JP2002503113A

JP2002503113A - 抗真菌組成物

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Publication number: JP2002503113A
Application number: JP50832699A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズグリーンランド，アンドリュー; マテオス，アンジェルマニュエルフェンテス
Original assignee: ゼネカリミテッド
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2002-01-29
Also published as: AU8347198A; PT999750E; EP0999750A1; GB9714564D0; DE69819731D1; DE69819731T2; US6599514B1; WO1999002038A1; ATE253827T1; CA2291714A1; ES2205519T3; DK0999750T3; EP0999750B1

Abstract

(57)【要約】抗真菌剤および食品添加物を含む、増強された抗真菌活性を有する抗真菌組成物が記載される。増強された活性を有する組成物を使用して真菌増殖を阻害する方法および抗真菌剤の抗真菌特性を増強するための食品添加物の使用もまた、記載される。

Description

【発明の詳細な説明】抗真菌組成物技術的分野本発明は、増強された抗真菌活性を示す組成物（1つ以上の抗真菌剤および1つ以上の食品添加物を含む）、抗真菌剤の抗真菌特性を増強するための食品添加物の使用、および本発明による組成物を使用して真菌の増殖を阻害する方法に関する。発明の背景一般の食品損傷生物の存在による食品中の汚染は、食品業界で繰り返し発生する問題である。最も驚いたことに、本発明者らは、抗真菌剤が一般に使用される食品添加物と併用される場合、抗真菌活性の増強を観察した。さらに、食品添加物が抗真菌活性を示す場合、本発明者らは増強された効果（それにより混合物の抗真菌活性が期待以上に大きくなる）を観察した。この増強または相乗的な効果は、食材中に存在する抗真菌化合物および／または食品添加物の減じた量での使用を可能にする。このことは特に有利であるが、それは、ヒトの消費用および動物の消費用の両方について、食材中に存在する任意の添加物量を最小化することが強く望まれているからである。発明の要旨従って、最初の局面において本発明は、1つ以上の抗真菌剤および1つ以上の食品添加物を含む抗真菌組成物を提供し、ただしこの組成物がナイシン(nisin)、ラクトフェリン、およびその誘導体、トリクロジアニンまたはリゾチームを含まず：抗真菌剤および食品添加物の相対量は、組成物の全体の抗真菌活性を増強し得る量である。この食品添加物はまた、観察されるように、例えば食品防腐剤を用いた単離に使用される場合、いくつかの抗菌活性とりわけ抗真菌活性を示し得る。そしてこの場合、この抗真菌剤および食品添加物の併用は相乗効果（混合物の抗真菌活性が単離中にそれぞれ観察され、そして個々の結果の合計と比較したよりも大きくなる）を生じる。当業者に容易に明らかなように、この場合、組成物中に存在する抗真菌剤と食品添加物は同じでない（すなわち異なる）。それゆえ、本発明は、1つ以上の抗真菌剤および1つ以上の食品添加物を含む抗真菌組成物を意図する：抗真菌剤および食品添加物の相対量は相乗効果を産生するような量である。本発明はさらに、本明細書中下文にさらに記載した本発明の方法における相乗的な組成物の使用を意図する。好ましい実施態様において、本発明は、1つ以上の抗真菌剤および1つ以上の食品添加物を含む抗真菌組成物を提供し、ここで１つ以上の上記の食品添加物が抗菌活性を示し、ただし、上記の組成物はナイシン、リゾチーム、またはラクトフェリン、およびその誘導体を含まず：例えば、この抗真菌剤および食品添加物の相対量は、この組成物の全体の抗真菌活性への相乗効果を産生する量である。さらに好ましい実施態様において、本発明は、金属キレート剤、湿潤剤、補助剤、酸化防止剤、着色料(colourants)、乳化剤、安定化剤(stabilisers)、界面活性剤、漂白剤、pH調製剤、香料および香味増強剤、金属イオン封鎖剤または食品保存添加物からなる群から選択された1つ以上の抗真菌剤および1つ以上の食品添加物を含む組成物を提供し、ただし、上記の組成物はナイシン、ラクトフェリン、およびその誘導体、トリクロジアニンまたはリゾチームを含まず：この抗真菌剤および食品添加物の相対量は、この組成物の全体の抗真菌活性を増強する量である。さらなる局面において、本発明は、抗真菌剤の抗真菌特性を増強するための食品添加物の使用を提供する。本明細書中で使用されるように、用語「増強」は、抗真菌活性の改善を示すのに使用され、そしてこれは例えば、強い真菌増殖阻害（例えば90%を超える真菌増殖阻害）を与えるために必要な抗真菌剤濃度において観察される低下により証明され得る。本明細書中で使用されるように、用語「相乗的」は抗真菌活性の改善を示すのに使用され、この活性は、例えばColby Formula(Colby S.R.(1967)We eds 15,20-22)の適用により、またはParrish and Davidson(1993)(In:Antimicro bials in foods.Ed.By P.M.Davidson and A.L.Branen.Marcel Dekker,Inc.New Y ork)により記述されたとおり、イソボログラム(isobologram)の図表において相乗的であることが実証され得る。食品添加物の例には、以下の一般的に使用される食品添加物が含まれる；ソルビン酸およびソルビン酸塩(E200-E203)、安息香酸および安息香酸塩(E210-E213) 、ヒドロキシ安息香酸塩(E214-E219)、二酸化硫黄および亜硫酸塩(E220-E228)、ビフェニルおよび誘導体(E230-E232)、亜硝酸化合物(E249-E250)、硝酸塩(E251- E252)、乳酸(E270)、乳酸塩(E325-E327)、クエン酸およびクエン酸塩(E330-E333 )、酒石酸および酒石酸塩(E334-E337)、正リン酸および正リン酸塩(E338-E341) 、リンゴ酸塩(E350-E352)、アジピン酸(E335)、コハク酸(E363)、1,4-ヘプトノラクトン(heptonolactone)(E370)、ニコチン酸(E375)、クエン酸トリアンモニウム(E380)クエン酸アンモニウム鉄(E381)、カルシウムニナトリウムEDTA(E385)、グリセロール(E422)、二、三およびポリリン酸塩(E450a、E450b、E450c)、脂肪酸(E470)、脂肪酸モノおよびジグリセリド(E471)、脂肪酸モノおよびジグリセリドエステル(E472a-E472f)、炭酸塩(E500、E501、E503、E504)、グルコン酸(E576 -E578)、塩素(E925)、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)(E320)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)(E321)、t-ブチルヒドロキノン (THBQ)、没食子酸プロピル、カルシウムヘプトネート(calcium heptonate)、フィチン酸カルシウム、ジエチルエーテル、EDTA、二ナトリウム二水素EDTA、酢酸エチル、モノ、ジおよびトリ酢酸グリセロール、グリシン、オキシステアリン酸 (oxystearin)、プロパン１、２ジオールおよびプロパン２オール(propan-2-ol) およびナトリウムヘプトネート(sodium heptonate)。