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JP2002505889A - 核酸の検出 - Google Patents

核酸の検出

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Publication number
JP2002505889A
JP2002505889A JP2000535775A JP2000535775A JP2002505889A JP 2002505889 A JP2002505889 A JP 2002505889A JP 2000535775 A JP2000535775 A JP 2000535775A JP 2000535775 A JP2000535775 A JP 2000535775A JP 2002505889 A JP2002505889 A JP 2002505889A
Authority
JP
Japan
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nucleic acid
phosphate
reaction
adenosine
probe
Prior art date
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Pending
Application number
JP2000535775A
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English (en)
Inventor
シュルツ，ジョン・ダブリュー
マンレカー，マイケル・エイ
ライペ，ドナ・エム
ルイス，マーティン・ケイ
ネルソン，リサ・エス
Original Assignee
プロメガ・コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/042,287 external-priority patent/US6335162B1/en
Application filed by プロメガ・コーポレーション filed Critical プロメガ・コーポレーション
Publication of JP2002505889A publication Critical patent/JP2002505889A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定の核酸配列を検出し、配列内の特定の塩基の同定の疑問を問い（interrogating）、そしてエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性をアッセイするための方法を開示する。ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせる。標的配列に相補なプローブを脱重合するが、疑問位置において標的とは異なるプローブは脱重合させない。上記核酸検出系は、様々なポリメラーゼにより触媒されるピロリン酸分解を利用することにより、デオキシリボヌクレオシド３リン酸またはリボヌクレオシド３リン酸を生成する。ＮＤＰＫの作用によりｄＮＴＰｓをＡＴＰにトランスフォームする。これらの反応により生成されたＡＴＰはルシフェラーゼ検出系またはＮＡＤＨに基づく検出系により検出される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、分子生物学の分野、特に核酸および細胞の検出に関する。本発明は
、ごく少量の核酸、特定の核酸、特定の核酸配列、特定のヌクレオチド配列およ
び細胞内物質の検出に関する方法ならびに組成物を包含する。 発明の背景 多量の組換えタンパク質を生成する方法が良く知られている。組換えタンパク
質工業が発達したため、様々な品質管理アッセイが必要になった。例として、組
換えタンパク質調製物中に存在する核酸の定量が必要である。最近のＦＤＡガイ
ドラインは、治療用組換えタンパク質内に存在する核酸量が組換えタンパク質の
毎日の投与量当たり１０ｐｇより少ないＤＮＡ量であることを、要求している。
それ故、ごく少量の核酸を検出する方法が必要とされる。また、そのような方法
は、法廷用、医療用および農業用サンプル内の核酸の定量への広範の使用が認め
られる。
【０００２】 低レベルの核酸を検出するいくつかの方法が報告されている。一つの方法は、
古典的ハイブリダイゼーション技術に基づいている。この方法では、興味ある核
酸と結合する放射能標識した核酸プローブが用いられる。しかしながら、この方
法には、乏しい再現性、大量の放射性試薬の廃棄、および非特異的結合によるバ
ックグラウンドレベルの高さを含む、いくつかの欠点がある。さらに、一般的に
、この技術は少量の未知配列核酸の存在決定には不適当である。
【０００３】 核酸を検出する第二の方法は、核酸内への挿入能力を持つ蛍光染料を用いる。
しかしながら、界面活性剤、タンパク質および脂質のような数多くの干渉物質は
、この方法によって生成するシグナルの再現性に影響を与える。
【０００４】 低レベルのＤＮＡを検出する第三の方法は、試薬としてビオチニル化された一
本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）(single-stranded DNA binding protein)
、ストレプトアビジン、ウレアーゼに融合させた抗ＤＮＡ抗体、およビオチニル
化ニトロセルロースを用いる。このアッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉ
ｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から市販されており、Ｋｕｎｇら、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８７，２２０−２７、１９９０、に記載されている。
アッセイは、ストレプトアビジン、ビオチン−ＳＳＢ、および抗ＤＮＡ抗体を共
にインキュベートし、複合体を形成させることによって、成し遂げられる。次い
で、複合体をビオチニル化膜上に捕獲し、洗浄し、そして捕獲されたウレアーゼ
の量を定量する。この方法は、感度が高いが、高価な試薬および広範な対照の必
要性を含む、いくつかの欠点を持つ。
【０００５】 ポリヌクレオチドポリメラーゼは、細胞内での核酸合成の原因である。また、
この反応の逆反応、核酸の脱重合は、リン酸の存在下（リン酸分解）またはピロ
リン酸存在下（ピロリン酸分解）で起こりうる。ピロリン酸分解を行うと報告さ
れている酵素には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ［ＤｅｕｔｓｃｈｅｒおよびＫｏ
ｒｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４（１１），３０１９−２８、
１９６９］、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，３０，５２６−３７、１９９１；ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，８３２２−２８、１９９０）、大腸菌ＲＮ
Ａポリメラーゼ（Ｒｏｚｏｖｓａｙａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２４，６４
５−５０、１９９４）、ＡＭＶおよびＲＬＶ逆転写酵素（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ
およびＭｏｄａｋ、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２５５，２０００−４、１９８０
）およびＨＩＶ逆転写酵素（Ｚｉｎｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
９，２４１９５−２０２、１９９４）が含まれる。
【０００６】 合衆国特許第４，７３５，８９７号には、ポリアデニル化メッセンジャーＲＮ
Ａ［ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ］を検出する方法が記載されている。リン酸存在下でポ
リ（Ａ）ｍＲＮＡの脱重合すると、ＡＤＰを形成し、ピルビン酸キナーゼまたは
クレアチンホスホキナーゼによってＡＴＰに変換されうることが、示されている
。また、ＲＮＡをリボヌクレアーゼによってＡＭＰに消化し、アデニル酸キナー
ゼによってＡＤＰに変換し、さらにピルビン酸キナーゼによってＡＴＰに変換す
ることもできる。そのようにして生成したＡＴＰを、ルシフェラーゼ検出システ
ムによって検出する。ＡＴＰおよび酸素の存在下で、ルシフェラーゼは、ルシフ
ェリンの酸化を触媒して発光するので、その光を発光計(luminometer) を用いて
測定することができる。反応のさらなる生成物は、ＡＭＰ、ピロリン酸およびオ
キシルシフェリンである。
【０００７】 また、全生物体内にはＡＴＰ生成酵素が存在するので、合衆国特許第５，６４
８，２３２号に記載のように、サンプル内の混入細胞の存在または量を検出する
ために、ルシフェラーゼシステムを用いることが可能である。例えば、ＡＤＰを
、混入細胞を含むと予想されるサンプルに加える。ＡＤＰは細胞内酵素によって
ＡＴＰに変換され、上記の方法に従ってルシフェラーゼアッセイによって検出す
ることができる。この方法の主な欠点は、ＡＤＰ基質が比較的不安定であること
である。
【０００８】 ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、特定核酸の検出に周知の方法である。ＰＣ
Ｒでは、２つのプライマーが用いられ、その一つは、ＤＮＡ標的のセンス鎖とハ
イブリダイズし、もう一つは、ＤＮＡ標的のアンチセンス鎖とハイブリダイズす
る。ＤＮＡを加熱によって変性させると一本鎖が得られ、プライマーはそれぞれ
の鎖とハイブリダイズすることが出来る。次いで、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ
ｓを用いて、標的鎖の配列に基づいた、プライマーから伸長された、新たなＤＮ
Ａ鎖が合成される。サイクルと繰り返すと、結果として、２つのプライマーによ
ってその５’末端および３’末端に結合したＤＮＡ生成物が増幅される。ＰＣＲ
は非常に敏感であるが、前もって増幅させた生成物からの混入物は、臨床適応へ
のその有用性を制限することがある。また、それは、未知配列の核酸の検出への
使用を制限する。
【０００９】 この技術分野で必要なのは、広範なサンプル内の非常に低レベルの核酸、特定
核酸、細胞および細胞内物質を検出する、信頼性の高い、価格的に有効な方法で
ある。 本発明の要約 組換え法によって生成されたタンパク質の品質管理アッセイが必要である。最
近のＦＤＡガイドラインは、組換えタンパク質調製物は、１０ｐｇより多い核酸
を含んではならないと、提議している。また、法廷サンプル内のごく低レベルの
核酸を定量できる必要もある。それ故、少量の核酸および少数の細胞または細胞
内物質を検出する方法を提供することが、本発明の一つの目的である。核酸検出
用組成物および核酸検出用キットを提供することもまた、本発明の一つの目的で
ある。
【００１０】 本発明は、少量のＤＮＡ、ＲＮＡおよび細胞を検出する新規の方法を開示する
。これらの方法は、次の反応：核酸のピロリン酸分解または酵素分解；ｄＮＴＰ
ｓのＡＴＰへの変換；ＡＭＰのＡＴＰへの直接変換；感度を上げるためのＡＴＰ
の増幅；およびオリゴヌクレオチドプローブの脱重合：の新規の組み合わせなら
びに最適化を利用している。
【００１１】 本発明の一つの実施態様では、ピロリン酸、ＡＤＰまたはその組み合わせを含
む、反応物中のＤＮＡを検出するための方法が提供される。いくつかの実施態様
において、方法は、制限するつもりはないが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａ
ｑポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、クレノーｅｘｏ（−）、ＡＭＶ
逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素を含む、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写
酵素の様な鋳型依存性ポリメラーゼによって触媒される次の反応： ＤＮＡn＋ＰＰi→ＤＮＡn-1＋ｄＮＴＰ ：に従って、ピロリン酸存在下で末端ヌクレオシド内ホスホジエステル結合を酵
素的に切断することによって、末端ヌクレオチドで核酸（ＮＡ）(nucleic acid)
を脱重合し、ｄＮＴＰを形成することを含む。いくつかの実施態様（例えば核酸
の定量アッセイ）では、脱重合段階が、実質上、終了するまで、または平衡にな
るまで繰り返し、少なくとも２つのヌクレオシド３リン酸分子を少なくとも３つ
のヌクレオチド鎖から得る。代わりの実施態様（例えばＤＮＡの定性検出）では
、シグナルを生成するために充分な核酸分子が存在するのであれば、脱重合段階
を繰り返す必要はない。さらなる実施態様では、次段階は、次の反応： ｄＮＴＰ* ＋ＡＤＰ→ｄＮＤＰ＋ＡＴＰ* （ヌクレオシド２リン酸キナーゼによって触媒され、式中、Ｐ* はその結果転移
された末端５’リン酸である）：に従って、ｄＮＴＰ分子から５’末端リン酸基
をＡＤＰ分子へ酵素的に転移して、ＡＴＰを形成することを含む。いくつかの好
ましい実施態様では、最終段階は、ルシフェラーゼ検出システムまたはＮＡＤＨ
検出システムのいずれかによる、ＡＴＰの検出である。所望であれば、脱重合段
階およびリン酸転移段階は、単一ポット反応で行うことができる。より高い感度
を所望する特に好ましい実施態様では、リン酸転移段階によって生成されるＡＴ
Ｐ分子または脱重合段階で生成されるｄＮＴＰｓを増幅して、多数のＡＴＰ分子
を形成させる。
【００１２】 また、本発明は、ピロリン酸を含む反応物中のポリ（Ａ）ｍＲＮＡを検出する
方法を提供する。いくつかの実施態様では、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）
ポリメラーゼによって触媒される次の反応： ＮＡn ＋ＰＰi → ＮＡn-1 ＋ＡＴＰ： に従って、最初に、末端ヌクレオシド内ホスホジエステル結合をピロリン酸存在
下で酵素的に切断することによって、末端ヌクレオチドで脱重合されて、遊離Ａ
ＴＰ分子を形成する。ＲＮＡの定量アッセイのような代わりの実施態様では、脱
重合段階を、実質上終了するまでまたは平衡化するまで繰り返すと、最少で３つ
のヌクレオチド鎖から少なくとも２つのヌクレオシド３リン酸分子が提供される
。ＲＮＡの定性検出のようなその他の代わりの実施態様では、シグナルを生成す
る充分な核酸分子が存在するならば、脱重合段階を繰り返す必要はない。好まし
い実施態様では、そのようにして形成されたＡＴＰ分子を、次に、ルシフェラー
ゼ検出システムまたはＮＡＤＨ検出システムのいずれかで検出する。特に好まし
い実施態様では、反応感度は、ＡＴＰ分子を所望により増幅することにより、高
められる。
【００１３】 また、本発明は、ピロリン酸またはＡＤＰ、またはその組み合わせを含む反応
物中のポリ（Ａ）ｍＲＮＡを選択的に検出する方法を提供する。一つの実施態様
では、相補的オリゴ（ｄＴ）プローブをポリ（Ａ）ｍＲＮＡにハイブリダイズし
、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリドを形成する。さらなる実施態様では、次にＲＮＡ−
ＤＮＡハイブリッドのオリゴ（ｄＴ）鎖を、逆転写酵素または逆転写酵素活性を
持つポリメラーゼによって触媒される次の反応： ＴＴn ＋ＰＰi →ＴＴn-1 ＋ｄＴＴＰ ：に従って、ピロリン酸存在下で末端ヌクレオシド内ホスホジエステル結合を酵
素的に切断することによって末端ヌクレオチドで脱重合し、ｄＴＴＰを形成させ
る。核酸の定量アッセイのような代わりの実施態様では、脱重合段階を、実質上
終了または平衡化するまで繰り返すと、最少で３つのヌクレオチド鎖から少なく
とも２つのオリゴヌクレオシド３リン酸分子が得られる。ＲＮＡの定性検出のよ
うなその他の代わりの実施態様では、シグナルを生成するに充分な核酸分子が存
在するならば、脱重合段階を繰り返す必要はない。いくつかの好ましい実施態様
では、ｄＴＴＰからのリン酸基を、ＮＤＰＫによって触媒される次の反応： ｄＴＴＰ* ＋ＡＤＰ→ ｄＴＤＰ＋ＡＴＰ* （式中、Ｐ* は、結果として転移される５’末端リン酸である）：に従って、Ａ
ＤＰ分子に酵素的に転移し、ＡＴＰ分子を形成する。好まし実施態様では、その
ようにして形成されたＡＴＰを、ルシフェラーゼ検出システムまたはＮＡＤＨ検
出システムによって検出する。高い感度を所望する場合の特に好ましい実施態様
では、ｄＴＴＰの末端リン酸をＡＤＰに転移して、上記のようにＡＴＰを形成し
、次に、得られたＡＴＰを増幅させる。
【００１４】 その他の実施態様では、本発明はまた、ＰＲＰＰ、ＡＤＰまたはその組み合わ
せを含む反応物中のＤＮＡを検出する方法を提供する。一つの実施態様では、遊
離ｄＮＭＰ分子を、５’リン酸を含むヌクレオチドを遊離するヌクレアーゼで消
化することによって、核酸から生成する。その他の実施態様では、次に、ＰＲＰ
Ｐ合成酵素によって触媒される次の反応： ｄＡＭＰ＋ＰＲＰＰ→ｄＡＴＰ＋リボース-５'−ＰＯ4 ：に従って、ピロリン酸基をＰＲＰＰ分子からｄＡＭＰ分子に酵素的に転移し、
ｄＡＴＰ分子を形成する。もう一つの実施態様では、ＮＤＰＫによって触媒され
る次の反応： ｄＡＴＰ* ＋ＡＤＰ→ ｄＡＤＰ＋ＡＴＰ* （式中、Ｐ* はその結果転移された５’末端リン酸である）：に従って、ｄＡＴ
Ｐ分子からの５’末端リン酸基を、ＡＤＰ分子に酵素的に転移し、ＡＴＰ分子を
形成させる。特に好ましい実施態様では、そのようにして生成されたＡＴＰを、
ルシフェラーゼ検出システムまたはＮＡＤＨ検出システムで検出する。さらにも
う一つの本発明の実施態様では、ピロリン酸転移段階およびリン酸転移段階を、
単一ポット反応で行う。その他の好まし実施態様では、高感度を要求する場合、
ＡＴＰ分子を増幅する。
【００１５】 さらなるその他の実施態様では、本発明は、ＰＲＰＰを含む反応物中のＲＮＡ
を検出する方法を提供する。本発明の好ましい実施態様では、ヌクレアーゼでＲ
ＮＡを消化することによって、ＡＭＰのような遊離のＮＭＰ分子を生成する。そ
の他の実施態様では、ＰＲＰＰ合成酵素によって触媒される次の反応： ＮＭＰ＋ＰＲＰＰ→ ＮＴＰ＋リボース−５'-ＰＯ4 ：に従って、ＰＲＰＰ分子からのピロリン酸分子を、ＮＭＰ分子に酵素的に転移
し、ＡＴＰのようなＮＴＰ分子を形成させる。特に好ましい実施態様では、その
ようにして生成したＡＴＰを、次に、ルシフェラーゼ検出システムまたはＮＡＤ
Ｈ検出システムによって検出する。その他の実施態様では、より高い感度が要求
される場合、そのようにして生成されたＡＴＰを増幅させる。
【００１６】 もう一つの実施態様では、本発明は、サンプル中に存在する細胞および細胞物
質の存在ならびに／または量を決定する方法を提供する。本発明のいくつかの実
施態様では、細胞の内容物を放出させて、細胞溶解物を形成させる。その他の実
施態様では、次に、リン酸ドナー分子（Ｄ−Ｐ）(phosphate donor molecules)
およびＡＭＰ分子を細胞溶解物に加えると、その結果、細胞溶解物中に存在する
内因性酵素によって触媒される次の反応： Ｄ−Ｐ＋ＡＭＰ → Ｄ＋ＡＤＰ ：の様に、ＡＤＰ分子が、ドナーからのリン酸基をＡＭＰに酵素的に転移するこ
とによって生成される。好ましい実施態様では、細胞溶解サンプル内に存在する
内因性酵素によって触媒される次の反応： Ｄ−Ｐ＋ＡＤＰ → Ｄ＋ＡＴＰ： に従って、次にドナー分子からのリン酸をアデノシン−５’−２リン酸分子に酵
素的に転移することによって、ＡＴＰを生成させる。特に好ましい実施態様では
、次に、そのようにした生成したＡＴＰを、ルシフェラーゼ検出システムまたは
ＮＡＤＨ検出システムによって検出する。本実施態様のリン酸ドナーは、ｄＣＴ
Ｐ、ｃＧＴＰまたはｄＴＴＰのいずれかであることが出来る。
【００１７】 本発明のその他の実施態様では、ＤＮＡ、ピロリン酸およびＡＤＰからＡＴＰ
を生成する組成物を提供する。好ましい実施態様では、この組成物は、ＡＴＰ生
成を触媒するに充分な濃度、おおよそピコグラムからミクログラムのＤＮＡ量を
提供するＮＤＰＫおよび核酸ポリメラーゼの混合物を含む。
【００１８】 さらなるその他の実施態様では、本発明はまた、ＤＮＡ、ＰＲＰＰおよびＡＤ
ＰからＡＴＰを生成するための組成物を提供する。好まし実施態様では、この組
成物は、ＡＴＰの生成を触媒するおおよそピコグラムからミクログラムのＤＮＡ
量の充分な濃度中にＰＲＰＰ合成酵素およびＮＤＰＫの混合物を含む。
【００１９】 もう一つの実施態様では、本発明は、様々な核酸検出用キットを提供する。一
つの実施態様では、ピロリン酸分解によってＤＮＡまたはＲＮＡを検出するため
の試薬を含むキットが提供される。もう一つの実施態様では、キットは、核酸ポ
リメラーゼを含むベッセルおよびＮＤＰＫを含むベッセルを含む。好ましい実施
態様では、核酸ポリメラーゼおよびＮＤＰＫを同一容器内に提供する。もう一つ
の実施態様では、ヌクレアーゼ消化によって核酸を検出するための試薬を含むキ
ットが提供される。いくつかの実施態様では、キットは、ＰＲＰＰ合成酵素を含
むベッセルおよびヌクレアーゼを含むベッセルを含む。その他の実施態様では、
ピロリン酸分解によってＲＮＡを検出するための試薬を含むキットが提供される
。その他の実施態様では、キットは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを含むベッセルを
含む。さらなるその他の実施態様では、ヌクレアーゼ消化によってＤＮＡを検出
するための試薬を含むキットが提供される。一つの実施態様では、キットは、Ｐ
ＲＰＰ合成酵素を含むベッセルとヌクレオシド２リン酸キナーゼを含むベッセル
を含む。その他の実施態様では、ＰＲＰＰ合成酵素とＮＤＰＫは、所望により、
同一容器内に提供される。いくつかの実施態様では、キットは使用指示書を含む
。
【００２０】 本発明のさらなる実施態様では、上記のキットは、プライマー−仲介特異的核
酸検出用のプライマーまたはプローブを含むことが出来る。いくつかの実施態様
では、キットは、興味ある核酸を検出するための少なくとも一つの核酸プローブ
を含む。その他の実施態様では、キットは、複数の核酸プローブを含み、そのそ
れぞれが少なくとも一つの疑問位置に異なる塩基を含むことが出来る。その他の
実施態様では、キットは、異なる種または対立遺伝子からの核酸、またはポイン
トミューテーションまたは欠失あるいは挿入変異を検出するのに有用な核酸、に
対する複数のプローブを含む。個々の特に好まし実施態様では、キットは、一つ
以上の塩基対が異なる２つの相同核酸を識別するため、および核酸が欠失または
挿入変異を含むか否かを決定するため、核酸内での特異的塩基の同一性の調査に
用いられる指示書を含む。
【００２１】 さらに、本発明の実施態様は、サンプル中の細胞および／または細胞物質を検
出する試薬を含むキットを提供する。いくつかの実施態様では、キットは、ＡＭ
Ｐを含むベッセルとルシフェラーゼによって用いられない高エネルギーリン酸ド
ナーを含むベッセルを含む。その他の実施態様では、キットは、使用指示書を含
む。
【００２２】 また、本発明は、アデノシン−５’−１リン酸分子、高エネルギーリン酸ドナ
ー分子またはその組み合わせを含む反応物中のヌクレオシド３リン酸分子を増幅
する方法を提供する。いくつかの実施態様では、サンプル中に存在するヌクレオ
シド３リン酸分子（ＸＴＰ）からの５’末端リン酸基を、ヌクレオシド１リン酸
キナーゼまたはアデニル酸キナーゼのいずれかであることができる第一の酵素に
よって触媒される次の反応： ＸＴＰ＋ＡＭＰ→ＸＤＰ＋ＡＤＰ： に従って、サンプルに加えられたＡＭＰ分子に酵素的に転移し、ＡＤＰ分子およ
びヌクレオシド２リン酸分子（ＸＤＰ、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌ
クレオシド２リン酸のいずれか）を形成する。その他の実施態様では、第一の酵
素では用いられ得ない高エネルギーリン酸ドナー分子（Ｄ−Ｐ）からのリン酸を
、ＮＤＰＫまたはピルビン酸キナーゼによって触媒される次の反応： ＡＤＰ＋Ｄ−Ｐ→ＡＴＰ＋Ｄ ：に従って、アデノシン−５’−２リン酸分子に酵素的に転移し、アデノシン−
５’−３リン酸分子を形成する。次に、これらの二つの段階を、所望レベルの増
幅が達成されるまで、繰り返す。好ましい実施態様では、高エネルギーリン酸ド
ナーは、ＮＤＰＫではｄＣＴＰまたはＡＭＰ−ＣＰＰから、ピルビン酸キナーゼ
ではＰＥＰから選択される。
【００２３】 さらなるもう一つの実施態様では、本発明はまた、単一のポット反応で、ピロ
リン酸、またはＡＭＰ、または高エネルギーリン酸ドナー、またはその組み合わ
せを含む反応物中の、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する方法を提供する。一つの実
施態様では、ポリメラーゼによって触媒される次の反応： 反応１： ＮＡn ＋ＰＰi → ＮＡn-1 ＋ＸＴＰ ：に従って、ピロリン酸分子の存在下で末端ヌクレオシド内ホスホジエステル結
合を酵素的に切断することによって、核酸を末端ヌクレオチドで脱重合し、遊離
のリボヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド３リン酸分子（ＸＴＰ）を形成
する。その他の実施態様では、脱重合段階を繰り返し、少なくとも２つのヌクレ
オシド３リン酸分子を得る。いくつかの実施態様では、次に、第一の酵素によっ
て触媒される反応： 反応２： ＸＴＰ＋ＡＭＰ→ＸＤＰ＋ＡＤＰ ：に従って、反応１で形成されたＸＴＰ分子からＡＭＰ分子に５’末端リン酸基
を酵素的に転移することによってＸＴＰ分子を増幅し、ＡＤＰ分子およびヌクレ
オシド５'-２リン酸分子（ＸＤＰ）を生成する。他の実施態様では、高エネルギ
ーリン酸ドナー分子からのリン酸基は、第一の酵素の基質ではないが、第二のホ
スホトランスフェラーゼ酵素によって触媒される反応： 反応３： ＡＤＰ＋Ｄ−Ｐ → ＡＴＰ＋Ｄ ：に従って、反応２で生成したＡＤＰ分子に酵素的に転移され、ＡＴＰ分子を生
成する。
【００２４】 好ましい実施態様では、２つの増幅段階を、所望レベルの増幅が得られるまで
繰り返す。代わりの実施態様では、この方法での酵素１はアデニル酸キナーゼま
たはヌクレオシド１リン酸キナーゼのいずれかであることが出来、これに対して
、酵素２はピルビン酸キナーゼまたはＮＤＰＫのいずれかであることが出来る。
【００２５】 本発明のもう一つの態様は、核酸サンプル中の少なくとも一つの標的核酸内の
少なくとも一つの特定の塩基の同一性を調査する方法を提供する。これらの実施
態様では、ハイブリダイズした核酸プローブ−標的核酸複合体が提供される。複
合体は、その配列が同定されるべき少なくとも一つの塩基を含む核酸標的、なら
びに、標的核酸配列と実質上相同な配列を含み、疑問位置に少なくとも一つのあ
らかじめ決定されたヌクレオチドを含む核酸プローブを含み、その中に、同定さ
れる少なくとも一つの塩基を疑問位置であらかじめ決定されたヌクレオチドとア
ラインする。核酸プローブを鋳型特異的ポリメラーゼで脱重合し、ヌクレオチド
を遊離させる。次に、遊離したヌクレオチドを検出する。
【００２６】 好ましい実施態様では、本発明は、核酸サンプル中の少なくとも一つの標的核
酸内の少なくとも一つの特定塩基の同一性を調査する方法を提供する。一つの実
施態様では、少なくとも一つの核酸プローブおよび標的核酸を含むと予想させる
サンプルを提供する。好ましい実施態様では、標的核酸およびプローブ核酸は、
ＲＮＡまたはＤＮＡであることが出来、標的核酸は、同定されるべき少なくとも
一つの塩基を含み、プローブは、標的核酸に実質上相補的であり、疑問位置に少
なくとも一つのあらかじめ決められたヌクレオチドを含む。本発明の特に好まし
実施態様では、疑問位置は、核酸プローブの３’末端塩基の６つの塩基内にある
。核酸プローブと標的核酸をハイブリダイズすると、核酸プローブ−標的核酸複
合体が形成される。複合体では、疑問位置でのあらかじめ決定したヌクレオチド
を、標的核酸内で同定された塩基とアラインしアニールするか、または対合させ
る。特に好ましい実施態様では、前記プローブを脱重合しヌクレオチドを遊離す
るような条件下で、複合体を処理する。いくつかの好ましい実施態様では、脱重
合は、限定するつもりはないが、クレノーｅｘｏ（−）ポリメラーゼ、Ｔａｑポ
リメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素を含む、少なくとも一
つの鋳型依存性ポリメラーゼによって触媒される。本発明のいくつかの実施態様
では、遊離したヌクレオチドを検出する。本発明の特に好ましい実施態様では、
同定される塩基の同一性を決定する。本発明のその他の特に好ましい実施態様で
は、ルシフェラーゼまたはＮＡＤＰＨ検出システムのいずれかを用いて、ＡＴＰ
を検出する。
【００２７】 さらなるその他の実施態様では、本発明の方法を、第一プローブ、第二プロー
ブ、第三プローブおよび第四プローブで実施する。本発明の好ましい実施態様で
は、第一プローブの疑問位置にはデオキシアデノシン残基およびアデノシン残基
からなる基から選択される核酸残基が含まれ、第二プローブの疑問位置にはウリ
ジン残基およびデオキシチミジン残基からなる基から選択される核酸残基が含ま
れ、第三プローブの疑問位置にはデオキシグアノシンおよびグアノシン残基から
なる基から選択される核酸残基が含まれ、そして、第四の核酸プローブにはデオ
キシシトシンおよびシトシン残基からなる基から選択された核酸残基が含まれる
。特に好ましい実施態様では、本発明の方法を個々の別個のプローブで繰り返し
、得られた結果を、プローブ核酸の疑問位置に相当する標的核酸内の位置の塩基
を同定するために、比較する。陽性の結果（例えば、対照サンプル以上の強い光
単位によって示されるような）は、同定された塩基と疑問位置の残基の相補性を
証明する。このように、このシステムを用いると、核酸の塩基を同定することが
出来る。
【００２８】 本発明のさらなるもう一つの実施態様では、核酸プローブ−標的核酸複合体を
、反応： プローブＮＡn ＋ＰＰi → プローブＮＡn-1 ＋ＸＴＰ ：に従って、末端ヌクレオシド内ホスホジエステル結合を酵素的に消化し、ピロ
リン酸存在下で遊離ＸＴＰ分子を形成することによって、プローブ末端ヌクレオ
チドでの複合体の脱重合を許す条件に晒す。特に好ましい実施態様では、ヌクレ
オシド３リン酸分子からの末端５’リン酸基を、次の一般反応： ＸＴＰ* ＋ＡＤＰ → ＸＤＰ＋ＡＴＰ* （式中Ｐ* はその結果転移された５’末端リン酸である）：に従って、ＡＤＰ分
子に酵素的に転移し、ＡＴＰを形成する。
【００２９】 本発明のもう一つの望ましい実施態様は、サンプル内の実質的に同一の核酸を
識別する方法を提供する。本発明の特に好ましい実施態様では、実質的に同一の
核酸は、異なる種からの対立遺伝子または相同の核酸であることが出来る。一つ
の実施態様では、少なくとも一つのヌクレオチド内のあらかじめ決められた位置
にミスマッチを持つ同一領域を共有する少なくとも２つの標的核酸を含むと予想
させるサンプルが提供される。さらに、同一の標的核酸領域と実質的に相補的で
ある少なくとも一つの核酸プローブを提供する。代わりの好ましい実施態様では
、少なくとも一つのハイブリダイズした核酸プローブ−核酸標的複合体を提供す
る。
【００３０】 特に好ましい実施態様では、プローブは、疑問位置に、標的核酸の一つの同一
領域内のあらかじめ決められた位置のヌクレオチドと相補的である少なくとも一
つのヌクレオチドを含む。好ましい実施態様では、標的核酸およびプローブ核酸
は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであることが出来る。本発明のもう一つの特
に好ましい実施態様では、疑問位置は、前記核酸プローブの３’末端塩基から１
０塩基の内にある。核酸プローブおよび標的核酸をハイブリダイズすると、核酸
プローブ−標的核酸複合体が形成される。複合体では、疑問位置のあらかじめ決
められたヌクレオチドを、標的核酸内の同一領域内にあるミスマッチ位置に存在
するヌクレオチド残基とアラインする。特に好ましい実施態様では、前記のプロ
ーブを脱重合してヌクレオチドを遊離するような条件下で、複合体を処理する。
いくつかの好ましい実施態様では、脱重合は、制限するつもりはないが、クレノ
ーｅｘｏ（−）ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｎ
ｅポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素を含む、鋳型依存
性ポリメラーゼによって触媒される。本発明のいくつかの実施態様では、遊離さ
れたヌクレオチドを検出する。本発明の特に好ましい実施態様では、同定された
塩基の同一性を決定する。本発明の特に好ましい実施態様では、ルシフェラーゼ
またはＮＡＤＨ検出システムのいずれかを用いてＡＴＰを検出する。
【００３１】 さらなるその他の実施態様では、第一プローブおよび第二プローブが提供され
る。第一プローブは、あらかじめ決定された位置の第一標的核酸と相補的である
ヌクレオチドを疑問位置に含み、第二プローブは、あらかじめ決定された位置の
第二の標的核酸と相補的であるヌクレオチドを疑問位置に含む。代わりの好まし
い実施態様では、第一核酸プローブ−核酸標的複合体および第二核酸プローブ−
標的核酸複合体が提供される。第一の複合体は、第一核酸標的にハイブリダイズ
した第一核酸プローブを含み、前記の第一核酸プローブは第一核酸標的のあらか
じめ決められた位置のヌクレオチド残基に対して疑問位置で相補的である。第二
の複合体は、第二の核酸標的とハイブリダイズさせた第二核酸プローブを含み、
前記の第二核酸プローブは、第二核酸標的のあらかじめ決められた位置のヌクレ
オチド残基に対して疑問位置で相補的である。特に好ましい実施態様では、方法
をそれぞれのプローブ毎に繰り返し、サンプル内に存在する特定の標的核酸を同
定するために結果を比較した。正の結果（例えば対照サンプル以上の高い光単位
を示すような）は、同定される塩基に対する疑問位置の残基の相補性を証明して
いる。
【００３２】 本発明のさらなるもう一つの実施態様では、核酸プローブ−標的核酸複合体を
、、反応： プローブＮＡn ＋ＰＰi → プローブＮＡn-1＋ＸＴＰ ：に従って、末端ヌクレオシド内ホスホジエステル結合をピロリン酸存在下で酵
素的に切断し、遊離のＸＴＰ分子を形成することによって、プローブ末端ヌクレ
オチドでプローブ核酸−標的核酸複合体の脱重合を許す条件に晒す。特に好まし
い実施態様では、ヌクレオシド３リン酸分子からの５’末端リン酸基を、次の一
般反応： ＸＴＰ* ＋ＡＤＰ → ＸＤＰ＋ＡＴＰ* （式中、Ｐ* はそのようにして転移された５’末端リン酸である）：に従って、
ＡＤＰ分子に酵素的に転移し、ＡＴＰを形成する。
【００３３】 本発明のもう一つの実施態様では、サンプル内のエンドヌクレアーゼおよびエ
キソヌクレアーゼを検出する方法が提供される。一つの好ましい実施態様では、
エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを含むと予想される溶液が提供さ
れる。核酸基質を溶液に加え、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼが
核酸に作用するに充分な時間、混合物をインキュベートする。特に好ましい実施
態様では、二本鎖核酸が基質として用いられる。次いで、混合物を核酸の脱重合
を許す条件下で反応させ、その結果ヌクレオシド１リン酸が生成される。エキソ
ヌクレアーゼ検出に関するもう一つの好ましい実施態様では、ヌクレアーゼの作
用により生成されるヌクレオチド１リン酸を、ヌクレオシド３リン酸に直接変換
する。エンドヌクレアーゼ検出に関するもう一つの特に好ましい実施態様では、
閉環ＤＮＡを基質として用いる。最も好ましい実施態様では、ルシフェラーゼま
たはＮＡＤＰＨ検出システムのいずれかを用いて、ＡＴＰを検出する。
【００３４】 本発明の特に好ましい実施態様では、核酸含有溶液を、次の反応： プローブＮＡn ＋ＰＰi → プローブＮＡn-1 ＋ｄＮＴＰ ：に従って、ピロリン酸存在下で末端ヌクレオシド内ホスホジエステラーゼ結合
を酵素的に切断することによって末端ヌクレオチドでの核酸の脱重合を許す条件
下に晒し、遊離のｄＮＴＰを形成させる。特に好ましい実施態様では、次の一般
的反応： ｄＮＴＰ* ＋ＡＤＰ → ｄＮＴＰ＋ＡＴＰ* （式中、Ｐ* はそのようにして転移された５’末端リン酸である）：に従って、
ヌクレオチド３リン酸分子からの５’末端リン酸基を、アデノシン５’−２リン
酸分子に酵素的に転移して、アデノシン５’−３リン酸を形成させる。いくつか
の好ましい実施態様では、ポリメラーゼは、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩまた
はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼである。
【００３５】 本発明のさらなるその他の好ましい実施態様では、興味ある特定のリボ核酸お
よびデオキシリボ核酸を検出する方法が提供される。一つの好ましい実施態様で
は、少なくとも一つの核酸プローブおよび標的核酸を含むと予想されるサンプル
が提供される。その他の実施態様では、核酸プローブを標的核酸とハイブリダイ
ズさせ、核酸プローブ−標的核酸複合体を形成させる。代わりの方法としては、
プローブ核酸−標的核酸複合体を提供する。特に好ましい実施態様では、核酸プ
ローブ−標的核酸複合体を、プローブを脱重合してヌクレオチドを遊離するよう
な条件下で処理する。その他の実施態様では、次に、ヌクレオチドを検出する。
最も好ましい実施態様では、ルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出システムのいず
れかを用いてＡＴＰを検出する。
【００３６】 本発明のさらなるもう一つの実施態様では、核酸プローブ−標的核酸複合体を
、次の反応： プローブＮＡn ＋ＰＰi → プローブＮＡn-1 ＋ＸＴＰ ：に従って、ピロリン酸存在下で末端ヌクレオシド内ホスホジエステル結合を酵
素的に切断することによって、プローブ末端ヌクレオチドでの核酸プローブ−標
的核酸複合体の脱重合を許す条件下に晒し、遊離のＸＴＰを形成させる。特に好
ましい実施態様では、ヌクレオシド３リン酸分子からの５’末端リン酸基を、次
の一般的反応： ＸＴＰ* ＋ＡＤＰ → ＸＤＰ＋ＡＴＰ* （式中、Ｐ* はその結果転移された５’末端リン酸である）：に従って、アデノ
シン５’−２リン酸分子に酵素的に転移し、アデノシン５’−３リン酸を形成さ
せる。特に好ましい実施態様では、脱重合は、制限するつもりはないが、クレノ
ーフラグメント、クレノーｅｘｏ（−）ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、
Ｔａｑポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈポ
リメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、およびＭＭＬＶ逆転写酵素を含む、鋳型依存
性ポリメラーゼによって触媒される。 発明の詳細な説明 本発明は、生物サンプル、特に組み換えタンパク質サンプル内の、ごく低レベ
ルのＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む様々な核酸、オリゴヌクレオチドならびに
ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。本発明の方法を用いて行われる反
応の非常に高い感度、再現性、簡便性および速度は、低レベルの核酸を検出する
ために用いられている最近の方法（例えば核酸の低濃度の検出）に大きくまさっ
ている。
【００３７】 検出方法は、一般的に三つの段階に分けることが出来る。第一段階は、次のヌ
クレオチド：リボヌクレオシド１リン酸（ＮＭＰｓ）ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰお
よびＣＭＰを含むヌクレオシド１リン酸（ＸＭＰｓ）；ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄ
ＴＭＰおよびｄＣＭＰを含むデオキシリボヌクレオシド１リン酸（ｄＮＭＰｓ）
；リボヌクレオシド３リン酸（ＴＮＰｓ）ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ
を含むヌクレオシド３リン酸（ＸＴＰｓ）；ならびに、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰおよびｄＣＴＰを含むデオキシリボヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）
