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JP2002506833A - 治療薬のｉｎｖｉｖｏデリバリー用担体 - Google Patents

治療薬のｉｎｖｉｖｏデリバリー用担体

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JP2002506833A
JP2002506833A JP2000536412A JP2000536412A JP2002506833A JP 2002506833 A JP2002506833 A JP 2002506833A JP 2000536412 A JP2000536412 A JP 2000536412A JP 2000536412 A JP2000536412 A JP 2000536412A JP 2002506833 A JP2002506833 A JP 2002506833A
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JP
Japan
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arg
lys
polymer
carrier
thiol
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Application number
JP2000536412A
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English (en)
Inventor
スタンリー スタイン
マイケル ジェイ レイボウィッツ
Original Assignee
ユニヴァーシティー オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュージャージー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニヴァーシティー オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュージャージー filed Critical ユニヴァーシティー オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュージャージー
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Abstract

(57)【要約】 生物分解性ジスルフィド結合を介して担体に共役されている、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体が提供される。in vivoの細胞外液は効果的にジスルフィド結合を還元するために適した環境を提供しないが、細胞のサイトゾルは適切な環境を提供するので、治療薬は、担体が細胞膜を通過するまで体内循環中は担体と実質的に結合したままであろう。結果として、治療薬は分解および腎クリアランスから保護され、当該治療薬が免疫反応を誘引する潜在能力は制限される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の属する技術分野 本発明は、哺乳類（例えばヒト）の組織に治療薬を輸送する化合物に関する。
より具体的には、本発明は、生物分解性ジスルフィド結合を介して治療薬が本発
明の担体と共役されている治療薬のデリバリー用担体を含む。本ジスルフィド結
合はin vivoの適切な環境で還元され、その結果、大量の治療薬が分解も排泄も されずに組織に輸送され、したがってその治療効果が高められる。
【０００２】従来技術 化合物（例えばペプチド、ペプチド類似物質、およびオリゴヌクレオチドまた
はその類似体もしくは誘導体）は、有力な治療薬として用いることができると言
われている。しかしながら、そのような化合物を該当者に投与するに際して問題
が存在する。例えば、プロテアーゼおよびエンドヌクレアーゼは体中に存在し、
そのような化合物を消化し、それらの生物学的活性を大いに低下させる。他の問
題には当該化合物に対する免疫反応の誘発が含まれ、その結果そのような化合物
を分解および不活化し、さらに特に治療薬の分子量が小さい場合は急速な腎クリ
アランスをもたらす。したがって、有効であるためには、そのような治療薬は頻
繁に、さらに経口ではなく非経口的に投与する必要がある。そのような治療薬の
例はインスリンで、糖尿病患者は典型的には１日数回これを注射する。
【０００３】 これらの問題を克服するために、研究者らは、それらの薬理学的特性を操作し
1、おそらくはそれらが分解され血流から排除される前にin vivoでより長時間残
留できるように、そのような治療薬を化学的に改変しようと試みてきた。例えば
、治療薬を化学的に改変する方法の１つは、水溶性ポリマー鎖（例えばポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ))を治療薬に付加することである2。研究者らは、多く の付加部位を有するＰＥＧ−リジンコポリマーをデザインし3、このコポリマー を低分子量の治療薬と共役させた。しかしながら、そのような改変にはもともと
限界があった。例えば、それらはしばしば治療薬の生体利用性を阻害する。結果
として、治療薬の標的が細胞内に存在し、さらに治療薬の改変によって治療薬の
細胞膜通過が妨害される場合は、この治療薬の生体利用性はこの化学的改変のた
めに低下する。 水溶性ポリマーを治療薬に付加する場合のまた別の制限は、治療薬の生物活性
を有害な態様で変化させることを含む。例えば、治療薬の改変がその三次元構造
を変化させる場合、レセプターに結合するその治療薬の能力は低下し、活性の減
少をもたらす。
【０００４】 したがって必要なものは、治療薬に対する免疫反応を誘発する機会を減少させ
る治療薬の担体である。 さらにまた必要なものは、プロテアーゼ／ペプチダーゼ／ヌクレアーゼによる
in vivoでの分解から治療薬を保護し、それによって治療薬の反復投与の必要性 を排除する担体である。 さらに必要なものは、細胞膜を通過する治療薬輸送を強化する治療薬担体であ
る。 さらにまた必要なものは、担体が細胞膜を通過するまで治療薬を遊離させない
が、いったん細胞内に入れば治療薬を生物学的に活性な状態で遊離させることが
できる治療薬担体である。 また必要なものは、治療薬の生体利用性を妨害しない治療薬担体である。
【０００５】発明が解決しようとする課題 本発明によれば、治療薬のin vivoデリバリー用担体が提供される。本担体は 、上記で述べたような他の薬剤輸送担体の短所をもたず、さらにほんのわずかの
利点を挙げれば、治療薬の生体利用性を妨害せず、治療薬を蛋白質分解／ヌクレ
オチド分解から保護し、免疫反応誘発から保護し、急速な腎クリアランスから保
護する。
【０００６】 おおざっぱに言えば、本発明は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリ ー用担体を提供する。ここで、当該担体はポリマーを含み、さらに少なくとも１
つのチオール化合物が当該ポリマーに、当該チオール化合物のチオール基と治療
薬のチオール基とがジスルフィド結合を形成することができるように共役されて
いる。ジスルフィド結合は、生理学的に適切な還元的環境（例えば細胞のサイト
ゾルで見出されるようなもの）で破壊される。したがって、本出願人らは、in v
ivoでの分解を最小限にし、しかもその生体利用性を制限しないように治療薬を 改変する方法を発見した。さらに、本発明は細胞のサイトゾルに治療薬を輸送す
るために特に適している。グルタチオン（天然に存在する還元剤）は細胞のサイ
トゾルに多く見出される。したがって、グルタチオンはジスルフィド結合を還元
し、標的組織の細胞内で本発明の担体から治療薬を遊離させることができる。さ
らに、２つ以上のチオール化合物をポリマーに共役させることができるので、本
発明の担体は２つ以上の治療薬を標的細胞または組織に輸送することができる。
【０００７】 多くの治療薬がチオール基を含み、治療薬をジスルフィド結合を用いて本発明
の担体に共役させるために用いることができる。例えば、システイン残基を含む
ペプチドである治療薬は、本発明の担体を用いてin vivoで輸送できる。さらに 、治療薬として作用するペプチドの類似体または誘導体に、本発明の担体を用い
てそれらをin vivoで輸送できるようにチオール基を含有させることができる。 ヌクレオチドおよびその類似体または誘導体（例えばアンチセンス療法で用いら
れる）でさえも改変して、本発明の担体を用いて輸送できるようにチオール基を
含有させることができる。
【０００８】 チオール基を含む治療薬のまた別の例（これはin vivoデリバリーのために本 発明の担体に共役させることができる）は、ＨＩＶ−１複製を抑制する治療薬で
ある。より具体的には、ＨＩＶのＴａｔ蛋白質は、ＴＡＲＲＮＡ領域との相互反
応を介してＨＩＶの転写を顕著に活性化させることが判明した。ＴＡＲＲＮＡド
メインは、ウイルスによりコードされる全てのＲＮＡの最初の５７ヌクレオチド
から成る。予想されるこのＴＡＲＲＮＡの二次構造は、３塩基の出っ張りと６塩
基のループをもつ二本鎖の茎状体（ステム）である。ＨＩＶＴａｔは８６−１０
２のアミノ酸を含む小さな核蛋白質で、何度もスプライシングされたｍＲＮＡに
よってコードされる。ＴＡＲＲＮＡの３塩基の出っ張り部分および他のいくつか
の隣接ヌクレオチドはＴａｔ−ＴＡＲ相互作用のために必須である。
【０００９】 Ｔａｔ蛋白質は、その塩基性ドメインを介してＴＡＲの３塩基の出っ張りと結
合することによって転写を促進するために作用しているらしい。これは、ホスト
の細胞因子（ＴａｔおよびＴＡＲ結合蛋白質を含む）のＴＡＲＲＮＡステムおよ
び６塩基ループ並びに、鋳型ＤＮＡ、転写因子およびＲＮＡポリメラーゼ複合体
への補給を伴う。プロウイルス遺伝子発現の開始は、ＮＦ−κＢおよび／または
Ｓｐ１依存性プロモーターの活性化によって生じるようで、その結果ウイルス転
写物が十分なレベルで生成されてＴａｔ蛋白質の合成をもたらし、Ｔａｔ蛋白質
は続いてＴＡＲと相互作用して長期間にわたってＨＩＶ転写物の生成を強化させ
る。
【００１０】 ＴＡＲと結合してＴａｔ−ＴＡＲ結合を阻害する治療薬を開発しようと努力が
続けられてきた。例えば、４量体のアンチセンスオリゴヌクレオチドが付加され
た１０残基のＴａｔペプチドは、特異的にＴＡＲＲＮＡと結合することができる
が、これは、６塩基の１本鎖ループとアニーリングするオリゴヌクレオチド部位
でのリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）Ｈ仲介切断を刺激する能力によって明らか
にされた。また別の例では、ビオチン付加ペプチドもまた、ＴＡＲへのＴａｔ結
合を抑制することが示された（以下を参照されたい：I.Choudhury, J. Wang, A.
B. Rabson, S. Stein, S. Pooyan, S. Stein & M.J. Leibowitz, (1998), Inhib
ition of HIV-1 replication by a Tat RNA binding domain peptide analog. J
. Acqu. Immune Def. Syndr. & Human Retrovirol., 17:104-111（この文献は参
照により本明細書に含まれる))。
【００１１】 したがって、本発明は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体 を含む。この場合、当該担体はポリマーを含み、さらに少なくとも１つのチオー
ル化合物が当該ポリマーに、当該チオール化合物のチオール基および治療薬のチ
オール基がジスルフィド結合を形成することができるように共役され、当該治療
薬はＴａｔ抑制ポリペプチド誘導体である。より具体的には、本発明の実施態様
の１つでは、チオール基を含む治療薬（これはＴａｔ抑制結合性ペプチド誘導体
である）は、下記式Ｉおよびその類似体、並びに生物学的および医薬的に許容可
能なその塩、並びに、そのような異性体が存在する場合は全てのその立体異性体
、光学異性体および幾何学異性体、並びに医薬的に許容できるその塩および溶媒
和物のビオチン付加ペプチドに関する： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基で、ＸはＣｙｓまたはＬｙｓ残基
である。これらは、ΔＴＡＲへの結合、モデル細胞アッセイでのＬＴＲ依存性レ
ポーター遺伝子発現の抑制、および最終的にはＨＩＶ複製（ＨＩＶ誘発合胞体形
成、細胞毒性および逆転写酵素産生アッセイで決定される）の抑制を含む有利な
特性を示す。式Ｉのビオチン付加ペプチドは、Ｃｙｓ残基のチオール基のイオウ
と担体のチオール化合物のチオール基のイオウとの間のジスルフィド結合を介し
て容易に本発明の担体に共役させることができる。
【００１２】 そのようなＴａｔペプチド誘導体の例には以下が含まれる（ただしこれらに限
定されない）： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:4) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2(
配列番号:5) N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:6) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:7)
【００１３】 また別の実施態様では、本発明は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバ リー用担体を含む。この場合、当該担体はポリマーを含み、さらに少なくとも１
つのチオール化合物が当該ポリマーに、当該チオール化合物のチオール基および
治療薬のチオール基がジスルフィド結合を形成することができるように共役され
、さらに当該治療薬は、以下のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体
、並びに生物学的および医薬的に許容可能なその塩を含むＴａｔ抑制ポリペプチ
ド誘導体である： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2 これらは、ΔＴＡＲへの結合、モデル細胞アッセイでのＬＴＲ依存性レポータ
ー遺伝子の発現抑制、および最終的にはＨＩＶ複製（ＨＩＶ誘発合胞体形成、細
胞毒性および逆転写酵素産生アッセイで決定される）の抑制を含む有利な特性を
示す。
【００１４】 さらにまた、本発明は、ウイルス感染の治療を必要とする哺乳類で当該ウイル
ス感染を治療する方法を含む。より具体的には、そのような方法は、チオール基
を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体の治療的に有効な量を哺乳類に投与す ることを含み、この場合、当該担体はポリマーを含み、さらに少なくとも１つの
チオール化合物が当該ポリマーに、当該チオール化合物のチオール基および治療
薬のチオール基がジスルフィド結合を形成することができるように共役されてお
り、さらに当該治療薬は、以下の式Ｉ、その類似体、並びに生物学的および医薬
的に許容可能なその塩のビオチン付加ペプチドを含むＴａｔ抑制結合ペプチド誘
導体を含む： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基で、ＸはＣｙｓまたはＬｙｓ残基
である。本明細書および添付の請求の範囲では、式Ｉのポリペプチド並びにその
類似体および塩は、そのような異性体が存在する場合には全てのその立体、光学
、および幾何学異性体を包含するとともに、その医薬的に許容可能な塩および溶
媒和物も包含する。適切な場合には、本ポリペプチドまたはその類似体はその対
応するアミド形として用いることができる。本明細書に記載したアミノ酸残基は
好ましくは"Ｌ"型異性体形である。しかしながら、"Ｄ"型異性体形をもつ残基も
、望ましい機能特性を当該ポリペプチドが保持するかぎりいずれのＬ−アミノ酸
残基の代用としてもよい。
【００１５】 より具体的には、そのような方法で使用される治療薬は以下の（ただしこれら
に限定されない）アミノ酸配列を含む： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:4) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:5) N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:6) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys(ビオチン)-Cys-NH2 (配
列番号:7)
【００１６】 別の実施態様では、本発明は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー 用担体を含み、この場合、当該担体はポリマーを含み、少なくとも１つのチオー
