JP2002502237A

JP2002502237A - 核酸分子の生成および精製のための方法

Info

Publication number: JP2002502237A
Application number: JP54938098A
Authority: JP
Inventors: イー．グルーバー，クリスチャン; エイ．ジェシー，ジョエル
Original assignee: ライフテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-05-12
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 2002-01-22
Also published as: WO1998051699A1; CA2287525A1; EP0981535A1; EP0981535A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸分子の生成および単離のための方法に関する。特に、本発明は、mRNA分子の単離、ならびに１本鎖および２本鎖であり得る核酸分子（例えば、cDNA分子またはライブラリー）の生成および単離に関する。さらに、本発明は、分子の集団を含み得るサンプルからの、目的の特定の核酸分子の選択および単離に関する。詳細には、本発明は、アフィニティー標識されたプライマー−アダプター分子に関し、これはこのような核酸分子の改善された単離および生成を可能にし、産物回収および単離のスピードの両方を増加する。

Description

【発明の詳細な説明】核酸分子の生成および精製のための方法発明の分野本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野にある。本発明は特に、核酸分子の生成および単離にために有用な方法に関する。特に、本発明は、mRNA分子の単離、ならびにcDNAライブラリー（１本鎖および２本鎖）の生成および単離に関する。さらに、本発明は、分子の集団を含み得るサンプルからの、目的の特定の核酸分子の選択および単離に関する。具体的には、本発明は、このような核酸分子の改善された単離および生成を可能にする、アフィニティー標識されたプライマーアダプター分子の使用に関し、産物回収および単離のスピードの両方を増加させる。発明の背景 cDNAおよびcDNAライブラリー生物体、組織、または細胞の構造および生理学を試験することにおいて、その遺伝子成分を決定することが、しばしば所望される。生物体の遺伝子のフレームワークは、生物体の体細胞および生殖細胞において含まれるデオキシリボ核酸（ DNA）中のヌクレオチド塩基の２本鎖配列においてコードされる。DNAの特定のセグメントの遺伝子の成分、あるいは遺伝子は、遺伝子がコードするタンパク質生成の際に、明らかにされるのみである。タンパク質を生成するために、DNA二重らせんの一方の鎖の相補的なコピー（「コード」鎖）は、ポリメラーゼ酵素によって生成され、リボ核酸（RNA）の特定の配列を生じる。この特定のタイプのRNA は、タンパク質の生成のためのDNAからの遺伝子メッセージを含むので、メッセンジャーRNA（mRNA）と呼ばれる。所定の細胞、組織、または生物体内に、無数のmRNA種が存在し、それぞれは、別個のおよび特定のタンパク質をコードする。この事実は、組織または細胞における遺伝子発現を研究することに興味がある研究者に、強力な道具を提供する-- mRNA分子は、種々の分子生物学的技術によって、単離され得、そしてさらに操作され得、それによって、細胞、組織、または生物体の完全に機能的な遺伝子成分の解明を可能にする。遺伝子発現の研究に対する１つの共通のアプローチは、相補性DNA（cDNA）クローンの生成である。この技術において、生物体からのmRNA分子は、生物体の細胞または組織の抽出物から単離される。この単離は、しばしば、固体クロマトグラフィーマトリクス（例えば、セルロースまたはセファロース）を用い、これに対してチミジン（T）のオリゴマーが複合体化されている。全ての真核生物mRNA 分子における３'末端は、アデノシン（A）塩基の列を含み、そしてAはTに結合するので、mRNA分子は、組織または細胞抽出物中の他の分子および物質から迅速に精製され得る。これらの精製されたmRNA分子から、cDNAコピーが、逆転写酵素（ RT）活性を有する酵素を使用して作製され得、mRNA鋳型の全てまたは一部に相補的な１本鎖cDNA分子の生成を生じる。適切な条件下で１本鎖cDNAをインキュベートすることは、２本鎖DNAの合成を可能にし、これは次いで、プラスミドまたはベクターに挿入され得る。この全体のプロセス、mRNAの単離から、プラスミドまたはベクターにcDNAを挿入して、単離された遺伝子を含有する宿主細胞集団の増殖までは、「cDNAクローニング」と呼ばれる。cDNAが多くの異なるmRNAから調製される場合、得られるcD NAのセットは、「cDNAライブラリー」と呼ばれ、供給源の細胞、組織、または生物体に存在する機能的な遺伝情報（遺伝子）の異なる集団を示すので、適切な用語である。これらのcDNAライブラリーの遺伝子型解析は、それらが由来する生物体の構造および機能に対する多くの情報を得ることができる。伝統的な生成法において、cDNA分子は、サイズ分画されなくてはならず、そして複数のフェノール／クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿が行われなくてはならない。これらの要件のそれぞれは、複数の抽出／沈殿に起因するサンプル欠損およびcDNA収量における制限のような固有の不利益を有する（Lambert，K.N .およびWilliamson，V.M.、Nucl.Acids Res．21（3）：775-776（1993））。これらの不利益は、文献において、部分的に取り組まれてきた。例えば、幾人かの研究者らは、オリゴ（dT）と結合されたラテックスまたは常磁性ビーズにmR NAを結合することによる、細胞および組識サンプルからのポリA+ mRNAの単離のための方法を報告し；次いで、１本鎖cDNA分子は、これらの固定されたRNA分子の逆転写によって生成され得る（Lambert，K.N.およびWilliamson，V.M.、Nucl ．Acids Res．21（3）：775-776（1993）；Kuribayashi-Ohta，K.ら、Biochim． Biophys．Acta 1156：204-212（1993）；Sasaki，Y.F.ら、Nucl.Acids Res．22 （3）:413-419（1996）；Fellman，F.ら、BioTechniques 21（5）:766−770（19 96））。このような固相合成法は、伝統的な方法の抽出／沈殿工程から生じる収量制限をほとんど受けない。しかし、これらの方法はなお、いくつかの重要な制限を有する。例えば、これらの方法のそれぞれは、cDNA分子のクローニングの前のPCR増幅に依存し、しばしば、偏りのあるcDNAライブラリーを生じる（すなわち、高度に発現される配列は、より低い量で発現される配列よりも優勢である）。さらに、これらの方法は、しばしば、鋳型に対するプライマー−アダプターの溶液ハイブリダイゼーションを使用する従来のcDNA合成よりも効率的でない（すなわち、ハイブリダイゼーション比率の増加のために回転拡散が必要とされる；Schmitz，K.S.およびSchur r，J.M.、J．Phys．Chem．76:534-545（1972）；Ness，J.V.およびHahn，W.E.、 Nucl.Acids Res．10（24）:8061-8077（1982））。最後に、上記の技術は、さらなるプロセシングのために、固相から新生のcDNA分子を遊離させるために熱変性または化学的な変性を使用し、これは、産物の欠損および／または損傷を生じ得る。従って、少量のRNA（全RNAまたはポリA+ mRNA）からの核酸分子の迅速で、高収量の合成、単離、および操作を提供する方法についての必要性が、当該分野において存在する。本発明は、このような方法を提供する。発明の要旨本発明は、少量の投入量核酸分子からの、核酸分子（１本鎖および２本鎖）の生成および単離のために有用な方法に関する。より詳細には、本発明は、リガンドが結合されたプライマー−アダプター分子を使用することによる、RNA鋳型（例えば、１本鎖mRNAまたはポリA+ RNA）からの、cDNA分子（１本鎖および２本鎖）の生成のための方法を提供する。このようなプライマー−アダプター分子はまた、RNA含有サンプルからmRNAまたはポリA+ RNA分子を単離するために、本発明に従って使用され得る。具体的には、本発明は、核酸分子を生成するための方法に関し、核酸鋳型、好ましくはmRNAまたはポリA+ RNA分子と、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチドならびにプライマーアダプター核酸分子とを、混合する工程を包含し、ここでプライマー−アダプター核酸分子は、１つ以上のリガンド分子および１つ以上の切断部位（好ましくは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位またはエンドヌクレアーゼ切断部位）を含有する。このプライマー−アダプターは、鋳型の任意の部分にハイブリダイズするように設計され得る。適切な条件下でのインキュベーションの際に、鋳型の全てまたは一部に相補的な第１の核酸分子（例えば、１本鎖cDNA）が、作製される。この第１の核酸分子は、第１の核酸分子および／または第１の核酸分子にハイブリダイズされる任意の核酸分子の単離を容易にするプライマー−アダプターを含む（好ましくは、その末端で、またはその末端近くで）。従って、第１の核酸分子（例えば、１本鎖cDNA）が、第２の核酸分子を作製するための鋳型として作用する場合（例えば、２本鎖cDNAのような２本鎖分子を形成する）、２本鎖分子は、分子中に含まれるプライマー− アダプター分子を使用して単離され得る。同様に、第１の核酸分子の合成の間に形成された鋳型−第１の核酸のハイブリッドが、単離され得る。所望される場合、プライマー−アダプターは、核酸合成の間の任意の工程または複数の工程で含まれ得る。例えば、プライマー−アダプター分子は、第１、第２、第３、第４などの合成工程の間に添加され得るか（第１の合成工程は、鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を作製する）、または複数のもしくは全ての合成工程において添加され得る。プライマー−アダプター分子を用いる複数の合成は、１つよりも多いプライマー−アダプターを有する合成された核酸分子を生じ得る。 RNAを含有するサンプルから、mRNAまたはポリA+ RNAを単離するために、１つ以上のmRNAまたはポリA+ RNA特異的プライマー−アダプターが使用される。このようなプライマー−アダプターは、mRNAおよび／またはポリA+ RNAにハイブリダイズして、プライマー−アダプター／ポリA+ RNAのハイブリッドを形成する。次いで、プライマー−アダプターは、サンプルからのmRNAおよび／またはポリA+ R NAの単離を容易にし得る。本発明のこの局面は、プライマー−アダプターが、目的の分子にハイブリダイズし、そして変性によって除去され得るので、プライマー−アダプターにおける切断部位は必要とされない。本発明のプライマー−アダプター分子はまた、特異的な核酸配列を単離するために使用され得る。目的の１つ以上の配列にハイブリダイズし得る１つ以上の標的特異的プライマー−アダプターを使用することによって、本発明は、核酸分子の集団からの特異的な核酸分子（例えば、遺伝子またはその部分）の選択および単離を可能にする。本発明によれば、２つ以上のこのような標的特異的プライマー−アダプター（それぞれ、異なる配列に指向される）の使用は、目的の１つよりも多い異なる配列の選択を可能にする。あるいは、目的の配列の異なる部分に指向される２つよりも多い標的特異的プライマー−アダプターは、バックグラウンド混入を減少することによって、このような配列の選択を容易にする。