：の生成である。好ましい実施態様では、ＮＭＰｓおよびｄＮＭＰｓを、ヌクレ
アーゼ消化によって生成し、ＮＴＰｓおよびｄＮＴＰｓを、ピロリン酸分解によ
る脱重合によって生成する。第二の段階は、最初の基質がＤＮＡである場合に用
いられるが、ｄＮＴＰｓからの末端リン酸をＡＤＰに転移し、ＡＴＰを形成させ
る。所望により、この段階でＸＴＰ増幅段階を行うと、特に核酸範囲１−１０ｐ
ｇの低レベルＤＮＡを含むサンプルを測定する場合、検出システムの感度を上げ
ることが出来る。第三段階は、適当な検出方法によるＡＴＰの検出である。その
ような検出システムの例としては、ルシフェラーゼ検出システムおよびＮＡＤＨ
を基本とした検出システムがあげられる。
【００３８】 本発明の理解を容易にするために、多数の用語を以下に定義する。ここで用い
られている「ヌクレオシド」は、ペントースに共有結合で連結したプリンまたは
ピリミジン塩基からなる化合物を指し、これに対して、「ヌクレオチド」は、そ
のペントース水酸基の一つをリン酸化したヌクレオシドを指す。”ＸＴＰ”、”
ＸＤＰ”および”ＸＭＰ”は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチ
ドの一般名称である。
【００３９】 「ポリヌクレオチド」は、一つのヌクレオチドのペントースの３’位が次のペ
ントースの５位にホスホジエステル基で結合している、ヌクレオチドが共有結合
で連結した配列である。「オリゴヌクレオチド」は、長さの短いポリヌクレオチ
ドである。典型的には、オリゴヌクレオチドは、１００残基より少ない長さ（例
えば８−１００）であるが、ここで用いられる用語は、より長い、またはより短
いポリヌクレオチド鎖をも包含するつもりである。オリゴヌクレオチドは、時と
して、それらの長さで呼ばれる。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「
２４マー」と呼ばれる。オリボヌクレオチドは、自己−ハイブリダイズによって
、または他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって、二次および
三次構造を形成しうる。そのような構造には、限定するつもりはないが、二本鎖
、ヘアピン、十文字、曲がり、および三本鎖が含まれる。「核酸」は、ヌクレオ
チド残基がホスホジエステル残基で特定の配列に連結されるポリヌクレオチドで
ある。ここで用いられる塩基の「位置」は、核酸内で与えられた塩基またはヌク
レオチド残基の位置を指す。「興味ある核酸」は、サンプル内で検出することの
できる任意の特定の核酸である。
【００４０】 用語「野生型」は、自然発生源から単離した時点での遺伝子または遺伝子生成
物の特徴を持つ、遺伝子または遺伝子生成物を指す。野生型遺伝子は、集団内で
最も頻繁に認められる型であり、従って、遺伝子の「正常」または「野生型」の
形は勝手に設計される。対照的に、「修飾された」または「変異体」は、野生型
の遺伝子または遺伝子生成物と比較した場合、配列および／または機能的性質の
修飾（即ち特徴の変化）された遺伝子または遺伝子生成物を指す。天然発生の変
異体を単離しうることは特記に値する：これらは、野生型遺伝子または遺伝子生
成物と比較して、特徴が変化している事実から同定される。
【００４１】 核酸は、異なる変異型を含むことが知られている。ここに用いられる「ポイン
ト」変異は、それ以外は相同な２つの核酸での異なる塩基の位置を指す。ここに
用いられている「損傷障害(lesion)」は、塩基が欠失（例えば欠失変異）または
挿入（例えば挿入変異）された核酸内、または野生型配列とは異なる任意の核酸
配列の部位を指す。
【００４２】 また、異なる種または対立遺伝子からの相同遺伝子は、配列が変化しているこ
とが知られている。異なる種または対立遺伝子からの相同遺伝子領域は、実質上
、配列が同一である可能性がある。そのような領域を、ここでは、「同一領域」
と呼ぶ。「実質的同一領域」は、相同性が大きいが、同一領域の同位置の塩基が
異なる「ミスマッチ」を含むと、考えられる。この塩基位置を「ミスマッチ位置
」と呼ぶ。
【００４３】 モノヌクレオチドを反応させると、一つのモノヌクレオチドペントース環の５
’リン酸をその近所にある３’酸素とホスホジエステル結合で一方向に連結させ
るような様式で、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが作成されるので
、ＤＮＡ分子は、「５’末端」と「３’末端」を持つと言われる。それ故、オリ
ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一方の端を、５’リン酸または水酸基
がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結していなければ「５’末端」
と呼び、その３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結
していなければ「３’末端」と呼ばれる。ここに用いられているように、核酸配
列は、より大きいオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内にある場合で
さえ５’および３’末端を持つ、ということができる。直鎖状または環状ＤＮＡ
分子のいずれでも、別個のエレメントは、５’の「上流」または３’エレメント
の「下流」と呼ばれる。この専門用語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’
への様式で進むという事実による。従って、末端ヌクレオチドは、ここで用いら
れているように、核酸の３’末端または５’末端のヌクレオチドである。
【００４４】 ここで用いられている、用語「標的核酸」は、興味ある特定の核酸を指す。従
って、「標的」は、その他の核酸が存在する中に存在する。 ここで用いられている、用語「プローブ核酸」は、精製された制限消化で自然
発生するか、または合成、組換えあるいはＰＣＲ増幅によって生成されるかのい
ずれかの、もう一つの興味あるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする能力を
持つ、オリゴヌクレオチド（即ちヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一
本鎖であっても、二本鎖であっても良い。プローブは、特定の遺伝子配列の検出
、同定および単離に有用である。
【００４５】 ここに用いられている、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合規則に
よって関連づけられるポリヌクレオチド（即ちヌクレオチドの配列）に関して用
いられる。例えば、配列”５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’”は、配列”３’−Ｔ−Ｃ−
Ａ−５’”と相補的である。いくつかの核酸塩基のみが塩基対合規則に従って適
合する相補性は、「部分的」であると言える。また、核酸間で「完全に」または
「全体的に」相補性である場合もある。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間の
ハイブリダイゼーションの効率および強度に有意の影響を及ぼす。このことは、
増幅反応、ならびに核酸間の結合に依存する検出方法で特に重要なものである。
用語「実質的に相補的」は、標的核酸配列のいずれかまたは両方の鎖と以下に記
載するような低いストリンジェンシ条件下、または好ましくはポリメラーゼ反応
バッファー中で、ハイブリダイズできる任意のプローブを指す。
【００４６】 ここに用いられている、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対
合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
強度（即ち核酸間の関連の強さ）は、核酸間の相補性の程度、形成されたハイブ
リッドのＴm （融解温度）および核酸内のＧ：Ｃ比率を含む、条件のストリンジ
ェンシーのようなそのような要素によって、影響を受ける。
【００４７】 ここに用いられている、用語”Ｔｍ”は、「融解温度」に関して用いられる。
融解温度は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度である。核酸
のＴm を計算する方程式は、この技術分野では周知である。標準参考文献に示し
たように、Ｔm 値の単純な概算は、核酸が１Ｍ ＮａＣｌ中の水溶液内にある場
合、方程式：Ｔm ＝８１．５±０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算することが出
来る（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照のこと）。その他の参考文献は、
構造的ならびに配列的特徴をＴm の計算に取り入れるより洗練された計算を含む
。
【００４８】 ここに用いられている、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼ
ーションが行われる、温度条件、イオン強度、およびその他の化合物の存在に関
して用いられる。「高いストリンジェンシー」条件下では、核酸塩基対合は、相
補的塩基配列を高い頻度で持つ核酸フラグメント間でのみ、起こるであろう。従
って、「弱い」または「低い」ストリンジェンシ条件は、時として、互いに完全
に相補的でない核酸をハイブリダイズするか互いにアニールさせることを所望す
る場合に、必要とされる。
【００４９】 用語「相同」は、相補性の程度を指す。部分的に相同であるか、または完全に
相同（即ち同一）である場合がある。標的核酸へのハイブリダイズから完全に相
補的な配列を少なくとも部分的に阻害する部分的相補配列を、機能性用語「実質
上相同」を用いて表す。
【００５０】 この技術分野では、低いストリンジェンシー条件を含む数多くの等価な条件を
用いうることが良く知られており：長さおよびプローブの種類（ＤＮＡ、ＲＮＡ
、塩基組成）および標的の種類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在する
かまたは固定化されているか、等）および塩濃度ならびにその他の成分（例えば
、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールが存在するかしな
いか）の様な因子が考慮され、ハイブリダイゼーション溶液を変えると、上記の
条件とは異なるが等価である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件
を作成することができる。さらに、この技術分野では、高ストリンジェンシー条
件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーショ
ンおよび／または洗浄段階の温度の上昇、ハイブリダイゼーション溶液中のホル
ムアミドの使用等）が知られている。
【００５１】 ｃＤＮＡまたはゲノムクローンのような二本鎖核酸配列に関して用いる場合、
用語「実質上相同」は、低いストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列のいず
れかの鎖とハイブリダイズできる任意のプローブを指す。
【００５２】 一本鎖核酸配列に関して用いる場合、用語「実質上相同」は、低いストリンジ
ェンシー条件下で一本鎖核酸鋳型配列とハイブリダイズできる（即ちそれの補体
である）任意のプローブを指す。
【００５３】 ここで用いられる、用語「疑問(interrogation) 位置」は、核酸プローブ内で
の与えられた塩基の位置を指す。従って、疑問位置の塩基は、如何なるリボヌク
レオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであっても良い。疑問位置を除いて同
一である、４つのプローブのセットを設計することが出来る。この例では、異な
る塩基が、４つのプローブの各々の疑問位置に取り込まれる。
【００５４】 ここに用いられる、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、
そのそれぞれが特定のヌクレオチド配列またはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断す
る、酵素の種類を指す。
【００５５】 ここに用いられる、用語「サンプル」は、その最も広範な意味で用いられる。
核酸を含むと予想されるサンプルは、細胞、細胞から単離された染色体（例えば
中期染色体の広がり）、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等を含むことが出来る
。
【００５６】 ここに用いられる、用語「検出」は、サンプル内でのヌクレオチドまたは核酸
の定量的または定性的同定を指す。 ここで用いられる、用語「脱重合」は、Ｐi またはＰＰi 存在下でのポリメラ
ーゼによる核酸の３’末端からのヌクレオチドの除去を指す。 １．ピロリン酸分解 核酸ポリメラーゼは、一般的に、核酸鎖の伸長を触媒する。個々のヌクレオチ
ドを加えた場合に遊離するピロリン酸の切断によって、反応を追う。個々のヌク
レオシド３リン酸は、リボースまたはデオキシリボースのＣ５に連結した３つの
リン酸基を持つ。成長する核酸にヌクレオチドを加えると、結果としてヌクレオ
シド内ホスホジエステル結合を形成する。この結合は、リボースまたはデオキシ
リボースのＣ３への３’結合、およびリボースまたはデオキシリボースのＣ５へ
の５’結合を持つことを特徴とする。、新たな３’結合の形成を通して個々のヌ
クレオチドが加えられ、その結果、核酸鎖が５’から３’方向に成長する。
【００５７】 また、重合プロセスの逆を触媒するいくつかのポリメラーゼが知られている。
この逆反応を「ピロリン酸分解」と呼ぶ。ＤＮＡポリメラーゼのピロリン酸分解
活性は、ＤｅｕｔｓｃｈｅｒおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２４４，３０１９−２８（１９６９）によって証明された。ピロリン酸分解
の能力を持つその他の鋳型依存性核酸ポリメラーゼには、限定するつもりはない
が、ＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ
、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、クレノーフラグメント、クレノーｅｘｏ（−）、ＡＭＶ逆転
写酵素、およびＭＭＬＶ逆転写酵素、が含まれる。しかしながら、すべてのポリ
メラーゼが、ピロリン酸分解活性を持つわけではないことが知られている。例え
ば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、ピロリン酸分解を触媒しないと報告されている
（Ｓｉｐｐｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７，３１−２０、１９７３
を参照のこと）。
【００５８】 ピロリン酸分解の機構は、ＲＮＡポリメラーゼに関して提案されている。機構
の理解は、本発明での使用に必須ではないが、Ｒｏｚｏｖｓｋａｙａら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．，２２４，６４５−５０、１９８４に記載のように、ＲＮＡのヌ
クレオシド内ホスホジエステル結合のリン酸へのピロリン酸の攻撃によるＭｇ2+ イオンの部分的転移が、ピロリン酸の求核反応性およびジエステルの求電子性を
増すことが出来ると、信じられている。ヌクレオシド内ホスホジエステル結合は
、ヌクレオシド５’リン酸にピロリン酸を加えることにより酵素切断され、新た
なホスホジエステル結合がピロリン酸とヌクレオシド１リン酸の間に形成される
。
【００５９】 ピロリン酸反応は、以下の反応： 反応１； ＮＡn ＋ＰＰi → ＮＡn-1+ＸＴＰ （式中、ＮＡは核酸であり、ＰＰi はピロリン酸であり、ＸＴＰはｄＮＴＰ分子
またはＮＴＰ分子のいずれかである）：に要約することが出来る。次いで、少な
くとも２つのＸＴＰ分子が生成するまで、反応を繰り返すことが出来る。同一核
酸分子上で、または複数の異なる核酸分子上で、反応を繰り返して行えることは
、特記に値する。
【００６０】 分析された各々の核酸ポリメラーゼ用の適当なバッファーを含む、ピロリン酸
分解による脱重合用の好ましい反応混合物は、実施例中に、より詳細に記載され
ている。これらの条件下で、充分なＮＴＰまたはｄＮＴＰが生成され、ごく少量
の核酸（例えば約５−１５ピコグラム）を正確に検出またはアッセイする。
【００６１】 重合およびピロリン酸分解による脱重合用の好ましい反応条件は類似している
が、これらの反応速度は、大きく異なっている。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ
ｎおよびＭｏｄａｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．，２５５（５），２０００−０
４、１９８０で証明されているように、ＡＭＶおよびＲＬＶ逆転写酵素は、最適
条件下で、重合反応の約５０−１００分の１の速度で、ピロリン酸反応を触媒す
る。このように、効率の高いピロリン酸反応は期待できないが、非常に多い量の
ＤＮＡを用いて行われた以前のＤＮＡピロリン酸分解研究とは対照的に、ごく低
レベルのＤＮＡ基質と結びつくらしい。 また、この結果についての可能な解釈 は、非常に低レベルのＤＮＡから生成された遊離デオキシリボヌクレオシド３リ
ン酸のモル濃度が非常に低いと予想されること、であろう。事実、これらのレベ
ルは、酵素のミカエリス定数（Ｋｍ）よりはるかに低いと予想される。従って、
遊離したｄＮＴＰｓの再取り込みは、見えないぐらい小さいと考えられる。
【００６２】 また、異なる核酸ポリメラーゼでのピロリン酸分解活性は、異なる。例えば、
Ｔ４ポリメラーゼは、ピロリン酸分解によって生成したＡＴＰについてルシフェ
ラーゼアッセイによって測定される程の最も強いピロリン酸分解活性を持つと考
えられる。実施例に記載したように、Ｔ４ポリメラーゼを用いたピロリン酸分解
は、結果として、ＭＭＬ−ＲＴと比較した場合、光生成で約１０倍増加し、Ｔａ
ｑポリメラーゼと比較した場合、光生成で４倍増加する。
【００６３】 本発明の開発中に、低いピコグラムレベルでのいくつかの型の核酸の検出が、
核酸のフラグメント化または部分消化によって一般に強化されることが、発見さ
れた。好ましくは、多数のより小さい核酸フラグメントを提供するために、核酸
の音波処理または制限酵素消化によって、フラグメント化を成し遂げる。本発明
を実施するために機構を理解することは必須ではないが、以下の実施例で示され
たように、ピロリン酸分解反応は、ＤＮＡの末端からのみ進行するので、この段
階は多分検出を強化する。より多数のＤＮＡ末端が提供されることによって、さ
らなる反応が一度に起こることが可能になる。ＤＮＡ末端は、分子内ならびに直
鎖状ＤＮＡフラグメントの末端に存在しうることに、注目しなければならない。
例えば、ポリメラーゼは、ＤＮＡセグメント内のギャップまたはニックからのピ
ロリン酸分解を触媒する。ピロリン酸分解反応に用いられる酵素および基質の型
は、フラグメント化が必要か否かによって、決まる。たとえば、実施例に示した
データは、Ｔａｑポリメラーゼを用いた場合、フラグメント化がプラスミドＤＮ
Ａの検出を大きく増加するが、Ｔ４ポリメラーゼを用いた場合には検出に影響を
与えないことを、証明している。しかしながら、染色体ＤＮＡが基質である場合
、フラグメント化は、両酵素での検出を増加させる。
【００６４】 また、制限酵素消化によって作成された切断型は、異なる核酸ポリメラーゼの
ピロリン酸分解活性に影響を与える。実施例に示すように、ＭＭＬＶ−ＲＴおよ
びＴａｑポリメラーゼは、５’の突出したＤＮＡフラグメントのピロリン酸分解
を触媒するが、３’突出のＤＮＡフラグメントのピロリン酸分解は触媒しない。
対照的に、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、３’−および５’−末端の両方の突出
およびブランドエンド仲介ピロリン酸分解を触媒する。従って、Ｔ４ポリメラー
ゼは、ピロリン酸分解に好ましい酵素である。他の核酸ポリメラーゼを、制限酵
素処理したＤＮＡのピロリン酸反応に用いる場合、制限エンドヌクレアーゼによ
って作り出された突出の型とポリメラーゼの突出特異性を適合させるために、注
意を要すると考えられる。そのような注意は、当業者らに良く知られている。
【００６５】 ＤＮＡのピロリン酸分解の配列特異性が、以前、ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａ
ｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（１４），８３２２−２８、１
９９０でのシークエンシングの間に注目されたことに、注目すべきである。ピロ
リン酸分解反応の配列特異性は、いくつかのジデオキシヌクレオチドで終わる末
端配列のフラグメントが他のフラグメントよりピロリン酸分解による分解をより
受けやすいことを示したときに、注目された。
【００６６】 さらに、ピロリン酸分解反応に用いられたポリメラーゼの型が、最良の結果を
作り出すための適正な核酸基質に適合することが、期待される。一般に、ＤＮＡ
ポリメラーゼおよび逆転写酵素は、ＤＮＡの脱重合に適しているが、ＲＮＡポリ
メラーゼは、ＲＮＡの脱重合に適している。逆転写酵素または逆転写酵素活性を
持つＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの脱重合に適している
。
【００６７】 本発明の開発中、ポリ（Ａ）ポリメラーゼがピロリン酸分解を触媒できること
が、そのような反応が以前に報告されたことがなかったにもかかわらず、明らか
になった。事実、ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、ピロリン酸分解を触媒しないと、
広く報告されていた（例えば、Ｓｉｐｐｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
３７，３１−４０、１９７３、ならびに、ＳａｎｏおよびＦｅｉｘ、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，５７７−８３、１９７６を参照のこと）。驚くべき
ことに、本発明の開発中、ポリ（Ａ）ポリメラーゼがピロリン酸分解を触媒する
ことが分かった。本発明のこれらの好ましい実施態様では、前報告のバッファー
中に存在する塩化マンガンを排除し、塩化ナトリウムの濃度を減少させ、ｐＨを
約８．０から約７．５に下げる。さらに、特に好ましい実施態様では、ポリ（Ａ
）ポリメラーゼピロリン酸分解反応バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ
ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および、２ｍＭ
ＮａＰＰi （リン酸ナトリウム）を含む。
【００６８】 脱重合反応は、重合反応の逆であることに注目することが重要である。それ故
、遊離のヌクレオシド３リン酸量の増加は脱重合によって作り出されるので、理
論上、重合と脱重合反応が平衡している平衡状態が達成される。代わりに、少量
の核酸を検出する場合、反応は、実質上、平衡に達することなく完了する（即ち
、核酸は、その９０％以上が、その構成サブユニットヌクレオチドに脱重合され
る）。遊離したヌクレオチド全量は検出アッセイで生成したシグナルの量と比例
するので、この因子は定量試験で重要である。核酸の定量検出に用いる場合、閾
値レベルのヌクレオチドが生成される限り、反応が平衡に達するか、または実質
上終了させる必要はない。好ましい実施態様では、脱重合によって生成されるヌ
クレオシド３リン酸分子の混合物を、以下に記載の方法に従って、ＡＴＰに変換
することが望ましい。定量または定性検出のいずれに於いても、好ましくは、典
型的ルシフェラーゼアッセイの光検出では、おおよそ１００μｌの１ｘ１０-12 Ｍ ＡＴＰの検出可能な閾値濃度のＡＴＰが提供される。
【００６９】 核酸の検出に関する本発明の好ましい実施態様では、核酸ポリメラーゼおよび
ピロリン酸（ＰＰi ）を、約１μｇより少ない核酸から、約１０ｐｇより少ない
核酸までを含むサンプルに加える。ＤＮＡ検出の感度を上げるために、ＤＮＡを
制限エンドヌクレアーゼでの処理または音波処理によってフラグメント化するこ
とも出来る。次に、遊離ＮＴＰｓまたはｄＮＴＰｓを放出するピロリン酸分解に
よって、核酸を分解する。ピロリン酸反応に有用な酵素には、限定するつもりは
ないが、以下のポリメラーゼ：ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＤＮＡ
ポリメラーゼαおよびβ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノーフラグメント、クレ
ノーｅｘｏ（−）、Ｔｔｈポリメラーゼ、およびポリ（Ａ）ポリメラーゼ：が含
まれる。最も好ましくは、上記のように、３’および５’突出ならびにブラント
エンドの認識そして高いプロセス性故に、Ｔ４ポリメラーゼをＤＮＡピロリン酸
分解反応に用いる。
【００７０】 ルシフェラーゼは、好ましいＡＴＰ検出システムの一部であるが、ＰＰi によ
って阻害される。好ましい実施態様では、高阻害量のＰＰi のＡＴＰ検出反応へ
の転移を防ぐために、注意が払われる。好ましくは、ＡＴＰ検出反応に運ばれる
ＰＰi 量は、約１００μＭより少ないルシフェラーゼ検出反応内のＰＰi 濃度内
であるが、約１０μＭより少ない濃度が望ましい。それ故、ピロリン酸分解に用
いられるＰＰi 量は、ルシフェラーゼ検出システムで用いられるアリコートのサ
イズによって決定される。アリコートのサイズは、用いられる試験システムに依
存して変化しうると考えられるが、ルシフェラーゼ検出反応に転移されるか運ば
れるＰＰi 量は、上記のＰＰi 濃度パラメーターに相当するはずであり、その結
果ＰＰi 濃度は、少なくとも約１００μＭより低く、好ましくは約１０μＭより
低い。 ２． ヌクレアーゼ消化 本発明のもう一つの実施態様では、最初に、次の反応： 反応２； ＮＡn ＋Ｈ2Ｏ → ＮＡn-1＋ＸＭＰ （式中，ＮＡは核酸であり、ＸＭＰはｄＮＭＰまたはＮＭＰのいずれかであり、
ｎは核酸内のヌクレオチドの数である）：に従って、核酸をエキソヌクレアーゼ
消化によってＮＭＰまたはｄＮＭＰに消化する。
【００７１】 ヌクレアーゼ消化は、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、やえなり
ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII およびリボヌクレアーゼIIを含む、５’
リン酸を持つヌクレオチドを遊離する様々なヌクレアーゼによって、達成するこ
とが出来る。ヌクレアーゼ消化の条件およびバッファーは、この技術分野で既知
であり、市販されており、また、そのいくつかは、参照としてここに採用される
実施例内に記載されている。
【００７２】 ヌクレアーゼでの消化後、ＮＭＰｓまたはｄＮＭＰｓを、それぞれ、ＮＴＰｓ
またはｄＮＴＰｓに変換する。合衆国特許第４，３７５，８９７号（ここに参照
として採用する）は、ヌクレアーゼで消化し、次にＮＴＰへ変換によることによ
るＲＮＡの検出、について記載している。しかしながら、この方法は、アデニル
酸キナーゼがＡＭＰをＡＤＰに変換し、その後ピルビン酸キナーゼがＡＤＰをＡ
ＴＰに変換する、二段階スキームを用いている。この方法は、そのメカニズムが
ルシフェラーゼの好ましい基質であるＡＴＰへのｄＮＴＰｓの変換を示唆しない
ため、実質上、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡの検出に限定される。さらに、ＤＮＡのヌク
レアーゼ消化またはピロリン酸反応は、結果として、ルシフェラーゼの有効な基
質として作用しないｄＮＴＰｓの混合物を生じる。
【００７３】 プリンおよびピリミジンモノヌクレオチドの生合成では、ＰＲＰＰが必須のリ
ボース−５’−リン酸ドナーである。ＰＲＰＰそれ自身は、ＡＴＰからリボース
−５’−リン酸へのピロリン酸の転移を通して、ＰＲＰＰ合成酵素によって触媒
される反応で形成される。この反応は、Ｓａｂｉｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２
３，１１９３−１１９５、１９８４に記載のように可逆的であることが知られて
いる。
【００７４】 本発明のいくつかの実施態様では、ヌクレアーゼ消化によって生成されるＮＭ
ＰまたはｄＮＭＰを、次の反応： 反応３； ＸＭＰ＋ＰＲＰＰ → ＸＴＰ＋リボース-５'-ＰＯ4 （式中、ＸＭＰはＡＭＰまたはｄＡＭＰのいずれかであり、ＸＴＰはＡＴＰまた
はｄＡＴＰのいずれかである）：に従って、好ましくは、酵素ＰＲＰＰ合成酵素
によって直接ＮＴＰまたはｄＮＴＰに変換する。好ましくは、この反応は、ＡＴ
Ｐ閾値濃度が、おおよそ１００μｌの１ｘ１０-12 Ｍ ＡＴＰである。
【００７５】 この反応では、ＰＲＰＰのピロリン酸基を酵素的にＸＭＰ分子に転移し、ＸＴ
Ｐを形成する。適当な反応条件およびバッファーの例を、以下の実施例に示す。
ＲＮＡが基質である場合、生成されたＡＴＰを直接検出できる。
【００７６】 本発明の核酸検出システムでのＰＲＰＰ反応の利用は、以前報告された方法以
上の長所を持つ。例えば、ＡＭＰまたはｄＡＭＰをＡＴＰまたはｄＡＴＰに変換
するため必要な段階は一つであり、それによって検出システムが簡素化される。
さらに、外因性ＡＴＰ、ＡＤＰまたはＡＭＰでの検出反応の汚染は、以前報告さ
れた方法と比較して、本発明の方法を用いると、ほとんどありそうでない。 ３． ヌクレオチドのＡＴＰへの変換 いくつかの実施態様では、ｄＮＴＰｓまたはＮＴＰｓは、ピロリン酸分解また
はヌクレアーゼ消化し、次にＮＭＰｓまたはｄＮＭＰｓを後に直接ルシフェラー
ゼの基質として用いうるＸＴＰに変換することによって生成され、核酸の検出が
可能になると、考えられている。しかしながら、ルシフェラーゼの好ましい基質
は、ＭｏｙｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３
１，１８７−８９（１９８３）で示されているように、ＡＴＰである。ＤＮＡが
最初の基質である場合、便宜上ＮＤＰＫを用いると、次の一般反応： 反応４： ｄＮＴＰ* ＋ＡＤＰ → ｄＮＤＰ＋ＡＴＰ* （式中、ｄＮＴＰは、デオキシリボヌクレオシド３リン酸の混合物であり、ｄＮ
ＤＰは、関連するデオキシリボヌクレオシド２リン酸である）：に従って、ｄＮ
ＴＰｓのＡＴＰへの変換が触媒される。反応では、ｄＮＴＰの末端５’−３リン
酸（Ｐ* ）をＡＤＰに転移し、ＡＴＰを形成させる。同様に、ＲＮＡピロリン酸
分解を通して生成されるＮＴＰｓ上でも反応を進めることが出来る。
【００７７】 この反応を触媒する酵素は、一般に、ＮＤＰＫｓとして知られている。ＮＤＰ
Ｋｓは、遍在しており、比較的非特異的な酵素である。ＮＤＰＫの論評に関して
は、ＰａｒｋｓおよびＡｇａｒｗａｌ、Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ、第８巻、Ｐ．
Ｂｏｙｅｒ編（１９７３）を参照のこと。好ましくは、ＮＤＰＫによるＮＴＰｓ
またはｄＮＴＰｓのＡＴＰへの変換は、ＮＤＰＫ、および、ピロリン酸分解また
はヌクレアーゼ消化後にＰＲＰＰ合成酵素によるピロリン酸分解を行うことによ
って生成すると考えられるＮＴＰｓまたはｄＮＴＰｓ量以上のモル過剰のＡＤＰ
を加えることによって、成し遂げられる。代わりに、もしＡＴＰ増幅スキームを
用いるならば、モル過剰のＡＭＰを好ましい基質として用いることが出来る。Ａ
ＤＰの利用には、加えるＡＤＰの量を最適化する必要がある。多すぎるＡＤＰは
、結果としてバックグラウンドのレベルを高くする。ＮＤＰＫを含む反応は、約
０．０１−０．５０μＭ ＡＤＰ、好ましくは約０．０５μＭ ＡＤＰを含む。
様々な有用なバッファーおよび反応成分は、実施例に示されている。 ４．増幅 所望の段階として、ピロリン酸分解またはヌクレアーゼ消化スキームによって
生成したＮＴＰ、ｄＮＴＰまたはＡＴＰを増幅して、感度をより高めることが出
来る。例えば、増幅は、ルシフェラーゼ以外の検出システムを用いる場合、また
は感度の低いルミノメーターで検出するためにシグナルのレベルを増加させる必
要がある場合、必要とされるであろう。「ＮＴＰの増幅」は、１ＮＴＰを２ＮＴ
Ｐｓにし、４ＮＴＰｓなどが得られるまで繰り返すことの出来る、連続反応を指
す。ＡＭＰを加えて増幅反応を提供すると、ＡＴＰが蓄積される。ＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ９４／２５６１９およびＣｈｉｔｔｏｃｋら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
２５５，１２０−６（１９９８）（ここに参照として採用される）は、以下の共
役反応： 反応５； Ｃ１＋Ｓ１→２Ｃ２ および ２Ｃ２＋２Ｓ２→２Ｃ１ ２Ｃ１＋２Ｓ１→４Ｃ２ および ４Ｃ２＋４Ｓ２＋Ｅ２→４Ｃ１ ４Ｃ１＋４Ｓ１→８Ｃ２ および ８Ｃ２＋８Ｓ２＋Ｅ２→８Ｃ１ （式中、Ｃ１は増幅されるサンプル内に存在する標的化合物であり、Ｓ１は増幅
基質であり、Ｅ１はＣ１とＳ１を用いてＣ２を生成する能力を持つ触媒酵素であ
り、Ｓ２は高エネルギーリン酸授与基質であり、そして、Ｅ２はＣ２およびＳ２
を用いてＣ１を生成する能力を持つ触媒酵素であり、次に反応を通してリサイク
ルされる）：を特徴とするＡＴＰ増幅システムについて開示している。本反応ス
キームに従って、共役反応を通過させると、そのそれぞれはＣ１量が２倍になり
、それに続いて、検出が可能になる。特許出願ＧＢ２，０５５，２００（ここに
参照として採用される）は、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼを用
いた増幅システムを開示している。
【００７８】 核酸検出に用いられる共役ＡＴＰ増幅反応を提供するに当たって、２つの主な
必要条件を考慮しなければならない。第一に、Ｅ１は、Ｅ２によって利用される
高エネルギーリン酸ドナーを用いることができてはならない。もしＥ１が高エネ
ルギーリン酸ドナーを利用できるならば、ＡＴＰ増幅反応は、ピロリン酸分解ま
たはヌクレアーゼ消化後のピロリン酸分解の結果として生成されるＮＴＰまたは
ｄＮＴＰが存在しなくても進行する。これにより、非所望の出来事による間違っ
た正の結果を生じる。第二に、加えられるモル過剰の高エネルギーリン酸ドナー
は、反応中に予想されるＸＴＰ量と比較して提供されることが好ましい。第三に
、Ｅ１は、ピロリン酸分解または核酸のヌクレアーゼ消化によって段階１で生成
された、ＮＴＰ、ｄＮＴＰまたはＡＴＰのいずれかを利用できるべきである。
【００７９】 本発明のいくつかの好ましい実施態様の増幅システムは、次の反応： 反応６： ＸＴＰ＋ＡＭＰ → ＸＤＰ＋ＡＤＰ ＡＤＰ＋Ｄ−Ｐ → ＡＴＰ （式中、Ｄ−Ｐは高エネルギーリン酸ドナーであり、Ｅ１およびＥ２はそれぞれ
、ＸＴＰからＡＭＰ、Ｄ−ＰからＡＤＰへのリン酸の転移を触媒する能力を持つ
酵素である）：に従って、特徴付けることができる。そのようにして生成したＡ
ＴＰは（ＸＴＰとして）反応に再入することができ、基質が涸渇するか、または
平衡が達成されるまで反応繰り返すと、結果として反応によって供給されるかま
たは反応によって生成させたＡＴＰ毎に２ＡＴＰを生成する。標的ＸＴＰがＡＴ
Ｐ以外の任意のヌクレオシド３リン酸である場合、最初の循環では、ＡＴＰが１
のみ得られ、１ＡＴＰは次に循環に再入して２ＡＴＰを作り出し、２ＡＴＰの両
方が循環に再入して、４ＡＴＰ等を生じる。好ましくは、増幅反応は、閾値であ
る１００μｌサンプル中のおおよそ１ｘ１０-12 ＭのＡＴＰ濃度を生じる。
【００８０】 いくつかの好ましい実施態様では、上記増幅システム内のＸＴＰは、ＮＴＰま
たはｄＮＴＰであり、好ましくは、ピロリン酸分解（例えば反応１）によって提
供されたか、またはＡＤＰのＡＴＰへのＮＤＰＫ変換（例えば反応４）によって
ＸＴＰから作り出されたか、またはＸＭＰｓのＸＴＰｓへのトランスフォーメー
ションと共役したヌクレアーゼ消化（例えば反応３）に続くＡＴＰへのＮＤＰＫ
変換（例えば反応４）によって提供される、ＡＴＰであることができる。しかし
ながら、増幅段階がＤＮＡ基質について用いられる場合、ｄＮＴＰのＡＴＰへの
変換段階は本来の増幅システム内にある、と認識すべきである。それ故、別々の
変換段階は、本発明には必要でない。
【００８１】 好ましくは、酵素１（Ｅ１）として、ヌクレオシド１リン酸キナーゼ（ＮＭＰ
Ｋ）(nucleoside monophosphate kinaze) またはアデニル酸キナーゼが用いられ
る。ＮＭＰＫｓは、そのそれぞれが特定のＮＭＰのリン酸化の触媒に応答する、
ファミリーとして起こる。最近まで、一般的に、ＡＴＰおよびｄＡＴＰは好まし
いリン酸ドナーであると考えられていた。しかしながら、Ｓｈｉｍｏｆｕｒｕｙ
ａおよびＳｕｚｕｋｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，２６（５），８５３−６１
（１９９２）は、最近、少なくともいくつかのＮＭＰＫｓは、ＣＴＰおよびＵＴ
Ｐのようなその他のリン酸ドナーを用いうることを、証明した。酵素２（Ｅ２）
は、好ましくは、ＮＤＰＫまたはピルビン酸キナーゼである。ＮＤＰＫｓは、一
般に、ＮＴＰｓの末端５'-３リン酸のＮＤＰｓでの転移を触媒し、ＮＤＰからＮ
ＴＰｓを形成する。ピルビン酸キナーゼは、リン酸のホスホエノールピルビン酸
（ＰＥＰ）からＡＤＰへの転移を触媒して、ＡＴＰを形成する。これらの酵素活
性を増幅反応に用いると、高エネルギーリン酸ドナー（Ｄ−Ｐ）からＡＤＰまた
はＮＤＰのいずれかにリン酸基が転移される。
【００８２】 特に好ましい実施態様では、Ｅ２によって利用されうるが、Ｅ１によっては利
用されない高エネルギーリン酸ドナー（Ｄ−Ｐ）を用いる。Ｅ２がＮＤＰＫであ
る場合、ｄＣＴＰまたはα，βメチレンアデノシン５'-３リン酸（ＡＭＰ−ＣＰ
Ｐ）をＤ−Ｐとして用いることができる。Ｅ２がピルビン酸キナーゼである場合
、ＰＥＰが好ましい高エネルギーリン酸ドナーである。本発明が開発される以前
、微量のＡＴＰの生成を可能にする能力でこれらの基質を利用するＮＤＰＫの能
力は知られていなかった。最近の文献は、ＮＭＰＫ（Ｅ１）がＡＴＰまたはｄＡ
ＴＰ以外にリン酸ドナーを用いることを示唆しており、これらの高エネルギーリ
ン酸ドナーが、増幅反応の必要性と合うＮＭＰＫと共に利用されることは、驚く
べきことである。また、アデニル酸キナーゼの非特異性も良く知られており、例
として、アデニル酸キナーゼがＥ−１である場合、ｄＣＴＰはＤ−Ｐとして利用
されない。好ましくは、高エネルギーリン酸ドナーおよび／またはＡＭＰを、サ
ンプル内に存在すると予想されるＡＴＰまたはｄＮＴＰ量と比べてモル過剰で提
供することによって、高エネルギーリン酸ドナーは感知できる速度ではリサイク
ルされない。本発明を如何なる特定の実施態様にも限定するつもりはないが、実
施例内には、様々なバッファーおよび反応成分が提供されている。 ５． ＡＴＰの検出 特に好ましい実施態様では、核酸検出の第三段階は、ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、また
は増幅されたＡＴＰを検出することである。二つの周知の検出システムには、発
光ルシフェラーゼ検出システムおよびＮＡＤＨ光吸収検出システム（ＮＡＤＨ検
出システム）が含まれる。
【００８３】 特に、ルシフェラーゼ検出システムは、ＡＴＰ検出に有用である。ＡＴＰおよ
び酸素存在下で、ルシフェラーゼはルシフェリンの酸化を触媒し、次に、ルミノ
メーターを用いて定量することができる。反応のさらなる生成物は、ＡＭＰ、ピ
ロリン酸およびオキシルシフェリンである。
【００８４】 特に好ましい実施態様では、ＬＡＲバッファーと呼ばれるＡＴＰ検出バッファ
ーを用いる。この検出バッファーは、１９．１ｍｌの脱イオン水；８００μｌ
０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．０；７０μｌの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ；４μｌ
の０．５Ｍ ＥＤＴＡ；０．１０８ｇのＤＴＴ（ジチオスレイトール）；０．０
０３ｇルシフェリン；および、必要であればｐＨを７．８に調製する：を混合す
ることにより、調合される。好ましくは、約５−１０ｎｇのルシフェラーゼを反