ル化合物が当該ポリマーの、当該チオール化合物のチオール基および治療薬のチ
オール基がジスルフィド結合を形成することができるように共役されており、さ
らに当該治療薬は、下記のアミノ酸配列またはその類似体もしくは誘導体、並び
に生物学的および医薬的に許容可能なその塩を含むＴａｔポリペプチド誘導体で
ある： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2 これらは、ΔＴＡＲへの結合、モデル細胞アッセイでのＬＴＲ依存性レポータ
ー遺伝子の発現抑制、および最終的にはＨＩＶ複製の抑制を含む有利な特性を示
す。
【００１７】 さらに、本発明は、N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-
DArg-DArg-DLys-DLys-DArg-NH2のアミノ酸配列並びにその生物学的および医薬的
に許容可能な塩を含むペプチドに共役させた本発明の担体を、ウイルス感染の治
療を必要とする哺乳類で当該ウイルス感染治療のために利用する方法を含む。そ
のような方法は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体の治療的 に有効な量を哺乳類に投与することを含み、この場合、当該担体はポリマーを含
み、さらに少なくとも１つのチオール化合物が当該ポリマーに、当該チオール化
合物のチオール基および治療薬のチオール基がジスルフィド結合を形成すること
ができるように共役されており、さらに当該治療薬は、N-アセチル-DCys-DLys-(
ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-DArg-NH2のアミノ酸配列
を含むビオチン付加ペプチドを含む。 特に、上記で述べた本発明の方法は、レトロウイルス感染（例えばヒトのエイ
ズ）を治療するために用いることができる。
【００１８】 さらに、本発明は、分枝または直鎖構造をもつポリマーを含む、治療薬のin v
ivoデリバリー用担体を含む。この用途のためには、"ポリマー"という用語はホ モポリマーおよびコポリマーの両方を包含する。好ましくはこのポリマーは水溶
性ポリマーである。
【００１９】 本発明で用いられる水溶性ポリマーの例には、ポリエチレングリコール、カル
ボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポ
リアミノ酸（ホモポリマー）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール
／プロピレングリコールのコポリマー、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー
、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコールとアミノ酸のコポリマー、プロピレン
オキシド／エチレンオキシドコポリマー、またはポリエチレングリコール／チオ
リンゴ酸のコポリマーが含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましい実
施態様では、当該ポリマーはポリエチレングリコールとリジンのコポリマーを含
む。
【００２０】 さらにまた、チオール化合物は、担体のポリマー、またはチオール化合物との
反応に利用できるポリマーに結合した少なくとも１つの官能基に共役させること
ができる。ただし、チオール化合物のチオール基が、治療薬のチオール基とジス
ルフィド結合を形成するために利用可能であることを条件とする。 多数の官能基を本発明の担体のポリマーに結合させ、それにチオール化合物を
共役させるために用いることができる。さらに、２種以上の官能基を同時にポリ
マーに結合させ、ポリマーにチオール化合物を共役させるために利用することが
できる。本発明のこの実施態様で用いられる官能基の例には、ケトン、エステル
カルボン酸、アルデヒド、アルコール、チオールまたはアミンが含まれるが、た
だしこれらに限定されない。好ましい実施態様では、ポリエチレングリコール／
リジンコポリマーにカルボン酸基が結合され、反応に用いられる。したがって、
２つ以上の治療薬分子を本発明の担体に共役させ、標的細胞または組織に輸送で
きる。
【００２１】 本発明の担体のポリマーは任意の分子量を有する。本発明の実施態様では、ポ
リマーは約１０００から約１００００００ダルトンの範囲の分子量、好ましくは
約２００００から２０００００ダルトンの範囲の分子量を有する。好ましい態様
では、ポリマーは約２７０００ダルトンの分子量を有する。
【００２２】 本発明はさらにチオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を含む。 この場合、当該担体はポリマーを含み、さらに少なくとも１つのチオール化合物
が、当該少なくとも１つのチオール化合物のチオール基と治療薬のチオール基と
がジスルフィド結合を形成できるようにある間隔でポリマーに共役される。本明
細書で用いられるように、"間隔"という用語は、本発明の担体のポリマーに共役
されるチオール化合物間の距離を指す。ある実施態様では、ポリマーに共役され
るチオール化合物間の間隔は約１００から約１００００ダルトンである。好まし
い実施態様では、担体のポリマーに共役されるチオール化合物の間隔は約３００
から約３０００ダルトンである。
【００２３】 さらにまた、本発明は官能基が結合されたポリマーを含む担体を包含する。こ
の場合、当該官能基はチオール化合物との共役に利用可能で、ある間隔でポリマ
ーに結合されている。ある実施態様では、ポリマーに結合された官能基間の間隔
は約１００から約１００００ダルトンである。好ましい実施態様では、担体のポ
リマーに結合された官能基間の間隔は約３００から約３０００ダルトンである。 さらに、本発明の担体で有用なチオール化合物の例には、ほんのわずかを挙げ
れば、システアミン、１−アミノ−２−メチル−２−プロパンチオールまたは１
−アミノ−２−プロパンチオールが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２４】 さらに、本発明はチオール基を有する治療薬のin vivoデリバリー用担体を含 む。この場合、当該担体はさらに当該ポリマーに共役させた細胞取り込み促進物
質を含む。細胞取り込み促進物質は、治療薬が共役された担体の利用性を強化し
、細胞膜を通過して細胞のサイトゾルに進入させる。 多数の細胞取り込み促進物質が知られており、本発明の実施態様で有用である
。本実施態様で有用な細胞取り込み促進物質の一例はビオチンである。したがっ
て、本発明の担体のポリマーへのビオチンの共役は担体の利用性を強化し、ジス
ルフィド結合を介して担体に結合させた治療薬に細胞膜を通過させて細胞のサイ
トゾルに進入させる。いったん細胞内に入れば、治療薬と担体との間のジスルフ
ィド結合は還元され治療薬が遊離されてその標的に対して作用する。 さらに、細胞取り込み促進物質は、有効であるためにポリマーにのみ共役させ
る必要はないことが判明した。反対に、細胞取り込み促進物質はまた治療薬に共
役させて担体の能力を強化し、治療薬に細胞膜を通過させることができる。
【００２５】 さらに、本発明は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体の製 造方法を含む。この場合、当該担体はポリマーを含み、さらに少なくとも１つの
チオール化合物が当該ポリマーに、当該チオール化合物のチオール基および治療
薬のチオール基がジスルフィド結合を形成することができるように共役されてい
る。本明細書で開示されるそのような方法の１つは以下の工程を含む： ａ）チオール化合物をジスルフィド化合物と反応させて、チオール化合物のチ
オール基とジスルフィド化合物のジスルフィド結合のイオウ原子がジスルフィド
結合を形成している第一の中間体を生成し、さらに、 ｂ）この第一の中間体をポリマーと反応させて担体を形成させるが、ここで第
一の中間体は、担体のチオール化合物のイオウ原子と治療薬のチオール基とがジ
スルフィド結合を形成できるようにポリマーに共役される。 いずれのジスルフィド化合物も上記で述べた方法の工程（ａ）で用いることが
できる。好ましくはこのジスルフィド化合物は対称性である。本発明の実施態様
の１つでは、ジスルフィド化合物は２，２'−ジチオジピリジンである。
【００２６】 チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を製造するまた別の方法 は、本明細書で説明するように以下の工程を含む： ａ）第一のチオール化合物を第二のチオール化合物と反応させ、ジスルフィド
結合を含む第一の中間体を生成し； ｂ）第一の中間体をポリマーと反応させて、第一の中間体がポリマーに共役さ
れている第二の中間体を生成し； ｃ）このジスルフィド結合を還元して、ポリマーおよび、第一のチオール化合
物のチオール基が反応に利用できるようにポリマーと共役されている第一のチオ
ール化合物を含む第三の中間体を生成し；さらに ｄ）第三の中間体をジスルフィド化合物と反応させて担体を生成するが、この
場合、第一のチオール化合物のチオール基とジスルフィド化合物のジスルフィド
結合のイオウ原子とがジスルフィド結合を形成する。 適切な条件下では、第一のチオール化合物のイオウ原子および治療薬のチオー
ル基はジスルフィド結合を形成することができる。 本発明の実施態様では、第一のチオール化合物および第二のチオール化合物は
同じ化合物である。
【００２７】 多数のチオール化合物が本発明の方法で有用である。そのような例には、ほん
のわずかを挙げればシステアミン、１−アミノ−２−メチル−２−プロパンチオ
ール、および１−アミノ−２−プロパンチオールが含まれる。 さらに、いずれのジスルフィド化合物も本方法の工程（ｄ）で用いることがで
きる。好ましくは、ジスルフィド化合物は対称性である。本発明の実施態様では
、ジスルフィド化合物は２，２'−ジチオジピリジンである。
【００２８】 本発明の実施態様では、チオール基を含む治療薬はＴａｔ抑制ペプチド誘導体
で、下記式Ｉおよびその類似体、並びにその生物学的および医薬的に許容可能な
塩、並びに、そのような異性体が存在する場合はその全ての立体異性体、光学異
性体および幾何学的異性体とともに医薬的に許容できるその塩および溶媒和物の
ビオチン付加ペプチドを含む： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基で、ＸはＣｙｓまたはＬｙｓ残基
である。そのような治療薬の類似体には以下が含まれる（ただしこれらに限定さ
れない）： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:4) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:5) N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:6) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:7)
【００２９】 本発明のまた別の実施態様では、チオール基を含む治療薬は、以下の配列のア
ミノ酸担体、その類似体または誘導体、およびその全ての医薬的に許容可能な塩
を含むＴａｔ抑制ペプチド誘導体である： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2 そのような治療薬の製造は、現在知られているペプチド固相合成法を含むペプ
チド製造方法（ただしこれに限定されない）を用いて容易に達成できる。さらに
また、そのようなペプチドのビオチン付加方法も当業者には極めて明白である。
【００３０】 本発明はさらに、上記で説明したように治療薬のin vivoデリバリー用担体を 製造する方法を含み、当該ポリマーは分枝または直鎖構造を有する。好ましくは
このポリマーは水溶性ポリマーである。本発明で有用な水溶性ポリマーの例には
、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ
−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸（ホモポリマー）、ポリプロピレン
グリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、エチレ
ン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコールとア
ミノ酸のコポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、また
はポリエチレングリコール／チオリンゴ酸のコポリマーが含まれる。 本発明の方法で用いられるポリマーは任意の分子量を有する。本発明の実施態
様では、ポリマーは約１０００から約１００００００ダルトンの範囲の分子量、
好ましくは約２００００から２０００００ダルトンの範囲の分子量を有する。好
ましい実施態様では、ポリマーは約２７０００ダルトンの分子量を有する。
【００３１】 本発明はさらにチオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を製造す る方法を含み、当該担体はポリマーおよびある間隔でポリマーに共役させた少な
くとも１つのチオール化合物を含む。本発明の実施態様の１つでは、ポリマーに
共役されるチオール化合物間の間隔は約１００から約１００００ダルトンで、好
ましくは約３００から約３０００ダルトンである。
【００３２】 さらに、本発明はチオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を製造 する方法を含む。この方法はさらに、中間体とポリマーを反応させる前に細胞取
り込み促進物質をポリマーに共役させる工程を含む。細胞取り込み促進物質は、
治療薬に結合させた担体の細胞膜通過および細胞のサイトゾルへの進入能力を強
化する。 多数の細胞取り込み促進物質が知られており、本発明で有用である。細胞取り
込み促進物質の一例はビオチンである。したがって、本発明の担体のポリマーへ
のビオチンの共役は、担体およびそれに共役させた治療薬の細胞膜通過および細
胞のサイトゾル進入能力を強化する。上記で説明したように、いったん担体が細
胞膜を通過しサイトゾルに進入すれば、ジスルフィド結合は還元され、治療薬は
遊離されてその標的に対して作用する。 さらに、細胞取り込み促進物質は、ポリマーにのみ共役させる必要がないこと
が判明した。反対に、細胞取り込み促進物質を治療薬に共役させ、担体および治
療薬の細胞膜通過能力を強化することができる。
【００３３】 さらに、本発明は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体の製 造方法を含む。この場合、当該担体は、ポリマーに結合させた少なくとも１つの
官能基を含む当該ポリマーを含み、さらにチオール化合物が、当該チオール化合
物のチオール基および治療薬のチオール基がジスルフィド結合を形成することが
できるように当該少なくとも１つの官能基に共役されている。そのような担体を
製造する方法の１例は以下の工程を含む： ａ）チオール化合物をジスルフィド化合物と反応させて、チオール化合物のチ
オール基とジスルフィド化合物のジスルフィド結合のイオウ原子がジスルフィド
結合を形成する第一の中間体を生成し、さらに、 ｂ）この第一の中間体を少なくとも１つの官能基が結合されているポリマーと
反応させて担体を形成させるが、ここで第一の中間体は、チオール化合物のイオ
ウ原子と治療薬のチオール基とが適切な条件下でジスルフィド結合を形成できる
ように官能基に共役される。
【００３４】 さらに本発明は、本明細書で説明するように、以下の工程を含むチオール基を
含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を製造する方法を含む： ａ）第一のチオール化合物を第二のチオール化合物と反応させ、第一のチオー
ル化合物のチオール基と第二のチオール化合物のチオール基がジスルフィド結合
を形成する第一の中間体を生成し； ｂ）第一の中間体を少なくとも１つの官能基がそれに結合したポリマーと反応
させて、第一の中間体が当該少なくとも１つの官能基と共役されている第二の中
間体を生成し； ｃ）第二の中間体のジスルフィド結合を還元して、少なくとも１つの官能基を
もつポリマーおよび、第一のチオール化合物のチオール基が反応に利用できるよ
うに当該官能基と共役されている第一のチオール化合物を含む第三の中間体を生
成し；さらに ｄ）第三の中間体をジスルフィド化合物と反応させて担体を生成するが、この
場合、第一のチオール化合物のチオール基とジスルフィド化合物のジスルフィド
結合のイオウ原子とがジスルフィド結合を形成する。したがって、適切な条件下
では、担体のジスルフィド結合は還元され、第一のチオール化合物のイオウ原子
および治療薬のチオール基がジスルフィド結合を形成することができる。 本発明の実施態様では、第一のチオール化合物および第二のチオール化合物は
同じ化合物でもよい。