本発明のこの局面において、標的特異的プライマー−アダプターは、所望の分子にハイブリダイズし、そして変性によって除去され得るので、標的特異的プライマー− アダプターにおける切断部位は、必要とされない。本発明によれば、プライマー−アダプター分子は、プライマー−アダプターのリガンド部分に依存することによって、このようなプライマー−アダプターを含有する分子の単離を容易にする。プライマー−アダプターが、核酸分子に結合される（ハイブリダイズされるまたは合成の間に取込まれる）後、プライマー−アダプターのリガンド部分は、プライマー−アダプターを含有する分子の選択的な単離を可能にする。このような単離は、リガンド−ハプテン相互作用によって達成され得、ここでは、ハプテンは、例えば、固体支持体に結合される。いったん固体支持体に結合されると、目的の分子（プライマー−アダプターを含有する核酸分子）は、混入する核酸およびタンパク質から、溶液、好ましくは、緩衝液または水で支持体マトリクスを洗浄することによって、分離され得る。次いで、プライマー−アダプター内の１つ以上の切断部位の切断は、固体支持体からの目的の核酸分子の回収を、リガンドが固体支持体のハプテンに結合されたままで可能にする。あるいは、プライマー−アダプターが、目的の核酸分子にハイブリダイズされる場合、単離は、所望の分子からのプライマー−アダプターの変性によって、および／またはプライマー−アダプター分子内の切断部位の切断によって、達成され得る。本発明における使用のために好ましい固体支持体としては、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、またはマイクロタイタープレート、および最も好ましくは、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、または超常磁性ビーズが挙げられ、これらはリガンド分子を特異的に認識および結合する１つ以上のハプテン分子を含むが、これらに制限されない。本発明のこの局面に従う特に好ましいハプテン分子としては：（ｉ）アビジンおよびストレプトアビジン；（ii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；（iii）酵素特異的基質：（iv）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和化タンパク質（ENP）；（ｖ）Fe⁺⁺⁺；（vi）トランスフェリンレセプター；（vii）インスリンレセプター；（viii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）レセプター；（ix）CD4；（x）スペクトリンまたはホドリン；（xi）ICAM-IまたはICAM-2 ；（xii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xiii）アンキリン；（x iv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、α₆β₁、α₇β₁、およびα₆β₅；（ xv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xvi）インテグリンα₃β₁、α₄β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁、α_IIbβ₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆ ；（xvii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃；（xviii）ビトロネクチン；（xix ）フィブロネクチン；（xx）コラーゲン；（xxi）ラミニン；（xxii）グリコホリン；（xxiii）Mac-1；（xxiv）LFA-1；（xxv）βアクチン；（xxvi）gp120；（xxvii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）：（xxviii）インスリン；（xxix）フェロトランスフェリン；（xxx）アポトランスフェリン；（xxxi）リポ多糖；（xxxii）酵素；（xxxiii）抗体；ならびに（xxxiv）ビオチンが挙げられるが、これらに制限されない。上記のハプテン分子に順に対応する、本発明に従う使用のために特に好ましいリガンド分子としては：（ｉ）ビオチン；（ii）抗体；（iii）酵素；（iv）リポ多糖；（ｖ）アポトランスフェリン；（vi）フェロトランスフェリン；（vii ）インスリン；（viii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）；（ix）gp120；（ｘ）β-アクチン；（xi）LFA-1；（xii）Ma c-1；（xiii）グリコホリン；（xiv）ラミニン；（xv）コラーゲン；（xvi）フィブロネクチン；（xvii）ビトロネクチン；（xviii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃；（xix）インテグリンα₃β₁、α₄β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁、α_I _Ib β₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆；（xx）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xxi）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、α₆β₁、α₇β₁ 、およびα₆β₅；（xxii）アンキリン；（xxiii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xxiv）ICAM-1またはICAM-2；（xxv）スペクリンまたはホドリン；（xxvi）CD4；（xxvii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）のレセプター；（xxviii）インスリンレセプター；（xxix）トランスフェリンレセプター；（xxx）Fe⁺⁺⁺；（xxxi）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和化タンパク質（ENP）；（xxxii）酵素特異的基質；（xxxiii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；ならびに（xxxiv）アビジンおよびストレプトアビジンが挙げられるが、これらに制限されない。従って、本発明は、核酸分子を作製するための方法に関し、以下（ａ）ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチドと、核酸鋳型ならびに本発明のプライマー−アダプターとを、混合する工程；ならびに（ｂ）プライマー−アダプターを含有する（好ましくは、その５'もしくは３' 末端で、またはその末端近くで）、ならびに鋳型の全ておよび一部に相補的である第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程を包含する。DNAポリメラーゼが、本発明に従って使用される場合、プライマー−アダプターは、３'末端で、または３'末端近くに位置され得、一方、逆転写酵素が使用される場合、プライマー−アダプターは、合成される核酸分子の５ '末端で、または５'末端近くに位置され得る。本発明によれば、第１の核酸分子は、第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第２の核酸分子を作製するために、鋳型として使用され得る。この合成において、プライマー−アダプターが使用される場合、各末端で、またはその末端近くで、プライマー−アダプターを含む２本鎖核酸分子が生成されるが、分子の異なる鎖においてである。しかし、プライマー−アダプターは、この第２の合成から除外され得、それによって、一方の末端でプライマー−アダプターを有する２本鎖核酸分子が提供される。所望される場合、本発明のプライマー−アダプターは、核酸分子を増幅するための方法において使用され得る。このような方法は、以下（ａ）ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチドと、核酸鋳型ならびに２っ以上のプライマー−アダプターとを、接触させる工程；ならびに（ｂ）鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程を包含する。このような増幅方法は、具体的に、以下（ａ）増幅される２本鎖核酸分子と、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチド、２本鎖分子の第１の鎖の部分に相補的な第１のプライマー−アダプター、ならびに２本鎖分子の第２の鎖の部分に相補的な第２のプライマー−アダプターとを、接触させる工程；（ｂ）第１のプライマーアダプターを含有し、および第１の鎖の全てまたは一部に相補的である第３の鎖の核酸分子、ならびに第２のプライマー−アダプターを含有し、および第２の鎖の全てまたは一部に相補的である第４の鎖の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程；（ｃ）第２の鎖と第４の鎖とを、および第１の鎖と第３の鎖とを変性させて、１本鎖核酸分子を形成する工程；ならびに（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の工程を、１回以上反復する工程、を包含する。本発明のこの局面において、第１のプライマー−アダプターまたは第２のプライマーアダプターは、核酸分子の合成を開始するための任意のオリゴヌクレオチドプライマーで置きかえられ得る。本発明の好ましい実施態様において、RNA（例えば、mRNAまたはポリA+ RNA）は、DNA合成のための鋳型として使用される。この好ましい方法は、RNA鋳型と、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、およびプライマーとを、混合する工程、ならびにRNA鋳型の全てまたは一部に相補的なDNA（例えば、cDNA）分子を作製するために十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程、を包含する。次いで、合成されたDNA分子は、さらなるDNA合成またはDNA増幅のための鋳型として、使用され得る。本発明のこの局面によれば、cDNAライブラリーは、 RNA分子（例えば、細胞または組織から単離されたRNA）の集団を使用する場合、生成され得る。本発明に従ってmRNAまたはポリA+ RNAを単離するために、方法は、具体的に、以下：（ａ）mRNAおよび/またはポリA+ RNAを含有する（または含有すると思われる）サンプルを得る工程；（ｂ）サンプルと、mRNAおよび/またはポリA+ RNAに選択的に結合し得る１つ以上のプライマーアダプターとを、接触させる工程；ならびに（ｃ）サンプルからmRNAおよび/またはポリA+ RNAを単離する工程、を包含し得る。特定のまたは所望の核酸分子を単離するために、本発明は、具体的に、以下：（ａ）１つ以上の所望の核酸分子を含有する（または含有すると思われる）サンプルを得る工程；（ｂ）サンプルと、１つ以上の所望の核酸分子に選択的に結合し得る１つ以上のプライマー−アダプターとを接触させる工程；および（ｃ）サンプルから所望の核酸分子を単離する工程、を包含する。好ましい局面において、所望の分子を含有するサンプルは、２本鎖または１本鎖cDNA分子の集団である。従って、本発明は、１つ以上の所望の核酸分子を単離する方法であって、以下：（ａ）１つ以上の所望のcDNA分子を含有する（または含有すると思われる）cD NA分子の集団を含有するサンプルを得る工程；（ｂ）サンプルと、１つ以上の所望のcDNA分子に特異的に結合し得る、１つ以上の標的特異的プライマー−アダプターとを、接触させる工程；および（ｃ）サンプルから所望のcDNA分子を単離する工程、を包含する方法に関する。