[go: up one dir, main page]

JP2002507186A - Antisense oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and uses thereof - Google Patents

Antisense oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and uses thereof

Info

Publication number
JP2002507186A
JP2002507186A JP51182692A JP51182692A JP2002507186A JP 2002507186 A JP2002507186 A JP 2002507186A JP 51182692 A JP51182692 A JP 51182692A JP 51182692 A JP51182692 A JP 51182692A JP 2002507186 A JP2002507186 A JP 2002507186A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
oligodeoxynucleotide
oligonucleotide
kit
mer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
JP51182692A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
エム ゲヴィルツ，アラン
カラブレッタ，ブルーノ
Original Assignee
テンプル ユニバーシティ−オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by テンプル ユニバーシティ−オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション filed Critical テンプル ユニバーシティ−オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション
Publication of JP2002507186A publication Critical patent/JP2002507186A/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが提供される。これら「アンチセンス」オリゴヌクレオチドはｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズすることができる。この種のオリゴヌクレオチドは、特に赤血球の過剰生産に基づくヘマトクリット値の上昇を特徴とする障害にて赤血球の増殖を選択的に阻止するのに有用である。さらにアンチセンスオリゴマーは血液学的腫瘍細胞に対する活性を有し、したがって骨髄浄化剤として適している。 (57) Abstract: An oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to at least a portion of an mRNA transcript of a human c- kit gene is provided. These "antisense" oligonucleotides are capable of hybridizing to the c- kit mRNA transcript. Oligonucleotides of this type are particularly useful for selectively inhibiting the growth of red blood cells in disorders characterized by elevated hematocrit due to overproduction of red blood cells. Furthermore, antisense oligomers have activity against hematological tumor cells and are therefore suitable as bone marrow purifiers.

Description

【発明の詳細な説明】 ｃ−ｋｉｔプロト−オンコ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよ びその使用 発明の分野 本発明は、プロト−オンコ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 特にｃ−ｋｉｔ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに或る種 の細胞の増殖を選択的に抑制するための前記オリゴヌクレオチドの使用に関する ものである。 政府認可の説明 ここに記載した発明は、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス認可Ｃ Ａ ３６８９６およびＣＡ ０１３２４によって１部支持された。米国政府は本 発明に所定の権利を有する。 発明の背景 ｃ−ｋｉｔ遺伝子はｖ−ｋｉｔ、すなわちＨＺ４ネコ肉腫ウィルスオンコ遺伝 子の通常の同族体である。これはヒト染色体４に存在する。この遺伝子は、コロ ニー刺戟因子−１および血小板由来の成長因子のためのリセプタに高度に関連す ると思われるチロシンキナーゼ活性を持ったダイマー経膜糖蛋白リセプタをコー ドする［ヤーデン等、ＥＭＢＯジャーナル、第６巻、第３３４１〜３３５１頁（ １９８７）］。これらリセプタと同様に、ｃ −ｋｉｔも免疫グロブリン遺伝子の上科に属すると思われる。 マウスｃ−ｋｉｔ遺伝子は染色体５までマッピングされており、優性白色斑点 位置（Ｗ）に対し対立性であることが決定された［シャボット等、ネイチャー、 第３３５巻、第８８〜８９頁（１９８８）］。ｃ−ｋｉｔ突然変異が一般にＷマ ウスで見られ、コート着色および性殖腺発生に影響を及ぼす異常性の他に各種の 造血上の欠点を示す。大赤血球性貧血症が最も顕著なこれら異常性の１つである 。特に重大な血液学的徴候に関連するＷ42突然変異は、１個のアミノ酸の置換お よび低下したチロシンキナーゼ活性をもたらすミスセンス突然変異に基づくこと が示されている［タン等、サイエンス、第２４７巻、第２０９頁（１９９０）］ 。この種の動物は、健康な野生型の同腹子の赤血球バースト形成単位の約１／３ を有することも知られている［ゴールドワザー等、Exp.Heme.、第１８巻、第９ ３６頁（１９９０）］。 今回、ｃ−ｋｉｔリセプタに関するリガンドが同定され、分子クローン化され 、かつ発現された［ヤーデン等、ＥＭＢＯジャーナル、第６巻、第３３４１〜３ ３５１頁（１９８７）］。幹細胞ファクター（ＳＣＦ）、マスト細胞成長因子（ ＭＧＦ）またはスチールファクター（ＳＬＦ）として知られるコードされた蛋白 は、スチール（Ｓ１）位置に存在する遺伝子の生産物である。Ｓ１突然変異を有 するマウスは、Ｗマウスと全く同様な表現型 異常性を有する。Ｗマウスは、ｃ−ｋｉｔによりコードされる重要な信号変換リ セプタを欠如し或いはこの信号変換リセプタに欠陥を有する。Ｓ１マウスは、リ セプタを刺戟するリガンドに欠陥を有する。 ヒト造血作用におけるｃ−ｋｉｔリガンド−リセプタ系の重要性は不明である 。対応位置におけるヒト突然変異については全く記載がない。マウスにおける研 究は、ヒト系に対する適用性が極めて低い。さらに、組織が特定メッセージを発 現することが示されたとしても、細胞表現型の発現に対するメッセージの重要性 は細胞からコード蛋白が除去されるまで知られない。生物学系は豊富である。蛋 白の欠損はしばしば同属の他の蛋白によって補うことができる。したがって、特 定遺伝子の発現抑制が表現型変化をもたらすと予測することはできない。 発明の要点 アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびこれと医薬キャリヤとの医薬組成物 が提供される。各オリゴヌクレオチドは、ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写 物の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する。このオリゴヌク レオチドはｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズすることができる。好ましくは 、オリゴヌクレオチドは少なくとも１２量体オリゴヌクレオチドであり、すなわ ち少なくとも１２個のヌクレオチド残基を有するオリゴマーである。特に、オリ ゴマーは有利には１２〜４０量体、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチドであ る。１２量体より小さいオリゴヌクレオチドも用いうるが、これらは標的でない 配列に対しハイブリダイズする傾向が統計的に大であり、この理由で特異性が低 い。さらに、単一のミスマッチではハイブリッドを不安定化させる。４０量体よ り大きいオリゴヌクレオチドも用いうるが、吸収はより困難である。さらに、長 い配列の部分的整合は非特異性のハイブリッド化および非特異性の作用をもたら しうる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１５〜３０量体オリゴデオキシヌク レオチドであり、より有利には１８〜２６量体である。１５〜２１量体が最も好 適である。 原理的にｃ−ｋｉｔ遺伝子の任意の領域に相補的な配列を有するオリゴヌクレ オチドを本発明に用いうるが、翻訳開始コドンを含むｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写 物の１部に対し相補的なオリゴヌクレオチドが特に好適である。さらに、翻訳開 始コドンから上流の約４０ヌクレオチド（５’方向）または下流の約４０ヌクレ オチド（３’方向）以内に位置するｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物の１部に対し相 補的なオリゴヌクレオチドも好適である。 さらに本発明は赤血球の増殖を抑制する方法をも提供し、この方法は処置を必 要とする宿主に対し本発明のｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効 量を投与することからなっている。 本発明は、処置を必要とする宿主またはこの宿主から集めた細胞に対し生体内 もしくは生体外にてｃ−ｋｉｔ アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を投与することからなるｃ−ｋｉｔ発 現を特徴とする血液学的腫瘍の処置方法を提供する。 ｃ−ｋｉｔオリゴヌクレオチドの投与は、悪性黒色腫および精巣もしくは卵巣 腫瘍の処置にも有用である。 本明細書にて用いる場合、特記しない限り、「オリゴヌクレオチド」という用 語はリボヌクレオチドのオリゴマー（すなわちオリゴリボヌクレオチド）および デオキシリボヌクレオチドのオリゴマー（すなわちオリゴデオキシリボヌクレオ チド、ここでは「オリゴデオキシヌクレオチド」とも称する）の両者を包含する 。オリゴデオキシヌクレオチドが好適である。 ここで用いる場合、特記しない限り、「オリゴヌクレオチド」という用語は「 ポリヌクレオチド」と称するのに充分な大きさとしうるオリゴマーをも包含する 。 「オリゴヌクレオチド」および「オリゴデオキシヌクレオチド」という用語は 生物学上重要なヌクレオチド、すなわちアデニン（「Ａ」）、デオキシアデニン （「ｄＡ」）、グアニン（「Ｇ」）、デオキシグアニン（「ｄＧ」）、シトシン （「Ｃ」）、デオキシシトシン（「ｄＣ」）、チミン（「Ｔ」）およびウラシル （「Ｕ」）のヌクレオチドのオリゴマーおよびポリマーだけでなく、他のヌクレ オチドをも含有しうるｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうる オリゴマーおよびポリマーをも包含する。同様に、「オリゴヌクレオチド」 および「オリゴデオキシヌクレオチド」という用語は１つもしくはそれ以上のプ リンもしくはピリミジン部分、糖部分またはヌクレオチド間の結合が化学的に改 変されたオリゴマーおよびポリマーも包含する。したがって「オリゴヌクレオチ ド」という用語は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の改変のため「オリゴ ヌクレオチド」と呼んでもよいオリゴマーを包含することも了解される。たとえ ば、この種の改変オリゴヌクレオチドは下記するアルキルホスホネートオリゴヌ クレオチドを包含する。 「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド間の 結合の１つもしくはそれ以上がホスホロチオエート基： であるオリゴヌクレオチドを意味し、未改変オリゴヌクレオチドの特徴であるホ スホジエステル基：とは異なる。 「アルキルホスホネートオリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド間 の結合の１つもしくはそれ以上がアルキルホスホネート基： ［式中、Ｒはアルキル基、好ましくはメチルもしくはエチルである］ であるオリゴヌクレオチドを意味する。 ヌクレオチド配列に沿った方向に関して用いる「下流」という用語は５’→３ ’方向を意味する。同様に、「上流」という用語は３’−５’方向を意味する。 「ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物」という用語は、ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子の現在 公知のｍＲＮＡ転写物または他の任意の解明しうる転写物を意味する。 図面の説明 第１図は、付着性のＴリンパ球欠失したヒト骨髄細胞（Ａ-Ｔ-ＭＮＣ）を２０ Ｕ／ｍｌのインターロイキン−３および５Ｕ／ｍｌのエリスロポイエチンにより 剌戟した後の所定間隔におけるｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡの増加を示す逆転写−ポリ メラーゼ連鎖反応ゲルの放射能写真である：レーン１（ｔ＝０）；レーン２（２ 時間）；レ ーン３（８時間）：レーン４（１２時間）；レーン５（２４時間）；レーン６（ ３６時間）；レーン７（４８時間）；レーン８（Ｈ2Ｏ比較）。 第２図は、５％ＡＢ血清におけるインターロイキン−３およびエリスロポイエ チンにより刺戟した後のＡ-Ｔ-ＭＮＣにおけるｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡレベルに対 するｃ−ｋｉｔオリゴマー露出の効果を示す同様な放射能写真である。レーン１ （オリゴマーなし、ｔ＝０）；レーン２（オリゴマーなし、ｔ＝３６時間）；レ ーン３（センスオリゴマー、３６時間）：レーン４（アンチセンス、３６時間） ；レーン５（同一の塩基含有量を有するスクランブル配列、３６時間）。 第３図は、ＢＦＵ−Ｅ−由来のコロニー形成に対するｃ−ｋｉｔオリゴデオキ シヌクレオチドの作用を示す。オリゴマーは時間０にて培養物に添加し、初期投 入量の５０％を再び１８時間後に添加した。グラフにおける棒線は次のことを示 す：１、未処理比較細胞；２、２０μｇ／ｍｌに続く１０μｇ／ｍｌのアンチセ ンス処理；３、４０μｇ／ｍｌに続く２０μｇ／ｍｌのアンチセンス処理；４、 １００μｇ／ｍｌに続く５０μｇ／ｍｌのアンチセンス処理；５、１００μｇ／ ｍｌに続く５０μｇ／ｍｌのセンス処理；６、１００μｇ／ｍｌに続く５０μｇ ／ｍｌのスクランブル配列処理。 発明の詳細な説明 ｃ−ｋｉｔ遺伝子はヒト造血作用において極めて重要 であることを突き止めた。さらに、この遺伝子が発現する蛋白、すなわちチロシ ンキナーゼのためのリセプタは、インターロイキン−３（ＩＬ−３）と調和作用 して細胞増殖（特に赤血球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）を最適化する信号を 変換することも突き止めた。 ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対し相補的な推定ＤＮＡ配列がヤー デン等、ＥＭＢＯジャーナル、第６巻、第３３４１〜３３５１頁（１９８７）に 報告されており、その全開示を参考のためここに引用する。ヌクレオチド配列お よび推定アミノ酸配列を第３図に示す。ｃ−ｋｉｔポリペプチドは、９７６アミ ノ酸ポリペプチドをコードする解放読枠を含有した単一５−ｋｂ ｍＲＮＡの翻 訳によって合成される。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意公知の化学的オリゴヌクレ オチド合成法によって合成することができる。この種の方法は一般に、たとえば ウィナカー、「遺伝子からクローンまで：遺伝子工学の序論」、ＶＣＨフェアラ ークスゲゼルシャフトｍｂＨ社、Ｈ．アイベルガウフツ・トランスレーション（ １９８７）に記載されている。 任意公知のオリゴヌクレオチド合成法を、本発明のアンチセンスオリゴヌクレ オチドを作成する際に用いることができる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは最も有利には、市販入手しうる自動化され た核酸合成装置、たとえばβ− シアノエチルホスホルアミダイト化学を利用するアプライド・バイオシステムス ３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置を用いて作成される。 ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物に対し相補的なＤＮＡの完全ヌクレオチド合成は 公知であるので、ｍＲＮＡ転写物の任意の部分にハイブリダイズしうるアンチセ ンスオリゴヌクレオチドは当業者に公知のオリゴヌクレオチド合成法によって作 成することができる。 任意の長さのオリゴヌクレオチドを本発明の実施に用いうるが、１２ヌクレオ チドよりも短い配列は標的ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡに対しハイブリダイズする特異 性が低く、酵素切断によって容易に破壊され、さらに単一の塩基対ミスマッチに よってさえ不安定化されうる。したがって、１２個もしくはそれ以上のヌクレオ チドを有するオリゴヌクレオチドが好適である。 長い配列、特に約４０ヌクレオチドよりも長い配列は、標的細胞による吸収の 低下のため、ｃ−ｋｉｔ翻訳を抑制する効果が若干低い。したがって、１２〜４ ０ヌクレオチドのオリゴマーが好適であり、より好ましくは１５〜３０ヌクレオ チド、特に好ましくは１８〜２６ヌクレオチドである。１８〜２１ヌクレオチド の配列が特に好適である。１８〜２１ヌクレオチドの配列が未改変のオリゴヌク レオチドにつき特に好適であるが、約２６ヌクレオチドまでの若干長い連鎖が改 変オリゴヌクレオチド（例えばホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）に対 し好適であり、この改変オリゴヌクレオチドはｍＲＮＡに対し未改変オリゴヌク レオチドよりも弱くハイブリダイズする。 ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物の任意の部分に対し相補的かつハイブリダイズし うるオリゴヌクレオチドは原理的に転写物の翻訳を抑制するのに有効であり、こ こに記載した作用を誘発することができる。翻訳は、開始コドンの部位またはそ れに近い部位にてｍＲＮＡを遮蔽することにより最も効果的に抑制されると思わ れる。したがって、ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物の５’−末端領域に対し相補的 なオリゴヌクレオチドが好適である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは蛋白合 成のための開始コドンの部位またはそれに近い部位に指向する。次の４０量体オ リゴデオキシヌクレオチドは、転写物の開始コドンから始まって下流（５’方向 ）に延びるｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物に対し相補的である：ＧＡＡＣＧＣＡＧ ＡＧ ＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧ ＧＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＣＡＴ（ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）。 上記配列に基づく小型オリゴマー、特に開始コドンを有するｃ−ｋｉｔメッセ ージのセグメントに対しハイブリダイズしうるオリゴマーを用いることができる 。次の１５〜２６量体が特に好適である： （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２） （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３）。 本発明により用いうるｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしう るオリゴヌクレオチドは生物学上重要なヌクレオチド、すなわちＡ、ｄＡ、Ｇ、 ｄＧ、Ｃ、ｄＣ、ＴおよびＵの天然オリゴマーだけでなく、改良された安定性お よび／または脂質溶解性につき改変されたオリゴヌクレオチド物質をも包含する 。オリゴヌクレオチドは、帯電もしくは非帯電の骨格を有するものを包含する多 数の種類のいずれであっても良い。たとえば、増大した脂質溶解性および／また はヌクレアーゼ切断に対する耐性がヌクレオチド間のホスホジエステル結合にお ける燐酸の酸素をアルキル基もしくは硫黄原子で置換してアルキルホスホネート オリゴヌクレオチドもしくはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを生成させ ることにより生ずることが知られている。特に、ホスホロチオエートはヌクレア ーゼ切断に対し安定であると共に脂質に可溶性である。これらは、公知の自動合 成法によっ て合成することができる。 用いるオリゴヌクレオチドは、未改変のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク レオチド同族体を示すことができる。この種の同族体の１群（すなわちアルキル ホスホネート）は限定はしないが米国特許第４，４６９，８６３号により開示さ れたエチルもしくはメチルホスホネート同族体を包含する。 