】 （５．２．１遺伝子治療） 本発明の特定の実施形態において、ｆｌｔ−４をコードする配列を含む核酸ま
たは、その機能的誘導体は、ｆｌｔ−４活性（例えば、遺伝子治療によるｆｌｔ
−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体活性または形成）を阻害するために投与される。
より特定の実施形態において、ｆｌｔ−４の細胞外ドメインをコードする核酸は
、遺伝子治療により投与される。遺伝子治療とは、核酸を被験体へ投与すること
により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、その核酸は、ｆｌ
ｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体活性または形成を阻害することによってｆｌｔ
−４活性を調節することによって治療効果を媒介する、それがコードするタンパ
ク質を発現する。当該分野において利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれ
もが本発明に従って使用され得る。例示的な方法を以下に記載する。
【００６０】 遺伝子治療の方法の一般的な概説について、以下を参照のこと：Ｇｏｌｄｓｐ
ｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｎｎａｃｙ １２
：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３
：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９
３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄ
ｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１
７；ａｎｄ Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１５５。使用され得る
組換えＤＮＡ技術の分野において一般的に公知の方法以下に記載される：Ａｕｓ
ｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，ＮＹ；ａｎｄ Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ。
【００６１】 好ましい局面において、その治療剤は、適切な宿主において細胞内ドメインの
少なくとも一部を欠如するであるｆｌｔ−４タンパク質のフラグメントを発現す
る発現ベクターの一部である核酸を含み、その結果、そのｆｌｔ−４フラグメン
トは、もはや、チロシンキナーゼ活性を有しないが、なおも、ＶＥＧＦ−Ｃまた
はＶＥＧＦ−Ｄと結合し得る。ｆｌｔ−４のそのようなフラグメントは、通常は
リガンド結合の際に生じる細胞内シグナルを伝達し得ず、従って、ＶＥＧＦ−Ｃ
またはＶＥＧＦ−ＤのＭ−４のこのフラグメントへの結合は、脈管形成の促進も
前立腺癌のオートクライン増殖も生じない。特に、そのような格差なＨ、ｆｌｔ
−４コード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有し、そのプロモーター
は、誘導性または構成性であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特
定の実施形態において、ｆｌｔ−４コード配列または任意の他の所望の配列がゲ
ノムにおける所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接する核酸分子が使用
され、その結果、ｆｌｔ−４フラグメントをコードする核酸の染色体内発現を提
供する（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ
ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。別の好
ましい局面において、その核酸は、ｆｌｔ−４の発現を阻害するアンチセンス核
酸である。
【００６２】 患者への核酸の送達は、患者が核酸または核酸保有ベクターに直接暴露される
ように直接であり得るか、または細胞がまずその核酸でインビトロ形質転換され
、次いで、その患者に移植されるように間接的であり得る。これらの２つのアプ
ローチは、それぞれ、インビボ遺伝子治療またはエキソビボ遺伝子治療として公
知である。
【００６３】 特定の実施形態において、その核酸は、インビボで直接投与され、そこで、そ
のコードされた産物が産生されるように発現される。これは、当該分野において
公知の多数の任意の方法によって達成され得る（例えば、適切な核酸発現ベクタ
ーの一部としてそれを構築するか、またはそれを投与して、その結果、それが細
胞内にあるようにさせること（例えば、保護的または減弱化したレトロウイルス
または他のウイルスベクターを用いた感染による（米国特許第４，９８０，２８
６）、または裸のＤＮＡの直接注入による）、あるいは微粒子ボンバードメント
の使用による（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）か、あ
るいは 脂質または細胞表面のレセプターのでのコーティング、あるいは、トラ
ンスフェクト剤の使用によるか、リポソーム、微粒子もしくは微小カプセル内へ
のカプセル化か、または核内に入ることが知られるペプチドへの連結させてそれ
を投与するか、あるいは、そのレセプターを特異的に発現する細胞型を標的化す
るように使用され得るレセプター媒介エンドサイトーシスに供されるリガンドに
対して連結させて投与することによる（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）など）。別の実施形
態において、核酸リガンド複合体は、そのリガンドが融合原生ウイルスペプチド
を含むように形成され得る。このペプチドは、エンドソームを破壊し、核酸がリ
ソソーム分解されることを回避することを可能とする。さらに別の実施形態にお
いて、その核酸は、インビボで、細胞特異的取り込みおよび発現に対して、特定
のレセプターを標的化することによって（例えば、以下を参照のこと国際特許公
開ＷＯ ９２／０６１８０、ＷＯ９２・２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；Ｗ
Ｏ９３／１４１８８；およびＷＯ９３・２０２２１）標的化され得る。あるいは
、その核酸は、細胞内に導入され得、そして相同組換えにより発現のための宿主
細胞ＤＮＡ内に取り込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１
９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８９３２−８９
３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４
３５−４３８）。
【００６４】 特定の実施形態において、ｆｌｔ−４をコードする核酸を含むウイルスベクタ
ーが使用される。別の特定の実施形態において、ｆｌｔ−４アンチセンス核酸を
含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが使用さ
れ得る（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
２１７：５８１−５９９）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノ
ムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要ではないレト
ロウイルス配列が除去されるように改変されている。遺伝子治療において使用さ
れるべき核酸をコードするかアンチセンスであるｆｌｔ−４は、ベクターにクロ
ーニングされ、これは、患者にその遺伝子を伝達することを容易にする。レトロ
ウイルスベクターに関するさらなる詳細は、以下に見出されるＢｏｅｓｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２。これは、
幹細胞を化学療法により耐性にさせるために、造血幹細胞に対してｍｄｒ１遺伝
子を送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する。レトロウイルスベクタ
ーを遺伝子治療において使用することを例示する他の参考文献は以下がある：Ｃ
ｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６
４４−６５１；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６
７−１４７３；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；ならびに Ｇｒｏｓｓ
ｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０。
【００６５】 アデノウイルスは、遺伝子治療において用いられ得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、呼吸器上皮への遺伝子送達のための特に魅力的なビヒ
クルである。アデノウイルスは、天然に呼吸上皮に感染し、そこで、それらは、
穏和な疾患を生じる。アデノウイルスベースの送達系のための他の標的は、肝臓
、中枢神経系、内皮細胞（例えば、前立腺細胞）および筋肉である。アデノウイ
ルスは、分裂性ではない細胞に感染し得る利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａ
ｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３は、アデノ
ウイルスベースの遺伝子治療を考察する。アカゲザルの呼吸上皮への移入のため
のアデノウイルスベクターの使用は以下に実証されている：Ｂｏｕｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３ −１０。遺
伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、以下に見出され得る：Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−
４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：１４
３−１５５；ａｎｄ Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５。
【００６６】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療において提唱されている（
Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．
Ｍｅｄ．２０４：２８９）。
【００６７】 遺伝子治療のための別のアプローチは、以下のような方法による組織培養物へ
の遺伝子の移入を包含する：エレクトロポレーション、リポフェクション、リン
酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染。通常、移入方法
は、選択マーカーを細胞へ移入することを包含する。次いで、その細胞は、選択
下に置かれて、それらが有しないものから移入された遺伝子を取り込みそして発
現しつつある細胞を単離する。次いで、それらの細胞は、患者に送達される。
【００６８】 この実施形態において、その核酸は、得られた組換え細胞のインビボ投与の前
に細胞に導入される。そのような導入は、当該分野において公知の任意の方法に
よって行われ得る。これには、以下が挙げられるがそれらに限定されない：エレ
クトロポレーション、微量注入、その核酸配列を含むウイルスもしくはバクテリ
オファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子治療、微小細胞媒介
遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入について多
数の技術が当該分野において公知である（例えば、以下を参照のこと：Ｌｏｅｆ
ｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：
５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，１９８５，Ｐｈａｒｉｎａｃ．Ｔ
ｈｅｒ．２９：６９−９２）。そして、これら方法は、レシピエント細胞の必要
な発生機能および生理学的機能が破壊されない限り本発明に従って使用され得る
。この技術は、核酸を細胞へ安定に移入するために提供されるべきであり、その
結果、その核酸は、細胞で発現可能であり、そして好ましくはその細胞の子孫に
遺伝可能でありそして発現可能である。
【００６９】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の種々の方法によって患者に送
達され得る。好ましい実施形態において、上皮細胞は、例えば、皮下で注射され
る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または先祖細胞）は、好ましくは、静脈内
投与される。使用が意図される細胞量は、所望の効果、患者の条体などに依存し
、そして当業者によって決定され得る。
【００７０】 核酸が遺伝子治療の目的で導入され得る細胞は、任意の所望で入手可能な細胞
型を包含する。そして、それには、以下が挙げられるがそれらに限定されない：
上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血球（
例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、巨核球、な
らびに顆粒球、種々の幹細胞および先祖細胞、特に造血幹細胞および先祖細胞（
例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから入手されたもの）など。
【００７１】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者にとって自
己性である。
【００７２】 組換え細胞が遺伝子治療において使用される１つの実施形態において、ｆｌｔ
−４フラグメントをコードする核酸が細胞に導入されて、その結果、その遺伝子
は、その細胞またはその子孫によって発現可能であり、そして次いで組換え細胞
は、インビボで治療効果のために投与される。特定の実施形態において、幹細胞
または先祖細胞が使用される。任意の幹細胞および先祖細胞であって、インビト
ロで単離および維持され得るものは、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使
用され得る。そのような幹細胞としては以下が挙げられるがそれらに限定されな
い：造血幹細胞（ＨＳＣ）、上皮組織の幹細胞（例えば、皮膚および腸の裏打ち
）、胚性心筋細胞、肝臓幹細胞（ 国際特許公開ＷＯ ９４／０８５９８）、お
よび神経幹細胞（Ｓｔｅｍｐｌｅ ａｎｄＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｌ
ｌ ７１：９７３−９８５）。
【００７３】 上皮幹細胞（ＥＳＣ）またはケラチノサイトは、皮膚および腸の裏打ちのよう
な組織から公知の手順によって入手され得る（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，１９８０，
Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２Ａ：２２９）。皮膚のような層化上皮組織に
おいて、新生は、基底膜に最近接する層である胚層内の幹細胞の有糸分裂によっ
て生じる。同様に、腸内の裏打ち内の幹細胞は、この組織の迅速な新生速度を提
供する。患者またはドナーの皮膚または腸の裏打ちから入手されたＥＳＣまたは
ケラチノサイトは、組織培養で増殖され得る（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，１９８０，
Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２Ａ：２２９；Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ ａｎｄ Ｓ
ｃｏｔｔ，１９８６，１ ０ Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７
１）。ＥＳＣがドナーによって提供される場合、宿主対移植片反応性の抑制のた
めの方法（例えば、照射、または薬物もしくは抗生物質を投与して緩和な免疫抑
制を促進すること）もまた使用され得る。
【００７４】 造血幹細胞（ＨＳＣ）に関して、ＨＳＣのインビトロでの単離、増殖および維
持を提供する任意の技術は、本発明のこの実施形態において用いられ得る。これ
が達成され得る技術は、以下を含む：将来の宿主またはドナーから単離されたＨ
ＳＣ培養物の骨髄細胞からの単離および樹立、あるいは（ｂ）これまで長期にわ
たり樹立されているＨＳＣ培養物の使用（これは、同種異系または異種であり得
る）。非自己ＨＳＣは、好ましくは、将来の宿主と患者との間の移植免疫反応を
抑制する方法と共に用いられる。本発明の特定の実施形態において、ヒト骨髄細
胞は、後方腸骨稜から針吸引によって入手され得る（以下を参照のこと：Ｋｏｄ
ｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−
１３８４）。本発明の好ましい実施形態において、ＨＳＣは、高度に富化され得
るか、または実質的に純粋な形態にされ得る。この富化は、長期の培養の前、間
または後に行われ得る。そして、これは、当該分野において公知の技術によって
なされ得る骨髄細胞の長期培養物は、例えば、以下を用いて樹立および維持され
得る：改変 Ｄｅｘｔｅｒ細胞培養技術（Ｄｅｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７
７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：３３５）または Ｗｉｔｌｏｃｋ−
Ｗｉｔｔｅ培養技術（Ｗｉｔｌｏｃｋａｎｄ Ｗｉｔｔｅ，１９８２，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３６０８−３６１２）。
【００７５】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域
に作動可能に連結された誘導性プロモーターを包含し、その結果、その核酸の発
現は、適切な転写インデューサーの存在または非存在を制御することによって制
御可能である。
【００７６】 さらなる方法は、ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄに結合するがチロシンキナーゼ活性を欠如
するｆｌｔ−４のフラグメントをコードする核酸を送達するために使用すること
について適合され得る （５．２．２ ｆｌｔ−４発現の抑制のためのアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの使用） 本発明の特定の実施形態において、ｆｌｔ−４発現または活性は、ｆｌｔ−４
アンチセンス核酸の使用によって阻害される。本発明は、ｆｌｔ−４をコードす
る遺伝子またはｃＤＮＡまたはその一部に対してアンチセンスである、少なくと
も６つのヌクレオチドの核酸の治療的または予防的な使用を提供する。ｆｌｔ「
アンチセンス」核酸は、本明細書において使用される場合、ｆｌｔ−４ ＲＮＡ
（好ましくはｍＲＮＡ）の一部にいくらかの配列複雑性によってハイブリダイズ
し得る核酸をいう。アンチセンス核酸は、ｆｌｔ−４ ｍＲＮＡのコード領域お
よび／または非コード領域に相補的であり得る。１つの例示的であるが非限定的
なｆｌｔ−４アンチセンス核酸の例としては、以下が挙げられる：核酸配列５’
−ＧＧＣＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＡＴ−３’（配列番号：３）。このようなアンチ
センス核酸であってｆｌ−ｔ４の発現を阻害するものは、治療剤として有用性を
有し、そして下記に記載されるように前立腺癌の処置、阻害または予防において
使用され得る。
【００７７】 本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖または一本鎖、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あ
るいはそれらの改変体または誘導体であるオリゴヌクレオチドであり得、これは
、細胞に直接投与され得るか、または外因性の導入された配列の転写によって細
胞内で産生され得る。
【００７８】 別の実施形態において、本発明は、原核生物または真核生物の細胞においてｆ
ｌｔ−４核酸配列の発現を阻害するための方法に関する。この方法は、有効量の
組成物をその細胞に提供する工程を包含する。この組成物は、本発明のｆｌｔ−
４アンチセンス核酸またはその誘導体を含む。
【００７９】 ｆｌｔ−４アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドからなり、そして
好ましくは６〜約２００のヌクレオチドの範囲内のオリゴヌクレオチドである。
特定の局面において、そのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド
であり、少なくとも１５ヌクレオチドであり、少なくとも１００ヌクレオチドで
あり、または少なくとも２００ヌクレオチドである。そのオリゴヌクレオチドは