特に好ましい食品添加物には以下が含まれる；ソルビン酸およびソルビン酸塩 (E200-E203)、安息香酸および安息香酸塩(E210-E213)、ヒドロキシ安息香酸塩(E 214-E219)、酢酸塩および酢酸塩(E260-E263)、乳酸(E270)、乳酸塩(E325-E327) 、クエン酸およびクエン酸塩(E330-E333)、酒石酸および酒石酸塩(E334-E337)、正リン酸および正リン酸塩(E338-E341)、リンゴ酸塩(E350-E352)、アジピン酸(E 335)、コハク酸(E363)、ニコチン酸(E375)、カルシウム二ナトリウムEDTA(E385) 、脂肪酸(E470)、脂肪酸モノおよびジグリセリド(E471)、脂肪酸モノおよびジグリセリドエステル(E472a-E472f)、EDTA、二ナトリウム二水素EDTA、酢酸エチル、モノ、ジおよびトリ酢酸グリセロール。さらに好ましい食品添加物には、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエンおよび第３級ブチルヒドロキシキノンが含まれる。本発明者らは、抗真菌剤をカルシウムイオン存在下で使用した場合、抗真菌剤の活性に有意な低下が観察されることを見い出した。この知見によると、乳製品のようなカルシウムに富む食品におけるこの技術の有用性は制限され得る。本発明者らは現在、高カルシウムレベルに関連した問題は、抗真菌剤に関連するキレート剤の使用により克服し得、そして最も驚くべきことに、キレート剤の存在は抗真菌剤の活性を増強することを見い出した。さらに本発明者らは、有効なキレート化を得るための文献に推奨されるよりも実質的に少ないキレート剤、とりわけEDTAおよびその塩のレベルでこれを達成し得ることを見い出した。特に好ましい食品添加物の例として、EDTAのような金属キレート剤および二ナトリウムまたはカルシウム二ナトリウム塩としてのその使用；有機酸（たとえば乳酸）のような溶媒および湿潤剤；補助剤：ならびに膜透過剤(membrane permea bilising agents)を含む食品保存添加物（例えば、ソルビン酸およびカルシウム、ナトリウムまたはカリウム塩としてのその使用、安息香酸およびナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩としてのその使用、没食子酸プロピルのような抗酸化薬およびブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエンおよび第３級ブチルヒドロキシキノンのようなC1-6アルキルエーテル）。酸および塩またはそのエステル誘導体、あるいはC1-6アルキルエーテルの食品添加物としての使用が最も特に好ましい。食品添加物のさらなる例は、MichaelおよびIrene Ash,Gower(1995)により編集された「Handbook of Food Additives」中に見い出だされる。本発明による組成物、方法および使用での使用のために特に好ましい抗真菌剤は、天然の供給源から入手可能なものである。抗真菌剤は耐熱性であること、および好ましくはタンパク分解に対して耐性があることもまた好ましい。食材はしばしば、調製、加工およびパッケージング中に非常な高温にさらされるので、このような安定性は特に有利である。それゆえ本発明の抗真菌組成物は、好ましくは１つ以上の熱安定性抗真菌剤を含む。本明細書中に使用されるように、用語「熱安定性」は、85℃20分または90℃10 分でインキュベーション後の抗真菌活性の保持を示すために使用され、そして用語「タンパク分解に対する耐性」は、トリプシンのような一般的なプロテアーゼによる消化に対する感受性の欠如示すために使用される。抗真菌剤は、例えば膜摂動剤として作用することによって、真菌細胞膜に影響することによりそれらの活性を与えることがさらに好ましい。抗真菌剤は、耐熱性およびタンパク分解耐性である膜摂動剤であることがより好ましい併用である。さらなる局面において、本発明は、１つ以上の上記の抗真菌剤が、植物またはその種子誘導体に由来する、１つ以上の抗真菌剤、および少なくとも１つの上記の食品添加物がその酸または塩またはエステル誘導体またはC1-6アルキルエーテルである１つ以上の食品添加物を含む抗真菌組成物を提供し、抗真菌剤および食品添加物の相対量な、組成物の全体の抗真菌活性を増強し得る量である。本発明の上記の局面の好ましい実施態様において、本発明者らは、１つ以上の上記の食品添加物が抗真菌活性を示す抗真菌剤を提供する；抗真菌剤および食品添加物の相対量は、組成物の全体の抗真菌活性に相乗効果を産生する量である。上記の局面において、食品添加物は、より好ましくは、EDTA、ソルビン酸、乳酸、安息香酸、またはその塩もしくはエステル誘導体、没食子酸プロピル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、または第三級ブチルヒドロキノンの群から選択される。抗真菌剤は、好ましくは、Cruciferae、Compositae、Leguminosae、Amarantha ceae、Hippocastanaceae、Saxifragaceae、GramineaeおよびAlliaceaeとしても知られるBrassicaceaeのような植物ファミリーに属するものに由来する植物もしくは種子に由来し、そしてより好ましくは以下の属に由来する：Raphanus、Heuc hera、Aesculus、Clitoria、Brassica、Briza、Sinapsis、Cnicus,、Allium、Am aranthus、Impatiens、MirabilisおよびCapsicum、最も好ましくはRaphanus、例えばRaphanus sativus；Sinapsis、例えばSinapsis alba；Amaranthus、例えばA maranthus caudatus；Impatiens、例えばImpatiens balsamina；Mirabilis、例えばMirabilis japa；Brassica、例えばBrassica napusに由来する。本発明による組成物、方法および使用での使用のために特に好ましい抗真菌剤の例には、植物およびその種子のような、例えば公開国際特許出願第WO92/15691号、第WO92/2 1699号、第WO93/05153号、第WO93/04586号、第WO94/11511号、第WO95/04754号、第WO95/18229号、第WO95/24486号、第WO97/21814号および第WO97/21815号（Rs-A FP1、Rs-AFP2、Dm-AMP1、Dm-AMP2、Hs-AFP1、Ah-AMP1、Ct-AMP1、Ct-AMP2、Bn-A FP1、Bn-AFP2、Br-AFP1、Br-AFP2、Sa-AFP1．