【００３５】 さらにまた本発明は、上記で述べたような本発明の担体を製造する方法を含み
、この場合、本発明の方法で用いられるポリマーに結合させる少なくとも１つの
官能基には、ほんのわずかを挙げればケトン、エステル、カルボン酸、アルデヒ
ド、アルコール、チオールまたはアミンが含まれる。 さらに本発明は、上記で述べたような本発明の担体を製造する方法を含み、こ
の場合、少なくとも１つの官能基はある間隔で本発明の担体のポリマーに結合さ
れる。本発明の実施態様では、ポリマーに結合される官能基間の間隔は約１００
から約１００００ダルトン、好ましくは、約３００から約３０００ダルトンであ
る。
【００３６】 上記で述べたように、本発明の担体と共役させる治療薬は少なくとも１つのチ
オール基を含む。実施例では、本発明の担体と共役させる治療薬は、以下の式Ｉ
およびその類似体、並びに生物学的および医薬的に許容可能なその塩とともに、
そのような異性体が存在する場合にはその全ての立体、光学および幾何学異性体
並びにその医薬的に許容できる塩および溶媒和物のＴａｔ抑制ペプチド誘導体を
含む： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基で、ＸはＣｙｓまたはＬｙｓ残基
である。
【００３７】 さらに、本発明で有用なそのような治療薬の類似体の例には、ほんのわずかを
挙げれば以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:4) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:5) N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:6) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:7) また別の実施態様では、チオール基を含み本発明の担体に共役される治療薬は
、以下の配列のアミノ酸配列、その類似体または誘導体、および医薬的に許容可
能なその塩を含む： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2
【００３８】 出願人らはまた、本発明の担体から治療薬が遊離する速度は、担体のチオール
化合物の立体的妨害状態に応じて調節できることを発見した。特に、出願人らは
、チオール化合物の立体的妨害状態が強ければ強いほど、担体から治療薬が遊離
する速度は遅くなることを発見した。したがって、本発明は、チオール基を含む
治療薬のin vivoデリバリー用担体を含み、この場合、当該担体は、ポリマーお よび少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのチオール化合物を含み、当
該チオール化合物は当該ポリマーに、チオール化合物のチオール基と治療薬のチ
オール基とがジスルフィド結合を生成できるように共役されており、さらに適切
な生理学的環境下でジスルフィド結合が還元される速度は、チオール化合物に結
合された当該少なくとも１つの官能基のサイズに左右される。 さらにまた、本発明は、上記で述べた本発明の担体の製造方法を含み、この場
合、当該少なくとも１つの官能基はある間隔で本発明の担体のポリマーに結合さ
れる。本発明の実施態様の１つでは、ポリマーに結合された官能基間の間隔は約
１００から約１００００ダルトンで、好ましくは約３００から約３０００ダルト
ンである。
【００３９】 本発明はさらに、治療薬が本発明の担体から遊離する速度が担体のチオール化
合物の立体的妨害状態に応じて調節されるまた別の実施態様を含む。特に、本明
細書で開示されるものは、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体 で、この場合、当該担体は、ポリマーおよび少なくとも１つの官能基を含む少な
くとも１つのチオール化合物を含み、さらにポリマーは反応に利用できる少なく
とも１つの官能基を含み、それによってチオール化合物は当該ポリマーに結合し
た少なくとも１つの官能基と共役し、チオール化合物のチオール基と治療薬のチ
オール基とがジスルフィド結合を形成できる。治療薬を担体に結合させるジスル
フィド結合の還元速度は、チオール化合物に結合された少なくとも１つの官能基
のサイズに依存する。 したがって、本発明の第一の目的は、ジスルフィド結合を介して担体と共役で
きる治療薬のin vivoデリバリー用担体を提供することである。
【００４０】 本発明のさらに別の目的は、in vivoの細胞外液で還元されにくい生物分解性 ジスルフィド結合を介して担体と共役される治療薬のin vivoデリバリー用担体 を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、担体が細胞膜を通過するまでは実質的に担体と共
役したままである治療薬のin vivoデリバリー用担体を提供することである。い ったん細胞内に入ると、サイトゾルの環境は、治療薬を担体に共役させているジ
スルフィド結合を還元して、当該治療薬を遊離させ、その標的に対して作用させ
る。 本発明のさらに別の目的は、治療薬が非経口的に反復して投与される速度を最
小限にできるように治療薬の生体利用性を高める、治療薬のin vivoデリバリー 用担体を提供することである。
【００４１】 本発明のさらに別の目的は、担体から治療薬が遊離する速度が、本発明の担体
の製造方法で用いられるチオール化合物の三次元構造に依存する、in vivoで治 療薬の遊離を調節する方法を提供する。 本発明のまた別の目的は、治療薬が担体から遊離する速度を低下させることが
できる構造を有する、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を提 供することである。これは、時間的に制御しながら治療薬をin vivoで遊離させ るために用いることができる。
【００４２】 本発明のさらに別の目的は、治療薬がＴａｔ抑制ポリペプチド誘導体、その類
似体または生物学的および医薬的に許容可能なその塩である、チオール化合物を
含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を提供することである。 本発明のまた別の目的は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担 体を提供することで、この場合、当該治療薬はＴａｔ抑制ペプチド誘導体であり
、本明細書で開示するＴａｔ抑制ペプチド誘導体と共役させた本発明の担体の投
与は、レトロウイルス感染（例えばエイズ）をもつ哺乳類の治療に用いることが
できる。 他の目的および利点は以下の詳細な図面を参考に進められる以下の記載から当
業者には明白になろう。
【００４３】課題を解決するための手段 本発明は、予想に反して生物分解性ジスルフィド結合を用いて、治療薬のin v
ivoデリバリー用担体に治療薬を共役させることができるという本出願人らの発 見に基づいている。この場合、担体はポリマーおよび当該ポリマーに共役された
チオール化合物を含み、当該チオール化合物は、チオール化合物のチオール基と
治療薬のチオール基とがジスルフィド結合を形成できるように当該ポリマーに共
役されている。in vivoの細胞外媒体は、相当な量のジスルフィド結合を還元す るために適切な環境を提供できない。したがって、治療薬をポリマーに共役させ
ているジスルフィド結合は、身体の細胞間マトリックスを担体が循環している間
は比較的安定な状態を維持する。対照的に、細胞のサイトゾルは、ジスルフィド
結合を還元するために適切な環境を提供する。なぜならば、特にグルタチオン（
天然に存在する還元剤）の還元形がサイトゾルに多く見出されるからである。い
ったん担体が細胞膜を通過しサイトゾルに進入すると、治療薬を担体に共役させ
ているジスルフィド結合は還元されて治療薬が遊離され、細胞内のその標的に作
用する。結果として、本発明の担体に共役されて該当者に投与され、標的細胞に
輸送された治療薬の相当な部分が続いて遊離される。
【００４４】 分子量を言うために本明細書で用いられる"約"という用語は、ポリマーの製造
で、表示の分子量よりもある分子は重く、ある分子は軽いことを意味する。 本明細書で用いられる"立体的妨害状態"という用語は、反応部位またはその近
くに結合された分子の当該部分の空間占有特性によってもたらされる相対的反応
速度に対する影響を指す。 本明細書で用いられる"生体利用性"という用語は、治療薬がその標的細胞また
は細胞内の標的分子に到達する能力を指す。
【００４５】 本明細書で用いられる"ポリマー"という用語はホモポリマーおよびコポリマー
の両方を包含する。 本明細書で用いられる"間隔"という用語は、本発明の担体のポリマーに共役さ
れたチオール化合物の間の距離、または本発明の担体のポリマーに結合された官
能基間の距離を指す。 さらにまた、本明細書で用いられる"治療的に有効"という用語は、Ｔａｔ蛋白
質によるウイルスＴＡＲＲＮＡのトランス活性化を防止するために、好ましくは
少なくとも約３０％低下させるために、より好ましくは少なくとも５０％、最も
好ましくは少なくとも９０％低下させるために十分な量を指すために用いられる
。 本発明の担体のポリマーは分枝または直鎖構造をもつことができる。好ましく
はポリマーは水溶性ポリマーである。
【００４６】 本発明で有用な水溶性ポリマーの例には、ポリエチレングリコール、カルボキ
シメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリア
ミノ酸（ホモポリマー）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール／プ
ロピレングリコールのコポリマー、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポ
リアミノ酸、ポリエチレングリコールとアミノ酸のコポリマー、プロピレンオキ
シド／エチレンオキシドコポリマー、またはポリエチレングリコール／チオリン
ゴ酸のコポリマーが含まれる。好ましい実施態様では、ポリマーはポリエチレン
グリコールおよびリジンのコポリマーである。そのようなコポリマーを製造する
方法は以下の文献に説明されている：A. Nathan, S. Zalipsky, S.I. Ertel, S.
N. Agathos, M.L. Yarmush & J. Kohn(1993) Copolymers of lysine and polyet
hylene glycol: A new family of functionalize drug carriers. Bioconj. Ceh
m. 4:54-62（この文献は参照により本明細書に含まれる))。
【００４７】 本発明の担体のポリマーは任意の分子量を有することができる。本発明の実施
態様の１つでは、ポリマーは、約１０００から約１００００００ダルトンの分子
量範囲、好ましくは約２００００から２０００００ダルトンの分子量範囲を有す
る。より好ましくは、本発明の担体のポリマーは約２７０００Ｄの分子量を有す
る。 本発明はチオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を包含し、この 場合、担体はポリマーおよび少なくとも１つのチオール化合物を含み、当該チオ
ール化合物は、チオール化合物のチオール基と治療薬のチオール基とがジスルフ
ィド結合を形成できるようにある間隔でポリマーに共役される。 ある実施態様では、本発明の担体のポリマーに共役されるチオール化合物間の
間隔は、約１００から約１００００ダルトンである。好ましい実施態様では、チ
オール化合物間の間隔は約３００から約３０００ダルトンである。したがって、
２分子以上の治療薬を本発明の担体に共役して、標的組織または細胞に輸送でき
る。
【００４８】 さらにまた、本発明はチオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を 含み、この場合、担体は、少なくとも１つの官能基を含むポリマーおよび当該少
なくとも１つの官能基に共役されたチオール化合物を含み、当該少なくとも１つ
の官能基はポリマーに結合されていて反応に利用でき、さらに当該チオール化合
物は、そのチオール化合物のチオール基と治療薬のチオール基とがジスルフィド
結合を形成することができるように当該少なくとも１つの官能基に共役されてい
る。官能基のポリマーへの結合は標準的な有機化学技術を用いて達成できる。多
くの水溶性ポリマーおよび多くの官能基が本発明で有用であるので、少なくとも
１つの官能基を結合するために用いられる化学合成経路は、ポリマーおよびそれ
に結合させたい官能基によって左右される。本発明の好ましい実施態様では、当
該ポリマーはポリエチレングリコールおよびリジンのコポリマーを含み、このコ
ポリマーは、もともとリジンに結合したカルボン酸を有し、反応に利用できる。
【００４９】 さらにまた、本発明の実施態様では、官能基は、約１００から約１００００ダ
ルトンの間隔でポリマーに結合される。好ましい実施態様では、官能基間の間隔
は約３００から約３０００ダルトンである。 本発明の担体のポリマーに結合できる官能基の例には、ほんの少し例を挙げれ
ばケトン、エステル、カルボン酸、アルデヒド、アルコール、チオールまたはア
ミンが含まれる。本発明の好ましい実施態様では、官能基はカルボン酸である。
さらにまた、２種以上の官能基を同時に本発明の担体のポリマーに結合させるこ
とができる。 さらに、本発明の担体で有用なチオール化合物の例には、ほんの少し例を挙げ
ればシステアミン、１−アミノ−２−メチル−２−プロパンチオール、または１
−アミノ−２−プロパンチオールが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００５０】 さらに、本発明は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を含 み、この場合、担体は、ポリマー、ポリマーに共役させた細胞取り込み促進物質
、および少なくとも１つのチオール化合物を含み、当該チオール化合物は、当該
少なくとも１つのチオール化合物のチオール基と治療薬のチオール基とがジスル
フィド結合を形成することができるようにポリマーに共役されている。細胞取り
込み促進物質は、ジスルフィド結合を介して治療薬に共役された本発明の担体の
細胞膜通過および細胞のサイトゾル進入能力を強化する。
【００５１】 多数の細胞取り込み促進物質が知られており、本発明で有用である。本発明で
有用な細胞取り込み促進物質の例はビオチンである。さらに、化合物（例えば本
発明の担体）にビオチンを付加する方法は当業者に知られており、本明細書では
詳細に述べない。 さらにまた、下記実施例で説明するように、細胞取り込み促進物質はまた、チ
オール基を含む治療薬に直接結合させ、担体および治療薬の細胞膜通過能力を強
化することができる。
【００５２】 さらに、本発明の担体に共役できるチオール基を含む治療薬の例には、以下の
式Ｉの配列、およびその類似体並びに生物学的および医薬的に許容可能な塩、並
びにそのような異性体が存在する場合には立体、光学および幾何学異性体ととも
に医薬的に許容できるその塩および溶媒和物を含むＴａｔ抑制結合ペプチドが含
まれる： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基で、ＸはＣｙｓまたはＬｙｓ残基
である。そのような治療薬は、Ｔａｔ蛋白質とＴＡＲＲＮＡとの相互作用を阻害
し、それによってＨＩＶ−１の複製サイクルでトランス活性化工程に緩衝する能
力のためにウイルス感染、例えば哺乳類のＨＩＶ−１感染の治療に有用である。
このアプローチの論理的根拠は、そのようなペプチドは、ＴＡＲＲＮＡとの結合
について完全長のＴａｔ蛋白質と競合し、それによってＴａｔ蛋白質と発生期の
転写機構との間で必要な相互作用を妨害するということである。
【００５３】 別の実施態様では、本発明の担体と共役される治療薬は、以下のアミノ酸配列
とともにその医薬的に許容できる塩、並びにその類似体および誘導体を含むＴａ
ｔ抑制ペプチドである。 N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2 実際、レポーターＣＡＴ遺伝子に連結されたＨＩＶ−１ＬＴＲのプロモーター
エレメントを用いた細胞培養実験では、上記で述べたようにチオール基を含み、
さらにＴａｔ蛋白質の９アミノ酸の塩基性ドメインを含む治療薬は、トランス活
性化プロセスを阻害することが示された。
【００５４】 さらにまた、式Ｉの代表的ペプチド、Ｔａｔ１０−ビオチンは、特異的にＣＡ
Ｔ蛋白質のＴａｔ蛋白質仲介発現を阻害するという確証がＨＬＣＥ−Ｄ３６細胞
アッセイで得られている（以下の文献を参照されたい：I. Choudhury, J. Wang,
A.B. Rabson, S. Stein, S. Pooyan, S. Stein & M.J. Leibowitz (1998), Inh
ibition of HIV-1 replication by a Tat RNA binding domain peptide anlog.