、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらのキメラ混合物または誘導体または改変版
であり得る。そして、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。そのオリゴヌ
クレオチドは、塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において改変され得る
。オリゴヌクレオチドは、他の付加基（例えば、ペプチド、細胞膜を横切る輸送
（例えば、以下を参照のこと：Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５
６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；国際特許公開 Ｎｏ．ＷＯ ８８／０９８
１０）または血液脳関門（例えば、以下を参照のこと：国際特許公開ＷＯ ８９
／１０１３４）、を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーション惹起切断薬剤（例
えば、以下を参照のこと：Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６）、またはインターカレート剤（例えば、以
下を参照のこと：Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９
））を含み得る。
【００８０】 本発明の好ましい局面において、ｆｌｔ−４アンチセンスオリゴヌクレオチド
が提供され、好ましくは、一本鎖ＤＮＡとして提供される。このオリゴヌクレオ
チドは、当該分野において一般に公知の構成要件を有するその構造において任意
の位置で改変され得る。
【００８１】 ｆｌｔ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された
塩基部分を含み得、これは、以下を含むがそれらに限定されない：５−フルオロ
ウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒ
ポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキ
シルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、５−
カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクト
シルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ），イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン
、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−
メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシ
ン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル，
５−メトキシアミノメチル チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン，５Ｎ
−メトキシカルボキシメチルウラシル，５−メトキシウラシル，２−メチル−チ
オ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン，ウラシルオキシ酢酸（ｖ），ウイブトキソ
シン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ），プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシ
トシン、５−メチルチオウラシル，２−チオウラシル，４−チオウラシル，５−
メチルウラシル，ウラシルオキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸（ｖ
）、５−メチルチオウラシル，３−（３−アミノ−Ｎ−カルボキシプロピル）ウ
ラシル，（ａｃｐ３）ｗ、ならびに２，６−ジアミノプリン。
【００８２】 別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変さ
れた糖部分を含む。これは、以下からなる群より選択されるがそれらに限定され
ない：アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソ
ース。
【００８３】 なお別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改
変されたホスフェート骨格を含む。これは、以下からなる群より選択される：ホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミノチオエート、ホスホ
ロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホト
リエステル、およびホルムアセタール、ならびにそれらのアナログ。
【００８４】 さらに別の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、２−ａ−アノマー
オリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補性ＲＮＡ
と特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、これは、通常のβユニットとは逆であ
り、その鎖は、互いに平行である（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。
【００８５】 そのオリゴヌクレオチドは、別の分子と結合体化され得る（例えば、ペプチド
、ハイブリダイゼーショントリガーされた架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーシ
ョントリガーされた切断剤など）。
【００８６】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野において公知の標準的な方法により
合成され得る（例えば、自己ＤＮＡ合成器の使用による（例えば、Ｂｉｏｓｅａ
ｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されるもの）。例
として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．
（１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６．３２０９）の方法により合
成され得る。メチルホルホネートオリゴヌクレオチドは、制御された孔ガラスポ
リマー支持体の使用によって調製され得る（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８
８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７
４５１）など。
【００８７】 特定の実施形態において、ｆｌｔ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、触
媒性ＲＮＡすなわちリボザイムを含む（例えば、以下を参照のこと：国際特許公
開ＷＯ ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５）。別の実施形態において、そのオリゴヌ
クレオチドは、メチルリボヌクレオチドである（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８），かまた
はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）である。
【００８８】 代替の実施形態において、本発明のｆｌｔ−４アンチセンス核酸は、外来性配
列からの転写によって生成される。例えば、ベクターは、細胞により取り込まれ
、その細胞内でそのベクターまたはその一部が転写されるようにインビボ導入さ
れ得、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。そのようなベクターは
、ｆｌｔ−４アンチセンス核酸をコードする配列を含む。そのようなベクターは
、それが、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成し得る限りエピソームの
ままであり得るか、または染色体に組み込まれ得る。そのようなベクターは、当
該分野において標準的な組換えＲＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクター
は、プラスミド、ウイルスまたは哺乳動物細胞において複製および発現し得るこ
とが知られる他の当該分野で公知であり得る。ｆｌｔ−４アンチセンスＲＮＡを
コードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞において作用するこ
とが当該分野において公知の任意のプロモーターによってであり得る。そのよう
なプロモーターは、誘導性または構成性であり得る。そのようなプロモーターと
しては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター
領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ
２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復において含ま
れるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ２２
：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８ １，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子調節配列（Ｂｒｉｎ
ｓｔｅｒｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）など。
【００８９】 本発明のアンチセンス核酸は、ｆｌｔ−４遺伝子、好ましくはヒトｆｌｔ−４
遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、完全な
相補性は好ましいが必要ではない。「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的」である
とは、本明細書において、使用される場合、そのＲＮＡとハイブリダイズして、
安定な二重鎖を形成するに充分な相補性を有し得る配列を意味する。二本鎖ｆｌ
ｔ−４アンチセンス核酸の場合にその二重鎖ＤＮＡの一方の鎖がこのようにして
試験され得るか、三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、
複雑性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブ
リダイズする核酸がより長くなれば、それは、ｆｌｔ−４ ＲＮＡとより多くの
塩基ミスマッチを有し得、なおも、安定な二重鎖を形成し得る（または三重鎖の
場合もあり得る）。当業者は、標準的な手順の使用によりミスマッチが寛容され
る程度を確認して、ハイブリッド複合体の融点を決定し得る。
【００９０】 ｆｌｔ−４アンチセンス核酸を使用して二次前立腺腫瘍転移を処置（または予
防）し得る。好ましい実施形態において、一本鎖ｆｌｔ−４ＤＮＡアンチセンス
オリゴヌクレオチドが使用される。
【００９１】 有効量のｆｌｔ−４アンチセンス核酸を薬学的に受容可能なキャリア中に含む
本発明の薬学的組成物（以下の第５．５節を参照のこと）は、二次前立腺腫瘍転
移を有する患者に投与され得る。
【００９２】 特定の障害または状態の処置において有効なｆｌｔ−４アンチセンス核酸の量
は、その障害または条体の性質に依存し、そして、標準的な臨床技術によって判
定され得る。可能である場合、ヒトにおける試験および使用の前に、アンチセン
スの細胞傷害性をインビトロで、そして有用な動物モデル系において判定するこ
とが望ましい。
【００９３】 特定の実施形態において、ｆｌｔ−４アンチセンス核酸を含む薬学的組成物は
、リポソーム、微小粒子または微小カプセルを介して投与される。種々の本発明
の実施形態において、ｆｌｔ−４アンチセンス核酸の持続性放出を達成するその
ような組成物を使用することが有用であり得る。
【００９４】 （５．２．３．ｆｌｔ−４に対する抗体） 本発明に従って、ｆｌｔ−４またはそのフラグメント、誘導体もしくはホモロ
グ、あるいはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体またはそのフラグメント、誘
導体もしくはホモログが、免疫原として使用されてそのような免疫原に免疫特異
的に結合し得る抗体を生成し得る。そのような抗体としては以下が挙げられるが
それらに限定されない：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体
、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリー。特定の実施
形態において、ヒトｆｌｔ−４に対する抗体が産生される。別の特定の実施形態
において、ヒトｆｌｔ−４およびヒトＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄの複合体
に対する抗体が生成される。別の実施形態において、ｆｌｔ−４のフラグメント
とＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄのフラグメントとから形成された複合体であ
って、そのフラグメントはその複合体の他のメンバーと相互作用するタンパク質
ドメインを含むものは、抗体生成のための免疫原として使用される。抗ｆｌｔ−
４抗体の１つの例示的であるが非限定的な例は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃｏｒ
ｐ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得られた抗ｆｌｔ−４抗体である。
【００９５】 別の特定の実施形態において、ｆｌｔ−４タンパク質に対する抗体は、二重特
異的抗体（例えば、一般的には以下を参照のこと：Ｆａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｄｒ
ａｋｅｍａｎ，１９９５，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖ
ｅｓ ８．１３３．１３７）。そのような二重特異的抗体は、遺伝子操作されて
以下の両方を認識させる：（１）ｆｉｔ−４エピトープおよび（２）種々の「ト
リガー」分子の一つ（例えば、骨髄細胞におけるＦｃレセプター、ならびにＴ細
胞におけるＣＤ３およびＣＤ２であって、これらは、細胞傷害性Ｔ細胞が特定の
標的を破壊するようにさせ得ると同定されている。そのような二重特異的抗体は
、当業者に公知の化学的結合、ハイブリドーマまたは組換え分子生物学技術のい
ずれかによって調製され得る。
【００９６】 種々の当該分野において公知の手順が、ｆｌｔ−４タンパク質、あるいはその
タンパク質のフラグメント、誘導体もしくはアナログ、またはｆｌｔ−４に対す
るポリクローナル抗体の産生のためにおよびＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄの複合体に対する
ポリクローナル抗体の産生のために使用され得る。
【００９７】 抗体の産生のために、種々の宿主動物に、ネイティブｆｌｔ−４タンパク質ま
たはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体、あるいは合成バージョン、あるいは
それらの誘導体（例えば、架橋ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体）が注射さ
れる。そのような宿主動物としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：
ウサギ、マウス、ラットなど。種々のアジュバントは、種々の種に依存して免疫
学的応答を増強するように使用され得、そしてそれらには以下が挙げられるがそ
れらに限定されない：フロイントアジュバント（完全および不完全）、ミネラル
ゲル（例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質（例えば、プルロニックポリ
オール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノール、およ
び潜在的に有用なヒトアジュバント（カルメット‐ゲラン杆菌ワクチン（ＢＣＧ
）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ。
【００９８】 ｆｌｔ−４ タンパク質またはその誘導体、フラグメント、ホモログもしくは
アナログ、あるいはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体、またはその誘導体、
フラグメント、ホモログもしくはアナログに対して指向されるモノクローナル抗
体の調製のために、培養物における連続的細胞株による抗体分子の産生のために
提供される任意の技術が使用され得る。そのような技術としては以下が挙げられ
るがそれらに限定されない：もともとは以下によって開発されたハイブリドーマ
技術：ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６
：４９５−４９７）；トリオーマ技術（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９１，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ２：２６−
３２）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８
３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）；ならびにＥＢＶハイブリ
ドーマ技術を用いてヒトモノクローナル抗体を生成すること（Ｃｏｌｅ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎ
ｄＣａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．
７７−９６）。本発明のさらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、国
際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５において最近記載された技術を利用し
て無菌の動物において生成され得る。
【００９９】 本発明に従って、ヒト抗体が使用され得、そしてヒトハイブリドーマを用いて
（Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ８０：２０２６−２０３０）またはヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスでイン
ビトロで形質転換することによって（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｉｎ
：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）入手され
得る。事実、本発明に従って、ｆｌｔ−４タンパク質に特異的なマウス抗体分子
からの遺伝子を、適切な生物学的な活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプ
ライスすることによって「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，
１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）が使用され得る。そのよう
な抗体は、本発明の範囲内である。
【０１００】 本発明に従って、単鎖抗体の産生のために記載される技術（米国特許第４，９
４６，７７８号）が ｆｌｔ−４ またはｆｌｔ−−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合
体に特異的な抗体を産生するように適合され得る。本発明のさらなる実施形態は
、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、ｆｉｔ−４ またはｆｌｔ−４：ＶＥＧ
Ｆ−Ｃ／Ｄ複合体、その誘導体もしくはアナログに対して所望の特異性を有する
モノクロ−ナルＦａｂフラグメントの迅速かつ簡便な同定のための技術を利用す
る（Ｈｕｓｅ ｅｔａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１
２８１）。非ヒト抗体は、公知の方法によって「ヒト化」され得る（例えば、米
国特許第５，２２５，５３９号。
【０１０１】 ｆｌｔ−４またはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体のイディオタイプを含
む抗体フラグメントは、当該分野において公知の技術によって生成され得る。例
えば、そのようなフラグメントとしては以下が挙げられるがそれらに限定されな
い：Ｆ（ａｂ’）2フラグメントであって、抗体分子のペプシン消化によって生
成され得るもの；Ｆａｂフラグメントであって、その抗体をパパインおよび還元