Sa-AFP2、Cb-AMP1、Cb-AMP2、Ca-A MP1、Bm-AMP1、Ace-AMP1、Ac-AMP1、Ac−AMP2、Mj-AMP1、Mj-AMP2、Ib-AMP1、Ib -AMP2、Ib-AMP3、Ib-AMP4およびそれに由来するペプチドまたは任意の上記のタンパク質と85%配列類似性、好ましくは90%を超える配列類似性、より好ましくは 95%を超える配列類似性、最も好ましくは96%、97%、98%または99%配列類似性を示す抗真菌タンパク質を含む）に記載された抗真菌タンパク質のような天然供給源から単離され得るもを含み、そして最も特にその食用種から単離可能である。本発明の特に好ましい実施態様において、抗真菌組成物は、１つ以上の植物および種子に由来する上記に列挙された抗真菌タンパク質またはペプチドを含み、上記の抗真菌タンパク質はそれらの耐熱性およびタンパク質分解に対する耐性によって特に有利である。本発明による、および本発明の方法および使用での使用のための特に好ましい組成物は、１つ以上の抗真菌タンパク質Rs-AFP2、Rs-AFP1、Sa-AFPs、Bn-AFPs、 Mj-AMP2、Ac-AMP1、Ib-AMP1もしくはIb-AMP2、またはその誘導体、あるいは85% を超える配列類似性、好ましくは90%を超える配列類似性、より好ましくは95%を超える配列類似性を示す抗真菌タンパク質、および１つ以上のEDTAまたはその塩、乳酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、没食子酸プロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエンあるいは第三級ブチルヒドロキノンを含む。 Rs-AFP2、Rs-AFP1、Bn-AFPs、Sa-AFPs、Ib-AMP1、Ib-AMP2、Mj-AMP2およびAc- AMP1の構造、単離および精製は、それぞれ、公開された国際特許出願第WO93/051 53号、同第WO95/24486号、同第WO92/15691号および同第WO92/21699号に記述されており、この教示は本明細書中で参考として援用される。本明細書中で、使用される用語「誘導体」はまた、とりわけ、公開国際特許出願番号第WO97/21815号に記載されたもののような全長配列に由来するペプチド、およびその残基が公開国際特許出願第WO97/21814号に記述されるもののようなネイティブ配列に関して変化したものもまた示す。本発明の状況において、３つのギャップまでを可能にするような最適に整列させた場合に、互いに少なくとも85%の類似性を有する２つのアミノ酸残基は似た位置で、少なくとも85%類似の（同一のまたは保存的置換した）アミノ酸残基を有し、ただし、ギャップに関して15アミノ酸以下の全ての残基が影響を受ける。同様に、互いに少なくとも90%の類似性を有する２つのアミノ酸配列は、３つのギャップまでを可能にするように最適に整列させた場合に、似た位置で、少なくとも90%同一のまたは保存的置換したアミノ酸残基を有し、ただしギャップに関して15アミノ酸以下の全ての残基が影響を受ける。本発明の目的のために、保存的なアミノ酸は、非修飾タンパク質と比較した場合、タンパク質の活性／機能を変えないものとして定義される。特に、保存的置換は以下のグループ内のアミノ酸間で作成され： (i) アラニン、セリン、グリシンおよびスレオニン (ii) グルタミン酸およびアスパラギン酸 (ili) アルギニンおよびリジン (iv) イソロイシン、ロイシン、バリンおよびメチオニン (v) フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン配列類似性は、例えばWilburおよびLipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,726-7 30(1983))、MyersおよびMi1ller(Comput.Appl.Biosci.4 11-17(1988))またはWat termanおよびEggert(J.Mol.Biol.(1987)197 723-28)により記載されるような、当該分野において周知の方法を用いて計算され得る。DNAstar Inc,1228 Selfpar k Street,Madison,Wisconsin,53715,USAより、レーザージーンシステムの一部として、入手し得るMegAlign Lipman-Pearsonワンペア法（初期設定パラメーターを使用）もまた使用され得る。他の抗真菌剤の例には、例えばキチナーゼようなPRタンパク質、β1,3および β1,6グルカナーゼのようなグルカナーゼ、キチン結合レクチン、ゼアマチン(ze amatin)、オスモチン、チオニンおよびリボソーム不活化タンパク質が含まれる。適切なキチナーゼおよびグルカナーゼの例は、例えば、公開欧州特許出願EP44 0304に；オスモチンの例は、公開国際特許出願第WO91/18984号に；キチナーゼＶの例は、公開国際特許出願第WO95/05467号に；キチン結合タンパク質の例は、公開国際特許出願第WO94/08009号に；β1,6グルカナーゼの例は、国際特許出願第PCT /EP98/02580号に見い出され得る。抗真菌剤は、化学的に合成され得るか、または当該分野で周知の方法を用いた組換えDNA技術を使用して生成され得る。抗真菌剤が微生物宿主中で組換え技術を使用して生成される場合、所望の薬剤の形質転換および生成に使用される宿主は、GRAS生物である。GRAS生物は、酵母、Pichia、乳酸菌、および監督機関により「安全」であるとみなされる特定のE.coli株のような生物である。従って、GR AS生物を使用して生成されたタンパク質は、精製され、そして食品添加物と併用して食材に添加され得る。抗真菌剤はまた、抽出物が部分的に精製されるかまたは濃縮された形態で抗真菌剤を含む種子または植物抽出物のような抽出物の形成で使用され得、そして食品添加物がこの抽出物に添加される。これは本明細書中の実施例に、より完全に記述される。本発明の方法および組成物は、一般の食品損傷生物、Fusarium culmorum、Pen icillium chrysogenum、Penicillium roquefortii、Alternaria sp.、Cladospor ium sp.、Trichoderma harzianum、Penicillium nalgiovense、Penicilliumcomm une、Mucor plumbeus、Aspergillus versicolorおよびScopulariopsisbrevicaul isに対して特に有効であると理解されている。これらの生物の試料は、例えば、 Rockville,Maryland,USAにおけるアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATC C)inから入手可能である。