応物中で用いる。いくつかの実施態様では、ＥＮＬＩＴＥＮ（登録商標）（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＦＦＱ０２１）をＬＡＲバッファーの代わりに用いる。本発明を特
定濃度のルシフェラーゼに限定するつもりはないが、より多量のルシフェラーゼ
は非特異的バックグラウンドを上昇させる傾向がある。好ましい実施態様では、
ＬＡＲ反応混合物から補酵素Ａを削除すると、バックグラウンドが減少する。
【００８５】 ＮＡＤＨ検出システムでは、２酵素、ホスホグリセル酸キナーゼおよびグリセ
ルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、の組み合わせを用いて、ＡＴＰ存在下で
のＮＡＤＨからＮＡＤの形成を触媒する。ＮＡＤＨが蛍光を放つのに対してＮＡ
Ｄは蛍光を放たないので、ＡＴＰは、蛍光強度の損失として測定される。ＮＡＤ
Ｈを基にしたＡＴＰアッセイの例は、合衆国特許第４，７３５，８９７号、第４
，５９５，６５５号、第４，４４６，２３１号および第４，７４３，５６１号な
らびに大英帝国特許出願ＧＢ２．０５５，２００に開示されており、そのすべて
をここに参照として採用する。
【００８６】 いくつかの実施態様では、ある上記の反応は、シングルポット反応として行う
ことができる。「シングルポット反応」は、触媒活性を持つ少なくとも２つの酵
素（即ちＥ２およびＥ２）が同一の反応混合物中に存在し、一つ以上の基質（即
ちＳ１およびＳ２）と作用する反応である。いくつかの実施態様では、酵素によ
って触媒される反応は、同時（Ｅ１はＳ１に作用し、そしてＥ２はＳ２に作用す
る）に起こる。代わりに、Ｅ１およびＥ２によって触媒される反応が、段階様式
または共役様式で起こることもある（例えば、Ｅ１はＳ１に作用して中間体Ｓ２
を生成し、次いでＥ２がＳ２と反応する）。もちろん、その他の実施様態でさえ
、そのような共役反応もまた、実質上、同時に起こりえる。 ７． 共役反応 シングルポット反応で本発明の酵素の組み合わせまたは混合物を用いる能力は
、本発明を用いて達成されたごく低レベルの核酸検出に照らして考えると、驚く
べくことである。この低レベル検出は、いくつかの酵素を最適に次ぐ条件で用い
た場合でさえ、可能である。以前に記載した様に、本発明の開発中に、ピロリン
酸分解反応で用いられるＰＰi 濃度を最適化して、ルシフェラーゼの阻害を防ぐ
必要があることが分かった。その結果、ＮＭＰ、ｄＮＭＰ、ＮＴＰ、ｄＮＴＰお
よびＡＴＰ生成反応からのアリコートを、反応生成物を全く精製することなく、
直接ルシフェラーゼ検出用ＬＡＲバッファーに加えることができる。ルシフェラ
ーゼ反応は、反応成分によって、害されはしないが、一方で急冷される。この望
ましい姿は、最少の時間および効果でのスクリーニング処理量を高くし、また、
全体検出スキームの設計での融通性を大きくする。しかしながら、本発明を、如
何なる特別な反応条件、試薬または実施態様にも制限するつもりはない。
【００８７】 いくつかの好ましい実施態様では、ｄＮＴＰを生成するピロリン酸分解反応お
よび、ＮＴＰｓまたはｄＮＴＰｓをＡＴＰに変換するＮＤＰＫ触媒反応は、これ
らの実施態様では、核酸ポリメラーゼバッファー内のシングルポット反応で行わ
れる。ＮＤＰＫ活性は、ポリメラーゼバッファー条件がＮＤＰＫ活性の最適に次
ぐ条件であったとしても、ｄＮＴＰをＡＴＰに変換するに充分である。ポリメラ
ーゼ酵素およびＮＤＰＫは、両方とも最初から反応物中に存在させるか、または
、ＮＴＰまたはｄＮＴＰの生成に充分なインキュベーション期間の後に、ＮＤＰ
Ｋを直接反応物に加えることもできる。代わりに、核酸ポリメラーゼおよびＮＤ
ＰＫを同一ベッセル内、または上記の反応に用いられる混合物中、に提供するこ
ともできる。好ましくは、混合物が、核酸、ピロリン酸およびＡＤＰの存在下に
ある場合、ＡＴＰ生成を触媒するのに充分な濃度の核酸ポリメラーゼおよびＮＤ
ＰＫを含む。好ましくは、ポリメラーゼは、約１−１００ｕ／μｌ（即ち、ｕは
ユニットである）の濃度、最も好ましくは、約５ｕ／μｌの濃度で提供される。
好ましくは、ＮＤＰＫは、０．１−１００ｕ／μｌの濃度、最も好ましくは、約
５ｕ／μｌの濃度で、提供される。より好ましい実施態様では、混合物は、９９
％以上純粋である。
【００８８】 同様に、ＰＲＰＰ合成酵素およびＮＤＰＫ反応は、ＰＲＰＰ合成酵素バッファ
ー中のシングルポット反応で行うことができる。再び、これらの実施態様では、
ＮＤＰＫ活性は、ＮＤＰＫ活性の条件が最適に次ぐ条件であっても、充分である
。遊離のＮＭＰｓおよびｄＮＭＰｓを含むヌクレアーゼ消化サンプルは、最初か
らＰＲＰＰ合成酵素およびＮＤＰＫを含む反応混合物に加えるか、または ＰＲ
ＰＰ合成酵素反応に加え次にＮＤＰＫおよびルシフェラーゼ検出反応成分を含む
反応混合物に加えることができる。実施例として、ある好ましいバッファーおよ
び反応成分を、実施例内に見出すことができる。しかしながら、本発明を、特定
のバッファーまたは反応成分に限定するつもりはない。ＰＲＰＰ合成酵素および
ＮＤＰＫは、同一ベッセル中に、または上記の反応中で用いられる混合物内に、
提供することができる。好ましくは、混合物は、ＰＲＰＰおよびＡＤＰ存在時に
ＡＴＰの生成を触媒するに充分な濃度のＰＲＰＰ合成酵素およびＮＤＰＫを含む
。好ましくは、ＮＤＰＫは、０．１−１００ｕ／μｌ、最も好ましくは約５ｕ／
μｌの濃度で提供される。好ましくは、ＰＲＰＰ合成酵素は、０．００１−１０
ｕ／μｌ、最も好ましくは約０．０１ｕ／μｌの濃度で提供される。もし増幅を
所望するならば、ＰＲＰＰ合成酵素反応を、熱不活性化することが好ましく、も
しそうでなければ、ＰＲＰＰ合成酵素は、加えられたＡＭＰをＡＴＰに変換する
。好ましくは、混合物は、９９％以上純粋である。
【００８９】 ピロリン酸反応および増幅反応もまた、シングルポット反応で行うことができ
る。このシングルポット反応では、限定するつもりはないが、ＡＭＶ逆転写酵素
、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼαおよびβ、Ｔａｑポリメラーゼ、
Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ、クレノーフラグメント、またはクレノーｅｘｏ（−）を
含む、ポリ（Ａ）ポリメラーゼまたは任意の適当な鋳型依存性ポリメラーゼを用
いることができる。いくつかの実施態様では、ＡＭＰをＡＤＰに変換する第一酵
素は、ミオキナーゼ（例えばアデニル酸キナーゼ）またはＮＭＰＫであることが
でき、その他の実施態様では、ＡＤＰをＡＴｐに変換する第二酵素は、ピルビン
酸キナーゼまたはＮＤＰＫであることができる。さらに、好ましい実施態様では
、反応はＡＭＰを供給する。特に好ましい実施態様では、アピラーゼー処理ＡＭ
Ｐを用いて、ＡＤＰおよびＡＴＰの混入によるバックグラウンドを減少させる。
好ましくは、１μｌの１ｕ／μｌアピラーゼを１９μｌの１０ｍＭ ＡＴＰに加
え、次に、室温で３０分間インキュベートし、７０゜Ｃで１０分間のインキュベ
ーションによりアピラーゼを熱不活性化する。高エネルギーリン酸ドナーもまた
、反応に加えられる。好ましい実施態様では、ピルビン酸キナーゼを用いる場合
は、ＰＥＰを加える。その他の好ましい実施態様では、ＮＤＰＫを用いる場合に
は、ｄＣＴＰを加える。好ましくは、高エネルギーリン酸ドナーは、ポリメラー
ゼでのプレインキュベーション後、約１５分に加えられるが、これは必須ではな
い。これらの反応は、次の反応： 反応７、 ＮＡn ＋ＰＰi → ＮＡn-1＋ＸＴＰ ＸＴＰ＋ＡＭＰ → ＡＤＰ＋ＸＤＰ ＡＤＰ＋Ｄ−Ｐ → ＡＴＰ＋Ｄ ［式中、ＮＡは核酸であり、ＸＴＰはヌクレオシド３リン酸（デオキシヌクレオ
シドまたはリボヌクレオシド３リン酸のいずれか）であり、ＸＤＰはヌクレオシ
ド２リン酸（デオキシヌクレオシドまたはリボヌクレオシド２リン酸のいずれか
）であり、そしてＤ−Ｐは高エネルギーリン酸ドナーである］を特徴とする。こ
の反応は、ルシフェラーゼの好ましい基質であるＡＴＰを、ｄＮＴＰｓから生成
する。増幅反応は、反応７に記載のように進行し、おおよそ１００μｌの１ｘ１
０-12 Ｍ ＡＴＰの閾値濃度のＡＴＰを生成する。好ましくは、ポリメラーゼは
、約１−１００ｕ／μｌ、最も好ましくは約５ｕ／μｌの濃度で提供される。好
ましくは、ＮＤＰＫは、０．１−１００ｕ／μｌ、最も好ましくは約１ｕ／μｌ
の濃度で提供される。好ましくは、混合物は、９９％以上純粋である。 ７． ポリ（Ａ）ｍＲＮＡの検出 その他の実施態様では、上記の反応を用いて、以下のスキームに従って、ポリ
（Ａ）ｍＲＮＡを選択的に検出することができる。最初にオリゴ（ｄＴ）プライ
マーをｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾にハイブリダイズすると、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リッドが形成される。次に、ピロリン酸分解反応を、逆転写酵素（ＲＴ）を用い
て行う。本発明に用いられる逆転写酵素には、限定するつもりはないが、Ｍｏｕ
ｓｅ Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）ＲＴおよび
Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）ＲＴまたは逆転写酵素活性
を持つ任意の鋳型依存性ポリメラーゼを含む。この検出システムの長所は、これ
らのＲＴｓが二本鎖核酸および二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのピロリン酸
分解を触媒するが、一本鎖核酸のピロリン酸分解を触媒しないことである。従っ
て、全細胞ＲＮＡサンプル中のポリ（Ａ）ｍＲＮＡ量は、これらの酵素を用いて
定量することができる。ピロリン酸分解反応は、次の反応： 反応８； ＴＴn ＋ＰＰi → ＴＴn-1 ＋ｄＴＴＰi （式中、ＴＴn はオリゴ（ｄＴ）であり、ＰＰi はピロリン酸である）：に従っ
て、ｄＴＴＰを生成する。
【００９０】 その他の実施態様では、ｄＴＴＰは、上記の反応４に記載されたように、ＮＤ
ＰＫによってＡＴＰに変換され、所望であれば増幅され、上記の方法に従って検
出することができる。 ８． 細胞物質の存在の検出 本発明のもう一つの実施態様では、上記の反応を用いて、サンプル内の細胞の
存在を検出することができる。合衆国特許第５，６４８，２３２号は、ここに参
照として採用されるが、サンプル内の細胞の検出方法について記載している。そ
の方法は、生きた全生物体内に存在する、アデニル酸キナーゼ活性を利用してい
る。簡単に言えば、微生物またはその他の生きた細胞を含むと予想されるサンプ
ルを、細胞溶解の原因となる条件下に置く。次いで、ＡＤＰを溶解物に加え、次
の反応： 反応９； ３ＡＤＰ → ＡＴＰ＋ＡＭＰ ：に従って、内因性アデニル酸キナーゼ活性によってＡＴＰに変換する。次に、
この反応によって生成されるＡＴＰを、ルシフェラーゼアッセイシステムによっ
て検出する。
【００９１】 また、本発明は、細胞物質を含むと予想されるサンプルの溶解物内で細胞の存
在を検出するために、別の基質を用いる方法を提供する。このシステムは、次の
反応スキーム： 反応１０； ＡＭＰ＋Ｄ−Ｐ → Ｄ＋ＡＤＰ および ＡＤＰ＋Ｄ−Ｐ → ＡＴＰ＋Ｄ （式中、Ｄ−Ｐは細胞溶解物に加えられた高エネルギーリン酸ドナーであり、Ａ
ＭＰは細胞溶解サンプルに加えられたアデノシン１リン酸である）：に従って、
内因性アデニル酸キナーゼ活性およびＮＤＰＫ活性によって触媒される共役反応
を利用する。この反応では、ＡＤＰ分子は、高エネルギーリン酸ドナー分子（Ｄ
−Ｐ）から加えられたＡＭＰ分子へのリン酸基の酵素転移によって生成される。
次いで、細胞溶解サンプル内に存在する内因性酵素によって触媒される上記の一
般反応に従って、ＡＴＰがＤ−Ｐ分子からＡＤＰ分子に酵素転移することによっ
て生成される。
【００９２】 本発明の開発中、サンプルに加えられたヌクレオチドの濃度の最適化が、これ
らの反応からでる光を最適化するために必要であった。好ましい実施態様では、
約０．０２ｍＭから１．５ｍＭ ＡＭＰおよび０．０２ｍＭから１．８ｍＭ ｄ
ＣＴＰを試験サンプルに加える。特に好ましい実施態様では、約０．１８ｍＭ
ＡＭＰおよび１．８ｍＭ ｄＣＴＰを試験サンプルに加える。サンプルにヌクレ
オチドを加えた後、好ましくは、サンプルを室温で約１０−６０分間インキュベ
ートし、サンプルからアウトプットされる光を、ルミノメーターによって定量し
た。その他の好ましいバッファーおよび反応成分は、実施例中に見い出すことが
できる。
【００９３】 本発明は、前記細胞検出システム以上の重要な利益を提供する。ＡＭＰおよび
ｄＣＴＰはＡＤＰより非常により安定であるので、本発明を用いて得られた結果
は、前に用いられていた方法より、再現性が良い。 ９． 検出キット 本発明のその他の実施態様では、核酸検出試験キットが、ピロリン酸分解核酸
検出法を達成するために提供される。好ましい実施態様では、核酸検出試験キッ
トは、核酸検出発明の方法に要求される重要な試薬を含む。例えば、ピロリン酸
分解による核酸検出用の特に好ましいキットでは、キットは、限定するつもりは
ないが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ、クレノーフラグメント、クレノーｅｘｏ（−）、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、またはポリ（
Ａ）ポリメラーゼを含む、ピロリン酸分解を触媒する能力を持つ酵素を含むベッ
セルを含む。好ましい実施態様では、ポリメラーゼ濃度は、約０．１−１００ｕ
／μｌの範囲であり、特に好ましい実施態様では、濃度は、約５ｕ／μｌである
。また、ＤＮＡ検出に用いられるキットは、ＮＤＰＫを含むベッセルおよびＡＤ
Ｐを含むベッセルを含む。好ましくは、これらの試薬は、ＡＴＰおよびアデニル
酸キナーゼを混入していない。ＮＤＰＫは、約０．１−１００ｕ／μｌの濃度、
好ましくは約１．０ｕ／μｌの濃度で提供される。混入物は、透析処理によって
酵素から除去することができる。所望であれば、キットは、ｄＴＮＰｓまたはＮ
ＴＰをＡＴＰに増幅するための試薬を含むベッセルを含む。増幅試薬には、限定
するつもりはないが、ピルビン酸キナーゼ、アデニル酸キナーゼ、ＮＭＰＫ、Ｎ
ＤＰＫ、ＡＭＰ（例えば増幅基質として）およびｄＣＴＰまたはＡＭＰ−ＣＰＰ
（例えば高エネルギーリン酸ドナーとして）が含まれる。特に好ましい実施態様
では、キットを、アッセイ方法を行うための指示書を含む単一の封入物内にパッ
ケージすることができる。いくつかの実施態様では、試薬は容器内に提供され、
直説使用または希釈後の使用に適した強さの容器である。代わりの好ましい実施
態様では、また、結果の定量を可能にするための標準セットを提供することがで
きる。さらなるその他の好ましい実施態様では、最適酵素活性のための試験バッ
ファーが含まれる。最も好ましくは、ＮＤＰＫおよび核酸ポリメラーゼを同一反
応混合物内に提供し、そうすることによって、一貫して、シングルポット反応を
行うことができる。もう一つの実施態様では、これらのキットは、エンドヌクレ
アーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性検出での使用に適している。ヌクレアーゼ
活性を検出するためのキットは、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ
のためのＤＮＡ基質（例えば、環状プラスミドまたは直鎖状ＤＮＡ）およびエン
ドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ検出のアッセイで試薬を用いるための
指示書、を含む。
【００９４】 さらなるその他の実施態様では、本発明は、本発明のヌクレアーゼ消化核酸検
出法を行うための核酸検出キットを提供する。いくつかの実施態様では、この試
験キットには、この方法に必要とされる重要な試薬が含まれる。これらの試薬に
は、制限するつもりはないが、ヌクレアーゼ、ＰＲＰＰ合成酵素、ＰＲＰＰ、Ｎ
ＤＰＫおよびＡＤＰをルシフェラーゼおよびルシフェリンと共に含む。好ましい
実施態様では、ヌクレアーゼは、約１−５００ｕ／μｌの濃度で、特に好ましい
実施態様では、約２０ｕ／μｌの濃度で、提供される。特に好ましい実施態様で
は、ＰＲＰＰ合成酵素は、約０．０１ｕ／μｌ−１０ｕ／μｌ、好ましくは、約
０．１ｕ／μｌ、の濃度で提供される。いくつかの好ましい実施態様では、キッ
トは、単一試薬溶液として提供されるルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む
これらの全試薬を含む。最も好ましくは、ＰＲＰＰ合成酵素およびＮＤＰＫは、
単一反応混合物中に提供され、そうすることによって、これら２つの酵素を含む
シングルポット反応を成し遂げることができ、検出方法を単純化することができ
る。好ましい実施態様では、本発明のキットは、好ましくは、発明の方法を成し
遂げる指示書を含むことが望ましい単一パッケージの形である。試薬は、直説使
用または希釈後の使用に適した強度を持つベッセル内に提供される。好ましくは
、最適の酵素活性を支えるバッファーが提供される。所望であれば、ＡＴＰシグ
ナルを増幅するための試薬も、上記のように提供される。
【００９５】 本発明のもう一つの態様では、試験キットは、試験サンプル内の微生物または
その他の細胞の存在を決定するために提供される。好ましい実施態様では、試験
キットは、方法に必要な重要な試薬を含む。いくつかの好ましい実施態様では、
これらの試薬には、限定するつもりはないが、ルシフェラーゼによって利用され
得ない高エネルギーリン酸ドナー、好ましくはｄＣＴＰおよびＡＭＰが、ルシフ
ェラーゼおよびルシフェリンと共に含まれる。代わりの好ましい実施態様では、
キットは、同一溶液内に提供されたルシフェラーゼおよびルシフェリンを含むこ
れらの全試薬を含む。その他の好ましい実施態様では、試薬は、限定するつもり
はないが、アデニル酸キナーゼおよびＡＴＰ（即ち間違った正の結果の原因とな
りうる混入物質）を含む混入成分を含まない。さらなるその他の実施態様では、
細胞溶解カクテルを、予定したそれぞれのアッセイ用に、標的細胞の内容物を効
率よく遊離するために提供することができる。原核微生物を検出するためのいく
つかの実施態様では、カチオン性界面活性剤のみが必要である。真菌胞子、酵母
、または真核生物細胞アッセイのためのさらなるその他の実施態様では、さらな
る非イオン性界面活性剤を含む。好ましい実施態様では、試薬を、直説使用また
は希釈後使用に適した強さのベッセル内に提供する。特に好ましい実施態様では
、細胞サンプルを希釈するバッファー溶液もまた、提供される。
【００９６】 本発明のさらなる実施態様では、上記キットは、プライマー仲介特異的核酸検
出のためのプライマーまたはプローブを含むことができる。いくつかの実施態様
では、キットは、興味ある核酸のために、少なくとも一つの核酸プローブを含む
。その他の実施態様では、キットは、複数のプライマーを含み、そのそれぞれは
、疑問位置に異なる塩基を含む。それぞれの実施態様では、キットは、核酸内の
特定塩基の同一性の調査に用いるための、一つより多くの塩基対によって異なる
２つの相同核酸間を識別するための、そして、核酸が欠失または挿入変異を含む
か否かを決定するための、指示書を含む。キット内に含まれうる核酸プローブの
型およびその使用は、以下により詳細に記載されている。 １０． プライマーの仲介する特異的核酸検出 また、脱重合反応を、核酸内の特定塩基の同定を予想するために用いることが
できる。例えば、核酸内の単一塩基の点変異、欠失、または挿入の同定は、以下
の方法に従って、決定することができる。
【００９７】 一つの実施態様では、点変異を含む、または含むと考えられる標的核酸に実質
上相補的な、核酸プローブを合成する。複数の核酸プローブを用いると、サンプ
ル内の複数の標的核酸を同定することができると、期待される。様々なハイブリ
ダイゼーション条件を用いると、ハイブリダイゼーションの起こるストリンジェ
ンシーを変化させうることが、分かるであろう。このように、用いられるシステ
ムに従って、プローブの相補性を変化させることができる。プローブの長さ、Ｇ
Ｃ含量、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、
プローブは、標的核酸と１０ほどの塩基ミスマッチ、好ましくは５より少ないミ
スマッチを持つことができる。最も好ましくは、プローブは標的核酸と１塩基の
みのミスマッチを持つか、または標的核酸と完全に相補性である。核酸プローブ
は、一本鎖核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。プローブは、長さを、好
ましくは約１０−１００塩基、最も好ましくは約１５−３０塩基に変化させるこ
とができる。特に好ましい実施態様では、プローブは、疑問位置と核酸プローブ
の３’末端との間のすべての塩基で、標的と相補的である。
【００９８】 好ましい実施態様では、疑問位置にあらかじめ決められたヌクレオチドを持つ
プローブを設計する。相補的プローブ塩基対が標的核酸とハイブリダイズする場
合、疑問位置の塩基を、塩基対合が起こるような条件下でその同一性が決定され
るべきである、核酸標的内の塩基とアラインする。疑問位置はプローブ内で変化
させることができると考えられる。例えば、いくつかの好ましい実施態様では、
疑問位置は、好ましくは核酸プローブの３’末端から１０塩基内にある。さらな
るその他の好ましい実施態様では、疑問位置は、核酸プローブの３’末端から６
塩基内にある。特に好ましい実施態様では、疑問位置は、核酸プローブの３’末
端の最後の次、または最後の塩基である。
【００９９】 いくつかの好ましい実施態様では、そのそれぞれが疑問位置に異なるヌクレオ
チドを有する、同じ長さの異なる４プローブを合成する。従って、いくつかの実
施態様では、１セットのＤＮＡプローブは、疑問位置にデオキシアデノシン残基
を持つ第一プローブ、疑問位置にデオキシチミジン残基を持つ第二プローブ、疑
問位置にデオキシグアノシン残基を持つ第三プローブ、疑問位置にデオキシシト
シン残基を持つ第四プローブを含む。同様に、１セットのＲＮＡプローブは、疑
問位置にアデノシン残基を持つ第一プローブ、疑問位置にウリジン残基を持つ第
二プローブ、疑問位置にグアノシン残基を持つ第三プローブ、疑問位置にシトシ
ン残基を持つ第四プローブを含む、と考えられる。
【０１００】 いくつかの実施態様の次の段階では、プローブまたはプローブ類を別反応で標
的核酸にハイブリダイズさせると、その結果、プローブ核酸−標的核酸複合体が
形成される。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さおよび塩基組成に
依存して変化すると考えられる。プローブ−標的核酸複合体では、疑問位置のヌ
クレオシドを特定塩基とアラインし、核酸内で同定する。１セットのプローブを
用いる実施態様では、別々の反応が、それぞれのプローブで行われる。プローブ
は疑問位置で異なるため、一つのプローブだけが疑問位置でアラインする標的核
酸内の特定塩基と相補的である。
【０１０１】 いくつかの実施態様の次の段階では、核酸プローブ−標的核酸複合体を、ピロ
リン酸分解によってプローブの脱重合を可能にする条件下で、個々に反応させる
。ピロリン酸分解の好ましい反応条件は、反応１として上に、および、以下の実
施例中に、記載されている。次に、ヌクレオチドを検出する。好ましい実施態様
では、反応混合物は、また、反応４および以下の実施例に記載のように、ＸＴＰ
のＡＴＰ等価物への変換を触媒するために必要な試薬を含む。いくつかの好まし
い実施態様では、脱重合反応によって生成されるヌクレオチドおよび／またはＡ
ＴＰを、次に、ルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出システムによって検出する。
核酸プローブの疑問位置での塩基と核酸標的内の関連塩基との相補性は、脱重合
に次ぐＡＴＰから生成されたシグナルの検出によって特徴付けられる。
【０１０２】 特に好ましい実施態様では、特定塩基の同一性は、それぞれの反応で生成され
るＡＴＰ量を比較することによって、決定される。プローブの脱重合は、その３
’末端から進行する。疑問位置の塩基が核酸内の特定塩基と相補的でない場合、
非常に少量のＡＴＰが生成されるか、またはＡＴＰは全く生成されず、従って、
シグナルは結果として生じない。代わりの実施態様では、この方法を、１−４の
プローブで実施することができる。用いられる複数プローブ（例えば疑問位置に
異なる塩基を持つそれぞれ）は、（例えば第一プローブで）正のシグナルが生成
されるとは限らない、と考えられる。
【０１０３】 さらなるもう一つの好ましい実施態様では、本発明のプライマーの仲介する特
定核酸検出法を用いると、興味ある核酸の同定を単純化する、または検出するこ
とができる。この方法では、ＲＮＡまたはＤＮＡであることのできる標的核酸に
実質上相補的である核酸プローブ（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を、用いる。い
くつかの実施態様では、複数プローブを用いて、複数の標的核酸を検出すること
ができると、考えられる。特に好ましい実施態様では、核酸プローブは、その全
体が標的核酸と相補的である。核酸プローブは、一本鎖核酸（例えばＤＮＡまた
はＲＮＡ）を含む。プローブは、長さを、好ましくは約１０−１００塩基、最も
好ましくは約１５−３０に、変化させることができる。検出は、上記のように行
われる。核酸プローブ−核酸標的複合体をプローブの脱重合を許す条件に晒すと
、結果としてＸＴＰｓが生成される。興味ある核酸の検出は、生成されたＸＴＰ
ｓによって生成されるシグナルの差によって特徴付けられる。好ましくは、ＸＴ
Ｐｓは、上記のようにＡＴＰに変換され、ＡＴＰは、ルシフェラーゼまたはＮＡ
ＤＨ検出システムによって検出される。
【０１０４】 もう一つの実施態様では、標的核酸内に損傷が存在するか、または存在しない
かを検出することができる。損傷は、野生型標的核酸内の挿入変異か、または欠
失変異のいずれかであることができる。野生型標的核酸は、標的プローブをハイ
ブリダイズすることのできる、相補性の領域を含む。従って、野生型標的核酸内
の相補性領域は、核酸プローブの５’および３’末端によって範囲を限定される
。相補性領域が損傷を含んでいる場合でも、なお、核酸プローブは標的核酸をハ
イブリダイズすることができるが、ハイブリダイゼーションは部分的にのみ起こ
る。損傷の大きさおよび姿に依存して、プローブの５’末端または３’末端は、
標的核酸とハイブリダイズすることができるか、またはループの存在を特徴とす
るハイブリダイゼーション構造を形成することができる。個々のこれらのケース
では、脱重合が妨害されるであろう。好ましくは、核酸プローブを設計し、そう
することによって、検出される損傷が、プローブの３’末端から約１０より少な
い塩基、好ましくは約６より少ない塩基で始まる。核酸プローブは、一本鎖核酸
（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。プローブは、その長さを、好ましくは約
１０−１００塩基、最も好ましくは約１５−３０塩基、に変化させることができ
る。損傷を含む核酸の検出は、生成したＸＴＰから発生したシグナルの差によっ
て特徴付けられる。好ましくは、上記のように、ＸＴＰｓをＡＴＰに変換し、Ａ
ＴＰは、ルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出システムによって検出した。
【０１０５】 上記のプライマー−仲介特定核酸検出法によって生成したシグナルの増加は新
規の循環法によって実感できるであろう。本発明のこの実施態様では、互いに相
補的であり、互いにハイブリダイズする場合に互いの末端に３’突出を持つ２つ
のプライマーを設計する。好ましい実施態様では、３’突出が単一塩基の突出で
あるように、プライマーをデザインする。代わりの実施態様では、プライマーは
、また標的核酸ともハイブリダイズする。特に好ましい実施態様では、核酸の３
’末端から働き、３’突出を認識しないポリメラーゼが、脱重合反応に用いられ
る。
【０１０６】 好ましい実施態様では、反応の第１段階は、ポリメラーゼ存在下および上記の
ような脱重合を許す条件下での、標的核酸への過剰な一つのプライマーのハイブ
リダイゼーションを含む。いくつかの実施態様では、３’突出は存在せず、脱重
合反応はプライマーの３’末端から進行する。いくつかの実施態様では、反応は
、プライマー−標的核酸複合体を加熱することによって、標的核酸からプライマ
ーを分離することによって、終結する。平均では、一つのみの塩基を、標的核酸
に結合したプライマーから除去し、より短いプライマーのフラクションを創造す
る。
【０１０７】 第二の段階では、過剰の第二プライマーを反応に加える。マス作用の法則によ
り、第１段階で作成されたより短いプライマーは、新たに加えられた相補的プラ
イマーと結合する傾向を持つが、短くなっていないプライマーは標的核酸と結合
する。相補的プライマーと結合する短いプライマーは、一端に３’突出を持つ複
合体を生成し、脱重合される。このことにより、脱重合反応で得られる基質の量
は効率良く二倍になる。段階１および２は、所望の検出レベルが得られるまで、
さらなる回数繰り返すことができる。代わりの好ましい実施態様では、反応は、
上記のようにＮＤＰＫと共役し、ルシフェラーゼを基本とした、またはＮＡＤＨ
を基本としたアッセイシステムによって検出ことのできるＡＴＰ等価物を生成す
る。
【０１０８】 また、核酸内の特定の塩基の同定を予想する能力は、異なる種からの、または
異なる対立遺伝子からの、核酸間の識別を可能にする。関連するまたは関連しな
い種の核酸間を検出し識別する能力もまた、得られた核酸−含有サンプル内に含
まれる種の同定を可能にする。例えば、方法は、いくつかの関連する細菌種がサ
ンプル（例えば、臨床サンプル、環境サンプル、または非ヒト−動物からのサン
プル）内に含まれるかを決定するために用いることができる。いくつかの実施態
様では、複数の核酸プローブを用いると、サンプル内の複数の核酸標的を検出す
ることができると考えられる。
【０１０９】 本発明の好ましい実施態様では、少なくとも２つの種または対立遺伝子からの
実質上同一の配列を持つ核酸を検出する。同一領域は、種間または対立遺伝子間
の少なくとも一つの前もって決められた位置に、少なくとも一つのヌクレオチド
ミスマッチを含み、また、３’末端および５’末端を含む。
【０１１０】 次に、いくつかの実施態様では、実質上同一領域と相補的なＲＮＡおよびＤＮ
Ａプローブを合成する。プローブは、その長さを、好ましくは約１０−１００塩
基、最も好ましくは約１５−３０塩基で、変化させることができる。上記のよう
に、この相補的プローブは、疑問位置を含む。疑問位置は、プローブ内で変化さ
せることができる。例えば、疑問位置は、好ましくは核酸プローブの３’末端か
ら１０塩基内にある。より好ましくは、疑問位置は、核酸プローブの３’末端か
ら６塩基内にある。最も好ましくは、疑問位置は、核酸プローブの３’末端の最
終残基の次または最終残基である。核酸プローブを、疑問位置の塩基が一つの種
または対立遺伝子のあらかじめ決められた位置のヌクレオチドと相補的であるが
、もう一つはミスマッチにより相補的でないように、設計する。同様に、第二の
種または対立遺伝子の前もって決定された位置のヌクレオチドと疑問位置で相補
的な第二のプローブを合成することができる。
【０１１１】 この同一の方法を用いると、与えられたサンプル内の複数の種の存在を同定す
ることができる。これらの実施態様では、要求されるすべてが、塩基ミスマッチ
を含む種間の実質上同一配列の同定である。
【０１１２】 いくつかの実施態様の次の段階では、分離反応を、それぞれのプローブを用い
て行う。プローブは、標的核酸とハイブリダイズして、プローブ核酸−標的核酸
複合体を形成することができる。プローブ核酸−標的核酸複合体では、疑問位置
のヌクレオチドを、核酸内のあらかじめ決めて置いた位置でヌクレオチドとアラ
インし、その結果、塩基対合が起こる。次に、プローブ−標的核酸複合体を、そ
の３’末端からのプローブの脱重合を可能にする条件下で反応させる。脱重合の
好ましい条件は、実施例中、および反応１に記載されている。次に、ヌクレオチ
ドを検出する。いくつかの好ましい実施態様では、ヌクレオチドを、反応４およ
び実施例に記載の方法に従って、ＡＴＰ等価物に変換する。好ましい実施態様で
は、ＡＴＰは、ルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出システムによって検出される
。
【０１１３】 本発明のこれらの実施態様では、プローブの疑問位置のヌクレオチドが種から
の核酸のあらかじめ決めておいた位置でヌクレオチドと相補的である場合のみ、
脱重合によりＮＴＰｓを生成するので、異なる種または対立遺伝子からの核酸間
の識別が可能になる。上記のように、有意の脱重合は、疑問位置での塩基が標的
核酸内のあらかじめ決めて置いた位置で、塩基と相補的である場合にのみ、進行
する。ＡＴＰ濃度を含むＮＴＰ濃度は、ミスマッチが存在しない場合と比較して
、ミスマッチが存在する場合、異なる。これらの差は、（例えばＡＴＰまたはＮ
ＡＤＨ検出システムのいずれかによって）検出することができる。 １１． エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性の検出 また、本発明を用いると、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性
をそのような活性を含むと考えられるサンプル中で検出することができる。一つ
の実施態様では、核酸基質を、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活
性を含むと考えられるサンプルに加える。いくつかの実施態様では、基質は、好
ましくは二本鎖核酸、最も好ましくはＤＮＡである。混合物を、サンプル中に存
在する任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性に充分な時間、
インキュベートし、基質を消化する。いくつかの実施態様では、インキュベーシ
ョンは、約１−１８時間であろうが、好ましい実施態様では、インキュベーショ
ンは約１２時間である。インキュベーション後、残留核酸量を、ピロリン酸分解
による脱重合を通して検出する。従って、いくつかの実施態様では、次に、イン
キュベーション混合物のアリコートを脱重合を許す条件に晒す。これらの条件は
、反応１および実施例に記載されている。次いで、脱重合によって生成されたヌ
クレオチドを検出する。いくつかの実施態様では、脱重合によって生成されたヌ
クレオチドを、反応４および実施例に記載の方法に従って、ＡＴＰ等価物に変換
する。好ましい実施態様では、ＡＴＰは、ルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出シ
ステムによって検出される。残留核酸がアッセイされるため、「ヌクレアーゼ（
−）」対照と比較したアッセイ値の減少（例えばルシフェラーゼ検出システムを
用いる場合は光ユニット）は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活
性の存在による。
【０１１４】 本発明のもう一つの実施態様では、エンドヌクレアーゼ活性を特異的に検出す
ることができる。閉環ＤＮＡは、脱重合を開始することのできるＤＮＡ末端を持
たないので、ピロリン酸分解の通常の基質ではない。それ故、いくつかの実施態
様では、閉環ＤＮＡ基質が、エンドヌクレアーゼを含むと考えられるサンプルに
加えられる。混合物を、サンプル中に存在する任意のエンドヌクレアーゼ活性に
充分な期間インキュベートし、基質を消化する（例えば基質中に二本鎖のブレー
クまたはニックを作り出す）。いくつかの実施態様では、インキュベーションは
、約１−１８時間であるが、好ましい実施態様では、インキュベーションは約１
２時間である。インキュベーション後、次に、インキュベーション混合物のアリ
コートを、脱重合を許す条件下に晒す。これらの条件は反応１、および実施例中
に記載されている。次に、脱重合によって生成したヌクレオチドを検出する。い
くつかの実施態様では、脱重合によって生成したヌクレオチドを、反応４および
実施例に記載の方法に従って、ＡＴＰ等価物に変換する。好ましい実施態様では
、ＡＴＰはルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出システムによって検出される。エ
ンドヌクレアーゼ活性の存在は、エンドヌクレアーゼ（−）対照と比較した場合
、アッセイユニットの増加（例えば、ルシフェラーゼ検出システムを用いる場合
光ユニットの増加）によって特徴づけられる。
【０１１５】 本発明のもう一つの実施態様では、エキソヌクレアーゼ消化によって生成され
たｄＮＭＰをＡＴＰに変換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を、定性
的にまたは定量的に検出することができる。いくつかの実施態様では、核酸基質
、好ましくはＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を含むと予想されるサンプルに
加える。混合物を、サンプル中に存在する任意のエキソヌクレアーゼに充分な期
間インキュベートすると、基質に作用する。いくつかの実施態様では、インキュ
ベーション時間は、約０．５−約４時間であるが、好ましい実施態様では、イン
キュベーション時間は約１時間である。インキュベーション後、次に、インキュ
ベーションのアリコートを、エキソヌクレアーゼ消化によって生成したｄＮＭＰ
ｓのｄＮＴＰｓへの変換を許す条件下に晒す。この反応は、ＰＲＰＰ合成酵素お
よびＰＲＰＰを必要とし、反応３および実施例中に記載されている。次に、ヌク
レオチドを検出する。いくつかの実施態様では、反応４および実施例中に記載し
た方法に従って、ｄＮＴＰｓをＡＴＰに変換することができる。いくつかの実施
態様では、ＡＴＰは、ルシフェラーゼ検出システムまたはＮＡＤＨ検出システム
によって検出される。エキソヌクレアーゼ活性の存在は、ヌクレアーゼ（−）対
照と比較した場合のアッセイユニットの増加（例えば、ルシフェラーゼ検出シス
テムを用いる場合、光ユニットの増加）を特徴とする。
【０１１６】 本発明のその他の態様は、以下の実施例で明らかにされるであろう。これらの
実施例は、本発明を説明するつもりのものであって、如何なる場合も本発明の態
様を制限するものではない。プローブに関連する配列ＩＤ番号は、表９３に提供
されている。 実施例 本明細書では以下の略語を使用している；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮ
Ａ（リボ核酸）；ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）；ＮＤＰＫ（ヌクレオシド
２リン酸キナーゼ）；ＮＴＰ（リボヌクレオシド５’−３リン酸）；ＮＤＰ（リ
ボヌクレオシド５’−２リン酸）；ＡＴＰ（アデノシン５’−３リン酸）；ＧＴ
Ｐ（グアノシン５’−３リン酸）；ＣＴＰ（シチジン５’−３リン酸）；ＵＴＰ
（ウリジン５’−３リン酸）：ＡＤＰ（アデニン５’２リン酸）；ＡＭＰ（アデ
ノシン５’−１リン酸）；ＧＭＰ（グアノシン５’−１リン酸）；ＵＭＰ（ウリ
ジン５’−１リン酸）；ＣＭＰ（シチジン５’−１リン酸）：ｄＡＭＰ（デオキ
シアデノシン５’−１リン酸）；ｄＧＭＰ（デオキシグアノシン５’−１リン酸
）；ｄＴＭＰ（デオキシチミジン５’−１リン酸）；ｄＣＭＰ（デオキシシチジ
ン５’−１リン酸）：ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン５’−３リン酸）；ｄＧＴ
Ｐ（デオキシグアノシン５’−３リン酸）；ｄＣＴＰ（デオキシシチジン５’−
３リン酸）；ｄＴＴＰ（デオキシチミジン５’−３リン酸）：ｄＮＴＰ（デオキ
シリボヌクレオシド５’−３リン酸）；ｄＮＤＰ（デオキシリボヌクレオシド５
’−２リン酸）；ＸＴＰ（リボヌクレオシド５’−３リン酸及び／又はデオキシ
リボヌクレオシド５’−３リン酸）、ＸＭＰ（リボヌクレオシド５’−１リン酸
及び／又はデオキシリボヌクレオシド５’−１リン酸）；Ｐｐｉ（ピロリン酸）
；ＰＲＰＰ（ホスホリボシルリン酸）；ＡＭＰ−ＣＰＰ（α、βメチレンアデノ
シン５’−３リン酸）；ＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）；ＭＭＬＶ（マウ
スマロネー白血病ウイルス）；ＡＭＶ（トリ骨髄芽性白血病ウイルス）；ＨＩＶ
（ヒト免疫不全ウイルス）；ＲＬＶ（ラウシャー白血病ウイルス）；及びｕ（単
位）。
【０１１７】 実施例１：ルシフェラーゼを用いたＡＴＰの検出 酵素をベースとした検出システムを利用する検出法の最終感度は、バックグラ
ンドを越える測定可能シグナルを生ずる酵素反応能に関係する。本実施例はルシ