非イオン型オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ加水分解に対する増大した耐性 および／または細胞吸収の増大を特徴とすると共に、相補的核酸配列との安定な 複合体を形成する能力を保持する。特にアルキルホスホネートはヌクレアーゼ切 断に対し安定であると共に脂質に可溶性である。アルキルホスホネートオリゴヌ クレオチドの作成は米国特許第４，４６９，８６３号に開示されている。 メチルホスホネートオリゴマーは、各種の方法により溶液中および不溶性ポリ マー支持体上の両者で作成することができる［アグローワルおよびリフチナ、ヌ クレイック・アシッズ・リサーチ、第６巻、第３００９〜３０２４頁（１９７９ ）；ミラー等、バイオケミストリー、第１８巻、第５１３４〜５１４２頁（１９ ７９）、ミラー等、Ｊ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５５巻、第９６５ ９〜９６６５頁（１９８０）；ミラー等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、 第１１巻、第５１８９〜５２０４頁（１９８３）、ミラー等、ヌクレイック・ アシッズ・リサーチ、第１１巻、第６２２５〜６２４２頁（１９８３）、ミラー 等、バイオケミストリー、第２５巻、第５０９２〜５０９７頁（１９８６）；エ ンゲルスおよびヤガー、アンゲバンテ・ヘミー・サプルメント、第９１２頁（１ ９８２）；シンハ等、テトラヘドロン・レタース、第２４巻、第８７７〜８８０ 頁（１９８３）；ドルマン等、テトラヘドロン、第４０巻、第９５〜１０２頁（ １９８４）；ヤガーおよびエンゲルス、テトラヘドロン・レタース、第２５巻、 第１４３７〜１４４０頁（１９８４）；ノーブル等、ヌクレイック・アシッズ・ リサーチ、第１２巻、第３３８７〜３４０４頁（１９８４）；カラハン等、プロ シーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第１ ６１７〜１６２１頁（１９８６）；コジオルキエウッチ等、ケミカ・スクリプタ 、第２６巻、第２５１〜２６０頁（１９８６）；アグローワルおよびグッドチャ イルド、テトラヘドロン・レタース、第３８巻、第３５３９〜３５４２頁（１９ ８７）；レスニコウスキー等、テトラヘドロン・レタース、第２８巻、第５５３ ５〜５５３８頁（１９８７）；サリン等、プロシーディング・ナショナル・アカ デミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第７４４８〜７４５１頁（１９８８） ］。 メチルホスホネートオリゴヌクレオシドを作成するための最も効率的な方法は 、オリゴデオキシリボヌクレオチドを作成すべく使用されるメトキシもしくはβ −シア ノエチルホスホルアミダイト試薬に類似した５’−ｏ−ジメトキシトリチルデオ キシヌクレオシド−３’−ｏ−ジイソプロピルメチルホスホルアミダイト中間体 の使用を含む。メチルホスホネートオリゴマーは、自動化ＤＮＡ合成装置を用い て調節気孔ガラスポリマー支持体で作成することができる［サリン等、プロシー ディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第７４４ ８〜７４５１頁（１９８８）］。 ヌクレアーゼ切断に対する耐性は、ヌクレオチド間の結合を５’および３’末 端の両者にてダグル等の手順によりホスホルアミダイドで改変して達成すること もできる［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１８巻、第４７５１〜４７５ ７頁（１９９０）］。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間のホスホジエステ ル結合に硫黄と酸素との置換を有する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド は、デュープレックス構成につき効果的なハイブリッド化の性質と相当なヌクレ アーゼ耐性との両者を兼備すると共に、帯電ホスフェート同族体の水溶性を保持 する。帯電は、リセプタによる細胞吸収の性質を付与すると思われる［レーク等 、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８６巻 、第３４７４〜３４７８（１９８９）］。 ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドはラプランシェ等によりヌク レイック・アシッズ・リサーチ、 第１４巻、第９０８１頁（１９８６）に記載され、さらにステック等によりジャ ーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ、第１０６巻、第６０７７頁（１９ ８４）に記載されている。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの一般的な合 成法がスタイン等により改変され［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１６ 巻、第３２０９〜３２２１頁（１９８８）］、これら化合物をホスホルアミダイ ト手段により自動合成装置にて容易に合成することができる。 さらに、オリゴリボヌクレオチド同族体の作成における最近の進歩は、ここに 説明した目的で他の試薬、たとえば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド［イノウ エ等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第６１３１頁（１９８７ ）］および複合ＲＮＡ−ＤＮＡ同族体であるキメラオリゴヌクレオチド［イノウ エ等、ＦＥＢＳレタース、第２１５巻、第３２７頁（１９８７）］をも使用しう ることを意味する。 ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ翻訳の抑制はアンチセンスオリゴリボヌクレオチドまた はオリゴデオキシリボヌクレオチドのいずれを用いても可能であるが、リボヌク レアーゼによる酵素浸蝕に対しては遊離オリゴリボヌクレオチドがオリゴデオキ シリボヌクレオチドよりも感受性である。したがって、本発明の実施にはオリゴ デオキシリボヌクレオチドが好適である。ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡとのハイブリッ ド化に際し得られるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリ ッドデュープレックスはＲＮアーゼＨのための基質であってＤＮＡ−ＲＮＡハイ ブリッドのＲＮＡ部分を特異的に浸蝕するので、オリゴデオキシリボヌクレオチ ドがさらに好適である。デュープレックスのｍＲＮＡストランドの分解は、追加 ｃ−ｋｉｔメッセージとハイブリッド化するアンチセンスオリゴデオキシヌクレ オチドを放出する。 一般に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉｔメッセージの 標的部分に対し完全に相補的な配列を有する。しかしながら、特に大型オリゴマ ーにおいては絶対的な相補性は必要とされない。したがって、ｃ−ｋｉｔの「ｍ ＲＮＡ転写物の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列」という説明は 、必ずしも転写物に対し１００％の相補性を有する配列を意味しない。一般に、 ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡに対し安定なデュープレックスを形成するのに充分な相補 性を有する任意のオリゴヌクレオチド、すなわち「ハイブリダイズしうる」オリ ゴヌクレオチドが適している。安定なデュープレックス構成はハイブリダイズす るオリゴヌクレオチドの配列および長さ、並びにｃ−ｋｉｔメッセージの標的領 域に対する相補性の程度に依存する。一般に、ハイブリダイズするオリゴマーが 大きい程、より大きいミスマッチを許容することができる。恐らく２個以上のミ スマッチは約２１ヌクレオチド未満のアンチセンスオリゴマーにつき許容されな い。当業者は、任意所定のアンチセンスオ リゴマーと標的ｃ−ｋｉｔメッセージ配列との間で許容しうるミスマッチの程度 を融点およびしたがって得られるデュープレックスの安定性に基づいて容易に決 定することができる。所定塩基対組成のデュープレックスにおける融点は、たと えばモレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、第２版（１９８９ ）、Ｊ．サムブルック等編のような標準的文献から決定することができる。 ｃ−ｋｉｔメッセージの任意の領域に対し安定にハイブリダイズしうるオリゴ ヌクレオチドが本発明の範囲内であるが、開始コドンを含む領域に対し相補的な オリゴヌクレオチドが特に効果的であると思われる。開始コドンの上流の４０ヌ クレオチドまで（５’方向）または前記コドンの下流の４０ヌクレオチドまで（ ３’方向）のｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡの領域に対しハイブリダイズしうるオリゴヌ クレオチドが特に好適である。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、コロニー形成単位−赤血球（Ｃ ＦＵ−Ｅ）およびバースト形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）の抑制により示され るように、ヒト赤血球造血を抑制する。しかしながら、これらはたとえばコロニ ー形成単位−顆粒球−大食細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）およびコロニー形成単位−巨核 球細胞（ＣＦＵ−ＭＥＧ）のような他の系列の細胞増殖を抑制しないと思われる 。ＣＦＵ−ＧＭ細胞およびＣＦＵ−ＭＥＧ細胞はそれぞれ血液顆粒球および血小 板の原種である。こ の医薬上重要な感受性の差は、本発明のオリゴヌクレオチドを赤血球の生産増加 を特徴とする障害の処置に有用とする。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、赤血球の過剰生産に基づくフェ マトクリット値上昇を特徴とする各種の症状の処置に有用であると思われる。こ の種の１つの障害（すなわち多血球血症）は各種の原因で生ずることがあり、相 対的、二次的もしくは一次的の多血球血症のいずれかとして分類される。 相対的多血球血症の場合、赤血球数は正常である。血漿容積が減少する。赤血 球の増加はしたがって濃縮作用である。相対的多血球血症は糖尿病酸性症、下痢 または尿崩症に関連する。さらに、これは利尿剤の摂取にも関連する。 二次的多血球血症において、赤血球数は上昇したエリスロポイエチン（ＥＰＯ ）生産まで二次的に増加する。これは高緯度に生存する個人で生ずる。何故なら 、酸素の低下は貧血症に類似して、赤血球生産の増加に関する開始信号となるか らである。二次的多血球血症は、重大な肺障害もしくは心臓障害を有する患者に も生ずる。組織に対する酸素供給の低下は貧血に類似して、赤血球生産を増加さ せる信号を発生する。二次的多血球血症はさらに副腎腫、小脳血管腫および子宮 平滑筋腫の場合のようにＥＰＯを合成しうる腫瘍を持った個人にも生じうる。 一次的多血球血症は赤血球数の増加を特徴とすると共 に、正常または低下したＥＰＯレベルを有する。一次的多血球血症は骨髄増殖障 害、特に真性多血球血症（ＰＶ）で生ずる。たとえばＰＶのような障害は、真正 な幹細胞障害である。したがって、白血球数および血小板数が上昇しうる。しか しながら、赤血球生産の調節がＰＶの管理における主たる目的である。ＰＶの調 節は一般に、二次的原因における静脈切除術により（一次的な病気の処置が無効 であれば）および静脈切除術と化学療法との組合せによって行われる。ＰＶの化 学療法処置は典型的にはたとえばブスルファン、メルファラン、シクロホスファ ミド、クロラムブシルまたは燐酸ナトリウム−Ｐ32としての放射性燐のようなア ルキル化剤を用いる。 ＰＶの処置において静脈切除術により加えられる急速な体液シフトは、心臓／ 肺の病気を有する患者に危険である。静脈切除術はさらに致命的血栓症の重大な 危険を伴う［バーク等、Semin.Hematol.、第２３巻、第１３２頁（１９８６）； エリス等、同上、第１４４頁］。本発明のｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマーの 投与による赤血球生産の調節は、静脈切除術および化学療法に対する魅力的な代 案である。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに血液学的悪性腫瘍の処置 にも用途を有すると思われる。本発明のｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴヌクレオ チドに対し感受性であると思われる血液学的腫瘍細胞は、たとえば骨髄性白血病 細胞を包含する。骨髄および身体のど こかにおけるこれら細胞の出現は、たとえば急性骨髄白血病および慢性骨髄白血 病の各種のフランス−アメリカ−英国（ＦＡＢ）サブタイプの全ての病的症状に 関連する。 ｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴヌクレオチドは、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）に 対し特に有用であると思われる。慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）に対する顕著な活性 も示されている。特にＣＭＬは血液、骨髄、脾臓、肝臓およびしばしば他の組織 における未熟な顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）の異常な増殖を特徴と する。本質的な特徴は、これら組織における顆粒球先駆体の蓄積である。徴候を 示す患者は１μｌ当り２０，０００個以上の白血球数を特徴とし、この白血球数 は４００，０００個を越えることもある。実質的に全てのＣＭＬ患者は「ブラス トクライシル」、すなわち病気の最終段階を発生し、未熟な芽細胞が急速に増殖 して患者の死亡をもたらす。 ｃ−ｋｉｔ機能は黒血球（すなわち神経冠由来の色素細胞）および胚芽細胞（ 生殖細胞）の発生に重要であると思われるので、本発明のアンチセンスオリゴヌ クレオチドは悪性黒色腫および精巣もしくは卵巣腫瘍の処置に有用であると思わ れる。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、骨髄浄化剤としても用いること ができる。これらは、インビトロにて血液学的腫瘍により汚染された骨髄を浄化 するために用いることができる。さらに、これらは同種もしく は自己骨髄移植のいずれにおいても浄化剤として有用であると思われる。これら は、骨髄に転移する血液学的悪性腫瘍または他の腫瘍の処置に特に効果的である と思われる。 骨髄浄化法によれば、骨髄を標準操作の室内手順によりドナーの腸骨から集め る。ドナーから骨髄を吸引する方法は当業界で周知されている。ドナーから骨髄 を吸引する装置および方法の例は米国特許第４，４８１，９４６号および第４， ４８６，１８８号に開示されている。ドナー（自己移植）または他の個人（同種 移植）のいずれかである受給患者が約４×１０8〜約８×１０8の処理骨髄細胞を 体重１ｋｇ当りに受けうるよう充分量の骨髄を抜取る。これは一般に、約７５０ 〜約１０００ｍｌの骨髄の吸引を必要とする。吸引された骨髄を、「バフィーコ ート」調製物として当業者に知られた単一の細胞懸濁物が得られるまで濾過する 。この白血球の懸濁物を適するキャリアにおけるｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴ ヌクレオチドで、有利には約８ｍｇ／ｍｌの濃度にて処理する。或いは、白血球 懸濁物を液体窒素中に当業者に知られた標準法により、浄化を行うまで貯蔵する ことができる。浄化された骨髄を液体窒素中に使用するまで凍結貯蔵することが できる。骨髄および生物学的物質を凍結させる方法はたとえば米国特許第４，１ ０７，９３７号および第４，１１７，８８１号に開示されている。 ｃ−ｋｉｔアンチセンスで処理するための骨髄を作成 する他の方法を用いることができ、この方法は上記バフィコート調製物よりもず っと精製された造血細胞の調製物をもたらす。 １種もしくはそれ以上の造血性成長因子を吸引骨髄もしくはバフィーコート調 製物に添加して、造血性腫瘍の成長を刺戟することによりｃ−ｋｉｔアンチセン スオリゴヌクレオチドの毒性に対する感受性を増大させることができる。この種 の造血性成長因子はたとえばＩＬ−３および顆粒球大食細胞コロニー刺戟因子（ ＧＭ−ＣＳＦ）を包含する。この種の成長因子の組換ヒト改変物が有利に使用さ れる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した後、移すベき細胞を自己血漿もし くは緩衝液で洗浄して組込まれてないオリゴマーを除去する。次いで、洗浄され た細胞を患者中へ潅流させる。 生体内で使用するため、アンチセンスオリゴヌクレオチドを医薬キャリヤ（た とえば適する液体ビークルもしくは賦形薬）および適宜の補助添加剤と組合せる ことができる。液体ビークルおよび賦形薬は慣用であって市販されている。その 例は蒸留水、生理食塩水、デキストロースの水溶液などである。生体内での抗腫 瘍の用途および生体内での赤血球の減少については、好ましくはｃ−ｋｉｔ ｍ ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを非経口的、特に好ましくは静脈内に投 与する。ビークルはそれに応じて設計される。この種の化合物は生体外で末 梢血液からリンパ球を分離し、これらをアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理 し、次いで処理されたリンパ球をドナーの末梢血液に戻すことにより投与するこ ともできる。生体外の技術は、インターロイキン−２で活性化されたリンパ球に より癌患者を処置する際に使用されており、当業者に周知されている。 慣用のキャリヤで投与する他、アンチセンスオリゴヌクレオチドは各種の特殊 なオリゴヌクレオチド供給技術により投与することもできる。たとえば、オリゴ ヌクレオチドは治療的供給のためリポソームに包封することもできる。オリゴヌ クレオチドはその溶解度に応じ水層および脂質層の両者に存在することができ、 或いは一般にリポソーム懸濁物と呼ばれる物に存在させることもできる。一般に 、限定はしないが疎水性層はたとえばレシチンおよびスフィンゴミエリンのよう な燐脂質、たとえばコレステロールのようなステロイド、たとえばジアセチルホ スフェート、ステアリルアミンもしくはホスファチジン酸のようなイオン型表面 活性剤および／または疎水性の他の物質からなっている。オリゴヌクレオチドは 、ユニラメラリポソームに好適に包封されている。 再変性されたセンダイウィルスエンベロプを用いてＲＮＡおよびＤＮＡを細胞 に供給することに成功している［アラド等、バイオヘミー・バイオフィジーク・ アクタ、第８５９巻、第８８〜９４頁（１９８６）］。 オリゴヌクレオチドをポリ（Ｌ−リジン）に結合させ て、細胞浸透を増大させることができる。この種の結合体はレマトワ等、プロシ ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８４巻、第６４ ８〜６５２頁（１９８７）に記載されている。この方法は、３’−末端ヌクレオ チドがリボヌクレオチドであることを必要とする。次いで、得られたアルデヒド 基をシッフ塩基形成によりポリ（Ｌ−リジン）のリジン残基のε−アミノ基にラ ンダム結合させ、次いでシアノ硼水素化ナトリウムで還元する。この方法は３’ −末端リボース環をモルホリン構造のアンチセンスオリゴマーに変換する。 たとえば骨髄浄化におけるような生体外の抗腫瘍用途については、ｃ−ｋｉｔ アンチセンスオリゴヌクレオチドを、腫瘍細胞を死滅させると共に正常な血液学 的細胞の生存を維持するのに有効な量で投与することができる。この量は腫瘍の 性質および程度、用いる特定オリゴヌクレオチド、このオリゴヌクレオチドに対 する腫瘍の相対的感受性および他の因子に応じて変化することができる。１０5 細胞当り約１０〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０5細胞当り約４０〜１５０ μｇ／ｍｌの濃度を用いることができる。同量もしくはそれ以下の量のオリゴヌ クレオチドを補充投与すれば、処置を最適化するのに有利である。すなわち、骨 髄容積１ｍｌ当り２×１０7個の細胞を含有する骨髄を浄化するには、骨髄１ｍ ｌ当り約２〜４０ｍｇのアンチセンスの投与量が効果的に用いられ、好ましくは 約８〜２４ｍｇ／ｍｌである。それよ り多量もしくは少量のオリゴヌクレオチドを用いることもできる。 生体内の使用についてはｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴヌクレオチドを、上記 インビトロ濃度に近似する細胞外濃度をもたらすのに充分な量で投与することが できる。好ましくは、細胞内濃度は約１０〜約１００μｇ／ｍｌの範囲である。 投与する実際量は、処置の性質が予防もしくは治療のいずれであっても患者の体 格および体重、患者の年齢、健康状態および性別、投与ルートおよび他の因子を 考慮することができる。当業者は適する投与量および投与方式を特定の状況に合 わせて容易に決定することができる。１日投与量は１日当り約０．１〜１０００ ｍｇのオリゴヌクレオチド、好ましくは１日当り約１０〜約１０００ｍｇの範囲 とすることができる。それより多量もしくは少量のオリゴヌクレオチドを所要に 応じ投与することができる。当業者は適する投与量および投与方式を特定の状況 および患者の必要に応じ容易に決定することができる。 以下、限定はしないが本発明を実施例により一層詳細に説明する。 実施例１ 正常な造血性原種細胞増殖に対するｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマー露出の作 用 造血性原種細胞クローン化効率および発生に対するｃ−ｋｉｔアンチセンスオ リゴヌクレオチドの作用を、Ｃ ＦＵ−Ｅ、バースト形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、ＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦ Ｕ−ＭＥＧ成長因子をオリゴマー露出の後に評価して系統的に検査した。 