さらなる局面において、本発明は、真菌の増殖が阻害される環境を、本発明の任意の上記の局面による殺真菌的に、有効な量の抗真菌組成物に暴露する工程を含む食材中で真菌の増殖を阻害する方法を提供する。なおさらなる局面において、本発明は、食材または食材の所在に、本発明の任意の上記の局面による殺真菌的に有効な量の抗真菌組成物を適用する工程を含む食材中で真菌の増殖を阻害する方法を提供する。本発明の方法および組成物は、果物およびジャム、ならびにヨーグルト、チーズ、クリームデザート、ミルクシェーキのような乳製品を含む広範囲な食品および飲料との使用に特に適切である。本発明による抗真菌組成物は、ヒトおよび動物消費用食材との使用に適切な形態である。組成物の他の成分は、天然の食材およびその消費方法により選択され得、そしてこれは当業者に容易に明らかである。真菌増殖の阻害が所望される環境は、ほとんど通常は保護される天然の食材により決定される様々な方法で、抗真菌剤および食品添加物を含む組成物に暴露され得る。例えば、本発明の食材および組成物は、製造工程中互いに混合され得る。あるいは、またはさらに、食材が梱包される容器は、包装および／または充填後、食材にこの組成物を添加および／または噴霧される前に、この組成物で噴霧され得る。本発明の組成物はまた、コーティング製品（例えばチーズワックス(c heese wax)）と組み合せて使用され得る。さらに好ましい実施態様において、抗真菌組成物は、１つ以上のFusarium cul morum、Penicillium chrysogenum、Penicillium roquefortii、Alternaria sp. 、Cladosporium sp.、Trichoderma harzianum、Penicillium nalgiovense、Peni cillium commune、Mucor plumbeus、Aspergillus versicolorおよびScopulariop sis breaUllSに対して抗真菌活性を示す。抗真菌タンパク質Rs-AFP2、Ib-AMP1、Ib-AMP2、Mj-AMP2、Bn-AFPs、Sa-AFPs、およびAc-AMP1は、食品損傷真菌株に対して異なる食品添加物と併用して、精製されたタンパク質および種子抽出物として試験された。本発明者らが抗真菌タンパク質と併用された場合に抗真菌活性を増強するとして、同定した食品添加物の例は、表１に列挙され、これには異なる食材中に現在許容される最大量の指標もまた含まれる。抗真菌剤および食品添加物の比は、一般的に、本発明による組成物中の食品添加物のレベルは、許容される最大濃度よりも有意に低いものである。例えば、特定の食材に許容される最大濃度よりも、２〜100倍、より好ましくは４〜50倍、および最も好ましくは４〜10倍低いレベルで（もしくは間で）、食品添加物は組成物中に存在し得る。抗真菌剤および食品添加物は、一般的に、本発明による組成物中に存在し、そして1:0.5〜1:900000、より好ましくは1:10〜1:10000および最も好ましくは1:5 〜1:500のそれぞれの比で、本発明の方法における使用のために存在する。表１．異なるAFPと併用した場合に相乗的な抗真菌効果を有することが示される、添加物の食品中における最大許容量図の簡単な説明本発明は、以下の限定しない実施例および図に関してさらに図示される。ここで：図１はP.chrysogenumに対するIb-AMP1のNa₂H₂EDTAとの併用のイソボログラムを示す。図２はP.roquefortiiに対するAc-AMP1のソルビン酸Ｋとの併用のイソボログラムを示す。図３はP.roquefortiiに対するRs-AFP2のソルビン酸Ｋとの併用のイソボログラムを示す。図４はP.chrysogenumに対するIb-AMP1の安息香酸Naとの併用のイソボログラムを示す。図５はP.chrysogenumに対するIb-AMP1の乳酸との併用のイソボログラムを示す。図６はP.chrysogenumに対するIb-AMP1のBHAとの併用のイソボログラムを示す。図７は以下についてのアミノ酸配列を示す：Rs-AFP1、Rs-AFP2、Dm-AMP1およびD m-AMP2、Hs-AFP1、Ah-AMP1、Ct-AMP1、Bn-AFP1、Bn-AFP2、Br-AFP1、Br-AFP2、S a-AFP1、Sa-AFP2、Cb-AMP1、Cb-AMP2、Ca-AMP1、Bm-AMP1、Ace-AMP1、Ac-AMP1、 Ac-AMP2、Mj-AMP1、Mj-AMP2、Ib-AMP1、Ib-AMP2、Ib-AMP3およびIb-AMP4 発明の詳細な説明実施例材料および方法材料 Raphanus sativus、Amaranthus caudatus、Mirabllis jalapaおよびImpatiens baisaminaの種菌をChiltern Seeds(Cumbria,UK)から入手した。Brassica napus およびSinapis albaの種菌はCargill,Plc.の好意により寄付された。非滅菌の平底96ウェルマイクロプレートを本実験中にわたって使用した。安息香酸NaはPfiz er Ltd.の好意により提供された。ソルビン酸ＫをHoechstから入手した。EDTAならびにそのNa塩およびCaNa₂塩はSIGMAから購入した。抗真菌アッセイ日常的に、試験を、20μlの試験溶液および培地Ａ（半分の強度のポテトブドウ糖培養液（すなわち1/2PDB）または培地Ｂ（１mM CaCl₂および50mM KClを補充した1/2PDB）中の真菌胞子(1×10⁴胞子/ml)の80μlの懸濁液を用いて実施した。コントロールの微量培養物は20μlの滅菌蒸留水および80μlの真菌の胞子懸濁液を含んだ。別に言及しない限り、インキュベートを24℃で48時間実施した。真菌増殖のパーセンテージをインキュベーション期間後マイクロプレートの顕微鏡検査により見積もった。コントロール微量培養物を、真菌の増殖阻害を見積もるために参考として使用した。強い真菌の増殖阻害（例えば、90％を超える真菌増殖阻害）を与えるために必要とされるタンパク質または化学化合物の最低濃度を、考慮したタンパク質または化合物の最低阻害濃度(MIC)として採用した。抗真菌タンパク質の精製抗真菌タンパク質Ac-AMP1、Mj-AMP1、Rs-AFP2、Ib-AMP1およびIb-AMP2の精製を、それぞれBroekaertら(1992,Biochem.,31,4308-4314)、Brunoら(1992,J.Biol .Chem.,267,4,2228-2233)、Terrasら(1992,J.Biol.Chem.,267,22:15301-15309) およびBroekartら(公開国際特許出願第WO95/24486号)により記載されるように実施した。結果抗真菌タンパク質の抗真菌効力精製タンパク質の抗真菌効力を、上記アッセイを使用して、異なる食品損傷真菌について評価した。真菌の増殖、真菌胞子の収集および収穫を以前に記載（Br oekaertら.,1990,FEMS Microbiol.Lett.,69:55-60）のように実施した。