フェラーゼを用いた極めて低レベルのＡＴＰの検出を記述する。
【０１１８】 ルシフェラーゼアッセイ試薬バッファー（ＬＡＲ）は、１９．１ｍｌのナノピ
ュアー水；８００μｌの０．５Ｍトリシン（ＳｉｇｍａＴ９７８４）、ｐＨ８．
９；７０μｌのＭｇＳＯ4（Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＡ３１９、ロット＃９７０９３ １）；４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＡ１８９、ロット＃９
６２１３１）；０．１３ｇＤＴＴ（ジチオスレイトール、ＰｒｏｍｅｇａＶ３１
ＳＡ）；０．００３ｇのビートルルシフェラーゼ（ＰｒｏｍｅｇａＥ１６０Ｃ、
ロット＃７９８３８）；０．００４４ｇの補酵素Ａ、ｐＨ７．８（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ２８−３００１−０３ロット＃７０５３００１０３１）を混合し、作製し
た。０．１ＭのＡＴＰ液は固体ＡＴＰ（ＳｉｇｍａＡ９１８７）をＴｒｉｓ−Ｃ
ｌ １０ｍＭ、ｐＨ７．５に溶解して調製した。この保存液をＴｒｉｓ−Ｃｌ、
１０ｍＭ、ｐＨ７．５で希釈し１００μＭ、１μＭ、１０ｎＭ及び１００ｐＭの
溶液を調製した。組換え体ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃１７０１、ロット
＃６４１４００２）をナノピュア水を用いて１ｍｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及
び１０μｇ／ｍｌに希釈した。
【０１１９】 反応液は、以下の成分を表１に従い含む形で２系列調製された。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】 ルシフェラーゼ添加直後にチューブをターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメータ
ーで読みとった。得られた値を表２に示す。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】 ルシフェラーゼは光シグナルを生むためにはＡＴＰとルシフェラーゼを必要と
する。上記反応により生まれる光は反応液に加えられたＬＡＲ試薬またはルシフ
ェラーゼいずれかのＡＴＰ汚染の結果である。以後の研究では、ＡＴＰ添加が無
い場合に生ずるバックグランド光のレベルが最低であるが、ＡＴＰ添加により光
出力が大きく増加する量である１０及び５ナノグラムのルシフェラーゼを選んだ
。
【０１２４】 反応液は５０μｌのＬＡＲバッファー、５または１０ｎｇのルシフェラーゼを
反応液にもたらす１μｌのストックルシフェラーゼ、及びＡＴＰを下表の濃度に
て含む形で２系列調製された。反応液からの光出力はすぐにターナー社製ＴＤ−
２０ｅルミノメーターで測定された。結果を表３に示す。これらデータは、試薬
のＡＴＰ汚染から生ずるバックグランドを最小にするレベルでルシフェラーゼを
利用した場合でも、ルシフェラーゼが低レベルのＡＴＰを検出できることを示し
ている。
【０１２５】
【表３】
【０１２６】 実施例２：ルシフェラーゼを利用したＡＴＰ検出の限界 本実施例は極めて低いレベルのＡＴＰで反応させた時に得られる光出力値は適
当なコントロール反応と統計上異なることを示す。検出限界は、スチューデント
ｔ試験を用いた時コントロール反応のデータに等しくなる確率が０．０５より小
さくなる様なシグナルを生ずる分析体の量として規定される。
【０１２７】 １０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５のＡＴＰ（ＳｉｇｍａＡ９１８７、
ロット＃３６Ｈ７８０８Ｐｒｏｍｅｇａ、−２０℃にて一晩保存）液を５００ｎ
Ｍ及び５０ｎＭに希釈した。様々な量のＡＴＰを３５０μｌのＬＡＲに加え、１
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌにて各種容積に調製した（合計３８５）。コントロー
ルには１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌのみを加え、バックグランドシグナルを測定
した。混合後、５０μｌのコントロールとサンプルの６分取標本をルミノメータ
に移した。ルシフェラーゼ（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（１×ＣＣＬＲ、細胞培養融
解試薬、ＰｒｏｍｅｇａＥ１５３Ａ、ロット＃７９０３２０１）を含む２．５ｎ
ｇ／μｌの１×ＣＣＬＲ２μｌ）を反応液に加え、チューブを叩いて試薬を混合
し、光出力をターナーＴＤ−２０ｅルミノメーターにて測定した。データは表４
に示す。
【０１２８】
【表４】
【０１２９】 スチューデントｔ−試験（異なる分散を示す２サンプルに関する２テールド試
験）を用いてデータを解析した。各ＡＴＰ濃度からの光出力はバックグランドの
光出力と比較し、それぞれの比較についてｐ−値を求めた。分析の結果は表５に
示す。ｐ値が０．０５より小さい時、比較された結果の２組は統計的に相互に異
なっていることを意味している。バックグランドのシグナルに比較した各ＡＴＰ
濃度は０．０５よりも小さいｐ値を示した。従って、この統計試験は、分析した
各ＡＴＰ濃度がバックグランドを越えて検出可能であることを示した。
【０１３０】
【表５】
【０１３１】 実施例３：ルシフェラーゼを用いたｄＡＴＰの検出 検出に利用される酵素がｄＡＴＰを利用できるのであれば、理論上は、ｄＡＴ
Ｐの測定を通じてルシフェラーゼを用いたポリデオキシリボヌクレオシドの検出
が実施できる。本実施例では、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）に比べることでル
シフェラーゼのデオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）の利用能力を試験した
。 反応液は、５０μｌのＬＡＲ、２または４μｌのルシフェラーゼ保存液（反
応液に５ないし１０ｎｇのルシフェラーゼを提供する）及び０または５μｌの１
ｍＭｄＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、ｄＡＴＰの最終濃度は約１００μＭ）を含め調製さ
れた。ルシフェラーゼは最後に加える成分である。酵素を加えた直後に、反応液
の光出力をターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用い決定した。結果は表
６に示す。これらのデータは、ルシフェラーゼがｄＡＴＰの直接検出に利用でき
ることを示している。
【０１３２】
【表６】
【０１３３】 実施例４：ルシフェラーゼのピロリン酸阻害 ルシフェラーゼの反応はＡＴＰまたはｄＡＴＰからリン酸を生じ、ピロリン酸
により阻害される。以下に概略を記す反応の幾つかは、他の酵素の基質としてピ
ロリン酸を用いる。これら反応に於いてヌクレオチドを利用するルシフェラーゼ
検出を阻害しないピロリン酸レベルを使用するため、我々はルシフェラーゼから
の光発生に及ぼす各種濃度のピロリン酸の阻害レベルを測定した。
【０１３４】 新規バッファー、補酵素Ａ無しのＬＡＲは実施例１記載の如くに作製された。
次に本バッファー及び元のＬＡＲを有し、かつ以下に示す成分を持つ各種反応液
を調製した。反応液は、ルシフェラーゼを最後に加える成分として組み立てた。
酵素添加直後、反応液の光出力をターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターで測
定した。結果は表７に示す。これらデータより、ルシフェラーゼからの光出力は
ピロリン酸存在下でも測定可能であり、１００μＭ以下のピロリン酸濃度では活
性は５０％以上が存在することが示された。さらにこれらデータは、ＬＡＲから
補酵素Ａを除くとルシフェラーゼの活性に大きな影響を与えることなく、反応よ
り生ずるバックグランド光が大きく低下することも示された。
【０１３５】
【表７】
【０１３６】 実施例５：ルシフェラーゼ阻害剤としてのＡＤＰの試験 以下に記す反応の概略の幾つかは他の酵素の基質としてＡＤＰを使用する。Ａ
ＤＰはルシフェラーゼの阻害剤でありうる。よって、ルシフェラーゼ及びＡＴＰ
からの光発生に及ぼす各種ＡＤＰ濃度の阻害レベルを測定した。
【０１３７】 ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ）またはＡＴＰの保存液を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７
．５に溶解し、各種濃度に希釈した。５２μｌの２．５μｇ／ｍｌルシフェラー
ゼ、５０μｌのＬＡＲ、５μｌのＡＤＰまたは５μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ
ｐＨ７．５及び５μｌのＡＴＰまたは５μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７
．５を含む反応液を調製した。ルシフェラーゼはこれら反応液に加える最後の成
分である。酵素添加直後、反応液の光出力をターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメ
ーターで測定した。反応液の最終ヌクレオチド濃度及び反応液の光出力を表８に
まとめる。これらデータより、ＡＤＰはＡＴＰを基質として利用するルシフェラ
ーゼの光発生能に大きく影響しないことが示された。換言すれば、低濃度のＡＤ
Ｐを他の酵素を利用し実施された反応液のルシフェラーゼ反応に加えた場合、ル
シフェラーゼを利用したＡＴＰの検出には殆ど影響ないことが期待される。
【０１３８】
【表８】
【０１３９】 実施例６：デオキシヌクレオチドを用いたＡＤＰからＡＴＰへのＮＤＰＫトラ
ンスフォーメーション ルシフェラーゼはｄＡＴＰ又はその他のヌクレオチドに比べ極低濃度のＡＴＰ
を検出できる。ｄＮＴＰｓを用いＡＴＰが生成できれば、感度が増加する可能性
がある。その為、我々はｄＮＴＰｓについて末端のリン酸をＡＤＰに転移し、Ａ
ＴＰ及びｄＮＤＰｓを形成する能力を調べた。
【０１４０】 １００μｌのＬＡＲ、ｄＮＴＰｓ存在下または不在下にて（添加する場合には
最終濃度１μＭ）の１０ｎｇのルシフェラーゼ、ＮＤＰＫ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｎ０
３７９、ロット＃１２７Ｆ８１８０２）１０単位を含む反応液を調製した。ルシ
フェラーゼを除いて反応液を調製し、１５分間室温でインキュベーションした。
ルシフェラーゼを加え、すぐに反応の光出力をターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノ
メーターを用いて測定した。測定された光出力値を表９に示す。これらのデータ
は、ＮＤＰＫがヌクレオチド３リン酸のリン酸をＡＤＰに転移し、ルシフェラー
ゼを用いて検出可能なＡＴＰを形成することができることを確証する。
【０１４１】
【表９】
【０１４２】 実施例７：ＮＤＰＫ及びＡＴＰ類似体を利用したＡＤＰからＡＴＰのＮＤＰＫ
トランスフォーメーション ヌクレオチドをトランスフォーメーションすることに使用される酵素の幾つか
は、リン酸ドナーとしてアデノシンヌクレオチドに特異性を示す。ルシフェラー
ゼ検出システムが利用される場合、これら転移酵素の高エネルギーリン酸ドナー
としてアデノシンヌクレオチドが利用できない可能性がある。それはルシフェラ
ーゼにより、添加されたアデノシンヌクレオチドから光が作られるからである。
本実施例は、転移酵素では利用可能であり、ルシフェラーゼでは利用不可能なこ
れら類似体の能力を試験する方法を示す。
【０１４３】 およそ５ｍｇのＡＴＰ（ＳｉｇｍａＡ９１８７、ロット＃３６Ｈ７８０８）、
α、βメチレンアデノシン５’−３リン酸（ＡＭＰ−ＣＰＰ）（ＳｉｇｍａＭ６
５１７、ロット＃９６Ｈ７８１３）及びβ、γメチレンアデノシン５’−３リン
酸（ＡＭＰ−ＰＰＰ）（ＳｉｇｍａＭ７５１０、ロット＃３４Ｈ７８４０）をＴ
ｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭ、ｐＨ７．５中に希釈した。これら溶液の５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５による１：１００希釈液の吸光度をベックマンＤＵ６５
０分光光度計を利用し２５９ｎｍにて測定した。吸光度と、分子吸光係数１５．
４×１０3Ｍを利用し、これら溶液の濃度を決定した。組換え体ルシフェラーゼ は１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＣＣＬＲ中、濃度２．５ｎｇ／ｍｌに希釈された。
反応液を調製する場合、２．５ｎｇ／ｍｌの保存液から２μlのルシフェラーゼ を加え、すぐに溶液の光放射をターナー社製のＴＤ−２０ｅルミノメーターを用
い読みとった。データを表１０に示す。
【０１４４】
【表１０】
【０１４５】 これらＡＰＴ類似体のマイクロモル液はヌクレオチドを添加されていない反応
液を越える光は生じず、また低レベルのＡＴＰを含む反応液の光出力をこれら類
似体が存在しない状態の値に比べ大きく低下させることはなかった。これら類似
体はルシフェラーゼを阻害せず、ルシフェラーゼにより利用されない。即ち、こ
れらのデータはこれら類似体がヌクレオチドのトランスフォーメーションに関す
る酵素に共に使用される能力について試験可能であることを示す。
【０１４６】 以下の反応を行い、ＡＭＰ−ＣＰＰまたはＡＭＰ−ＰＣＰがＮＤＰＫにより利
用可能であるか決定した。全ての反応液は２系列調製され、室温で２０分間イン
キュベーションされた。１０ナノグラムのルシフェラーゼを加え、すぐにターナ
ー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用いて反応液の光出力を測定した。データ
を表１１に示す。これらデータは、類似体ＡＭＰ−ＣＰＰが酵素ＮＤＰＫにより
基質として利用され、ＡＤＰからＡＴＰが生成されることを示している。示され
たＡＭＰ−ＣＰＰ、ＡＤＰ及びＮＤＰＫに関する値は、ＡＤＰ単独、ＡＭＰ−Ｃ
ＰＰ無しのＡＤＰ及びＮＤＰＫ、並びにＮＤＰＫに関する値に比べ実質的に高い
。その他の酵素についても同様の実験を行い、同様の様式にてヌクレオチド基質
を利用するそれらの能力を試験することができる。
【０１４７】
【表１１】
【０１４８】 実施例８：ＡＤＰのＮＭＰＫトランスフォーメーション 本実施例は、ヌクレオシド２リン酸をルシフェラーゼによる光発生に利用可能
であるヌクレオチドにトランスフォームする能力について試験する方法を示す。
酵素ヌクレオシド１リン酸キナーゼ（ＮＭＰＫ、Ｓｉｇｍａ，Ｎ−４３７９）は
ＡＴＰからリン酸をＵＭＰに転移し、ＵＤＰとＡＤＰを形成する。本実験は、こ
の酵素標本もおそらく以下の反応によるＡＤＰからのＡＴＰ形成に利用可能であ
ることを示している： ２ＡＤＰ→ＡＴＰ＋ＡＭＰ 反応液は表１２記載の如くに２系列調製し、室温で３０分間インキュベーション
した。その後、ルシフェラーゼ１０ｎｇを加え、ターナー社製ＴＤ−２０ｅルミ
ノメーターを用いて溶液の光出力を測定した。データは表１２に示した。これら
データは、ＮＭＰＫがＡＤＰをＡＴＰに転換できることを示した。同様の実験を
使用することにより、他の酵素の同様のトランスフォーメーション能力を試験す
ることができる。
【０１４９】
【表１２】
【０１５０】 実施例９：ＯＮＰＫとＤＮＰＫ、ｄＣＴＰ及びＡＭＰの組み合わせ。 ＡＴＰシグナルを増幅する可能性のある方法の一つは、２種類の酵素とリン酸
ドナーを必要とする。このシステムを作動するには、第１酵素Ｅ１がＡＭＰをＡ
ＤＰに転換するが、リン酸ドナーを使用できないものでなければならない。第２
酵素、Ｅ２はリン酸ドナーを効率的に使用し、形成されたＡＤＰをＡＴＰにトラ
ンスフォームしなければならない。本実施例は、この様な組み合わせ反応に利用
される酵素の組み合わせの能力について試験する方法を示す。上記実施例は、Ｎ
ＤＰＫがｄＣＴＰをリン酸ドナーとして使用して、ＡＤＰをＡＴＰにトランスフ
ォームできることを示している。
【０１５１】 反応液を表１３に示すように調製し、室温で３０分間インキュベーションした
。次に１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む２ｍｌの１ＸＣＣＬＲ中のルシフェラーゼ１
０ｎｇを加え、ターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用いて反応液の光出
力を測定した。データは表１３に示す。
【０１５２】 ＮＭＰＫがｄＣＴＰを基質として用いＡＭＰをＡＤＰにトランスフォームでき
れば、大量のＡＴＰを生成できた反応は反応４である。ルシフェラーゼを介した
光発生にて測定されるとおり、この反応は極少量のＡＴＰのみ生成した。反応５
（ＮＤＰＫを用い、加えたｄＣＴＰを利用してＡＤＰをＡＴＰにトランスフォー
ムする）及び反応６（ＮＭＰＫを用いＡＤＰをＡＴＰにトランスフォームする）
がより多くのＡＴＰを生成した。全ての酵素が活性であることが示されているこ
とから、これらのデータはＮＭＰＫが本質的にｄＣＴＰを利用しＡＭＰをＡＤＰ
にトランスフォームできないことを示している。このことは上記ＡＴＰ増幅シス
テムにとって必須条件である。この具体例ではＥ１（ＮＭＰＫ）はリン酸ドナー
（ｄＣＴＰ）を利用できないが、ＡＭＰとＡＴＰを使用して２分子のＡＤＰを生
成することができる（反応６の逆反応）。第２酵素、Ｅ２（ＮＤＰＫ）はリン酸
ドナー（ｄＣＴＰ）を使用し、第１酵素により生成されたＡＤＰをトランスフォ
ームして２ｄＣＴＰを使用し２ＡＤＰから２ＡＴＰを作ることができる。これら
のＡＴＰｓは次にこのサイクルに戻る。このプロトコルを使用し、高度とリン酸
ドナーの組み合わせについて、これらのＡＴＰ増幅法に於いて酵素として機能す
る能力について試験することができる。
【０１５３】
【表１３】
【０１５４】 実施例１０：ＡＴＰスパイクによるＮＭＰＫ、ＮＤＰＫ、ｄＣＴＰ及びＡＭＰ
を用いたＡＴＰの増幅 実施例９に示された酵素の組み合わせは、先に概略が示されたサイクル型の増
幅反応を介することで相対ＡＴＰ濃度を大きく増加できるべきである。本実施例
は、これら酵素とヌクレオチドを用いた入力ＡＴＰの異なるレベルの増幅を示す
。反応液は表１４に示す様に調製され、室温でインキュベーションされた。反応
液がインキュベーション時間０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１
８０及び２４０分に達した時、各反応液のサンプル１１２μｌをルミノメーター
チューブに移し、１０ｎｇのルシフェラーゼを加えた。すぐにターナー社製ＴＤ
−２０ｅルミノメーターを用い反応液の光出力を測定した。データを表１５に示
す。
【０１５５】 ＡＴＰが加えられた反応液（反応液１、２及び３）は、ＡＴＰを添加していな
い反応液に比べより迅速にＡＴＰを増加した。ＡＴＰの増加速度は反応液に加え
られたＡＴＰ量に依存した。即ち、酵素のこの組み合わせは入力ＡＴＰシグナル
を増幅し、特定時間に生成されたＡＴＰ量は加えられたＡＴＰ出発量に依存した
。
【０１５６】 更に反応液の組み合わせを用い、使用者が、使用したいずれかの酵素がシステ
ムに影響を及ぼすかもしれない予想外の活性により汚染されているかを測定する
ことを可能にする。例えば、システムからＮＭＰＫ，ｄＣＴＰ又はＡＭＰを除く
と予想通り何らかのＡＴＰの蓄積を阻害する。しかし、ＮＤＰＫのみを除いた場
合のＡＴＰ蓄積速度への影響は極わずかである。これらのデータは、使用したＮ
ＭＰＫ源が、本システムにおいてＮＤＰＫの位置を取り得る少量の活性を含むこ
とを示す。
【０１５７】 同様の実験を行うことで、使用者が、実施例１１に示す様にこの様な増幅法に
他の酵素が使用可能であるか決定することを可能にする。
【０１５８】
【表１４】
【０１５９】
【表１５】
【０１６０】 実施例１１：アデニレートキナーゼ及びピルビン酸キナーゼを用いたＡＴＰの
増幅 本実施例は非ヌクレオシドベースリン酸ドナーを利用する第２の増幅システム
を示す。使用した酵素は：アデニレートキナーゼ（１ＡＴＰと１ＡＭＰより２Ａ
ＤＰを生成するが、リン酸ドナーとしてＰＥＰは利用できない酵素）及びピルべ
ーとキナーゼ（ＰＥＰをリン酸ドナーとして利用しＡＤＰをリン酸化してＡＴＰ
を生成する酵素）である。反応液は表１６の様に調製された。これら反応液を室
温でインキュベートし、１０９μｌの反応液を０、３０、６０及び１２０分目に
取り出した。ルシフェラーゼ（２μｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ入り１×ＣＣＬＲ中
に１０ｎｇ）を加え、すぐにターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用いて
反応液の光出力を測定した。データを表１７に示す。
【０１６１】 インキュベーション３０分後に、ＡＴＰを含む反応液（反応液１）はＡＴＰを
加えられていない反応液（反応液２）に比べて、より迅速に増加した。即ち、Ａ
ＴＰサンプルが増幅された。この反応液のセットでは、反応液１及び２のＡＴＰ
含有量は最終ＡＴＰレベルに達したことも注目される。このことは、反応が平衡
値に達したことを意味する。
【０１６２】 最終的には、ＡＭＰを加えていない反応液も時間と共に増加した。この事は成
分の一つがＡＭＰ又はＡＤＰにより汚染されていたことを示す。更に実験は本研
究で使用されたピルべートキナーゼ中にヌクレオチドの汚染が存在していたこと
を示した。以下の実施例は、この汚染ヌクレオチドを除去する方法を示す。
【０１６３】
【表１６】
【０１６４】
【表１７】
【０１６５】 実施例１２：透析を利用したピルベートキナーゼ中の干渉物質の除去 本実施例は他の実施例で考察される各種技術の中で用いられている酵素中の汚
染ヌクレオシドを検出し、汚染物質を除去する方法を示す。
【０１６６】 更に、別の増幅方法を記す。この方法では：アデニレートキナーゼ（Ｅ１）；
ＮＤＰＫ（Ｅ２）；ＡＭＰ；及びＡＴＰ類似体であるＡＭＰ−ＣＰＰを高エネル
ギーリン酸ドナーとして利用する。ＡＭＰが本反応から除かれると、初期ＡＴＰ
シグナルの増加は他の物質がＡＭＰ（又はＡＤＰ）に汚染されていな限り起こら
ない。
【０１６７】 実施例１１記載の如くに実施された反応は、成分の一つがアデノシンヌクレオ
シドに汚染されていることを示唆した。汚染が疑われた成分の一つはピルベート
キナーゼである。この酵素のサンプルを、分子量カットオフ１５３，５００ｄａ
のＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ透析チューブ内にて、５０ｍＭ ＫＰＯ4、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2ｐＨ７．６に対し透析した。透析は１０００倍量のバッファーに対し 、数時間、４℃で２回行い、遊離型アデノシンを除去した。表１８に従い反応液
を調製した。これらのデータは、透析により酵素液が透析前に比べ僅かに希釈さ
れたことを示す。透析後の酵素５．３μｌの添加及び透析前の５．０μｌの酵素
添により、等量のＰＫが反応液に加えられた。
【０１６８】 ＬＡＲ−ＣｏＡ５００μｌを調製済み反応液に加え、この最終反応液を室温で
インキュベートした。０、１０、２０及び３０分目に、１１４μｌの反応液に、
１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む５μｌの１×ＣＣＬＲ液中の１０ｎｇのルシフェラ
ーゼを加え、すぐにターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメータにて溶液の光出力を
測定した。データを表１９に示す。
【０１６９】 このデータより２つの主要観察結果が導かれ得る。第１に、ＡＫ、ＮＤＰＫ、
ＡＭＰ、ＡＭＰ−ＣＰＰ酵素−基質の組み合わせがＡＴＰシグナルの増幅に利用
可能である。しかし、幾つかの汚染源からのＡＴＰの産生は、ＡＴＰスパイクを
もたらす濃度に近似した最終ＡＴＰ濃度に達する量のＡＴＰを反応液に提供する
ことはなかった。
【０１７０】 ＡＭＰまたはＰＫが加えられない反応液（反応液２）は時間経過に伴い増加し
ない。しかしながら、未透析ＰＫを加えられたがＡＭＰは加えられなかった反応
液は、時間経過に伴い強い光出力を示した（反応液５）。ＡＭＰを欠いた反応液
への透析したＰＫの添加（反応液８）は、時間と共に光出力は増加したが、増加
速度は透析しなかった場合に比べ大きく低下したことを示す。
【０１７１】 本実施例は、さらに別の増幅システムを使用し、出発時点のＡＴＰスパイクの
レベルよりもＡＴＰレベルを更に高くできる事を示す。更に、本実施例は、これ
らのシステムを利用することで溶液がヌクレオチドを含むかを決定でき、又透析
を使用してＡＴＰ増幅反応液に利用される酵素から汚染ヌクレオチドを分画でき
ることを示している。
【０１７２】
【表１８】
【０１７３】
【表１９】
【０１７４】 実施例１３：ＰＲＰＰ合成酵素、アデノシンによる反応 酵素５’ホスホリボース１’ピロリン酸合成酵素（ＰＲＰＰ合成酵素）はＡＤ
ＰからＤ−リボース５’リン酸にピロリン酸を転移する。本実験は、この酵素を
ＡＭＰ及び５’ホスホリボース１’ピロリン酸と共に用いることにより、ＡＴＰ
及びＤ−リボース５’リン酸を生成できるかを測定するために実施された。
【０１７５】 ＡＴＰ、ＡＭＰ及びＰＲＰＰは１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．３にて希釈された
。ＰＲＰＰ合成酵素（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ０２８７）はＰＲＰＰ合成酵素反応バッフ
ァー（以下参照）にて希釈された。２μｌＡＴＰ、２μｌＡＭＰ、２μｌＰＲＰ
Ｐ及び２μｌのＰＲＰＰ合成酵素（または適当なバッファー）を表２０に示す様
に２０μｌのＰＲＰＰ合成酵素バッファーに加えた。
【０１７６】 反応液は３７℃の水槽中で３０分間インキュベーションした。チューブを水槽
から取り出し、１００μｌのＬＡＲ（ＣｏＡ無し）を加えた。次に１２６μｌを
ルミノメーターチューブに移した。１０ｎｇのルシフェラーゼを１ｍｇ／ｍｌの
ＢＳＡを含む１×ＣＣＬＲ、５μｌ中に加え、ターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノ
メーターにて光出力を測定した。データは表２１に示す。このデータはＰＲＰＰ
合成酵素が非ヌクレオチド基質からＡＭＰにピロリン酸を転移し、ＡＴＰを形成
できることを示す。
【０１７７】 反応液中のヌクレオチド濃度は：ＡＴＰ（添加時）１．２×１０5Ｍ；ＡＭＰ （添加時）２．９×１０-5Ｍ、及びＰＲＰＰ（添加時）２．６×１０-5Ｍであっ
た。反応当たり６×１０-4単位の酵素（ＰＲＰＰ合成酵素）を加えた。ＰＲＰＰ
合成酵素バッファーは５０ｍＭトリエタノールアミン、５０ｍＭリン酸カリウム
、ｐＨ７、０．３７ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍｌＢＳ Ａである。
【０１７８】
【表２０】
【０１７９】 実施例１４：ＰＲＰＰ合成酵素、デオキシアデノシン１リン酸による反応。 ＤＮＡの検出に関する幾つかの方法はＤＮＡのヌクレアーゼ消化により生成さ
れたｄＡＭＰのｄＡＴＰへの変換を必要とする。本実施例は、酵素ＰＲＰＰ合成
酵素がＰＲＰＰを共基質として使用しｄＡＭＰからｄＡＴＰへのトランスフォー
メーションを実施できることを示す。更に、反応液に加えられたＮＤＰＫの作用
によって、形成されたｄＡＴＰを使用してＡＤＰがＡＴＰにトランスフォームす
れば、より高感度のルシフェラーゼ検出によりこのトランスフォームをモニター
できる。
【０１８０】 反応液は表２１に示す如く２重に調製された。反応成分の濃度は：ｄＡＭＰ２
．９×１０-4Ｍ、１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ７．３；ＡＭＰ２．９×１０-4Ｍ、１
０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．３；ＰＲＰＰ Ｓｙｎ（ＰＲＰＰ合成酵素）（Ｓｉｇ
ｍａ＃Ｐ２０８７）保存液の１００Ｘ希釈液、０．０３ｕ／μｌ。成分を２０μ
ｌのＰＲＰＰ合成酵素バッファー（実施例１３）に加えた。４７分間３７℃でイ
ンキュベーションした後、１００μｌのＬＡＲを１０ｎｇのルシフェラーゼと共
に全ての反応液に加え、反応液の光出力をすぐに測定した。データは表２２に示
す。ＰＲＰＰは基質としてｄＡＭＰ（反応液１を２，３，４及び５に比較）を利
用できた。しかし、反応液より生成された光量は低くかったが、おそらくこれま
でに示されたＡＴＰに比べ、ルシフェラーゼがｄＡＴＰを極めて低い効率で使用
するためであろう。
【０１８１】
【表２１】
【０１８２】
【表２２】
【０１８３】 ｄＡＴＰからＡＤＰにリン酸が転移しＡＰＴが形成されることを示すために、
表２３に示した反応液を２０μｌのＰＲＰＰ合成酵素バッファー（液組成につい
ては表下を見よ）中に２系列調製した。次にそれらを３７℃で３４分間インキュ
ベートした。加えた成分は以下の通り調合した：ＡＤＰ５２．３×１０-2Ｍを含
む１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．３；ＮＤＰＫ−Ｓｉｇｍａ＃Ｎ０３７９
の１０００Ｘ希釈液、１０ｕ／μｌ（最終濃度０．０１ｕ／μｌ）。次にチュー
ブを更に３７℃で６０分間インキュベーションし、１０ｎｇのルシフェラーゼを
加え、ターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用いて光出力を測定した。デ
ータは表２４に示す。これらのデータは、ＰＲＰＰ合成酵素反応液により産生さ
れたｄＡＴＰがＮＤＰＫの作用によりＡＤＰに転移され、ＡＴＰを生成すること
を示している。
【０１８４】
【表２３】
【０１８５】
【表２４】
【０１８６】 実施例１５：ヌクレアーゼを用いたポリ（ｄＡ）の消化 ＤＮＡを検出する有力な方法の一つは、ポリマーをｄＮＭＰｓに消化し、ｄＮ
ＭＰｓをｄＮＴＰｓにトランスフォームし、ＡＤＰとＮＤＰＫを用いてｄＮＴＰ
ｓからＡＴＰを形成、その後ルシフェラーゼを用いてＡＴＰを検出する。本実施
例はデオキシアデノシンポリマーの消化を例示する。
【０１８７】 ｄＡＭＰの溶液は、９９０μｌの水と１０μｌの１ＸＴＥバッファー（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ８．０）を２５単位のポリアデニル
酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ２７−７８６、ロット＃５０１７８３６０２１）に加え
作製した。反応液は以下の材料より調製された：４５０μｌのナノピュアー水、
５０μｌの１０ＸＳ１ヌクレアーゼバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ、Ｍ
５７７Ａ、ロット＃６７４８６０５）及び１０μｌの上記ポリデオキシアデニル
酸溶液。２６０ｎｍの吸光度の変化をベックマン社製ＤＵ６５０分光光度計にて
モニターした。溶液の吸光度変化率は０．００２０Ａｂｓ／分であった。この時
点で１μｌのＳ１ヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ、Ｅ５７６ＡＢロッ ト＃６８００８１０）を加え、溶液の吸光度の変化を再度測定したところ０．０
１５６ａｂｓ／分であった。小分子のオリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチド
はそれに対応する量のポリヌクレオチドに比べると高い吸光度を示すことから、
これは本酵素がポリマーを消化できることを示している。
【０１８８】 下記反応条件は以後の実施例で使用されるポリデオキシアデニル酸ポリマーサ
ンプルの消化に用いられた条件である。 以下を含む３種類の反応液を調製した： 反応液１：上記のポリデオキシアデニル酸液９０μｌ、１０ＸＳ１ヌクレアー
ゼ反応バッファー、１０μｌ。
【０１８９】 反応液２：上記反応液１に同じ。 反応液３；ナノピュアー水９０μｌ、Ｓ１ヌクレアーゼ反応バッファー１０μ
ｌ。 消化０時間に各反応液１０μｌを取り、４９０μｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−
Ｃｌ、ｐＨ８．０に加えた。すぐに１μｌのＳ１ヌクレアーゼを反応液２を除く
残りの反応混合液１及び３に加え、混合液を室温でインキュベーションした。更
に反応時間２０、５０及び１４０分時に反応液サンプル１０μｌを取り出し、４
９０μｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０に加え希釈した。データは表２
５に示す。反応液＃１の溶液吸光度が増加したことから、やはり本反応液ではポ
リマーが経時的に消化されていることが示された。反応液の第２セットを上記の
如く作製した。これら反応液の唯一の違いは、ポリ（ｄＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｐ−
００８７，ロット＃６７Ｈ０２２６）５０単位が１．５ｍｌのＴＥバッファー中
に溶解され、反応液中に利用されていることである。消化１４０分後に、これら
反応液を実施例１６記載の如くに利用した。
【０１９０】
【表２５】
【０１９１】 実施例１６：ヌクレアーゼ及びＰＲＰＰ合成酵素を用いたポリ（ｄＡ）の検出 本実施例では、実施例１５記載の消化されたポリヌクレオチドを２つの異なる
方法により検出する。何れの方法もまずＰＲＰＰ合成酵素とＰＲＰＰを用いた、
デオキシヌクレチドをデオキシヌクレオシド３リン酸へのトランスフォーメーシ
ョンから始まる。第１法では、ＰＲＰＰ合成酵素反応中に形成されたデオキシヌ
クレオシド３リン酸を使いＡＤＰをＡＴＰに変換し、生じたＡＴＰをルシフェラ
ーゼにより検出する。第２法では、ＰＲＰＰ合成酵素反応により形成されたｄＮ
ＴＰｓを使用しＡＭＰをＡＴＰに変換すると同時にルシフェラーゼを用いて増幅
、検出する。
【０１９２】 表２６はＰＲＰＰ合成酵素反応液の組成を表す。成分の濃度は：ＰＲＰＰ、２
．６×１０-4Ｍ 、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５；ＰＲＰＰ合成酵素、６．０× １０-4単位（ＳｉｇｍａＰ０２８７）／２μｌＰＲＰＰ合成酵素バッファーであ
った。バッファーの組成については、実施例１３のＰＲＰＰ合成酵素バッファー
を参照されたい。Ｓ１を含むヌクレオシド消化物を脱イオン水で希釈し、８μｌ
の液体中に表２８掲載の量のポリマーを得、適当な反応液に加えた。ポリマーを
含まない消化物を、ポリマーを含む消化物同様に希釈した。この溶液８μｌは、
ポリ（ｄＡ）を除く７２０ｎｇポリマーを含むサンプル中の全ての成分を含んだ
。全ての反応液を３２分間、３７℃にてインキュベーションした。この時点で、
全ての反応液を９５℃で５分間加熱し、ＰＲＰＰ合成酵素を失活させ、氷槽中に
て５分間冷却した。
【０１９３】
【表２６】
【０１９４】 Ａ．第１検出法 各反応液２０μｌをＣｏＡを含まない１００μｌのＬＡＲに加えた。１０ｎｇ
のルシフェラーゼをすぐに加え、反応液の光産生を測定した。第２サンプル２０
μｌをＣｏＡを含まない１００μｌのＬＡＲに加え、更にＡＤＰ（２μｌ、２μ
ｇ／ｍｌ保存液）とＮＤＰＫ（２μｌ、１×１０-2ｕ／μｌ）を加え、室温にて
２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１０ｎｇのルシフェ
ラーゼを反応液に加え、反応液の光産生を感度５２．１％にてターナー社製ＴＤ
−２０／２０ルミノメーターを用い測定した。これら測定で得たデータを表２７
に示す。
【０１９５】 これらデータは、比較的多い量の消化ＤＮＡを測定する場合、ルシフェラーゼ
を利用したｄＮＴＰの直接測定が可能であることを示している（ＮＤＰＫを含ま
ない縦列に於ける反応液１対反応液５及び６を参照）。しかし、ｄＮＴＰｓを利
用し、ＮＤＰＫを用いてＡＤＰをＡＴＰに転換すれば、より高感度の検出が可能
である。
【０１９６】
【表２７】
【０１９７】 Ｂ．第２検出法 熱不活性化したＰＲＰＰ合成酵素反応液より得た２０μｌの反応混合液をＡＴ
Ｐ増幅反応液に加え、初期ｄＮＴＰｓを用いてＡＴＰを産生することを試みた。
これにより、ＰＲＰＰ合成反応により産生されたＡＴＰをより簡便に検出できる
。
【０１９８】 反応液は表２８に示す如くに調製した。反応液を混合し、その一部１０９．３
μｌ（反応液の１／７）を取り出し、すぐにアデニレートキナーゼを加えた。こ
の液をルミノメーターチューブに入れ、１０ｎｇルシフェラーゼを添加し、チュ
ーブを叩いて混合、感度５２．１％でターナー社製ＴＤ−２０／２０を用い光出
力を測定した。続いて２０分間隔で反応液の一部を取り出し、すぐに測定した。
反応液は室温でインキュベーションした。得られたデータを表２９に示す。
【０１９９】 これらデータは、ヌクレオシド３リン酸に転換後、消化ＤＮＡより産生された
ＡＴＰが増幅可能であることを示している。本法により得られた光出力は、非増
幅ＰＲＰＰ合成酵素法の光出力に比べ大きいことに注意されたい。
【０２００】
【表２８】
【０２０１】
【表２９】
【０２０２】 実施例１７：ＰｈｉＸ１７４ＨｉｎＦ１断片の消化 自然で遭遇するポリヌクレオチドはしばしば２本鎖である。エンドヌクレアー
ゼＨｉｎＦ１を用いＰｈｉＸ１７４ＤＮＡを消化し作製されたＤＮＡ断片は各種
長さを持つ２本鎖ＤＮＡ断片である。２本鎖ＤＮＡが検出可能であるか試験する
ために、ＰｈｉＸ１７４を直接試験基質に用い、あるいはヌクレアーゼで消化し
ヌクレオチドを作製し、これを前記実施例の如くにヌクレオシド３リン酸に変換
した。
【０２０３】 以下の条件を使用して、バクテリオファージＰｈｉＸ１７４のＤＮＡ断片を消
化した。これら材料を３本の１．５ｍｌポリプロピレンチューブに入れた：５０
μｌのＰｈｉＸ１７４ＨｉｎＦＩ断片（ＰｒｏｍｅｇａＧ１７５Ａ、ロット＃７
７３６０３）；４０μｌの５ｍＭ ＭｇＳＯ4；５μｌのＥｘｏＩＩＩバッファ ー（１０Ｘ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ５７７Ｂ、４８５３２１６）及び５μｌのナ
ノピュアー水。５０μｌＴＥバッファー及び４０μｌの５ｍＭ ＭｇＳＯ4；５ μｌのＥｘｏＩＩＩバッファー（１０×）及び５μｌのナノピュアー水を１つの
サンプルに加えた。ＰｈｉＸ１７４ＤＮＡを含む２つのサンプルについては、更
に２μｌのＥｘｏＩＩＩ（ＰｒｏｍｅｇａＭ１８１Ａ、５５１２７０８）で処理
し、チューブを３７℃の水槽に６０分間入れた。ＥｘｏＩＩＩはＤＮＡを含まな
いサンプルにも加え、サンプルを３７℃で６０分間インキュベーションした。
【０２０４】 この時点で、８００μｌのナノピュアー水及び１００μｌ（１０×）のＳ１ヌ
クレアーゼバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ５７７Ａ、ロット＃６７４８６０５
）を全てのサンプルに加えた。３μｌのＳ１ヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ
５７６Ｂ、ロット＃７８９８８１）を全てのサンプルに加えた。全てのサンプル
は３７℃で３０分間インキュベーションした。
【０２０５】 ＤＮＡを含む３本のチューブそれぞれから２００μｌを取り、３００μｌの１
×ＴＥバッファーで希釈、ベックマンＤＵ６５０分光光度計を使い、２６０ｎｍ
で吸光度を読みとった。記録された測定値は；チューブ１（ヌクレアーゼ添加無
し）、０．３０７３；チューブ２（ＥｘｏＩＩＩ処理）、０．５４９５；チュー
ブ３（ＥｘｏＩＩＩ及びＳ１処理）、０．５１９０であった。ヌクレアーゼ処理
されたチューブで吸光度が増加したことはポリマーが消化されたことを示す。こ
れら消化物は引き続き他の試験に使用した（実施例１８参照）。
【０２０６】 実施例１８：ヌクレアーゼ、ＰＲＰＰ合成酵素、ＮＤＰＫを用いたＰｈｉＸ１
７４ＨｉｎＦ１断片の検出 本実施例は、ヌクレアーゼを使用したポリマーをヌクレオシド１リン酸への消
化、ＰＲＰＰ合成酵素を使用したヌクレオシド１リン酸からヌクレオシド３リン
酸へのトランスフォーメーション、並びにＰＲＰＰ合成酵素の作用により産生さ
れたヌクレオシド３リン酸を使用したＰＲＰＰによるＡＤＰのＡＴＰへのトラン
スフォーメーション、およびルシフェラーゼを使用したＡＴＰの検出によるＤＮ
Ａの検出を示す。デオキシヌクレオチド（ポリ（ｄＡ））は実施例１７記載の如
くに調製した。異なる量のデオキシヌクレオチドを表３０に示す如くの反応液に
使用した。
【０２０７】 各反応液毎に以下の添加物を作製した：２μｌのＰＲＰＰ、２μｌのＰＲＰＰ
合成酵素、及び２０μｌのＰＲＰＰ合成酵素バッファー。反応液を３７℃で２８
分間処理し、その時点で反応を２μｌのＡＤＰ及び２μｌのＮＤＰＫを含む１０
０μｌのＬＡＲに移した。この第２反応液を室温で２０分間置き、処理した。産