剤で処理することによって生成され得るもの；ならびにＦｖフラグメント。
【０１０２】 抗体の生成において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該分野にお
いて公知の技術によって達成され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着
アッセイ）。ｆｌｔ−４タンパク質の特定のドメインまたはその誘導体、ホモロ
グもしくはアナログに対して特異的な抗体を選択するために、ｆｌｔ−４タンパ
ク質のフラグメント、またはその誘導体、ホモログもしくはアナログに結合する
産物であって、そのようなどメインを含むものについて生成されたハイブリドー
マをアッセイし得る。ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体、またはその誘導体
、ホモログ、もしくはアナログに特異的に結合するが、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−
Ｃ／Ｄ複合体の個々のタンパク質、またはその誘導体、ホモログもしくはアナロ
グには特異的に結合しない抗体の選択のために、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ
複合体に正に結合すること、およびｆｌｔ−４およびＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧ
Ｆ−Ｄのタンパク質への結合の欠如に基づいて選択し得る。
【０１０３】 ｆｌｔ−４タンパク質のドメインまたはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体
のドメイン、またはその誘導体、ホモログもしくはアナログに対して特異的な抗
体もまた提供される。
【０１０４】 上記は、ｆｌｔ−４またはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の局在化およ
び／または定量に関連する当該分野において公知の方法において使用され得る（
例えば、これらのタンパク質の画像化、適切な生理学的サンプルにおけるそれら
のレベルの測定、診断方法など）。これはまた、ｆｉｔ−４ タンパク質または ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の誘導体、ホモログ、もしくはアナログ
についても真である。
【０１０５】 本発明の別の実施形態において（下記参照）、抗ｆｌｔ−４抗体または抗ｆｌ
ｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体抗体またはそれらのフラグメントであって、結
合ドメインを含むものは、治療である。
【０１０６】 抗体および抗原結合抗体フラグメントもまた、異種タンパク質またはペプチド
と、化学的結合体化または組換えＤＮＡ技術によって結合体化され得る。得られ
たキメラタンパク質は、異種タンパク質の抗体の抗原結合特異性および機能を有
する。例えば、ｆｌｔ−４の細胞外ドメインに対して特異的な抗体の抗原結合領
域をコードする抗体ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞レセプターのゼータ鎖について
のコード配列に遺伝的に融合され得る。
【０１０７】 Ｔ細胞におけるこの構築物を発現した後、Ｔ細胞を、エキソビボで拡大し、そ
して前立腺癌患者に注入し得る。このキメラタンパク質を発現するＴ細胞は、抗
体結合特異性の結果としてｆｌｔ−４を発現する腫瘍に特異的に指向され、腫瘍
細胞殺傷を生じる。あるいは、タンパク質に融合された抗体であり、これは、白
血球の遊走を誘導するか、または腫瘍部位へ他の化合物をひきつけるための親和
性を有する。この型の特異的なタンパク質は、ストレプトアビジンである。スト
レプトアビジン結合体化された抗体の主要細胞への結合の後には、ビオチン化さ
れた薬物、毒素または放射性同位体を添加して腫瘍特異性殺傷を生じさせ得る。
【０１０８】 上記型の物質のいずれかに連結されたモノクローナル抗体（またはそのフラグ
メント）を含むそのようなインビトロ腫瘍局在化および治療方法を用いる使用の
ためのキットが調製され得る。そのキットの構成要素は、水性媒体中または凍結
乾燥形態のいずれかで包装され得る。そのモノクローナル抗体（またはそのフラ
グメント）は、キットにおいて、標識または治療的部分（例えば、放射性金属イ
オンまたは治療薬物部分）が付着された結合体の形態で使用される。そのような
結合体の成分は、完全に結合体化された形態、中間体の形態、またはキットのユ
ーザーによって結合体化されるように別個の部分として供給され得る。
【０１０９】 （５．３．ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体ならびにその誘導体およびア
ナログのアッセイ） ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体、またはその誘導体、フラグメントもし
くはアナログを形成するその能力により測定されるように、ｆｌｔ−４の機能活
性は、種々の方法により測定され得る。ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体形
成の潜在的なアンタゴニスト（例えば、抗ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体
抗体およびｆｌｔ−４アンチセンス核酸）は、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複
合体形成を阻害する能力についてアッセイされ得る。
【０１１０】 本発明の１つの実施形態では、抗ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体抗体へ
の結合について野生型ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体との結合または競合
する能力についてアッセイしている場合、使用され得る当該分野で公知の種々の
免疫アッセイとしては、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着ア
ッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射測定アッセイ、ゲル拡散沈
降素反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（コロイド状金、酵素
または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット分析、沈降反応、凝
集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ）、相補体固定化ア
ッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイなど
のような技術を使用する、競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられる
が、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標
識を検出することにより検出される。別の実施形態では、一次抗体は、二次抗体
または試薬の一次抗体への結合を検出することにより検出される。さらなる実施
形態では、二次抗体は標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の
検出について、当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【０１１１】 ｆｌｔ−４遺伝子の発現（内在性およびこれらの遺伝子を含むクローンＤＮＡ
から発現されたもの）は、当該分野で公知の技術を使用して検出され得る。これ
らの技術としては、サザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７
５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７）、ノーザンハイブリダイゼ
ーション（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：４０９４−４０９８を参照のこと）、制限エンドヌ
クレアーゼマッピング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７），ＤＮＡ配列分析およびポリメラーゼ
連鎖反応増幅（ＰＣＲ；米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１
９５号および同第４，８８９，８１８号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎら、１９８８
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７６５２−７６５７
；Ｏｃｈｍａｎら、１９８８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０：６２１−６２３；Ｌ
ｏｈら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７−２２０）続く種々の細胞
型におけるｆｌｔ−４遺伝子に対して特異的なプローブを用いるその後のサザン
ハイブリダイゼーションが挙げられるがこれらに限定されない。当該分野で一般
に公知であるＰＣＲではない増幅の方法が使用され得る。ノーザンブロット分析
またはサザンブロット分析のためのハイブリダイゼーション条件のストリンジェ
ンシーは、使用される特定のプローブとの関連性の所望の程度と核酸の検出を確
実にするために操作され得る。当該分野で一般に公知のこれらの方法および他の
方法に対する改変は、使用され得る。
【０１１２】 ｆｌｔ−４の誘導体（例えば、フラグメント）、ホモログおよびアナログは、
当該分野で公知の任意の方法によりＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄへの結合についてアッセイ
され得る。これらの方法としては、例えば、第５．４．１節（後述）に記載され
る改変酵母マトリックス接合試験；他のタンパク質と複合体形成したｆｌｔ−４
へ結合する抗体を使用する免疫沈降、続いて免疫沈降タンパク質のサイズ分画（
例えば、変性または非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）；ウェスタ
ンブロット分析などが挙げられる。
【０１１３】 本発明の１つの実施形態は、生物学的活性について、ｆｌｔ−４の誘導体、ホ
モログまたはアナログをスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、
上記ｆｌｔ−４の誘導体、ホモログまたはアナログをＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄと接触さ
せる工程；および上記ｆｌｔ−４の誘導体、ホモログまたはアナログとＶＥＧＦ
−Ｃ／Ｄとの間の複合体の形成を検出する工程を包含し；ここで、上記複合体の
形成の検出は、上記ｆｌｔ−４の誘導体、ホモログまたはアナログが生物学的（
例えば、結合）活性を有することを示す。
【０１１４】 （５．４．ｆｌｔ−４活性のアンタゴニストについてのスクリーニング） ｆｌｔ−４の機能活性は、そのリガンド、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと
結合する能力である。従って、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体、そのおよ
び誘導体、フラグメントおよびアナログ、ｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥ
ＧＦ−Ｄをコードする核酸ならびにその核酸の誘導体、フラグメントおよびアナ
ログは、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体コード核酸、複合体のメンバーの
タンパク質および前記の誘導体に結合するか、あるいはそれらの機能を調節する
化合物についてのスクリーニングに使用され得、従って、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ
−Ｃ／Ｄ複合体の活性のアゴニストもしくはアンタゴニスト、または形成として
の潜在的な用途を有する。従って、本発明は、ｆｌｔ−４核酸、ＶＥＧＦ−Ｃ核
酸およびＶＥＧＦ−Ｄ核酸、タンパク質または核酸およびタンパク質の誘導体に
特異的に結合するか、またはそれらの機能を調節する分子を検出するためのアッ
セイに関する。例えば、ｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの両方を
発現する組換え細胞は、これらのアッセイにおける複合体またはタンパク質を組
換え生成するために使用され得、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体に結合す
るか、またはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体形成を妨害するか、もしく促
進する分子についてのスクリーニングに使用され得る。好ましい実施形態では、
優れた安定性を有するが、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体を形成する能力
を保持したままである、ポリペプチドアナログ（例えば、結合アッセイ緩衝液中
でのタンパク質分解に対して耐性であるように、または酸化分解に対して耐性で
あるように改変されたｆｌｔ−４およびＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ）は、
ｆｌｔ−４活性またはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の活性もしくは形成
の調節因子についてのスクリーニングにおいて使用される。このうような耐性分
子は、例えば、タンパク質分解切断部位におけるアミノ酸の置換、タンパク質分
解感受性部位での化学的に誘導体化されたアミノ酸の使用、および酸化に供され
たアミノ酸残基（すなわち、メチオニンおよびシステイン）の置換により生成さ
れ得る。
【０１１５】 分子（例えば、推定結合パートナーまたはｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合
体の活性または形成の調節因子）は、結合または調節を助長する条件下で、ｆｌ
ｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体またはそのフラグメントと接触され、次いで、
ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体に特異的に結合するかまたはｆｌｔ−４：
ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の活性または形成を調節する分子が同定される。同様の
方法が、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ核酸またはその誘導体に結合するか、ま
たはその機能を調節する分子についてのスクリーニングに使用され得る。
【０１１６】 本発明の特定の局面は、例えば、第５．６．１節（後述）に記載される改変酵
母マトリックス接合試験、および「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃ
ｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃ
ｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ Ｏｃｃｕｒ ｉｎ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｈｅｓ
ｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」と題された国際特許公開第ＷＯ９７／４７７６
３号（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）を使用してイン
ヒビターをスクリーニングすることについて記載される方法を使用して、ｆｌｔ
−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の形成または分解を阻害するかまたは促進する分
子を同定することに関連する。
【０１１７】 本発明の１つの実施形態では、ｆｌｔ−４またはｆｌｔ−４およびＶＥＧＦ−
Ｃ／Ｄの複合体の活性を調節する分子は、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄの存
在下で１つ以上の候補分子をｆｌｔ−４と接触させ；そしてｆｌｔ−４とＶＥＧ
Ｆ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄとの間で形成される複合体の量を測定することにより
同定される；ここで、候補分子の非存在下で形成する量と比較して形成される複
合体の量における増加または減少は、この分子が、ｆｌｔ−４もしくはＶＥＧＦ
−ＣもしくはＶＥＧＦ−Ｄ、またはｆｌｔ−４およびＶＥＧＦ−ＣもしくはＶＥ
ＧＦ−Ｄの上記複合体の活性を調節することを示す。好ましい実施形態では、調
節因子は、候補分子をネイティブなｆｌｔ−４でもネイティブなＶＥＧＦ−Ｃも
しくはＶＥＧＦ−Ｄプロモーターでもないプロモーターからのｆｌｔ−４および
ＶＥＧＦ−Ｃの両方またはｆｌｔ−４およびＶＥＧＦ−Ｄの両方を発現するトラ
ンスジェニック非ヒト動物に投与することにより同定される。より好ましくは、
候補分子はまた、トランスジェニック非ヒト動物中で組換え的に発現される。あ
るいは、このような調節因子を同定するための方法は、好ましくは、精製ｆｌｔ
−４、精製ＶＥＧＦ−Ｃまたは精製ＶＥＧＦ−Ｄおよび精製候補分子を用いてイ
ンビトロで行われ得る。
【０１１８】 前記を実施するために使用され得る方法は、一般に当該分野で公知である。ス
クリーニングされる薬剤／分子は、限定された数の特定の化合物の混合物または
化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどとして提供され得る。スクリー
ニングされる薬剤／分子はまた、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の活性ま
たは形成を調節し得る抗血清、アンチセンス核酸などの全ての形態を含み得る。
【０１１９】 例として、ランダムな、または組み合わせのペプチドまたは非ペプチドライブ
ラリーのような多様なライブラリーは、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体に
特異的に結合する分子についてスクリーニングされ得る。使用され得る多くのラ
イブラリーが当該分野で公知であり、例えば、化学合成ライブラリー、組換え（
例えば、組換えファージディスプレイ、組換えライブラリーおよびインビトロ翻
訳に基づく組換えライブラリー）である。
【０１２０】 化学的に合成されたライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒら、１９９１，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９１．Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５４：８４−８６；Ｌａｍら、１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−
８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ １２：７
０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｙ ３７：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、１９９３，Ｐｒｏ
ｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅ
ｒｂら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１
１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎ
ら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１７
０８−１１７１２；国際特許公開第ＷＯ９３／２０２４２；およびＢｒｅｎｎｅ
ｒおよびＬｅｒｎｅｒ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８９：５３８１−５３８３に記載される。
【０１２１】 ファージディスプレィライブラリーの例は、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１
９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０
，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、１９９２
，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８；Ｌｅｎｓｔｒａ，１９９２
，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７；Ｋａｙら、１９９