細胞：ヒト骨髄細胞（ＢＭＣ）を正常な健康志願者からフィコール−ハイパッ ク密度勾配遠心分離によって得ると共に、付着性の食細胞要素およびＴリンパ球 の除去により造血性原種を部分濃縮した［ゲウィルツ等、Ｊ・イミュノロジー、 第１３９巻、第２９１５〜２９２５頁（１９８７）］。幾つかの実験については 、付着性のＴリンパ球欠失した集団（Ａ-Ｔ-ＭＮＣ）を免疫磁気ビーズでのＣＤ ３４+細胞の積極的選択によりさらに濃縮した［Ａ．Ｓ．ダイナール、オスロー 、ノルウェー］。Ａ-Ｔ-ＭＮＣ細胞を補充α培地に懸濁させ、１：２０の希釈率 にてマウス抗−ＨＰＣＡ−Ｉ抗体と共に４℃にて試験管をゆっくり転動させなが ら４５分間培養した。細胞を補充α培地で３回洗浄し、次いでヤギ抗−マウスＩ ｇＧ1のＦｃ断片で被覆されたビーズと共に培養した［免疫ビーズ７５μｌ／１ ０7 Ａ-Ｔ-ＭＮＣ］。４５分間培養した後（４℃）、ビーズに付着した細胞を 業者により指示されたように磁性粒子濃縮器を用いて積極的に選択した。 オリゴデオキシヌクレオチド：未改変の１８−ヌクレオチドオリゴデオキシヌ クレオチド（オリゴマー）を従来報告されているように合成した［ゲウィルツ等 、サイエンス、第２４２巻、第１３０３〜１３０６（１９８８） ］。要するにオリゴマーを、β−シアノエチルホスホルアミダイト化学によりア プライド・バイオシステムス３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置で合成した。オリゴマー をエタノール沈殿および複数回の７０％エタノールでの洗浄により精製した。次 いで、これらを凍結乾燥させると共に、１μｇ／μｌの濃度（０．１７５μＭ） で使用する前に培地に再溶解させた。公開されたヒトｃ−ｋｉｔ ｃＤＮＡ配列 ［ヤーデン等、ＥＭＢＯジャーナル、第６巻、第３３４１〜３３５１頁（１９８ ７）］のコドン１〜６に対応する用いたオリゴマー配列は次の通りである：ＡＴ ＧＡＧＡＧＧＣＧ ＣＴＣＧＣＧＧＣ（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ：１４）、センスオリ ゴマー；ＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧ ＣＣＴＣＴＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０ ）、アンチセンスオリゴマー；およびＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧ ＣＣＡＧＴＣＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１５）、スクランブル配列オリゴマー。 細胞のオリゴマー処理：細胞を上記したようにオリゴマーに露出させた［ゲウ ィルス等、サイエンス、第２４２巻、第１３０３〜１３０６頁（１９８８）］。 ２×１０5のＡ-Ｔ-ＭＮＣもしくはＣＤ３４+ＭＮＣを、２％ヒトＡＢ血清および １０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液を含有する全容積で０．４ｍｌのイソコウブ改変デ ュルベッコ培地（ＩＭＤＭ）における５ｍｌのポリプロピレン試験管（フィッシ ャー・サイエンティフックス社、ピッツバーグ、ＰＡ）にて培養した。オリゴマ ーを０時点にて 添加し（２．５〜１００μｇ／ｍｌ）、次いで初期投与量の５０％を再び１８時 間後に添加した（最終的な全濃度０．６〜２６μＭ）。オリゴマーを最初に添加 してから２４時間後に凝固血漿もしくはメチルセルロース培養物に接種して細胞 を作成した。細胞（皿１枚当り１×１０5 Ａ-Ｔ-ＭＮＣもしくは１×１０4 Ｃ Ｄ３４+ＭＮＣ）を洗浄せずに接種した。比較培養物、は同様に処理したが、オ リゴマーでは処理しなかった。 コロニー分析：変化系列の造血性原種細胞の分析を実質的に上記したと同様に 行った。要するに細胞（１０5Ａ-Ｔ-ＭＮＣもしくは５×１０3 ＣＤ３４+ＭＮ Ｃ）を、３０％ヒトＡＢ血清と１％ＢＳＡと１０-4Ｍメルカプトエタノールと１ ０％クエン酸処理牛血漿（ハイクローン・ラボラトリース社、デンバー、ＣＯ） とが補充されたＩＭＤＭに再懸濁させた。適する組換ヒト成長因子の添加により 次の種類の細胞を刺戟した： ＣＦＵ−Ｅ：５ Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ； ＢＦＵ−Ｅ：２０ Ｕ／ｍｌ ＩＬ−３および ５ Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ、または １００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦおよび ５ Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ； ＣＦＵ−ＧＭ：２０ Ｕ／ｍｌ ＩＬ−３および ５ ｎｇ／ｍｌ顆粒球−大食細胞 コロニー刺戟因子； ＣＦＵ−ＭＥＧ：２０ Ｕ／ｍｌ ＩＬ−３および １００ ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６。 １ｍｌ容積を３５ｍｍのペトリ皿で３７℃、５％ＣＯ2および９５％湿度にて 培養した。ＣＦＵ−Ｅコロニーを７日目に、ＢＦＵ−Ｅコロニーを１４日目に、 ＧＦＵ−ＭＥＧを１２日目に、およびＣＦＵ−ＧＭを培養の１１日目に評価した 。コロニーの同定は上記に記載したように行った。 統計：試験群の平均値における統計的有意差を統計ソフトウエア・パッケージ （スタトビュー５１２＋、ブレインパワー・インコーポレーション社、カラバサ ス、ＣＡ）を用いてマン−ホイットニー非パラメータ分析により評価した。それ らの結果を第１および２表に示す。示した数値は、２回もしくは３回の個々の試 験から集めた実際の計数コロニー数である。 第１表に示したように、指示細胞としてＡ-Ｔ-ＭＮＣを用いた場合、ｃ−ｋｉ ｔ アンチセンスオリゴマーは最高投与量で用いた際に、ＣＦＵ−Ｅの増殖を〜７ ５％抑制すると共にＢＦＵ−Ｅの増殖を〜７１％抑制した。抑制は、センスオリ ゴマーもスクランブル配列オリゴマーも顕著には未処理比較と対比してコロニー 成長に影響を与えなかったので配列特異性であった。これら結果と対比し、ＣＦ Ｕ−ＧＭおよびＣＦＵ−ＭＥＧ由来のコロニー形成は、用いた如何なる投与量で もオリゴマーへの露出により影響を受けなかった（第１表）。 ＣＤ３４+細胞をｃ−ｋｉｔオリゴマーに露出した後に同様な結果が得られた 。第２表に示したように、ＣＦＵ−Ｅコロニーの平均数はｃ−ｋｉｔアンチセン スオリゴマーに露出した後に〜６６％減少したのに対し、ＢＦＵ−Ｅのコロニー 個数は〜７１％減少した。センスオリゴマーもスクランブル配列オリゴマーもコ ロニー形成を抑制しなかった。精製度の低い細胞調製物でも認められるように、 アンチセンスオリゴマーも比較オリゴマーもＣＦＵ−ＧＭコロニー形成を抑制し なかった。ＣＦＵ−ＭＧおよびＣＦＵ−ＭＥＧをｃ−ｋｉｔアンチセンスが抑制 しなかったことは驚異的である。何故なら、Ｗ／ＷVマウスは欠陥のある顆粒球 造血性および巨核球造血性を有すると報告されているからである［シェルベニッ ク等、Proc.Soc.Exp.Biol,Med.、第１５２巻、第３９８〜４０２頁（１９７６） ］。 赤血球コロニー形成は投与量に依存して抑制された。第３図を参照して、ＢＦ Ｕ−Ｅ由来のコロニー形成に対するｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマーの種々の 濃度の効果を示す。さらに、残留するコロニーはアンチセンス処理された細胞に つき未処理比較と対比してずっと低かった（データ示さず）。 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：アンチセンス作用がｃ−ｋｉ ｔ ｍＲＮＡレベルの特異的減少に基づくことをさらに証明するため、骨髄単核 細胞におけるｃ−ｋｉｔメッセージ発現の速度を検査し、次いでｃ−ｋｉｔ ｍ ＲＮＡレベルに対するオリゴマー露出の効果を次のＲＴ−ＰＣＲ法によって評価 した。 全ＲＮＡをチャーグウイン等、バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４頁 （１９７９）のグアニジンイソチオシアネート法により細胞から抽出した。細胞 （２〜５×１０6）を２５０μｌのグアニジンチオシアネート緩衝液（４Ｍグア ニジンチオシアネート；５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）；１ｍＭ ＥＤ ＴＡ；１Ｍβ−メルカプトエタノール；０．５％サルコシル）にて溶解させ、次 いでベックマン頂部開放型超透明遠心分離管（０．８ｍｌ）にて２５０μｌの塩 化セシウム（５．７Ｍ）クッショクの上に層状化させた。これらチューブを遠心 分離し（ベックマンＴＬ−１００超遠心分離器；１００，０００ＲＭＰ；１．５ 時間；２０℃）、得られたＲＮＡペレットを〜４００μｌの水に再懸濁させ、０ ．３ Ｍの酢酸カリウムで沈殿させ、７５％エタノールで２回洗浄し、次いで−７０℃ にて使用するまで貯蔵した。 ＲＮＡを５００Ｕのモロネイ種ネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＭｏＭＬＶ −ＲＴ）および公開されたｃ−ｋｉｔ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１２０１− １１７９（ＣＴＡＧＧＡＡＴＧＴ ＧＴＡＡＧＴＧＣＣＴＣＣ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１６）に相補的な５０ｐモルの２２−ヌクレオチドオリゴデオキシヌクレ オチド３’プライマにより逆転写させた。得られたｃＤＮＡ断片を５Ｕのテルム ス ・アクワチクス（Ｔａｑ）ポリメラーゼとｃ−ｋｉｔヌクレオチド８４２〜８ ６４（ＧＧＴＴＧＡＣＴＡＴ ＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧ ＡＧ、ＳＥＱＩＤ Ｎｏ ：１７）に特異性の２２−ヌクレオチドオリゴデオキシヌクレオチド５’プライ マーとを用いて増大させた。２５μｌの増大した生成物を４％アガロースゲルに て電気泳動させ、次いでナイロンフィルタに移した。これらフィルタを予備ハイ ブリッド化させ、次いで増大領域（ヌクレオチド１０６８〜１０４７）内に含ま れる２１−ヌクレオチドｃ−ｋｉｔ配列（ＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣ ＴＧＧＴＧＴ ＴＣＡＧ ＧＮＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１８）に対応するＰ32末端標識のオリゴヌ クレオチドのプローブ［カラチオロ等、サイエンス、第２４５巻、第１１０７〜 １１０９頁（１９８９）］で検査した。フィルタをコダックＸ線フィルム上に− ７０℃で強化スクリーンを用いて露出させることにより放射能写真撮影を行 った。 Ａ-Ｔ-ＭＮＣ細胞を２％ヒトＡＢ血清を含有するＩＭＤＭ中に４℃にて２４時 間保ち、次いで３７℃に加温し、５％ヒトＡＢ血清におけるＩＬ−３（２０Ｕ／ ｍｌ）およびＥＰＯ（５Ｕ／ｍｌ）で刺戟した。ｃ−ｋｉｔ発現をＲＴ−ＰＣＲ にしたがい所定間隔で測定した。それらの結果を第１図に示す。第１図の各レー ンは、刺戟後の次の間隔にてＲＴ−ＰＣＲハイブリッド化ゲルの放射能写真によ り決定された相対的なｃ−ｋｉｔ転写物量を示す：第１図 レーン ＲＴ−ＰＣＲ分析までの時間（hrs） １ ０ ２ ２ ３ ８ ４ １２ ５ ２４ ６ ３６ ７ ４８ ９ Ｈ2Ｏ レーン８は比較としてＨ2Ｏを含有した。発現は〜３６時間にてピークに達す ると思われる。 同様に刺戟されたＡ-Ｔ-ＭＮＣ細胞（ｔ＝０）をｃ−ｋｉｔセンス、アンチセ ンスもしくはミスマッチのオ リゴマーに露出させた。上記と同様にＲＴ−ＰＣＲ（ｔ＝３６ｈｒｓ）によりｃ −ｋｉｔ発現を分析した。その結果を第２図に示す。各レーンは次のように同定 される： 第２図 レーン 処理 １ 比較細胞（ｔ＝０） ２ 比較細胞（ｔ＝３６ｈｒｓ） ３ センス（ｔ＝３６ｈｒｓ） ４ アンチセンス（ｔ＝３６ｈｒｓ） ５ ミスマッチ（ｔ＝３６ｈｒｓ） アンチセンス処理された細胞（レーン４）は検出しうるｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ を含まないのに対し、センス（レーン３）およびスクランブル配列（レーン５） の処理細胞は同時点における未処理比較細胞で観察されたレベル（レーン２）と 同様なレベルを有した。 実施例２ 悪性造血原種細胞増殖に対するｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマー露出の作用 悪性造血細胞増殖を調整するｃ−ｋｉｔリセプタの重要性を検査するため、過 去に用いて成功し［カラブレッタ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ ー・サイエンス、ＵＳＡ、第８８巻、第２３５１頁（１９９１）］かつ上記と実 質的に同一である手段を用いた。各種の血液学的悪性腫瘍を有する患者からＡ- Ｔ-ＭＮＣを得 ると共に、先の正常な細胞試験で用いたｃ−ｋｉｔオリゴマーに露出させた。コ ロニーを形成する悪性ＣＦＵ−ＧＭの能力に対する作用、悪性細胞の生存に対す る作用指数、および増殖活性を評価した。全部で２２名の患者を試験し、そのう ち３名は急性リンパ球白血病を有し、４名は急性骨髄白血病を有し、１０名は慢 性骨髄白血病を有し、さらに１名は脊髄異形成（早期白血、病）症候群を有し、 ４名は真性多血球血症を有した。全体的な反応割合および病気種類による反応割 合を第３表に示す。 ＣＭＬ以外の種類に属する患者数は少ないが、そのデータはＣＭＬを有する患 者が特にｃ−ｋｉｔアンチセン スに反応すると思われることを示唆する。したがって、ｃ−ｋｉｔアンチセンス オリゴマーはＣＭＬ骨髄浄化剤として特に有用であると思われる。さらに、その 顕著な赤血球原種細胞の抑制のため、ｃ−ｋｉｔオリゴマーはＰＶ（すなわち他 の骨髄増殖性障害）を有する患者に見られる顕著に上昇したヘモグロビン／ヘマ トクリットを調節するのに有用であると思われる。実施例３ 幹細胞因子へのＢＦＵ−Ｅ反応性に対するｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマー露 出の作用 赤血球造血のｃ−ｋｉｔアンチセンス媒介抑制がＫＩＴリセプタ機能の不存在 に基づくことを証明するため、幹細胞因子（ＳＣＦ）へのＢＦＵ−Ｅ反応性がｃ −ｋｉｔオリゴマーへの露出の後に配列特異的に破壊されうることを証明すべく 試みた。したがって、ＣＤ３４+ ＭＮＣ（２×１０4）を５単位のＥＰＯおよび １ｍｌ当り１００ｎｇのＳＣＦの存在下に単独で或いはセンス、アンチセンスも しくはスクランブル配列のｃ−ｋｉｔオリゴマー（最終濃度、１５０μｇ／ｍｌ （〜２６μＭ））と共にクローン化させた。４回の実験にて、１９１±１９ＢＦ Ｕ−Ｅ（平均±ＳＤ）を成長因子単独の存在下に増殖させた。これら個数は、セ ンスオリゴマー（１８３±２９；Ｐ＝０．６５４）またはスクランブル配列オレ ゴマー（１８０±２０；Ｐ＝０．７５８）でクローン化させたものとは統計的に 異ならなかった。ｃ−ｋｉｔア ンチセンスオリゴマーの存在下に、ＢＦＵ−Ｅ由来のコロニー形成は完全に破壊 され（０．４±０．７；Ｐ＜０．０００１）、ＫＩＴリセプタがもはやそのリガ ンドと相互作用すべく存在しなかったことを示唆する。 以下、限定はないが本発明による骨髄浄化の１つの方法を実施例により説明す る。 実施例４ ｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴヌクレオチドによる骨髄浄化 骨髄を、一般的な麻酔の下で手術室にて標準技術を用いドナーの腸骨から集め た。複数の吸引物をヘパリン処理した注射器に採取した。骨髄受給者が体重１ｋ ｇ当り約４×１０8〜約８×１０8の処理骨髄細胞を受けうるのに充分な量の骨髄 を抜き取った。すなわち、約７５０〜１０００ｍｌの骨髄を抜取った。この吸引 した骨髄を直ちに、１０，０００単位の保存料フリーのヘパリンを培地１００ｍ ｌ当りに含有する輸送培地（ＴＣ−１９９、ギブコ社、グランドアイランド、ニ ューヨーク）に移した。吸引骨髄を、３種の順次に微細にするメッシュで単一細 胞懸濁物が生ずるまで、すなわち細胞凝集体、残骸および骨粒子のない懸濁物が 生ずるまで濾過した。次いで、濾過した骨髄をさらに自動化細胞分離器（たとえ ばコーブ２９９１セル・プロセッサ）で処理して、「バフィーコート」生成物（ すなわち赤血球および血小板のない白血球）を作成した。次いでバフィーコート 調製物を 移動パックに入れて、さらに処理および貯蔵した。これを標準法により液体窒素 中で浄化するまで貯蔵することができる。或いは浄化を直ちに行い、次いで浄化 した骨髄を液体窒素中に移植の準備ができるまで凍結貯蔵することができる。 浄化法は次のように行うことができる。バフィーコート調製物における細胞を 、約２０％自己血漿を含有するＴＣ−１９９における約２×１０7／ｍｌの細胞 濃度に調製する。たとえば約８ｍｇ／ｍｌの濃度におけるｃ−ｋｉｔアンチセン スオリゴデオキシヌクレオチドを、細胞懸濁物を含有した移動パックに添加する 。組換ヒト造血性成長因子（たとえばｒＨ ＩＬ−３もしくはｒＨＧＭ−ＣＳＦ ）を懸濁物に添加して造血性腫瘍の成長を刺戟させ、これによりｃ−ｋｉｔアン チセンスオリゴヌクレオチド毒性に対するその感受性を増大させることができる 。次いで移動パックを３７℃の水浴に入れ、緩和に振とうしながら１８〜２４時 間にわたり培養した。次いで細胞を液体窒素内で凍結させ或いは約２０％の自己 血漿を含有するＴＣ−１９９にて４℃で１回洗浄して未混入のオリゴマーを除去 することができる。次いで、洗浄した細胞を受給者に還流させた。できる限り無 菌条件下で作業すると共に常に決定的な無菌技術を維持するよう注意せねばなら ない。 本発明はその思想および範囲から逸脱することなく他の実施態様にて実現可能 であり、したがって本発明の範 囲を決定するに当り上記説明だけでなく請求の範囲を考慮すべきである。 合成法、製造法および分析法に関し、ここに引用した引例は全て参考のためこ こに引用する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION an antisense oligonucleotide to the c-kit proto-oncogene and And its use                                Field of the invention   The present invention provides an antisense oligonucleotide for a proto-onco gene, Especially c-kitAntisense oligonucleotides to genes, as well as certain species Use of the oligonucleotide to selectively inhibit the growth of cells Things.                              Explanation of government approval   The invention described herein is a National Institute of Health licensed C A 36896 and partly supported by CA 01324. U.S. government book Has certain rights in the invention.                                Background of the Invention   c-kitThe gene is v-kitIe, HZ4 feline sarcoma virus oncogene The normal homolog of the child. It is present on human chromosome 4. This gene is Highly related to receptors for knee stimulating factor-1 and platelet-derived growth factor A dimeric transmembrane glycoprotein receptor with tyrosine kinase activity [Yarden et al., EMBO Journal, Vol. 6, pp. 3341-351 ( 1987)]. Like these receptors, c −kitAlso appear to belong to the superfamily of immunoglobulin genes.   Mouse c-kitThe gene has been mapped to chromosome 5, with dominant white spots Was determined to be opposing to the position (W) [Shabot et al., Nature, 335, 88-89 (1988)]. c-kitMutations are generally W And other abnormalities affecting coat coloring and gonad development Shows hematopoietic disadvantages. Macrocytic anemia is one of the most prominent of these abnormalities . W especially associated with significant hematological signs42Mutations are substitutions of one amino acid or Based on missense mutations resulting in reduced tyrosine kinase activity [Tan et al., Science, 247, 209 (1990)]. . This type of animal has about one-third of the erythrocyte burst-forming units of healthy wild-type littermates. [Goldwather et al., Exp. Heme., Vol. 18, No. 9] 36 (1990)].   