生されたＡＴＰ量は、１０ｎｇのルシフェラーゼを加え、ルミノメータで光出力
を測定し求めた。データは表３０に示す。
【０２０８】 これらのデータは、この酵素の組み合わせによりＤＮＡが検出できることを示
す。
【０２０９】
【表３０】
【０２１０】 実施例１９：逆転写酵素及びＮＤＰＫを用いたＰｈｉＸ１７４ＨｉｎＦ１断片
の検出 以下の実施例は、逆転写酵素を利用したその端がオーバーハングしたヌクレオ
チドを持つ２本鎖ＤＮＡ断片の検出を示す。反応液は表３１記載の如くに調製し
た。
【０２１１】 成分は：バッファー、５×ＭＭＬＶ−ＲＴバッファー、（Ｐｒｏｍｅｇａパー
ツ＃Ｍ５３１Ａ、ロット＃７０９０１０１）；ＤＮＡ、ＰｈｉＸ１７４ＨｉｎＦ
１断片（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｃ１１３Ａ、ロット＃６６７５７０５）；ＡＤ
Ｐ、１μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ−５２８５、ロット＃５６Ｈ７８１５）；
ＮＤＰＫ、ＮＤＰＫ、（Ｓｉｇｍａ Ｎ−０３７９、ロット＃１２７Ｆ８１８０
２）１Ｕ／μｌを含む２５ｍＭクエン酸ナトリウム；ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｍ１７０Ａ，ロット＃６９８００１９，１Ｕ／ｍｌ）を３０分間３７℃
でインキュベーションし、次に２μｌの反応液を１００μｌのＬ／Ｌ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ ＦＦ２０２１、ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬）に加えた。反応液
による光産生をすぐにターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターで測定した。デ
ータは表３１に示す。
【０２１２】 これらデータは、ＭＭＬＶ−ＲＴがＤＮＡのピロリン酸化に使用できること、
及び生じたヌクレオチドを使用しＡＤＰをＡＴＰにトランスフォームし、形成さ
れたＡＴＰをルシフェラーゼを用いて検出できることを示す。同様の様式にて、
その他の酵素についてもこの反応の実施能力を試験できる。
【０２１３】
【表３１】
【０２１４】 実施例２０：逆転写酵素、ＮＤＰＫおよびルシフェラーゼを用いたＤＮＡ断片
検出の限界 実施例１８に示す如く、ＤＮＡを断片化し、逆転写酵素によりピロリン酸化し
てｄＮＴＰｓを生じ、末端のリン酸基をｄＮＴＰｓからＡＤＰｓに転移しＡＴＰ
を形成させた場合に、ルシフェラーゼを用いＤＮＡが検出できる。本実施例は、
極めて低いレベルのＤＮＡを含む反応液中に生じる光単位が、適当なコントロー
ル反応液の値に比べ統計上有意であることを示す。実施例２同様に、検出限界は
スチューデントｔ試験を用い統計的に決定された。表３２に示す反応液を２系列
作製した。成分は：バッファー、５×ＭＭＬＶ−ＲＴバッファー、（Ｐｒｏｍｅ
ｇａＭ５３１Ａ）；ＤＮＡ、ＴＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ１７５Ａ）で希釈された
ＰｈｉＸ１７４ＨｉｎＦ１断片；ＴＥ，Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ＥＤＴＡ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ ＡＡ６４１）；ＮａＰＰｉ、４０ｍＭピロリン酸ナトリウム（Ｐｒｏｍｅ
ｇａＣ１１３Ａ）；ＡＤＰ、２μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ−５２８５）Ｔｒ
ｉｓ−Ｃｌ １０ｍＭ ｐＨ７．３液；ＮＤＰＫ、１単位／μ水溶液（Ｓｉｇｍ
ａ Ｎ−０３７９）；水、ナノピュア水；ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＭＭＬＶ逆転写酵素
２００単位／μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１７０Ａ）。
【０２１５】 ＤＮＡ及びＭＭＬＶ−ＲＴを除く全ての試薬を１．５ｍｌポリプロピレンチュ
ーブに加え、混合した。一部１６．５μｌを２系列、別のポリプロピレンチュー
ブに移した。１μｌのＭＭＬＶ−ＲＴを各チューブに加え、次に各種濃度のＤＮ
Ａ２．５μｌまたはＴＥ２．５μｌを加えた。反応液を３７℃、１０分間インキ
ュベーションし、続いて２０μｌの反応溶液から２μｌを取りルミノメーターチ
ューブ内の１００μｌのＬ／Ｌ試薬（ルシフェラーゼを含む。Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｆ２０２Ａ及びＦ１８０Ａ、混合体）に加えた。チューブを叩いて混合し、続い
てすぐにターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメータを用い、感度５２．１％で測定
した（この感度はターナー社製ＴＤ−２０／２０と同等）。データを表３３に示
す。
【０２１６】 各ＤＮＡ濃度の光出力（各６回測定）をバックグランドコントロール（ＤＮＡ
なし）の光出力と比較し、各比較毎にｐ−値を測定した。実験２に示すように、
ｐ−値は試験した各サンプルに関し０．０５以下であった。したがって、１０ｐ
ｇ以下のＤＮＡが確実に検出できる。
【０２１７】
【表３２】
【０２１８】
【表３３】
【０２１９】
【表３４】
【０２２０】 実施例２１：逆転写酵素及びＮＤＰＫを用いた平滑端ＤＮＡ断片の検出 以下の実施例は、逆転写酵素を用いた平滑端を持つＤＮＡ断片の検出を示す。
反応マスター混合液は以下を含む：８０μｌ、５×ＭＭＬＶ−ＲＴバッファー（
ＰｒｏｍｅｇａＭ５３１Ａ，ロット＃７０９０１０１）；１０μｌの４０ｍＭピ
ロリン酸ナトリウム（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｃ１１３Ａ、ロット＃６６７５７
０５）；１０μｌの１μＭのＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ−５２８５、ロット＃５６
Ｈ７８１５）；２０μｌのＮＤＰＫ（Ｓｉｇｍａ Ｎ−０３７９、ロット＃１２
７Ｆ８１８０２ １Ｕ／μｌ）；及び２１０μｌの脱イオン水。
【０２２１】 ＤＮＡサンプルは、２５ｂｐ（ＰｒｏｍｅｇａＧ４５１、ロット＃８４７９１
）及び５０ｂｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ４５２、ロット＃８４７９６）の倍数であ
る平滑端ＤＮＡ断片のラダーを含有する１×ＴＥバッファーを含む。これら材料
を１×ＴＥバッファーで希釈し、各種ＤＮＡ濃度の液系列を作製した、反応液は
表３５に示す如くに調製された。これら成分の組成は；ＭＭ、マスターミックス
（上記）及び２００ｕ／μｌのＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｍ５３
１Ａ）である。
【０２２２】 これら反応液を３０分間、３７℃でインキュベーションした。インキュベーシ
ョン後、反応液２μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、反応液の光産生をター
ナー社ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用いて測定した。データを表３５に示す。
これらのデータは、ＤＮＡをリン酸分解した後、ＡＤＰをＡＴＰに変換すること
により平滑端断片の高感度ＤＮＡ検出が可能であることを示している。
【０２２３】
【表３５】
【０２２４】 実施例２２：ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いたポリ（Ａ）ｍＲＮＡの検出 本実施例は、ポリ（Ａ）片のピロリン酸化によるポリ（Ａ）ｍＲＮＡ検出を示
す。反応液は表３６の如く調製した。反応液材料の組成は以下の通りである；１
０×バッファー−０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＭｇＣ
ｌ2、０．５Ｍ ＮａＣｌ；グロビンｍＲＮＡ ＧｉｂｃｏＢＲＬ カタログ＃ １８１０３−０２８（Ｈ2Ｏに溶解）；ＮａＰＰ1、２０ｍＭピロリン酸ナトリウ
ム（ＰｒｏｍｅｇａＣ１１３Ａ、脱イオン水中）；ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｓ
ｉｇｍａＰ４０５８、１Ｕ／μｌ）。これら反応液を３７℃で３０分間インキュ
ベーションし、反応液２μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、反応液の光産生
をすぐにターナー社ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用い測定した。データは表３
７に示す。これらデータは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼがＲＮＡをピロリン酸化で
き、又存在するＲＮＡが例え極低レベルの場合でも、ルシフェラーゼ利用により
生じたヌクレオシド３リン酸が検出できることを示している。
【０２２５】
【表３６】
【０２２６】
【表３７】
【０２２７】 実施例２３：逆転写酵素及びＮＤＰＫを用いたポリ（Ａ）ｍＲＮＡの検出 本実施例はｍＲＮＡ、特にポリ（Ａ）ｍＲＮＡ検出に関する別の方法を示す。
本法では、ＤＮＡセグメントはｍＲＮＡにハイブリダイズされ、プローブは逆転
写酵素とピロリン酸を用いピロリン酸化される。ピロリン酸化が起こるにつれて
、デオキシヌクレオシド３リン酸を利用し酵素ＮＤＰＫを用いてＡＤＰをＡＴＰ
に転換する。次にルシフェラーゼを利用し最終溶液のＡＴＰが測定される。
【０２２８】 反応液は表３８の如くに調製された。反応液の成分は：バッファー、５×ＭＭ
ＬＶ−ＲＴバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｍ５３１Ａ、ロット＃７０９０
１０１）；ｍＲＮＡ、グロビンｍＲＮＡ（Ｈ2Ｏに溶解されたＧｉｂｃｏＢＲＬ カタログ＃１８１０３−０２８）；ポリ（ｄＴ）、０．２μＭオリゴｄＴ（５
０）、ＮａＰＰｉ、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム（脱イオン水中のＰｒｏｍｅ
ｇａＣ１１３Ａ）；ＡＤＰ、１０ｍＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ−５２８５、ロ
ット＃５６Ｈ７８１５）；ＮＤＫＰ、ＮＤＰＫ、１Ｕ／μｌ（Ｓｉｇｍａ Ｎ−
３０７９、ロット＃１２７Ｆ８１８０２）；ＭＭＬＶ−ＲＴ、（Ｐｒｏｍｅｇａ
パーツ＃Ｍ５３１Ａ、ロット＃７０９０１０１）２００Ｕ／μｌ；及び２００Ｕ
／μｌ ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ＃１８０６
４−０１４）であった。
【０２２９】 これら反応液を３０分間、３７℃にてインキュベーションし、反応液２μｌを
１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加えた。反応液による光産生をすぐにターナー社製Ｔ
Ｄ−２０ｅルミノメーターで測定した。データは表３９に示す。
【０２３０】
【表３８】
【０２３１】
【表３９】
【０２３２】 実施例２４：ヌクレアーゼ、ＰＲＰＰ合成酵素を用いたＲＮＡの検出 本実施例は、ヌクレアーゼによるＲＮＡの消化、生じたＡＭＰのＰＲＰＰ合成
酵素によるＡＴＰのトランスフォーメーション、産生されたＡＴＰのルシフェラ
ーゼを使用した検出によるＲＮＡの検出を示す。３種類の反応液を調製した：消
化液１（２５０ｎｇグロビンｍＲＮＡ及びＳ１ヌクレアーゼを含む１０μｌの反
応液）：消化液２（Ｓ１ヌクレアーゼを加えない以外は消化液１に同じ）；消化
液３（グロビンｍＲＮＡを加えない以外は消化液１に同じ）。これら消化液を３
０分間、３７℃でインキュベーションした後、これらを用い表４０に示す反応液
を作製した。［これら溶液の濃度に関しては、実施例１６の反応液組成表下の記
述を参照せよ。］ 反応液を３０分間、３７℃でインキュベーションし、１００μｌのＬＡＲ−Ｃ
ｏＡ及び１０ｎｇのルシフェラーゼを各チューブに加え、反応液の光出力をター
ナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用いて測定した。データを表４０に示す
。これらのデータは、この酵素の組み合わせが比較的低レベルのＲＮＡを検出に
使用できることを示す。
【０２３３】
【表４０】
【０２３４】 実施例２５：細胞内の酵素からＡＴＰ産生させる材料を加えることによる細胞
の検出の改良 細胞の存在を検出する一般的方法の一つは、細胞を含む材料に含まれるＡＴＰ
をアッセイすることである。しかしこの様な検出法は、極僅かな細胞を含むサン
プル中に存在するＡＴＰ濃度が極めて低いことによる制約を受けている。全ての
生細胞では複数のタイプの酵素活性が必要とされる。これら活性は、細胞代謝で
の利用に関するヌクレオチドからヌクレオシド３リン酸へのトランスフォーメー
ションに関与している。特にアデニレートキナーゼ及びＮＤＰＫとして知られる
活性は広く細胞内に認められる。これら酵素は全ての細胞溶解物内に存在するこ
とが期待され、ＡＭＰ及びｄＣＴＰの負荷により以下の反応を開始細胞溶解物中
にＡＴＰが形成される： ＡＭＰ＋ｄＣＴＰ＋アデニレートキナーゼ→ＡＤＰ＋ｄＣＴＰ ＡＤＰ＋ｄＣＴＰ＋ＮＤＰＫ→ＡＴＰ＋ｄＣＤＰ しかし、このような抽出物由来のＡＴＰが形成されるのに伴い、これを除くのに
酵素が十分活性であれば、結果としてＡＴＰの産生は起こらない。
【０２３５】 本実施例は、ＡＭＰ及びｄＣＴＰを加える細胞溶解物サンプル中のＡＴＰが検
出可能であることを示す。上記のヌクレオシド転換はおそらくＡＴＰ濃度を上昇
させる。従って、これら酵素のトランスフォーメーション活性を利用し、ＡＭＰ
をＡＴＰを産生させ、ＡＴＰを直接検出することで少数の細胞及び細胞物質が検
出できる。
【０２３６】 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９のサンプルをルリアブロス内で２時間増殖した。細胞
を７２４０×ｇ、１０分間の遠心分離により集め、次に１×ＴＢＳに再懸濁した
。再度細胞を同様に遠心分離し、１×ＴＢＳに再懸濁した。再懸濁された細胞の
サンプルを取り出し、滅菌したルリアブロスで希釈、ルリア寒天培地に接種し、
再懸濁細胞培養液１μｌ当たりの細胞数を求めた。細胞培養体を超音波処理によ
り溶解し、反応液中に使用した溶解物を表４１に示す。４０分間室温でインキュ
ベーションした後、１０ｎｇのルシフェラーゼを反応液に加え、反応液の光出力
をすぐにターナーＴＤ２０−ｅルミノメーターを用い測定した。データを表４１
に示す。
【０２３７】
【表４１】
【０２３８】 本データは、溶解物へのｄＣＴＰの添加（反応液１）は、添加がない場合（反
応液３）又は溶解物にＡＭＰのみ添加した場合（反応液２）に比べ、細胞サンプ
ルからより多くの光が測定されることを可能にする。しかし、ＡＭＰ及びｄＣＴ
Ｐ両方が溶解物に加えられた場合（反応液５）には、より強い光を観察すること
ができる。溶解物の希釈は、ＡＭＰ及びｄＣＴＰが添加された反応液（反応液６
及び７）から産生される光の減少をもたらす。しかし、観察された光量は溶解物
を単純に比較した場合に期待される光量に比べて依然高い。従ってこれらデータ
は、サンプル中のＡＴＰレベルの上昇をもたらす添加物を溶解物に加えることが
できれば、改良された細胞の検出が証明できることを示す。
【０２３９】 実施例２６：細胞溶解物中にＡＴＰを追加形成させるために加えるヌクレオチ
ド濃度の最適化 実施例２５は材料を細胞溶解物に加えると、追加のＡＴＰが細胞溶解物中に検
出できることを示している。本実施例は、加えられた材料の濃度を調整すること
で、溶解物中に元々存在するＡＴＰに比べ実質的に高いレベルのＡＴＰを生じせ
しめることが可能であることを示す。既知量の細胞より作られる細胞溶解物は実
施例２５の様にして作製された。この新しい溶解物を表４２に示す反応液中に使
用した。反応液を４０分間、室温でインキュベーションした。インキュベーショ
ン後、１０ｎｇのルシフェラーゼを反応液に加え、反応液の光出力をすぐにター
ナーＴＤ２０−ｅルミノメーターを用い測定した。データを表４２に示す。
【０２４０】 これらデータは、両ヌクレオチドの濃度を共に最適化することで、溶解物にこ
れを付加しない場合、又は付加濃度が最適化されていない場合に比べはるかに強
い光量値が得られることを示している。
【０２４１】
【表４２】
【０２４２】 実施例２７：酵素基質の付加後の溶解物中のＡＴＰ増加の時間変化 上記実施例は、細胞検出感度が、ｄＣＴＰ及び／又はＡＭＰの添加、続くＡＴ
Ｐ検出前のルシフェラーゼ使用によるインキュベーション時間により増加したこ
とを示す。本実施例は、検出反応液が同様に一時的に最適化されるかもしれない
ことを示す。
【０２４３】 細胞融解物は実施例２５の如く作製し、凍結した。本溶解物を融解し、表４３
に示す反応液の作製に使用した。反応液５から、１，５，１５、３０、６０、９
０、１２０、１５０及び１８０分時に反応液からサンプルを取り出し、更に５分
時に別の反応液からもサンプルを得た。これらサンプルを１０ｎｇルシフェラー
ゼに加え、反応液の光出力をすぐにターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターを
用い測定した。５分時に得たサンプルの結果を表４３に示す。経時的（分）に反
応液５のサンプルより得た結果を表４４に示す。
【０２４４】 反応液に関し光出力は経時的に劇的に増加すること、又最終値が前記実施例報
告値よりはるかに高くなることに注意されたい。これらのデータは、細胞を最も
高感度に検出するには、加える物質を最適化することに加え、検出する反応時間
も最適化する必要があることを示している。
【０２４５】
【表４３】
【０２４６】
【表４４】
【０２４７】 実施例２８：ピロリン酸化によるＤＮＡ検出に及ぼすＤＮＡ端の数の増加の効
果の測定 逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、通常重合反応中の基質として利用可能
なＤＮＡセグメントに結合する。プラスミドＤＮＡは共有結合により閉鎖された
環状分子でることから、ＤＮＡ末端を持っていない。一般に、この様な分子はＤ
ＮＡをまず逆転写酵素、又はポリメラーゼに適した基質に変形しない限りピロリ
ン酸化されないと考えられる。本実施例では、プラスミドＤＮＡが消化断片とし
てピロリン酸化の基質としては好適ではないことを確認する実験を記す。更に、
ＤＮＡを切断する酵素を利用し１以上の新規ＤＮＡ端を生じせしめ、ＤＮＡ検出
を改良する。 反応液は表４５に示す如くに調製した。成分は：プラスミド、ｐ
ＧＥＭ３ＺＦ（＋）（１ｍｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、パーツ＃Ｐ２２７Ａ）
；バッファー、１０×バッファーＢ、（Ｐｒｏｍｅｇａ社、パーツ＃Ｒ０００２
Ａ）；Ｓａｕ３Ａ１、エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ１、（Ｐｒｏｍｅｇａ社、
８Ｕ／μｌ、パーツ＃Ｒ６１９Ｅ）；ＢａｍＨ１、エンドヌクレアーゼＢａｍＨ
１（Ｐｒｏｍｅｇａ社、１０Ｕ／μｌ、パーツ＃Ｒ６０２Ａ）であった。反応液
を３７℃で１時間インキュベーションし、さらに７０℃、１０分間加熱し、室温
まで冷却した。
【０２４８】 次に溶液を表４６に示す反応液に加えた。反応液は３７℃で２０分間インキュ
ベーションした。インキュベーション後、反応液２μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試
薬に加え、反応液からの光出力をすぐにターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメータ
ーを用いて測定した。データを表４６に示す。
【０２４９】 これらデータは更にピロリン酸化によるＤＮＡの検出が可能であることを再び
示す。更に、これらデータは逆転写酵素を用い処理する前にプラスミドＤＮＡの
消化が必要であることを示した。ＢａｍＨ１はプラスミドより１つのＤＮＡ断片
のみを生じるが、Ｓａｕ３Ａはこのプラスミドから１０以上の断片を生じた。こ
れらデータは、断片の末端数の増加に伴い光産生も増加することを示す。
【０２５０】
【表４５】
【０２５１】
【表４６】
【０２５２】 実施例２９：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されたピロリン酸化を使
用したＤＮＡ検出の例示 逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖へのヌクレオチド付加を触媒
する。これまでの実施例に示した様に、逆転写酵素を利用することでＤＮＡをピ
ロリン酸化を触媒し、それにより共役酵素反応を用いた検出が可能となる。本実
施例では、我々はＤＮＡポリメラーゼを利用し本反応を触媒することが可能であ
り、またＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来のＤＮＡポリメラ
ーゼが本当に逆転写酵素に比べ加えられたＤＮＡ量に比べより大きな光を生ずる
こと示す。
【０２５３】 マスターミックス（ＭＭ）は以下を含み作製された：１０×バッファー（Ｐｒ
ｐｍｅｇａパーツ＃Ｍ１９０Ｇ、ロット＃７６７５５２６）、２０μｌ、２５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、４０μｌ、４０ｍＭピロリン酸ナトリウム、５μｌ；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｍ１６６Ｂ、ロット＃７４７４６
２３）［保存バッファーｂ］、５Ｕ／μｌ、１０μｌ；水、１００μｌ。この溶
液をボルテックスし混合し、次に以下の反応液を組成するのに使用した：反応液
１−３（１７．５μｌマスターミックス、２．５μｌ １×ＴＥ）；反応液４−
６（１７．５μｌマスターミックス、１μｌの１００ｐｇ ＤＮＡ／μｌ［Ｐｈ
ｉＸ１７４ＨＩｎＦ１断片、ＰｒｏｍｅｇａＧ１７５Ａ、１×ＴＥを用い掲載濃
度に希釈、１．５μｌ １×ＴＥ）；及び反応液７−９（１７．５μｌマスター
ミックス、２．５μｌの１００ｐｇＤＮＡ／μｌ）。溶液を混合し、３０μｌの
ミネラルオイルを用い水溶液を覆う。溶液を７０℃で３０分間インキュベーショ
ンした。１５μｌを取り出し、これに１ｕ／μｌのＮＤＰＫ１μｌと１ｕＭのＡ
ＤＰ１．５μｌを加えた。室温、１５分後に各サンプル２．３μｌを１００μｌ
のＬ／Ｌ試薬に加えた。反応液の光産生をすぐにターナー社ＴＤ−２０ｅルミノ
メーターを用い測定した。データは表４７に示す。
【０２５４】 これらの結果は、ピロリン酸化反応がＤＮＡポリメラーゼにより触媒され、少
量のＤＮＡが検出できることを示している。１０及び２５ｐｇのＤＮＡを用いた
反応より得た値はＤＮＡを付加しない場合の値に対し統計上異なっていた。
【０２５５】
【表４７】
【０２５６】 実施例３０：その他のＤＮＡ検出実験 本実施例は逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａ
ｑポリメラーゼ）及び非熱安定型ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
）によるＤＮＡ検出の直接比較である。反応液中に利用されるＤＮＡ断片の特別
な構造がＤＮＡ修飾酵素の特性に適合している必要があることを示す別の例も示
す。酵素はその反応を開始するためにＤＮＡ末端を必要とすることから、スーパ
ーコイル構造を持つプラスミドＤＮＡよりシグナルを得ることは一般にはできな
い。ＭＭＬＶ−ＲＴ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼは５’オーバーハングを持つ
ＤＮＡ種を基質として利用できｋるが、３’オーバーハングを持つＤＮＡは基質
として利用することはできない。これに対し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは５’オ
ーバーハング及び３’オーバーハングの両方を有するＤＮＡ基質を利用する。さ
らに本実施例は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた反応が他の２つの酵素のいず
れかを用いた同等の反応からの光に比べ多くの光を生ずることを示す。
【０２５７】 反応液は表４８に示す如くに調製した。溶液を３７℃にて１時間、その後７０
℃、１０分間インキュベーションした。この時点で、各反応液１μｌを水を用い
２０μｌに希釈し、１０００ｐｇＤＮＡ／μｌの濃度にした。溶液ＭＭは以下の
如くに調製した；４０μｌの５×ＭＭＬＶ−ＲＴ反応バッファー（Ｐｒｐｍｅｇ
ａパーツ＃Ｍ５３１Ａ）、５μｌ、４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム；２０μｌ
、１μＭ ＡＤＰ；５μｌの１ｕ／μｌＮＤＰＫ；及び１８０μｌの水。反応液
を混合し、１８μｌを８本のチューブに移した。上記反応液１を１μｌと１μｌ
のＭＭＬＶ−ＲＴをチューブ３及び４に加え、上記反応液３、１μｌと１μｌの
ＭＭＬＶ−ＲＴをチューブ５及び６に加えた；更に反応液３、１μｌをチューブ
７及び８に加えた。チューブを２０分間３７℃でインキュベーションし、続いて
溶液２μｌを１００μｌのＬ／Ｌに加え、得られた混合液の光出力をすぐにター
ナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーターを用いて測定した。データは表４９に示す
。
【０２５８】 第２ＭＭミックスをＴ４ＤＮＡポリメラーゼに合わせ以下の様にして作製した
：２０μｌの１０×バッファーＣ（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｒ００３Ａ）；５μ
ｌの４０ｍＭピロリン酸ナトリウム；２０μｌの１μＭ ＡＤＰ；５μｌの１ｕ
／μｌのＮＤＰＫ；及び１３０μｌの水。この溶液をボルテックスして混合し、
上記パラグラフ記載の８反応混合液の作製に使用した。３７℃にて２０分間イン
キュベーションし、続いて２μｌの反応混合液をルシフェラーゼ入りＬ／Ｌに加
えた。すぐに光出力を測定し、表５０に記したデータを得た。
【０２５９】 これらのデータは、これら酵素が共に５’オーバーハングを持つＤＮＡをピロ
リン酸化できることを示している。しかし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは３’オー
バーハングを持つＤＮＡをピロリン酸化できるのに対し（ＤＮＡのＳｐｈａＩ背
負うかにより産生される）、逆転写酵素はこの形のＤＮＡを利用できない。
【０２６０】 最終のＭＭミックスは以下を含むように作製した：２０μｌの１０×Ｔａｑバ
ッファー（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃１９０Ｇ）；４０μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ 2 ；５μｌの４０ｍＭピロリン酸ナトリウム、及び１０５μｌの水。この新ＭＭ ミックスを用いて８混合液を作製した。混合液１及び２は、１７μｌの新ＭＭミ
ックス、１μｌの希釈したＤＮＡ反応液１、及び２μｌのＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｍ１６６Ｂ）を含む：混合液３及び４はＭＭミッ
クス、１μｌの反応液２、及び２μｌのＴａｑＤＮＡを含み：混合液５及び６は
ＭＭミックス、１μｌの反応液３、及び２μｌのＴａｑＤＮＡを含み；混合液７
及び８はＭＭミックス、１μｌの反応液３を含む。混合液をボルテックスして混
合し、３０μｌのミネラルオイルで混合液を多い、７０℃、２０分間インキュベ
ーションした。各チューブから１５μｌを取り出し、１μｌの１ｕ／μｌのＮＤ
ＰＫと１．５μｌの１μＭのＡＤＰを各チューブに加えた。チューブを室温にて
１５分間インキュベーションし、各反応液から２．３μｌを取り、ルシフェラー
ゼを含む１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、すぐにルミノメータを持ちいて反応液
の光出力を測定した。データを表５０に示す。
【０２６１】 これらのデータは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが５’オーバーハングを持つＤ
ＮＡを利用できることを示す。しかし、ＤＮＡが３’オーバーハングを持つとき
、光出力は非常に小さかった。即ち、ＴａｑポリメラーゼはＭＭＬＶ−ＲＴと同
様に、５’オーバーハングを持つＤＮＡはピロリン酸化を触媒するが、３’オー
バーハングの場合には触媒しないと考えられる。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは何れ
のＤＮＡオーバーハングの形についてもピロリン酸化する。更に、全てのデータ
を比較すると、Ｔ４ポリメラーゼを持ちた反応は、他の酵素の何れかを使った場
合に比べはるかに強い光を生ずることが明らかである。
【０２６２】
【表４８】
【０２６３】 使用した溶液は：バッファー：ＰｒｏｍｅｇａバッファーＢ（パーツ＃Ｒ００
２Ａ）；ＤＮＡ、ｐＧＥＭ ３ＺＦ＋（１ｍｇ／ｍｌ）、Ｐｒｏｍｅｇａ パー
ツ＃２２７Ａ；ＢａｍＨＩ、ＰｒｏｍｅｇａＢａｍＩ、パーツ＃Ｒ６０２Ａ、Ｓ
ｐｈｉ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＳＰｈｉＩ、パーツ＃６２６Ａである。
【０２６４】
【表４９】
【０２６５】
【表５０】
【０２６６】
【表５１】
【０２６７】 実施例３１：ゲノムＤＮＡの検出 本実施例では、高分子ＤＮＡをＤＮＡのピロリン酸化、末端リン酸基のｄＮＴ
ＰｓからＡＤＰの転移によるＡＴＰの形成、及びルシフェラーゼを利用したＡＴ
Ｐ測定について記す。高分子ＤＮＡは、エンドヌクレアーゼによりまず切断され
ると、より高い感度にて検出できる。
【０２６８】 反応液は表５２の如く調製した。反応に使用した材料は；バッファー；１０×
Ｍｕｌｔｉｃｏｒｅバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｒ９９９Ａ）；酵母Ｄ
ＮＡ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａＤＮＡ（３８０μｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ
パーツＧ＃３０１Ａ）；マウスＤＮＡ（３００μｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａパ
ーツ＃Ｇ３０９Ａ）；ＥｃｏＲＩ、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、１２ｕ／μ
ｌ、（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｒ６０１Ａ）であった。反応液を３７℃に６０分
間、続いて７０℃で１０分間加熱した。この時点で、各反応液１μｌに水１９μ
ｌを加え２０μｌに希釈した。溶液（ＭＭ）は以下を含む様に調製された；２４
μｌの１０×バッファーＣ（Ｐｒｐｍｅｇａパーツ＃Ｒ００２Ａ）、６μｌ、４
０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム；２４μｌ、１μＭＡＤＰ；６μｌの１ｕ／μｌ
ＮＤＰＫ；及び１５６μｌの水。このミックスを用いて、表５３に示す反応液を
調製した。
【０２６９】 上記反応液１Ａから１０Ａまでに加えられたＤＮＡは、表５３に記した反応液
１−４より得た希釈物質を意味する。Ｔ４ＤＮＡ ＰｏｌはＴ４ＴＮＡポリメラ
ーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａパーツ＃Ｍ４２１Ｆ）である。これら反応液を３７℃で２
０分間インキュベーションし、続いて反応液２μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に
加えた。反応液より生ずる光をすぐにターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメーター
を用いて測定した。データは表５４に示す。反応がシステムがゲノムＤＮＡを検
出できることを示していることに注意。更に、ピロリン酸化の前のＥｃｏＲＩ処
理は、ＥｃｏＲＩ処理なしの場合に比べより高い光値を生じた。
【０２７０】
【表５２】
【０２７１】
【表５３】
【０２７２】
【表５４】
【０２７３】 実施例３２：ピロリン酸化によるＤＮＡ検出に使用するＡＤＰ濃度の最適化 本実施例で我々はＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡのピロリン
酸化、及びＮＤＰＫを用いたｄＮＴＰｓの末端リン酸基のＡＤＰへの転移による
ＤＮＡ検出に対する、ＡＤＰ濃度を変化させた場合の効果について検討する。Ａ
ＤＰ濃度の上昇は、ＡＴＰ添加なしで観察されたバックグランドを上昇させる。
ＡＤＰ濃度の上昇はＤＮＡピロリン酸化を介したシグナルも増加できる。最適な
ＡＤＰ添加量は、バックグランドに対しシグナルの最適増加をもたらすＡＤＰの
濃度を選択することで決定できる。
【０２７４】 ＡＤＰ（ＳｉｇｍａカリウムＡＤＰ、Ａ−５２８５、ロット＃５６Ｈ７８１５
）を蒸留水を用いて０．２から２０μＭの範囲の各種濃度に希釈した。実施例２
６にて記載したｐＧＥＭ３ＺＦ＋のＢａｍＨＩ消化物を用いて、以下からなる反
応液（溶液ＭＭ）を作製した；４０μｌの１０×バッファーＣ（Ｐｒｐｍｅｇａ
パーツ＃Ｒ００３Ａ）、１０μｌの４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム；１０μｌ
、１ｕ／μｌＮＤＰＫ；１μｌの２０ｎｇ／μｌのＢａｍＨＩ消化ｐＧＥＭ３Ｚ
Ｆ＋、及び２９９μｌの水。これら溶液を用いて、表５５に示す反応液を組成さ
せた。
【０２７５】 ＡＤＰ濃度が増加すると、表５６に示すように、ポリメラーゼを含む反応液も
ポリメラーゼを含まない反応液も共に総光量値は増加する。本実施例では、バッ
クグランドに対するシグナルの増加倍率として定義される最適なシグナル増加は
、ピロリン酸化反応液に０．０５μＭのＡＤＰが存在する時観察される。
【０２７６】
【表５５】
【０２７７】 Ｔ４ＤＮＡ ＰｏｌはＰｒｏｍｅｇａ社製Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（１０ｕ／μ
ｌ）（Ｐｔ＃Ｍ４２１Ｆ）である。
【０２７８】
【表５６】
【０２７９】 実施例３３：蛍光ベース法を用いたＡＴＰの検出 ルシフェラーゼをベースとする方法によるＡＴＰの検出に加え、ＡＴＰは蛍光
をベースとするシステムを用いても検出できる。蛍光ベース測定法として、ＡＴ
Ｐ測定キット（Ｓｉｇｍａ＃３６６−Ａロット＃１１７Ｈ６０１７）を用いた。
本キットはホスホグリセレートキナーゼ及びグリセルアルデヒドリン酸脱水素酵
素の組み合わせを用い、ＡＴＰ存在下にＮＡＤＨからのＮＡＤ形成を触媒する。
ＮＡＤＨは蛍光物質であり、ＮＡＤは蛍光物質ではないことから、ＡＴＰは蛍光
強度の消失として測定できる。反応バッファーはキット成分より以下の如くに調
製された：３ｍｌの供給バッファーを５．２５ｍｌのナノピュアー水で希釈し、
０．７５ｍｌの１２％トリクロロ酢酸を加えた。供給ＮＡＤＨの１バイアルを１
ｍｌのナノピュアー水で再構成した；酵素混合液は供給されたまま使用した。測
定毎に、１０μｌの酵素混合液と２０μｌのＮＡＤＨを透明なプラスチック製１
０ｍｍキュベット内にある１．５ｍｌの反応バッファーに加えた。蛍光はＳＰＥ
Ｘｄｍ３０００ソフトウエアーを用いたＳＰＥＸフルオロログフルオロメーター
にて、吸光及び発光波長をそれぞれ３４０ｎｍ及び４６０ｎｍに設定し測定した
。
【０２８０】 ＡＴＰを１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．３にて１０倍づつ連続希釈して各種濃
度のＡＴＰサンプルを調製した。各種様々な量の希釈液をキュベットに加え、蛍
光の低下を記録した（表５７）。比較のために、ＡＴＰをルシフェラーゼを用い
ることによっても定量した。各ＡＴＰ希釈液２０μｌを１０ｎｇのルシフェラー
ゼを含む１００μｌのＬＡＲに加え、光出力をＴＤ−２０ｅルミノメーターを用
いて測定した。各希釈液は二重に測定した（表５８）。
【０２８１】 本実施例は、ＡＴＰが最小二乗法により検出可能であることを示している。蛍
光ベース系では、１ナノモルＡＴＰに相当するおよそ２００，０００蛍光単位の
変化が有意であった。ルシフェラーゼアッセイはより低いレベルのＡＴＰに対し
感受性であった。
【０２８２】
【表５７】
【０２８３】
【表５８】
【０２８４】 実施例３４：蛍光を用いたＡＴＰの検出：ＰＲＰＰ合成酵素、アデノシン１リ
ン酸による反応 ＡＴＰは、反応をより大きな容積で実施し、又基質濃度がより高度であること
を除き、実施例１３と同様に基質ＡＭＰ及びＰＲＰＰより、酵素ＰＲＰＰ合成酵
素により合成された。２０μｌのＡＭＰ（２９ｍＭ）及び２０μｌＰＲＰＰ（２
６ｍＭ）を２０μｌのＰＲＰＰ合成酵素（６×１０−３単位）を含む２００μｌ
のＰＲＰＰ合成酵素バッファーと共にインキュベーションした。反応は表５９に
まとめる。３７℃、３０分インキュベーションした後、ＰＲＰＰ合成酵素を９４
℃、１０分間加熱不活性化した。次にＡＴＰを蛍光ベースシステムとルシフェラ
ーゼベースシステムの両方で定量した。蛍光ベース測定では、実施例３３記載の
ＡＴＰ測定キットを利用した（Ｓｉｇｍａ＃３６６−Ａ、ロット＃１１７Ｈ６０
１７）。次に、ＰＲＰＰ反応液の一部２０μｌを１，５ｍｌのバッファー、１０
μｌの酵素混合液、及び２０μｌのＮＡＤＨを含むキュベットに加えた。蛍光の
減少をモニターした。各反応毎に４ないし６回の測定を行った（表６０）。ルシ
フェラーゼベースアッセイでは、２０μｌを１００μｌのＬＡＲと１０ｎｇのル
シフェラーゼに加えた。各反応を３回測定で決定した。光出力はターナー社製Ｔ
Ｄ−２０ｅルミノメーターを用い測定した（表６１）。本実施例は、ＰＲＰＰ合
成酵素によるＡＴＰ産生が蛍光またはルシフェラーゼを利用し測定できることを
示している。
【０２８５】
【表５９】
【０２８６】
【表６０】
【０２８７】
【表６１】
【０２８８】 実施例３５：蛍光を用いたＡＴＰの検出；細胞溶解体 ＡＴＰは実施例２５，２６及び２７記載の如く、細胞溶解体をＡＭＰ及びｄＣ
ＴＰとインキュベーションしても産生できる。実施例３３記載のＳｉｇｍａＡＴ
Ｐ測定キットを使っても、本システム中のＡＴＰを検出された。反応液を下記（
表６２）の様に調製し、室温にてインキュベートした。ＡＴＰ濃度はルシフェラ
ーゼを用いて８０分時及び１４０分時に定量した。本アッセイでは、各反応液１
５μｌが１００μｌのＬＡＲと１０ｎｇのルシフェラーゼに加えられた。光出力
はターナー社製ＴＤ−２０ｅを用い測定した（表６３）。経過時間中、ＡＴＰは
蛍光によっても測定された。手順は、測定毎に２０μｌではなく各１５μｌの反
応液を加えたことを除いて、手順は実施例３３記載の通りである。最初の時刻設
定は８０分に開始し、第２の読みとり設定は１４０分時に開始した。各反応は二
重又は３重測定された（表６４）。本実施例は、細胞融解物内に合成されたＡＴ
Ｐがルシフェラーゼ又は蛍光アッセイを用いて検出できることを示している。
【０２８９】
【表６２】
【０２９０】
【表６３】
【０２９１】
【表６４】
【０２９２】 実施例３６：ピロリン酸化反応産物の増幅による超高感度ＤＮＡ測定 本実施例は、ＡＴＰが、ヌクレオチド３リン酸がスパイクされた反応での不要
なバックグランドの増幅をもたらす外来ヌクレオチド源になること、及びサンプ
ルが増幅されるとサンプルのピロリン酸化により測定されたＤＮＡの検出限界を
下げる事ができることを示す。
【０２９３】 ２種類の反応液を調製した。反応液１は：２μｌの１０×バッファーＣ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ社、Ｒ００３Ａ、ロット７５４４２０５）；０．５μｌの４０ｍＭピ
ロリン酸ナトリウム；２μｌの１ｍＭ ＡＭＰ；１μｌの０．２５ｕ／μｌのミ
オキナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｍ３００３、ロット１１６Ｈ９５１６）；１μｌの０
．１７ｕ／ｕｌのピルベートキナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｎ０３７９，ロット１２７
Ｆ８１８０２）；１μｌの１０ｕ／μｌＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａＭ４２１Ｆロット６１７５０６）及び１１．５μｌの水からなった。反応液２