３，Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５；および国際特許公開第ＷＯ９４／１８３１
８号に記載される。
【０１２２】 インビトロ翻訳に基づくライブラリーとしては、国際特許公開第ＷＯ９１／０
５０５８；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２−９０２６に記載されるインビトロ翻
訳に基づくライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２３】 非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば
、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：４７０８−４７１２）は、使用に適用され得る。ペプチドライブラリー（
Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９：９３６７−９３７１）もまた、使用され得る。使用され得るライブラリーの
他の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２）により記載される。（ここで、ペ
プチドにおけるアミド機能性は、ペルメチル化され（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅ
ｄ）、化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーを作製する。
【０１２４】 ライブラリーをスクリーニングすることは、種々の一般に公知の方法により達
成され得る。例えば、以下の参考文献を参照のこと（これらは、ペプチドライブ
ラリーのスクリーニングを開示する）：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，１９
８９，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；Ｓｃｏｔ
ｔｒおよびＳｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；
Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４
２７；Ｏｌｄｅｎｂｒｔｇら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら、１９９４，Ｃｅｌｌ ７６：
９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７
−５８０；Ｂｏｃｋら、１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔ
ｕｅｒｋら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５
５：８５０−８５２；米国特許第５，０９６，８１５号、同第５，２２３，４０
９号および同第５，１９８，３４６号（全てＬａｎｄｎｅｒらに対して）；Ｒｅ
ｂａｒおよびＰａｂｏ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；
ならびに国際特許公開ＷＯ９４／１８３１８号を参照のこと。
【０１２５】 特定の実施形態では、スクリーニングは、固相上に固定されたｆｌｔ−４：Ｖ
ＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体（または、コード核酸または誘導体）とライブラリーのメ
ンバーを接触させて、そしてタンパク質（または、コード核酸または誘導体）に
結合するこれらのライブラリーのメンバーを回収することにより行われ得る。こ
のようなスクリーニング方法（「パニング」技術といわれる）の例は、例として
、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１
８；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２，ＢｉｏＴｈｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４４
２−４２７；国際特許公開第ＷＯ９４／１８３１８号；および本明細書上記に引
用される参考文献中に記載される。
【０１２６】 特定の実施形態では、ｆｌｔ−４またはＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄのフ
ラグメントおよび／またはアナログ、特にペプチド模倣物は、ｆｌｔ−４：ＶＥ
ＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の形成の競合阻害または非競合阻害としての活性をスクリー
ニングされ、これらはこれによりｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の活性ま
たは形成を阻害する。
【０１２７】 好ましい実施形態では、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体に結合する分子
は、第５．４．１節（後述）中に記載される改変酵母マトリクス接合試験を使用
してスクリーニングされ得る。
【０１２８】 １つの実施形態では、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の活性または形成
（ｆｌｔ−４活性）を調節する（すなわち、アンタゴナイズまたはアゴナイズす
る）薬剤は、結合阻害アッセイを使用してスクリーニングされ得、ここで薬剤は
、試験される薬剤の非存在下でｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の形成が起
こる水性結合条件下、または生理学的結合条件下で、それらのｆｌｔ−４：ＶＥ
ＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の形成を調節する能力についてスクリーニングされる。ｆｌ
ｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の形成を妨害する薬剤は、複合体形成のアンタ
ゴニストとして同定される。ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の形成を促進
する薬剤は、複合体形成のアゴニストとして同定される。ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ
−Ｃ／Ｄ複合体の形成を完全にブロックする薬剤は、複合体形成のインヒビター
として同定される。
【０１２９】 スクリーニングのための方法は、放射性リガンド（例えば、125Ｉまたは3Ｈ）
、磁気リガンド（例えば、フォトビオチンアセテートに共有結合した常磁性ビー
ズ）、蛍光リガンド（例えば、フルオレセインまたはローダミン）または酵素リ
ガンド（と問えば、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ）で複合タンパ
ク質を標識することを必要とする。次いで、これらの反応物は、溶液中で結合し
、当該分野で公知の多くの技術の１つにより単離され得る。これらの技術として
は、非標識結合パートナー（または第２の標識複合部分から識別可能なマーカー
を有する標識結合パートナー）に対する抗血清を使用する標識複合体部分の共免
疫沈降、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび
勾配密度遠心分離が挙げられるが、これらに制限されない。好ましい実施形態で
は、標識結合パートナーは、市販のフィルターにより保持されない小さいフラグ
メントまたはペプチド模倣物である。次いで、結合に際して、標識種は、そのフ
ィルターを通過し得ず、複合体形成の単純なアッセイを提供し得る。
【０１３０】 当該分野で一般に公知である方法を使用して、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ
複合体の少なくとも１つのメンバーを標識する。適切な標識方法としては、放射
性標識アミノ酸（例えば、Ｈ3−ロイシンまたは35Ｓ−メチオニン）の取り込み
による放射性標識化、クロラミンＴ方法、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬など
を使用する125Ｉまたは131Ｉを用いる翻訳後ヨウ素化による放射性標識化、また
はホスホリラーゼおよび無機放射性標識亜リン酸を使用する32Ｐを用いる標識化
、フォトビオチンアセテートおよび太陽灯を使用するビオチン標識化などが挙げ
られるが、これらに限定されない。例えば、後述のようにｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ
−Ｃ／Ｄ複合体のメンバーの１つが固定される場合、遊離種が標識される。相互
作用している種のいずれも固定されない場合、各々は、両方の部分の単離の次に
、より正確な定量を提供しそして異種複合体から同種複合体の形成を識別し得る
するように、識別マーカーで標識され得る。改変された相互作用物の１つに結合
し、検出の感度、複合体の安定性の増加などを改良するアクセサリータンパク質
を使用する方法が、提供される。
【０１３１】 例えば、限定としてではないが、典型的な結合条件は、１０〜２５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５〜８、および０．５％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００または相互作用の特異性を改良する他の界面活性剤の水溶性塩
溶液中である。金属キレート剤および／または二価カチオンは、結合を改良する
ためおよび／またはタンパク質分解を減少するために添加され得る。反応温度と
しては、４、１０、１５、２２、２５、３５または４２℃が挙げられ得、そして
インキュベーションの時間としては、代表的には１５秒であるが、より長い時間
が結合平衡を生じさせるのに好ましい。特定のｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複
合体は、再現性の結合のための最適な結合条件を決定するために、後述のように
、慣用的なタンパク質結合アッセイを使用してアッセイされ得る。
【０１３２】 複合体形成の物理学的パラメーターは、例えば、放射活性検出のための液体シ
ンチレーションカウンター、酵素標識部分に関する酵素活性などを使用して、使
用される標識について特異的なアッセイ方法を使用する複合体形成の定量により
分析され得る。次いで、反応結果は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析、Ｈｉｌｌ分析お
よび当該分野で一般に公知である他の方法（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，第２版
（１９９３）Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａ
ｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）を使用して分析される。
【０１３３】 結合アッセイへの第２のアプローチにおいて、結合種の１つは、フィルター上
、マイクロタイタープレートのウェル中、試験管中、クロマトグラフィーマトリ
ックスなどへ共有結合的または非共有結合的に固定される。タンパク質は、当該
分野で公知の任意の方法を使用して、共有結合的に固定され得る。これらの方法
としては、例えば、ＫａｄｏｎａｇａおよびＴｊｉａｎ，１９８６，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５８８９−５８９３の方法（すな
わち、ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような臭
化シアン誘導体化基質への結合）の方法が挙げられるが、これに限定されない。
必要ならば、種の使用は、基質により立体障害を減少し得る。タンパク質の基質
への非共有的付着としては、タンパク質の荷電表面への付着、特異的抗体との結
合、第３の非関連相互作用タンパク質への結合などが挙げられるが、これらに限
定されない。
【０１３４】 １つの実施形態では、固定ｆｌｔ−４は、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合
体形成を調節するその能力について試験される化合物の存在または非存在下で放
射性標識されたＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄへの結合についてのアッセイに
使用される。結合パートナーは、水性条件または生理学的条件下（例えば、本来
相互作用が検出された条件下）での結合を可能にする。逆に、別の実施形態では
、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄは、固定化され、そして結合条件下で標識ｆ
ｌｔ−４タンパク質またはその誘導体と接触される。
【０１３５】 ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体（または、その誘導体）の１つのメンバ
ーと、任意の手段（例えば、上記に記載の手段）により標識されたｆｌｔ−４：
ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体の他のメンバーとの結合についての競合についての薬剤
のアッセイ（細胞抽出物およびライブラリープールを含む）は、ｆｌｔ−４：Ｖ
ＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体形成の競合剤またはエンハンサーについてのスクリーニン
グに提供される。
【０１３６】 特定の実施形態では、他のタンパク質成分への試薬の非特異的な結合または粒
子、固定化マトリックスなどへの試薬の吸着損失を阻害するためのブロッキング
剤が、アッセイ混合物に含まれ得る。ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブ
ミン、βカゼイン、脱脂粉乳、デンハート試薬、Ｆｉｃｏｌｌ、ポリビニルピロ
リジン、非イオン性界面活性剤（ＰＮ４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅ
ｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０など）、イオン性界面化性剤（例えば、ＳＤＳ、ＬＤＳ
など）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
適切なブロッキング剤濃度は、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体形成を可能
にする。
【０１３７】 結合が行われた後に、非結合の標識タンパク質を上清から取り除き、そして任
意の結合した標識タンパク質を保持している固定されたタンパク質は、広範に洗
浄される。次いで、結合標識の量は、前出に記載されるような標識を検出するた
めの当該分野において標準の方法を使用して定量される。
【０１３８】 （５．４．１．タンパク質−タンパク質相互作用についてのアッセイ） 本発明の１つの局面は、ｆｌｔ−４ペプチドまたはｆｌｔ−４のフラグメント
、誘導体、ホモログもしくはアナログへの結合について、ｆｌｔ−４相互作用タ
ンパク質のフラグメント、誘導体またはアナログをアッセイおよびスクリーニン
グするための方法を提供する。ｆｌｔ−４、ｆｌｔ−４の誘導体、アナログまた
はフラグメントと相互作用するＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄの誘導体、アナ
ログまたはフラグメントは、酵母マトリックス接合試験系またはより好ましくは
、国際特許公開第ＷＯ９７／４７７６３号に記載されるようなそれらの改良の手
段により同定され得る。相互作用な、酵母中でスクリーニングされるので、この
系で検出される分子間タンパク質相互作用は、哺乳動物細胞における条件を模倣
した生理学的条件下で起こる（Ｃｈｉｅｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９５７８−９５８１）。
【０１３９】 改善した酵母マトリックス接合試験による相互作用タンパク質の同定は、レポ
ーター遺伝子（「レポーター遺伝子」）の発現の検出に基づく。この遺伝子の転
写は、２つのタンパク質（各々は転写レギュレーターの半分に融合する）の相互
作用による転写レギュレーターの再構築に依存する。ベイトｆｌｔ−４または誘
導体、ホモログ、またはアナログおよびプレイタンパク質（ベイトと相互作用す
る能力に関して試験されるタンパク質）は、それぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン、お
よび転写調節ドメインに対する融合タンパク質として発現され、逆もまた同様で
ある。種々の特定の実施形態において、プレイは、少なくとも５０、１００、５
００、１，０００、５，０００、１０，０００、または５０，０００の複雑性を
有し；または２５〜１００，０００、１００〜１００，０００、５０，０００〜
１００，０００、または１００，０００〜５００，０００の範囲の複雑性を有す
る。例えば、プレイ集団は、例えば、部位特異的変異誘発またはヌクレオチド配
列において変異を作製する別の方法により生成されるように、１つ以上のＶＥＧ
Ｆ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄの変異体をコードする核酸であり得る。好ましくは、
プレイ集団は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または、合成ＤＮＡ
）によりコードされるタンパク質である。例えば、この集団は、ｃＤＮＡ（哺乳
動物ＲＮＡに由来する）の集団の特徴付けしていないサンプルからのｃＤＮＡ配
列を含むキメラ遺伝子から発現され得る。好ましくはこのプレイ集団は、ＤＮＡ
（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または、合成ＤＮＡ）によりコードされる
タンパク質である。
【０１４０】 特定の実施形態において、無作為にペプチドを発現する組換え生物学的ライブ
ラリーは、プレイ核酸の供給源として使用され得る。
【０１４１】 本発明の別の実施形態において、本発明は、本明細書中で同定された相互作用
タンパク質のインヒビターまたはエンハンサーについてスクリーニングする方法
を提供する。簡潔には、タンパク質間相互作用アッセイは、１つ以上の候補分子
の存在下で行われることを除いて、本明細書中に記載されるように行われる。１
つ以上の候補分子が存在しない場合に存在する活性に対するレポーター遺伝子活
性の増加または減少は、この候補分子が、相互作用している対に対する効果を有
することを示す。好ましい方法において、相互作用の阻害は、例えば、相互作用
がＵＲＡ３遺伝子を活性化する場合、化学物質５−フルオロオロト酸を含む媒体
中で酵母を死滅させることについて選択する（すなわち、相互作用の阻害は、細
胞が生存するために必要である）（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９８３，Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１６７−１８０）。このような相互作用のインヒビタ
ーの同定はまた、例えば、前出に記載のように競合的インヒビターアッセイを用
いて達成され得るが、これらに限定されない。
【０１４２】 一般に、ベイトおよびプレイ集団のタンパク質は、所定の選択された配列に連
続的な各タンパク質を含む融合（キメラ）タンパク質として（好ましくは、キメ
ラコード配列の組換え発現により）提供される。１つの集団に関して、所定の選
択された配列は、ＤＮＡ結合ドメインである。ＤＮＡ結合ドメインは、プロモー
ター内のＤＮＡ配列またはＤＮＡプロモーターの活性を調節するＤＮＡ配列（例
えば、エンハンサーエレメント）を特異的に認識する限り、任意のＤＮＡ結合ド
メインであり得る。例えば、ＤＮＡ結合ドメインは、転写アクチベーターまたは
インヒビターである。他の集団に関しては、所定の選択された配列は、それぞれ
、転写アクチベーターまたはインヒビターのアクチベーターまたはインヒビター
ドメインである。調節ドメイン単独（タンパク質配列に対する融合物としてでは
ない）およびＤＮＡ結合ドメイン単独（タンパク質配列に対する融合物としてで
はない）は、好ましくは、このアッセイにおける擬陽性を避けるために、検出可
能に相互作用しない。このアッセイ系は、プロモーターに作動可能に連結された
レポーター遺伝子をさらに含み、このプロモーターは、転写アクチベーター（ま
たは転写インヒビター）のＤＮＡ結合ドメインについての結合部位を含む。従っ
て、本発明の方法において、ｆｌｔ−４融合タンパク質のプレイ融合タンパク質
に対する結合は、レポーター遺伝子の発現を活性化する（または阻害する）転写
アクチベーター（または転写インヒビター）の再構築を導く。レポーター遺伝子
の転写活性化は、例えば、原核生物または真核生物の細胞において、好ましくは
、細胞培養物において、細胞内で生じる。
【０１４３】 レポーター遺伝子ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターは、
ネイティブまたはネイティブでないプロモーターのヌクレオチド配列であり得る
。そして融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン部分により認識されるＤＮＡ結合