以下の真菌株を使用した：Fusarium culmorum、Penicillium chrysogenum、Pe nicillium roquefortlii、Penicilliumcommune、Penicillium nalgiovense、Muc or plumbeus、Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus versicolor、Alterna ria sp.、Cladosporium sp.およびTrichoderma harzianum。二回、蒸留水での抗真菌タンパク質の段階希釈を、増殖培地Ａ（半分の強度のポテトブドウ糖培養液、1/2PDB）中または培地Ｂ（1mM CaCl₂および50mM KClを補充した培地Ａ）中のいずれかに調製した真菌の胞子懸濁液に適用した。増殖阻害パーセンテージを、正常な真菌増殖の参考として、抗真菌剤タンパク質を添加しない微量培養コントロールを採用して、マイクロタイタープレートの顕微鏡検査により見積もった。48時間のインキュベーション後に真菌の増殖を強く阻害するために必要な最低濃度、例えば90％を超える増殖阻害(MIC値)を、このように計算する。培地ＡおよびＢの両方においてある範囲の真菌株に対して、Ib-WPiおよびRs-A FP2について得られた結果を表２に要約する。両ペプチドは試験真菌株に対して広いスペクトル活性を示す。低イオン強度（培地Ａ）において、MIC値は一般的に、25μg/ml未満である。ペプチドの活性は、アッセイに使用されるイオン条件に感受性であり、そしてそれらの活性は高塩培地（培地Ｂ）において減少する。表２．低塩培地Ａ(1/2PDB)および培地Ｂ(1mM CaCl₂および50mM KClを含む培地Ａ中のRs-AFP2およびIb-AMP1の抗真菌活性の比較。抗真菌タンパク質および食品添加物の併用の抗真菌効力ａ）抗真菌タンパク質／EDTA併用の抗真菌の効力食品添加物EDTAは、金属カチオンをキレートするその役割の理由で、抗酸化剤として食品中に使用される。いかなる抗真菌特性も、食品中で使用される濃度ではEDTAに割り当てていない。しかし、培地Ｂ中での抗真菌タンパク質とEDTAとの併用は、試験した真菌株（Penicillium chrysogenumおよびPenicillium roquefo rtii）に対する抗真菌活性の増強をもたらした。観察されたいくつかの結果を、以下の表３に要約する。1mM CaCl₂および50mM KClを含む培地中のEDTAおよびその塩による抗真菌タンパク質の活性の増強は、個々に使用された場合に必要な濃度よりもずっと低い両薬剤の濃度で24℃で48時間のインキュベーション後、インビトロで真菌増殖の強い阻害を提供し得る。類似の方法で、抗真菌タンパク質と他の添加物との併用の食品保存への適用は、食品へ添加するこのような添加物の量において低下を可能にする。表３．培地Ｂ(1mM CaCl₂および50mM KClを含む1/2PDB)中、24℃で48時間のインキュベーション後、強い増殖阻害を与えるために必要とされる単独および併用で使用した場合の抗真菌剤の濃度ｂ）ソルビン酸Ｋの抗真菌タンパク質との併用の抗真菌効力ソルビン酸およびそのナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩は現在、防腐剤（かび抑制剤として作用する）として食材に使用されている。食品中の許容最大量を、表１に示す。ソルビン酸と抗真菌タンパク質との併用は、真菌増殖の増強した阻害を示す。インビトロ試験中において、真菌増殖を強く阻害し得るいくつかの併用の実施例を表４および５に示す。表４．培地Ｂ(1mM CaCl₂および50mM KClを含む1/2PDB)中、24℃で48時間のインキュベーション後、食品損傷株Penicillium chysogenumの強い増殖阻害を与えるために必要とされる、単独および併用で使用した場合の抗真菌タンパク質およびソルビン酸Ｋの濃度表５．培地Ｂ(1mM CaCl₂および50mM KClを含む1/2PDB)中、24℃で48時間のインキュベーション後、食品損傷株Penicillium roquefortiiの強い増殖阻害を与えるために必要とされる単独および併用で使用した場合の抗真菌タンパク質およびソルビン酸Ｋの濃度の濃度ｃ）安息香酸およびその塩とIb-AMP1およびRs-AFP2との併用の抗真菌効力安息香酸およびそのNa塩およびＫ塩は、バクテリアよりも影響を受ける酵母およびカビの抗真菌活性のため、食品防腐剤として使用されている。食品中の安息香酸およびその塩の許容最大濃度は0.1％である。その存在は、添加される食品の香味で容易に認知し得る。抗真菌タンパク質Ib-AMP1およびRs-AFP2と併用した場合の真菌増殖に対する安息香酸Naの効果を、Penicillium chrysogenumについて試験した。表６および７に要約したこの結果は、必要な安息香酸Na量の減少を助けることにより、抗真菌タンパク質の食品保存への適用のために使用され得る相乗的な抗真菌効果を明らかに示す。表６．培地Ｂ(1mM CaCl₂および50mM KClを含む1/2 PDB)中、24℃、48時間インキュベーション後、強い増殖阻害を与えるために必要とされる、単独および併用で使用した場合の抗真菌剤Ib-AMP1および安息香酸Naの濃度表７．培地Ｂ(1mM CaCl₂および50mM KClを含む1/2 PDB)中、24℃、48時間インキュベーション後、強い増殖阻害を与えるために必要とされる単独および併用で使用した場合の抗真菌剤Rs-AFP2および安息香酸Naの濃度ｄ）Penicillium chrysogenumに対する乳酸とIb-AMP1との併用の抗真菌効力乳酸は、異なる可能な適用を有する食品添加物である：酸味料、防腐剤、補助剤、香味増強剤またはふくらまし剤(raising agent)。それはGRASと考えられ、そしてADI限界を有さない。抗真菌タンパク質Ib-AMP1と併用した場合の真菌増殖に対する乳酸の効果を、P enicillium chrysogenumに対して試験した。表９に要約する結果は、２つの薬剤の併用の抗真菌の相乗効果を示す。表８．培地Ｂ(1mM CaCl₂および50mM KClを含む1/2 PDB)中、24℃、48時間インキュベーション後、強い増殖阻害を与えるために必要とされる単独および併用で使用した場合の抗真菌剤Ib-AMP1および乳酸の濃度ｅ）食品添加物と併用した種子抽出物の抗真菌効力ハツカダイコン(Raphanus sativus)、アブラナ(Brassica napus)および白カラシナ(Sinapis alba)の種子を使用して、現在使用されている食品添加物（例えば、ソルビン酸、安息香酸ナトリウムおよびEDTA)と併用することにより食品の保存に適用され得る塩基性抗真菌タンパク質に富む抽出物を調整した。塩基性タンパク質を含む抽出物は、Terrasら(J.Biol.Biochem.(1992),267,22,15301-15309) により公開されたとおり調製した。この抽出物の抗真菌活性を、顕微鏡で評価し、そして活性の単位（ここで10単位は1mlの培地中24℃48時間の真菌増殖を阻害するのに必要な抗真菌活性を表す）で表現した。