This time, c-kitLigands for the receptor have been identified and molecularly cloned. [Yarden et al., EMBO Journal, Vol. 351 (1987)]. Stem cell factor (SCF), mast cell growth factor ( Encoded protein known as MGF) or Steel Factor (SLF) Is the product of the gene present at the steel (S1) position. Has S1 mutation Mice have the same phenotype as W mice Has abnormalities. W mouse, c-kitSignificant signal conversion resources coded by Missing or defective signal conversion receptor. S1 mouse The ligand that stimulates the sceptor is defective.   C- in human hematopoiesiskitImportance of ligand-receptor system is unknown . There is no description of the human mutation at the corresponding position. Laboratory in mice Therefore, its applicability to human systems is extremely low. In addition, the organization issues a specific message Significance of the message for the development of the cellular phenotype, even if it has been shown to Is unknown until the encoded protein is removed from the cell. Biological systems are plentiful. Red rice White defects can often be compensated by other proteins in the genus. Therefore, It cannot be predicted that suppression of the expression of a constant gene will result in a phenotypic change.                                The gist of the invention   Antisense oligonucleotides and pharmaceutical compositions of the same with pharmaceutical carriers Is provided. Each oligonucleotide is human c-kitMRNA transcription of gene A nucleotide sequence complementary to at least a portion of the product. This oligonuc Leotide can hybridize to mRNA transcripts. Preferably The oligonucleotide is at least a 12-mer oligonucleotide, i.e. Oligomers having at least 12 nucleotide residues. In particular, Gomer is advantageously a 12-40 mer, preferably an oligodeoxynucleotide. You. Oligonucleotides smaller than 12-mer can also be used, but these are not targets The tendency to hybridize to the sequence is statistically large and for this reason the specificity is low. No. In addition, a single mismatch destabilizes the hybrid. 40-mer Larger oligonucleotides can be used, but absorption is more difficult. In addition, long Partial alignment of unique sequences results in nonspecific hybridization and nonspecific effects Can. Preferably, the oligonucleotide is a 15-30 mer oligodeoxynucleotide. Reotide, more preferably 18 to 26 mer. 15-21 mer is most preferred Suitable.   In principle c-kitOligonucleotide having a sequence complementary to any region of gene Otides may be used in the present invention, but may include c-kit  mRNA transcription Oligonucleotides complementary to part of the product are particularly preferred. In addition, translation About 40 nucleotides upstream (5 'direction) or about 40 nucleotides downstream from the start codon C- located within the octide (3 'direction)kit  Phase for part of mRNA transcript Complementary oligonucleotides are also suitable.   The invention further provides a method for inhibiting red blood cell proliferation, which method requires treatment. For the required host, the c-kitEffectiveness of antisense oligonucleotide Consists of administering an amount.   The present invention relates to a method for treating a host in need thereof or cells collected from the host in vivo. Or c- in vitrokit C- comprising administering an effective amount of an antisense oligonucleotide.kitDeparture A method for treating a hematological tumor characterized by the present invention is provided.   c-kitOligonucleotide administration may result in malignant melanoma and testis or ovary It is also useful for treating tumors.   As used herein, unless otherwise specified, the term “oligonucleotide” The terms are oligomers of ribonucleotides (ie, oligoribonucleotides) and Oligomers of deoxyribonucleotides (ie, oligodeoxyribonucleotides) (Also referred to herein as "oligodeoxynucleotides"). . Oligodeoxynucleotides are preferred.   As used herein, unless otherwise specified, the term “oligonucleotide” refers to “ And oligomers that can be large enough to be referred to as "polynucleotides". .   The terms “oligonucleotide” and “oligodeoxynucleotide” Biologically important nucleotides, namely adenine ("A"), deoxyadenine ("DA"), guanine ("G"), deoxyguanine ("dG"), cytosine ("C"), deoxycytosine ("dC"), thymine ("T") and uracil Oligomers and polymers of ("U") nucleotides, as well as other nucleic acids C- which may also contain otidekit  Can hybridize to mRNA transcript Also encompasses oligomers and polymers. Similarly, "oligonucleotides" And the term "oligodeoxynucleotide" refer to one or more The linkage between the phosphorus or pyrimidine moiety, the sugar moiety or the nucleotide is chemically modified. Also encompasses modified oligomers and polymers. Therefore, "oligonucleotides The term `` oligo '' refers to the term `` oligo It is also understood that it encompasses oligomers that may be referred to as "nucleotides". for example For example, this type of modified oligonucleotide is an alkyl phosphonate oligonucleotide described below. And nucleotides.   The term "phosphorothioate oligonucleotide" refers to a One or more of the bonds is a phosphorothioate group: , Which is a characteristic of the unmodified oligonucleotide. Sphodiester group:And different.   The term "alkylphosphonate oligonucleotide" refers to an internucleotide Wherein one or more of the linkages is an alkyl phosphonate group: [Wherein R is an alkyl group, preferably methyl or ethyl] Means an oligonucleotide that is   The term "downstream" used with respect to directions along a nucleotide sequence is 5 '→ 3 'Direction. Similarly, the term "upstream" refers to the 3'-5 'direction.   "C-kit  The term "mRNA transcript" refers to human c-kitGene present A known mRNA transcript or any other elucidable transcript is meant.                                Description of the drawings   FIG. 1 shows human bone marrow cells lacking adherent T lymphocytes (A-T-MNC) is 20 With U / ml interleukin-3 and 5 U / ml erythropoietin C- at a predetermined interval after stimulationkit  Reverse transcription-poly showing increased mRNA 5 is a radiograph of a merase chain reaction gel: lane 1 (t = 0); lane 2 (2 Time); Lane 3 (8 hours): Lane 4 (12 hours); Lane 5 (24 hours); Lane 6 ( 36 hours); Lane 7 (48 hours); Lane 8 (HTwoO comparison).   FIG. 2 shows interleukin-3 and erythropoie in 5% AB serum. A after stimulation with chin-T-C- in MNCkit  vs. mRNA level C-kit5 is a similar radiograph showing the effect of oligomer exposure. Lane 1 (No oligomer, t = 0); lane 2 (no oligomer, t = 36 hours); Lane 3 (sense oligomer, 36 hours): Lane 4 (antisense, 36 hours) Lane 5 (scrambled sequence with identical base content, 36 hours).   FIG. 3 shows c- against colony formation derived from BFU-E-.kitOligodeoki 4 shows the action of a nucleotide. The oligomer was added to the culture at time 0 and 50% of the charge was added again after 18 hours. Bars in the graph indicate: 1. Untreated control cells; 2, 20 μg / ml followed by 10 μg / ml antiserum. 3, 40 μg / ml followed by 20 μg / ml antisense treatment; 100 μg / ml followed by 50 μg / ml antisense treatment; 5, 100 μg / ml ml followed by 50 μg / ml sense treatment; 6, 100 μg / ml followed by 50 μg / Ml scrambled array processing.                             Detailed description of the invention   c-kitGenes are critical for human hematopoiesis I found out. Furthermore, the protein expressed by this gene, Receptor for inkinase acts in concert with interleukin-3 (IL-3) Signal to optimize cell proliferation (especially red blood cell burst forming units (BFU-E)) I've also figured out conversion.   Human c-kitPutative DNA sequences complementary to the mRNA transcript of the gene Den, et al., EMBO Journal, Volume 6, pages 3341-351 (1987). The entire disclosure has been reported and is incorporated herein by reference. Nucleotide sequence And the deduced amino acid sequence is shown in FIG. c-kitThe polypeptide is 976 amino acids Translation of a Single 5-kb mRNA Containing an Open Reading Frame Encoding Nonoic Acid Polypeptide Synthesized by translation.   The antisense oligonucleotide of the present invention may be any known chemical oligonucleotide. It can be synthesized by the otide synthesis method. This type of method is generally Winaker, "From Genes to Clones: An Introduction to Genetic Engineering", VCH Faira Co., Ltd. Eibergauft Translation ( 1987).   Any known oligonucleotide synthesis method can be used with the antisense oligonucleotide of the present invention. It can be used when making otide.   Antisense oligonucleotides are most advantageously automated, commercially available. Nucleic acid synthesizer such as β- Applied biosystems using cyanoethyl phosphoramidite chemistry Created using a 380B DNA synthesizer.   c-kit  Complete nucleotide synthesis of DNA complementary to mRNA transcripts Since it is known, it is possible to hybridize to any part of the mRNA transcript. Oligonucleotides are made by oligonucleotide synthesis methods known to those skilled in the art. Can be achieved.   Oligonucleotides of any length may be used in the practice of the present invention, but will Sequences shorter than the tide are targeted c-kit  Specificity to hybridize to mRNA Low disruption, easily destroyed by enzymatic cleavage, and even single base pair mismatches Thus even destabilization can occur. Therefore, 12 or more nucleos Oligonucleotides having a tide are preferred.   Longer sequences, especially those longer than about 40 nucleotides, may be more likely to be absorbed by target cells. Due to the decrease, c-kitThe effect of suppressing translation is slightly lower. Therefore, 12-4 Oligomers of 0 nucleotides are preferred, more preferably 15 to 30 nucleobases. And particularly preferably 18 to 26 nucleotides. 18-21 nucleotides Are particularly preferred. Oligonucleotide whose sequence of 18 to 21 nucleotides is unmodified Particularly preferred for leotides, slightly longer chains of up to about 26 nucleotides are modified. For modified oligonucleotides (eg, phosphorothioate oligonucleotides) The modified oligonucleotide may be an unmodified oligonucleotide to mRNA. Hybridizes weaker than leotide.   