本発明によれば、標的特異的プライマー−アダプターは、cDNA分子がRNA鋳型から合成される後の、特定のcDNA分子の選択において使用され得る（RNA/cDNA２本鎖分子に結合するか、またはRNA鎖の除去後に、１本鎖cDNA分子に結合する）。あるいは、標的特異的プライマー−アダプターは、２本鎖cDNA分子を結合するために使用され得る。このような標的特異的プライマー−アダプターはまた、増幅される核酸分子の集団から、１つ以上の所望の分子を選択するために、本発明に従って使用され得る。本発明はまた、本発明に従って生成されるcDNA分子または核酸分子を含有するベクター（発現ベクターを含む）、およびこれらのcDNA分子、核酸分子、またはベクターを含有する宿主細胞に関する。本発明はまた、組換えポリペプチドの発現に有利な条件下でこれらの宿主細胞を培養する工程、およびポリペプチドを単離する工程を包含する、組換えポリペプチドを生成するための方法を提供し、ならびにこれらの方法に従って生成される組換えポリペプチドを提供する。他の好ましい局面において、本発明は、１つ以上の容器（例えば、チューブ、バイアル、ボトル、アンプルなど）をそこに密接な制限で受けるように区画された運搬手段（例えば、ボックス、カートンなど）を備える、核酸分子またはcDNA 分子の生成のためのキットに関し、ここで第１の容器は、１つ以上のリガンド分子（好ましくは、ビオチン）を含有するプライマー−アダプター分子を含み、このプライマー−アダプター分子は、１つ以上の切断部位、好ましくは１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する。本発明はまた、逆転写酵素活性および／またはポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含み得るさらなる容器を備える、このようなキットに関する。本発明によれば、１つよりも多いポリペプチドが、同じまたは異なる容器において含まれ得る。本発明はまた、本発明のプライマー−アダプターのリガンドを特異的に結合し得る１つ以上のハプテンを有する固体支持体を含み得る、さらなる容器を備えるキットに関する。本発明はまた、本発明のプライマー−アダプターにおける切断部位を認識および切断する１つ以上のエンドヌクレアーゼを含み得るさらなる容器を備えるキットに関する。本発明の他の好ましい実施態様は、以下の図面および発明の説明、ならびに請求の範囲を考慮して、当業者に明らかである。図面の簡単な説明図１は、本発明の方法に従う、２本鎖cDNA分子の生成および単離、ならびにプラスミドベクター（pCMVSP0RT）へのそのライゲーションの説明である。「Ｂ」は、ビオチン分子（従って、cDNA分子のビオチン化の部位）を示し、そして「RE 」は、単離後の固相支持体からのcDNAの回収を容易にするために使用される、制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位置を示す。発明の詳細な説明本発明は、高い処理量（high−througout）の様式における、小量のポリA+ RN AまたはmRNAからのcDNAライブラリーの迅速的な生成および単離について特に適する。本発明の好ましい局面において、１本鎖ポリA+ RNAまたはmRNAの集団は、リガンド結合化プライマーアダプター（非特異的または遺伝子特異的）と、溶液中でハイブリダイズされる。本明細書中で使用されるように、用語「プライマー −アダプター」は、鋳型核酸分子（例えば、mRNAまたはポリA+ RNA分子）に特異的に結合（例えば、ハイブリダイズ）し得る核酸分子をいう。本発明の特に好ましい実施態様において、プライマー−アダプターは、鋳型核酸分子の全てまたは部分に相補的な核酸分子の転写、逆転写、重合化、または伸長の開始を可能にする。本発明により、第１鎖および第２鎖のcDNA反応は、好ましくは１つのチューブにおいて行われ、生成される２本鎖cDNAの３'末端、または３'末端近くに、リガンドを導入する。次いで、リガンド結合されたcDNAは、リガンドハプテン相互作用を介してcDNAが結合するハプテンと結合された固体支持体に結合し、それによってcDNAの濃縮、ならびに有機抽出および沈殿を伴わない緩衝液の交換を可能にすることによって単離され得る。続いて、結合されたcDNAは、制限酵素消化によって、固相支持体から解離される。次いで、この非対称性のcDNAは、適切な末端（一方の末端は、cDNAを解離するために使用される制限部位に適合し、および他方の末端は、平滑末端である）を含むベクターに、直接的にクローン化される。ベクターへのクローニングに続いて、またはその前に、特定のcDNA配列（例えば、遺伝子または遺伝子フラグメント）は、本発明の標的特異的プライマー−アダプターを使用して選択的に単離され得る。複数の時間のかかる抽出および沈殿の排除に加えて、本発明の方法は、DNAアダプターについて必要なものおよびcDNA 分画（過剰の連結されないアダプターを除去するために、通常必要な工程）についての必要性を排除する。従って、本発明は、PCR増幅に必要性を伴うことなく、ナノグラム量のポリA+ RNAまたはmRNAから、より多くの量のcDNAの迅速的な生成および単離ならびにcDNAライブラリーの構築を容易にする。本発明はまた、構築されたcDNAライブラリーからの、所望の遺伝子または遺伝子フラグメントの単離を可能にする、単回の選択技術を提供する。核酸鋳型分子の供給源本発明の方法を使用して、核酸分子、および、特に、cDNA分子が、種々の核酸鋳型分子から調製され得る。本発明における使用のために好ましい核酸分子としては、１本鎖または２本鎖のRNAが挙げられる。より好ましい核酸分子としては、ポリアデニル化RNA（ポリA+ RNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、およびリボソームRNA（rRNA）分子が挙げられ、ならびに最も好ましいのは、mRNAおよびポリA+ RNA分子である。本発明の方法による核酸分子またはcDNA分子を調製するために使用される核酸鋳型分子は、当業者に周知の標準的な有機化学合成法に従って、合成的に調製され得る。より好ましくは、核酸鋳型分子は、天然の供給源（例えば、種々の細胞、組織、器官、または生物体）から得られ得る。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原核生物（細菌細胞、これには、Escherichia属、Bachillus属、 Serratia属、Salmonella属、Staphylococcus属、Streptococcus属、Clostridium 属、Chlamydia属、Neisseria属、Treponema属、Mycoplasma属、Bprrelia属、Leg ionella属、Pseudomonas属、Mucobacterium属、Heilicobacter属、Erwinia属、A grobacterium属、Rhizobium属、およびStreptomyzes属の種の細胞を含む）、または真核生物（真菌（特に、酵母）、植物、原生動物、および他の寄生虫、ならびに動物（昆虫（特に、Drosophilla spp.細胞）、線虫（特に、Caenorhabditis ele gans細胞）、および哺乳動物（特に、ヒト細胞）を含む）であり得る。核酸の供給源として使用され得る哺乳動物体細胞としては、血球（網赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または末梢神経系由来）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋からの筋細胞および筋芽細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、および骨芽細胞を含む）、ならびに他の間質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、シュワン細胞）が挙げられる。哺乳動物生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）はまた、上述の体細胞および生殖細胞を生じる前駆体（progenitor）、先駆体（precursor）、および幹細胞であり得るので、本発明における使用のための核酸の供給源として使用され得る。核酸の供給源として使用するために適切なものはまた、哺乳動物の組織または器官である（例えば、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環系、リンパ系、胃腸、および結合組織の供給源由来の組織または器官、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）の胚または胎児に由来する供給源に由来する組織または器官）。任意の上述の原核生物または真核生物の細胞、組織、および器官は、正常であり得るか、罹患され得るか、形質転換され得るか、樹立され得るか、前駆体であり得るか、先駆体であり得るか、胎性であり得るか、または胚であり得る。罹患された細胞は、例えば、感染性疾患（細菌、真菌、もしくは酵母、ウイルス（AI DSを含む）、もしくは寄生虫によって引き起こされる）に関与するか、遺伝的もしくは生化学的病理学（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、もしくは多発性硬化症）に関与するか、またはガン性プロセスに関与する細胞を含み得る。形質転換または樹立された動物細胞株としては、例えば、COS細胞、CHO細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、K562細胞、F9細胞などが挙げられ得る。本発明における使用のための核酸の供給源として適切な他の細胞、細胞株、組織、器官、および生物体は、当業者に明らかである。一旦、開始する細胞、組織、器官、または他のサンプルが得られると、核酸分子（例えば、mRNA）は、当該分野において周知である方法によって、そこから単離され得る（例えば、Maniatis，T.らCell 15:687-701（1978）；Okayama，H．およびBerg，P.、Mol．Cell．Biol．2:161-170（1982）；Gubler，U.およびHoff man，B.J.、Gene 25:263-269（1983）を参照のこと）。考察されるように、本発明は、サンプルからmRNAおよび/またはポリA+ RNAを単離することおける改善を提供する。ポリA+ RNAまたはmRNAを特異的に認識し、そして結合する、本発明のプライマー−アダプターの使用は、このような選択を可能にする。好ましくは、プライマー−アダプターは、mRNAまたはポリA+ RNAのポリAテイルを認識し、そしてこれにハイブリダイズする。このような、プライマー−アダプターとしては、オリゴ（dT）を含有するプライマー−アダプターが挙げられ得る。いったん結合すると、プライマー−アダプターのリガンド部分の使用は、所望のRNA分子の単離を可能にする。次いで、このように単離されるポリA+ RNAまたはmRNA分子は、本発明の方法を使用して、cDNA分子およびcDNAライブラリーを調製するために使用され得る。核酸分子の合成本発明の実施において、１つ以上のリガンド分子を含有する核酸分子、および、特に、cDNA分子またはcDNAライブラリーは、上記のように得られる核酸鋳型（これは、好ましくは、mRNA分子またはポリA+ RNA分子である）と、ポリメラーゼ活性および／または逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドと、本発明の１つ以上のプライマー−アダプターとを混合することによって生成される。投入核酸分子の逆転写および／または重合化に有利な条件下で、鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子の合成が、達成される。