J. Acqu. Immune Def. Syndr. & Human Retrovirol., 17:104-111(この文献は参
照により本明細書に含まれる))。Ｔａｔ蛋白質がＨＩＶＬＴＲから蛋白質発現を
誘発する機序は、転写伸長に対する影響によると一般には考えられているが、Ｔ
ａｔ蛋白質の転写後作用もまた存在する可能性がある。したがって、Ｔａｔ１０
−ビオチンが転写伸長工程でのみＴａｔ蛋白質と競合するか否かはまだ決定され
ていない。それとは関係なく、出願人らはそのような機序を説明する義務を負わ
ず、上記に述べた機序の説明には拘束されるべきではない。
【００５５】 本発明は、したがってレトロウイルス感染の治療を必要とする哺乳類でそのよ
うな感染を治療する方法を提供する。そのような方法は、チオール基を含む治療
薬のin vivoデリバリー用担体の治療的に有効な量を哺乳類に投与することを含 む。この場合、当該担体は、ポリマーおよび当該ポリマーに共役された少なくと
も１つのチオール化合物を含み、当該少なくとも１つのチオール化合物は、チオ
ール化合物のチオール基と治療薬のチオール基とがジスルフィド結合を形成でき
るように当該ポリマーに共役され、チオール基を含む治療化合物はＴａｔ抑制結
合ペプチド誘導体を含む。
【００５６】 例えば、本方法で有用なＴａｔ抑制結合誘導体は、下記式Ｉのビオチン付加ペ
プチド、およびその類似体、並びに生物学的および医薬的に許容できるその塩、
またはそのような異性体が存在する場合はその立体、光学および幾何学異性体、
並びに医薬的に許容できるその塩および溶媒和物を含む： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基で、ＸはＣｙｓまたはＬｙｓ残基
である。
【００５７】 式ＩのＴａｔ抑制結合誘導体の例には、以下の配列、またはその類似体もしく
は誘導体、または医薬的に許容できるその塩が含まれるが、ただしこれらに限定
されない： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:4)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:5)、 N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:6)又は、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:7)。
【００５８】 別の実施例では、本発明の担体に共役できるＴａｔ抑制ペプチド誘導体は以下
のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体、またはその医薬的に許容で
きるその塩を含む： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2。 上記で説明したように、多くの方法を利用してそのようなペプチド誘導体を合
成できる。例えば、それらは、そのようなペプチドをコードする特別な遺伝子操
作を施したＤＮＡ分子の遺伝子組換え発現によって製造できる。さらにまた、そ
のようなペプチドは、容易に利用できる固相合成技術を用いて合成できる。その
ようなペプチドを合成した後、それらは、現在知られているビオチン付加方法を
用いて容易にビオチン付加できる。
【００５９】 上記で説明したように、本明細書で開示するＴａｔ抑制ペプチドはＴａｔ蛋白
質ＲＮＡ−結合ドメイン模倣体として利用し、ＨＩＶ−１感染およびその結果の
エイズを治療できる。治療を受ける哺乳類はヒト、サル、イヌなどであるが、ヒ
トの治療が特に好ましい。治療薬がＴａｔ拮抗物質を含む場合のin vivoデリバ リー用担体は、細胞性転写物に対するＴＡＲ用エレメントとの相互作用によって
ホスト細胞に対するＴａｔ蛋白質の病理学的作用を軽減するために有用なはずで
ある。Ｔａｔ蛋白質のコアドメイン配列のペプチド類似体（これはウイルスによ
ってコードされたＲＮＡとではなくホスト細胞因子と相互作用すると考えられて
いる）に関する最近の研究は、ＨＩＶ−１複製サイクルにおけるトランス活性化
工程の抑制に基づく新規な種類のエイズ治療薬を同じように提唱することとなっ
た。したがって、そのような薬剤を本発明の担体に共役させることによって、そ
れらが標的組織に作用する前にそのような治療薬が分解され、さらに腎クリアラ
ンスを受けるのを減少させ、目的の組織および細胞に対するそれら薬剤の生体利
用性が実質的に高められる。
【００６０】 式Ｉのポリペプチドおよびその類似体は、下記式のアミノ酸配列、その類似体
または誘導体とともに当技術分野で知られている通常の溶液法または固相合成技
術によって合成できる： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2 本明細書および請求の範囲を通して、式Ｉのポリペプチド並びにその類似体お
よび誘導体並びにその塩は、そのような異性体が存在する場合には全てのその立
体、光学および幾何学異性体を、医薬的に許容できるその塩および溶媒和物とと
もに包含する。適切な場合には、当該ポリペプチドまたはその類似体は対応する
そのアミド形として用いることができる。本明細書で開示するアミノ酸配列は好
ましくは"Ｌ"型異性体であるが、"Ｄ"型異性体の残基も、当該ポリペプチドが所
望の機能特性を維持するかぎり、いずれのＬ−アミノ酸残基の代用とすることが
できる。
【００６１】 式ＩのペプチドのＲ基は、アルキル、アルケニルまたはアリールカルボン酸の
いずれの残基でもよく、すなわち、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、アリル
酸、安息香酸などが適切である。本発明での使用に特に好ましいものは、式Ｉの
ペプチドのアセチル誘導体である。 "生物学的および医薬的に許容できる塩"という用語は、哺乳類系で受容される
無機または有機酸に由来する任意の塩を含むことを意図する。これらの塩には、
酢酸塩、アジンピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸、アスパラギン酸塩、安息香
酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ヘキサン酸塩、コハク酸塩、フマル酸
塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、メタン
スルホン酸塩、シュウ酸塩、プロピオン酸塩、トシレート、およびメシレートが
含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような塩を生成するために用い
ることができる酸の例には、塩酸、硫酸および燐酸のような無機酸、並びにシュ
ウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸のような有機酸が含まれる。
【００６２】 ポリペプチドを規定するために用いられる命名法は成書（Schroder & Lubke,
"The Peptides", Academic Press(1965)）に規定されたもので、この場合、通常
の表記にしたがい、Ｎ−末端のアミノ基が左に、Ｃ−末端のカルボキシル基が右
に示される。ＮＨ2は、ポリペプチド配列の右に書かれているときはカルボキシ 末端に存在するアミド基を示す。 したがって、式Ｉのポリペプチドと実質的に同等の活性を示すポリペプチド類
似体は本発明での使用が同様に意図される。これらの改変は、適切な出発物質を
利用するペプチド合成によって得ることができる。
【００６３】 標準的なポリペプチド命名法（J.Biol. Chem., 243:3552-59(1969)）と歩調を
合わせて、アミノ酸残基の略語は以下の対応表に示す。 対応表 記号 アミノ酸 １文字 ３文字 Ｙ Ｔｙｒ チロシン Ｇ Ｇｌｙ グリシン Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｍ Ｍｅｔ メチオニン Ａ Ａｌａ アラニン Ｓ Ｓｅｒ セリン Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン Ｌ Ｌｅｕ ロイシン Ｔ Ｔｈｒ スレオニン Ｖ Ｖａｌ バリン Ｐ Ｐｒｏ プロリン Ｋ Ｌｙｓ リジン Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン Ｑ Ｇｌｎ グルタミン Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン Ｒ Ａｒｇ アルギニン Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｎ Ａｓｎ アスパラギン Ｃ Ｃｙｓ システイン
【００６４】 全てのアミノ酸残基配列は、その左から右の方向が通常のアミノ末端からカル
ボキシ末端方向になるように本明細書では表されていることは留意されるべきで
ある。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュ記号は、１つまた
は２つ以上のアミノ酸残基のまた別の配列とのペプチド結合を示すこともまた留
意されるべきである。上記の表は、本明細書で互換的に使用される３文字表記と
１文字表記を対照するために提示されている。
【００６５】 本発明のポリペプチドのアミノ酸は、非保存的態様（すなわち、特定のサイズ
または性状をもつアミノ酸のグループに属するアミノ酸を別のグループに属する
アミノ酸と変更することによる）、または保存的態様（すなわち、特定のサイズ
または性状をもつアミノ酸のグループに属するアミノ酸を同じグループに属する
アミノ酸と変更することによる）で変更できる。一般的にそのような保存的変更
は、得られるポリペプチドの構造および機能における変化を小さくする。本発明
は、その配列が、得られるポリペプチドの活性または結合特性が顕著に変化しな
い保存的変更を含む類似体を含むと考えるべきである。
【００６６】 以下はアミノ酸の種々のグループ分けの１例である。 非極性Ｒ基をもつアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プ
ロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。 非荷電極性Ｒ基をもつアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン
、チロシン、アスパラギン、グルタミン。 荷電極性Ｒ基をもつアミノ酸（ｐＨ６．０で陰性に荷電）：アスパラギン酸、
グルタミン酸。 塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で陽性に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジ
ン（ｐＨ６．０で）。 別のグループは芳香族基をもつアミノ酸であろう：フェニルアラニン、トリプ
トファン、チロシン。
【００６７】 別のグループ分けは分子量によるものであろう（すなわちＲ基のサイズ）： グリシン ７５ アラニン ８９ セリン １０５ プロリン １１５ バリン １１７ スレオニン １１９ システイン １２１ ロイシン １３１ イソロイシン １３１ アスパラギン １３２ アスパラギン酸 １３３ グルタミン １４６ リジン １４６ グルタミン酸 １４７ メチオニン １４９ ヒスチジン（ｐＨ６．０で） １５５ フェニルアラニン １６５ アルギニン １７４ チロシン １８１ トリプトファン ２０４
【００６８】 特に好ましい置換は、ＡｒｇまたはＬｙｓの代わりに−Ｇｌｎを、およびＬｙ
ｓまたはＡｒｇの代わりに−Ｈｉｓを代用する。 アミノ酸置換はまた、特定の好ましい特性をもつアミノ酸を代用するために導
入できる。例えば、Ｃｙｓは、もう１つのＣｙｓまたは本発明の担体とのジスル
フィド架橋のための潜在的部位として導入できる。Ｈｉｓは、特に"触媒"部位と
して導入できる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として働くことができ、生化
学的触媒作用で最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、特にその平坦な構造
（これはポリペプチド構造でβ−回転を誘発する）のゆえに導入できる。また別
には、１つまたは２つ以上の部位でＤ−アミノ酸をＬ−アミノ酸の代用にするこ
とができる。
【００６９】 したがって式Ｉのポリペプチドの代表的類似体には以下が含まれる： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:4) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:5) N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:6) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:7)
【００７０】 さらに本発明で開示されるものは、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバ リー用担体を製造する方法である。この場合、当該担体はポリマーおよび少なく
とも１つのチオール化合物を含み、当該チオール化合物は、当該少なくとも１つ
のチオール化合物のチオール基と治療薬のチオール基とがジスルフィド結合を形
成できるようにポリマーに共役される。 本明細書で開示されるそのような方法の１つは以下の工程を含む： ａ）少なくとも１つのチオール化合物をジスルフィド化合物と反応させ、当該
少なくとも１つのチオール化合物のチオール基と当該ジスルフィド化合物のジス
ルフィド結合のイオウ原子とがジスルフィド結合を形成する第一の中間体を生成
し；さらに ｂ）第一の中間体をポリマーと反応させて、当該ポリマーに共役させた第一の
中間体を含む担体を生成する。 いったん担体が生成されたら、それをチオール基をもつ治療薬と反応させ、そ
れによってそのジスルフィド結合が還元され、さらに、担体の少なくとも１つの
チオール化合物のイオウ原子と治療薬にチオール基とがジスルフィド結合を形成
する。
【００７１】 上記で説明したように、多数のチオール化合物が担体の製造に有用である。ほ
んの少しの例を挙げれば、システアミン、１−アミノ−２−メチル−２−プロパ
ンチオール、または１−アミノ−２−プロパンチオールが挙げられる。 さらにまた、多数のジスルフィド化合物が上記で説明した方法で用いることが
できる。好ましくは、ジスルフィド化合物は対称性である。好ましい実施態様で
は、当該化合物は２，２'−ジチオジピリジンである。
【００７２】 さらに、上記の方法で用いられるポリマーは分枝または直鎖構造を有する。好
ましくは、当該ポリマーは水溶性ポリマーである。本発明で有用な水溶性ポリマ
ーの例には、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキスト
ラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソ
ラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸（ホモポリマー）、ポリ
プロピレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマ
ー、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸、ポリエチレングリ
コールとアミノ酸のコポリマー、またはプロピレンオキシド／エチレンオキシド
コポリマーが含まれる。好ましい実施態様では、ポリマーはポリエチレングリコ
ールおよびリジンのコポリマーである。
【００７３】 さらにまた、本発明の担体の製造方法で用いられるポリマーは任意の分子量を
有することができる。本発明の実施態様では、チオール基を含む治療薬のin viv
oデリバリー用担体の製造方法で用いられるポリマーは、約１０００から約１０ ０００００ダルトンの分子量範囲を有し、好ましくは約２００００から２０００
００ダルトンの分子量範囲を有する。好ましくは、当該ポリマーは約２７０００
ダルトンの分子量を含む。
【００７４】 本発明はさらに、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を製造 する方法を含み、この場合ポリマーは、それに結合した反応に利用できる少なく
とも１つの官能基を含む。したがって、そのような担体を製造する方法は以下の
工程を含む： ａ）チオール化合物をジスルフィド化合物と反応させ、チオール化合物のチオ
ール基とジスルフィド化合物のジスルフィド結合のイオウ原子とがジスルフィド
結合を形成する第一の中間体を生成し；さらに ｂ）第一の中間体をそれ自身に結合した少なくとの１つの官能基を含むポリマ
ーと反応させて、当該ポリマーに結合した少なくとも１つの官能基と共役させた
第一の中間体を含む担体を生成する。 担体が生成された後、それはチオール基を含む治療薬と容易に反応してそのジ
スルフィド結合が還元され、酸化性カップリングが、治療薬のチオール基とチオ
ール化合物のチオール基との間で生じ、それによって治療薬が本発明の担体とジ
スルフィド結合を介して共役される。
【００７５】 さらに、本発明の方法で用いられるポリマーの当該少なくとも１つの官能基は
ある間隔でポリマーに結合できる。ある実施態様では、ポリマー上の官能基間の
この間隔は約１００から約１００００ダルトンで、好ましくは約３００から約３
０００ダルトンである。 さらに、上記で説明した本発明の方法で、そのような化合物を反応させて、ジ