以下の表に見られるとおり、塩基性タンパク画分を含む抽出物の抗真菌活性は、増殖培地(半分の強度のポテトデキストロース培養液)への1mMCaCl₂および50mM KClの添加により劇的に減少する。活性の有意な比率が、現在使用されている食品添加物（例えば、EDTA、安息香酸ナトリウムおよびソルビン酸Ｋ）をこの抽出物と併用して添加する場合、回復され得る。食品添加物による抽出物中に存在する抗真菌活性の増強は、広範囲の食品中の保存システムの一部としてのこのような併用を用いることを可能にする。表10．食用種子から入手した塩基性タンパク質画分のP.roquefortiiに対する抗真菌活性。抗真菌活性の単位は、種子のグラムあたりで表現している。異なる食品添加物による培地Ｂ中の抽出物の抗真菌活性の増強が、明らかに示された。添加物ソルビン酸Ｋおよび安息香酸Naの濃度は、食品中に許容される最大値内である。EDTAは、包装材料に抗酸化剤として添加する間接的な食品添加物である。Na₂ H₂EDTAによる類似の増強もまた観察されている。表11．ソルビン酸Ｋによるアブラナ種子塩基性タンパク質抽出物の、食品損傷性 Penicillium sppに対する、抗真菌活性の増強。抗真菌活性の単位は、種子１グラムあたりで表現する。表12．安息香酸Naによるアブラナ塩基性タンパク質抽出物の真菌の食品損傷株に対する抗真菌活性の増強。抗真菌活性の単位は、種子１グラムあたりで表現する。表13．ソルビン酸Ｋによるハツカダイコン種子塩基性タンパク質抽出物のPenici llium roquefortiiに対する抗真菌活性の増強。抗真菌活性の単位は、種子１グラムあたりで表現する。ｆ）フェノール性抗酸化剤およびIb-AMPの併用の抗真菌効力フェノール性抗酸化剤は、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、第三級ブチルヒドロキノン(TBHQ)および没食子酸プロピル( PG)を含む。この化合物は、不飽和脂質の自己酸化を防止するために食品に添加する。米国および少なくとも60の他の国々では、油および脂肪含有量あたり最大濃度の200ppmで抗酸化剤としての食品中の使用について、それらはGRASである(D avidson,P.M.(1993)Parabens and phenolic compounds.In:Antimicrobials in f oods.P.M.DavisonおよびA.L．Branen編、Marcel Dekker,Inc.New York)。食品中に許容されるこの最大濃度では、それらは食品防腐剤としては作用しないが、より高い濃度で抗バクテリアおよび抗真菌活性を示す。抗真菌タンパク質Ib-AMP1と併用して使用される低濃度のBHAの抗真菌活性を、ある範囲の食品損傷株に対してインビトロで研究した。BHAを50％エタノール中に溶解し、そして増殖培地（1mM CaCl₂および50mM KClを含む半分の強度のポテトデキストロース培養液）に添加して必要最終濃度(200,100,50および25ppm)を与えた。純粋なIb-AMP1タンパク質を試験溶液に添加し、そして上記のように真菌胞子懸濁液と混合した。接種後、このプレートを24℃で48時間インキュベートした。真菌増殖阻害を、BHAもIb-AMP1も含まないコントロールと比較して、顕微鏡で評価した。得られ結果の要約を表14に示す。表14．24℃で48時間インキュベーション後、培地Ｂ中で単独および併用で使用した場合、真菌増殖の強い阻害が可能な抗真菌タンパク質Ib-AMP1およびフェノール性抗酸化剤BHAの最小阻害濃度従って、低濃度のBHAによる抗真菌タンパク質Ib-AMP1の抗真菌活性の明白な増強が決定された。BHAを増殖培地中に単独で添加した場合、試験したBHAの最大濃度(200ppm)では、抗真菌活性は観察されなかった。類似の方法で、増殖培地への 100または200ppmのIb-AMP1の添加は、全種類ではないが数種類の試験真菌株の増殖を強く阻害するために十分であった。しかし、BHAおよびIb-AMP1の併用した適用は、試験した全ての株の増殖を強く阻害し得た。このような観察は、食品中に存在する抗酸化剤の最大許容濃度を超えずに抽出物を含む抗真菌タンパク質とGR ASフェノール性抗酸化剤とを併用することによる食品の保存を試みることを可能にする。ｇ）ソルビン酸Ｋと、キチナーゼＩおよびグルカナーゼＩとの併用の抗真菌効力酵素キチナーゼＩおよびβ-1,3-グルカナーゼは、それらを、（理想的には比率１：１の併用で）使用する場合、成長している菌糸の真菌細胞壁を分解し得る。この観察は、真菌病原体に対する植物防衛機構におけるこれらのタンパク質の役割を説明する。しかし、胞子の発芽阻害は、これらの酵素の存在によっては比較的影響されないようである。さらに、真菌の菌糸はキチナーゼＩおよびβ-1,3 -グルカナーゼの存在下で出芽する場合耐性になり得ることが観察された。これらの観察は、酵素キチナーゼＩおよびβ-1,3-グルカナーゼを含む抽出物の食品保存への適用を妨害し、ここで胞子の出芽阻害が最大に重要である。この状況において、真菌の食品損傷を防止することを試みるためにChi/Gluと食品添加物との可能な併用での適用が考えられた。キチナーゼＩおよびβ-1,3- グルカナーゼを、Sela-Buurlage,M.B.らにより1993(Plant Physiol.101,857-863 )に公開された方法に従ってタバコから抽出および精製した。精製した酵素を比率１：１で混合し、次に食品損傷性真菌株Penicillium roquefortiiおよびP.chr ysogenumに対する抗真菌活性を試験した。抗真菌アッセイは上記のように実行した。増殖阻害の評価を、24℃で48および96時間後、顕微鏡検査によって実行した。以下の表に見られるように、食品添加物ソルビン酸Ｋによる酵素の抗真菌活性の明らかな相乗的増強が観察された。96時間インキュベーション後にこの相乗効果が観られた。なぜなら、ソルビン酸Ｋ単独が明らかに48時間を超えて真菌の増殖を遅らせることはできなかったからである。実際、ソルビン酸Ｋによる真菌増殖阻害を、96時間インキュベーション後、コントロールの10〜20％のみであると見積もった。100ppmまでの酵素キチナーゼＩおよびβ-1,3-グルカナーゼの各々の存在下での真菌増殖は、コントロールの増殖と同等であった（すなわち、阻害は観察されなかった）。従って、抗真菌剤の併用での適用の効果は、ソルビン酸Ｋ単独での適用と同じであると期待された。驚いたことに、強い増殖阻害（すなわち、コントロールと比較して90％を超える強い増殖阻害）が検出された。表15．培地Ｂ(1mM CaCl₂および50mM KClを含む1/2 PDB)中、24℃での96時間インキュベーション後、食品損傷株Penicillium roquefortiiおよびP.chrysogenumの強い増殖阻害を与えるために必要とされる、単独および併用で使用した場合のタンパク質キチナーゼＩおよびグルカナーゼＩとソルビン酸Ｋの濃度上記に含まれる全ての実施例において、90％を超える増殖阻害と同等であり、単独で使用した場合の阻害濃度未満の各々の化合物を併用することにより真菌増殖の強い阻害が得られた。