本発明において使用される逆転転写酵素および／またはポリメラーゼ活性を有する好ましいポリペプチド（例えば、酵素）としては、モロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（RSV）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス（RAV）逆転写酵素、骨髄芽球症随伴ウイルス（MAV）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Thermus thermophilus（Tth）DNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus（Taq）DNAポリメラーゼ、Thermotoga neopolit ana（Tne）DNAポリメラーゼ、Thermotoga maritima（Tma）DNAポリメラーゼ、Th er mococcus litoralis（TliまたはVENT^TM）DNAポリメラーゼ、Pyrococcus furiosu s（PfuまたはDEEPVENT^TM）DNAポリメラーゼ、Pyrococcus woosii（Pwo）DNAポリメラーゼ、Bacillus sterothermophilus（Bst）DNAポリメラーゼ、Sulfolobus a cidocaldarius（Sac）DNAポリメラーゼ、Thermoplasma acidophilum（Tac）DNA ポリメラーゼ、Thermus flavus（Tfl/Tub）DNAポリメラーゼ、Thermus ruber（T ru）DNAポリメラーゼ、Thermus brockianus（DYNAZYME^TM）DNAポリメラーゼ、Me thanobacterium thermoautotrophicum（Mth）DNAポリメラーゼ、ならびにその変異体、改変体、および誘導体が挙げられるが、これらに制限されない。本発明における使用のために特に好ましいのは、RNase H活性が実質的に減少されるこれらの酵素の改変体である。「RNase H活性が実質的に減少された」酵素によって、野生型のRNase H活性または「RNaseH゛」酵素（例えば、野生型M-MLVまたはAM V逆転写酵素）活性の約20%未満、より好ましくは、約15%、10%、もしくは５%未満、そして最も好ましくは、約２%未満の活性を有する酵素が意味される。任意の酵素のRNase H活性は、例えば、米国特許第5,244,797号において、Kotewicz， M.L.ら、Nucl.Acids Res．16:265（1988）において、およびGerard，G.F.ら、FO CUS14(5):91（1992）（これらの全ての開示は、本明細書中に参考として十分に援用される）において記載されるアッセイのような種々のアッセイによって決定され得る。ハプテン分子が結合する任意のリガンドは、本発明の方法において使用されるリガンド結合プライマー−アダプター分子を形成するために使用され得る。この目的のために適切なリガンドとしては：（ｉ）ビオチン；（ii）抗体；（iii）酵素；（iv）リポ多糖；（ｖ）アポトランスフェリン；（vi）フェロトランスフェリン；（vii）インスリン；（viii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）；（ix）gp120；（ｘ）β-アクチン；（xi）LF A-1；（xii）Mac-1；（xiii）グリコホリン（glycophorin）；（xiv）ラミニン；（xv）コラーゲン；（xvi）フィブロネクチン；（xvii）ビトロネクチン；（x viii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃；（xix）インテグリンα₃β₁、α₄β₁ 、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁、α_IIbβ₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆；（xx）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xxi）インテグリンα₁β₁、α₂ β₁、α₃β₁、 α₆β₁、α₇β₁、およびα₆β₅；（xxii）アンキリン；（xxiii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xxiv）ICAM-1またはICAM-2；（xxv）スペクリンまたはホドリン；（xxvi）CD4；（xxvii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）レセプター；（xxviii）インスリンレセプター；（xxix）トランスフェリンレセプター；（xxx）Fe⁺⁺⁺；（xxxi）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和タンパク質（ENP）；（xxxxii）酵素特異的基質；（xxxiii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；ならびに（xxxiv）アビジンおよびストレプトアビジンが挙げられるが、これらに制限されない。本発明の方法における使用のために最も好ましいのは、ビオチンである。リガンド結合プライマー−アダプター核酸分子は、１つ以上のリガンド分子がプライマー−アダプター分子の１つ以上のヌクレオチドに付着され（好ましくは、共有結合的に）（例えば、図１を参照のこと）、当業者に周知の従来の有機合成法を使用して、生成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、最初に５'アミノ（NH₂）基を生成し、次いでCab-NHSエステルを付加することによって、５'末端でビオチン化され得る（Langer，P.R.ら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA 78:6633（1981））。本発明の特に好ましい局面において、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、または４つ以上のリガンド分子、最も好ましくはビオチン分子を含有するプライマー−アダプター分子が、調製される。リガンド分子に加えて、プライマー−アダプター分子はまた、好ましくは、１つ以上のエンドヌクレアーゼ切断部位、好ましくは制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。これらの部位は、ハプテン結合化固体支持体からの、プライマー− アダプターを含有する新規に合成される核酸分子の解離を容易にする。本発明に従って使用され得るエンドヌクレアーゼの例としては、GeneIIが挙げられるが、これに制限されない。本発明に従って使用され得る制限エンドヌクレアーゼの例としては、AluI、Eco47III、EcoRV、FspI、HpaI、MscI、NruI、PvuII、RsaI、Sc aI、SmaI、SspI、StuI、ThaI、AvaI、BamHI、BanII、BglII、ClaI、EcoRI、Hind III、HpaII、KpnI、MseI、NcoI、NdeI、NotI、PstI、PvuI、SacI/SstI、SalI、X baI、XhoI、およびI-CeuIが挙げられるが、これらに制限されない。プライマー−アダプター分子中に操作される制限エンドヌクレアーゼ部位は、好ましくは、平滑末端または突出末端のいずれかを生じるように選択される。その認識部位が本発明のプライマー−アダプター分子中に操作され得る、平滑末端制限酵素の例としては、AluI、Eco47III、EcoRV、FspI、HpaI、MscI、NruI、Pvu II、RsaI、ScaI、SmaI、SspI、StuI、およびThaIが挙げられるが、これらに制限されない。その認識部位が本発明のプライマー−アダプター分子中に操作され得る、突出末端酵素の例としては、AvaI、BamHI、BanII、BglII、ClaI、EcoRI、HindIII、H paII、KpnI、MseI、NcoI、NdeI、NotI、PstI、PvuI、SacI/SstI、Sall，Xba、Xh oI、およびI-CeuIが挙げられるが、これらに制限されない。本発明の特に好ましい局面において、プライマーアダプター分子は、まれな切断制限エンドヌクレアーゼ（例えば、８個以上の塩基を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、８塩基対カッターなど））によって認識される部位を含むように操作される。このような制限部位としては、NotI制限部位、I-CeuI制限部位、PI -PspI制限部位、およびI-PpoI制限部位、PI-TliI制限部位、およびPI-FceI制限部位が挙げられ得る。上記の制限酵素、および本発明の方法において等しく使用され得る他の制限酵素は、例えば、Life Technologies，Inc．（Rockville、MD ）から市販されている。制限酵素およびそれらの切断部位の他の例について、Ro berts，R.J.、Nucl.Acids Res.17（補遺）:r347-r387（1989）もまた参照のこと。一旦、リガンド結合化プライマー−アダプター分子が得られると、これは、多数の任意の周知の技術を使用して、投入した核酸から核酸分子を生成するために使用される。このような合成技術としては、核酸鋳型へのプライマー−アダプターのハイブリダイゼーション、および鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を作製するためのプライマー−アダプターの伸長が挙げられる。このような合成は、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ddNTP）、またはそれらの誘導体）、ならびにポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドの存在下で、達成される。本発明のプライマー−アダプターは、周知の技術を使用して、任意の核酸合成反応（cDNA合成を含む）、核酸増幅、および核酸配列決定において使用され得る。cDNAの合成のために、本発明のプライマー−アダプター分子は、cDNA分子もしくはcDNAライブラリーを生成するために、以下の実施例１に記載されるようなcDNA合成の方法、または当該分野において周知の他の方法（例えば、Gubler，U.およびHoffman，B.J.、Gene 25:263-269（1983）；Krug， M.S.およびBerger，S.L.、Meth．Enzymol．152:316-325（1987）；Sambrook，J. ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor、N Y：Cold Spring Harbor Laboratory Press、8.60〜8.63頁（1987））と組合わせて使用され得る。あるいは、本発明のプライマー−アダプター分子は、本発明に従う、cDNAの単一チューブ合成において使用され得る。このアプローチにおいて、投入核酸分子（好ましくは、mRNAまたはポリA+ RNA分子）は、本発明のプライマー−アダプター分子と、溶液中でハイブリダイズされ、ハイブリダイズされた複合体は、cDNA 合成に必要なdNTPおよび補因子の存在下、逆転写酵素活性を有するポリペプチド（例えば、酵素）（これは、好ましくは、上記の任意のポリペプチドである）と接触される。第１の鎖の合成後、次いで、第２のcDNA鎖が、改変されたGulber-H offman反応（D'Alessio，J.M.ら、Focus 9:1（1987））によって、同じ反応容器中で合成され得る。本発明の方法が有利に使用され得るcDNA合成の他の技術は、当業者に容易に明らかである。核酸分子の単離本発明の方法に従って、１つ以上のプライマー−アダプターを含有する１本鎖および２本鎖の核酸分子（例えば、cDNA分子またはcDNAライブラリー）が、生成される。