スルフィド結合を含む第一の中間体を生成する多くの方法が当業者に知られてい
る。例えば、そのような反応は、本の少しを挙げれば、酸化剤、例えば酸素（Ｏ 2 ）、過酸化水素、酢酸タリウム（ＩＩＩ）、Ｍｅ2ＳＯＩ2、相転移条件下の臭 素、酸化窒素、重クロム酸カリウム、銅、メチレンクロリドに溶解した場合は塩
化クロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）の存在下で実施できる。
【００７６】 上記の方法で第一の中間体が生成された後、第一の中間体のジスルフィド結合
を破壊することなく、この第一の中間体をポリマーの少なくとも１つの官能基に
共役させるために、多数の化学反応を利用できる。例えば、そのような化学反応
は、例えば以下のような極性中性溶媒中で実施できる：Ｎ，Ｎ−ジメチルフォル
ムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセト
アミド（ＤＭＡ）。好ましくは、反応は、ＤＭＦおよび他の試薬（例えばベンゾ
トリアゾル−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサ
フルオロホスフェート（ＢＯＰ）およびヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ
))を含む溶液中で実施される。本発明の担体のポリマーの少なくとも１つの官能
基に第一の中間体を共役させる、当業者に周知の他の反応も本発明に包含される
。
【００７７】 本発明の担体を生成した後、チオール化合物のイオウ原子と治療薬のチオール
基とがジスルフィド結合を形成できるように、当該担体をチオール基を含む治療
薬と反応させることができる。この反応は、ポリマーの少なくとも１つの官能基
に共役されたチオール化合物のイオウ原子が、治療薬のチオール基と酸化的カッ
プリングを受けるように、担体のジスルフィド結合を還元することを含む。結果
として、治療薬は本発明の担体に生物分解性ジスルフィド結合を介して結合され
る。
【００７８】 ここで説明する、チオール基を含むin vivoデリバリー用担体の別の製造方法 は、以下の工程を含む： ａ）第一のチオール化合物を第二のチオール化合物と反応させて、第一のチオ
ール化合物のチオール基と第二のチオール化合物のチオール基とがジスルフィド
結合を形成する第一の中間体を生成し； ｂ）第一の中間体をポリマーと反応させて、ポリマーに共役した第一の中間体
を含む第二の中間体を生成し； ｃ）第二の中間体のジスルフィド結合を還元して、ポリマーおよび、第一のチ
オール化合物のチオール基が反応に利用できるようにポリマーと共役した第一の
チオール化合物を含む第三の中間体を生成し；さらに ｄ）第三の中間体とジスルフィド化合物を反応させて、第一のチオール化合物
のチオール基とジスルフィド化合物のイオウ原子とがジスルフィド結合を形成で
きるように担体を生成する。
【００７９】 担体を生成した後、担体はチオール基を含む治療薬と容易に反応させることが
できる。そのような反応は、担体のジスルフィド結合を還元し、第一のチオール
化合物のイオウ原子と治療薬のチオール基との間の酸化的カップリングを促進し
て生物分解性ジスルフィド結合を生成することを含む。 本発明の実施態様では、第一のチオール化合物および第二のチオール化合物は
同じ化合物である。したがって、第一の中間体は対称性または非対称性ジスルフ
ィド化合物である。そのような反応は上記の酸化剤を用いて容易に実施できる。 さらにまた、本発明の担体のポリマーに第一の中間体を共役させて第二の中間
体を生成することは、上記で述べたものと同様な態様で、すなわち中性溶媒中で
ＢＯＰおよびＨＯＢｔを添加して実施できる。
【００８０】 本発明のこの方法の次の工程は、第二の中間体のジスルフィド結合を還元して
第三の中間体を生成することを含む。ジスルフィド結合を還元するために、多数
の還元剤が当業者には利用可能である。そのような例には、ほんの少しを挙げれ
ばジエチルエーテルの存在下での水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4） 、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）、グルタチオン、β−メルカプトエタ ノールおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）が含まれる。
【００８１】 いったんチオール基が第三の中間体上に形成されると、本発明の担体を生成す
るためにそれとジスルフィド化合物を反応させることができる。好ましくは、ジ
スルフィド化合物は対称性である。本発明の実施態様では、ジスルフィド結合を
含む化合物は２，２'−ジチオジピリジンである。この実施態様では、この化合 物のジスルフィド結合は容易に還元されて、２つのチオピリジン分子（すなわち
離脱基として作用するものおよび、第三の中間体のチオール基と酸化的カップリ
ングを受けて本発明の担体を生成するもの）を生成できる。
【００８２】 さらに別に付加される工程は、担体をチオール基を含む治療薬と反応させるこ
とを含む。チオピリジンは安定な離脱基であるので、そのような反応は容易に惹
起される。結果として、治療薬を生物分解性ジスルフィド結合を介して本発明の
担体に共役できる。このジスルフィド結合は細胞外液でin vivoで還元するのは 困難であるが、サイトゾルでは還元される。したがって、本発明の担体は、上記
で考察した他のタイプの担体を含む治療薬に提供される生体利用性と比較してよ
り強い生体利用性をもつ治療薬を提供する。
【００８３】 本発明の別の実施態様では、少なくとも１つの官能基が本発明の担体のポリマ
ーに結合され、反応に利用できる。チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリ ー用担体を製造する方法は以下の工程を含む： ａ）第一のチオール化合物を第二のチオール化合物と反応させて、第一のチオ
ール化合物のチオール基と第二のチオール化合物のチオール基とがジスルフィド
結合を形成する第一の中間体を生成し； ｂ）第一の中間体を、少なくとも１つの官能基がそれに結合されているポリマ
ーと反応させて、当該少なくとも１つの官能基と共役した第一の中間体を含む第
二の中間体を生成し； ｃ）第二の中間体のジスルフィド結合を還元して、少なくとも１つの官能基が
結合したポリマーおよび、第一のチオール化合物のチオール基が反応に利用でき
るように当該官能基に共役された第一のチオール化合物を含む第三の中間体を生
成し、；さらに ｄ）第三の中間体とジスルフィド化合物を反応させて、第一のチオール化合物
のチオール基とジスルフィド化合物のイオウ原子とがジスルフィド結合を形成す
る担体を生成する。
【００８４】 上記で説明したように、多数の官能基が上記の方法で有用である。本発明の担
体のポリマーに結合できる官能基の例には、ほんの少しを挙げればケトン、エス
テル、カルボン酸、アルデヒド、アルコール、チオール、またはアミンが含まれ
る。本発明の好ましい実施態様では、官能基はカルボン酸である。さらにまた、
２種以上の官能基を同時に本発明の担体のポリマーに結合できる。 さらに、少なくとも１つの官能基はある間隔でポリマーに結合できる。ある実
施態様では、ポリマー上の官能基間の間隔は約１００から約１００００ダルトン
である。好ましい実施態様では、ポリマー上の官能基間の間隔は約３００から約
３０００ダルトンである。
【００８５】 さらにまた、多数のチオール化合物が本発明の方法で有用である。例えば、ほ
んの少しを挙げれば、システアミン、１−アミノ−２−メチル−２−プロパンチ
オール、または１−アミノ−２−プロパンチオールのようなチオール化合物を、
本発明のこの方法のチオール化合物として用いることができる。
【００８６】 さらに、本発明の担体を製造するために上記で述べた他の方法に関して言えば
、本発明のこの方法のポリマーは分枝構造でも直鎖構造でもよい。好ましくは、
ポリマーは水溶性ポリマーである。ここで有用な水溶性ポリマーの例には、ポリ
エチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，
３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸（ホモポリマー）、ポリプロピレングリコ
ール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、エチレン／無
水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコールおよびアミ
ノ酸のコポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドのコポリマー、また
はポリエチレングリコール／チオリンゴ酸のコポリマーが含まれる。好ましい実
施態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコールおよびリジンのコポリマーを
含み、これは、本発明の担体のポリマーにチオール化合物を共役させるために容
易に利用できるカルボン酸官能基を有する。
【００８７】 さらに、ポリマーは任意の分子量を有することができる。本発明の実施態様で
は、ポリマーは、約１０００から約１００００００ダルトンの分子量範囲、好ま
しくは約２００００から２０００００ダルトンの分子量範囲を有する。好ましい
実施態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコールおよびリジンのコポリマー
で、約２７０００ダルトンの分子量を有する。
【００８８】 チオール基を含む治療薬の例もまた明細書を通して説明されるが、本発明は、
本明細書で説明される実施例に全く限定されない。特に、本明細書ではチオール
基を含むＴａｔ抑制結合ペプチド誘導体が開示される。したがって、それらは、
ジスルフィド結合を介して本発明の担体に容易に共役でき、ウイルス感染に罹患
している（例えばエイズ）哺乳類を治療するために治療的に有効な量を投与でき
る。本発明で有用なＴａｔ抑制ペプチド誘導体の例には、下記式Ｉのアミノ酸配
列およびその類似体、並びに生物学的および医薬的に許容できるその塩、並びに
そのような異性体が存在する場合はその立体、光学および幾何学異性体、並びに
その医薬的に許容できる塩および溶媒和物が含まれる： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基で、ＸはＣｙｓまたはＬｙｓ残基
である。そのような治療薬はＣｙｓ残基（これはチオール基を含む）を含むので
、それらはジスルフィド結合を介して本発明の担体に容易に共役できる。
【００８９】 したがって式Ｉのポリペプチドの代表的な類似体は以下を含む： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:4) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:5) N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:6) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:7)
【００９０】 本発明の担体に共役できるチオール基を含む治療薬の別の例では、以下のアミ
ノ酸配列、およびその類似体または誘導体、並びに生物学的および医薬的に許容
できるその塩を含むＴａｔ抑制結合ペプチドが開示される： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2
【００９１】 さらにまた、上記で説明したように、本発明は、ウイルス感染の治療を必要と
している哺乳類でウイルス感染を治療する方法を含む。より具体的には、そのよ
うな方法は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体に共役された チオール基を含む治療薬の治療的に有効な量哺乳類に投与することを含むが、こ
の場合、当該担体はポリマーおよび当該ポリマーに共役された少なくとも１つの
チオール化合物を含み、それによってチオール化合物のチオール基と治療薬のチ
オール基とがジスルフィド結合を形成し、さらに治療薬はＴａｔ抑制結合ペプチ
ド誘導体を含む。
【００９２】 Ｔａｔ抑制結合ペプチド誘導体の例は、下記式Ｉのビオチン付加ペプチド、お
よびその類似体、並びに生物学的および医薬的に許容可能なその塩、並びにその
ような異性体が存在する場合はその立体、光学および幾何学異性体を含む： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基で、ＸはＣｙｓまたはＬｙｓ残基
である。
【００９３】 さらにまた、本発明の担体に共役でき、ウイルス感染をもつ（例えばエイズ）
哺乳類に治療的に有効な量で投与できるＴａｔ抑制結合ペプチド誘導体のまた別
の例には、以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:4) N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:5) N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
(配列番号:6)又は、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys(ビオチン)-Cys-NH2 (配
列番号:7)。
【００９４】 本発明の担体に共役され、ウイルス感染の治療を必要としている哺乳類でその
ような治療に用いることができるチオール基を含む治療薬のまた別の例には、以
下のアミノ酸配列およびその類似体または誘導体、並びに医薬的に許容できるそ
の塩が含まれる： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
DArg-NH2 この方法は、特にレトロウイルス感染（例えばヒトのエイズ）を治療するため
に用いることができる。
【００９５】 治療効果をもたらす本発明の担体を哺乳類に投与するために現在多くの方法が
利用できる。例えば、Ｔａｔ抑制ペプチド誘導体に共役させた本発明の担体、お
よび医薬的に許容できるその担体を含む医薬組成物を生成できる。さらにまた、
本発明にしたがって、Ｔａｔ抑制ペプチド誘導体に共役させた担体または上記の
医薬組成物を非経口的に、経粘膜的に（例えば経口、経鼻、または経腸的）、ま
たは経皮的に導入してもよい。好ましくは、投与は非経口的（例えば静脈内注射
）であるが、また細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内および頭蓋内
投与も含まれる（ただしこれらに限定されない）。 別の実施態様では、本発明の担体はＴａｔ蛋白質抑制ポリペプチド誘導体に共
役されるか、またはそのような共役物質を含む医薬組成物は小胞、特にリポソー
ムとして体内を輸送できる（例えば以下を参照されたい：Langer, Science 249:
1527-1533(1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious
Disease and Cancer, Lopez-Berestein & Fidler(eds.), Liss: New York, pp.
353-365(1989); Lopez-Berestein, 上掲書、pp.317-327；一般的には上掲書を参
照されたい）。
【００９６】 さらに別の実施態様では、Ｔａｔ蛋白質抑制ポリペプチド誘導体のような治療
薬は本発明の担体に共役できるが、これを続いて遊離制御系として体内輸送する
ことができる。例えば、上記で説明したように、本発明の担体のチオール基に結
合させた官能基は立体的妨害状態を生じ、これは、治療薬を本発明の担体に共役
させているジスルフィド結合が還元される速度を低下させる。したがって、Ｔａ
ｔ蛋白質抑制ポリペプチド誘導体が担体から遊離され、さらに標的細胞または組
織に輸送される速度は、担体のチオール化合物の構造に依存する。遊離制御系と
して治療薬を体内輸送する他の方法には、静脈内輸液、埋め込み用浸透圧ポンプ
、経皮貼付薬、リポソーム、またはその他の投与態様が含まれる。ある実施態様
ではポンプを使用することができる（例えば以下を参照されたい：Langer, 上掲
書；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987); Buchwald et al., S
urgery 88:507(1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574(1989)）。ま
た別の実施態様では、ポリマー材を用いることができる（例えば以下を参照され
たい："Medical Applications of Controlled Release", Langer & Wise(eds.),
CRC Press: Boca Raton, Florida(1974); "Controlled Drug Bioavailability,
Drug Product Design and Performance", Smolen & Ball(eds.), Wiley: New Y
ork(1984); Ranger & Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61
(1983); Levy et al., Science 228:190(1985); During et al., Ann. Neurol.