部位は、プロモーターに対してネイティブであり得る（このプロモーターが通常
このような結合部位を含む）か、または非ネイティブであり得る。従って、例え
ば、適切なＤＮＡ結合部位の１つ以上の直列コピー（例えば、４または５コピー
）は、所望のプロモーターにおけるＴＡＴＡボックスの上流に（例えば、−１０
０〜−４００位の領域において）導入され得る。好ましい局面において、１７ｂ
ｐのＵＡＳ（ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部位）の４または５直列コピーは、所望のプ
ロモーターのＴＡＴＡボックスの上流に導入される。このプロモーターは、選択
マーカーまたは検出マーカーの所望のコード配列の上流にある。好ましい実施形
態において、ＧＡＬ１−１０プロモーターは、所望のヌクレオチド配列に作動可
能に融合され；ＧＡＬ１−１０プロモーターは、ＧＡＬ４に関して既に５つの結
合部位を含む。あるいは、所望の遺伝子の転写活性化結合部位は欠失され得、そ
してＧＡＬ４結合部位と置換され得る（Ｂａｒｔｅｌら、１９９３，ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ １４（６）：９２０−９２４；Ｃｈａｓｍａｎら，１９８９
，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：４７４６−４７４９）。レポーター遺伝子
は、好ましくは、検出マーカーまたは選択マーカーをコードする配列を含む。こ
のようなマーカーの発現は、このマーカーが特定の相互作用の存在に応答して、
細胞においてオンにされるか、またはオフにされるかのいずれかであるように、
転写アクチベーターにより調節される。好ましくは、このアッセイは、バックグ
ラウンドレベルの転写アクチベーターがない場合に行われる（例えば、変異して
いるか、さもなければ転写アクチベーターが欠如した細胞において）。１つの実
施形態において、１つを超えるレポーター遺伝子を用いて、転写活性化を検出す
る（例えば、検出マーカーをコードする１つのレポーター遺伝子および異なる選
択マーカーをコードする１つ以上のレポーター遺伝子）。検出マーカーは、検出
可能なシグナルを生じ得る任意の分子であり得る（例えば、蛍光タンパク質、ま
たは容易に可視化され得るか、もしくは特定の抗体により認識可能であるタンパ
ク質）。選択マーカーは、選択マーカーを発現しない細胞の増殖を支持しない条
件下で増殖能力を付与する任意のタンパク質分子であり得る（例えば、選択マー
カーは、必須の栄養素を提供する酵素であり、そして相互作用アッセイが生じる
細胞は、酵素が欠損しており、そして選択培地は、このような栄養素を欠如する
）。レポーター遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質についての結合部位を天然に含
むネイティブなプロモーターの制御下にあるか、または異種もしくは合成プロモ
ーターの制御下にあるかのいずれかであり得る。
【０１４４】 このアッセイにおいて使用される活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインは
、広範に種々の転写アクチベーターが別々の結合活性化ドメインおよび転写活性
化ドメインを有する限り、これらの転写アクチベータータンパク質に由来し得る
。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ４タンパク質、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅのＧｃｎ４タンパク質（ＨｏｐｅおよびＳｔｒｕｈｌ，１９８６，Ｃｅ
ｌｌ ４６：８８５−８９４）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｒｄ１タンパク
質（Ｔｈｕｋｒａｌら、１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２３６０
−２３６９）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｃｅ１調節タンパク質（Ｔｈｉｅ
ｌｅら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２７４５−２７５２）、
Ｅ．ｃｏｌｉのＬｅｘＡリプレッサタンパク質（Ｓｃｈｎａｒｒら、１９９１，
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７３：４２３−４３１）、およびヘルペスウイルスＶＰ１
６トランスアクチベーター（Ｈｉｐｐｅｎｍｅｙｅｒら，１９９５，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５４８−５５２）、ならびにヒトエスト
ロゲンレセプター（Ｋｕｍａｒら，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：９４１−９５１
）は、分離できるＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する。融合タン
パク質において利用されるＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、同じ転
写アクチベーター由来である必要はない。特定の実施形態において、Ｇａｌ４ま
たはＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインが利用される。別の特定の実施形態において
、Ｇａｌ４または単純ヘルペスウイルスＶＰ１６（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら，
１９８８，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２：７３０−７４２）の活性化ドメインが利用
される。特定の実施形態において、Ｇａｌ４のアミノ酸１〜１４７（Ｍａら、１
９８７、Ｃｅｌｌ ４８：８４７−８５３；Ｐｔａｓｈｎｅら、１９９０、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４６：３２９−３３１）は、ＤＮＡ結合ドメインであり、そしてＶ
Ｐ１６のアミノ酸４１１〜４５５（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら，１９８８，Ｇｅ
ｎｅｓ Ｄｅｖ．２：７３０−７４２；Ｃｒｅｓｓら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５１：８７−９０）は、活性化ドメインである。
【０１４５】 好ましい実施形態において、酵母転写因子Ｇａｌ４は、タンパク質間相互作用
により再構築され、そして宿主株は、Ｇａｌ４についての変異体である。別の実
施形態において、ＤＮＡ結合ドメインはＡｃｅ１Ｎであり、そして／または活性
化ドメインはＡｃｅ１Ｎであり、そしてそれぞれ、Ａｃｅ１Ｎタンパク質のＤＮ
Ａ結合ドメインおよび活性化ドメインである。Ａｃｅ１Ｎは、二価銅の存在下で
ＣＵＰ１オペロンからの転写を活性化する酵母タンパク質である。ＣＵＰ１は、
メタロチオネインをコードし、このメタロチオネインは、銅をキレート化し、そ
してＣｕｐ１タンパク質の発現は、銅の存在下での増殖を可能にする（さもなけ
れば銅は宿主細胞に対して毒性である）。レポーター遺伝子はまた、再構築され
たＡｃｅ１転写アクチベーターの結合の際に酵素β−ガラクトシダーゼ（慣用的
な色素生成アッセイにより検出可能）を発現するＣＵＰ１−ｌａｃＺ融合物であ
り得る（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら、１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５７
：２２１−２２６）。別の特定の実施形態において、１つ以上のエストロゲンレ
セプター応答エレメントにより駆動されるレポーター遺伝子とともに、ヒトエス
トロゲンレセプターのＤＮＡ結合ドメインが使用される（Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎ
ら、１９９５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２３：８７６−８７８）。
【０１４６】 ＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクチベーター／インヒビタードメインは、各
々、好ましくは、融合タンパク質が発現される細胞において機能的な、核局在化
シグナルを有する（Ｙｌｉｋｏｍｉら、１９９２，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３６８
１−３６９４；ＤｉｎｇｗａｌｌおよびＬａｓｋｅｙ，１９９１，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６：４７９−４８１）。
【０１４７】 コードされたタンパク質の単離を容易にするために、融合構築物は、グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはマルトース結合タンパク質または利用可能
な抗体のエピトープのようなアフィニティータグをコードする配列を、アフィニ
ティー精製のためにさらに含み得る（それぞれ、例えば、グルタチオン、マルト
ース、またはエピトープに特異的な特定の抗体に結合する）（Ａｌｌｅｎら、１
９９５、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：５１１−５１６）。別
の実施形態において、融合タンパク質は、細菌細胞における融合タンパク質の組
換え生成のための細菌プロモーター配列をさらに含む（Ａｌｌｅｎら、１９９５
、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：５１１−５１６）。
【０１４８】 相互作用アッセイが生じる宿主細胞は、原核生物または真核生物の任意の細胞
であり得、これらの細胞においてレポーター遺伝子の転写が生じ得、そして検出
され得る。このような細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：哺乳動物細胞（例えば、サル、ニワトリ、マウス、ラット、ヒト、ウシ）、
細菌、および昆虫細胞（そして好ましくは、酵母細胞である）。結合ドメイン融
合タンパク質、転写活性化ドメイン融合タンパク質、およびレポーター遺伝子産
物をコードし、かつ発現し得る発現構築物は、発現構築物を含む細胞を接合する
ことにより、または細胞融合、形質転換、エレクトロポレーション、マイクロイ
ンジェクションなどにより、宿主細胞内に提供される。このアッセイが哺乳動物
において行われる特定の実施形態において、このＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ
４ ＤＮＡ結合ドメインであり、活性化ドメインは単純ヘルペスウイルスＶＰ１
６転写活性化ドメインである。そしてレポーター遺伝子は、いくつかのＧＡＬ４
ＤＮＡ結合部位により駆動される、アデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子由来の最小プ
ロモーターエレメントに作動可能に連結された所望のレポーター遺伝子コード配
列を含む（Ｆｅａｒｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８９：７９５８−７９６２）。使用される宿主細胞は、ＤＮＡ結合ド
メイン融合集団により認識されるものと同じＤＮＡ部位に結合する内因性転写因
子を発現しないべきである。また、好ましくは、この宿主細胞は、変異している
か、さもなければ、このアッセイにおいて使用されるレポーター遺伝子の内因性
の機能的形態が欠如している。
【０１４９】 酵母における２つの融合タンパク質集団の発現のための種々のベクターおよび
宿主株は公知であり、そして使用され得る（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、米国特許
第５，１４６８，６１４号；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３、「Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ
ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒ
ａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｈａｒｔｌｅｙ編、Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ ｘｖｉｉｉ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，ＮＹ，１５３〜１７９頁；ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｎｇｌａｚ，１９９
４，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：２８６−２９２」を参照の
こと）。限定ではなく例示として、酵母株または誘導株がこれらから作製され、
使用され得るものは、Ｎ１０５、Ｎ１０６、Ｎ１０５１、Ｎ１０６１およびＹＵ
ＬＨである。本発明のアッセイにおいて使用され得る例示的な株としてはまた、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【０１５０】
【化１】 （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能；Ｈａｒｐｅｒら
、１９９３、Ｃｅｌｌ ７５：８０５−８１６）。Ｙ１９０は、ＧＡＬ４結合部
位により駆動されるＨＩＳ３およびｌａｃＺレポーター遺伝子を含む。
【０１５１】
【化２】 （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能）。ＣＧ−１９４
５は、ＧＡＬ４結合部位により駆動されるＨＩＳ３およびｌａｃＺレポーター遺
伝子を含む。
【０１５２】 Ｙ１８７：ＭＡＴα、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−２００、ａｄｅ２−１０１
、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３，１１２、ｇａｌ４α、ｇａｌ８０α、ＵＲ
Ａ３：：ＧＡＬ１UAS−ＧＡＬ１TATA−ｌａｃＺ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能）。Ｙ１８７は、ＧＡＬ４結合部位により駆動さ
れるｌａｃＺレポーター遺伝子を含む。
【０１５３】 ＳＦＹ５２６：ＭＡＴａ、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−２００、ｌｙｓ２−８
０１、ａｄｅ２−１０１、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３，１１２、ｇａｌ４
−５４２、ｇａｌ８０−５３８、ｃａｎr、ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺ（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能）。ＳＦＹ５２６は
、ＧＡＬ４結合部位により駆動されるＨＩＳ３およびｌａｃＺレポーター遺伝子
を含む。
【０１５４】 ＨＦ７ｃ：ＭＡＴａ、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−２００、ｌｙｓ２−８０１
、ａｄｅ２−１０１、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３，１１２、ｇａｌ４−５
４２、ｇａｌ８０−５３８、ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１−ＨＩＳ３、ＵＲＡ３：：Ｇ
ＡＬ１UAS17マー(x3)−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌ ｔｏ，ＣＡから入手可能）。ＨＦ７ｃは、ＧＡＬ４結合部位により駆動されるＨ
ＩＳ３およびｌａｃＺレポーター遺伝子を含む。
【０１５５】 ＹＲＧ−２：ＭＡＴａ、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−２００、ｌｙｓ２−８０
１、ａｄｅ２−１０１、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３，１１２、ｇａｌ４−
５４２、ｇａｌ８０−５３８、ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１UAS−ＧＡＬ１TATA−ＨＩ
Ｓ３、ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１UAS17マー(x3)−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。ＹＲ
Ｇ−２は、ＧＡＬ４結合部位により駆動されるＨＩＳ３およびｌａｃＺレポータ
ー遺伝子を含む。 一般的に知られており、かつ当該分野で入手可能な多くの他の株を、使用し得る
。
【０１５６】 既に内因性レポーター遺伝子活性を欠失していない場合、レポーター遺伝子が
変異した細胞は、公知の方法により選択され得るか、またはこれらの細胞はレポ
ーター遺伝子を導入する前に、公知の遺伝子破壊法により標的レポーター遺伝子
において変異させられ得る（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９８３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．１０１：２０２−２１１）。
【０１５７】 特定の実施形態において、異なる融合タンパク質集団をコードするプラスミド
は、同時形質転換により、両方とも、１つ以上のレポーター遺伝子を含む単一の
宿主細胞（例えば、ハプロイド酵母細胞）に導入されて、タンパク質−タンパク
質相互作用についてのアッセイを実行し得る。より好ましくは、２つの融合タン
パク質集団は、（例えば、酵母細胞の）交配または（例えば、哺乳動物細胞の）
細胞融合のいずれかにより、単一の細胞内に導入される。交配型アッセイにおい
て、それぞれ、結合ドメイン融合発現構築物（好ましくは、プラスミド）および
活性化（またはインヒビター）ドメイン融合発現構築物（好ましくはプラスミド
）で形質転換された、反対の交配型のハプロイド酵母細胞の接合（ｃｏｊｕｇａ
ｔｉｏｎ）は、両方の構築物を同じ二倍体細胞中に送達する。酵母株の交配型は
、ＨＯ遺伝子での形質転換によって操作され得る（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚおよび
Ｊｅｎｓｅｎ，１９９１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９４：１３２−１４６
）。
【０１５８】 特定の実施形態において、酵母相互作用交配アッセイは、酵母Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つの異なる型の宿主細胞（株型ａおよ
びα）を用いて、使用される。宿主細胞は、好ましくは、各々が（例えば、転写
アクチベーターの）ＤＮＡ結合ドメインの１つ以上の結合部位を有する、少なく
とも２つのレポーター遺伝子を含む。アクチベータードメインおよびＤＮＡ結合
ドメインは、２つのそれぞれのタンパク質集団から形成されたキメラタンパク質
のそれぞれの部分である。一組の宿主細胞（例えば、ａ株細胞）は、ヌクレオチ
ド配列のライブラリーの、転写アクチベーター（例えば、ＧＡＬ４）のＤＮＡ結
合ドメインとの融合を含む。この一組の宿主細胞において発現されたハイブリッ
ドタンパク質は、レポーター遺伝子上のＤＮＡ結合部位を認識し得る。第２の酵
母宿主細胞の組（例えば、α株細胞）は、転写アクチベーターの活性化ドメイン
に融合されたＤＮＡ配列のライブラリーの融合をコードするヌクレオチド配列を
含む。
【０１５９】 特定の実施形態において、融合タンパク質構築物は、一組のプラスミドとして
宿主細胞中に導入される。これらのプラスミドは、好ましくは宿主酵母細胞にお
いて自律性複製をし得、そしてまた、好ましくはＥ．ｃｏｌｉで増殖され得る。
これらのプラスミドは、ＤＮＡ結合ドメイン融合遺伝子または活性化ドメイン融
合遺伝子の転写を指向するプロモーター、および転写終止シグナルを含む。これ
らのプラスミドはまた、好ましくは選択可能なマーカー遺伝子を含み、プラスミ
ドを含む細胞の選択を可能にする。これらのプラスミドは、単一コピーまたは複
数コピーであり得る。酵母動原体を有する単一コピー酵母プラスミドもまた、活
性化ドメイン融合およびＤＮＡ結合ドメイン融合を発現するために使用され得る
（Ｅｌｌｅｄｇｅら、１９８８、Ｇｅｎｅ ７０：３０３−３１２）。別の実施
形態において、融合構築物が、相同組換えを介して酵母染色体に直接導入される
。これらの目的のための相同組換えは、酵母の栄養成長（ｖｅｇｉｔａｔｉｖｅ
ｇｒｏｗｔｈ）に必須ではない酵母配列（例えば、ＭＥＲ２、ＭＥＲ１、ＺＩ
ＰＩ、ＲＥＣ１０２、またはＭＥ１４遺伝子）を介して媒介される。
【０１６０】 バクテリオファージベクターもまた、ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質およ
び／または活性化ドメイン融合タンパク質を発現するために使用され得る。ライ