次いで、このような核酸分子またはライブラリーは、リガンドを結合する１つ以上のハプテン分子を含有する固体支持体に、核酸分子を結合することによって、溶液から迅速的に単離され得る。本発明の実施において、リガンド特異的ハプテン分子が結合され得る任意の固体支持体が使用され得る。好ましいこのような固相支持体としては、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ビーズ、およびマイクロタイタープレートが挙げられるが、これらに制限されない。好ましいものは、ガラス、ラテックス、または磁性材料から作製されるビーズであり、そして特に好ましいものは、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、または超常磁性ビーズである。固体支持体へのハプテン分子の結合は、当業者に周知の共有結合、疎水性結合、またはイオン結合のようなハプテン結合の任意の方法（コーティングを含む）によって達成され得る。本発明により、プライマー−アダプター分子に結合される（それゆえ、本発明の方法によって生成される核酸分子中に含まれる）リガンド分子を結合する能力を有する任意のハプテン分子が、使用され得る。本発明における使用のために特に好ましいハプテン分子（これは、上述で列挙されるリガンド分子に順に対応する）としては、：（ｉ）アビジンおよびストレプトアビジン；（ii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；（iii）酵素特異的基質；（iv）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和タンパク質（EN P）；（ｖ）Fe⁺⁺⁺；（vi）トランスフェリンレセプター；（vii）インスリンレセプター；（viii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）のレセプター；（ix）CD4；（x）スペクトリンまたはホドリン；（xi）ICAM-IまたはICAM-2；（xii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xiii）アンキリン；（xiv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、 α₆β₁、α₇β₁、およびα₆β₅；（xv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xvi）インテグリンα₃β₁、α₄β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁ 、α_IIbβ₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆；（xvii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃ ；（xviii）ビトロネクチン；（xix）フィブロネクチン；（xx）コラーゲン；（ xxi）ラミニン；（xxii）グリコホリン；（xxiii）Mac-1；（xxiv）LFA-1；（xx v）β-アクチン；（xxvi）gp120；（xxvii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）；（xxviii）インスリン；（xxix）フェロトランスフェリン；（xxx）アポトランスフェリン；（xxxi）リポ多糖；（xxxii ）酵素；（xxxiii）抗体；ならびに（xxxiv）ビオチンが挙げられるが、これらに制限されない。例えば、プライマー−アダプター分子および新規に合成された核酸分子が、ビオチンを含む、本発明の好ましい局面において、ビオチンを結合するハプテン（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）は、固体支持体に連結され得る。特に好ましいこのような局面において、使用される固体支持体は、アビジンもしくはストレプトアビジンが結合された磁性ビーズ、常磁性ビーズ、または超常磁性ビーズであり、これらは、例えば、Dynal A.S.（Oslo、Norway）またはSigm a（St．Louis、Missouri）から市販されている。もちろん、ハプテンの選択は、プライマー−アダプター分子の生成において使用されるリガンドの選択に依存し；従って、本発明の方法における使用のために適切なハプテンは、当業者に周知である。本発明の方法によって生成される核酸分子を単離するために、本発明のプライマー−アダプターを含有する核酸分子を含む溶液は、ハプテンによるリガンドの結合に有利な条件下で、ハプテン結合化固体支持体と接触される。代表的には、これらの条件は、緩衝化塩溶液、好ましくは、TRIS-、リン酸-、HEPES-、または炭酸塩-緩衝化塩化ナトリウム溶液、より好ましくは、TRIS-緩衝化塩化ナトリウム溶液、なおより好ましくは、約10〜100mM TRIS-HClと約300〜2000mM NaClとを含有する溶液、および最も好ましくは、約10mM TRIS-HClと約１M NaClとを、約６〜９のpH、より好ましくは、約７〜８のpH、なおより好ましくは、約7.2〜7.6 のpH、そして最も好ましくは、約7.5のpHで含有する溶液中でのインキュベーションを包含する。インキュベーションは、好ましくは、０℃〜約25℃で、そして最も好ましくは約25℃で、約30〜120分間、好ましくは、約45〜90分間、そして最も好ましくは、約60分間、行われ、ハプテン結合化固体支持体へのリガンド結合化核酸分子の結合を可能にした。いったん核酸が、固相支持体に結合されると、所望されない物質または混入物質（例えば、第１および第２の鎖の合成反応からの緩衝液および酵素、転写されない投入RNA分子など）は、上清中のそれらを単に除去することによって、排除され得る。例えば、ビオチン化cDNA分子が、アビジンまたはストレプトアビジン結合化固相に結合される好ましい局面において、混入物は、穏やかに吸引し、そして上清を捨てることによって、除去され得る。アビジンもしくはストレプトアビジンが結合された磁性、常磁性、または超常磁性のビーズが固体支持体として使用される特に好ましいこのような局面において、核酸（例えば、cDNA）を含有するビーズは、磁石（例えば、Manga-Sep Magnetic Particle Separator；Life Technologies，Inc.）を使用して上清から分離され、そして上清は、ピペットを使用して取り除かれる。固体支持体からのそれらの解離の前に、固定化された核酸分子は、好ましくは、所望されない物質をより十分に除去するために、例えば、上記の緩衝化塩溶液の１つで、１回以上洗浄される。一旦、混入物が十分に除去されると、核酸（例えば、cDNA）分子は、認識配列の切断に有利な条件下で、支持体を、上記のようなプライマー−アダプター分子中に操作された配列を特異的に認識するエンドヌクレアーゼ（これは、制限エンドヌクレアーゼであり得る）と接触させることによって、固体支持体から解離され得る。NotIおよび／またはI-CeuI認識配列が、プライマー−アダプター分子中に操作される（従って、これは、新規に合成された核酸（例えば、cDNA）分子中に含まれる）本発明の特に好ましいこのような局面において、固体支持体は、No tIおよび／またはI-CeuIを含有する溶液と接触される。もちろん、固体支持体から核酸分子を解離するために使用される制限酵素の選択は、プライマー−アダプター分子中に操作された特異的な認識部位およびその認識部位が核酸分子中に存在する可能性に依存する。固体支持体からの核酸分子（例えば、cDNAまたはcDNA ライブラリー）の解離のための好ましい条件は、約20℃〜約40℃、好ましくは、約25℃〜約39℃、より好ましくは、約30℃〜約37℃、そして最も好ましくは、約 37℃で、約30〜180分間、好ましくは、約60〜150分間、そして最も好ましくは約 120分間のインキュベーションを包含する。固体支持体からのそれらの解離後、核酸分子（例えば、cDNA分子またはcDNAライブラリー）は、本発明に従って、または文献において周知である技術（例えば、Gubler，U.およびHoffman，B.J．Ge ne 25:263-269（1983）；Krug，M.S.およびBerger，S.L.、Meth．Enzymol．152: 316−325（1987）；Sambrook，J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 、第２版、Cold Spring Harbor、NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press、8. 60〜8.63頁（1987））、および当業者に周知の技術によって、加工およびさらに精製され得る。キット本発明はまた、核酸分子（例えば、cDNA分子またはライブラリー）の生成および単離における使用のためのキットを提供する。本発明のこの局面に従うキットは、１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなど）をその中の密接な（close）仕切りの中に有するキャリア手段（例えば、ボックス、カートン、チューブなど）を含み、ここで第１の容器は、１つ以上のプライマー−アダプター核酸分子を含み、このプライマー−アダプター分子は、好ましくは、ビオチン化されたプライマー−アダプター核酸分子である。他の局面において、本発明のキットはさらに、ハプテンが結合された固体支持体を含有する１つ以上のさらなる容器を含み、この固体支持体は、任意の上記の固体支持体であり得、および最も好ましくは、アビジンもしくはストレプトアビジンが結合された磁性、常磁性、または超常磁性のビーズである。さらなる局面において、本発明のキットはさらに、例えば、１つ以上のヌクレオチド（例えば、dNTP、ddNTP、もしくはその誘導体）、または逆転写酵素活性および／またはポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド（例えば、酵素）、好ましくは上記のそれらの酵素のいずれかを含む、１つ以上のさらなる容器を含み得る。このようなヌクレオチドまたはその誘導体としては、dUTP、dATP、dTTP、dCTP、cGTP、dITP、7-デアザ-dGTP、α-チオ-dATP、α-チオ-dTTP、α-チオ-dGTP、α-チオ-dCTP、ddUTP 、ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP、ddITP、7-デアザ（deaza）-ddGTP、α-チオ-dd ATP、α-チオ-ddTTP、α-チオ-ddGTP、α-チオ-ddCTP、またはそれらの誘導体（これらの全ては、Life Technologies，Inc.（Rockville、Maryland）、New Engl and BioLabs（Beverly，Massachusetts）、およびSigma Chemical Company（Sai nt Louis，Missouri）を含む供給源から市販されている）が挙げれ得るが、これらに制限されない。本発明に従うさらなるキットは、固体支持体からの、核酸分子（例えば、cDNA分子またはcDNAライブラリー）の解離のために使用される、１つ以上のエンドヌクレアーゼまたは制限酵素を含有する１つ以上のさらなる容器を含み得る。本発明のこの局面により包含されるキットはさらに、核酸逆転写および／または重合化プロトコルを行うために必要な、さらなる試薬（例えば、適切な緩衝液）および化合物を含み得る。使用本発明は、核酸分子の迅速的な生成および単離を必要とする種々の適用において使用され得る。本発明は、mRNAまたはポリA+ RNA分子の単離に、核酸分子の集団からの所望の核酸分子の単離に、および核酸分子（特に、小量のmRNAからの完全長のcDNA分子）の生成に、特に適する。本発明はまた、核酸分子の増幅のための方法に、およびこれらの方法によって増幅された核酸分子に関する。本発明のこの局面により、核酸分子は、当該分野で公知の任意の増幅方法に従って、本発明の核酸分子（例えば、cDNA分子）を増幅することによって、増幅され得る（すなわち、核酸分子のさらなるコピーが調製される）。