25:351(1989); Howard et al., J Neurosurg. 71:105(1989)）。 以下の実施例は本発明をより完全に説明するために提示されるが、本発明の範
囲を限定するものと解されるべきではない。
【００９７】実施例 上記で説明したように、水溶性ポリマーの二価結合を、治療薬の医薬特性を操
作するために用いることができる。例えば、蛋白質にポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）の鎖を付加することによって、その循環半減期が増加し、その免疫原性
が最小限になる2。他の研究者らによって、多数の結合部位をもつＰＥＧ−リジ ンコポリマーがデザインされた3。続いて、生物耐性または生物分解性結合を介 する共役物が製造されたが、生物分解性ジスルフィド結合は調べられなかった3 。この結合は、細胞内では細胞外液中よりも強い還元性環境が存在するために、
細胞内へのドラッグデリバリーに特に有用である。本明細書では、チオール基を
含む治療薬のin vivoデリバリー用担体が開示されるが、この場合、担体は、治 療薬とジスルフィド結合を形成するために多数の結合部位を有する。ジスルフィ
ド結合はこれまで、治療薬と合成ポリマー担体との間の生物分解性結合としても
、細胞取り込み促進物質と組み合わせても用いられたことはなかった。
【００９８】 材料と方法 システアミンヒドロクロリド、エルマン試薬〔５，５'−ジチオビス（２−ニ トロ安息香酸）〕およびグルタチオン（還元形）はシグマ・ケミカル社（Sigma
Chemicals, St. Louis, MO）から入手した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）はピ
アース（Pierce, Rockford, IL）から入手した。２，２'−ジピリジルジスルフ ェート、１−アミノ−２−メチル−２−プロパンチオール、ジイソプロピルエチ
レンアミン（ＤＩＥＡ）およびシリカゲル（７０−２３０メッシュ、６０Ａ）は
、アルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical, Milwaukee, WI)から入手した。
ヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）、ベンゾトリアゾル−１−イルオキシ
トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）
およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はパーセプティブ・バイオシステムズ（
PerSeptive Biosystems, Boston, MA)から入手した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）
およびメタノール（ＭｅＯＨ）はＨＰＬＣ用等級で、フィッシャー・サイエンテ
ィフィック（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)から入手した。"ＳＥＰＨＡ ＤＥＸ"ゲルろ過ビーズはファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー（Pharmacia L
KB Biotechnology, Piscataway, NJ)から入手した。分子量が約２７ｋＤａ（分 子量＝２．６９ｘ１０4Ｄ、２１９８Ｄ／反復ユニット）のポリエチレングリコ ール−リジンコポリマーは文献記載の方法3にしたがって合成した。
【００９９】 ペプチド合成 小さなペプチドを合成し、チオール基を含む治療薬として本明細書で用いた。
ペプチド：N-アセチル-Phe-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列番号:8)は、ルイジアナ 州立大学（Louisiana State University, LSU)、コア施設でＦｍｏｃ化学反応を
用いて合成し、逆相ＨＰＬＣで精製し、質量分光分析で構造を確認した。 ペプチド：N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列
番号:9)およびN-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチ ン)-Cys-NH2 (配列番号:3)は、Ｆｍｏｃ化学反応を用いて手動で合成した。放射
能標識のために、固形支持体上で製造したペプチドを、カップリング活性化試薬
ＢＯＰ、ＨＯＢｔおよびＤＩＥＡの存在下でトリチウム含有無水酢酸と反応させ
た。ペプチドのアセチル化は、過剰の非放射性無水酢酸でチェースして完了させ
た。 固形支持体から切離してエーテルで沈澱させた後、放射能標識ペプチドは、ク
ロマトグラフィーによって"ＳＥＰＨＡＤＥＸ"ゲル濾過ビーズサイズＧ−１０上
で、溶出にＰＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、
ｐＨ７．４）を用いて精製するか、または"ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−１０"ウルトラ
フィルター（Amicon/Millipore, Bedford, MA)を用いて遠心濃縮によって精製し
た。
【０１００】 方式Ｉによる本発明の担体の製造 脱気緩衝液（酢酸でｐＨ４．０に調整した０．１Ｎ酢酸ナトリウム、０．３Ｍ
塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ）１５ｍｌに溶解したシステアミン塩化水素（
０．５０ｇ、４．４mmole)の溶液に、２，２'−ジチオジピリジン（３．５ｇ、 １５mmol；１８ｍｌのＭｅＯＨに溶解）を加えた。混合物をＮ2下で室温で攪拌 した。反応は薄層クロマトグラフィー（水酸化アンモニウム／ＭｅＯＨ（メタノ
ール）／ＤＣＭ（ジクロロメタン）：２／１０／９０）でモニターし、４時間後
に完了させた。ＭｅＯＨを真空中で除去し、残留物を炭酸ナトリウムで飽和させ
て塩基性にした。残留物をＤＣＭで抽出し（３ｘ５０ｍｌ）、一緒にしたＤＣＭ
を水（２ｘ４０ｍｌ）およびブライン（４０ｍｌ）で洗浄し、続いて硫酸マグネ
シウム上で乾燥させた。この硫酸マグネシウムをろ過し、濾液を真空中で濃縮し
油状の残留物になるまで濃縮した。生成物、システアミン−チオピリジン（方式
Ｉの第一中間体）はフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルカラム上で
精製した（水酸化アンモニウム／ＭｅＯＨ／ＤＣＭ：２／１０／９０）。収量：
０．３０ｇ（黄色油）（３６％）。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ８．４−８．５ｐ
ｐｍ（ｍ，１Ｈ）、７．７−７．６ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ）、７．１５−７．０ｐｐ
ｍ（ｍ，１Ｈ）、３．０−２．７ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ）、０．９ｐｐｍ（ｂ，２Ｈ
）。
【０１０１】 ＰＥＧ−リジンコポリマーを含むポリマー（０．２０ｇ、９１μｍｏｌリジン
）を２．５ｍｌの脱気ＤＭＦに溶解した。システアミン−ＴＰ（第一の中間体）
（０．５mmol）、ＢＯＰ（０．５mmol）、ＨＯＢｔ（０．５mmol）およびＤＩＥ
Ａ（２５μｌ）をポリマーを含む溶液に加え、Ｎ2下で攪拌した。この反応で、 第一の中間体はポリマーに結合されている反応に利用可能な少なくとも１つのカ
ルボン酸と共役して第二の中間体を生成する。多数の自由なカルボン酸がポリマ
ー上に存在するので、２つ以上の第一中間体がポリマーに共役される。
【０１０２】 生成物（本発明の担体）を冷エーテルで沈澱させ、冷エーテルで洗浄してから
スピードバック（Speedvac, Savant Instrument Co., Farmingdale, NY）でゲル
様残留物になるまで乾燥させた。生成物を溶解し"ＳＥＰＨＡＤＥＸ"ゲルろ過Ｇ
−７５カラム（ベッド容積４８ｍｌ）で０．１Ｎ酢酸を用いて精製した。適切な
分画を一緒にして凍結乾燥させた。収量：０．１１ｇ（無色固体）。いったん担
体が精製されたら、それをチオール基を含む治療薬と、治療薬のジスルフィド結
合が還元されるように反応させて新しいジスルフィド結合を形成し、担体と治療
薬を結合させることができる。
【０１０３】 方式ＩＩによる本発明の担体の製造 上記で述べたように、この方法では、第一のチオール化合物および第二のチオ
ール化合物は同じ化合物でよい。したがって、この実施例では、２つのシステア
ミン塩化水素を、トリエチルアミンでｐＨ８．６に調節した大気下水溶液（１５
ｍｌに０．３ｇ）で一晩攪拌して先ずジスルフィド連結二量体に変換した。エル
マンのアッセイでは、残留遊離チオールは１％未満であった。この混合物にｐＨ
１０になるまで炭酸ナトリウムの飽和溶液を加え、続いてＤＣＭ（５ｘ２０ｍｌ
）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し回転蒸発装置で濃縮した。
結果として、対称性ジスルフィドの第一の中間体が生成された。
【０１０４】 ＰＥＧーリジンコポリマー（０．２０ｇ、９１μモルのリジン、分子量２．６
９ｘ１０4Ｄ）を２．５ｍｌの脱気ＤＭＦに溶解した。システアミン二量体（第 一中間体）（６５０μモル）、ＢＯＰ（６５０μモル）、ＨＯＢｔ（６５０μモ
ル）およびＤＩＥＡ（２５μｌ）をＰＥＧコポリマー溶液に加え、Ｎ2下で一晩 攪拌した。生成物（本発明の担体）を冷エーテルで沈澱させ、冷エーテルで洗浄
してからスピードバック（Speedvac, Savant Instrument Co., Farmingdale, NY
）でゲルになるまで乾燥させた。生成物（第二の中間体）を"ＳＥＰＨＡＤＥＸ"
Ｇ−７５ゲルろ過カラムで上記のように精製した。適切な分画を一緒にして凍結
乾燥させ、無色の固体７０ｍｇを得た。これを脱気ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解
した。
【０１０５】 続いてＤＴＴ（リジンを基準に１０モル相当）を加え、第二の中間体のジスル
フィド結合を還元し、さらに還元反応をＮ2下で一晩進行させた。生成物（第三 の中間体）を溶出に１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｎ酢酸を用いてＧ−７５カラ
ム（４８ｍｌベッド容積）で精製した。適切な分画を一緒にして凍結乾燥させ、
無色の固体６０ｍｇを得た。これを４ｍｌの脱気緩衝液（酢酸でｐＨ４．０に調
整した０．１Ｎ酢酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ）に
溶解した。
【０１０６】 ３ｍｌの脱気ＭｅＯＨに溶解した２，２'ジチオピリジン（２７０μモル）を 加え、反応混合物をＮ2下で２時間攪拌した。ＭｅＯＨを回転蒸発装置で除去し 、生成物（担体）を溶出に０．１Ｎ酢酸を用いて"ＳＥＰＨＡＤＥＸ"Ｇ−７５ゲ
ル濾過カラム（４８ｍｌベッド容積）で精製した。適切な分画を一緒にして凍結
乾燥させ、無色の固体３０ｍｇを得た。この時点で非対称性ジスルフィドである
担体は、チオール基を含む治療薬と容易に反応して、それによってジスルフィド
結合を還元し、ジスルフィド結合を介して本発明の担体に共役させることができ
る。同様な方法を用いて、立体的に拘束されたシステアミン類似体、１−アミノ
−２−メチル−２−プロパンチオールのＰＥＧ誘導体を製造した。本発明の担体
で立体的に拘束されたシステアミン類似体を用いることによって、担体から治療
薬が遊離する速度を調節できる。特に、システアミンへの２メチル基の付加は立
体的拘束をもたらす。出願人らは、この拘束が、本発明の担体に治療薬を共役さ
せているジスルフィド結合が還元される速度を低下させることを見出した。結果
として、この遊離速度の低下は、本発明の担体のポリマーに共役されるチオール
化合物の立体的拘束に依存する。
【０１０７】 ＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＴＰの２−チオピリジン含有量の測定 酸加水分解および、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）の
アミノ酸分析装置（ＬＳＵコア施設）を用いて遊離リジンの測定によって、ＰＥ
Ｇ−Ｓ−Ｓ−ＴＰ溶液の濃度を求めた。４ｍｇ／ｍｌの水溶液（約２μモル／ｍ
ｌのリジン）のＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−２ＴＰの種々の量（１００、２００および４０
０μｌ）を別々に過剰のＤＴＴ（水で２６μモル／ｍｌを２００μｌ）と反応さ
せ、最終容積１．０ｍｌにＰＢＳで希釈した。遊離された２−チオピリドンの量
を３４３ｎｍで７．０６ｘ１０3のモル吸光係数を用いて定量した（５）。続い てリジンに対するチオピリジンの比を計算した。
【０１０８】 ＰＥＧ−システアミンの製造 水に溶解させたＰＥＧ−システアミン−ＴＰ（チオール基を含む治療薬とジス
ルフィド結合を介して共役する前の本発明の担体の例）（８μモル／ｍｌのリジ
ン）を等容積の１ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳと混合した。この溶液３ｍｌに１当量
（チオールのためのエルマンのアッセイで決定6）のペプチド：N-アセチル-Phe-
Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列番号:8)を加えた。Ｎ2下で１５分攪拌した後、この 反応（混合物の部分標本を３４３ｎｍでモニター）を終了させた。溶出液として
ＰＢＳを用いて生成物をセファデックスＧ−７５カラムで精製した。適切な分画
を一緒にした。コポリマーのペプチド誘導化の程度をアミノ酸分析（ＬＳＵコア
施設）で求めた。放射能標識ペプチドをＰＥＧ−システアミン−ＴＰに付加し、
同様な態様であるがより小さな規模でＧ−７５カラムで精製した。
【０１０９】 本発明の担体からペプチドの遊離 ジスルフィド連結共役物：PEG-システアミン-N-アセチル-Phe-Arg-Arg-Arg-Cy
s-NH2 (配列番号:8)を還元されたグルタチオンの溶液（ＰＢＳ中で３ｍＭ）に最
終ペプチド濃度０．３ｍＭで加え、続いてＮ2下で室温で保温した。サンプルを 各時点で採取し、適量の５％ＴＦＡを加えて酸性にし、０．１％ＴＦＡ中のＧ−
７５カラムにかけ、ＰＥＧ−共役ペプチドを遊離ペプチドから分離した。高分子
量領域の適切な分画を一緒にし、各時点でのペプチド誘導化の程度をアミノ酸分
析で決定した。放射能標識ペプチドの遊離を測定するために、各時点の部分標本
を硫酸でｐＨ３．５の酸性にした。続いて、"ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−１０"による
限外濾過を用いて、ＰＥＧ共役ペプチドおよび遊離ペプチドを分離した。分離が
完全であることを確認するために、残留物および一緒にした濾液の放射能活性を
シンチレーション計測で定量した。
【０１１０】 結果 チオール基を含む治療薬と共役した本発明の担体の製造 合成経路は方式ＩおよびＩＩで示されている。方式Ｉでは、システアミン（チ
オール化合物）は先ず２−チオピリジンとの混合ジスルフィドに変換され、第一
の中間体を生じた。システアミン−ＴＰ試薬をシリカゲルクロマトグラフィーで
精製し、その構造を1Ｈ−ＮＭＲで確認した。２−チオピリドンは約１５％／日 の速度で２，２'−ジピリジルジスルフィドに戻るので、この試薬は、ＰＥＧ− リジンコポリマーとのカップリングに直ちに用いなければならないことが判明し
た。ＰＥＧ−リジンコポリマー上のカルボキシレート基とシステアミン上のアミ
ノ基との間のアミド結合生成は、ペプチド合成でカップリングに典型的に用いら
れる試薬を使って達成した（方式Ｉ）。
【０１１１】 方式ＩＩでは、システアミン（実施例の第一および第二のチオール化合物）を
先ず対称性ジスルフィド（本方法の第一中間体）に変換し、続いてＰＥＧ−リジ
ンポリマーに付加して第二の中間体を生成する。続いて第二の中間体のジスルフ
ィド結合を還元して、チオール基を含む第三の中間体を生成する。この最後の工
程で、第三の中間体を２，２'−ジチオジピリジンと反応させて、チオール基を 含む治療薬と共役させる前の本発明の担体を生成する。したがって、この時点で
本担体はジスルフィド結合を含む。
【０１１２】 ２−チオピリジンと担体のＰＥＧ−リジンポリマーに付加されたシステアミン
との間のジスルフィド結合は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）での加水分解に対して安定
で、これは、室温で２４時間後に３４３ｎｍの吸収が認められないことによって
決定された。しかしながら、システイニル−ペプチド、例えば、N-アセチル-Phe
-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列番号:8)の付加によって、この反応は数分以内に終 了した（３４３ｎｍで測定したときの遊離２−チオピリドン基によって決定）（
図３）。化学量論に関しては、ある量のＰＥＧ／Ｌｙｓ−Ｓ−Ｓ−ＴＰ溶液から
過剰のＰＢＳ中の還元剤（ＤＴＴ）によって遊離される２−チオピリドンの量を
決定した。続いて、１当量（エルマンアッセイによって測定されたチオール基に
よって決定）のペプチド： N-アセチル-Phe-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列番号:8)
をＰＥＧ／Ｌｙｓ−Ｓ−Ｓ−ＴＰ溶液の部分標本に加え、遊離された２−チオピ
リドンによって反応が本質的に完了したことが判明した。生成物、ＰＥＧ／Ｌｙ
ｓ−Ｓ−Ｓ−ペプチドのゲル濾過クロマトグラフィーによる精製によって遊離２
−チオピリドンから、さらにおそらくは未反応残留ペプチドから完全に分離され
た（図４）。
【０１１３】 酸加水分解とそれに続くアミノ酸分析を用いてＰＥＧ−リジンコポリマーのサ
ンプルの濃度を決定し、さらに過剰のＤＴＴによる処理を用いてこの同じサンプ
ルに共役されたシステアミン−Ｓ−Ｓ−ＴＰの量を決定した。この方法によって
、６６＋／−８％のリジンカルボキシレート基が、方式Ｉで製造されたＰＥＧ／
Ｌｙｓシステアミン−ＴＰのサンプルにシステアミン−ＴＰにより誘導されたこ
とが判明した。また、酸加水分解とそれに続くアミノ酸分析を用いて、ペプチド
：N-アセチル-Phe-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列番号:8)による誘導化の程度を決 定した。２組ずつ実施した分析によって、Ｐｈｅ：Ｌｙｓの比が０．６４および
０．５５、Ａｒｇ：Ｌｙｓの比が２．０および１．８を得た。したがって、ペプ
チド誘導化の程度は、リジン基を基準にして６２＋／−４％であった。方式Ｉに
より製造した別のサンプルでは、ペプチドのカップリング比は６６＋／−５％で