２つの薬剤間の相互作用の性質を評価するために、それが相加性、相乗性あるいは拮抗性の相互作用のいずれであれ、Colbyにより記載された数学的な表現が使用され得る（Colby,S.R.(1967)Calculating synergis tic and antagonistic responses of herbicide combinations.Weeds 15,20-22 ）。 Colbyの公式E₁=X₁Y₁/100において、X₁およびY₁はそれぞれ、化合物Ａ（投薬量ｐ）および化合物Ｂ（投薬量ｑ）を用ちいて、コントロールの百分率として増殖を表する。E₁は、混合物ＡおよびＢ（投薬量ｐ＋ｑ）を用ちいての、コントロールの百分率として、予想される増殖である。観察される応答(E_obs)、コントロールの百分率阻害として表現されるは、それぞれ投薬量ｐおよびｑで、２つの化合物を併用することにより得られる。観察および予想される百分率阻害応答(E_obs/ E_exp)の比較は、相乗作用(E_obs/E_exp＞1)または拮抗作用(E_obs/E_exp＜1)を示す。 Colbyの方程式を、相乗効果が観察されていることを実証するために、上記に示した表から得られたいくつかの実施例に適用した。報告されるいくつかの併用へのColbyの方程式の適用を、どのように相乗的な相互作用が同定されたかについての例とするために、以下に報告する。抗真菌活性が希釈試験を使用して測定される記載される実験において、相乗効果の存在はまた、イソボログラム(isobologram)(Parish M.E.およびDavidson P. M.(1993)Methods for evalution.Antimicrobials infoods、P.M.Davidsonおよび A.L.Branen.編Marcel Dekker,Inc.New York)を使用して決定され得る。イソボログラムは、真菌の増殖を強く阻害するために必要な２つの異なる抗真菌剤の最小阻害濃度(MIC)の図解表現である。２つの抗真菌剤の濃度を、最も低い濃度から最も高い濃度までの各座標軸に配置する。増殖を強く阻害する濃度が、各座標上の個々のMIC値を結ぶ直線におおよそ重なるとき、併用した効果は相加的である。相加直線の左への直線性の偏差は、相乗作用を意味する。いくつかの併用のイソボログラムは、Colbyの公式の適用により得られた結果を確認するために、以下に与えられる実施例に含まれる。ａ）12.5ppm Ib-AMP1と75ppm Na₂H₂EDTAとの併用培地Ｂ中のPenicillium chrysogenumの胞子懸濁液への12.5ppm Ib-AMP1の、単一の適用は、コントロールと比較した場合、100％真菌増殖をもたらした。他方では、75ppm Na₂H₂EDTAの適用は、Penicillium chrysogenumの90％増殖をもたらした。Colbyの方程式によると、予想される増殖はE₁=100×90/100=90％である。しかし、12.5ppm Ib-AMP1および75ppm Na₂H₂EDTAの存在下での観察されるP.chry sogenumの増殖を、コントロールの５％のみであると見積もった。従って、観察した応答と予想した応答との間の比率は、E_obs/E_exp=95/10=9.5であり、これは明らかにIb-AMP1およびNa₂H₂EDTA間の相乗的な相互作用を示す。ｂ）P.roquefortiiに対する、25ppm Ac-AMP1と500ppmソルビン酸Ｋとの併用培地Ｂ中のPenicillium roquefortiiの胞子懸濁液への、25ppm Ac-AMP1の単一の適用は、コントロールと比較した場合、100％真菌増殖をもたらした。500ppm ソルビン酸Ｋの単独での適用は、P.roquefortiiの90％増殖をもたらした。Colby の方程式に従うと、予想される増殖は、E₁=100×90/100=90％である。しかし、2 5ppm Ac-AMP1および500ppmソルビン酸Ｋ存在下で観察されるP.roquefortii増殖をコントロールの５％のみであると見積もった。従って、観察される応答と予想される応答との間の比率はE_obs/E_exp=95/10=9.5であり、これは明らかにAc-AMP1 とソルビン酸Ｋとの間の相乗的な相互作用を示す。ｃ）P.roquefortiiに対する、3.1ppm Rs-AFP2と500ppmソルビン酸Ｋとの併用培地Ｂ中のPenicillium roquefortiiの胞子懸濁液への3.1ppm Rs-AFP2の単一の適用は、コントロールと比較した場合、100％真菌増殖をもたらした。500ppm ソルビン酸Ｋの適用はP.roquefortiiの90％増殖をもたらした。Colbyの方程式に従うと、予測される増殖は、E₁=100×90/100=90％である。しかし、3.1ppm Rs-A FP2および500ppmソルビン酸Ｋの存在下で観察されたP.roquefortiiの増殖を、コントロールの５％のみであると見積もった。従って、観察される応答と予測される応答との間の比率はE_obs/E_exp=95/10=9.5であり、これはRs-AFP2とソルビン酸Ｋとの間の相乗的な相互作用を示す。ｄ）P.chrysogenumに対する100ppm Ib-AMP1と500ppm安息香酸Naとの併用培地Ｂ中のPenicillium chrysogenumの胞子懸濁液への100ppm Ib-AMP1の単一の適用は、コントロールとして比較した場合、100％真菌増殖をもたらした。他方では、500ppm安息香酸Naの適用は99％と見積もられるP.chrysogenumの増殖をもたらした。Colbyの方程式に従う。予想される増殖は、E₁=100×99/100=99％である。しかし、100ppm Ib-AMP1および500ppm安息香酸Naの存在下で観察されるP. chrysogenum増殖を、コントロールの５％のみであると見積もった。従って、観察される応答と予想される応答との間の比率はE_obs/E_exp=95/1=95であり、これは明らかにIb-AMP1と安息香酸Naとの間の相乗的な相互作用を示す。ｅ）P.chrysogenumに対する、200ppm Ib-AMP1と2500pp・乳酸との併用培地Ｂ中のPenicillium chrysogenumの胞子懸濁液への200ppm Ib-AMP1の単一の適用は、コントロールと比較した場合、100％真菌増殖をもたらした。他方では、2500ppm乳酸の適用は、90％と見積もられるP.chrysogenumの増殖をもたらした。Colbyの方程式に従うと、予想される増殖は、E₁=100×90/100=90％である。しかし、200ppm Ib-AMP1および2500ppm乳酸の存在下で観察されるP.chrysogenum の増殖は、コントロールの５％のみであると見積もった。従って、観察される応答と予想される応答との間の比率はE_obs/E_exp=95/10=9.5であり、これは明らかにIb-AMP1と乳酸との間の相乗的な相互作用を示す。