本発明のこの局面に従う特に好ましい増幅方法としては、PCR（米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号）、Strand Displacement Amplific ation（SDA；米国特許第5,455,166号;EP 0 684 315）、およびNucielc Acid Seq uence-Based Ampllfication（NASBA；米国特許第5,409,818号；EP 0 329 822）が挙げられる。最も好ましいものは、１つ以上のPCR増幅を含むそれらの方法である。本発明はまた、本発明の核酸分子、または増幅された核酸分子を含む組換えベクターを調製するために使用され得る方法、これらの組換えベクターを含む宿主細胞、これらのベクターおよび宿主細胞を使用して組換えポリペプチドを生成するための方法、ならびにこれらの方法を使用して生成される組換えポリペプチドに関する。組換えベクターは、当該分野において周知である方法を使用して、本発明に従って調製された１つ以上の核酸分子または増幅された核酸分子を、ベクターに挿入することによる、本発明のこの局面に従って生成され得る（図１を参照のこと）。本発明のこの局面において使用されるベクターは、例えば、ファージまたはプラスミドであり得、および好ましくはプラスミドである。好ましいのは、目的のポリペプチドをコードする核酸配列に対するシス作用性の制御領域を含有するベクターである。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、補足（complementing）ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自身によって供給され得る。この点に関する特定の好ましい実施態様において、ベクターは、本発明のcDNA 分子または核酸分子の特異的な発現を提供する発現ベクターであり、このベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る。このようなベクターの中で特に好ましいのは、温度および栄養素添加物のような、操作することが容易である環境因子による誘導性のベクターである。本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体-、エピソーム-、およびウイルス-由来のベクター（例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター）、およびそれらの組み合わせに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられ、そして好ましくは、少なくとも１つの選択マーカー（例えば、細菌宿主細胞中での培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子）が挙げられる。このような発現ベクターへの挿入の前に、本発明の核酸分子（例えば、cDNA分子）または増幅される核酸分子は、適切なプロモーター（例えば、ファージλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーターおよびtacプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。本発明における使用のために特に好ましいベクターとしては、pQE70、pQE60、およびpQE-9（Qiagenから入手可能）；pBSベクター、Phagescriptベクター、Blu eScriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）；pcDNA3（Invitorogenから入手可能）;pGEX、pTrxfus、pTrc99a、pET-5、pET-9 、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）；ならびにpS PORT1、pSP0RT2、およびpSV・SPORT1（Life Technologies，Inc.から入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。本発明に従って使用され得る代表的な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられるが、これらに制限されない。好ましい細菌宿主細胞としては、Escherichia ssp.細胞（特に、E.coli細胞および最も特には、E.coliのDH10BおよびStb12株）、Bacillus spp.細胞（特に、B.subtilis およびB.megaterium細胞）、Streptomyces spp.細胞、Erwinia ssp.細胞、Klebs iella spp.細胞、ならびにSalmonella spp.細胞（特に、S．typhimurium細胞）が挙げられるが、これらに制限されない。好ましい動物宿主細胞株としては、昆虫細胞（最も特には、Spodoptera frugiperda Sf9およびSf21細胞、ならびにTrich oplusa High-Five細胞）、ならびに哺乳動物細胞（最も特には、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、およびヒト細胞）が挙げられる。これらのおよび他の適切な宿主細胞は、例えば、Life Technologies，Inc.、アメリカンタイプカルチャーコレクション、およびInvitrogenから市販されている。さらに、本発明は、組換えポリペプチドを生成するための方法、およびこれらの方法によって生成されるポリペプチドを提供する。本発明のこの局面により、組換えポリペプチドは、任意の上述の組換え宿主細胞を、そこからのポリペプチドの生成、およびポリペプチドの単離を有利にする条件下で、培養することによって、生成され得る。組換え宿主細胞を培養するための方法、ならびにそこからのポリペプチドの生成および単離のための方法は、当業者に周知である。他の適用において、本発明の方法は、ポリA+ RNAの複雑な集団から遺伝子特異的cDNAライブラリーを作製するために使用され得る。本発明の方法はまた、AFLP のような多型解析法と組合わせて、異なる２つのDNA集団間の転写の差異の、迅速的なおよび直接的な同定を容易にする。さらに、本発明において使用されるプライマー−アダプターは、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、または他の調節領域）を含むように設計され得る。１つのこのような局面において、T7またはSP6 RNAポリメラーゼについてのプロモーターが、プライマー−アダプター中に操作され得、それによって増幅またはサブトラクションにおける使用のための元のmRNAのさらなるコピーの生成を可能にする。さらに、本発明の方法は、細胞、組織、器官、もしくは生物体からのような、全RNAからポリA+ RNAを単離するために、または全RNAからcDNAライブラリーを直接的に作製するために、使用され得る。後者の適用において、本発明は、目的のmRNAが全RNAのうちのごく微少な画分を示す場合に特に有用であり；本発明によって、この低レベルの mRNAは、全RNAのバックグラウンドから迅速的かつ効率的に単離され得、次いで、種々の目的（例えば、クローニングおよび／または増幅）のために、１本鎖または２本鎖のcDNA分子に、迅速的かつ効率的に逆転写され得る。本明細書中に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適応は、明白であること、および本発明の範囲またはその任意の実施態様から逸脱することなくなされ得ることが、当業者には容易に明らかである。ここで本発明を、詳細に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照することによってより明らかに理解され、この実施例は、例示の目的のためのみに本明細書中に含まれ、本発明を制限することは意図されない。実施例１：cDNA分子の生成および単離第１鎖および第２鎖のcDNA合成反応を、50〜5000ngのmRNAを、10⁶個を超えるクローンのライブラリーを生成するための開始材料として使用した以外は、SUPE RSCRIPT Plasmid System（Life Technologies，Inc.，Rockville，Maryland）についての指導マニュアルにおいて記載されるように行った。cDNA合成において使用されるプライマー−アダプターは、４つのビオチン（Ｂ）残基を含んだ：B-GA CT（-B）AGT（-B）T（-B）CTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T₁₅)（配列番号１）。簡潔には、１μgのビオチン化されたプライマー−アダプターを使用して、第１鎖の合成を、60分間、50mM TRIS-HCl（pH8.3）、75mM KCl、３mM MgCl₂、10mM DTT、それぞれ500μMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、50μM/ml Bio-p-A、ならびに10,000〜50,000ユニット/ml SuperScript II逆転写酵素（Life Technolog ies，Inc.）を含有する溶液中で、開始した。第２鎖の合成を、以前に記載された方法（Okayama，H.およびBerg，P.、Mol．Cell．Biol．2:161（1982）；Guble r，U.およびHoffman，B.J.、Gene 25:263（1983）；D'Alessio，J.M．ら、FOCUS 9:1（1987））を用いて、25mM TRIS-HCl（pH7.5）、100mM KCl、５mM MgCl₂、10 mM(NH₄)₂SO₄、0.15mM B-NAD+、それぞれ250μMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP 、1.2mM DTT、65ユニット/ml DNAリガーゼ、250ユニット/ml DNAポリメラーゼI 、ならびに13ユニット/ml RNase Hを含有する溶液中で、２時間、16℃にて行った。２時間の第２鎖のcDNA合成反応のうちの最後の30分間の間、ストレプトアビジン常磁性ビーズを調製した。簡潔には、常磁性ビーズ（Life Technologies，Inc .）を再懸濁し、そして150μlのビーズ懸濁液を、各反応についてマイクロ遠心分離チューブ中においた。チューブを、Magna-Sep-Magnetic particle Separato r（磁石）に、２分間置き、そして上清を吸引によって除去した。次いで、ビーズを100μlのTE緩衝液（10mM TRIS-HCl（pH7.5）、１mM EDTA）を各チューブに添加することによって洗浄し、ビーズを再懸濁し、そして上記のように２分後に上清を除去した。洗浄後、ビーズを、160μlの結合緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7 .5）、１mM EDTA、１M NaCl）中に再懸濁し、そしてcDNAを単離することにおける使用まで、25℃で保持した。第２鎖のcDNA合成反応混合物を、T4 DNAポリメラーゼとともにインキュベーションした後、チューブを氷上に置き、そして反応を、10μlの0.5M EDTAの、各チューブへの添加によって終わらせた。次いで、その溶液を、ストレプトアビジンを結合した常磁性ビーズと接触させることによって、ビオチン化cDNA分子を単離した。簡潔には、上記のように調製された160μlのビーズを、cDNA反応混合物チューブに添加し、そしてチューブを穏やかに混合し、そして室温で、60分間、インキュベートした。次いで、チューブを２分間、磁石中に挿入し、その後、上清を除去し、そして捨てた。