あることが判明した。方式ＩＩで製造したサンプルでは、ペプチドのカップリン
グ比は、７８＋／−９％であることが判明した。
【０１１４】 遊離実験 ＰＥＧ／Ｌｙｓコポリマーを含む本発明の担体とのそのジスルフィド結合の還
元的切断によるペプチド：N-アセチル-Phe-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列番号:8) の遊離を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３ｍＭグルタチオンを室温で用いて調べた
。各時点で、部分標本を取り、酸性にしてジスルフィド交換反応を停止させた。
ゲル濾過クロマトグラフィーによってＰＥＧ／Ｌｙｓ−ペプチド共役物から遊離
されたペプチドを除去し、ペプチド（すなわちＰｈｅまたはＡｒｇ残基）に対す
るＰＥＧ（すなわちＬｙｓ残基）の比をアミノ酸分析によって決定した。遊離は
比較的迅速でハーフタイムが約３分であることが判明した。高分子量グルタチオ
ン処理サンプル中のグリシンおよびグルタミン酸の存在は、グルタチオンがＰＥ
Ｇコポリマー上で遊離されたペプチドと入れ代わることを示した（データは提示
されていない）。
【０１１５】 また、ジスルフィド結合放射能標識ペプチド：N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-A
rg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列番号:9)およびN-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-
Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:3)を用いて遊離キネ ティクスを調べた。遊離ペプチドを限外濾過によってＰＥＧ／Ｌｙｓ−ペプチド
共役物から除去した。３ｍＭのグルタチオンを含むＰＢＳ中での遊離ハーフタイ
ムは、いずれのペプチドについても約３分であることが分かった。
【０１１６】 より緩徐な遊離速度を達成するために、抗体を毒素に連結するために以前に提
唱されたように7、立体的に拘束されたシステアミン類似体、１−アミノ−２− メチル−２−プロパンチオールのＰＥＧ／Ｌｙｓ誘導体を合成した。放射能標識
ペプチド：N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-
Cys-NH2 (配列番号:3)の遊離速度の分析によって、３０ｍＭのグルタチオンの存
在下で約４０分のハーフタイムが得られた（図６）。ジスルフィド切断速度はグ
ルタチオン濃度に比例するので8、立体的に拘束されたリンカーは、チオール化 合物がシステアミンである本発明の担体の場合よりも約１００倍遅い遊離速度を
もつ。したがって、遊離速度は、チオール化合物がポリマーに共役され、ジスル
フィド結合を介して治療薬に共役される、官能基をもつチオール化合物を選択す
ることによって容易に制御することができる。
【０１１７】 本発明の担体に共役された治療薬の生体利用性 治療薬が本発明の担体に共役された当該担体の生体利用性に対する影響を知る
ために、N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cy
s-NH2 (配列番号:3)のアミノ酸配列を有するＴａｔ抑制ポリペプチド誘導体を、
１１番目のシステイン残基によるジスルフィド結合を介して本発明の担体に共役
させた。この実施例で用いられた本発明の担体は、分子量が約２７０００Ｄ（２
．６９ｘ１０4Ｄ）のポリエチレングルコール／リジンコポリマーを含むポリマ ーを含んでいた。このポリマーに共役された少なくとも１つのチオール化合物は
システアミンであった。特に、システアミンは、ポリマーのリジンのカルボン酸
基に共役された（以下では"システアミン−ＰＥＧ担体"と称する）。 続いて、配列番号：３のアミノ酸配列の単独でＴＡＲＲＮＡとのＴａｔ結合を
抑制する能力を、本発明の担体と共役させたアミノ酸配列のＴＡＲＲＮＡとのＴ
ａｔ結合を抑制する能力と比較するために実験を実施した。この実験の結果は図
７に示されている。
【０１１８】 最初に、ジャーカット（Jurkat）細胞株をＴＡＲ−ＣＡＴプラスミドで安定に
トランスフェクトした。時間（ｔ）＝０で、細胞をＴａｔ−蛋白質プラスミドを
トランスフェクトした。続いて細胞を１０％ウシ胎児血清中で１８時間増殖させ
た。ｔ＝１８時間で、配列番号：３の配列を有するビオチン付加Ｔａｔペプチド
抑制物質（遊離しているか、またはジスルフィド結合を介して本発明の担体に結
合されている）を、各々図７のグラフのｘ軸に表示されている濃度で添加した。
この本発明の担体に付加されている抑制物質の場合、当該担体は、ポリマーに共
役されたシステアミンを有する、分子量が約２７０００Ｄ（２．６９ｘ１０4Ｄ ）のＰＥＧ／Ｌｙｓコポリマーを含み、ジスルフィド結合は、配列番号：３のア
ミノ酸配列を有する抑制物質とシステインの間で形成されていた。ｔ＝４２時間
で、細胞を採集し、免疫アッセイによってＣＡＴ蛋白質を測定した。図７に示し
た各データの点は別々の３組の細胞培養の平均である。遊離および結合ペプチド
の低濃度についてのそれぞれのデータは並列した実験で得られ、一方、高濃度に
ついてのデータは別々の実験で得られた。高濃度の抑制物質での２０−２５％の
残留ＣＡＴ活性は、おそらく、培養液に抑制物質が添加され細胞に取り込まれる
前にすでに合成されたＣＡＴ蛋白質を示しているのであろう。
【０１１９】 驚くべきことに、本発明の担体に結合されたビオチン付加Ｔａｔ−ペプチド抑
制物質（配列番号：３のアミノ酸配列を含む）は、単独で投与されたビオチン付
加Ｔａｔペプチド抑制物質の能力と比較してさらに約５倍能力が増加した。した
がって、本発明の担体は、チオール基を含む治療薬の能力および生体利用性の強
化に寄与する。
【０１２０】 考察 本明細書では、可逆的に本発明の担体と結合された治療薬のin vivoデリバリ ー用担体、およびそのような担体を製造する方法が開示される。この可逆性結合
はジスルフィド結合で、これは、細胞のサイトゾルで豊富に見出される生理学的
な関わりを有する還元剤であるグルタチオンによって切断される。 特に、本発明の担体からのペプチドのような治療薬の遊離を３ｍＭの還元グル
タチオンを含むＰＢＳ中で調べた（このグルタチオン濃度は、ほとんどの組織の
細胞で見出される濃度に近似する9）。血中の還元グルタチオン濃度は１０μＭ の濃度であるので10、ジスルフィド結合を介して本発明の担体に共役された治療
薬は、細胞外環境下では本発明の担体にほとんど結合したままであろう。より重
要なことには、治療薬は細胞内への進入に際して本発明の担体から遊離される。
【０１２１】 さらにまた、本明細書で開示した実施例で用いられたペプチド：N-アセチル-A
rg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:3)は
、上記で詳述したように代表的なＴａｔ抑制ペプチド誘導体である。付加したビ
オチン部分はこのペプチドの細胞取り込みを高めることが判明した11。そのよう
な細胞取り込み促進物質は、治療薬に結合させるか、または本発明の担体のポリ
マーに結合することができる。したがって、本発明の担体は、当該担体がなけれ
ば細胞膜を通過するために不可欠である薬理学的特性をもたない治療薬を細胞内
の疾患関連標的に到達させるための運搬体を提供する。付加されたＣｙｓは、担
体とジスルフィド結合を形成するために治療薬のチオール基として機能する。 さらに、図７に示したデータは、本発明の担体に共役されたとき治療薬は能力
が高められることを明瞭に示している。そのような能力の増強は、本発明の担体
がそれに共役された治療薬に提供する保護作用および生体利用性の強化の反映で
ある。
【０１２２】 本発明を種々の特定の材料、手順および具体例によって詳細に説明してきたが
、本発明は、そのような目的のために選択された特定の材料、材料の組合せおよ
び手順に限定されないことは理解されよう。当業者には明白であるが、多数の変
型例が暗示されている。 以下は、上記の開示に関連する、特に実験手順および考察に関連する文書のリ
ストである。これら文書は参照により本明細書に含まれる。 文献リスト 1. Duncan, R. and Kopacek, J. (1984) Soluble synthetic polymers as poten
tial drug carriers. Adv. Polym. Sci. 57, 53-101. 2. Davis, S., Abuchowski, A., Park, Y. K. and Davis, F. F. (1981) Altera
tion of the circulating half life and antigenic properties of bovine ade
nosine deaminase in mice by attachment of polyethylene glycol. Clin. Exp
. Immunol. 46, 649-652. 3. Nathan, A., Zalipsky, S., Ertel, S. I., Agathos, S. N., Yarmush, M. L
. and Kohn, J. (1993) Copolymers of lysine and polyethylene glycol: A ne
w family of functionalized drug carriers. Bioconj. Chem. 4, 54-62. 4. Woghiren, C., Sharma, B. and Stein, S. (1993) Protected thiolpolyethy
lene glycol: A new activated polymer for reversible protein modification
. Bioconj. Chem. 4, 314-318. 5. D. R. Grasseti and J. F. Murray. J. R. (1967) Determination of sulfhy
dryl groups with 2,2'- or 4,4'- dithiodipyridine. Arch. Biochem. Biophys
. 119, 41-49. 6. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., and Zerner, B. (1979) Ellman's reage
nt: 5,5' Dithobis(2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Anal. Biochem. 9
4, 75-81. 7. Goff, D. A. and Carroll, S. F. (1990) Substituted 2-iminothiolanes: R
eagents for the preparation of disulfide cross-linked conjugates with in
creased stability. Bioconj. Chem. 1, 381-386. 8. Trimble, S. P., Marquardt, D. and Anderson, D. C. (1997) Use of disig
ned peptide linkers and recombinant hemoglobin mutants for drug delivery
: In vitro release of an angiotensin II analog and kinetic modeling of d
elivery. Bioconj. Chem. 8, 416-423. 9. Meister, A., Griffith, O. W. and Tate, S. S. (1979) New aspects of gl
utathione metabolism and translocation in mammals. Ciba Foundation Sympo
sium 72, 135-161. 10. Meister, A. (1991) Glutathione deficiency produced by inhibition of
its synthesis and its reversal; applications in research and therapy. Ph
armacol. Ther. 51, 155-194. 11. Choudhury, I., Wang, J., Rabson, A. B., Stein, S., Pooyan, S., Stein
, S. and Leibowitz, M. J. (1998) Inhibition of HIV-1 replication by a Ta
t RNA binding domain peptide analog. J. Acqu. Immune Def. Syndr. & Human
Retrovirol., 17, 104-111. さらにまた、前出の一切の参考文献もまた参照により本明細書に含まれる。 本発明の範囲を逸脱することなく本発明の他の多くの変型および改変が当業者
には明白であろう。上記の開示はしたがって単なる典型例であって、上記にいう
全ての変型および改変は、添付の請求の範囲に規定される本発明の範囲内に包含
しようとするものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を製造する方式 Ｉの模式図である。
【図２】 図２は、チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体を製造する方式 ＩＩの模式図である。
【図３】 図３は、ＰＥＧ−システアミン−チオピリジン（ＰＥＧ−システアミン−ＴＰ
）とペプチド：N-アセチル-Phe-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2 (配列番号:8)との反応の 分光分析である。ＰＥＧ−システアミン−ＴＰの溶液のＵＶスペクトルは示す実
線で示す。ペプチドの付加は２−チオピリドンの遊離をもたらすが、これは３４
３ｎｍで最大を示すピークとして認められる（点線）。
【図４】 図４は、ＰＥＧ−システアミン−ＴＰとペプチド：N-アセチル-Phe-Arg-Arg-A
rg-Cys-NH2 (配列番号:8)との反応混合物から得られた生成物のゲル濾過クロマ トグラフィーによる精製を示すグラフである。３４３ｎｍでの吸収に対応する低
分子量分画の遊離２−チオピリジンの存在に注意されたい。
【図５】 図５は、ＰＢＳ中の３ｍＭグルタチオンによってＰＥＧ−システアミン−ペプ
チドから遊離される、放射能標識ペプチドの遊離タイムコースを示すグラフであ
る。データはセミログプロットとして表示されている。２つのまた別の実験で本
質的に同じ遊離キネティクスが得られた。
【図６】 図６は、ＰＢＳ中の３０ｍＭグルタチオンによってＰＥＧ−１−アミノ−２−
プロパンチオール−ペプチドから遊離される、放射能標識ペプチドの遊離タイム
コースを示すグラフである。点線は、Ｃ＝Ｃinitialｅ-ktの理論的プロットであ
る。初期時点のデータのセミログプロットは挿入図で示されている。２つのまた
別の実験で本質的に同じ遊離キネティクスが得られた。
【図７】 図７は、ＴＡＲ−ＣＡＴ（ＴＡＲ−クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ）プラスミドおよびＴａｔ−蛋白質プラスミドをトランスフェクトされ
たジャーカット細胞株での蛋白質発現の抑制を比較したグラフである。この実験
では、１つの群の細胞に、N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-L
ys-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:3)の配列を有するビオチン付加Ｔａｔ抑制ポ
リペプチド誘導体を与え、別の群の細胞には、チオール化合物のチオール基のイ
オウ原子とＣｙｓ残基（配列番号：３のビオチン付加Ｔａｔ抑制ポリペプチド誘
導体のアミノ基とビオチンの間に存在する）のチオール基との間のジスルフィド
結合を介して本発明の担体に共役させた同じビオチン付加Ｔａｔ抑制ペプチド誘
導体を与えた。この実験で用いた担体のポリマーは約２７０００Ｄ（６．２９ｘ
１０4）の分子量を有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびリジンのコ ポリマーを含んでいた。システアミンはこのポリマーに共役されたチオール化合
物である。システアミンのポリマーへの共役は、反応に利用できるコポリマーに
取り込まれているリジンのカルボン酸基を必要とする。ポリペプチドがＴＡＲと
Ｔａｔとの結合を抑制することができる場合は、ＣＡＴが生成されているであろ
う。したがって、ＣＡＴのアッセイを抑制測定に用いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 レイボウィッツ マイケル ジェイ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07726−2603 マナラパン バロン コー ト ３ Ｆターム(参考） 4C076 AA95 CC35 CC41 DD50 DD51 DD61 EE06 EE08 EE16 EE19 EE23 EE26 EE33 EE38 EE48 EE56 FF02 FF32 FF34 4C084 AA02 BA32 CA59 DC50 MA02 MA05 NA14 ZB331 ZC551

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下を含む、チオール基含有治療薬のin vivoデリバリー用 担体： ａ）ポリマー；および ｂ）少なくとも１つのチオール化合物であって、前記チオール化合物のチオー
    ル基および前記治療薬のチオール基がジスルフィド結合を形成できるように前記
    ポリマーに共役されている前記チオール化合物。
  2. 【請求項２】 前記ポリマーが分枝または直鎖構造を含む請求項１の担体。
  3. 【請求項３】 前記ポリマーが水溶性ポリマーである請求項１の担体。
  4. 【請求項４】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、カルボキ
    シメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
    ドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリア
    ミノ酸、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコー
    ルのコポリマー、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸、ポリ
    エチレングリコールおよびアミノ酸のコポリマー、プロピレンオキシド／エチレ