は、ＡＭＰが２０μｌの１０ｍＭＡＭＰ及び１μｌの１ｕ／μｌのアピラーゼ（
ＳｉｇｍａＡ６５３５ロット１２７Ｈ７０１０）からなる反応液中にてアピラー
ゼにより３０分間、室温処理され、続いて７０℃、１０分間の熱不活性化工程に
よりアピラーゼ活性が排除される以外は反応液１に同じであった。
【０２９４】 ０時に０．１μｌの１０ｍＭ ＰＥＰが各反応液に加えられ、反応液は混合、
室温にてインキュベートされた。２分時に、反応液２μｌが取り出され、１００
μｌのＬ／Ｌ試薬に加えられ、上記の如くにターナー社製ＴＤ−２０ｅルミノメ
ーターを用い光出力が測定された。以下のデータを得た：反応液１；８１７．４
光単位、反応液２；７．３光単位。本反応では、試薬中の汚染物質として外来性
にヌクレオシド２又は３リン酸が加えられない限りＡＴＰ産生は起こらないべき
であることから、この結果はＡＭＰがおそらくアピラーゼ処理により除かれるレ
ベルの汚染ヌクレオチドを含んでいたことを示す。
【０２９５】 以下の反応液を調製した：反応液Ａは、１×ＴＥバッファー／μｌにて１μｌ
当たり１ｎｇの濃度に希釈されたＨｉｎＦ１断片（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｇ１７５
Ａロット７７３３６０２）１μｌが加えられ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが初期反
応混合液に加えられないこと以外の上記反応液２の成分を含む；反応液Ｂ、ＤＮ
Ａが１００ｐｇＤＮＡ／μｌの濃度で加えられる以外は反応液Ａに同一；反応液
Ｃ、添加ＤＮＡが１０ｐｇＤＮＡ／μｌの濃度である以外は反応液Ａに同一；反
応液Ｄ、添加ＤＮＡが１ｐｇＤＮＡ／μｌである以外は反応液Ａに同一；及び反
応液Ｅは１μｌの１×ＴＥバッファーが加えられ、ＤＮＡが加えられない事以外
は反応液Ａに同一。
【０２９６】 １μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを各反応液に加え、反応液を３７℃にて１５
分間インキュベートした。このインキュベーションの後、各反応液に１μｌの１
０ｍＭＰＥＰを加え、再度室温にて１０分間インキュベートした。この時点で、
各反応液２μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、反応液の光出力を上記同様タ
ーナー社製ルミノメーターにて測定した。データは表６５に示す。本実施例は、
ピロリン酸化反応の産物がＡＴＰ増幅システムと共役でき、ＤＮＡ測定の感度を
上昇させることを示している。
【０２９７】
【表６５】
【０２９８】 実施例３７：メッセージ配列に正確に一致するＤＮＡプライマーを利用した特
異メッセージの検出、及びＤＮＡプライマーが３’末端でミスマッチした時のシ
グナルの消失 本実施例では、ルシフェラーゼの光シグナルがＲＮＡ種の配列に相補的である
ＤＮＡプライマーのピロリン酸化により生成されることを示す。更に、プライマ
ーの３’末端塩基がメッセージ配列のＲＮＡ塩基と相補的でない場合には、この
シグナルが生成されないことを示す証拠を提示する。このデータは、プライマー
のピロリン酸化を利用することで特異的ＲＮＡ配列の存在が検出できること、及
び塩基とはマッチするがメッセージに伴うシグナルは発しないプライマーを利用
することでメッセージ中の特異塩基の変異が検出できることを示している。
【０２９９】 マスター反応ミックスは以下を含む様に調製される： キャップ構造を持つカナマイシンＲＮＡ（０．６２ｍｇ／ｍｌ） １．２５μｌ ５×ＭＭＬＶ 反応バッファー ５０μｌ ４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ２．５μｌ １０μＭ ＡＤＰ ２．５μｌ ＮＤＰＫ（１ｕ／μｌ） ５μｌ ＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ｕ／μｌ） １２．５μｌ ナノピュア水 １６３．７５μｌ 配列番号１から４に相当するプライマー（配列番号及びプライマー配列につい
ては表９３を参照せよ）を１×ＴＥバッファー中に１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解さ
れた。
【０３００】 １９μｌのマスター反応ミックスを１０本のラベル付きチューブに入れ、以下
の添加物をチューブに加えた；チューブ１及び２、１μｌの１×ＴＥバッファー
；チューブ３及び４、１μｌのプライマー１、チューブ５及び６、１μｌのプラ
イマー２（配列番号２）；チューブ７及び８、１μｌのプライマー３（配列番号
３）、及びチューブ９及び１０、１μｌのプライマー４（配列番号４）。プライ
マー１はカナマイシンＲＮＡのコーディング域の部分に完全に相補的に設計され
ており、プライマー２，３及び４はプライマーの３’末端塩基がその位置に於い
て他の３種類の塩基の１つに変えられている以外はプライマー１の配列に等しく
なるよう設計されている。
【０３０１】 １０本の０．５ｍｌ微量遠心チューブを３７℃、２０分間インキュベートし、
続いてチューブの内容物２μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、ルミノメータ
ーを用い試薬の光出力を測定した。以下のデータを得た。
【０３０２】 チューブ 相対光ユニット １ ３．９８９ ２ ３．４５８ ３ ４９．９５ ４ ５２．２４ ５ ３．７７９ ６ ４．３９４ ７ ４．１６３ ８ ７．８７９ ９ ７．８１１ これらデータは、ＭＭＬＶ−ＲＴが内部的にＲＮＡ配列にハイブリダイズする
ＤＮＡプライマーをピロリン酸化でき、形成された遊離型のヌクレオシド３リン
酸はルシフェラーゼを利用し測定可能なＡＴＰ相当量に転換可能であることを示
している。更にデータは、予定塩基に対する３’ミスマッチを持つプライマーを
反応液に使用した場合にはシグナルが消失するか極めて弱くなることを示してい
る。
【０３０３】 実施例３８：特異ＲＮＡの検出；グロビンｍＲＮＡ 本実施例では、グロビンｍＲＮＡの２領域に相補的なＤＮＡプライマーのピロ
リン酸化より生じた光シグナルを、同一領域の正確な配列である２種類のＤＮＡ
プライマーからのシグナルと比較した。さらに、ＲＮＡに相補的なプライマーは
バックグランド以上のシグナルを提供することが示されたが、ＲＮＡに相補的で
ないプライマーはシグナルが殆ど無いか、全く無かった。
【０３０４】 プライマー配列リストに示すプライマー５−８（配列番号５，６，１７，１８
）を１×ＴＥバッファーにて０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。精製されたグ
ロビンｍＲＮＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１８１０３−０２８）を１×ＴＥバッファ
ーにて濃度２０ｎｇ／μｌに溶解した。
【０３０５】 ハイブリダイゼーション液は以下の様に調製した： 溶液１ １０μｌのプライマー５及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ 溶液２ １０μｌのプライマー６及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ 溶液３ １０μｌのプライマー７及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ 溶液４ １０μｌのプライマー８及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ 溶液５ １０μｌのプライマー５及び１０μｌの１×ＴＥバッファー 溶液６ １０μｌのプライマー６及び１０μｌの１×ＴＥバッファー 溶液７ １０μｌのプライマー７及び１０μｌの１×ＴＥバッファー 溶液８ １０μｌのプライマー８及び１０μｌの１×ＴＥバッファー 溶液９ １０μｌの１×ＴＥバッファー及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ これら溶液を０．５ｍｌのチューブ内に調製し、５０℃にて１５分間加熱、研
究机の上で１５分間室温まで冷却した。
【０３０６】 以下のマスター反応混合液を調製した： ナノピュア水 ３４６．５μｌ ＭＭＬＶ−ＲＴ ５×反応バッファー １３２μ
ｌ ピロリン酸ナトリウム（ＰｒｏｍｅｇａＭ５３１，ロット７０９０１０５） １６．５μｌ ＮＤＰＫ（１ｕ／μｌ） ３３μｌ ＡＤＰ（２μＭ） ３３μｌ ＭＭＬＶ−ＲＴ（１００ｕ／μｌに調製） ３３μｌ 上記溶液を混合し、１８μｌを２７本のチューブに入れた。上記各ハイブリダ
イゼーション液を、マスター反応液ミックスを含むチューブ３本それぞれに２μ
ｌづつ加え３７℃にて１５分間インキュベートした。次にチューブの内容物を１
００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、ルミノメーター（ターナー社製２０／２０）を用
い得られた反応液の光産生を測定した。
【０３０７】 以下のデータを得た。
【０３０８】
【表６６】
【０３０９】 これらのデータは、プライマー６又は８を含む反応ミックス及びＲＮＡをＬ／
Ｌ試薬に加えると強い光シグナルが見られるが、プライマーをＲＮＡなしにイン
キュベートするか、又はＲＮＡをこれらプライマーなしにインキュベートした場
合には殆どシグナルが観察されないことを示している。更に、プライマー５及び
７では、シグナルは添加ＲＮＡの有無に関わらず極めて低かった。プライマー６
及び８はグロビンｍＲＮＡのコーディング域内の２ヶ所の領域に対し相補的にな
る様に設計された。プライマー５及び７は、これら同一ＲＮＡ領域の配列を正確
に模して作製された。従ってこれらのデータは、プライマーのピロリン酸化を利
用し如何にして特異的ＲＮＡが検出できるかを示す第２例を提供する。
【０３１０】 実施例３９：ＲＮＡの特異検出；ランダムＲＮＡ由来のシグナルとプライマー
配列にマッチするＲＮＡ種由来のシグナルの比較 前記実施例に記載のピロリン酸化反応を利用し特異的ＲＮＡを検出する為には
、プライマーは検出対象の配列を含まないＲＮＡ種では強いシグナルを発しては
ならないことが求められる。本実施例では、グロビンｍＲＮＡ検出を目的として
設計されたプライマーのシグナル強度を、これらプライマーを酵母全ＲＮＡとの
反応に用いた場合に観察されるシグナルと比較する。
【０３１１】 プライマー６及び８とオリゴ（ｄＴ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃ１１０Ａ）を１×
ＴＥバッファーを用いて０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。グロビンｍＲＮＡ
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１８１０３−０２８）は１×ＥＴバッファー中に濃度２０
ｎｇ／枚ｌに希釈された。酵母ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
Ｒ３６２９）を１×ＴＥバッファーにて濃度２０ｎｇ／μｌに希釈された。
【０３１２】 ハイブリダイゼーション液は以下の様に調製した： １０μｌのオリゴｄＴ及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ １０μｌのプライマー６及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ １０μｌのプライマー８及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ １０μｌの１×ＴＥ及び１０μｌのグロビンｍＲＮＡ １０μｌのオリゴｄＴ及び１０μｌの酵母ｍＲＮＡ １０μｌのプライマー６及び１０μｌの酵母ｍＲＮＡ １０μｌのプライマー８及び１０μｌの酵母ｍＲＮＡ １０μｌの１×ＴＥ及び１０μｌの酵母ｍＲＮＡ これら溶液を０，５ｍｌチューブ内に調製し、５０℃で１５分間加熱、続いて
室温まで１５分かけて冷却した。
【０３１３】 以下のマスター反応混合液を調製した： ナノピュア水 ３４６．５μｌ ＭＭＬＶ−ＲＴ ５×反応バッファー １３２μ
ｌ ピロリン酸ナトリウム（ＰｒｏｍｅｇａＭ５３１，ロット７０９０１０５） １６．５μｌ ＮＤＰＫ（１ｕ／μｌ） ３３μｌ ＡＤＰ（２μＭ） ３３μｌ ＭＭＬＶ−ＲＴ（１００ｕ／μｌに調製） ３３μｌ 上記溶液を混合し、１８μｌを２４本のチューブに入れた。上記各ハイブリダ
イゼーション液を、マスター反応液ミックスを含むチューブ３本それぞれに２μ
ｌづつ加え３７℃にて１５分間インキュベートした。次にチューブの内容物を１
００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、ルミノメーター（ターナー社製２０／２０）を用
い得られた反応液の光産生を測定した。
【０３１４】 以下のデータを得た。
【０３１５】
【表６７】
【０３１６】 これらのデータは、プライマーが酵母全ＲＮＡとインキュベートされた場合に
比べグロビンｍＲＮＡとインキュベートされた場合により強いシグナルが得られ
ることを示している。酵母ＲＮＡはグロビン配列を含んでいないため、高いシグ
ナルが期待される。オリゴ（ｄＴ）も低いシグナルを示すことから、この標本中
の大部分のＲＮＡはｍＲＮＡではなく、別の形のＲＮＡであることが示唆された
。
【０３１７】 実施例４０：ＲＮＡの特異的検出：外来性ＤＮＡを含む、及び含まない反応液
中でのプライマー配列にマッチするＲＮＡ種からのシグナルの比較 特異的メッセージの検出に利用される実施例３８記載のピロリン酸化反応に関
する別のシステム条件は、外来性ＲＮＡの有無に関わらずプライマーが極めてよ
く似たシグナルを提供しなければならない事である。本実施例では、大量の酵母
ＲＮＡ存在下に於けるグロビンｍＲＮＡを検出するために設計されたプライマー
のシグナル強度が、酵母ＲＮＡ添加ない場合に観察されるシグナルと同等になる
。
【０３１８】 様々なレベルの酵母ＲＮＡ、プライマー６又はプライマー８，及びグロビンｍ
ＲＮＡを含むハイブリダイゼーション液を、５μｌの５００ｎｇ／μｌのプライ
マー６又はプライマー８を５μｌの４０ｎｇ／μｌのグロビンｍＲＮＡ及び１０
μｌの酵母ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒ３６２９）を含む１×
ＴＥバッファーに加え、総酵母ＲＮＡ含有量０，２、２０、２００、４００及び
８００ｎｇの溶液を作製した。溶液を５０℃で１５分間加熱し、室温まで１５分
間冷却した。
【０３１９】 反応マスターミックスを上記実施例（３８）の如くに調製し、混合液１８μｌ
を１８本のチューブに入れた。１５分間冷却した後、プライマー６を含む各種ハ
イブリダイゼーション液２μｌをチューブに加え、チューブを３７℃のヒーティ
ングブロックに入れた。
【０３２０】 ハイブリダイゼーション混合液を反応マスターミックスと１５分間インキュベ
ーションした後、溶液２０μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、ターナー社製
ＴＤ−２０／２０ルミノメーターを用い、得られた反応液の光出力を測定した。
【０３２１】 プライマー６のデータを収集した後、同様の反応セットをプライマー８を含む
ハイブリダイゼーション液を用いて実施した。 以下のデータを得た：
【０３２２】
【表６８】
【０３２３】
【表６９】
【０３２４】 これらのデータは、ハイブリダイゼーション反応液に極少量の酵母ＲＮＡを添
加しても、特異的ＲＮＡ種に関するプライマーからのシグナルは大きく低下しな
いことを示している。
【０３２５】 実施例４１：グロブリンｍＲＮＡ＃１に対するプライマーを利用した突然変異
検出：プライマー配列の３’末端にあるミスマッチ塩基の検出 プライマー６及びプライマー８を用いる様なＲＮＡ検出に関するピロリン酸化
反応では、プライマーがポリメラーゼ添加によりピロリン酸化される必要がある
。プライマーの３’末端がＲＮＡにマッチしない塩基を含むと、それはピロリン
酸反応の基質にはならないだろう。ＲＮＡ種の存在を検出するプライマーを、Ｒ
ＮＡ含有のサンプルを含む反応液に添加した場合にこの様なことが起こるのであ
れば、これはプライマーの３’末端にマッチする塩基位置でＲＮＡの配列が変化
していることを示すと考えられる。変化したＲＮＡ配列に相補的な塩基を含む新
規プライマーに交換するとシグナルは回復するだろう。この様にして、ピロリン
酸化反応を用いることで、プライマーの３’末端にマッチする領域内にＲＮＡ種
の配列を取り込ませてよい。この考えを検証するために、プライマーの３’塩基
をその別の３種類のＤＮＡ塩基各々のうちの１つ代えること以外プライマー６及
びプライマー８の配列に同一であるプライマーを設計した。本実施例は、ピロリ
ン酸化反応により光シグナルを発生させるが、変化した３’塩基を持つ別のプラ
イマーではこのシグナルが発生しないことによる、プライマーの３’末端にある
ＲＮＡ塩基が期待される塩基にマッチすることを確認する為のプライマーペアー
の使用を示す。
【０３２６】 プライマー６ｍ１から６ｍ３（配列番号７，８，９）を５００ｎｇ／μｌの濃
度に１×ＴＥバッファーにて溶解した。 プライマー６ないしプライマー６ｍ３、又はプライマー８ないしプライマー８
ｍ３（配列番号１８，１９、２０及び２１）を含むハイブリダイゼーション液を
、５μｌの２０ｎｇ／μｌのグロビンｍＲＮＡ又はＴｒｉｓバッファーを加え調
製した。溶液を５０℃で１５分間加熱し、室温まで１５分間冷却した。
【０３２７】 反応マスターミックスを上記実施例３８の如くに調製し、ミックス１８μｌを
１８本のチューブに入れた。１５分間冷却した後、プライマー６ないしプライマ
ー６ｍ３を含む各種ハイブリダイゼーション液２μｌをチューブに加え、チュー
ブを３７℃のヒーティングブロックに入れた。
【０３２８】 ハイブリダイゼーション混合液を反応マスターミックスと１５分間インキュベ
ーションした後、溶液２０μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、すぐに反応液
の光出力を測定した。以下のデータが記録された；
【０３２９】
【表７０】
【０３３０】 反応マスターミックスを上記実施例３８の如くに調製し、ミックス１８μｌを
１８本のチューブに入れた。１５分間冷却した後、プライマー８ないしプライマ
ー８ｍ３を含む各種ハイブリダイゼーション液２μｌをチューブに加え、チュー
ブを３７℃のヒーティングブロックに入れた。
【０３３１】 ハイブリダイゼーション混合液を反応マスターミックスと１５分間インキュベ
ーションした後、溶液２０μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、すぐに反応液
の光出力を測定した。以下のデータが記録された；
【０３３２】
【表７１】
【０３３３】 これらデータも、プライマーの３’塩基がＲＮＡ鋳型上の対応する塩基にハイ
ブリダイズできない場合には、上記ピロリン酸反応が強い光シグナルを生じない
ことを示している。これらデータは更に、この方法を利用しプライマーの末端塩
基がＲＮＡ中の予想塩基と相補的であるか決めることができること、換言すれば
ピロリン酸化開始部位のＲＮＡ塩基が期待通りのものであるか確認することに利
用できることも示している。
【０３３４】 実施例４２：グロブリンｍＲＮＡ＃２に対するプライマーを用いた変異検出：
プライマー３’末端より２番目位置のミスマッチ塩基の検出 実施例４１にて、プライマー末端のミスマッチをピロリン酸化可能な条件下で
の光シグナルの欠失から検出できる事が示された事から、プライマー配列の３’
末端から２番目の塩基を別の塩基に変えたプライマー６及びプライマー８に対応
する一連のプライマーを作製した。
【０３３５】 プライマー６ｍ４から６ｍ６を１×ＴＥバッファーに、濃度５００ｎｇ／μｌ
に溶解した。 プライマー６及びプライマー６ｍ４ないし６ｍ６（配列番号１０、１１及び１
２）、又はプライマー８及びプライマー８ｍ４ないし８ｍ８（配列番号２２，２
３，２４，２５及び２６）を含むハイブリダイゼーション液を、５μｌの２０ｎ
ｇ／μｌのグロビンｍＲＮＡ又はＴｒｉｓバッファーを加え調製した。溶液を５
０℃で１５分間加熱し、室温まで１５分間冷却した。
【０３３６】 反応マスターミックスを上記実施例３８の如くに調製し、ミックス１８μｌを
１８本のチューブに入れた。１５分間冷却した後、プライマー６ないしプライマ
ー６ｍ６を含む各種ハイブリダイゼーション液２μｌをチューブに加え、チュー
ブを３７℃のヒーティングブロックに入れた。
【０３３７】 ハイブリダイゼーション混合液を反応マスターミックスと１５分間インキュベ
ーションした後、溶液２０μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、すぐに反応液
の光出力を測定した。以下のデータが記録された：
【０３３８】
【表７２】
【０３３９】 反応マスターミックスを上記実施例３８の如くに調製し、ミックス１８μｌを
１８本のチューブに入れた。１５分間冷却した後、プライマー８ないしプライマ
ー８ｍ６を含む各種ハイブリダイゼーション液２μｌをチューブに加え、チュー
ブを３７℃のヒーティングブロックに入れた。
【０３４０】 ハイブリダイゼーション混合液を反応マスターミックスと１５分間インキュベ
ーションした後、溶液２０μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、すぐに反応液
の光出力を測定した。以下のデータが記録された；
【０３４１】
【表７３】
【０３４２】 これらデータは、プライマーの３’末端から２番目位置の塩基がＲＮＡ鋳型上
の対応する塩基にハイブリダイズできない場合には、殆どピロリン酸反応が起こ
らず、強い光シグナルが生じないことを示している。これらデータは更に、この
方法を利用しプライマー末端から２番目位置の塩基がＲＮＡ中の予想塩基と相補
的であるか、即ちプライマーの末端より２番目の位置にあるＲＮＡ塩基が期待通
りであるか決定することができることも示す。
【０３４３】 実施例４３：ピロリン酸化＃１に適したプライマー長の改良、プライマーの３
’及び５’末端を伸長することによる長さの変更 ピロリン酸反応に基質として用いられるプライマー長の変更が、反応の特異性
又は発生するシグナルの強さに影響する可能性がある。本研究では、各種プライ
マーの組み合わせを用い、プライマーの長さ又は末端の変更の効果を測定する。
【０３４４】 プライマー９ないし１７を１×ＴＥバッファーで希釈し、濃度を５００ｎｇ／
μｌとした。次にこれら溶液それぞれを１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌバッファーｐ
Ｈ７．３を用いて２０ｎｇ／μｌのプライマー濃度に希釈した。グロビンｍＲＮ
Ａ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製品番号＃１８１０３−０１０、ロットＫＢ６７０５）を
１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．３バッファーに濃度２０ｎｇ／μｌに溶解
した。５μｌのプライマー及びプライマー９−１７（配列番号２８、２９、３０
、３１、３２、３３、３４、３５及び３６）と５μｌのグロビンｍＲＮＡ液を混
合し、別の１０μｌのハイブリダイゼーション反応液を調製した。５μｌのプラ
イマー６及び９−１７と５μｌの１０ｍＭＴｒｉｃ−Ｃｌ、ｐＨ７．３を混合し
、コントロールの模擬ハイブリダイゼーション液も作製し、更に５μｌのグロビ
ンｍＲＮＡ液と１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．３を混合しＲＮＡ単独コン
トロールを作製した。これら全ての反応液を５０℃で１５分間加熱し、続いて室
温まで１５分間冷却した。
【０３４５】 反応当たり以下を含むマスター反応混合液を調製した： ナノピュア水 １０．５μｌ ５×ＭＭＬＶ−ＲＴバッファー ４．０μ
ｌ ４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ０．５μｌ ＮＤＰＫ（１ｕ／μｌ） １．０μｌ ＡＤＰ（２μＭ） １．０μｌ ＭＭＬＶ−ＲＴ酵素 １．０μｌ 各ハイブリダイゼーション液、プライマーコントロール液、及びグロビンＲＮ
Ａ液について、３系列の反応液を調製した。それぞれは、各溶液２μｌを１８μ
ｌのマスター反応液ミックスに加え、混合し、３７℃にて２０分間インキュベー
トした作製した。インキュベーション後、各溶液を１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加
え、溶液の光出力をすぐにターナー社製２０／２０ルミノメーターを用い測定し
た。
【０３４６】 以下のデータを得た。
【０３４７】
【表７４】
【０３４８】 これらのデータより以下の比較が得られた： ３’末端が同一で長さが異なるプライマー：
【０３４９】
【表７５】
【０３５０】 ５’末端が同一で長さが異なるプライマー：
【０３５１】
【表７６】
【０３５２】 これらのデータ（表７５及び７６）は、プライマーの５’末端のプライマー長
を伸ばすことが、上記の如く実施されたピロリン酸化反応からの光出力を増加さ
せる効果的方法であることを示唆している。しかし、これらの結果は、プライマ
ーがＲＮＡにハイブリダイズする位置によるのかもしれなかった。プライマーの
長さが規則的に光出力に影響するものであるか試験するために、別の研究を行っ
た。この研究では、プライマーの３’配列を一定にし、５’末端をＲＮＡの領域
にマッチする形で漸次伸長した。ハイブリダイゼーションに選択された領域は、
プライマーの５’配列が一定となる上記プライマーの標的である複数の領域に含
まれた。 プライマー１８−２２（配列番号３７、３８，３９、４０及び４１）
を上記同様に溶解し、希釈した。上記同様に、グロビンｍＲＮＡ入りのこれらプ
ライマーのハイブリダイゼーション液、プライマー単独及びＲＮＡのハイブリダ
イゼーション液を調製し、加熱、冷却した。
【０３５３】 これら溶液を、上記同様に作製されたマスターミックスに加え、インキュベー
トし、上記同様にＡＴＰの存在について試験した。以下のデータを得た：
【０３５４】
【表７７】
【０３５５】 これらのプライマーは、上記５’端を変化させた別のプライマーセットについ
て観察された如く（表７５）、プライマー長の増加に伴い光値を増加することは
なかった。この事は、本ＲＮＡ検出に於いては広範囲のサイズのプライマーがシ
グナルを提供するが、プライマーによってシグナル強度が変動すると予想される
ことを示唆している。
【０３５６】 実施例４４：既知ＲＮＡに対するプライマーのリン酸化に由来するシグナルに
及ぼすミスマッチ位置の効果 ３’塩基又は３’末端から２番目の塩基がミスマッチしているプライマーは上
記実施例４１及び４２に示すピロリン酸化反応条件でのインキュベーションでは
光シグナルを発しなかったことから、プライマー配列内の別のミスマッチ塩基が
ピロリン酸化反応により生じる光シグナルに影響を及ぼすか決定するために以下
の実験を行った。
【０３５７】 プライマー６ｍ７ないし６ｍ１０（配列番号１３，１４，１５，及び１６）及
びプライマー８ｍ７ないし８ｍ９（配列番号２５、２６、及び２７）を上記実施
例４２同様に溶解、希釈した。グロビンｍＲＮＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製品番号＃
１８１０３−０１０、ロットＫＢ６７０５）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ
７．３バッファーに濃度２０ｎｇ／μｌに溶解した。５μｌのプライマー６、６
ｍ１、６ｍ６、及び６ｍ７ないし６Ｍ１０、８、８ｍ３、８ｍ５、及び８，７−
９を５μｌのグロビンｍＲＮＡ液と混合し、１０μｌのハイブリダイゼーション
反応液を調製した。５μｌの上記掲載のプライマーと５μｌの１０ｍＭＴｒｉｃ
−Ｃｌ、ｐＨ７．３を混合しコントロールの模擬ハイブリダイゼーション液も作
製し、更に５μｌのグロビンｍＲＮＡ液と１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．
３を混合しＲＮＡ単独コントロールを作製した。これら全ての反応液を５０℃で
１５分間加熱し、続いて室温まで１５分間冷却した。
【０３５８】 反応当たり以下を含むマスター反応混合液を調製した： ナノピュア水 １０．５μｌ ５×ＭＭＬＶ−ＲＴバッファー ４．０μｌ ４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ０．５μｌ ＮＤＰＫ（１ｕ／μｌ） １．０μｌ ＡＤＰ（２μＭ） １．０μｌ ＭＭＬＶ−ＲＴ酵素 １．０μｌ 各ハイブリダイゼーション液、プライマーコントロール液、及びグロビンＲＮ
Ａ液について、３系列の反応液を調製した。それぞれは、各溶液２μｌを１８μ
ｌのマスター反応液ミックスに加え、混合し、３７℃にて２０分間インキュベー
トした作製した。インキュベーション後、各溶液を１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加
え、溶液の光出力をすぐにターナー社製２０／２０ルミノメーターを用い測定し
た。
【０３５９】 以下のデータを得た。
【０３６０】
【表７８】
【０３６１】 これらのデータは、ＲＮＡ鋳型とＭＭＬＶ−ＲＴを反応液に使用した場合には
プライマーの３’末端から６塩基対までのミスマッチでさえもプライマーのピロ
リン酸反応からの光出力を大きく低下させることを示している。即ち、この様な
低下を利用することで、少なくとも６塩基対長のＲＮＡ領域に起こった変異を示
すことができる。
【０３６２】 実施例４５：内部プライマーを用いたＤＮＡの検出 本実験は、ＤＮＡにハイブリダイズできるヌクレオチド配列をコードする短い
オリゴヌクレオチド（プライマー）存在下にＤＮＡを変性し、変性ＤＮＡを含む
溶液を冷却し、溶液状にてピロリン酸反応を実施し、続いてヌクレオシド３リン
酸の末端リン酸をＡＤＰに転移してＡＴＰを形成せしめることで特定のＤＮＡ配
列が検出可能であることを示すために計画された。生じたＡＴＰはルシフェラー
ゼ／ルシフェリン反応を用いて測定できる。
【０３６３】 カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドの１ｍ／ｍｌのＤＮＡ液２μｌを５
μｌのバッファーＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、４μｌエンドヌクレアーゼＳｐｈＩ
（１０ｕ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）、及び３９μｌの無ヌクレアーゼ水と共に
１時間３７℃にてインキュベートした。次に溶液を７０℃で１０分間インキュベ
ートし、エンドヌクレアーゼを不活性化した。最終溶液をＳｐｈＩ消化ｐＫＡＮ
（４０ｎｇ／μｌ）で標識した。
【０３６４】 以下の溶液を調製した： 溶液１及び２： ２μｌのＳｐｈＩ消化ｐＫＡＮ １８μｌの無ヌクレアーゼ水 溶液３及び４： １μｌの１ｍｇ／ｍｌのプライマー１ １９μｌの無ヌクレアーゼ水 溶液５及び６； ２μｌのＳｐｈＩ消化ｐＫＡＮ １μｌの１ｍｇ／ｍｌのプライマー１ １７μｌの無ヌクレアーゼ水 これら溶液を９５℃で３分間加熱し、実験机上に置き約１０分間室温まで冷却
した。
【０３６５】 ２×マスターミックスを以下の如く調製した： ４０μｌの１０×ＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ１９６
５Ａ） １０μｌの４０ｍＭのピロリン酸ナトリウム １０μｌ（１０ｕ／μｌ）クレノーエキソマイナスＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ、Ｍ２１８Ｂ） ２μｌの濃度１ｕ／μｌのＮＤＰＫ ４μｌの１０μＭＡＤＰ １３４μｌの無ヌクレアーゼ水 マスターミックス成分を混合し、室温まで冷却した後、９５℃に加熱された各
溶液に２０μｌの２×マスターミックスを加えた。次に、反応液を３７℃にて２
０分間インキュベートした作製した後、反応液４μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬
に加え、反応液より生ずる光をすぐにターナー社製２０／２０ルミノメーターを
用い測定した。以下のデータを得た。
【０３６６】
【表７９】
【０３６７】 これらの結果は、強い光シグナルが標的ＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列内部にハ
イブリダイズするプライマー、クレノーＤＮＡポリメラーゼ及び本実施例に掲載
の反応液のその他の成分を含む反応液より生じることを示す。全ての成分が反応
液中に存在する場合に生じるシグナルは、標的ＤＮＡまたはプライマーが存在し
ない場合に比べはるかに強いことに注意されたい。
【０３６８】 実施例４６：特定ＤＮＡ配列にハイブリダイズするプライマーを利用した、プ
ラスミド中の特定ＤＮＡ配列の同定 前記実施例は、特定のＤＮＡ配列が、ピロリン酸化反応を利用により、配列に
ハイブリダイズするプライマーを利用することで検出できることを示す。前記実
施例は、プライマーがプライマーの３’末端にある塩基対を同定する様に設計さ
れている場合、この様な反応を利用しＲＮＡ配列中の変異も検出できることを示
している。本実施例はリン酸化反応用鋳型としてＤＮＡを利用し実施できる類似
反応を記載する。
【０３６９】 以下の溶液を調製した：
【０３７０】
【表８０】
【０３７１】 これらの溶液を９５℃に３分間加熱し、１０分間室温まで冷却した。実施例４
５記載の如く２×マスターミックスを調製、混合し、この２×マスターミックス
２０μｌを上記の各溶液に加えた。これら反応液を３７℃にて２０分間インキュ
ベートし、次に各４μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、得られた応液の光産
生をターナー社製２０／２０ルミノメーターを用い測定した。
【０３７２】 以下のデータを得た。
【０３７３】
【表８１】
【０３７４】 これらのデータは、プラスミド上に存在するＤＮＡ配列に正確に一致するプラ
イマーは、プライマーの３’末端にミスマッチを含むプライマーに比べ、はるか
に強い光シグナルを提供することを示している。プライマーは部位において予測
される塩基にマッチするように設計できることから、このシグナルが劇的に低下
することで、予想塩基がその部位に存在しないことを示すことができる。従って
本システムを利用して、予想配列が別の塩基に変化したＤＮＡ中の変異を検出す
ることができる。
【０３７５】 実施例４７：プライマーピロリン酸化を利用したプラスミドＤＮＡに関する初
期検出限界 前記２つの実施例では、ＤＮＡ中の配列にハイブリダイズするプライマーを利
用することでプラスミドＤＮＡが特異的に検出された。本実施例で我々は、本シ
ステムからのシグナルを得るのに必要なＤＮＡのレベルを決定するために、ピロ
リン酸反応中のＤＮＡ滴定を行った。
【０３７６】 ＳｐｈａＩで切断されたｐＫＡＮＤＮＡ（４０，０００ｐｇ／μｌ）を無ヌク
レアーゼ水を用い連続希釈し、１０，０００、２，５００，６２５、１５６及び
３９ｐｇ／μｌの濃度を得た。これらＤＮＡ液１μｌ、１μｌのプライマー１及
び１８μｌの無ヌクレアーゼ水を含む溶液２系列を、１μｌのプライマー１及び
１９μｌの無ヌクレアーゼ水を含む溶液ペアーと同様に調製した。これら全てを
９５℃にて３分間加熱し、続いて１０分間室温まで冷却した。実施例４５記載の
如くに２×マスターミックスを調製し、次にミックス２０μｌを全てのチューブ
に加え、チューブを３７℃にて２０分間インキュベートした。次に溶液４μｌを
１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、光産生をターナー社製２０／２０ルミノメータ
ーを用い測定した。以下結果を得た。
【０３７７】
【表８２】
【０３７８】 これらのデータはこれら条件下での本反応によるＤＮＡの検出限界が少なくと
も６２．５ｐｇＤＮＡであり、おそらく１５．６ｐｇＤＮＡまたはそれ以下であ
ることを示している。
【０３７９】 実施例４８：プラスミド中のβ−ガラクトシダーゼ配列の検出 本実施例では、相互に相補的な２種類のプライマーを利用する。その内の一方
はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列に正確に一致し（センス側）、もう一方の
プライマーはその遺伝子の相補鎖に正確に一致する（アンチセンス鎖）。本実施
例は、両プライマーがプラスミドＤＮＡ中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の存在
を検出に利用できるが、一方のプライマーＤＮＡのみを含む反応液により得られ
るバックグランドシグナルのレベルに大きさ差があることを示す。
【０３８０】 プライマー２３及び２４（配列番号４２及び４３）を上記の様に５００ｎｇ／
μｌの濃度に溶解し、無ヌクレアーゼ水中に１００及び２０ｎｇ／μｌに希釈す
る。プラスミドｐＧＥＭ７ｚｆ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＳａｃＩ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社）で消化し、希釈して２０ｎｇプラスミドＤＮＡ／μｌの溶液を得た。
【０３８１】 以下の溶液を調製した： 溶液 プラスミドDNA プライマー、濃度 Ｈ2Ｏ ＃１ １μｌ （なし、１μｌの１Ｘ ＴＥ添加） １８μｌ ＃２ ０ １μｌプライマー２３、500ng/μｌ １９μｌ ＃３ ０ １μｌプライマー２３、100ng/μｌ １９μｌ ＃４ ０ １μｌプライマー２３、 20ng/μｌ １９μｌ ＃５ １μｌ １μｌプライマー２３、500ng/μｌ １８μｌ ＃６ １μｌ １μｌプライマー２３、100ng/μｌ １８μｌ ＃７ １μｌ １μｌプライマー２３、 20ng/μｌ １８μｌ ＃８ ０ １μｌプライマー２４、500ng/μｌ １９μｌ ＃９ ０ １μｌプライマー２４、100ng/μｌ １９μｌ ＃10 ０ １μｌプライマー２４、 20ng/μｌ １９μｌ ＃11 １μｌ １μｌプライマー２４、500ng/μｌ １８μｌ ＃12 １μｌ １μｌプライマー２４、100ng/μｌ １８μｌ ＃13 １μｌ １μｌプライマー２４、 20ng/μｌ １８μｌ これらの溶液を９５℃にて３分間加熱し、１０分間室温まで冷却した。実施例
４５記載の如くに調製された２０μｌの２×マスターミックスを加え、溶液を３
７℃にて２０分間インキュベートした。次に溶液４μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試
薬に加え、反応液の光出力をターナー社製２０／２０ルミノメーターを用い測定
した。
【０３８２】 以下のデータを得た。
【０３８３】
【表８３】
【０３８４】 これらのデータは両プライマーが、プライマーに一致するβガラクトシダーゼ
遺伝子をコードする領域がプラスミド中に存在することを示すシグナルを生ずる
のに利用できることを示している。それらは又、標的ＤＮＡが存在しない状態で
プライマーより生まれるシグナルのレベルは多様であり、プライマー及びそのプ
ライマーの相補体より生ずるシグナルが必ずしも同じでない事も示している。
【０３８５】 実施例４９：ラムダＤＮＡ上の特定ＤＮＡ配列の検出 本実施例では、組換え体ラムダファージのＤＮＡ内のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子の検出を示す。
【０３８６】 以下を含む溶液を２系列作製した：溶液１及び２、１μｌの３００ｎｇ／μｌ
ラムダｇｔ１１ＤＮＡ、及び１９μｌの無ヌクレアーゼ水；溶液３及び４、１μ
ｌの５００ｎｇ／μｌプライマー２３、及び１９μｌの無ヌクレアーゼ水；溶液
５及び６、１μｌの３００ｎｇ／μｌラムダｇｔ１１ＤＮＡ、１μｌの５００ｎ
ｇ／μｌプライマー２３、及び１８μｌの無ヌクレアーゼ水。これら全てを９５
℃、３分間加熱し、１０分間室温まで冷却した。この時点で実施例４５記載の如
くに調製された２０μｌの２×マスターミックスを加え、溶液を３７℃にて更に
２０分間インキュベートした。次に反応液４μｌを取り出し、１００μｌのＬ／
Ｌ試薬に加え、溶液の光産生を測定した。以下のデータを得た。
【０３８７】
【表８４】
【０３８８】 これらのデータは、プライマーピロリン酸化システムがラムダｇｔ１１ＤＮＡ
の特定配列の検出に利用できることを示している。 実施例５０：基質破壊による底レベルエンドヌクレアーゼの検出 本実施例では、２本鎖ＤＮＡのサンプルを、レベルを低下させた非特異的エン
ドヌクレアーゼに暴露する。消化後、溶液をピロリン酸化反応混合液に添加し、
残存する２本鎖ＤＮＡ量が決定される。このアプローチにより、我々は極端に低