ブラリーは一般的に、プラスミドベクターからよりも、バクテリオファージベク
ターからより速く、かつより容易に調製され得る。
【０１６１】 特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のタンパク質−タンパク質相互
作用を検出する方法を提供し、この方法は、（ａ）第１の交配型であり、かつｆ
ｌｔ−４配列およびＤＮＡ結合ドメインを含有する第１の融合タンパク質を含む
酵母細胞の第１の集団において、ｆｌｔ−４またはその誘導体、ホモログもしく
はアナログを組換え発現する工程であって、ここでこの酵母細胞の第１の集団は
、ＤＮＡ結合ドメインにより認識される１つ以上のＤＮＡ結合部位により駆動さ
れるプロモーターに作動可能に連結された第１のヌクレオチド配列を含み、それ
により、この第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との相互作用が、第
１のヌクレオチド配列の転写の増加を生じ、この第２の融合タンパク質が、転写
活性化ドメインを含む、工程；（ｂ）第１の集団において、第１のヌクレオチド
配列の増加した転写が、この第２の融合タンパク質の非存在下で起こる酵母細胞
を除去するようにネガティブに選択する工程；（ｃ）第１の交配型とは異なる第
２の交配型の酵母細胞の第２の集団において、複数の第２の融合タンパク質を組
換え発現する工程であって、各第２の融合タンパク質は、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶ
ＥＧＦ−Ｄのフラグメント、誘導体、ホモログまたはアナログの配列と、転写ア
クチベーターの活性化ドメインとを含み、この活性化ドメインは、各この第２の
融合タンパク質中で同じである、工程；（ｄ）酵母細胞の第１の集団を、酵母細
胞の第２の集団と交配して、二倍体酵母細胞の第３の集団を形成する工程であっ
て、ここでこの二倍体酵母細胞の第３の集団は、ＤＮＡ結合ドメインにより認識
されるＤＮＡ結合部位により駆動されるプロモーターに作動可能に連結された第
２のヌクレオチド配列を含み、これにより、第１の融合タンパク質と第２の融合
タンパク質との相互作用が、第２のヌクレオチド配列の転写の増大を生じ、ここ
で第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が同じであり得るか、
または異なり得る、工程；ならびに（ｅ）この第１のヌクレオチド配列および／
または第２のヌクレオチド配列の増大された転写を検出する工程であって、それ
により第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との間の相互作用を検出す
る、工程、を包含する。
【０１６２】 特定の実施形態では、ベイト（ｂａｉｔ）ｆｌｔ−４配列およびキメラ遺伝子
のプレイ（ｐｒｅｙ）ライブラリーが、ほぼ６〜８時間の間、固形培地上で２つ
の酵母株を交配することによって、合わされる。必要に応じて、この交配は、液
体培地中で実施される。得られた二倍体は、両方の種類のキメラ遺伝子、すなわ
ち、ＤＮＡ結合ドメイン融合および活性化ドメイン融合を含む。
【０１６３】 好ましいレポーター遺伝子は、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、および／またはＬａｃＺ
遺伝子（例えば、ＲｏｓｅおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ、１９８３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．１０１：１６７−１８０）を含む（ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン
認識エレメントに作動可能に連結される）。他のレポーター遺伝子は、グリーン
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｕｂｂｉｔら、１９９５、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：４４８−４５５）、ルシフェラーゼ、ＬＥＵ２、ＬＹ
Ｓ２、ＡＤＥ２、ＴＲＰ１、ＣＡＮ１、ＣＹＨ２、ＧＵＳ、ＣＵＰ１、またはク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の機能的コード配列
を含むが、これらに限定されない。ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＡＤＥ２、およびＴＲ
Ｐ１の発現は、特定の規定培地における増殖によって検出される；ＧＵＳおよび
ＣＡＴは、周知の酵素アッセイによってモニタリングされ得る；そしてＣＡＮ１
およびＣＹＨ２は、それぞれカナバニンおよびシクロヘキシミドの存在下におけ
る選択によって検出される。ＧＦＰに関しては、タンパク質の天然蛍光が検出さ
れる。
【０１６４】 特定の実施形態では、レポーター遺伝子の転写は、連結複製アッセイによって
検出される。例えば、Ｖａｓａｖａｄａら、１９９１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０６８６−１０６９０により記載されるよ
うに、ＳＶ４０ラージＴ抗原の発現は、ＧＡＬ４結合部位に応答性のＥ１Ｂプロ
モーターの制御下にある。ＳＶ４０複製起点を含むプラスミドの複製は、ＧＡＬ
４タンパク質の再構築およびタンパク質−タンパク質相互作用を示す。あるいは
、ポリオーマウイルスレプリコンが用いられ得る（Ｖａｓａｖａｄａら、１９９
１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０６８６−１０
６９０）。
【０１６５】 別の実施形態では、タンパク質をコードするレポーター遺伝子の発現は、免疫
アッセイによって、すなわち、このようなタンパク質に対する抗体の免疫特異的
結合を検出することによって、検出され得、この抗体は、標識され得るか、また
は代わりに、この抗体は、検出可能シグナルを生じるように、抗体に対する標識
された結合パートナーと共にインキュベートされ得る。
【０１６６】 ＡｌａｍおよびＣｏｏｋ、１９９０、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：２
４５−２５４は、再構築された転写アクチベーターに応答性の転写調節領域に作
動可能に連結され得、従ってレポーター遺伝子として用いられ得る、検出可能な
マーカー遺伝子の限定されない例を開示する。
【０１６７】 ＵＲＡ３またはＨＩＳ３のようなレポーター遺伝子の活性化は、それぞれウラ
シルまたはヒスチジンの非存在下で細胞を増殖させ得ず、従って、選択可能なマ
ーカーとして作用する。従って、交配後、タンパク質−タンパク質相互作用を示
す細胞は、栄養成分（例えば、それぞれウラシルまたはヒスチジン）を欠損する
培地（それぞれ、−ＵＲＡ（ＵＲＡマイナス）培地および−ＨＩＳ（ＨＩＳマイ
ナス）培地と称される）中で増殖する能力について選択される。−ＨＩＳ培地は
、好ましくは、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ）（これは、
ＨＩＳ３遺伝子産物の競合的インヒビターであり、そして選択を達成するために
より高いレベルの転写を必要とする）を含む（Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３、Ｇｅ
ｎｅｓ Ｄｅｖ．７：５５５−５６９）。同様に、６−アザウラシル（これは、
ＵＲＡ３遺伝子産物のインヒビターである）は、−ＵＲＡ培地中に含まれ得る（
Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎら、１９９５、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：８
７６−８７８）。ＵＲＡ３遺伝子活性もまた、その遺伝子産物、オロチジン−５
’−一リン酸デカルボキシラーゼの活性を決定することにより検出および／また
は測定され得る（Ｐｉｅｒｒａｔら、１９９２、Ｇｅｎｅ １１９：２３７−２
４５；Ｗｏｌｃｏｔｔら、１９６６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ １２２：５３２−５３４）。本発明の他の実施形態では、ｌａｃＺまたはＧ
ＦＰのようなレポーター遺伝子の活性は、これらのレポーター遺伝子の活性化か
ら生じる検出可能なシグナル（例えば、それぞれ色素生産または蛍光）を測定す
ることによりモニタリングされる。例えば、ｌａｃＺ転写は、そのコードされた
酵素（β−ガラクトシダーゼ）についての色素生産性基質（例えば、Ｘ−ｇａｌ
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド））の存在
下でのインキュベーションによってモニタリングされ得る。ｆｌｔ−４配列産物
とライブラリーとを交配することによってこのようにして単離された全ての相互
作用タンパク質のプールは、「ｆｌｔ−４インタラクティブ集団（ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」を同定する。
【０１６８】 本発明の特定の実施形態では、転写アクチベータードメイン融合タンパク質の
非存在下でのＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質による転写活性化から生じる偽
陽性は、活性化ドメイン融合集団への曝露の前の、ＤＮＡ結合融合集団を含む宿
主細胞内でのこのような活性化についてのネガティブ選択によって、防止または
減少される。例として、このような細胞がＵＲＡ３をレポーター遺伝子として含
む場合、ネガティブ選択は、ＵＲＡ＋細胞を殺傷する５−フルオロオロット酸（
５−ＦＯＡ）の存在下で細胞をインキュベートすることにより実施される（Ｒｏ
ｔｈｓｔｅｉｎ、１９８３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１６７−１８
０）。従って、ＤＮＡ結合ドメイン融合それ自体が転写を活性化する場合、５−
ＦＯＡの代謝が、細胞死、および自己活性化ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドの
除去に導く。
【０１６９】 レポーター遺伝子としての選択可能なマーカーの使用、および細胞培地中の、
レポーター遺伝子転写の非存在下で宿主細胞に対して毒性または増殖阻害性の薬
剤の存在を含むネガティブ選択は、これが他の方法よりも高い速度でのプロセシ
ングを可能にするため、好ましい。明らかなように、ネガティブ選択はまた、単
独で、またはＤＮＡ結合融合集団のネガティブ選択に加えてのいずれかで、同様
の方法によって、ＤＮＡ結合ドメイン融合集団との相互作用の前に活性化ドメイ
ン融合集団に対して実施され得る。
【０１７０】 ネガティブ選択はまた、公知の方法（例えば、Ｂａｒｔｅｌら、１９９３，Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４）によって回収されたｆｌｔ
−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ対において実施したが、上記のプレネガティブ選択（相
互作用アッセイの前）が好ましい。例えば、活性化ドメイン（検出された相互作
用対の２分の１）に融合されたタンパク質もしくはペプチドまたはポリペプチド
をコードする各々のプラスミドは、単独か、またはＤＮＡ結合ドメインのみ、検
出された相互作用するタンパク質に融合されているＤＮＡ結合ドメイン、または
転写に影響しないか、またはタンパク質−タンパク質相互作用に関与しないタン
パク質に融合されているこのＤＮＡ結合ドメインをコードするプラスミドととも
に元の本来のスクリーニング株に形質転換され得る；検出された相互作用するタ
ンパク質に融合されたＤＮＡ結合ドメインをコードするプラスミド以外の任意の
プラスミドを用いて検出されるポジティブな相互作用は、活性化ドメインが偽陽
性を生じることを示し、そしてこれは、続いてこのスクリーンから無視される。
【０１７１】 特定の実施形態において、このｆｌｔ−４プラスミド集団は、第１の交配型（
ａまたはα）の酵母株において形質転換され、そして第２のプラスミド集団（Ｄ
ＮＡ配列のライブラリーを含む）は、異なる交配型の酵母株において形質転換さ
れる。両方の株は、好ましくはＵＲＡ３およびＨＩＳ３に関する変異体であり、
そしてレセプター遺伝子としてＵＲＡ３および必要に応じてｌａｃＺを含む。酵
母細胞の第１のセットは、ｆｌｔ−４プラスミドに関してポジティブに選択され
、そして選択マーカー（例えば、ウラシル）を欠失しており、そして５−ＦＯＡ
を含んでいる培地におけるインキュベーションにより偽陽性に関してネガティブ
に選択される。第２の交配型の酵母細胞は、第２のプラスミド集団を用いて形質
転換され、そして融合タンパク質のライブラリーを含むプラスミドの存在に関し
てポジティブに選択される。選択された細胞はプールされる。プールされた細胞
の両方の群は互いに混合され、そして交配は、固相で生じることを可能にする。
次いで、得られる２倍体細胞は、各プラスミドの存在についておよびレセプター
遺伝子の活性化について選択する、選択培地に移される。
【０１７２】 本発明の特定の実施形態において、相互作用する集団が得られた後、相互作用
するタンパク質の対をコードするＤＮＡ配列は、別個のそれぞれの反応において
ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドまたは活性化ドメインハイブリッドのいずれか
が増幅される方法によって単離される。好ましくは、この増幅は、ＤＮＡ結合ド
メインハイブリッドまたは活性化ドメインハイブリッドのいずれかに特異的なオ
リゴヌクレオチドプライマーの対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米
国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号および同第４，８８
９，８１８号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７６５２−７６５６；Ｏｃｈｍａｎら、１９８
８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０：６２１−６２３；Ｌｏｈら、１９８９，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４３：２１７−２２０；Ｉｎｎｉｓら、１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ）によって実施される。このＰＣＲ反応はまた、相互作用するタンパク質
対（好ましくは、プールされた多数の反応体として）を発現するプールされた細
胞で実施され得る。当該分野で公知の他の増幅方法は使用され得、この方法とし
ては、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ ３２０，３０８）、Ｑβレプリカ−ゼの使用、
またはＫｒｉｃｋａら、１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，第１章および表ＩＸ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに列挙される方法が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【０１７３】 ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドタンパク質および活性化ドメインハイブリッ
ドタンパク質をコードするプラスミドはまた、当該分野で周知の方法のいずれか
によって単離され、そしてクローン化され得る。例えば、限定の目的ではないが
、シャトル（酵母からＥ．ｃｏｌｉ）ベクターを使用して、融合タンパク質を発
現する場合、この遺伝子は、酵母ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉへ形質転換し、そしてＥ
．ｃｏｌｉからプラスミドを回収することによって回収され得る（例えば、Ｈｏ
ｆｆｍａｎら、１９８７，Ｇｅｎｅ ５７：２６７−２７２）。あるいは、酵母
ベクターは単離され得、そして融合タンパク質をコードする挿入物は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉにおいてプラスミドの増殖のために細菌発現ベクターにサブクローン化した
。
【０１７４】 （５．５．薬学的組成物および治療的／予防的投与） 本発明は、本発明の有効量の治療剤の、被験体への投与による治療（および予
防）の方法を提供する。好ましい局面において、この治療剤は、実質的には精製
される。この被験体としては、好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ
、イヌなどが挙げられるが、これらに限定されない動物であり、そして好ましく
は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態において、非ヒ
ト哺乳動物が被験体である。
【０１７５】 治療剤が、節５．２．１および節５．２．２（前出）に記載される核酸を含有
する場合、使用され得る処方物および投与の方法；さらなる適切な処方物および
投与の経路は、本明細書中の以下に記載した中から選択され得る。
【０１７６】 種々の送達系は公知であり、そして本発明の治療剤を投与するために使用され
得る（例えば、リポソーム、微粒子、およびマイクロカプセルにおけるカプセル
化）：治療剤を発現し得る組換え細胞の使用、レセプター媒介性エンドサイトー
シスの使用（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６２：４４２９−４４３２）；レトロウイルスベクターまたはその他のベクター
の一部として治療剤核酸の構築など。導入の方法としては、皮膚内、筋肉内、腹
腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口が挙げられるが、これらに限定
されない。この化合物は、任意の好都合な経路によって（例えば、注入によって
、ボーラス注射によって、上皮の内面（ｌｉｎｉｎｇ）または粘膜皮膚の内面（
例えば、口粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を介する吸入によって）投与され
得、そしてその他の生物学的に活性な因子とともに投与され得る。投与は、全身
的または局所的であり得る。さらに、脳室内および鞘内の注射を含む、任意の適
切な経路による本発明の薬学的組成物の中枢神経系への導入が所望され得る；脳
室内注射は、（例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに付着される）
脳室カテーテルによって容易にされ得る。肺の投与はまた、例えば、呼吸器また
は噴霧器の使用およびエアゾール剤を有する処方物の使用によって使用され得る
。
【０１７７】 特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物を処置を、必要とする領域に
局所的に投与することが望ましい。例えば、これは、限定の目的ではなく、例え
ば、外科の後の創傷包帯剤とともに外科中の局所的注入、局所的塗布によって、
注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または移植片によって達成
され得、この移植片は、多孔性、非多孔性または膜（例えば、シラスチック膜）
を含むゼラチン材料、あるいは繊維である。１つの実施形態において、投与は、
悪性腫瘍もしくは腫瘍性組織または前腫瘍性組織の部位（または以前の部位）に
直接注射することにより得る。
【０１７８】 別の実施形態において、この治療剤は、小胞内、特にリポソーム内に送達され
得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３
；Ｔｒｅａｔら、１９８９，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ編、Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，３５３−３６５頁；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書、３１７−３
２７頁；一般的には同書を参照のこと）。
【０１７９】 なお別の実施形態において、この治療剤は、制御された放出系を介して送達さ
れ得る。１つの実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，前出
；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ
．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８
８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
３２１：５７４−５７９）。別の実施形態において、ポリマー材料が使用され得
る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏ
ｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕ
ｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇ
ｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ編、Ｗｉｌ
ｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，１９８
３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：
６１；Ｌｅｖｙら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０−１９２；Ｄｕ
ｒｉｎｇら、１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗ
ａｒｄら、１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：８５８−８６３）。なお
別の実施形態において、制御された放出系は、治療標的の近位（すなわち、脳）
に配置され得、従って、全身用量の一部のみが必要である（例えば、Ｇｏｏｄｓ
ｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前出、第２巻、１１５−１３８頁）。他の制御
された放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７
−１５３３）による概説において議論される。
【０１８０】 特定の実施形態において、この治療剤は、タンパク質治療剤をコードする核酸
であり、この核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてそれ
が細胞内になるように投与することによって（例えば、レトロウイルスベクター
の使用（米国特許第４，９８０，２８６号）によって、直接注射によって、微粒
子ボンバーメントの使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎ
ｔ）によって、脂質、細胞表面レセプターまたはトランスフェクト因子で被覆す
ることによって、あるいは、核を挿入することで公知の、ホメオボックス様ペプ
チドに連結された状態で投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９
９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８
６８）など）インビボで投与され、そのコードされたタンパク質の発現を増強し
得る。あるいは、核酸治療剤は、発現のために細胞内に導入され得、そして相同
組換えによって宿主細胞ＤＮＡ内に取り込まれ得る。
【０１８１】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療的に有効
量の治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。特定の実施形態にお
いて、用語「薬学的に受容可能」は、連邦政府または州政府の監督官庁によって
認可されているか、または動物、より詳細には、ヒトにおける使用のための米国
薬局方もしくはその他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを
意味する。用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュ
バント、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水ま
たは油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などがあげられるが、これらに
限定されない、石油由来、動物由来、植物由来または合成由来の油を含む）のよ
うな滅菌した液体であり得る。薬学的組成物が経口投与される場合、水は、好ま
しいキャリアである。薬学的組成物が静脈内に投与される場合、生理食塩水およ
び水溶性ブドウ糖は、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液および水溶性ブ
ドウ糖ならびにグリセロール溶液は、好ましくは注射可能溶液のための液体キャ
リアとして使用される。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、
ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲ
ル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナ
トリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エ
タノールなどが挙げられる。所望の場合、この組成物はまた、少量の保湿剤もし
くは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液
、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出処方物などの形態であり得る
。この組成物は、伝統的な結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）を
用いて座剤として処方され得る。経口処方物としては、薬学的等級のマンニトー
ル、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的なキャリアが挙げられ得る
。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されてい
る。このような組成物は、治療的に有効量の治療剤（好ましくは精製された形態
で）を、患者への適切な投与のための形態を提供するために適切な量のキャリア
とともに含む。この処方物は、投与形態に好都合であるべきである。
【０１８２】 好ましい実施形態において、この組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適合
された薬学的組成物として慣用的な手順に従って処方される。代表的には、静脈
内投与のための組成物は、滅菌された等張緩衝液における溶液である。必要に応
じて、この組成物はまた、安定化剤および局所麻酔薬（例えば、注射の部位の痛
みを和らげるリグノカイン）を含み得る。一般的には、この成分は、別個にかま
たは単位用量形態において互いに混合されるかのいずれかで供給される（例えば
、凍結乾燥粉末または密封容器内での無水濃縮物（例えば、多量の活性剤を含む
アンプルまたは袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ））として）。この組成物が注入によって
投与される場合、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルを
用いて調剤され得る。この組成物が注射によって投与される場合、注射のための
滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与の前に混合され得るように提
供され得る。
【０１８３】 本発明の治療剤は、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、遊離カルボキシル基（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、
酒石酸など由来の塩）を用いて形成される塩、遊離アミノ基（例えば、イソプロ
ピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プ
ロカインなど由来の塩）を用いて形成される塩、およびナトリウム、カリウム、
アンモニウム、カルシウム、および水酸化鉄（ＩＩＩ）など由来の塩が挙げられ
る。
【０１８４】 特定の障害または状態の処置において有効な本発明の治療剤の量は、障害また
は状態の性質に依存し、そして標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに
、インビトロアッセイは、最適な投薬量の範囲を同定するのを助けるために必要
に応じて使用され得る。処方物において使用されるべき正確な用量はまた、投与
の経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、そして医者の判断および各々
の患者の状況に従って決定するべきである。しかし、静脈内投与のための適切な
投薬量の範囲は、一般的には、１ｋｇ体重あたり約２０〜５００μｇの活性化合
物である。鼻腔内投与のための適切な投薬量の範囲は、一般的には、約０．０１
ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効的な用量は、インビトロまたは
動物モデル試験系から導かれる用量−反応曲線から推定され得る。
【０１８５】 座剤は、一般的には、０．５重量％〜１０重量％の範囲内の活性成分を含む；
経口処方物は、好ましくは、１０％〜９５％の活性成分を含む。
【０１８６】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされている１つ
以上の容器を含む薬学的パックまたは薬学的キットを提供する。必要に応じて、
このような容器に関して、医薬品または生物学的産物の製造、使用または販売を
規制する政府の機関による所定の形式における通告があり得、これは、ヒトの投
与のための製造、使用、または販売の機関による認可を反映して通告される。
【０１８７】 （５．６．動物モデル） 本発明はまた、動物モデルを提供する。１つの実施形態において、ｆｌｔ-４
：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複合体に関連する疾患および障害についての動物モデルが提
供される。これらは、二次前立腺腫瘍転移を含むが、これに限定されない。この
ような動物は、染色体のｆｌｔ−４遺伝子とＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子またはＶＥＧＦ
−Ｄ遺伝子との間の、および生物学的に不活性であるかまたは欠失させられた（
好ましくは、異種配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）の挿入によって）外来性
ｆｌｔ−４遺伝子とＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子またはＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子との間の相同
性組換えまたは挿入変異誘発を促進することによって、最初に作製され得る。好
ましい局面において、相同性組換えは、挿入的に不活性化されたｆｌｔ−４およ
びＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子を含むベクターを用いて胚誘導幹（Ｅ
Ｓ）細胞を形質転換することによって実施され、その結果、相同性組換えが起こ
り、続いて、形質転換されたＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、そして胚盤胞を養母に
移植し、続いて、キメラ動物（「ノックアウト動物」）が誕生する。このキメラ
動物において、ｆｌｔ−４および／またはＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ遺伝
子は、不活性化または欠失している（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）。このキメラ動物は交配されて、さらなる
ノックアウト動物を産生し得る。このような動物は、マウス、ハムスター、ヒツ
ジ、ブタ、ウシなどであり得、そして好ましくは、非ヒト動物である。特定の実
施形態において、ノックアウト動物が、作製され得る。
【０１８８】 本発明の異なる実施形態において、機能性ｆｌｔ−４および／またはＶＥＧＦ
−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子を、例えば、ｆｌｔ−４およびＶＥＧＦ−Ｃまた
はＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子を、タンパク質（単数または複数）を過剰発現するか、ま
たは複合体またはタンパク質を通常発現しない組織において、それらを発現する
かいずれかの異種プロモーター（すなわち、ネイティブのｆｌｔ−４またはＶＥ
ＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄプロモーターではないプロモーター）の制御下で導
入することによって、組み込み、そして発現する（あるいは過剰発現するかまた
は発現し損なう）トランスジェニック動物は、ｆｌｔ−４：ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ複
合体の上昇したレベルによって特徴付けられる疾患および障害の動物モデルとし
ての用途を有し得る。このような動物は、上記の疾患または障害を処置するか、
または予防する能力について、分子をスクリーニングするかまたは試験するため
に使用され得る。
【０１８９】 １つの実施形態において、本発明は、ｆｌｔ−４遺伝子およびＶＥＧＦ−Ｃ遺
伝子またはＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の両方を含む組換え体非ヒト動物を提供し、ここ
で、ｆｌｔ−４遺伝子は、、ネイティブのｆｌｔ−４遺伝子プロモーターではな
いプロモーターの制御下にあり、ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子またはＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子
は、ネイティブのＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子プロモーターまたはＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子プ
ロモーターではないプロモーターの制御下にある。
【０１９０】 以下の一連に実験は、例示のために示され、本発明の範囲に対する制限のため
ではない。
【０１９１】 （６．実施例） 以下の実験は、ｆｌｔ−４が前立腺癌細胞においてのみ発現されることを示し
、この前立腺癌細胞は、転移能力を有するか、または一次の前立腺腫瘍の二次の
前立腺腫瘍転移から誘導され、その結果、前立腺癌細胞におけるｆｌｔ−４発現
は、前立腺癌の診断および予後マーカーとして作用する。そして、以下の実験は
さらに、ｆｌｔ−４の発現または活性を阻害する方法は、前立腺癌の処置、阻害
または予防において有用であることを示す。
【０１９２】 （６．１ 免疫組織化学によって決定されたｆｌｔ−４発現） 良性前立腺過形成、一次前立腺癌、正常なリンパ節および二次前立腺腫瘍リン
パ転移の代表的な組織サンプルを、Ｚｅｍｅｄ（Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ，ＣＡ）から得られるＺｅｍｅｄ Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎキットを使用して
、抗ｆｌｔ−４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕ
ｚ，ＣＡ）とともに染色した。免疫組織化学的アッセイを、３０分間の希釈一次
抗体、１５分間のビオチニル化二次抗体および１５分間のＨＲＰ−ストレプトア
ビジンの連続的な適用によって実施した。免疫反応性は、ＡＥＣ（３−アミノ−
９−エチルカルバゾール）またはＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）色原
体を用いて可視化し、そして切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。適切な陰
性コントロールを、ウサギ抗体またはヤギ抗体またはアイソタイプである適合マ
ウス抗体を使用して実施し、そして全ての陰性コントロールは、非常に低いバッ
クグランドを示した。陽性コントロールよおび陰性コントロールを、各バッチを
用いて並行して実施した。それらの結果を、図２Ａ〜２Ｆに示す。
【０１９３】 図２Ａおよび２Ｂ（それぞれ、正常なリンパ節組織および良性前立腺過形成組
織）には、ｆｌｔ−４発現はみられない。しかし、ｆｌｔ−４発現は、前立腺転
移を有するリンパ節組織において明らかである（図２Ｃおよび図２Ｄ）。図２は
、前立腺癌組織と良性前立腺過形成組織との間のｆｌｔ−４発現における差異を
明らかに示す。図２Ｆもまた、ｆｌｔ−４が前立腺癌組織において発現されるこ
とを明らかに示す。
【０１９４】 試験された臨床サンプルにおいて、全ての良性上皮は、試験の結果（５／５）
、ｆｌｔ−４発現について陰性であった。全ての良性リンパ節（７／７）もまた
、試験の結果、ｆｌｔ−４発現について陰性であった。ほとんどの前立腺癌（９
/１０）もまた、試験の結果、ｆｌｔ−４発現について陰性であった。興味深い
ことに、前立腺癌についての例外のみが、根治的前立腺切除に続く局所的な繰返
し発生疾患を発症した患者から得られた。リンパ節におけるすべての前立腺癌転
移は、試験の結果（２／２）、ｆｌｔ−４発現について陽性であった。これらの
同じサンプルはすべて、試験の結果、ＶＥＧＦ−Ｃ発現について陽性であり、こ
のことは、二次の前立腺腫瘍転移が、ＶＥＧＦ−Ｃ／ｆｌｔ−４オートクライン
ループを示すことを示す。
【０１９５】 ヒト前立腺癌細胞株をまた、ｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ−Ｃ、ｆｌｋ−１およびＶ
ＥＧＦ発現について、免疫組織化学によって試験した。ヒト前立腺癌細胞株（Ｌ
ＮＣａＰ、ＰＣ−３、Ｄｕ１４５、およびＴＳＵＰｒ１）を、スライドチャンバ
ーにおいて増殖させ、そして１０％ホルマリンで固定し、上記のように抗ｆｌｔ
−４とともに染色した。ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦおよびｆｌｋ−１に対する抗体
はまた、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）か
ら得た。ｆｌｔ−４が、各ヒト前立腺癌細胞株において発現されるという結果は
、図３Ａ〜３Ｄに示される。
【０１９６】 （６．２．逆トランスクリプターゼＰＣＲによって決定されたＦＬＴ−４発現
） 全ＲＮＡを、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、ホルモン感受性細胞株、ＰＣ−
３、ＤＵ−１４５およびＴＳＵＰｒ１、ホルモン非依存性細胞株から、ＲＮＡｚ
ｏｌ Ｂキット（Ｂｉｏｔｅｘ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して単離した。
ＲＮａｓｅのないＤＮａｓｅ Ｉ処理（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
）後、５μｇのＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ
，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を使用して逆転写した。
【０１９７】 ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を、ＶＥＧＦおよびそのレセプターｆｌ
ｋ−１、ならびにＶＥＧＦ−Ｃおよびそのレセプターｆｌｔ−４に対するプライ
マーを使用して逆転写したｃＤＮＡサンプルに対して実施した。使用したプライ
マーを以下の通りである：
【０１９８】
【化３】 。
【０１９９】 ＰＣＲを、Ｂｉｏｌａｓｅ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ，Ｌｏｎｄ
ｏｎ，ＵＫ）と供給された緩衝液および３ｍＭ ＭｇＣｌ2とをともに使用して
、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃおよびｆｌｔ−４について実施したか、またはＢｉｏ
ｌａｓｅ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）と供給
された緩衝液および３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2とをともに使用して、ｆｌｋ−１に
ついて実施した。増幅条件は、９４℃で３０秒間の変性の３５サイクル；１分間
の、ＶＥＧＦについて６３℃でのアニーリング、ｆｌｋ−１について６２℃での
アニーリング、ＶＥＧＦ−Ｃについて５７℃でのアニーリングおよびｆｌｔ−４
について６３℃でのアニーリング；ならびに７２℃で１分間の伸長であった。３
５サイクル後、最終的な伸長工程を７２℃で１０分間実施する。増幅産物を、２
．５％アガロースゲルで分離した。これらの結果を図４に示す。
【０２００】 図４に示されるように、ｆｌｔ−４は、試験された全てのヒト前立腺癌細胞株
において発現される。さらに、ｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ−Ｃに対するリガンドがま
た、試験された全てのホルモン非依存性前立腺癌細胞株において発現される。こ
れらの結果は、免疫組織化学の結果と一致し、そして転移性前立腺癌細胞におけ
るＶＥＧＦ−Ｃ／ｆｌｔ−４オートクラインループの存在と一貫している。
【０２０１】 （６．３．フローサイトメトリー） ＬＮＣａＰ細胞（１×１０6）をペレット化し、そしてウサギ抗ｆｌｔ−４血
清または正常なウサギ血清（陰性コントロール）（それぞれ、Ｓａｎｔａ Ｃｒ
ｕｚ Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得た）とともに、４℃で
３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ビオチニル