c-kit  Complementary and hybridizes to any part of the mRNA transcript The resulting oligonucleotides are, in principle, effective in inhibiting transcript translation, The effects described herein can be induced. Translation is at the start codon or at Probably the most effective suppression by blocking mRNA at sites close to it It is. Therefore, c-kit  Complementary to the 5'-terminal region of the mRNA transcript Suitable oligonucleotides are preferred. Preferably, the oligonucleotide is a protein Directed to or near the site of the initiation codon for synthesis. Next 40-mer The ligodeoxynucleotide is located downstream (5 'direction) starting from the start codon of the transcript. C-kit  Complementary to mRNA transcript: GAACGCAG AG AAAATCCCAG GGCCGCGGAGCGCCTCTCAT ( SEQ ID No: 1).   Small oligomers based on the above sequences, especially c- with an initiation codonkitMesse Oligomers capable of hybridizing to the segment of the page . The following 15- to 26-mers are particularly preferred:       (SEQ ID No: 2)       (SEQ ID No: 3)       (SEQ ID No: 4)       (SEQ ID No: 5)       (SEQ ID No: 6)       (SEQ ID No: 7)       (SEQ ID No: 8)       (SEQ ID No: 9)       (SEQ ID No: 10)       (SEQ ID No: 11)       (SEQ ID No: 12)       (SEQ ID No: 13).   C- which can be used according to the present inventionkit  hybridize to mRNA transcript Oligonucleotides are biologically important nucleotides, ie, A, dA, G, Not only natural oligomers of dG, C, dC, T and U, but also improved stability and And / or also oligonucleotide substances modified for lipid solubility . Oligonucleotides include those having a charged or uncharged backbone. Any of a number of types may be used. For example, increased lipid solubility and / or Is resistant to nuclease cleavage by phosphodiester bonds between nucleotides. An alkylphosphonate by replacing the oxygen of phosphoric acid with an alkyl group or a sulfur atom Produce oligonucleotides or phosphorothioate oligonucleotides It is known that this occurs. In particular, phosphorothioates are nucleated It is stable to lyase cleavage and soluble in lipids. These are known automatic synthesis By law Can be synthesized.   Oligonucleotides used are unmodified oligonucleotides or oligonucleotides. Leotide homologs can be indicated. A group of homologs of this type (ie, alkyl Phosphonates) are disclosed by, but not limited to, U.S. Patent No. 4,469,863. Ethyl or methyl phosphonate homologs.   Nonionic oligonucleotides have increased resistance to nuclease hydrolysis And / or characterized by increased cell absorption and stable binding with complementary nucleic acid sequences Retains the ability to form a complex. In particular, alkyl phosphonates are nuclease cut Stable to fracture and soluble in lipids. Alkyl phosphonate oligonu The preparation of nucleotides is disclosed in U.S. Pat. No. 4,469,863.   Methylphosphonate oligomers can be prepared in solution and insoluble poly [Agrowal and Lifchina, Nu Clay Acids Research, Vol. 6, pp. 3009-3024 (1979 Mirror; Biochemistry, Vol. 18, pp. 5134-5142 (19) 79), Miller, et al., J. Biological Chemistry, 255, 965 9-9665 (1980); Miller et al., Nucleic Acids Research, Vol. 11, pp. 5189-5204 (1983), Miller et al. Acids Research, Vol. 11, pp. 6225-6242 (1983), Mirror Et al., Biochemistry, Vol. 25, pp. 5092-5097 (1986); Ngels and Jaguar, Angevante Chemie Supplement, p. 912 (1 982); Shinha et al., Tetrahedron Letters, Vol. 24, 877-880. Page (1983); Dolman et al., Tetrahedron, Vol. 40, pp. 95-102 ( 1984); Jaguar and Engels, Tetrahedron Letters, Vol. 25, Pp. 1437-1440 (1984); Noble et al., Nucleic Acids. Research, Vol. 12, pp. 3387-3404 (1984); Callahan et al. Seeding National Academy Sciences, USA, Vol. 83, No. 1 617-1621 (1986); Kodiolki Lodz et al., Chemica Scripta 26, 251-260 (1986); Agrowal and Goodcha Ild, Tetrahedron Letters, 38, 3539-3542 (19 87); Lesnikowski et al., Tetrahedron Letters, Vol. 28, No. 553 5-5538 (1987); Sarin et al., Proceeding National Aka. Demmy Science, USA, Vol. 85, pp. 7448-7451 (1988) ].   The most efficient way to make methylphosphonate oligonucleosides is , Methoxy or β used to make oligodeoxyribonucleotides -Shea 5'-o-Dimethoxytrityldeo analogous to the noethyl phosphoramidite reagent Xynucleoside-3'-o-diisopropylmethyl phosphoramidite intermediate Including the use of Methylphosphonate oligomer is prepared using an automated DNA synthesizer. Can be made on controlled pore glass polymer supports [Sarin et al., Proc. Ding National Academy Sciences, USA, 85, 744 8-7451 (1988)].   Resistance to nuclease cleavage indicates that the linkage between nucleotides is at the 5 'and 3' ends. Achieved by modifying with phosphoramidite by a procedure such as Dagger at both ends [Nucleic Acids Research, Vol. 18, 4751-475 7 (1990)].   Phosphorothioate oligonucleotides are used as phosphodiesters between nucleotides. Has a substitution of sulfur and oxygen for the hydrogen bond. Phosphorothioate oligonucleotides The effective hybridizing properties and substantial Combines both with ASE resistance and maintains the water solubility of homologous phosphate homologs I do. Electrification appears to impart the property of cell absorption by receptors [Lake et al. , Proceeding National Academy Sciences, USA, vol. 86 3474-3478 (1989)].   Phosphorothioate oligodeoxynucleotides Lake Acids Research, 14, pp. 9081 (1986). Internal American Chemical Society, Vol. 106, pp. 6077 (19 84). General synthesis of phosphorothioate oligonucleotides The synthesis method was modified by Stein et al. [Nucleic Acids Research, No. 16 Vol. 3209-3221 (1988)], and these compounds are phosphoramidite. Can be easily synthesized by an automatic synthesizing device by means of a computer.   In addition, recent advances in making oligoribonucleotide homologs For the purposes described, other reagents, such as 2'-O-methyl ribonucleotide [Inou E. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 15, p. 6131 (1987 )] And chimeric oligonucleotides that are complex RNA-DNA homologs [Inou Et al., FEBS Letters, Vol. 215, 327 (1987)]. Means that   c-kit  Inhibition of mRNA translation is due to antisense oligoribonucleotides or Can be made using any of oligodeoxyribonucleotides. Free oligoribonucleotides are oligodeoxynucleotides for enzyme erosion More sensitive than siribonucleotides. Therefore, the practice of the present invention Deoxyribonucleotides are preferred. c-kit  Hybridization with mRNA DNA-RNA hybrid obtained upon Duplex is a substrate for RNase H and is a DNA-RNA hybrid. It specifically erodes the RNA portion of the bridging, so oligodeoxyribonucleotides Are more preferred. Additional degradation of duplex mRNA strands c-kitAntisense oligodeoxynucleic acid hybridizing with message Releases otide.   Generally, the antisense oligonucleotide of the present invention comprises c-kitOf the message It has a sequence completely complementary to the target moiety. However, especially for large oligomers Absolute complementarity is not required. Therefore, c-kit"M The description "nucleotide sequence complementary to at least a portion of the RNA transcript" Does not necessarily mean a sequence that has 100% complementarity to the transcript. In general, c-kit  Sufficient complementation to form a stable duplex to mRNA Any oligonucleotide that is capable of hybridizing, ie, a “hybridizable” oligonucleotide. Gonucleotides are suitable. Stable duplex configurations hybridize Oligonucleotide sequence and length, and c-kitMessage target area It depends on the degree of complementarity to the region. Generally, the hybridizing oligomer is Larger can allow larger mismatches. Probably more than two Matches are not tolerated for antisense oligomers of less than about 21 nucleotides No. Those skilled in the art will recognize that any given antisense Rigomer and target c-kitAcceptable degree of mismatch with the message sequence Can be easily determined based on the melting point and thus the stability of the resulting duplex. Can be specified. The melting point of a duplex with a given base pair composition is For example, Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition (1989) ), J. et al. It can be determined from standard literature such as Sambrook et al.   c-kitOligos that can stably hybridize to any region of the message The nucleotide is within the scope of the present invention, but is complementary to the region containing the initiation codon. Oligonucleotides appear to be particularly effective. 40 nuclei upstream of the start codon Up to the nucleotide (5 'direction) or up to 40 nucleotides downstream of the codon ( 3 'direction) c-kit  Oligonucleotides that can hybridize to regions of mRNA Creotide is particularly preferred.   The antisense oligonucleotide of the present invention comprises a colony forming unit-erythrocyte (C FU-E) and burst forming units-indicated by suppression of red blood cells (BFU-E) As such, suppresses human erythropoiesis. However, these are, for example, colonies -Forming units-granulocytes-macrophages (CFU-GM) and colony forming units-megakaryocytes Does not seem to suppress cell growth of other lineages such as spheroid cells (CFU-MEG) . CFU-GM cells and CFU-MEG cells are blood granulocytes and blood cells, respectively. It is the original species of the board. This Differences in pharmaceutically important sensitivity of the oligonucleotide of the present invention It is useful for the treatment of disorders characterized by the following.   The antisense oligonucleotides of the present invention can be used to control erythrocyte overproduction. It appears to be useful in treating various conditions characterized by elevated matcrit. This One disorder of this species (ie, polycythemia) can be caused by a variety of causes. It is classified as either a symptomatic, secondary or primary polycythemia.   In the case of relative polycythemia, the red blood cell count is normal. Plasma volume decreases. Red blood Increasing the spheres is thus a concentrating effect. Relative polycythemia is diabetic acidosis, diarrhea Or associated with diabetes insipidus. In addition, it is related to the intake of diuretics.   