レベルのエンドヌクレアーゼの測定が可能であることを示す。
【０３８９】 酵素希釈液は、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒ３９６、ロット
８５６０８０３）を１８０μｌのバッファーＡ（１８μｌの１０×バッファーＡ
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒ００１、ロット７６５１１０４を１６２μｌのナノピュア
水（Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＡ３３９、ＬＳＳ６５２）で希釈し作製）に加え作製さ
れた。この溶液を使いＲＱ１ ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ６１０、ロット
７５２０１０８）を濃度を酵素の元の濃度（１ｕ／μｌ）の０．００１×、０．
０００３３×、０．０００１×、０．００００３３×及び０．００００１×まで
希釈した。
【０３９０】 希釈ＤＮＡ液は、５００ｂｐＤＮＡ断片（ＤＮＡラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ
２１０）に用いられた５００ｂｐ断片）を１０ｎｇ／μｌに希釈し、作製された
。
【０３９１】 ８μｌのナノピュア水；４μｌの１０ｍＭＣａＣｌ2；２μｌの１０×バッフ ァーＡ；２μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ；２μｌの希釈ＤＮＡを６本の０．５
ｍｌ微量遠心チューブに加え、混合してＤＮＡ基質混合液を６本作製した。上記
の各種ＲＱ１ ＤＮＡｓｅ液をチューブの１本に加え、コントロールである最後
のチューブにはナノピュア水１μｌを加えた。
【０３９２】 チューブを再度混合し、一晩３７度でインキュベートし氷上に置いた。 マスター反応液ミックスは２５０μｌのナノピュア水；４０μｌの１０×バッ
ファーＡ；２０μｌのＮＤＰＫ（０．１ｕ／μｌ）；２０μｌの２μＭ ＡＤＰ
；１０μｌの２０ｍＭピロリン酸ナトリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ１１３，ロッ
ト６６７５７０５）をナノピュア水で１：１に希釈し作製；及び２０μｌのＥ．
ｃｏｌｉポリメラーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ２０５、ロット８１０４７０２）
を、１．５ｍｌの微量遠心チューブに加え、ボルテックスにより混合し作製した
。１８本の０．５ｍｌチューブにラベルを貼り、各チューブに１８μｌのマスタ
ー反応液ミックスを加えた。各ＤＮＡ消化体（一晩インキュベートした）２μｌ
を３本のチューブに加え、得られた溶液をボルテックスして混合、３７℃で１８
分間インキュベートした。インキュベート後、各チューブの内容物を１００μｌ
のＬ／Ｌに加え、得られた反応液の光産生をすぐにターナー社製ルミノメーター
を用いて測定した。以下のデータを得た。
【０３９３】
【表８５】
【０３９４】 これらのデータは、本アッセイによりＲＱ１ ＤＮａｓｅの１ないし１００，
０００倍希釈でも容易に測定できることを示す。 実施例５１：特異的エンドヌクレアーゼ活性の検出 本実施例では、別種のエンドヌクレアーゼ、ＲｓａＩが閉環型プラスミドＤＮ
Ａとインキュベートされる。閉環型ＤＮＡは通常はピロリン酸の基質ではない。
しかし、エンドヌクレアーゼがプラスミド中に２本鎖ＤＮＡ切断を作れば、生じ
た直鎖状ＤＮＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使った反応の基質になる。ＲｓａＩ
とインキュベートしたプラスミドＤＮＡのサンプルを取り出し、ルシフェラーゼ
及びルシフェリンの溶液に加え、形成されたＡＴＰを光産生より検出した。得ら
れたデータは、この様な方法を利用することで極めて低いレベルでエンドヌクレ
アーゼ活性が検出できることを示している。
【０３９５】 １×バッファーＣ保存液は；２０μｌの１０×バッファーＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｒ００３、ロット７５４４２０５）を１８０μｌのナノピュア水（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ ＡＡ３９９、ロットＬＳＳ６５２）で希釈し作製した。これを用い、２０
μｌの１０，ｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒ３９６、ロット８５６０８
０３）を１８０μｌの１×バッファーＣに加え、ＲｓａＩ希釈バッファーを作製
した。ＲｓａＩ希釈バッファーを使い、ＲｓａＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒ９３７、
ロット７９８０００３）を出発酵素濃度（３ｕ／μｌ）の０．１×、０．０１×
、０．００１×、０．０００３３×、０．０００１×、０．００００３３×及び
０．００００１×濃度まで希釈した。
【０３９６】 プラスミド基質溶液は、プラスミド（ｐＧＥＭ ３ＺＦ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐ
２２７、８１４１８０）１μｌを２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．３（２Ｍ
保存液をナノピュア水で希釈し作製）１００μｌで希釈し、１０ｎｇ／μｌプラ
スミドＤＮＡ液を作製し調製した。
【０３９７】 以下を含む６本の反応チューブを調製した：２μｌの１０×バッファーＣ、２
μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、２μｌの１０ｎｇ／μｌＤＮＡ。これらチューブ
の１本に１μｌのＲＳＡ Ｉ希釈バッファーを加えた。残りの５本のチューブに
は１μｌの０．００１から０．００００１×のＲｓａＩ 希釈液を加えた。チュ
ーブを一晩３７℃にてインキュベートした。
【０３９８】 翌日、インキュベートしたチューブのサンプル２μｌを前実施例に記載のピロ
リン酸反応混合液に加え、１８分間３７℃にてインキュベートした。インキュベ
ート後、チューブの内容物を１００μｌのＬ／Ｌに加え、この反応液の光産生を
すぐにターナー社製２０／２０ルミノメーターを用い測定した。以下のデータを
得た。
【０３９９】
【表８６】
【０４００】 これらのデータは、本アッセイを利用することでモデルエンドヌクレアーゼで
ある極めて低レベルのＲｓａＩが検出できることを示している。 実施例５２：低レベルエキソヌクレアーゼの検出 本実施例では、エキソヌクレアーゼが：５’ヌクレオチド１リン酸を産生する
エキソヌクレアーゼを利用し、ＰＲＰＰ合成酵素とＰＲＰＰを用いてｄＡＭＰｓ
を３リン酸型に転換し；ｄＡＴＰを利用し、ＮＤＰＫによりＡＤＰをＡＴＰに転
換し、ルシフェラーゼを用いてＡＴＰを測定することでエキソヌクレアーゼを検
出する。
【０４０１】 エキソヌクレアーゼＩＩＩ希釈バッファーは、まず２０μｌの１０×エキソヌ
クレアーゼＩＩＩ反応バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ５７７、ロット４８５３
２１８）を１８０μｌのナノピュア水（Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＡ３９９、ＬＳＳ９
６５２）で希釈し、１×エキソヌクレアーゼIII液を作り、続いて２０μｌの１ ０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒ３９６、ロット８５６０８０３）を１
８０μｌの１×エキソヌクレアーゼＩＩＩバッファーで希釈し作製した。
【０４０２】 エキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１８１、ロット５５１２７０
８）をエキソヌクレアーゼ希釈バッファーで連続希釈し、保存酵素濃度（１７５
ｕ／μｌ）の０．１×、０．０１×、０．００１×、０．０００３３×、０．０
００１×、０．００００３３×及び０．００００１×の酵素濃度を得た。
【０４０３】 ＤＮＡ（ＰｈｉＸ１７４ＨｉｎＦＩ ＤＮＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７１５、ロ
ット７７３３６０４）を前記実施例と同様に作製した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ
バッファー１４μｌで希釈し、１１５ｎｇ／μｌのＤＮＡを含む溶液を得た。
【０４０４】 以下を含む６本の反応チューブを調製した：１３μｌのナノピュア水、２μｌ
の１０×エキソヌクレアーゼＩＩＩ反応バッファー、２μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢ
ＳＡ、及び１μｌの１１５ｎｇ／μｌＤＮＡ保存液。１本のチューブには更に１
μｌのナノピュア水を加え、陰性コントロールとした。残りの５本のチューブに
は１μｌの０．００１から０．００００１×の範囲の濃度の希釈エキソヌクレア
ーゼサンプルを加えた。反応液を３７℃にて１時間インキュベートした。
【０４０５】 １８本の０．５ｍｌチューブに、上記パラグラフに記載の如くに作製された１
消化物、５μｌ、２μｌのＡＤＰ、２μｌのＮＤＰＫ（共に前記実施例と同様に
作製）、２μｌのＰＲＰＰ（固形物のＰＲＰＰ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
社、を希釈し１００ｕｇ／ｍｌを作製）、１７μｌのＰＲＰＰ合成酵素バッファ
ー及びＰＲＰＰ合成酵素反応バッファー中に０．００１×ＰＲＰＰ合成酵素を含
む液２μｌを加えた。チューブは３７℃で３０分間インキュベートされ、次に反
応液を１００μｌのＬ／Ｌに加え、反応液により産生された光を測定した。
【０４０６】 以下のデータを得た。
【０４０７】
【表８７】
【０４０８】 これらのデータは、エンドヌクレアーゼＩＩＩは上記条件下に於いて少なくと
も１７５ｕ／μｌの０．０００１×希釈まで検出できることを示している。 実施例５３：基質消化によるエキソヌクレアーゼ活性の検出 本実施例では、エキソヌクレアーゼを用いて直鎖型２本鎖ＤＮＡを消化する。
残存ＤＮＡをピロリン酸化、リン酸転移及びルシフェラーゼをベースとした光産
生を用い測定する。エキソヌクレアーゼはＤＮＡよりデオキシヌクレオチド３リ
ン酸を生じないため、エキソヌクレアーゼによるＤＮＡ消化は、後の反応の基質
の消失を招くと予想される。即ち、エキソヌクレアーゼとのインキュベーション
後に残る基質濃度の低下を測定することにより、エキソヌクレアーゼ活性を検出
できる。
【０４０９】 エキソヌクレアーゼＩＩＩを前実施例記載同様に希釈した。５００ｂｐの直鎖
型ＤＮＡ断片（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ３７０、ロット７９２８０）、１．４６ｍｇ
／ｍｌのサンプル１μｌを１４６μｌのナノピュア水で希釈し、１０ｕ／ｍｌの
液を得た。
【０４１０】 １２μｌのナノピュア水、２μｌの１０×エキソヌクレアーゼＩＩＩ反応バッ
ファー、２μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、及び１μｌの希釈５００ｂｐＤＮＡ断
片を含む６本の反応チューブを調製した。１本のチューブには更に１μｌのナノ
ピュア水を加え、陰性コントロールとした。残りの５本のチューブには１μｌの
濃縮エキソヌクレアーゼＩＩＩ又は０．１から０．０００１×の濃度範囲の希釈
エキソヌクレアーゼ（保存液１７５μ／μｌ）を加えた。チューブを３７℃にて
１時間インキュベートした。
【０４１１】 ２７５μｌのナノピュア水；４４μｌの１０×バッファーＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｒ００１、ロット７６５１１０３）、２２μｌのＮＤＰＫ（０．１μ／μｌ）
；２２μｌの２μＭ ＡＤＰ；１１μｌのピロリン酸ナトリウム（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｃ１１３，ロット６６７５７０５）及び２２μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ２４１、ロット６１７５７１１）を含むマスター反応液ミ
ックスを作製した。１８本の０．５ｍｌチューブに１８μｌのマスター反応液ミ
ックスを加え、３７℃にて各種濃度のエキソヌクレアーゼＩＩＩとインキュベー
トされた６本のチューブより得た２μｌを３系列づつ加えた。これら新チューブ
を３７℃で１時間インキュベートし、チューブの内容物を１００μｌのＬ／Ｌに
加え、反応液の光出力をターナー社製ルミノメーターを用いて測定した。以下の
結果を得た。
【０４１２】
【表８８】
【０４１３】 これらのデータは、本法の利用により低レベルの２本鎖ＤＮＡエキソヌクレア
ーゼが測定できることを示す。 実施例５４：ピロリン酸分解によるＰＣＲ産物のプライマー依存検出 ６１３ｂｐのＰＣＲ産物を、プラスミドｐＫａｎＤｅｌｔａＣＧ内のカナマイ
シン耐性遺伝子に相当する１．２ｋｂの合成ＲＮＡより逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）により合成した。ＲＮＡはテキサス州、オースチン、Ａｍｂｉｏｎ社製市
販キット（ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ ＳＰ６キット カタログ＃１３
４０）を使い合成された。ＰＫａｎＤｅｌｔａＣＧをまずＥｃｏＲＩで直鎖状に
し、転写可能な形にした。プラスミドを３７℃、１時間以下の反応液内で消化し
た： ２５μｌの１ｍｇ／ｍｌのｐＫａｎ ＤｅｌｔａＣＧ １０μｌの１０×Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｒｅバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒ９９
９Ａ） ５μｌの８０ｕ／μｌ ＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒ６０１１） ６０μｌの水 １００μｌ ５ＭのＮａＣｌを１０μｌ、ＥｃｏＲ１消化ＤＮＡに加え、反応液を１１０μ
ｌのフェノール：クロロホルム；イソアミルアルコール（４９：４９：２、Ｐｒ
ｏｍｅｇａ、Ｚ５２９Ａ）で抽出した。上清を２倍量のエタノールで沈殿させ、
沈殿を真空乾燥し、３０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。ＴＥを加え、消化プラスミド濃度を０．５ｍｇ／
ｍｌに調整した。
【０４１４】 カナマイシン転写体は以下の反応にて作製された： １６μｌの無ＲＮａｓｅ水（Ａｍｂｉｏｎ ９９１０Ｇ） ８μｌの１０×転写バッファー（８１５３Ｇ） ４０μｌの２×リボヌクレオチドミックス（８０５５Ｇ） ８μｌのＥｃｏＲＩ切断プラスミド（４μｇ） ８μｌの１０×酵素ミックス（２０７９Ｇ） ８０μｌ 反応液は３７℃で１時間インキュベートした。キャップ類似体がリボヌクレオ
チドミックス中に存在したことから、合成されたＲＮＡの大部分は５’末端にキ
ャップ構造（ＧｐｐｐＧ）を含む。反応終了後、４μｌのＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉ
ｏｎ ２２２６Ｇ）を加え、更に１５分間、３７℃でインキュベートを続けた。
次に、１２０μｌの水と１００μｌのＬｉＣｌ沈殿液（Ａｍｂｉｏｎ ９４８０
Ｇ）を加えた。反応液を−２０℃に３０分間冷却し、遠心分離器により１４，０
００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。沈査を７０％エタノールで１回洗浄し、５
０μｌの水に溶解した。ＲＮＡ濃度は、１ｍｇ／ｍｌの溶液が２６０ｎｍにて吸
光度２５を示すと仮定し、分光光度計にて決定した。まずＰＣＲアンカーとして
機能する小型のＲＮＡオリゴヌクレオチドを５’末端に結合させてＲＮＡを調製
した。このオリゴＲＮＡをカナマイシンＲＮＡに結合する前に、カナマイシンＲ
ＮＡをまずウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）及びタバコ酸性ピロホ
スファターゼ（ＴＡＰ）で処理した。ホスファターゼのステップは、５’キャッ
プを含まないＲＮＡ分子の結合工程では利用されない。ホスファターゼを除かれ
ると、キャップ自体もＴＡＰと共に除かれる。合成カナマイシンＲＮＡは以下の
反応中にＣＩＡＰで処理された： ０．６μｌの８５０μｇ／ｍｌ全マウス肝臓ＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ１６
０Ａ） １μｌの５ｐｇ／μｌのキャップ構造を持つカナマイシンＲＮＡ ５μｌの１０×ＣＩＡＰバッファー １μｌの４０ｕ／μｌ ｒＲＮＡａｓｉｎ（ＰｒｏｍｅｇａＮ２５１Ｅ） ２μｌの１ｕ／μｌＣＩＡＰ ４０．４μｌの水 ５０μｌ １時間、３７℃のインキュベーションの後、２５０μｌの水、７５μｌの１０
Ｍ酢酸アンモニウム、及び３７５μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミル
アルコール（４９：４９：２）を加えた。反応液を振盪し、遠心分離装置にて５
分間遠心分離を行い相分離した。上清（３５０μｌ）を除き、抽出を繰り返した
。９００μｌのエタノールを加え、５分間遠心分離し上清を沈殿させた。７０％
エタノール洗浄に続き、沈査を４３．５μｌの水に溶解した。ＣＩＡＰ−処理Ｒ
ＮＡに以下を加えた： ５μｌの１０×ＴＡＰバッファー １μｌの４０ｕ／μｌ ｒＲＮａｓｉｎ １μｌの０．１ｕ／μｌ ＴＡＰ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔ１９５００） １時間、３７℃のインキュベーションの後、反応液を上記同様に抽出、沈殿さ
せ、沈査を１３μの水に溶解した、これに以下を加えた： ４μｌの１０×ＲＮＡリガーゼバッファー １μｌの０．２５ｕｇ／μｌＲＮＡオリゴ３０ｍｅｒ １μｌの４０ｕ／μｌのｒＲＮａｓｉｎ １μｌの１０ｕ／μｌのＲＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１０１５１） ２０μｌの４０％ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ Ｐ−２１３９） そして反応液を一晩１６℃にてインキュベートした。 １０×ＣＩＡＰバッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１００ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ １０×ＴＡＰバッファー：０．５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
、１％βメルカプトエタノール、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １０×ＲＮＡリガーゼバッファー：０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１０
０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．６８％ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ ＲＮＡオリゴの配列； ５’ＡＧＡＧＵＣＵＵＧＡＣＧＧＡＵＣＣＡＧＧＵＡＣＣＡＧＵＡＡＡ３’ 連結工程の後、２５０μｌの水、７５μｌの１０Ｍ酢酸アンモニウム及び９０
０μｌのエタノールを反応液に加えた。混合液をボルテックスし、続いて遠心分
離器により１４，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心分離を行った。沈殿を７０
％エタノールで洗浄し、１５μｌの水に溶解した。ＰＣＲの前に、まずｃＤＮＡ
をＲＮＡより合成した。ＲＮＡに１μｌ（５０ｐｍｏｌｅｓ）のｃＤＮＡ合成プ
ライマーを加え、混合液を７０℃にて５分間加熱し、１０分間室温に冷却した。
ＲＮＡ／プライマーに以下を加えた： ５μｌの５×第１鎖バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ１１３Ａ） ２．５μｌの４０ｍＭピロリン酸ナトリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ５１０８） １μｌの２５ｕ／μｌ ＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ５１０８） 反応液を１時間、４２℃にてインキュベートし、続いて０．５μｌの０．５Ｍ
ＥＤＴＡ及び７４μｌの水を添加し停止させた。ｃＤＮＡ５μｌに以下を加え
た： ５μｌの１０×サーモフィリックバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１９０Ｇ） ５μｌの１０×ＰＣＲ ｄＮＴＰ ５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2（Ｐｒｏｍｅｇａ Ａ３５１Ｈ） １μｌの３２０ｕｇ／ｍｌ上流プライマー ２６．５μｌの水 反応液を混合し、５０μｌのミネラルオイルで覆った。これを９５℃のサーマ
ルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒモデル４８０）に入れた。２分後、１
μｌの５ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｏｍｅｇａＭ１６６Ｂ）を
加え、反応サイクル、９５℃１分、４３℃１分、７２℃２分を５回行い、続いて
８５℃に持っていった。次に１μｌの３２０ｕｇ／ｍｌの下流プライマーを加え
、反応サイクル９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２度１分を３０回行い、続いて
７２℃に５分置いた後４℃とした。 １０×ＰＣＲ ｄＮＴＰ；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ各１ｍＭ 上流プライマー：５’ＴＧＡＴＣＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＴＧＡＣＧＧＡＴＣ３’ 下流プライマー：５’ＴＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡ３’ ＰＣＲ反応は６１３ｂｐの産物を生じた。取り込まれていないプライマーとｄ
ＮＴＰを除くために、ＰＣＲ反応液１５μｌをキットの指示に従いＰｒｏｍｅｇ
ａ社製Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ（Ａ７１７０）にかけ精製した。精製
ＰＣＲ産物の濃度はピロリン酸分解アッセイにて決定した。マスターミックス（
ＭＭ）は以下成分を含む形で調製された： ２０μｌの１０×バッファーＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒ００１Ａ） ２μｌの４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ２μｌの１０μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ５２８５） ２μｌの１ｕ／μｌ ＮＤＰＫ（Ｓｉｇｍａ Ｎ０３７９） １５１μｌの水 １８０μｌ 本混合液を、Ｔ４ＤＮＡＰ（１０ｕ）を添加された、及び添加されていない、
コントロールのＰｈｉＸ１７４ＨｉｎＦＩＤＮＡ鎖（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ１７５
Ａ）又はＰＣＲ産物の一部を含む反応液内に使用した。
【０４１５】 結果は以下の通りである：
【０４１６】
【表８９】
【０４１７】 得られた光単位（ＬＵ）は、反応混合液２μｌを１００μｌのＬ／Ｌ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｆ２０２Ａ）に添加し生じた。 上記の如く、ＰｈｉＸ１７４ＨｉｎＦＩＤＮＡは添加されたＤＮＡ量に比例し
た光シグナルを生じた。１０倍希釈されたＰＣＲ反応液の濃度は、ＤＮＡスタン
ダード濃度にほぼ等しいことから、未希釈ＰＣＲ産物ＤＮＡは１０ｎｇ／μｌの
濃度であった。バックグランド光は、ＰＣＲ産物は含むが、Ｔ４ＤＮＡＰを含ま
ない反応液についてのみ観察された。この事は、実質Ｗｉｚａｒｄ樹脂による洗
浄中にｄＮＴＰが完全に除去されたことを示す。
【０４１８】 次に我々は、内部配列に結合するプライマーをハイブリダイズし、ピロリン酸
化することでＰＣＲ産物を検出した。プライマーの配列は５’ＧＣＡＡＣＧＣＴ
ＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＴＴＣ３’であった。この目的には、Ｔ４ＤＮＡＰ
の代わりエキソヌクレアーゼマイナスクレノーＤＮＡＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ２
１８Ｂ）を利用することが最適であることを見いだした。２×マスターミックス
（ＭＭ）は以下の様に調製した： ６０μｌの１０×ＤＮＡＰバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１９５Ａ） １５μｌの４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １５μｌの１０μ／μｌクレノーエキソヌクレアーゼマイナスＤＮＡＰ ３μｌの１ｕ／μｌ ＮＤＰＫ（Ｓｉｇｍａ Ｎ０３７９） ６μｌのＡＤＰ ２０１μｌの水 ３００μｌ ＰＣＲ産物（０から２０ｎｇ）を１μｌの１μｇ／μｌプライマー及び水と下
記の如くに混合した（又は混合しなかった）。混合液を９５℃で３分間加熱し、
続いて１０分間室温まで冷却した。２０μｌの２×ＭＭを加え、反応液を２０分
間３７℃にてインキュベーションし、４μｌを１００μｌのＬ／Ｌに加えた。
【０４１９】
【表９０】
【０４２０】 プライマーがＤＮＡと共に存在する場合に本質的に高いＬＵが生じ、このシグ
ナルはプラマー単独によるものではないことが分かる（反応液１１）。例えばＤ
ＮＡ量が多い場合でも、極少量のＰＣＲ産物が再アニールがアッセイ中にシグナ
ルを発することは驚くべき事である。生じた光単位は反応液に加えられたＤＮＡ
のわずか１／１０であることが示され、またこのデータよりプライマー依存的な
様式ではＰＣＲ産物約１０ｐｇを容易に検出できることが示された。
【０４２１】 実施例５５：ＰＣＲ産物中のミスマッチ（変異）の検出 塩基応答又はミスマッチを検出するために、上記PCR産物に４種類のプライマ ーを使用した。野生型（ＷＴ）プライマーは実施例３７に用いたものと同一であ
る。更に、３’末端の塩基が異なる３種類のプライマーを使用した。ＷＴプライ
マー（プライマー１）はＰＣＲ鋳型上のＧにマッチしたＣを含む。その他の３種
類のプライマーは３’末端位置にＧ、Ａ又はＴの何れかを含み（それぞれプライ
マー２，３及び４）、従って鋳型とハイブリダイズさせるとそれぞれＧＧ、ＧＡ
及びＧＴのミスマッチを形成する。これらミスマッチした塩基は実施的にハイブ
リダイズしたプライマーのピロリン酸化を阻止することから、ＤＮＡ鋳型上に存
在するこの位置の塩基を決定することができる。２×マスターミックス（ＭＭ）
は実施例５４同様に調製し、１μの１０ｎｇ／μｌＰＣＲ産物を以下の様に１μ
ｌの１μｇ／μｌのプライマー及び水、又はＴＥと混合した。混合液を３分間、
９５℃で加熱し、続いて１０分間室温まで冷却した。続いて２０μｌの２×ＭＭ
を加え、反応液を混合、２０分間３７℃にてインキュベーションし、４μｌを１
００μｌのＬ／Ｌに加え、生じた光単位を測定した。
【０４２２】
【表９１】
【０４２３】 最大ＬＵは、マッチしたプライマー（プライマー１）の例にて得られた。ぷＰ
ＣＲ産物単独及びプライマー単独のバックグランド減じ、マッチ及びミスマッチ
プライマーの例について以下のＬＵを得た：
【０４２４】
【表９２】
【０４２５】 鋳型とミスマッチな３’末端塩基を持つとハイブリダイズしたプライマーのピ
ロリン酸分解の速度が大きく低下することは明確である。 上記に見られるプライマー単独バックグランドは低い（＜１０ＩＵ）。しかし
、我々は非常に高いバックグランド（１００ｎｇプライマー当たり５００ＬＵ）
を示したプライマーを経験した。この様なプライマーは一般に相補的であり、そ
の３’末端に自己ダイマーまたはヘアピン構造を形成し２本鎖域をもたらす。こ
の様なプライマーは避けなければならず、又しばしば各種二次構造予測プログラ
ムを利用することで検出可能である。プライマーセットが高いバックグランドを
示す場合には、同一側に結合できる３’末端を持つ近接する他のプライマーを利
用することができる。
【０４２６】 実施例５６：偽ＰＣＲ産物合成鋳型上での変異検出 塩基が実際に変化した（変異）ＤＮＡ鋳型上での塩基探索を示すために、薬剤
であるガンシクロビルに対する耐性への関係が示されてる変異が存在するサイト
メガロウイルスＤＮＡの領域に対応する合成オリゴヌクレオチドを作製した。野
生型鋳型の上鎖は配列１下（配列番号４４）に対応し、下部鎖は配列２下（配列
番号４５）に相当する。変異型鋳型の上鎖（配列３、配列番号４６）は太字の塩
基がＡからＧに変化した以外は配列１に等しい。変異型鋳型の下部鎖（下記配列
４、配列番号４７）は太字の塩基がＴからＣに変化した以外は配列２に等しい。
一つは野生型に相当し、もう一つは変異型配列に相当する２種類のオリゴを使い
変異塩基の位置を探った。野生型探索オリゴの配列は配列５（配列番号４８）下
であり、変異型探索オリゴの配列は配列６下（配列番号４９）である。これらオ
リゴはそれぞれ番号９２１１及び９２１２により特定された。配列５は配列６と
、太字の塩基位置で異なっており、これらオリゴに関してはミスマッチ塩基は各
オリゴの３’末端から３ヌクレオチドの位置にある。野生型オリゴは野生型鋳型
上で最も強いシグナルを出し、変異型オリゴは変異型鋳型上で最も強いシグナル
を出すと予想された。以下に示す実験にてこれが示された。
【０４２７】 探索対象の野生型及び変異型ＤＮＡ鋳型は、オリゴ配列１とオリゴ配列２を、
オリゴ配列３をオリゴ配列４とを混合し、最終濃度０．３ｐｇ／ｍｌに調製され
た。探索オリゴ９２１１及び９２１２は共にＴＥバッファーにて１ｍｇ／ｍｌの
濃度に溶解された。反応液を下記の如く、及び鋳型のみ、プライマーのみ、又は
鋳型＋プライマーとして調製された。
【０４２８】 野生型 鋳 型 ９２１１ ９２１２ 水 １および２ １μｌ − − １９μｌ ３および４ − １μｌ − １９μｌ ５および６ − − １μｌ １９μｌ ７および８ １μｌ １μｌ − １８μｌ ９および10 １μｌ − １μｌ １８μｌ 反応液を混合し９５℃で３分間加熱し、机の上で１０分間室温まで冷却した。
次に２０μｌの２×マスターミックスを加え、反応液を３７℃にて２０分間イン
キュベートし、続いて４μｌを１００μｌのＬ／Ｌ試薬に加え、生じた光単位を
ルミノメータにより測定した。
【０４２９】 ２×マスターミックス： ６０μｌの１０×ＤＮＡＰバッファー １５μｌの４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １５μｌクレノーエキソ-ＤＮＡＰ ３μｌの１ｕ／μｌ ＮＤＰＫ ６μｌのＡＤＰ ２０１μｌの水 ３００μｌ 生じた相対光単位は以下の通りであった： 反 応 光ユニット １ １．６８７ ２ １．７３２ ３ ４．３１３ ４ ３．９４８ ５ １０．５４ ６ １０．０４ ７ ２２０．８ ８ ２０６．８ ９ ４９．６７ １０ ３７．３３ 探索プライマーのみの場合（３から６）に比べ、ＤＮＡ鋳型自体は極めて僅か
なＬＵのみ生ずることが分かる（１及び２）。野生型探索プライマーを野生型の
鋳型と混合すると２００ＬＵ以上を生ずるが、、変異プライマーを野生型鋳型と
混合した場合には５０ＬＵ以下であった。鋳型及びプライマー単独で得られるバ
ックグランドを減じた後、野生型オリゴは野生型鋳型に対しては、変異型オリゴ
に比べ約５倍強いシグナルを生ずることが分かる。
【０４３０】 次に野生型鋳型を変異型鋳型に変更し、上記実験を繰り返した。得られたＬＵ
は以下の通りである： 反 応 光ユニット １ １．７６０ ２ １．７７９ ３ ４．１５７ ４ ４．３１６ ５ １１．０ ６ １０．５６ ７ ３４．３１ ８ ２９．５３ ９ ２４１．９ １０ ２６４．５ この場合も鋳型単独及びプライマー単独のバックグランドは低く（１−６）、
今回は最大のシグナルは野生型プライマーではなく変異型プライマー（９２１２
）について見られた。即ち、野生型と変異型プライマーによるシグナルの比を比
較することで、変異ＤＮＡから野生型ＤＮＡを区別できる。
【０４３１】
【表９３】
【０４３２】
【表９４】
【０４３３】
【表９５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ライペ，ドナ・エム アメリカ合衆国ウィスコンシン州53705， マディソン，シェボイガン・アベニュー 4833，ナンバー 328 (72)発明者 ルイス，マーティン・ケイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53716， マディソン，フォージ・ドライブ 5210 (72)発明者 ネルソン，リサ・エス アメリカ合衆国ウィスコンシン州53532， デフォレスト，ヘルムケ・ロード 7881 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QA20 QQ06 QQ08 QQ34 QQ42 QQ52 QQ53 QQ63 QR02 QR04 QR07 QR08 QR32 QR42 QR55 QR57 QR62 QS34 QX02

Claims (127)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸サンプル中の特定の塩基の正体の疑問を問う（interrogat
    ing）方法であって、以下の工程： ａ）少なくとも一つの核酸プローブおよび少なくとも一つの標的核酸を含む疑
    いのあるサンプルを用意するが、その際、核酸プローブは標的核酸に実質上相補
    であり、且つ疑問位置において少なくとも一つの予め決定されたヌクレオチドを
    含み、そして標的核酸は同定される少なくとも一つの塩基を含み； ｂ）核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせることにより核酸プローブ
    −標的核酸複合体を形成するが、その際、疑問位置において予め決定されたヌク
    レオチドを標的核酸内の同定される塩基と並べて、その結果塩基対合うを生じさ
    せ； ｃ）プローブが脱重合してヌクレオチドを放出させるような条件下で核酸プロ
    ーブ−標的核酸複合体を処理し；そして ｄ）放出されたヌクレオチドを検出すること からなる、方法。
  2. 【請求項２】 同定される塩基を同定する工程をさらに含む、請求項１記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 標的核酸がデオキシリボ核酸およびリボ核酸からなる群から選
    択される、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 第１プローブ、第２プローブ、第３プローブおよび第４プロー
    ブをさらに含む、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 第１プローブの疑問位置がデオキシアデノシン残基およびアデ
    ノシン残基からなる群から選択される核酸残基を含み、第２プローブの疑問位置
    がデオキシチミジン残基およびチミジン残基からなる群から選択される核酸残基
    を含み、第３プローブの疑問位置がデオキシグアノシン残基およびグアノシン残
    基からなる群から選択される核酸残基を含み、そして第４プローブの疑問位置が
    デオキシシトシン残基およびシトシン残基からなる群から選択される核酸残基を
    含む、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 同定される塩基の正体を決定する工程をさらに含む、請求項５
    記載の方法。
  7. 【請求項７】 さらに、核酸プローブが５’末端および３’末端を含み、疑問
    位置が上記３’末端から１０塩基以内である、請求項２記載の方法。
  8. 【請求項８】 核酸プローブ−標的核酸複合体の上記処理が、 ａ）核酸プローブ−核酸標的複合体、アデノシン５’２リン酸およびピロリン
    酸を含む溶液を用意するが、核酸プローブは末端ヌクレオチドおよび末端ヌクレ
    オチド間のホスホジエステル結合を有し、そして末端ヌクレオチドは末端ヌクレ
    オチド間ホスホジエステル結合により上記核酸に共有結合しており； ｂ）反応： プローブＮＡn ＋ ＰＰi → プローブＮＡn-1 ＋ ＸＴＰ に従い、ピロリン酸の添加により末端ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵
    素分解することにより核酸プローブ−標的核酸複合体を核酸プローブ末端ヌクレ
    オチドにおいて脱重合することにより、末端５’リン酸基を有する遊離のヌクレ
    オシド断片分子を形成させ；そして ｃ）以下の一般反応： ＸＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ＸＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、ヌクレオシド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸分子に末端５
    ’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン酸を形成させ
    るが、但し＊はそのようにして移された末端５’リン酸である ことを含む、請求項２記載の方法。
  9. 【請求項９】 脱重合がクレノーｅｘｏマイナスポリメラーゼ、Ｔａｑポリメ
    ラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素（reverse transcriptase）およびＭＭＬＶ逆転写酵 素からなる群から選択されるポリメラーゼにより触媒される、請求項２記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 検出工程がアデノシン５’−３リン酸を定量することをさら
    に含む、請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 検出工程がルシフェラーゼおよびＮＡＤＨ検出系からなる群
    から選択される、請求項８記載の方法。
  12. 【請求項１２】 サンプル中の実質上同一の核酸の間を識別する方法であって
    、以下の工程： ａ）少なくとも２つの標的核酸を含む疑いのあるサンプルを用意するが、但し
    標的核酸は予め決定された位置において少なくとも単一のヌクレオチドのミスマ
    ッチを有する同一領域を含み； ｂ）少なくとも一つの核酸プローブを用意するが、但し核酸プローブは同一性
    領域の標的核酸に実質上相補であり、且つ疑問位置において少なくとも一つのヌ
    クレオチドを含み、疑問位置のヌクレオチドは標的核酸の同一領域の予め決定さ
    れた位置において上記ヌクレオチドに相補であり； ｃ）核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせることにより核酸プローブ
    −標的核酸複合体を形成させるが、但し疑問位置における上記ヌクレオチドは上
    記同一領域において予め決定された位置において上記ヌクレオチドと並び； ｄ）プローブが脱重合してヌクレオチドを放出させるような条件下で核酸プロ
    ーブ−標的核酸複合体を処理し；そして ｅ）放出されたヌクレオチドを検出すること からなる、方法。
  13. 【請求項１３】 標的核酸がデオキシリボ核酸およびリボ核酸からなる群から
    選択される、請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 第１プローブ、第２プローブ、第３プローブおよび第４プロ
    ーブをさらに含む、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 第１プローブの疑問位置がデオキシアデノシン残基およびア
    デノシン残基からなる群から選択される核酸残基を含み、第２プローブの疑問位