次いで、ビーズを、100μlの洗浄緩衝液（10mM TRIS- HCl（pH7.5）、１mM EDTA、500mM NaCl）で、穏やかに再懸濁し、続いて磁石中に再挿入することによって洗浄した。２分後、上清を除去し、および捨て、そして洗浄工程を反復した。第２の洗浄後、ビーズを100μlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、新しいチューブに移し、そして上述のように２回洗浄した（磁石への５分間の曝露を伴った）。第２の５分間の洗浄後、上清を除去し、および捨て、そしてcDNA分子を、NotI とのインキュベーションによってビーズから取り出した。簡潔には、50μlのNot I溶液（41μlのオートクレーブした蒸留水、５μlのREact3緩衝液（500mM TRIS- HCl（pH8.0）、100mM MgCl₂、１M NaCl）、および４μlのNotI）を各反応チューブに添加し、そしてチューブを穏やかなピペッティングによって混合した。チューブを、２時間、37℃でインキュベートし、次いで、磁石中に２分間挿入した。 cDNA分子を含有する上清を、新しいチューブに回収し、そしてビーズを、20μl のTE緩衝液中で穏やかに再懸濁し、磁石中に２分間、再挿入し、そしてこの洗浄からの上清を、上述からのcDNA分子を含有する上清と組合わせた。プールした上清を含有する各チューブに対して、70μlのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）を添加し、そしてチューブを、徹底的にボルテックスし、そして室温で、５分間、14,000×gにて遠心分離した。遠心分離後、65μl の上部の水層を各チューブから取り出し、そして新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、そして32μlの7.5M酢酸アンモニウム、１μl（20μg）のグリコーゲン、および250μlの冷（-20℃）無水エタノールを、各チューブに添加した。次いで、チューブを混合し、そしてドライアイス上に、または-70℃で15分間、保存し、次いで、30分間、14,000×gで、４℃にて、遠心分離した。上清を除去し、そして捨て、100μlの70％エタノールを、ペレットに添加し、そしてチューブを、２分間、14,000×gで、室温にて、遠心分離した。上清を除去し、および捨て、そしてペレットを、speed-vac中で乾燥し、次いで、TE緩衝液（50〜200ngの投入mRNAについて10μl、または200〜5000ngの投入mRNAについて100μl）中に溶解した。最終的なcDNA収量を、チェレンコフ計数によって決定した。実施例２：cDNAのベクターライゲーションおよび宿主細胞への導入 10〜50ngのcDNAをベクター（例えば、pCMVSPORT）にライゲーションし、そしてこのライゲーションを、クローニングベクターをNotIおよびSmaIで予め消化したことを除いて、SUPERSCRIPT Plasmid System manual（Life Technologies，In c.）において記載されるように形質転換することによって、E.collに導入した。１つのこのようなライゲーションにおいて、50ngのベクターを、４μlの5×T4 D NAリガーゼ緩衝液（250mM TRIS-HCl（pH7.6）、50mM MgCl₂、５mM ATP、５mM DT T、25%（w/v）PEG-8000）、および１μlのT4リガーゼ（１ユニット）を含有する 1.5mlマイクロ遠心チューブ中で、４℃にて、16時間、cDNAにライゲーションした。実施例３：cDNA収量比較本発明の方法によるcDNA合成の効率および収量を調べるために、cDNAを上記のように生成し、そして生成された量を、代替の市販の系（SUPERSCRIPT Plasmid System：Life Technologies，Inc.、Rockville、Maryland）を使用して得られた量と比較した。簡潔には、pCMV・SPORT-cDNAライゲーションを、MAX EFFICIENCY を含有するプレートに播き、形質転換効率を決定した。各実験について、48個のランダムに選択したコロニーに対して、SP6およびT7プロモータープライマー、ならびに40サイクルのPCRを使用することによって、cDNAインサートをサイズ分離した。表１は、SuperScript Plasmid Systemを使用して得られるcDNA収量に対する、本発明の方法によって得られるcDNA収量の比較を示す。表１．SUPERSCRIPT Plasmid Systemに対する、本発明の比較これらの結果は、本発明が、SUPERSCRIPT Plasmid Systemよりも約３〜４倍優れたcDNAの収量を生成することを実証する。さらに、本発明は、SUPERSCRIPT Pl asmid Systemで得られる形質転換効率および平均インサートサイズに、ほぼ等価な形質転換効率および平均インサートサイズを実証した。従って、本発明は、時間がかかり、そして収量を減少させる、cDNAのサイズ分画工程の使用を伴わない、完全長のcDNA分子の迅速的かつ効率的な生成のための方法を提供する。実施例４：種々の量の投入mRNAを使用する、cDNAの生成および単離本発明の方法が、cDNAを迅速的かつ効率的に生成することが実証されたので、種々の量の投入mRNAからのcDNAを生成することにおける本発明の効果を調べた。これらの研究において、投入mRNAの量を、５ng〜１μgまで変化させ、そしてcDN A収量、形質転換効率、および平均のインサートサイズを、上述のように決定した。結果を、表２に示す。表２．異なる量の投入mRNAを使用した場合のcDNAの収量これらの結果は、本発明が、5ngほど小量の投入mRNAから、大きなcDNAライブラリー（すなわち、10⁵個のクローンを超える）を生成し得ることを実証する。以前は、PCR（cDNAライブラリーを偏らせる(bias)プロセス）が、この小量のRNA からのcDNAライブラリーの生成を可能にした唯一の方法であった。上述の結果を合わせると、これらの結果は、本発明は、種々の量の投入mRNA（低レベルの発現を示し、従って、ポリA+または全RNAプールの小画分のみを示すmRNAを含む）から高品質の、完全長のcDNA分子を、迅速的かつ効率的に生成し得ることを示す。ここで、理解の明瞭さの目的のために、説明および実施例によって、本発明をいくらか詳細に十分に記載したが、本発明の範囲またはその任意の特定の実施態様に影響することなく、条件、処方、および他のパラメーターの広範なおよび等価な範囲内で、本発明を改変または変化することによって、本発明が行われ得ること、ならびにこのような改変または変化は、添付の請求の範囲内に包含されることが意図されることが当業者には明白である。本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術のレベルを示し、ならびに各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参考として援用されることが詳細におよび個々に示されるよのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸分子を作製するための方法であって、以下（ａ）核酸鋳型と、（ｉ）ポリメラーゼ活性および／または逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、ならびに（ii）プライマー−アダプター核酸分子とを、混合する工程；ならびに（ｂ）該鋳型の全てまたは一部に相補的な第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程であって、該プライマー−アダプター核酸分子は、１つ以上のリガンドおよび１つ以上の切断部位を含有する工程を包含する、方法。２．前記第１の核酸分子が、前記プライマー−アダプター核酸分子を含有する、請求項１に記載の方法。３．前記鋳型が、RNAまたはDNAである、請求項１に記載の方法。４．前記RNAが、mRNAまたはポリA+ RNA分子である、請求項３に記載の方法。５．前記第１の核酸分子が、RNAまたはDNAである、請求項１に記載の方法。６．請求項１に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、モロニー白血病ウイルス（M-MLV）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（RSV）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素、Tne DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、TliまたはVENT^TMDNAポリメラーゼ、PfuまたはDEEPVENT^TMDNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Sac DNAポリメラーゼ、Tac DNAポリメラーゼ、Tfl/Tub DNAポリメラーゼ、Tru DNAポリメラーゼ、DYNAZYME^TMDNAポリメラーゼ、Mth DNAポリメラーゼ、ラウス随伴ウイルス（RAV）逆転写酵素、骨髄芽球症随伴ウイルス（MAV）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎ウイルス逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、ならびにその変異体、改変体、および誘導体からなる群より選択される、方法。７．前記第１の核酸分子が、cDNA分子である、請求項４に記載の方法。８．前記切断部位が、前記プライマー−アダプター核酸分子からの、前記リガンドの少なくとも１つの除去を可能にする、請求項１に記載の方法。９．前記切断部位が、前記第１の核酸分子からの前記リガンドの少なくとも１つの除去を可能にする、請求項２に記載の方法。１０．請求項１に記載の方法であって、前記リガンド分子が：（ｉ）ビオチン；（ii）抗体；（iii）酵素；（iv）リポ多糖；（ｖ）アポトランスフェリン；（v i）フェロトランスフェリン；（vii）インスリン；（viii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）；（ix）gp120；（ｘ）β- アクチン；（xi）LFA-1；（xii）Mac-1；（xiii）グリコホリン；（xiv）ラミニン；（xv）コラーゲン；（xvi）フィブロネクチン；（xvii）ビトロネクチン；（xviii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃；（xix）インテグリンα₃β₁、α₄ β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁、α_IIbβ₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆；（xx）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xxi）インテグリンα₁β₁ 、α₂β₁、α₃β₁、α₆β₁、α₇β₁、およびα₆β₅；（xxii）アンキリン；（xx iii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xxiv）ICAM-1またはICAM-2 ；（xxv）スペクトリンまたはホドリン；（xxvi）CD4；（xxvii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）レセプター；（xxviii）インスリンレセプター；（xxix）トランスフェリンレセプター；（ xxx）Fe⁺⁺⁺；（xxxi）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和化タンパク質（ ENP）；（xxxii）酵素特異的基質；（xxxiii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；ならびに（xxxiv）アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、方法。