In secondary polycythemia, the erythrocyte count was elevated with erythropoietin (EPO ) Secondary increase until production. This occurs in individuals living at high latitudes. Because Does hypoxia signal an increase in red blood cell production, similar to anemia? It is. Secondary polycythemia occurs in patients with significant lung or heart disorders. Also occurs. Reduced oxygen supply to tissues increases red blood cell production, similar to anemia. Generate a signal to Secondary polycythemia is also associated with adrenal gland, cerebellar hemangioma and uterus It can also occur in individuals with tumors that can synthesize EPO, as in the case of leiomyomas.   Primary polycythemia is characterized by an increased red blood cell count. Have normal or reduced EPO levels. Primary polycythemia is myeloproliferative disorder It occurs in harm, especially polycythemia vera (PV). For example, obstacles like PV are genuine Is a serious stem cell disorder. Therefore, white blood cell count and platelet count may increase. Only However, regulation of erythrocyte production is a major goal in the management of PV. PV tone Nodes are generally removed by vein resection for secondary causes (primary disease treatment is ineffective) And if combined with phlebotomy and chemotherapy. Conversion of PV Therapeutic treatments typically involve e.g. busulfan, melphalan, cyclophospha Mid, chlorambucil or sodium phosphate-P32Such as radioactive phosphorus as Use a ruquifying agent.   The rapid fluid shifts imposed by phlebotomy in the treatment of PV are Danger to patients with lung disease. Phlebotomy is even more critical for fatal thrombosis It is dangerous [Bourke et al., Semin. Hematol., 23, 132 (1986); Ellis et al., Ibid., Page 144]. C- of the present inventionkitAntisense oligomer Modulation of red blood cell production by administration is an attractive alternative to phlebotomy and chemotherapy. It is a plan.   The antisense oligonucleotides of the invention may further treat hematological malignancies. It seems to have uses as well. C- of the present inventionkitAntisense oligonucleo Hematological tumor cells that may be sensitive to pide include, for example, myeloid leukemia. Cells. Bone marrow and body throat The appearance of these cells in the body, for example, acute myeloid leukemia and chronic myeloid leukemia For all pathological symptoms of various French-American-British (FAB) subtypes of the disease Related.   c-kitAntisense oligonucleotides are used in acute myeloid leukemia (AML) On the other hand, it seems to be particularly useful. Outstanding activity against chronic myeloid leukemia (CML) Are also shown. In particular, CML contains blood, bone marrow, spleen, liver and often other tissues. Characterized by abnormal proliferation of immature granulocytes (neutrophils, eosinophils and basophils) in I do. An essential feature is the accumulation of granulocyte precursors in these tissues. Signs The patients shown are characterized by a leukocyte count of 20,000 or more per μl, May exceed 400,000. Virtually all CML patients are referred to as Brass Toclicil, the last stage of the disease, causing immature blasts to grow rapidly And result in patient death.   c-kitThe function is erythrocyte (ie, pigment cells from neural crest) and germ cells ( Germ cells), the antisense oligonucleotides of the present invention Creotide may be useful in treating melanoma and testicular or ovarian tumors It is.   The antisense oligonucleotide of the present invention may also be used as a bone marrow purifier Can be. They purify bone marrow contaminated by hematological tumors in vitro Can be used to In addition, they may be homogeneous or Is thought to be useful as a purifying agent in any autologous bone marrow transplantation. these Is particularly effective in treating hematological malignancies or other tumors that metastasize to the bone marrow I think that the.   According to the bone marrow purification method, bone marrow is collected from a donor's iliac bone using standard laboratory procedures. You. Methods for aspirating bone marrow from a donor are well known in the art. Donor to bone marrow Examples of devices and methods for sucking air are described in U.S. Pat. No. 486,188. Donor (autologous) or other individual (allogeneic) Transplantation) is about 4 × 108~ 8 × 108Processing bone marrow cells Extract enough bone marrow to receive 1 kg of body weight. This is generally about 750 Requires aspiration of ~ 1000 ml of bone marrow. The aspirated bone marrow is Filter until a single cell suspension known to those skilled in the art as a "preparation" preparation is obtained. . This suspension of leukocytes is treated with c- in a suitable carrier.kitAntisense oligo It is treated with nucleotides, advantageously at a concentration of about 8 mg / ml. Or white blood cells Store the suspension in liquid nitrogen until clarification according to standard methods known to those skilled in the art. be able to. Purified bone marrow can be stored frozen in liquid nitrogen until used. it can. Methods for freezing bone marrow and biological material are described, for example, in US Pat. Nos. 07,937 and 4,117,881.   c-kitCreate bone marrow for processing with antisense Other methods can be used, which are less than the buffy coat preparations described above. This results in a highly purified preparation of hematopoietic cells.   One or more hematopoietic growth factors are aspirated bone marrow or buffy coat C- by adding to the product to stimulate the growth of hematopoietic tumorskitAntisen The sensitivity of the oligonucleotide to the toxicity can be increased. This species Hematopoietic growth factors include, for example, IL-3 and granulocyte macrophage colony stimulating factor ( GM-CSF). Recombinant human variants of this type of growth factor are advantageously used. It is.   After treatment with antisense oligonucleotides, transfer cells to autologous plasma. Alternatively, wash with buffer to remove unincorporated oligomers. Is then washed The cells are perfused into the patient.   For use in vivo, antisense oligonucleotides can be used in pharmaceutical carriers (such as (Eg suitable liquid vehicles or excipients) and suitable auxiliary additives be able to. Liquid vehicles and excipients are conventional and commercially available. That Examples are distilled water, saline, aqueous dextrose, and the like. Antitumor in vivo For use of the tumor and reduction of red blood cells in vivo, preferably c-kit  m The RNA antisense oligonucleotide is administered parenterally, particularly preferably intravenously. Give. The vehicle is designed accordingly. This type of compound is ex vivo Separate lymphocytes from peripheral blood and treat them with antisense oligonucleotides And then administer the treated lymphocytes by returning them to the donor's peripheral blood. Can also be. In vitro technology is applied to lymphocytes activated by interleukin-2 It has been used in treating more cancer patients and is well known to those skilled in the art.   In addition to administration in conventional carriers, antisense oligonucleotides are available in a variety of specialized It can also be administered by any oligonucleotide delivery technique. For example, oligo Nucleotides can also be encapsulated in liposomes for therapeutic delivery. Oligonu Nucleotides can be present in both aqueous and lipid layers depending on their solubility, Alternatively, it may be present in a substance generally called a liposome suspension. In general , But not limited to, hydrophobic layers such as lecithin and sphingomyelin Steroids such as cholesterol such as diacetyl phospholipid Ionic surfaces such as sulfate, stearylamine or phosphatidic acid It consists of activators and / or other hydrophobic substances. Oligonucleotides , In a unilamellar liposome.   Using denatured Sendai virus envelope to transfer RNA and DNA to cells [Arad et al., Biohemie Biophysics. Actor, 859, 88-94 (1986)].   Oligonucleotide linked to poly (L-lysine) Thus, cell penetration can be increased. Conjugates of this type are used by National Academy of Sciences, USA, 84, 64 Pages 8 to 652 (1987). This method uses a 3'-terminal nucleoside. Requires that the tide be a ribonucleotide. Then the obtained aldehyde The group is converted to the ε-amino group of the lysine residue of poly (L-lysine) by Schiff base formation. Random coupling followed by reduction with sodium cyanoborohydride. This method is 3 ' -Convert the terminal ribose ring to an antisense oligomer having a morpholine structure.   For in vitro antitumor applications, such as in bone marrow purification, c-kit Antisense oligonucleotides can be used to kill tumor cells and normal hematology Can be administered in an amount effective to maintain the survival of the target cells. This amount is The nature and extent, the particular oligonucleotide used and the May vary depending on the relative sensitivity of the tumor to be affected and other factors. 10Five About 10 to 200 μg / ml per cell, preferably 10FiveAbout 40-150 per cell A concentration of μg / ml can be used. Oligonus of the same amount or less Supplemental administration of nucleotides is advantageous for optimizing treatment. That is, bone 2 × 10 per ml of pith volume7To purify bone marrow containing individual cells, bone marrow 1m A dose of about 2 to 40 mg of antisense per liter is effectively used, preferably It is about 8 to 24 mg / ml. That's it Larger or smaller amounts of oligonucleotides can also be used.   