ｆ）Ib-AMP1とBHAとの併用培地Ｂ中のPenicillium chrysogenumの胞子懸濁液への25ppm Ib-AMP1の単一の適用は、コントロールと比較した場合、100％真菌増殖をもたらした。他方では、50ppm BHAの適用は、P.chrysogenumの99％増殖をもたらした。Colbyの方程式に従うと、予想される増殖は、E1=100×99/100=99％である。しかし、25ppm Ib- AMP1および50ppm BHAの存在下で観察されるP.chrysogenumの増殖は、コントロールの５％のみであると見積もった。従って、観察される応答と予想される応答との間の比率はE_obs/E_exp=95/1=95であり、これは明らかにIb-AMP1とBHA間の相乗的な相互作用を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フェンテスマテオス，アンジェルマニュエルイギリス国アールジー42 ６イーティーバークシャー，ブラックネル，ジェロッツヒルリサーチステーション（番地なし），ゼネカアグロケミカルズ内

Claims

【特許請求の範囲】１．１つ以上の抗真菌剤および１つ以上の食品添加物を含む抗真菌組成物であって、ただし該組成物はナイシン、ラクトフェリンおよびその誘導体トリクロジアニンまたはリゾチームを含まず、該抗真菌剤および該食品添加物の相対量が該組成物の全体的な抗真菌活性を増強するための量である、抗真菌組成物。２．請求項１に記載の抗真菌組成物であって、１つ以上の前記食品添加物が抗真菌活性を示し；該抗真菌剤および該食品添加物の相対量が該組成物の全体的な抗真菌活性における相乗効果を産生するための量である、抗真菌組成物。３．前述の請求項のいずれか１つに記載の抗真菌組成物であって、金属キレート剤、溶媒、湿潤剤、補助剤、酸化防止剤、着色料、乳化剤、安定化剤、界面活性剤、漂白剤、pH調製剤、香料および香味増強剤、金属イオン封鎖剤または食品保存添加物からなる群から選択された１つ以上の抗真菌剤および１つ以上の食品添加物を含み、ただし該組成物はナイシン、ラクトフェリンおよびその誘導体、トリクロジアニンまたはリゾチームを含まず、該抗真菌剤および該食品添加物の相対量が該組成物の全体的な抗真菌活性増強するための量である、抗真菌組成物。４．前記食品添加物が、酸または塩またはそのエステル誘導体またはC1-6アルキルエーテルである、前述の請求項のいずれかに記載の抗真菌組成物。５．前記食品添加物が、EDTA、ソルビン酸、安息香酸、乳酸またはその塩またはエステル誘導体、没食子酸プロピル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエンまたはt-ブチルヒドロキノンからなる群から選択される、請求項４に記載の抗真菌組成物。６．前記抗真菌剤が、耐熱性である、請求項１に記載の抗真菌組成物。７．前記抗真菌剤が、植物またはその種子のような天然供給源から単離され得る請求項６に記載の抗真菌組成物。８．前記抗真菌剤が、食用植物またはその種子から単離され得る、請求項７に記載の抗真菌組成物。９．１つ以上の抗真菌剤が、植物またはその種子誘導体から誘導される１つ以上の該抗真菌剤、および少なくとも１つ以上の食品添加物が酸または塩またはそのエステル誘導体またはC1-6アルキルエーテルである１つ以上の該食品添加物を含む抗真菌組成物であって、該抗真菌剤および該食品添加物の相対量が該組成物の全体的な抗真菌活性を増強するための量である、抗真菌組成物。１０．１つ以上の前記の食品添加物が、抗真菌活性を示す、請求項９に記載の抗真菌組成物であって；該真菌剤および該食品添加物の相対量が該組成物の全体的な抗真菌活性における相乗効果を産生するための量である、抗真菌組成物。１１．前記食品添加物が、EDTA、ソルビン酸、乳酸、安息香酸またはその塩またはエステル誘導体、没食子酸プロピル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエンあるいはt-ブチルヒドロキノンからなる群から選択される、請求項９または請求項１０に記載の抗真菌組成物。１２．前記抗真菌剤が、耐熱性である、請求項９、請求項１０、または請求項１１に記載の抗真菌組成物。１３．前記抗真菌剤が食用種子または植物から誘導される、請求項１２に記載の抗真菌組成物。１４．前記抗真菌剤が、Brassicaceae(Cruciferae)、Compositate、Leguminosae 、Amaranthaceae、Hippocastanaceae、Saxifragaceae、GramineaeおよびAlliac eae 科に属する植物から、またはこの属：Raphanus、Heuchera、Aesculus、Clito ria、Brassica、Briza、Sinapsis、Cnicus、Allium、Amaranthus、Impatiens、M irabilisおよびCapiscumから、またはその種子誘導体に由来する、前述の請求項のいずれかに記載の抗真菌組成物。１５．１つ以上の前記抗真菌タンパク質Rs-AFP2、Rs-AFP1、Sa-AFPs、Bn-AFPs、 Mj-AMP2、Ac-AMP1、Ib-AMP1またはIb-AMP2またはその誘導体、あるいは85％を超える配列類似性、好ましくは90％を超える配列類似性、より好ましくは95％を超える配列類似性を示す抗真菌タンパク質を含む、前述の請求項のいずれかに記載の抗真菌組成物。１６．前記抗真菌剤および前記食品添加物が、それぞれ、1:0.5〜1:900000、より好ましくは1:10〜1:10000、および最も好ましくは1:5〜1:500の比で存在する、前述の請求項のいずれかに記載の抗真菌組成物。１７．前記抗真菌剤が、植物または種子抽出物の形態である、前述の請求項のいずれかに記載の抗真菌組成物。１８．食材中の真菌増殖を阻害する方法であって、該増殖が阻害される環境を、前述の請求項のいずれかに記載の抗真菌組成物の殺真菌的に有効な量に暴露する工程を包含する、方法。１９．食材中の真菌増殖を阻害する方法であって、食材にまたは食材の所在に、前述の請求項のいずれか１つに記載の抗真菌組成物の殺真菌的に有効な量を適用する工程を包含する、方法２０．抗真菌剤の抗真菌的な性質を増強するための食品添加物の使用。２１．前記食品添加物が、酸または塩またはそのエステル誘導体またはC1-6アルキルエーテルである、請求項２０に記載の食品添加物の使用。２２．前記食品添加物が、EDTA、ソルビン酸、乳酸、安息香酸またはその塩またはエステル誘導体、没食子酸プロピル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエンあるいはt-ブチルヒドロキノンからなる群から選択される、請求項２１に記載の食品添加物の使用。２３．前記抗真菌剤が請求項１２〜１５および１７のいずれか1つにおいて定義されると同様である、請求項２０、２１、または２２に記載の食品添加物の使用。２４．前記抗真菌剤および前記食品添加物が、それぞれ、1:0.5〜1:900000、より好ましくは1:10〜1:10000、および最も好ましくは1:5〜1:500の比で存在する、前述の請求項のいずれかに記載の食品添加物の使用。