１１．前記切断部位が、制限エンドヌクレアーゼ切断部位またはエンドヌクレアーゼ切断部位である、請求項１に記載の方法。１２．請求項２に記載の方法であって、該方法がさらに、前記第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、該第１の核酸分子をインキュベートする工程を包含する、方法。１３．前記第２の核酸分子が、RNAまたはDNA分子である、請求項１２に記載の方法。１４．前記第１および第２の核酸分子が、２本鎖核酸分子を形成する、請求項１２に記載の方法。１５．前記２本鎖核酸分子が、２本鎖cDNA分子である、請求項１４に記載の方法。１６．前記インキュベーション工程が、前記第１の核酸分子と、DNAポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上のプライマーとを混合する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。１７．前記プライマーが、１つ以上のリガンドおよび１つ以上の切断部位を含有するプライマー−アダプターである、請求項１６に記載の方法。１８．請求項２に記載の方法であって、該方法がさらに、１つ以上の前記リガンドを、１つ以上のハプテンに結合し、それによって核酸−リガンド−ハプテン複合体を形成する工程を包含する、方法。１９．請求項１２に記載の方法であって、該方法がさらに、１つ以上の前記リガンドを、１つ以上のハプテンに結合し、それによって核酸−リガンド−ハプテン複合体を形成する工程を包含する、方法。２０．請求項１８または１９に記載の方法であって、該方法がさらに、前記切断部位の１つ以上の切断によって、前記複合体から前記核酸分子を単離する工程を包含する、方法。２１．前記核酸分子が、２本鎖または１本鎖の核酸分子である、請求項２０に記載の方法。２２．前記１つ以上のハプテンが、固体支持体に結合される、請求項１８または１９に記載の方法。２３．請求項２２に記載の方法であって、前記固体支持体が、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、およびマイクロタイタープレートからなる群より選択される、方法。２４．請求項１８または１９に記載の方法であって、前記１つ以上のハプテンが：（ｉ）アビジンおよびストレプトアビジン；（ii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；（iii）酵素特異的基質；（iv）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和化タンパク質（ENP）；（ｖ）F e⁺⁺⁺；（vi）トランスフェリンレセプター；（vii）インスリンレセプター；（v iii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）レセプター；（ix）CD4；（x）スペクトリンまたはホドリン；（xi）IC AM-IまたはICAM-2；（xii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（Xiii ）アンキリン；（xiv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、α₆β₁、α₇β₁ 、およびα₆β₅：（xv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃ ；（xvi）インテグリンα₃β₁、α₄β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁、α_IIbβ₃、 α_Vβ₃、およびα_Vβ₆；（xvii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃；（xviii）ビトロネクチン；（xix）フィブロネクチン；（xx）コラーゲン；（xxi）ラミニン；（xxii）グリコホリン；（xxiii）Mac-1；（xxiv）LFA-1；（xxv）β-アクチン；（xxvi）gp120；（xxvii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）；（xxviii）インスリン；（xxix）フェロトランスフェリン；（xxx）アポトランスフエリン；（xxxi）リポ多糖；（xxxii）酵素；（ xxxiii）抗体；ならびに（xxxiv）ビオチンからなる群より選択される、方法。２５．請求項２に記載の方法であって、該方法がさらに、前記第１の核酸分子を増幅する工程を包含する、方法。２６．前記増幅が、前記第１の核酸分子を、DNAポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上のプライマーとともにインキュベートする工程を包含する方法によって達成される、請求項２５に記載の方法。２７．前記プライマーが、プライマー−アダプターである、請求項２６に記載の方法。２８．請求項１２に記載の方法であって、該方法がさらに、前記第１および第２の核酸分子を増幅する工程を包含する、方法。２９．請求項２８に記載の方法であって、前記増幅が、以下（ａ）前記第１の核酸分子の一部に相補的である第１のプライマー−アダプターを有する該第１の核酸分子、および前記第２の核酸分子の一部に相補的である第２のプライマー−アダプターを有する該第２の核酸分子と、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチドとを、接触させる工程；（ｂ）該第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第３の核酸分子、および該第２の核酸分子の全てまたは一部に相補的である第４の核酸分子を形成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程；（ｃ）該第１の核酸分子と第３の核酸分子とを、および該第２の核酸分子と第４の核酸分子とを、変性させる工程；ならびに（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の工程を、１回以上反復する工程、を包含する方法によって達成される、方法。３０．前記第１のプライマー−アダプターまたは前記第２のプライマーアダプターが、オリゴヌクレオチドプライマーで置換えられる、請求項２９に記載の方法。３１．請求項２９に記載の方法であって、該方法がさらに、前記リガンドの１つ以上を、１つ以上のハプテンに結合し、それによって、前記増幅された核酸を有する核酸−リガンド−ハプテン複合体を形成する工程を包含する、方法。３２．請求項３１に記載の方法であって、該方法がさらに、前記切断部位の１つ以上を切断することによって、前記複合体から前記核酸を単離する工程を包含する、方法。３３．１つ以上のプライマー−アダプター分子を含む核酸分子であって、該プライマー−アダプター分子は、１つ以上のリガンドおよび１つ以上の切断部位を含有する、核酸分子。３４．前記１つ以上の切断部位が、該核酸分子からの前記１つ以上のリガンドの除去を可能にする、請求項３３に記載の核酸分子。３５．前記リガンドが、１つ以上のハプテンに結合される、請求項３３に記載の核酸分子。３６．前記１つ以上のハプテンが、固体支持体に結合される、請求項３５に記載の核酸分子。３７．前記切断部位が、制限エンドヌクレアーゼ部位またはエンドヌクレアーゼ切断部位である、請求項３３に記載の核酸分子。３８．前記核酸分子が、２本鎖または１本鎖である、請求項３３に記載の核酸分子。３９．前記核酸分子が、DNA分子、RNA分子、またはDNA/RNAハイブリッド分子である、請求項３８に記載の核酸分子。４０．請求項１または請求項１２に記載の方法によって生成される、核酸分子。４１．１つ以上の容器を備える、核酸分子の生成のためのキットであって、第１の容器は１つ以上のリガンドおよび１つ以上の切断部位を含有するプライマー− アダプター分子を含む、キット。４２．ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドを含有する１つ以上のさらなる容器をさらに備える、請求項４１に記載のキット。４３．前記リガンドを特異的に認識し、そして結合し得る１つ以上のハプテンを含有する個体支持体を含む１つ以上のさらなる容器をさらに備える、請求項４１に記載のキット。４４．cDNA分子を生成するための方法であって、（ａ）mRNA鋳型と、逆転写酵素活性を有するポリペプチドおよびプライマー− アダプター核酸分子とを混合する工程であって、該プライマー−アダプター分子は、１つ以上のリガンドおよび１つ以上の切断部位を含有する工程；（ｂ）該鋳型の全てまたは一部に相補的な第１のDNA分子を作製するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートし、それによってDNA−プライマー−アダプター分子を形成する、工程（ｃ）該DNA−プライマー−アダプター分子を、リガンド−ハプテン相互作用を介して、固体支持体に結合させる工程；および（ｄ）該１つ以上の切断部位を切断することによって、該固体支持体から該第１のDNA分子を単離する工程、を包含する、方法。４５．請求項４４に記載の方法であって、該方法がさらに、前記第１のDNA分子の全てまたは一部に相補的な第２のDNA分子を作製する工程を包含する、方法。４６．前記第２のDNA分子が、前記第１のDNA分子の単離の前または後に作製される、請求項４５に記載の方法。４７．前記第２のDNA分子が、プライマー−アダプター分子を含有する、請求項４６に記載の方法。４８．請求項４４に記載の方法であって、該方法が、mRNAサンプルからcDNAライブラリーを調製するために使用される、方法。４９．cDNA分子を生成するための方法であって、該方法は、以下（ａ）mRNA鋳型と、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドと、プライマーとを、該鋳型の全てまたは一部に相補的な第１のDNA分子を作製するのに十分な条件下で、インキュベートする工程；（ｂ）該第１のDNA分子と、プライマー−アダプター分子とを、プライマー− アダプター分子を含有する２本鎖DNA分子を形成するのに十分な条件下で、インキュベートする工程であって、ここで該プライマー−アダプター分子は、１つ以上のリガンドおよび１つ以上の切断部位を含有する、工程；（ｃ）該２本鎖DNA分子を、リガンド−ハプテン相互作用を介して、固体支持体に結合させる工程；ならびに（ｄ）該１つ以上の切断部位を切断することによって、該固体支持体から該２本鎖DNA分子を単離する工程、を包含する、方法。５０．請求項４９に記載の方法であって、該方法が、mRNAサンプルからcDNAライブラリーを調製するために使用される、方法。５１．mRNA分子を単離するための方法であって、該方法は、以下（ａ）RNAサンプルと、mRNAにハイブリダイズするプライマー−アダプター分子とを混合し、それによってmRNA−プライマー−アダプター分子を形成する工程であって、ここで該プライマー−アダプター分子は、１つ以上のリガンドおよび１つ以上の切断部位を含有する工程；（ｂ）該mRNA−プライマー−アダプター分子を、リガンド−ハプテン相互作用を介して、固体支持体に結合する工程；ならびに（ｃ）該１つ以上の切断部位を切断することによって、該固体支持体から該mR NA分子を単離する工程、を包含する、方法。５２．前記プライマー−アダプター分子が、オリゴ(dT)を含有する、請求項５１に記載の方法。５３．核酸分子の集団から、１つ以上の所望の核酸分子を単離するための方法であって、以下（ａ）該核酸分子の集団と、１つ以上の標的特異的プライマー−アダプター分子とを混合する工程；（ｂ）該所望の核酸分子に該プライマー−アダプター分子を結合させるのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程；ならびに（ｃ）該所望の核酸分子の１つ以上を単離する工程、を包含する、方法。