For in vivo use c-kitAntisense oligonucleotides as described above It may be administered in an amount sufficient to provide an extracellular concentration that approximates the in vitro concentration. it can. Preferably, the intracellular concentration ranges from about 10 to about 100 μg / ml. The actual amount to be administered will depend on the patient's body, whether the nature of the treatment is prophylactic or therapeutic. Size and weight, patient age, health and gender, route of administration and other factors. Can be considered. Persons of ordinary skill in the art can determine the appropriate dosage and mode of administration for a particular situation. Can be easily determined. The daily dose is about 0.1-1000 per day mg oligonucleotide, preferably in the range of about 10 to about 1000 mg per day It can be. Requires larger or smaller oligonucleotides Can be administered accordingly. One of skill in the art will determine the appropriate dosage and And can be easily determined according to the needs of the patient.   Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples without limitation.                                 Example 1 Production of c-kit antisense oligomer exposure on normal hematopoietic progenitor cell proliferation for   C- for hematopoietic progenitor cell cloning efficiency and developmentkitAntisense The effect of the lignonucleotide is C FU-E, burst forming unit-red blood cells (BFU-E), CFU-GM and CF U-MEG growth factors were evaluated after oligomer exposure and examined systematically.   cell: Human bone marrow cells (BMC) from normal healthy volunteers Adherent phagocytic elements and T lymphocytes obtained by density gradient centrifugation Hematopoietic progenitors were partially enriched by removal of [Gewirtz et al., J. Immunology, 139, pp. 2915-2925 (1987)]. For some experiments A population lacking adherent T lymphocytes (A-T-MNC) on CD with immunomagnetic beads 34+Further enrichment was achieved by active selection of cells [A. S. Dinard, Oslo ,Norway]. A-T-MNC cells were suspended in supplemented α medium and diluted 1:20 The tube was slowly rolled at 4 ° C with the mouse anti-HPCA-I antibody at For 45 minutes. The cells are washed three times with supplemented alpha medium and then goat anti-mouse I gG1[Immune beads 75 μl / l] 07  A-T-MNC]. After culturing for 45 minutes (4 ° C.), the cells attached to the beads are removed. Active selection was performed using a magnetic particle concentrator as directed by the vendor.   Oligodeoxynucleotide: Unmodified 18-nucleotide oligodeoxynuclear A nucleotide (oligomer) was synthesized as previously reported [Gewirt et al. , Science, Vol. 242, 1303-1306 (1988) ]. In short, the oligomers are obtained by β-cyanoethyl phosphoramidite chemistry. It was synthesized on a Pride Biosystems 380B DNA synthesizer. Oligomer Was purified by ethanol precipitation and multiple washes with 70% ethanol. Next Then, these are freeze-dried and at a concentration of 1 μg / μl (0.175 μM). Redissolved in medium before use in. Published human c-kit  cDNA sequence [Yarden et al., EMBO Journal, Vol. 6, pp. 3341-351 (198 7)] The oligomer sequences used corresponding to codons 1-6 of the following are: AT GAGAGGCG CTCGCGGC (SEQ ID No: 14), Sense Ori Gomer; GCCGCGAGCG CCCTCAT (SEQ ID No: 10 ), An antisense oligomer; and GCACCGTCCTG CCAGTCGC (SEQ ID No: 15), scrambled sequence oligomer.   Cell oligomerization: Cells were exposed to oligomers as described above [Geu Jills et al., Science, Vol. 242, pp. 1303-1306 (1988)]. 2 × 10FiveA-T-MNC or CD34+MNC was supplemented with 2% human AB serum and 0.4 ml of Isokobu modified data in a total volume containing 10 mM Hepes buffer. 5 ml polypropylene test tube (Fissi) in Dulbecco's medium (IMDM) (Science Fuchs, Pittsburgh, PA). Oligomer ー at time 0 (2.5-100 μg / ml), then add 50% of the initial dose again at 18:00 Shortly afterwards (final total concentration 0.6-26 μM). Add oligomer first 24 hours after inoculation into coagulated plasma or methylcellulose culture It was created. Cells (1 × 10 per dish)Five  A-T-MNC or 1 × 10Four  C D34+MNC) was inoculated without washing. Comparative cultures were treated similarly, Rigomer did not process.   Colony analysis: Analysis of hematopoietic progenitor cells of the altered lineage substantially as described above. went. In short, cells (10FiveA-T-MNC or 5 × 10Three  CD34+MN C) 30% human AB serum, 1% BSA and 10%-FourM mercaptoethanol and 1 0% citric acid-treated bovine plasma (Hyclone Laboratories, Denver, CO) Were resuspended in supplemented IMDM. With the addition of suitable recombinant human growth factor Stimulated the following types of cells:   CFU-E: 5 U / ml EPO;   BFU-E: 20 U / ml IL-3 and               5 U / ml EPO, or               100 ng / ml SCF and               5 U / ml EPO;   CFU-GM: 20 U / ml IL-3 and                 5 ng / ml granulocyte-macrophage                 Colony stimulating factor;   CFU-MEG: 20 U / ml IL-3 and                   100 ng / ml IL-6.   1 ml volume in a 35 mm Petri dish at 37 ° C, 5% COTwoAnd at 95% humidity Cultured. CFU-E colonies on day 7, BFU-E colonies on day 14, GFU-MEG was evaluated on day 12 and CFU-GM on day 11 of culture. . Colony identification was performed as described above.   statistics: Statistical software package for statistically significant differences in mean values of test groups (Statview 512+, Brain Power Inc., Calabasa , CA) using a Mann-Whitney non-parametric analysis. It The results are shown in Tables 1 and 2. The figures shown are for two or three individual trials. The actual number of colonies counted from the experiment.   As shown in Table 1, A was used as the indicator cell.-T-When MNC is used, c-ki t The antisense oligomer, when used at the highest dose, increased CFU-E growth by ~ 7. In addition to 5% inhibition, the proliferation of BFU-E was inhibited by ７１71%. Suppression is a sense Both gonomers and scrambled sequence oligomers are markedly colonies in comparison to untreated controls. Sequence specificity as it did not affect growth. In contrast to these results, CF Colony formation from U-GM and CFU-MEG was determined at any dose used. Were also unaffected by exposure to oligomers (Table 1).   CD34+The cells are c-kitSimilar results were obtained after exposure to oligomers . As shown in Table 2, the average number of CFU-E colonies was c-kitAntisen Colonies of BFU-E compared to ~ 66% after exposure to small oligomers The number decreased by ~ 71%. Both sense oligomers and scrambled sequence oligomers It did not inhibit Ronnie formation. As can be seen in less purified cell preparations, Both antisense and comparative oligomers inhibit CFU-GM colony formation Did not. CFU-MG and CFU-MEG are c-kitAntisense is suppressed What I didn't do is amazing. Because W / WVMice are defective granulocytes This is because they have been reported to have hematopoietic and megakaryocyte hematopoietic properties. Proc. Soc. Exp. Biol, Med., Vol. 152, 398-402 (1976). ].   Erythrocyte colony formation was suppressed in a dose-dependent manner. Referring to FIG. C- for colony formation from UEkitVarious antisense oligomers Shows the effect of concentration. In addition, remaining colonies can be found in antisense-treated cells. Much lower than the untreated comparison (data not shown).   Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR): Antisense action is c-ki t   To further demonstrate that it is based on a specific decrease in mRNA levels, C- in cellskitCheck the rate of message expression, then c-kit  m The effect of oligomer exposure on RNA levels was assessed by the following RT-PCR method did.   Total RNA was analyzed using Chigwin et al., Biochemistry, Vol. 18, p. 5294. (1979) was extracted from the cells by the guanidine isothiocyanate method. cell (2-5 × 106) With 250 μl of guanidine thiocyanate buffer (4M guanidine). Niidine thiocyanate; 50 mM sodium acetate (pH 5.0); 1 mM ED TA; 1M β-mercaptoethanol; 0.5% sarkosyl) 250 μl of salt in an ultra clear centrifuge tube (0.8 ml) with a Beckman open top Layered on cesium bromide (5.7M) cushion. Centrifuge these tubes Separate (Beckman TL-100 ultracentrifuge; 100,000 RPM; 1.5 Time; 20 ° C.), resuspend the resulting RNA pellet in ４００400 μl water, . 3 Precipitated with M potassium acetate, washed twice with 75% ethanol and then at -70 ° C. And stored until use.   The RNA was transferred to 500 U of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (MoMLV). -RT) and published c-kit  nucleotides 1201- of the cDNA sequence 1179 (CTAGGAATGT GTAAGTGCCTCC, SEQ ID No: 16) 50 pmol of the 22-nucleotide oligodeoxynucleotide complementary to Reverse transcription was performed with the otide 3 'primer. The obtained cDNA fragment wasTherm S ・Akwatics(Taq) Polymerase and c-kitNucleotides 842-8 64 (GGTTGACTAT CAGTTCAGCG AG, SEQ ID No. : 17) 22-nucleotide oligodeoxynucleotide 5 'ply specific to And augmented with 25 μl of increased product on 4% agarose gel Electrophoresis and then transferred to a nylon filter. Pre-high these filters Blended and then contained within the growth region (nucleotides 1068-1047) 21-nucleotide c-kitSequence (GATCCACTGC TGGGTGT P corresponding to TCAG GNSEQ ID No. 18)32End-labeled oligonucleotide Nucleotide probe [Karachiolo et al., Science, Vol. 245, No. 1107- 1109 (1989)]. Filter on Kodak X-ray film Perform radioactivity photography by exposing at 70 ° C using an intensifying screen. Was.   A-T-MNC cells in IMDM containing 2% human AB serum at 4 ° C. for 24 hours And then warmed to 37 ° C., and IL-3 (5 U / 20 U) in 5% human AB serum. ml) and EPO (5 U / ml). c-kitRT-PCR expression The measurement was performed at predetermined intervals according to the following. FIG. 1 shows the results. Each race in Fig. 1 At the next interval after stimulation, according to the radiograph of the RT-PCR hybridized gel. Relative c−kitShow transcript quantity:Fig. 1 Lane Time to RT-PCR analysis (hrs)       10       22       3 8       4 12       5 24       6 36       7 48       9HTwoO   Lane 8 is H for comparison.TwoO was contained. Expression peaks at ~ 36 hours It seems to be that.   A similarly stimulated-T-MNC cells (t = 0) were converted to c-kitSense, antisense Or mismatched Exposed to rigomer. RT-PCR (t = 36 hrs) in the same manner as above −kitExpression was analyzed. The result is shown in FIG. Each lane is identified as follows Will be:   Fig. 2 Lane processing         1 Comparative cells (t = 0)         2 Comparative cells (t = 36 hrs)         3 sense (t = 36 hrs)         4 Antisense (t = 36 hrs)         5 Mismatch (t = 36 hrs)   Antisense treated cells (lane 4) have detectable c-kit  mRNA , The sense (lane 3) and scrambled sequence (lane 5) Treated cells at the same time as the level observed in untreated control cells (lane 2) Had a similar level.                                 