化抗ウサギ抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳでのもう一
度の洗浄後、細胞をｓｔｒｅｐ−ＰＥとともに、４℃で３０分間インキュベート
した。細胞をもう一度ＰＢＳで洗浄し、そしてＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。ＬＮＣａＰ細胞
株を、リンパ節組織における二次前立腺転移から誘導した。これらの結果を図５
に示す。
【０２０２】 図５は、ｆｌｔ−４発現が、生存したＬＮＣａＰ細胞の表面で検出され得るこ
とを明確に示す。
【０２０３】 （６．４．アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するＰＣ−３増殖の阻害） この実施例は、ＶＥＧＦおよびそのレセプター（ｆｌｋ−１およびｆｌｔ−１
）ならびにＶＥＧＦ−Ｃおよびそのレセプター（ｆｌｔ−４）の発現を阻害する
ためのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞
株ＰＣ−３（前立腺腫瘍転移由来の細胞株）の増殖を阻害することを示す。
【０２０４】 ＰＣ−３細胞を、９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルで播種したか、
または血清がないＸ−ＶＩＶＯ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒ
ｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中の２４ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルで播種
した。アンチセンスオリゴを、１μＭから１００μＭに増加する濃度で細胞に添
加した。培地およびオリゴを３日ごとに新しくし、そして培養を１４日間継続し
た。生存可能な細胞を、血球計細胞計測によってか、またはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得たＭＴＳ ９６ウェル生存可能細胞アッセイによっ
てのいずれかで定量化した。ＭＴＳアッセイを使用する細胞増殖を、コントロー
ルのパーセンテージとして表現した。これらの実験は、２連で行った。オリゴヌ
クレオチドの配列は、以下の通りであった：
【０２０５】
【化４】 。
【０２０６】 これらの結果を、図６に示す。
【０２０７】 １００μＭのオリゴ濃度は細胞に対して毒性であることが判明し、そして図６
から排除されている。図６に示されるように、増殖阻害は、一般に、５〜１０μ
Ｍで最大であった。ｆｌｔ−１およびｆｌｔ−４の発現の抑制は、ＰＣ−３細胞
増殖に対して最大の阻害効果（約５０％）を有し、続いて、ＶＥＧＦ−Ｃ（約２
０〜３０％）であった。抗ＶＥＧＦおよび抗ｆｌｋ−１オリゴは、コントロール
オリゴと比較して約２０％まで増殖を阻害した。ＶＥＧＦ−Ｃ／ｆｌｔ−４とＶ
ＥＧＦ／ｆｌｔ−１との間の示差的な阻害は、各オートクライン経路の相対的な
重要性を反映し得る。従って、これらの結果は、抗ｆｌｔ−４および抗ＶＥＧＦ
−Ｃアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前立腺癌転移を阻害するか、または抑
制するために有効である。
【０２０８】 特許請求されかつ本明細書中に記載された本発明は、本明細書中に開示された
特定の実施形態によって、範囲が限定されることはない。なぜなら、これらの実
施形態は、本発明のいくつかの局面の例示として意図されるからである。実際、
本明細書中に示されかつ記載されるものに加えて本発明の種々の改変は、先の記
載から当業者に明らかになる。このような改変はまた、添付の特許請求の範囲の
範囲内にあることが意図される。
【０２０９】 多くの参考文献が本明細書中に引用され、それらの全開示は、本明細書中で、
その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、ヒトｆｌｔ−４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびア
ミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ヒトｆｌｔ−４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびア
ミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、ヒトｆｌｔ−４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびア
ミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｄ】 図１Ｄは、ヒトｆｌｔ−４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびア
ミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｅ】 図１Ｅは、ヒトｆｌｔ−４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびア
ミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｆ】 図１Ｆは、ヒトｆｌｔ−４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびア
ミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】 図２Ａは、抗ｆｌｔ−４抗体染色された前立腺組織切片の写真である。図２Ａ
：正常なリンパ節。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、抗ｆｌｔ−４抗体染色された前立腺組織切片の写真である。図２Ｂ
：良性前立腺過形成組織。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、抗ｆｌｔ−４抗体染色された前立腺組織切片の写真である。図２Ｃ
前立腺転移を有するリンパ節。
【図２Ｄ】 図２Ｄは、抗ｆｌｔ−４抗体染色された前立腺組織切片の写真である。図２Ｄ
：前立腺転移を有するリンパ節。
【図２Ｅ】 図２Ｅは、抗ｆｌｔ−４抗体染色された前立腺組織切片の写真である。図２Ｅ
：良性前立腺過形成組織および前立腺癌。
【図２Ｆ】 図２Ｆは、抗ｆｌｔ−４抗体染色された前立腺組織切片の写真である。２Ｆ：
前立腺癌。
【図３Ａ】 図３Ａは、抗ｆｌｔ−４抗体で染色されたヒト前立腺癌細胞株の写真である。
図３Ａ：ＬＮＣａ細胞株。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、抗ｆｌｔ−４抗体で染色されたヒト前立腺癌細胞株の写真である。
図３Ｂ：ＰＣ３細胞株。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、抗ｆｌｔ−４抗体で染色されたヒト前立腺癌細胞株の写真である。
図３Ｃ：ＤＵ１４５。
【図３Ｄ】 図３Ｄは、抗ｆｌｔ−４抗体で染色されたヒト前立腺癌細胞株の写真である。
図３Ｄ：ＴＳＵＰｒｌ細胞株。
【図４】 図４は、いくつかのヒト前立腺癌細胞株において、それぞれ、ＶＥＧＦ、ＶＥ
ＧＦ−Ｃならびにそれらのレセプターであるｆｌｋ−１およびｆｌｔ−４の発現
について、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）試験の結果を
示すアガロースゲルの写真である。
【図５】 図５は、抗ｆｌｔ−４抗体を用いてｆｌｔ−４発現が生のＬＮＣａＰ細胞の表
面において検出され得ることを示すグラフである。
【図６】 図６は、ヒト前立腺癌細胞株のアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の結果を
示すヒストグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ ４Ｃ０８７ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/04 Ａ６１Ｐ 35/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/543 ５９７ 33/543 ５９７ 33/574 Ａ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 DA20 DA78 FB03 FB12 GC15 4B063 QA01 QA19 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 BA41 BA44 CA17 CA53 CA59 DC32 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA32 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA44 MA52 MA56 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZB262 ZC422 4C085 AA14 AA15 AA16 AA19 AA26 BB11 BB41 BB43 BB44 CC02 CC03 CC04 CC05 CC22 CC32 DD62 DD63 DD86 DD88 EE01 EE06 FF02 FF03 FF13 FF17 FF20 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA32 MA35 MA36 MA37 MA41 MA44 MA52 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZB26 ZC42 4C087 BB65 BC83 CA12 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA32 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA44 MA52 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZB26 ZC42

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 転移性の可能性の検出のための方法であって、該方法は、以
    下の工程： 前立腺細胞におけるｆｌｔ−４の発現を検出する工程であって、該ｆｌｔ−４
    の発現は、該細胞が転移性の可能性を有することを示す、工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 転移性の可能性の検出のための方法であって、該方法は以下
    の工程： 被検体から得られた体液サンプルにおける前立腺細胞を同定する工程、および 該細胞においてｆｌｔ−４の発現を検出する工程であって、該ｆｌｔ−４の発
    現は、該細胞が前立腺癌細胞であることを示し、該前立腺癌細胞は、転移性の可
    能性を有するか、または二次性前立腺腫瘍転移性であるか、あるいはそれらに由
    来する、工程、 を包含する、方法。
  3. 【請求項３】 前記前立腺細胞は、前立腺細胞特異的マーカーに結合する抗
    体またはその部分を用いることによって同定される、請求項１または２に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】 前記前立腺特異的マーカーは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）
    、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ）、前立腺
    酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ヒト腺カリクレイン２（ＨＫ−２）、前立腺幹細
    胞抗原（ＰＳＣＡ）およびＰＴＩ−１からなる群より選択される、請求項３に記
    載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ｆｌｔ−４発現は、ｆｌｔ−４に結合する抗体またはそ
    の一部を用いて検出される、請求項１または２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ｆｌｔ−４発現は、核酸分子を用いて検出され、該核酸
    分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に相補的な、少なくとも６つの
    連続するヌクレオチドの配列からなるヌクレオチド配列を含む、請求項１または
    ２に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記体液は、血液、尿または精液である、請求項２に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 前記前立腺細胞を検出する工程、および前記ｆｌｔ−４発現
    を検出する工程は、同時に行われる、請求項２に記載の方法。
  9. 【請求項９】 任意の免疫蛍光アッセイが使用される、請求項８に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 前記免疫蛍光アッセイは、フローサイトメトリーまたはレ
    ーザ走査サイトメーターを使用する、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 被検体において転移性前立腺癌を診断するための方法であ
    って、該方法は以下の工程： 該被検体から得られた体液サンプル中の前立腺細胞を同定する工程、および 該前立腺細胞においてｆｌｔ−４の発現を検出する工程であって、前立腺細胞
    における該ｆｌｔ−４の発現は、該被検体が転移性前立腺癌を有することを示す
    、工程、 を包含する、方法。
  12. 【請求項１２】 前立腺癌を有する被検体の予後を決定するための方法であ
    って、該方法は以下の工程： 前立腺癌を有する被検体から得られた体液サンプル中の前立腺細胞を同定する
    工程、および 該前立腺細胞においてｆｌｔ−４の発現を検出する工程であって、該細胞にお
    けるｆｌｔ−４の発現は、該被検体が、前立腺細胞がｆｌｔ−４の発現も活性も
    検出されない第二の被検体に比べてより悪い予後を有することを示す、工程、 を包含する、方法。
  13. 【請求項１３】 二次的前立腺腫瘍転移を処置、妨害または予防する方法で
    あって、該方法は以下の工程： そのような処置、妨害または予防が所望される被検体に治療有効量の分子を被
    検体に投与する工程であって、該化合物は、ｆｌｔ−４発現または活性を阻害す
    る、工程、 を包含する、方法。
  14. 【請求項１４】 前記分子は、ｆｌｔ−４のフラグメントを含むタンパク質
    であって、該フラグメントは、少なくとも配列番号２に示されるアミノ酸配列か
    らなり、該タンパク質は、そのリガンドＶＥＧＦ−Ｃに結合するｆｌｔ−４の競
    合インヒビターとして作用する、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記タンパク質が可溶性である、請求項１４に記載の方法
    。
  16. 【請求項１６】 前記分子は、ｆｌｔ−４のフラグメントをコードするヌク
    レオチド配列を含む核酸分子であり、該フラグメントは、そのリガンドＶＥＧＦ
    −Ｃに結合するｆｌｔ−４の競合インヒビターとして作用する、請求項１３に記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に相
    補的な、少なくとも６つの連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含
    むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配
    列５’−ＧＧＣＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＡＴ−３’（配列番号３）を含む、請求項
    １７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記分子は、ｆｌｔ−４に結合する抗体またはその一部で
    ある、請求項１３に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 二次前立腺腫瘍転移を処置、妨害または予防する分子につ
    いてスクリーニングするための方法であって、該方法は以下の工程： ｆｌｔ−４を発現する前立腺細胞に、候補分子を接触させる工程、および そのように接触された該細胞におけるｆｌｔ−４発現のレベルを、そのように
    は接触されていないｆｌｔ−４を発現する前立腺細胞と比較する工程であって、
    該非接触細胞と比較して、該接触された細胞においてより低いレベルのｆｌｔ−
    ４発現は、該候補分子が二次前立腺腫瘍転移を処置、妨害または予防するにおい
    て活性を有することを示す、工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 二次前立腺腫瘍転移を処置、妨害または予防する分子につ
    いてスクリーニングするための方法であって、該方法は以下の工程： 候補分子の存在下でｆｌｔ−４とＶＥＧＦ−Ｃとから形成される複合体のレベ
    ルを、該複合体の形成が実施される条件下で測定する工程；および 該分子の非存在下で形成される該複合体のレベルを比較する工程であって、該
    分子の存在下における該複合体のより低いレベルは、該候補分子が二次前立腺腫
    瘍転移を処置、阻害または予防するにおいて活性を有することを示す、工程、 を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】 二次前立腺腫瘍転移を処置、妨害または予防する分子につ
    いてスクリーニングするための方法であって、該方法は以下の工程： 候補分子の存在下でｆｌｔ−４とＶＥＧＦ−Ｄとから形成される複合体のレベ
    ルを、該複合体の形成が実施される条件下で測定する工程；および 該分子の非存在下で形成される該複合体のレベルを比較する工程であって、該
    分子の存在下における該複合体のより低いレベルは、該候補分子が二次前立腺腫
    瘍転移を処置、阻害または予防するにおいて活性を有することを示す、工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 転移性前立腺癌を処置または妨害する方法の効力をモニターする方法であって、
    該方法は以下の工程： 被検体から得られた前立腺細胞におけるｆｌｔ−４の発現または活性のレベル
    を測定する工程であって、該サンプルは、該方法の適用の後に該被検体から得ら
    れ、そして （ａ）該方法の適用前に該被検体から得られたサンプルにおける該レベル、ま
    たは （ｂ）転移性前立腺癌の前処置段階に関連する標準的なレベル、 と比較し、ここで、該方法の適用前に取られた該サンプルにおけるｆｌｔ−４の
    発現もしくは活性のレベルまたは該標準的なレベルと比較して、該方法の適用後
    にとられた該サンプルにおけるｆｌｔ−４の発現または活性のレベルにおける減
    少は、該方法が有効であることを示す、工程、 を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 タンパク質および薬学的に需要可能なキャリアを含む薬学
    的組成物であって、該タンパク質は、ｆｌｔ−４のフラグメントを含み、該フラ
    グメントは、少なくとも配列番号２において示されるアミノ酸配列からなり、該
    タンパク質は、そのリガンドＶＥＧＦ−Ｃに結合するｆｌｔ−４の競合的インヒ
    ビターとして作用する、薬学的組成物。
  25. 【請求項２５】 前記タンパク質が可溶性である、請求項２４に記載の組成
    物。
  26. 【請求項２６】 核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成
    物であって、該核酸は、ｆｌｔ−４のフラグメントをコードするヌクレオチド配
    列を含み、該フラグメントは、そのリガンドＶＥＧＦ−Ｃへのｆｌｔ−４結合の
    競合的インヒビターとして作用する、薬学的組成物。
  27. 【請求項２７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能
    なキャリアを含む薬学的組成物であって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１
    に示されるヌクレオチド配列に相補的な少なくとも６つの連続するヌクレオチド
    からなるヌクレオチド配列を含む、薬学的組成物。
  28. 【請求項２８】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配
    列５’−ＧＧＣＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＡＴ−３’（配列番号３）を含む、請求項
    ２７に記載の組成物。
  29. 【請求項２９】 ｆｌｔ−４に結合する抗体またはその一部および薬学的に
    受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
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