    置がデオキシチミジン残基およびチミジン残基からなる群から選択される核酸残
    基を含み、第３プローブの疑問位置がデオキシグアノシン残基およびグアノシン
    残基からなる群から選択される核酸残基を含み、そして第４プローブの疑問位置
    がデオキシシトシン残基およびシトシン残基からなる群から選択される核酸残基
    を含む、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 さらに、核酸プローブが５’末端および３’末端を含み、疑
    問位置が上記３’末端から１０塩基以内である、請求項１３記載の方法。
  17. 【請求項１７】 核酸プローブ−標的核酸複合体の上記処理が、 ａ）核酸プローブ−核酸標的複合体、 アデノシン５’２リン酸およびピロリ
    ン酸を含む溶液を用意するが、核酸プローブは末端ヌクレオチドおよび末端ヌク
    レオチド間のホスホジエステル結合を有し、そして末端ヌクレオチドは末端ヌク
    レオチド間ホスホジエステル結合により上記核酸に共有結合しており； ｂ）反応： プローブＮＡn ＋ ＰＰi → プローブＮＡn-1 ＋ ＸＴＰ に従い、ピロリン酸の添加により末端ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵
    素分解することにより核酸プローブ−標的核酸複合体を核酸プローブ末端ヌクレ
    オチドにおいて脱重合することにより、末端５’リン酸基を有する遊離のヌクレ
    オシド断片分子を形成させ； ｃ）以下の一般反応： ＸＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ＸＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、ヌクレオシド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸分子に末端５
    ’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン酸を形成させ
    るが、但し＊はそのようにして移された末端５’リン酸であり； ｄ）ａ−ｃを繰り返す ことを含む、請求項１３記載の方法。
  18. 【請求項１８】 脱重合がクレノーｅｘｏマイナスポリメラーゼ、Ｔａｑポリ
    メラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素からなる群から選択され
    るポリメラーゼにより触媒される、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 検出工程がアデノシン５’−３リン酸を定量することをさら
    に含む、請求項１７記載の方法。
  20. 【請求項２０】 検出工程がルシフェラーゼおよびＮＡＤＨ検出系からなる群
    から選択される、請求項１７記載の方法。
  21. 【請求項２１】 第１および第２核酸が対立遺伝子である、請求項１２記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】 第１核酸が第１の種からであり、そして第２核酸が第２の種
    からである、請求項１２記載の方法。
  23. 【請求項２３】 核酸を検出する方法であって、以下の工程： ａ）少なくとも一つの核酸プローブおよび少なくとも一つの標的核酸を含む疑
    いのあるサンプルを用意するが、但し核酸プローブは標的核酸に実質上相補であ
    り； ｂ）核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせることにより核酸プローブ
    −標的核酸複合体を形成させ； ｃ）核酸プローブが脱重合されてヌクレオチドを放出することを可能にする条
    件下で核酸プローブ−標的核酸複合体を処理し；そして ｄ）放出されたヌクレオチドを検出する ことからなる、方法。
  24. 【請求項２４】 標的核酸がデオキシリボ核酸およびリボ核酸からなる群から
    選択される、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 核酸プローブがデオキシリボ核酸およびリボ核酸からなる群
    から選択される、請求項２３記載の方法。
  26. 【請求項２６】 核酸プローブ−標的核酸複合体の上記処理が、 ａ）核酸プローブ−核酸標的複合体、アデノシン５’２リン酸およびピロリン
    酸を含む溶液を用意するが、核酸プローブは末端ヌクレオチドおよび末端ヌクレ
    オチド間のホスホジエステル結合を有し、そして末端ヌクレオチドは末端ヌクレ
    オチド間ホスホジエステル結合により上記核酸に共有結合しており； ｂ）反応： プローブＮＡn ＋ ＰＰi → プローブＮＡn-1 ＋ ＸＴＰ に従い、ピロリン酸の添加により末端ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵
    素分解することにより核酸プローブ−標的核酸複合体を核酸プローブ末端ヌクレ
    オチドにおいて脱重合することにより、末端５’リン酸基を有する遊離のヌクレ
    オシド断片分子を形成させ；そして ｃ）以下の一般反応： ＸＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ＸＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、ヌクレオシド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸分子に末端５
    ’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン酸を形成させ
    るが、但し＊はそのようにして移された末端５’リン酸である ことを含む、請求項２３記載の方法。
  27. 【請求項２７】 脱重合がクレノーｅｘｏマイナスポリメラーゼ、Ｔａｑポリ
    メラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素からなる群から選択され
    るポリメラーゼにより触媒される、請求項２３記載の方法。
  28. 【請求項２８】 検出工程がアデノシン５’−３リン酸を定量することをさら
    に含む、請求項２６記載の方法。
  29. 【請求項２９】 検出工程がルシフェラーゼおよびＮＡＤＨ検出系からなる群
    から選択される、請求項２６記載の方法。
  30. 【請求項３０】 プローブ核酸がさらに５’末端および３’末端を含み、標的
    核酸がさらに核酸プローブに相補な領域を含み、該相補領域が核酸プローブの３
    ’末端により規定される第１末端および核酸プローブの５’末端により規定され
    る第２末端を有し、該相補領域がその中に第１末端と第２末端の間に傷害を有す
    る、請求項２３記載の方法。
  31. 【請求項３１】 傷害が変異の挿入を含む、請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 傷害が欠失変異を含む、請求項３０記載の方法。
  33. 【請求項３３】 傷害が核酸プローブの３’末端の１０塩基以内である、請求
    項３０記載の方法。
  34. 【請求項３４】 ａ）核酸ポリメラーゼを含む容器；ｂ）ヌクレオシド２リン
    酸キナーゼを含む容器；およびｃ）興味のある核酸に実質上相補な核酸プローブ
    少なくとも一つからなる、興味のある核酸を検出するための試薬を含むキット。
  35. 【請求項３５】 ピロリン酸分解により核酸を検出するための指示書をさらに
    含む、請求項３４記載のキット。
  36. 【請求項３６】 興味のある核酸が傷害を含む、請求項３４記載のキット。
  37. 【請求項３７】 核酸プローブがリボ核酸を含む、請求項３４記載のキット。
  38. 【請求項３８】 核酸プローブがデオキシリボ核酸を含む、請求項３４記載の
    キット。
  39. 【請求項３９】 第１核酸プローブ、第２核酸プローブ、第３核酸プローブお
    よび第４核酸プローブをさらに含み、そして上記核酸プローブがさらに疑問位置
    を含む、請求項３４記載のキット。
  40. 【請求項４０】 第１プローブの疑問位置がデオキシアデノシン残基およびア
    デノシン残基からなる群から選択される核酸残基を含み、第２プローブの疑問位
    置がデオキシチミジン残基およびチミジン残基からなる群から選択される核酸残
    基を含み、第３プローブの疑問位置がデオキシグアノシン残基およびグアノシン
    残基からなる群から選択される核酸残基を含み、そして第４プローブの疑問位置
    がデオキシシトシン残基およびシトシン残基からなる群から選択される核酸残基
    を含む、請求項３９記載のキット。
  41. 【請求項４１】 さらに第１プローブおよび第２プローブを少なくとも含むが
    、但し第１プローブは第１の種の核酸に相補であり、そして第１プローブは第１
    の種の核酸に相補であり、第１核酸プローブおよび第２核酸プローブは各々疑問
    位置を有し、第１核酸プローブの疑問位置は第１ヌクレオチド残基を含み、そし
    て第２核酸プローブの疑問位置は第２ヌクレオチド残基を含む、請求項３４記載
    のキット。
  42. 【請求項４２】 さらに使用のための指示書を含む、請求項３４記載のキット
    。
  43. 【請求項４３】 サンプル中のヌクレアーゼ活性を検出するための方法であっ
    て、 ａ）ｉ）ヌクレアーゼ活性を含む疑いのある溶液；および ｉｉ）核酸基質を用意し； ｂ）核酸基質を溶液に加えて混合物を用意し； ｃ）ヌクレアーゼが核酸上に作用するのに十分な時間混合物をインキュベート
    し； ｄ）上記核酸の脱重合が生じてヌクレアーゼを生成するような条件下で混合物
    を反応させ；そして ｅ）ヌクレアーゼを検出する ことからなる、上記方法。
  44. 【請求項４４】 核酸基質が直鎖状デオキシリボ核酸および閉環デオキシリボ
    核酸からなる群から選択される、請求項４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 ヌクレアーゼ活性がエキソヌクレアーゼ活性およびエンドヌ
    クレアーゼ活性からなる群から選択される、請求項４３記載の方法。
  46. 【請求項４６】 反応工程が、 ａ）核酸基質、アデノシン５’２リン酸およびピロリン酸を含む溶液を用意す
    るが、核酸基質は末端ヌクレオチドおよび末端ヌクレオチド間のホスホジエステ
    ル結合を有し、そして末端ヌクレオチドは末端ヌクレオチド間ホスホジエステル
    結合により上記核酸に共有結合しており； ｂ）反応： ｄＮＡn ＋ ＰＰi → ｄＮＡn-1 ＋ ｄＮＴＰ に従い、末端ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵素分解することにより核
    酸を末端ヌクレオチドにおいて脱重合することにより、ピロリン酸分子を有する
    遊離のヌクレオシド３リン酸分子を形成させ； ｃ）以下の一般反応： ｄＮＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ｄＮＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、ヌクレオシド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸分子に末端５
    ’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン酸を形成させ
    るが、但し＊はそのようにして移された末端５’リン酸である ことをさらに含む、請求項４４記載の方法。
  47. 【請求項４７】 検出工程がアデノシン５’−３リン酸を定量することをさら
    に含む、請求項４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 検出工程がルシフェラーゼおよびＮＡＤＨ検出系からなる群
    から選択される、請求項４６記載の方法。
  49. 【請求項４９】 基質が直鎖状デオキシリボ核酸である、請求項４４記載の方
    法。
  50. 【請求項５０】 脱重合が大腸菌ポリメラーゼ１により触媒される、請求項４
    ９記載の方法。
  51. 【請求項５１】 基質が閉環プラスミドＤＮＡである、請求項４４記載の方法
    。
  52. 【請求項５２】 脱重合がＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される、請求
    項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 エキソヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、 ａ）ｉ）エキソヌクレアーゼ活性を含む疑いのある溶液；および ｉｉ）核酸基質を用意し； ｂ）核酸基質を溶液に加えて混合物を用意し； ｃ）エキソヌクレアーゼによる上記核酸の分解を可能にするように混合物をイ
    ンキュベートし、それによりヌクレオシド１リン酸を形成させ； ｄ）ヌクレオシド１リン酸をヌクレオシド３リン酸に変換し：そして ｅ）ヌクレオシド３リン酸を検出する ことからなる、上記
  54. 【請求項５４】 変換工程が、 ａ）ホスホリボシルピロリン酸、アデノシン５’２リン酸、およびホスホリボ
    シルトランスフェラーゼを含む溶液を用意し； ｂ）ホスホリボシルピロピロリン酸トランスフェラーゼにより触媒される以下
    の反応： ｄＮＴＰ ＋ ＰＲＰＰ → ｄＡＴＰ ＋ リボース−５’−ＰＯ4 に従い、ピロリン酸をホスホリボシルピロリン酸分子からデオキシアデノシン１
    リン酸分子に酵素で転移させることにより、デオキシアデノシン３リン酸分子を
    形成し；そして ｃ）以下の反応： ｄＮＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ｄＮＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、末端の５’リン酸基をデオキシリボヌクレオシド３リン酸分子からアデ
    ノシン５’２リン酸分子へ酵素で転移させるが、但し＊はそのようにして移され
    た末端５’リン酸である ことをさらに含む、請求項５３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 検出工程がアデノシン５’３リン酸を定量することをさらに
    含む、請求項５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】 検出工程がルシフェラーゼおよびＮＡＤＨ検出系からなる群
    から選択される、請求項５４記載の方法。
  57. 【請求項５７】 ａ）ヌクレオシド２リン酸キナーゼを含む容器；およびｂ）
    核酸基質を含むヌクレアーゼ活性検出用キット。
  58. 【請求項５８】 鋳型依存性ポリメラーゼを含む第２の容器をさらに含む、請
    求項５７記載のキット。
  59. 【請求項５９】 核酸基質が直鎖状デオキシリボ核酸および閉環デオキシリボ
    核酸からなる群から選択される、請求項５７記載の方法。
  60. 【請求項６０】 ホスホリボシルピロリン酸トランスフェラーゼを含む第２の
    容器をさらに含む、請求項５９記載のキット。
  61. 【請求項６１】 エンドヌクレアーゼ活性検出における使用のための指示書を
    さらに含む、請求項５７記載のキット。
  62. 【請求項６２】 エキソヌクレアーゼ活性検出における使用のための指示書 をさらに含む、請求項５７記載のキット。
  63. 【請求項６３】 ピロリン酸、アデノシン５’−２リン酸、またはそれらの組
    み合わせを含む反応物中のデオキシリボ核酸を検出する方法であって、該方法は
    、 反応： ｄＮＡn ＋ ＰＰi → ｄＮＡn-1 ＋ ｄＮＴＰ に従い、末端のヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵素で分解してピロリン
    酸分子を用いて同じく再形成することにより末端ヌクレオチドにおいてデオキシ
    リボ核酸を脱重合することにより、遊離のデオキシリボ核酸３リン酸分子を形成
    し； 以下の一般反応： ｄＮＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ｄＮＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、デオキシリボヌクレオシド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸
    分子に末端５’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン
    酸を形成させるが、但し＊はそのようにして移された末端５’リン酸であり；そ
    して それにより形成されたアデノシン５’−３リン酸を検出する ことを含む。
  64. 【請求項６４】 脱重合工程がＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるか、また
    は脱重合工程がＴ４ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素およ
    びＭＭＬＶ逆転写酵素からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼまたは逆転
    写酵素により触媒される、請求項６３記載の方法。
  65. 【請求項６５】 ヌクレオシド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸分
    子に末端５’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン酸
    分子を形成させる工程がヌクレオシド２リン酸キナーゼにより触媒される、請求
    項６３記載の方法。
  66. 【請求項６６】 ＡＴＰ検出方法がルシフェラーゼ検出系である、請求項６３
    記載の方法。
  67. 【請求項６７】 ＡＴＰ検出方法がＮＡＤＨ検出系である、請求項６３記載の
    方法。
  68. 【請求項６８】 脱重合工程およびリン酸転移工程が単一のポット反応におい
    て実施される、請求項６３記載の方法。
  69. 【請求項６９】 リン酸転移工程により生成されるアデノシン５’−３リン酸
    分子を増幅する工程を伴う、請求項６３記載の方法。
  70. 【請求項７０】 増幅を請求項１０１記載の方法により実施する、請求項６９
    記載の方法。
  71. 【請求項７１】 ピロリン酸を含む反応物中のポリアデニル化ｍＲＮＡを検出
    する方法であって、該方法は、 ポリ（Ａ）ポリメラーゼにより触媒される反応： ＮＡn ＋ ＰＰi → ＮＡn-1 ＋ ｄＮＴＰ に従い、末端のヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵素で分解してピロリン
    酸分子を用いて同じく再形成することにより末端ヌクレオチドにおいてポリアデ
    ニル化ｍＲＮＡを脱重合することにより、遊離のアデノシン３リン酸分子を形成
    し；そして それにより形成されたアデノシン５’−３リン酸を検出する ことを含む。
  72. 【請求項７２】 ＡＴＰ検出方法がルシフェラーゼ検出系である、請求項７１
    記載の方法。
  73. 【請求項７３】 ＡＴＰ検出方法がＮＡＤＨ検出系である、請求項７１記載の
    方法。
  74. 【請求項７４】 脱重合工程により生成されるアデノシン５’−３リン酸分子
    を増幅する工程を伴う、請求項７１記載の方法。
  75. 【請求項７５】 増幅を請求項１０１記載の方法により実施する、請求項７４
    記載の方法。
  76. 【請求項７６】 ピロリン酸、アデノシン５’−２リン酸、またはそれらの組
    み合わせを含む反応物中のポリ（Ａ）−ｍＲＮＡを検出する方法であって、該方
    法は、 ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡに相補なオリゴ（ｄＴ）プローブをハイブリダイズさせ
    ることによりＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成させ； 逆転写酵素により触媒される一般反応： ｄＴＴn ＋ ＰＰi → ｄＴＴn-1 ＋ ｄＴＴＰ に従い、末端のヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵素で分解してピロリン
    酸分子を用いて同じく再形成することにより末端ヌクレオチドにおいてＲＮＡ−
    ＤＮＡハイブリッドのオリゴ（ｄＴ）鎖を脱重合することにより、遊離のデオキ
    シチミジン５’−３リン酸分子を形成し； 以下の一般反応： ｄＴＴＰ* ＋ ＡＤＰ ＝ ｄＴＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、デオキシチミジン５’−３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸分
    子に末端５’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン酸
    を形成させるが、但し＊はそうして移された末端５’リン酸であり；そして それにより形成されたアデノシン５’−３リン酸を検出する ことを含む。
  77. 【請求項７７】 ＡＴＰ検出方法がルシフェラーゼ検出系である、請求項７６
    記載の方法。
  78. 【請求項７８】 ＡＴＰ検出方法がＮＡＤＨ検出系である、請求項７６記載の
    方法。
  79. 【請求項７９】 脱重合工程により生成されるアデノシン５’−３リン酸分子
    を増幅する工程をさらに含む、請求項７６記載の方法。
  80. 【請求項８０】 増幅を請求項１０１記載の方法により実施する、請求項７９
    記載の方法。
  81. 【請求項８１】 ホスホリボシルピロリン酸、アデノシン５’−２リン酸、ま
    たはそれらの組み合わせを含む反応物中のＤＮＡを検出する方法であって、該方
    法は、 ヌクレアーゼによる消化により核酸から遊離のデオキシアデノシン１リン酸を
    生成し、 ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼにより触媒される反応： ｄＡＭＰ ＋ ＰＲＰＰ → ｄＡＴＰ ＋ リボース−５−ＰＯ4 に従い、ホスホリボシルピロリン酸分子からデオキシアデノシン１リン酸分子へ
    ピロリン酸分子を酵素により転移させることにより、デオキシアデノシン３リン
    酸分子を形成し； 以下の一般反応： ｄＡＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ｄＡＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、デオキシリボヌクレオチド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸
    分子に末端５’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン
    酸を形成させるが、但し＊はそうして移された末端５’リン酸であり；そして それにより形成されたアデノシン５’−３リン酸を検出する ことを含む。
  82. 【請求項８２】 遊離のデオキシアデノシン３リン酸分子からアデノシン５’
    −２リン酸分子へのリン酸の酵素による転移がヌクレオシド２リン酸キナーゼに
    より触媒される、請求項１記載の方法。
  83. 【請求項８３】 検出系がルシフェラーゼ検出系である、請求項８１記載の方
    法。
  84. 【請求項８４】 検出系がＮＡＤＨ検出系である、請求項８１記載の方法。
  85. 【請求項８５】 ピロリン酸転移工程およびリン酸転移工程が単一のポット反
    応において実施される、請求項８１記載の方法。
  86. 【請求項８６】 リン酸転移工程により生成されるアデノシン５’−３リン酸
    分子を増幅する工程を伴う、請求項８１記載の方法。
  87. 【請求項８７】 増幅を請求項１０１記載の方法により実施する、請求項８６
    記載の方法。
  88. 【請求項８８】 ホスホリボシルピロリン酸を含む反応物中のＲＮＡを検出す
    る方法であって、該方法は、 ヌクレアーゼによる消化によりＲＮＡからリボヌクレオシド１リン酸分子を生
    成し； ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼにより触媒される反応： ｄＡＭＰ ＋ ＰＲＰＰ → ｄＡＴＰ ＋ リボース−５−ＰＯ4 に従い、ホスホリボシルピロリン酸分子からアデノシン１リン酸分子へピロリン
    酸分子を酵素により転移させることにより、アデノシン３リン酸分子を形成し；
    そして それにより生成されたＡＴＰを検出する ことを含む。
  89. 【請求項８９】 検出系がルシフェラーゼ検出系である、請求項８８記載の方
    法。
  90. 【請求項９０】 検出系がＮＡＤＨ検出系である、請求項８８記載の方法。
  91. 【請求項９１】 リン酸転移工程により生成されるアデノシン５’−３リン酸
    分子を増幅する工程を伴う、請求項８８記載の方法。
  92. 【請求項９２】 増幅を請求項１０１記載の方法により実施する、請求項９１
    記載の方法。
  93. 【請求項９３】 細胞および細胞性物質の存在および／または量を測定するた
    めの方法であって、該方法は、 細胞溶解物から細胞の内容物を放出させ、 リン酸ドナー分子およびアデノシン５’−１リン酸分子を細胞溶解物に加え、
    その結果、細胞溶解物中に存在する内因性酵素により触媒される以下の一般反応
    ： Ｄ−Ｐ ＋ ＡＭＰ → Ｄ ＋ ＡＤＰ に従い、ドナーからアデノシン５’−１リン酸へのリン酸基の酵素による転移に
    よりアデノシン５’−２リン酸分子が生成され；そして 細胞溶解物サンプル中に存在する内因性酵素により触媒される以下の一般反応
    ： Ｄ−Ｐ ＋ ＡＭＰ → Ｄ ＋ ＡＤＰ に従い、ドナー分子からアデノシン５’−２リン酸分子へのリン酸基の酵素によ
    る転移によりアデノシン５’−３リン酸分子を生成し；そして それにより生成されたアデノシン５’−３リン酸を検出することを含む。
  94. 【請求項９４】 リン酸ドナーが、デオキシシチジン５’−３リン酸、デオキ
    シグアニジン５’３リン酸およびデオキシチミジン５’３リン酸からなる群から
    選択される、施３記載の方法。
  95. 【請求項９５】 ＤＮＡからのアデノシン５’−３リン酸、ピロリン酸、およ
    びアデノシン５’−２リン酸を生成するための物質の組成物であって、該組成物
    は、 ヌクレオシド２リン酸キナーゼ、および 約ピコグラムからマイクログラムの量のＤＮＡでＤＮＡからアデノシン３リン
    酸の生成を触媒するのに十分な濃度で提供された、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオ
    シド２リン酸キナーゼおよび核酸ポリメラーゼ を含む。
  96. 【請求項９６】 ＤＮＡからのアデノシン３リン酸、ホスホリボシルピロリン
    酸シンセターゼ、およびアデノシン５’−２リン酸を生成するための物質の組成
    物であって、該組成物は、 ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ、および 約ピコグラムからマイクログラムの量のＤＮＡでアデノシン３リン酸の生成を
    触媒するのに十分な濃度の、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ、ホスホリボシルピ
    ロリン酸シンセターゼおよびヌクレオシド２リン酸キナーゼ を含む。
  97. 【請求項９７】 核酸ポリメラーゼを含む容器；およびヌクレオシド２リン酸
    キナーゼを含む容器を含む、ピロリン酸溶解によるＤＮＡの検出のための試薬を
    含むキット。
  98. 【請求項９８】 核酸ポリメラーゼとヌクレオシド２リン酸キナーゼが同じコ
    ンテナー中に提供される、請求項９７記載のキット。
  99. 【請求項９９】 ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼを含む容器；および
    ヌクレオシド２リン酸キナーゼを含む容器を含む、ヌクレアーゼ消化によるＤＮ
    Ａの検出のための試薬を含むキット。
  100. 【請求項１００】 ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼとヌクレオシド２
    リン酸キナーゼが同じコンテナー中に提供される、請求項９９記載のキット。
  101. 【請求項１０１】 アデノシン５’−１リン酸分子、高エネルギーリン酸ドナ
    ー分子、またはそれらの組み合わせを含む反応物中のヌクレオシド３リン酸分子
    から多数のアデノシン３リン酸分子を生成する方法であって、該方法は、 （１）第１酵素により触媒される以下の一般反応： ＸＴＰ ＋ＡＭＰ → ＸＤＰ ＋ＡＤＰ に従い、サンプル中に存在するヌクレオシド３リン酸分子から、サンプルに加え
    られたアデノシン５’−１リン酸分子へ、末端５’−リン酸基を酵素により転移
    することにより、アデノシン５’−１リン酸分子およびヌクレオシド２リン酸分
    子を形成させ； （２）ヌクレオシド２リン酸キナーゼにより触媒される以下の一般反応： ＡＤＰ Ｄ−Ｐ ＝ ＡＴＰ ＋Ｄ に従い、第１酵素により利用されないかもしれない高エネルギーリン酸ドナー分
    子からアデノシン５’−２リン酸分子へ、リン酸基を酵素により転移させ；そし
    て （３）所望のレベルの増幅が達成されるまで、工程（１）および（２）を繰り
    返すことにより生成されるアデノシン３リン酸分子を増幅する ことを含む。
  102. 【請求項１０２】 第１酵素がヌクレオシド１リン酸キナーゼおよびアデニレ
    ートキナーゼからなる群から選択される、請求項０１記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 高エネルギーリン酸ドナーがｄＣＴＰおよびＭＰ−ＣＰＰ
    からなる群から選択される、請求項１０１記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 ピロリン酸、アデノシン５’−１リン酸および高エネルギ
    ーリン酸ドナー、またはそれらの組み合わせを含む反応物中のデオキシリボ核酸
    またはリボ核酸を検出する方法であって、該方法は単一ポット中で以下の工程： 反応１： ＮＡn ＋ ＰＰi → ＮＡn-1 ＋ ＸＴＰ に従い、末端ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵素分解してピロリン酸分
    子を用いて同じものを再形成することにより末端ヌクレオシドにおいて核酸を脱
    重合することにより、遊離のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド
    ３リン酸を形成し； 脱重合工程を繰り返すことにより、少なくとも２つのヌクレオシド３リン酸分
    子を得て； （ｉ）第１酵素により触媒される反応２： ＸＴＰ ＋ ＡＭＰ ＝ ＸＤＰ ＋ ＡＤＰ に従い、反応１において形成されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレ
    オチド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸分子へ末端５’リン酸基を酵
    素により転移することにより、アデノシン５’−２リン酸分子およびリボヌクレ
    オシドまたはデオキシリボヌクレオシド２リン酸分子を生成し； （ii）第２酵素により触媒される反応３： ＡＤＰ ＋ Ｄ−Ｐ ＝ ＡＴＰ ＋ Ｄ に従い、第１酵素のための基質ではない高エネルギーリン酸ドナー分子から、反
    応２において生成されたアデノシン５’−２リン酸分子へ、リン酸基を酵素によ
    り転移し；そして （iii）所望のレベルの増幅が達成されるまで、工程（ｉ）（ii）を繰り返す ことにより、そうして生成されたアデノシン３リン酸分子を増幅し、そしてそう
    して生成されたＡＴＰを検出すること を実施する。
  105. 【請求項１０５】 酵素１がアデニレートキナーゼおよびヌクレオシド１リン
    酸キナーゼからなる群から選択される、請求項１０４記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 酵素２がピルベートキナーゼおよびヌクレオシド２リン酸
    キナーゼからなる群から選択される、請求項１０４記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼを含む容器；およ
    びヌクレアーゼを含む容器を含む、ヌクレアーゼ消化による核酸検出のための試
    薬を含むキット。
  108. 【請求項１０８】 ポリ（Ａ）−ポリメラーゼを含む容器を含むピロリン酸分
    解によるＲＮＡ検出のための試薬を含むキット。
  109. 【請求項１０９】 アデノシン５’−１リン酸を含む容器；およびルシフェラ
    ーゼにより利用されないかもしれない高エネルギーリン酸ドナーを含む容器を含
    む、サンプル中の細胞および／または細胞性物質の検出のための試薬を含むキッ
    ト。
  110. 【請求項１１０】 ピロリン酸、アデノシン５’−２リン酸、またはそれらの
    組み合わせを含む反応物中のデオキシリボ核酸をアッセイする方法であって、該
    方法は、 反応： ｄＮＡn ＋ ＰＰi → ｄＮＡn-1 ＋ ｄＮＴＰ に従い、末端ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵素分解してピロリン酸分
    子を用いて同じものを再形成することにより末端ヌクレオチドにおいて核酸を脱
    重合することにより、遊離のデオキシリボヌクレオチド３リン酸分子を形成し； 脱重合工程を繰り返すことにより、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオシ
    ド３リン酸分子を得て； 以下の一般反応： ｄＮＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ｄＮＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、デオキシリボヌクレオシド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸
    分子に末端５’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン
    酸を形成させるが、但し＊はそうして移された末端５’リン酸であり；そして それにより形成されたアデノシン５’−３リン酸を検出する ことを含む。
  111. 【請求項１１１】 脱重合工程がＴ４ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａ
    ＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素からなる群から選択されるＤＮＡポリ
    メラーゼまたは逆転写酵素により触媒される、請求項１１０記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 ヌクレオシド３リン酸分子からアデノシン５’−２リン酸
    分子に末端５’リン酸基を酵素により移すことにより、アデノシン５’−３リン
    酸分子を形成させる工程がヌクレオシド２リン酸キナーゼにより触媒される、請
    求項１１０記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 ＡＴＰ検出方法がルシフェラーゼ検出系である、請求項１
    １０記載の方法。
  114. 【請求項１１４】 ＡＴＰ検出方法がＮＡＤＨ検出系である、請求項１１０記
    載の方法。
  115. 【請求項１１５】 脱重合工程およびリン酸転移工程が単一のポット反応にお
    いて実施される、請求項１１０記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 リン酸転移工程により生成されるアデノシン５’−３リン
    酸分子を増幅する工程を伴う、請求項１１０記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 増幅を請求項１０１記載の方法により実施する、請求項６
    ９記載の方法。
  118. 【請求項１１８】 ピロリン酸を含む反応物中のポリアデニル化ｍＲＮＡをア
    ッセイする方法であって、該方法は、 ポリ（Ａ）ポリメラーゼにより触媒される反応： ＮＡn ＋ ＰＰi → ＮＡn-1 ＋ ＡＴＰ に従い、末端ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵素分解してピロリン酸分
    子を用いて同じものを再形成することにより末端ヌクレオチドにおいてポリアデ
    ニル化ｍＲＮＡを脱重合することにより、遊離のアデノシン３リン酸分子を形成
    し； 脱重合工程を繰り返すことにより、少なくとも２つのヌクレオシド３リン酸分
    子を得て；そして それにより形成されたアデノシン５’−３リン酸を検出する ことを含む。
  119. 【請求項１１９】 ＡＴＰ検出方法がルシフェラーゼ検出系である、請求項１
    １８記載の方法。
  120. 【請求項１２０】 ＡＴＰ検出方法がＮＡＤＨ検出系である、請求項１１８記
    載の方法。
  121. 【請求項１２１】 脱重合工程により生成されるアデノシン５’−３リン酸分
    子を増幅する工程を伴う、請求項１１８記載の方法。
  122. 【請求項１２２】 増幅を請求項１０１記載の方法により実施する、請求項１
    ２１記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 ピロリン酸、アデノシン５’−２リン酸、またはそれらの
    組み合わせを含む反応物中のポリ（Ａ）−ｍＲＮＡを選択的にアッセイする方法
    であって、該方法は、 ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡに相補なオリゴ（ｄＴ）プローブをハイブリダイスさせ
    ることにより、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、 逆転写酵素により触媒される以下の一般反応： ｄＴＴn ＋ ＰＰi → ｄＴＴn-1 ＋ ｄＴＴＰ に従い、末端ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を酵素分解してピロリン酸分
    子を用いて同じものを再形成することにより末端ヌクレオチドにおいてＲＮＡ−
    ＤＮＡのオリゴ（ｄＴ）鎖を脱重合することにより、デオキシチミジン５’−３
    リン酸分子を形成し； 脱重合工程を繰り返すことにより、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオシ
    ド３リン酸分子を得て； 以下の一般反応： ｄＮＴＰ* ＋ ＡＤＰ → ｄＮＤＰ ＋ ＡＴＰ* に従い、デオキシチミジン５’−２リン酸分子から末端５’リン酸基を酵素によ
    り移すことにより、アデノシン５’−３リン酸を形成させるが、但し＊はそうし
    て移された末端５’リン酸であり；そして それにより形成されたアデノシン５’−３リン酸を検出する ことを含む。
  124. 【請求項１２４】 ＡＴＰ検出方法がルシフェラーゼ検出系である、請求項１
    ２３記載の方法。
  125. 【請求項１２５】 ＡＴＰ検出方法がＮＡＤＨ検出系である、請求項１２３記
    載の方法。
  126. 【請求項１２６】 脱重合工程により生成されるアデノシン５’−３リン酸分
    子を増幅する工程を伴う、請求項１２３記載の方法。
  127. 【請求項１２７】 増幅を請求項１０１記載の方法により実施する、請求項１
    ２６記載の方法。
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