    ンオキシドのコポリマー、およびポリエチレングリコール／チオリンゴ酸のコポ
    リマーから成る群から選ばれる請求項３の担体。
  5. 【請求項５】 前記ポリマーが約１０００から約１００００００ダルトンの
    範囲の分子量、好ましくは約２００００から２０００００ダルトンの範囲の分子
    量を有する請求項１の担体。
  6. 【請求項６】 前記ポリマーが約２７０００ダルトンの分子量を有する請求
    項５の担体。
  7. 【請求項７】 前記少なくとも１つのチオール化合物が前記ポリマーにある
    間隔で結合される請求項１の担体。
  8. 【請求項８】 前記間隔が約１００から約１００００ダルトン、好ましくは
    約３００から約３０００ダルトンである請求項７の担体。
  9. 【請求項９】 前記ポリマーが、前記ポリマーに結合されていて、さらに前
    記チオール化合物との反応に利用できる少なくとも１つの官能基を含み、その結
    果、前記少なくとも１つのチオール化合物が前記少なくとも１つの官能基と共役
    できる請求項１の担体。
  10. 【請求項１０】 前記少なくとも１つの官能基が前記ポリマーにある間隔で
    結合される請求項９の担体。
  11. 【請求項１１】 前記間隔が約１００から約１００００ダルトン、好ましく
    は約３００から約３０００ダルトンである請求項１０の担体。
  12. 【請求項１２】 前記官能基がケトン、エステル、カルボン酸、アルデヒド
    、アルコール、チオールまたはアミンを含む請求項１１の担体。
  13. 【請求項１３】 前記チオール化合物がシステアミン、１−アミノ−２−メ
    チル−２−プロパンチオール、または１−アミノ−２−プロパンチオールを含む
    請求項１の担体。
  14. 【請求項１４】 前記ポリマーに共役された細胞取り込み促進物質をさらに
    含む請求項１の担体。
  15. 【請求項１５】 前記細胞取り込み促進物質がビオチンである請求項１の担
    体。
  16. 【請求項１６】 チオール基を含む前記治療薬がそれに共役された細胞取り
    込み促進物質をさらに含む請求項１の担体。
  17. 【請求項１７】 前記治療薬に共役された前記細胞取り込み促進物質がビオ
    チンである請求項１６の担体。
  18. 【請求項１８】 チオール基を含む前記治療薬が、下記式Ｉのアミノ酸配列
    、その類似体、並びに生物学的および医薬的に許容可能なその塩、そのような異
    性体が存在する場合は、その立体、光学および幾何学異性体並びに医薬的に許容
    できるその塩および溶媒和物を含むＴａｔ抑制ポリペプチドを含む請求項１の担
    体： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基を含み、さらにＸはＣｙｓまたは
    Ｌｙｓ残基である。
  19. 【請求項１９】 チオール化合物を含む前記治療薬が以下のアミノ酸配列を
    含む請求項１８の担体： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:4)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:5)、 N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:6)、又は、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:7)。
  20. 【請求項２０】 チオール基を含む前記治療薬が、以下のアミノ酸配列、そ
    の類似体もしくは誘導体、または生物学的および医薬的に許容可能なその塩を含
    むＴａｔ抑制ポリペプチドを含む請求項１の担体： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
    DArg-NH2
  21. 【請求項２１】 以下の工程を含む、チオール基含有治療薬のin vivoデリ バリー用担体の製造方法であって、前記担体がポリマーおよび少なくとも１つの
    チオール化合物を含み、前記チオール化合物が前記ポリマーに、前記少なくとも
    １つのチオール化合物のチオール基と前記治療薬のチオール基とがジスルフィド
    結合を形成できるように共役されている前記in vivoデリバリー用担体： ａ）少なくとも１つのチオール化合物をジスルフィド化合物と反応させて、チ
    オール化合物のチオール基とジスルフィド化合物のジスルフィド結合のイオウ原
    子とがジスルフィド結合を形成する第一の中間体を生成し；さらに、 ｂ）第一の中間体をポリマーと反応させて、チオール基を含む治療薬と反応で
    きる担体を生成し、それによって、前記担体に共役された少なくとも１つのチオ
    ール化合物のイオウ原子と前記治療薬のチオール基とがジスルフィド結合を形成
    できる。
  22. 【請求項２２】 工程（ａ）の前記ジスルフィド化合物が対称性である請求
    項２１の方法。
  23. 【請求項２３】 前記ジスルフィド化合物が２，２'−ジチオジピリジンで ある請求項２２の方法。
  24. 【請求項２４】 前記ポリマーが分枝または直鎖構造を含む請求項２１の方
    法。
  25. 【請求項２５】 前記ポリマーが水溶性ポリマーである請求項２１の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、カルボキシメ
    チルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン
    、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ
    酸、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールの
    コポリマー、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸、ポリエチ
    レングリコールおよびアミノ酸のコポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオ
    キシドのコポリマー、およびポリエチレングリコール／チオリンゴ酸のコポリマ
    ーを含む請求項２５の方法。
  27. 【請求項２７】 前記ポリマーが約１０００から約１００００００ダルトン
    の範囲の分子量、好ましくは約２００００から２０００００ダルトンの範囲の分
    子量を有する請求項２１の方法。
  28. 【請求項２８】 前記ポリマーが約２７０００ダルトンの分子量を有する請
    求項２７の方法。
  29. 【請求項２９】 前記少なくとも１つのチオール化合物が前記ポリマーにあ
    る間隔で共役される請求項２１の方法。
  30. 【請求項３０】 前記間隔が約１００から約１００００ダルトン、好ましく
    は約３００から約３０００ダルトンである請求項２９の方法。
  31. 【請求項３１】 前記チオール化合物がシステアミン、１−アミノ−２−メ
    チル−２−プロパンチオール、または１−アミノ−２−プロパンチオールを含む
    請求項２１の方法。
  32. 【請求項３２】 前記ポリマーを第一の中間体と反応させる前に前記ポリマ
    ーに細胞取り込み促進物質を共役させる工程をさらに含む請求項２１の方法。
  33. 【請求項３３】 前記細胞取り込み促進物質がビオチンである請求項３２の
    方法。
  34. 【請求項３４】 前記ポリマーが、それに結合した反応に利用できる少なく
    とも１つの官能基を含み、さらに工程（ｂ）が、第一の中間体を少なくとも１つ
    の官能基を含むポリマーと反応させ、第一の中間体が前記ポリマーに結合してい
    る少なくとも１つの官能基に共役される担体を生成する工程を含む請求項２１の
    方法。
  35. 【請求項３５】 前記少なくとも１つの官能基が前記ポリマーにある間隔で
    結合される請求項３４の方法。
  36. 【請求項３６】 前記間隔が約１００から約１００００ダルトン、好ましく
    は約３００から約３０００ダルトンである請求項３５の方法。
  37. 【請求項３７】 前記少なくとも１つの官能基がケトン、エステル、カルボ
    ン酸、およびアルデヒド、アルコール、チオールまたはアミンを含む請求項３５
    の方法。
  38. 【請求項３８】 細胞取り込み促進物質が治療薬に共役される請求項２１の
    方法。
  39. 【請求項３９】 前記細胞取り込み促進物質がビオチンである請求項３８の
    方法。
  40. 【請求項４０】 チオール基を含む前記治療薬が、下記式Ｉのポリペプチド
    、その類似体、並びに生物学的および医薬的に許容可能なその塩、そのような異
    性体が存在する場合は、その立体、光学および幾何学異性体並びに医薬的に許容
    できるその塩を含むＴａｔ抑制ポリペプチドを含む請求項３９の方法： 配列番号：１ R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基を含み、さらにＸはＣｙｓまたは
    Ｌｙｓ残基である。
  41. 【請求項４１】 前記治療薬が以下のアミノ酸配列を含む請求項４０の方法
    ： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:4)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:5)、 N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:6)又は、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys(ビオチン)-Cys-NH2 (配
    列番号:7)。
  42. 【請求項４２】 前記治療薬が、以下のアミノ酸配列、その類似体または誘
    導体、並びに生物学的および医薬的に許容可能なその塩を含むＴａｔ抑制結合蛋
    白質を含む請求項３９の方法： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
    DArg-NH2
  43. 【請求項４３】 以下の工程を含む、チオール基を含む治療薬のin vivoデ リバリー用担体の製造方法であって、前記担体が、ポリマーおよび前記ポリマー
    に共役された少なくとも１つのチオール化合物を含み、それによって前記チオー
    ル化合物のチオール基と前記治療薬のチオール基とがジスルフィド結合を形成で
    きる前記in vivoデリバリー用担体の製造方法： ａ）第一のチオール化合物を第二のチオール化合物と反応させて、第一のチオ
    ール化合物のチオール基と第二のチオール化合物のチオール基とがジスルフィド
    結合を形成する第一の中間体を生成し； ｂ）第一の中間体をポリマーと反応させて、第一の中間体がポリマーに共役さ
    れている第二の中間体を生成し； ｃ）第二の中間体のジスルフィド結合を還元して、ポリマーおよび、チオール
    化合物のチオール基が反応に利用できるように前記ポリマーに共役された第一の
    チオール化合物を含む第三の中間体を生成し；さらに ｄ）第三の中間体をジスルフィド化合物と反応させ、第一のチオール化合物の
    チオール基とジスルフィド化合物のジスルフィド結合のイオウ原子とがジスルフ
    ィド結合を形成する担体を生成し、それによって第一のチオール化合物のイオウ
    原子と治療薬のチオール基とがジスルフィド結合を形成できるように前記担体を
    生成する。
  44. 【請求項４４】 前記工程（ｄ）のジスルフィド化合物が対称性である請求
    項４３の方法。
  45. 【請求項４５】 前記ジスルフィド化合物が２，２'−ジチオジピリジンで ある請求項４４の方法。
  46. 【請求項４６】 前記ポリマーが分枝または直鎖構造を含む請求項４３の方
    法。
  47. 【請求項４７】 前記ポリマーが水溶性ポリマーである請求項４３の方法。
  48. 【請求項４８】 前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、カルボキシメ
    チルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン
    、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ
    酸、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールの
    コポリマー、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸、ポリエチ
    レングリコールおよびアミノ酸のコポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオ
    キシドのコポリマー、またはポリエチレングリコール／チオリンゴ酸のコポリマ
    ーを含む請求項４７の方法。
  49. 【請求項４９】 前記ポリマーが約１０００から約１００００００ダルトン
    の範囲の分子量、好ましくは約２００００から２０００００ダルトンの範囲の分
    子量を有する請求項４３の方法。
  50. 【請求項５０】 前記ポリマーが約２７０００ダルトンの分子量を有する請
    求項４９の方法。
  51. 【請求項５１】 前記少なくとも１つのチオール化合物が前記ポリマーにあ
    る間隔で共役される請求項４３の方法。
  52. 【請求項５２】 前記間隔が約１００から約１００００ダルトン、好ましく
    は約３００から約３０００ダルトンである請求項５１の方法。
  53. 【請求項５３】 前記ポリマーが、それに結合した反応に利用できる少なく
    とも１つの官能基を含み、さらに工程（ｂ）が、第一の中間体を前記ポリマーに
    結合した少なくとも１つの官能基を含む前記ポリマーと反応させて、第一の中間
    体が少なくとも１つの官能基に共役している第二の中間体を生成する工程を含む
    請求項４１の方法。
  54. 【請求項５４】 前記少なくとも１つの官能基が前記ポリマーにある間隔で
    結合される請求項５３の方法。
  55. 【請求項５５】 前記間隔が約１００から約１００００ダルトン、好ましく
    は約３００から約３０００ダルトンである請求項５４の方法。
  56. 【請求項５６】 前記少なくとも１つの官能基が、ケトン、エステル、カル
    ボン酸、アルデヒド、アルコール、チオールまたはアミンを含む請求項５４の方
    法。
  57. 【請求項５７】 前記チオール化合物がシステアミン、１−アミノ−２−メ
    チル−２−プロパンチオール、または１−アミノ−２−プロパンチオールを含む
    請求項４１の方法。
  58. 【請求項５８】 ポリマーを第一の中間体と反応させる前に、細胞取り込み
    促進物質をポリマーに共役させる工程をさらに含む請求項４１の方法。
  59. 【請求項５９】 前記細胞取り込み促進物質がビオチンである請求項５８の
    方法。
  60. 【請求項６０】 ａ）ポリマーおよびｂ）前記ポリマーに共役された、少な
    くとも１つの官能基を含む少なくとも１つのチオール化合物を含む、チオール基
    含有治療薬のin vivoデリバリー用担体であって、前記少なくとも１つのチオー ル化合物の前記チオール基と前記治療薬のチオール基とがジスルフィド結合を形
    成でき、さらに、前記治療薬が担体から遊離できるようにジスルフィド結合がin
    vivoで還元される速度が、前記少なくとも１つのチオール化合物と結合してい る前記少なくとも１つの官能基のサイズに依存する前記in vivoデリバリー用担 体。
  61. 【請求項６１】 チオール基を含む治療薬のin vivoデリバリー用担体の治 療的に有効な量を哺乳類に投与することを含む哺乳類でウイルス感染を治療する
    方法であって、前記担体が、 ａ）ポリマー；および ｂ）少なくとも１つのチオール化合物であって、前記チオール化合物のチオー
    ル基と前記治療薬のチオール基とがジスルフィド結合を形成できるように前記ポ
    リマーに共役されている前記少なくとも１つのチオール化合物を含み、さらに、 前記治療薬がＴａｔ抑制ポリペプチド類似体またはその誘導体である前記ウイ
    ルス感染の治療方法。
  62. 【請求項６２】 前記Ｔａｔ抑制ペプチド誘導体が、下記式、その類似体、
    並びに生物学的および医薬的に許容可能なその塩、そのような異性体が存在する
    場合は、その立体、光学および幾何学異性体並びに医薬的に許容できるその塩お
    よび溶媒和物を含む請求項６１の方法： R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(ビオチン)-Cys-NH2 (配列番号:1) 式中、Ｒはカルボン酸残基またはアセチル基を含み、さらにＸはＣｙｓまたは
    Ｌｙｓ残基である。
  63. 【請求項６３】 前記Ｔａｔ抑制結合ペプチド誘導体が以下のアミノ酸配列
    を含む請求項６２の方法： N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:2)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2 ( 配列番号:3)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Cys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:4)、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:5)、 N-アセチル-Gln-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-D-Lys-(ビオチン)-Cys-NH2
    (配列番号:6)又は、 N-アセチル-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Cys(ビオチン)-Cys-NH2 (配
    列番号:7)。
  64. 【請求項６４】 前記Ｔａｔ抑制結合ペプチドが以下のアミノ酸配列、その
    類似体もしくは誘導体、並びに生物学的および医薬的に許容可能なその塩を含む
    請求項６１の方法： N-アセチル-DCys-DLys-(ビオチン)-DArg-DArg-DArg-DGln-DArg-DArg-DLys-DLys-
    DArg-NH2
  65. 【請求項６５】 前記ウイルス感染がエイズである請求項６１、６２、６３
    、または６４のいずれかの方法。
  66. 【請求項６６】 前記哺乳類がヒトを含む請求項６５の方法。
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