Example 2 Effects of c-kit antisense oligomer exposure on malignant hematopoietic progenitor cell proliferation   C- regulates malignant hematopoietic cell proliferationkitTo check the importance of the receptor, [Proceeding National Academy, Calabletta, etc.] Science, USA, Vol. 88, pp. 2351 (1991)] The qualitatively identical means were used. A from patients with various hematological malignancies- T-Get MNC And c- used in the previous normal cell test.kitExposed to oligomer. Ko Effect on the ability of malignant CFU-GM to form Ronnie, on survival of malignant cells Action index and proliferative activity were evaluated. A total of 22 patients were tested and 3 had acute lymphocytic leukemia, 4 had acute myeloid leukemia, and 10 had Have myeloid leukemia, one further has myelodysplastic (early leukemia, disease) syndrome, Four had polycythemia vera. Overall response rate and response rate by disease type The results are shown in Table 3.   Although the number of patients belonging to types other than CML is small, the data Is particularly c-kitAntisen Suggest that it may respond to Therefore, c-kitAntisense Oligomers appear to be particularly useful as CML bone marrow purifiers. In addition, Due to significant suppression of erythroid progenitor cells, c-kitThe oligomer is PV (ie, other Significantly increased hemoglobin / hema seen in patients with myeloproliferative disorders It seems to be useful for adjusting the tocrit.Example 3 Exposure of c-kit antisense oligomer to BFU-E reactivity to stem cell factor Action   Erythropoiesis c-kitAntisense-mediated suppressionKITAbsence of receptor function BFU-E reactivity to stem cell factor (SCF) −kitTo prove that it can be sequence-specifically destroyed after exposure to oligomers Tried. Therefore, CD34+  MNC (2 × 10Four) To 5 units of EPO and In the presence of 100 ng SCF per ml alone or with sense and antisense Or c-kitOligomer (final concentration, 150 μg / ml (〜26 μM)). In four experiments, 191 ± 19 BF U-E (mean ± SD) were grown in the presence of growth factor alone. These numbers are Oligomer (183 ± 29; P = 0.654) or scrambled sequence Statistically cloned with Gomer (180 ± 20; P = 0.758) It was not different. c-kitA Colony formation from BFU-E is completely destroyed in the presence of antisense oligomers (0.4 ± 0.7; P <0.0001),KITThe receptor is no longer in Riga Suggests that it did not exist to interact with the fund.   The following non-limiting examples illustrate one method of purifying bone marrow according to the present invention. You.                                 Example 4 Bone marrow purification with c-kit antisense oligonucleotide   Bone marrow is collected from the donor iliac using standard techniques in the operating room under general anesthesia Was. Multiple aspirates were collected in heparinized syringes. Bone marrow recipient weighs 1k About 4 × 10 per g8~ 8 × 108Enough bone marrow to receive bone marrow cells Was extracted. That is, about 750 to 1000 ml of bone marrow was extracted. This suction Immediately after transplanting bone marrow, 10,000 units of preservative-free heparin transport medium (TC-199, Gibco, Grand Island, Ni New York). Aspirated bone marrow is single-thin with three successively finer meshes Until a cell suspension is formed, i.e., without cell aggregates, debris and bone particles. Filtered until formed. The filtered bone marrow is then further purified by an automated cell separator (eg, For example, processed on a Cove 2991 cell processor) to produce a "buffy coat" product ( That is, red blood cells and white blood cells without platelets) were prepared. Then buffy coat Preparation Further processed and stored in transfer packs. This is standard liquid nitrogen It can be stored until it is purified inside. Or purify immediately, then purify The transplanted bone marrow can be stored frozen in liquid nitrogen until ready for transplantation.   The purification method can be performed as follows. Cells in buffy coat preparation , About 2 x 10 in TC-199 containing about 20% autologous plasma7/ Ml cells Adjust to a concentration. For example, c- at a concentration of about 8 mg / mlkitAntisen Add the oligodeoxynucleotide to the transfer pack containing the cell suspension . Recombinant human hematopoietic growth factor (eg, rHIL-3 or rHGM-CSF) ) Is added to the suspension to stimulate the growth of hematopoietic tumours, whereby c-kitAnn Can increase its susceptibility to antisense oligonucleotide toxicity . Next, put the transfer pack in a 37 ° C water bath and shake it gently for Cultured over time. The cells are then frozen in liquid nitrogen or about 20% autologous Wash once with TC-199 containing plasma at 4 ° C. to remove uncontaminated oligomers can do. The washed cells were then refluxed to the recipient. As little as possible Care must be taken to work under fungal conditions and to always maintain definitive aseptic techniques Absent.   The present invention can be implemented in other embodiments without departing from the spirit and scope thereof. Therefore, the scope of the present invention In determining the enclosure, not only the above description, but also the claims should be considered.   All references cited herein regarding synthesis, manufacturing and analytical methods are for reference only. I quote here.

【手続補正書】 【提出日】平成１１年４月７日（１９９９．４．７） 【補正内容】 （一）「請求の範囲」を次のように補正する。 １． 医薬キャリアと、ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも１ 部に対し相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドとからなり、前 記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうることを 特徴とする医薬組成物。 ２． 癌を処置する薬剤を調製するためのオリゴヌクレオチドの使用であって、 前記オリゴヌクレオチドはヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも 一部に対し相補的なヌクレオチド配列を有し、前記オリゴヌクレオチドが前記ｍ ＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうることを特徴とするオリゴヌクレオチド の使用。 ３． 前記癌は、血液学的腫瘍であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載 のオリゴヌクレオチドの使用。 ４． 前記癌は、悪性黒色腫、精巣癌或は卵巣癌から成る群より選択されること を特徴とする請求の範囲第２項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。 ５． 赤血球増殖を抑制する薬剤を調製するためのオリゴヌクレオチドの使用で あって、前記オリゴヌクレオチドはヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少 なくとも一部に対し相補的なヌクレオチド配列を有し、前記オリゴヌクレオチド が前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうることを特徴とするオリゴヌク レオチドの使用。 ６． 宿主から集めた骨髄細胞を、ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少 なくとも一部に対し相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであ って、前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドの有 効量にて処置することを含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔの発現を特徴とする 腫瘍細胞の骨髄の生体外での浄化方法。[Procedure amendment] [Date of submission] April 7, 1999 (1999.4.7) [Contents of amendment] (1) Amend "claims" as follows. 1. A pharmaceutical carrier, and an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to at least a part of the mRNA transcript of the human c- kit gene, wherein the oligonucleotide is capable of hybridizing to the mRNA transcript. A pharmaceutical composition. 2. Use of an oligonucleotide for preparing a medicament for treating cancer, wherein the oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary to at least a portion of an mRNA transcript of a human c- kit gene, wherein the oligonucleotide is Use of an oligonucleotide characterized by being capable of hybridizing to the mRNA transcript. 3. The use of the oligonucleotide according to claim 2, wherein the cancer is a hematological tumor. 4. 3. The use according to claim 2, wherein the cancer is selected from the group consisting of malignant melanoma, testicular cancer or ovarian cancer. 5. Use of an oligonucleotide for preparing a drug that suppresses erythrocyte proliferation, wherein the oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary to at least a portion of an mRNA transcript of a human c- kit gene, Is capable of hybridizing to the mRNA transcript. 6. The use of an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to at least a portion of an mRNA transcript of a human c- kit gene, wherein the oligonucleotide capable of hybridizing to the mRNA transcript is obtained by using bone marrow cells collected from a host. An ex vivo method for purifying bone marrow of tumor cells characterized by expression of c-kit, which comprises treating with an amount.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，Ｎ Ｌ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＳ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｋ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＵＳ (72)発明者 カラブレッタ，ブルーノ アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19103 フィラデルフィア パイン ストリート 2401────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LU, MC, N L, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM , GA, GN, ML, MR, SN, TD, TG), AT , AU, BB, BG, BR, CA, CH, CS, DE, DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, L K, LU, MG, MN, MW, NL, NO, PL, RO , RU, SD, SE, US (72) Inventor Calabretta, Bruno             United States Pennsylvania 19103               Philadelphia Pine Street               2401

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 医薬キャリアと、ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも１ 部に対し相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドとからなり、前 記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうることを 特徴とする医薬組成物。 ２． オリゴヌクレオチドが少なくとも１２量体からなる請求の範囲第１項に記 載の組成物。 ３． オリゴヌクレオチドが、翻訳開始コドンの約４０ヌクレオチド以内に存在 するｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡの１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する請求 の範囲第２項に記載の組成物。 ４． オリゴヌクレオチドが、ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物の翻訳開始コドンを 含む前記転写物の１部に対し相補的なデオキシヌクレオチド配列を有するオリゴ デオキシヌクレオチドである請求の範囲第２項に記載の組成物。 ５． オリゴヌクレオチドが１２〜４０量体オリゴデオキシヌクレオチドからな る請求の範囲第２項に記載の組成物。 ６． オリゴデオキシヌクレオチドがアルキルホスホネートオリゴデオキシヌク レオチドまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである請求の範 囲第５項に記載の組成物。 ７． オリゴデオキシヌクレオチドが１５〜３０量体からなる請求の範囲第５項 に記載の組成物。 ８． オリゴデオキシヌクレオチドが１８〜２６量体からなる請求の範囲第７項 に記載の組成物。 ９． オリゴデオキシヌクレオチドが１８〜２１量体からなる請求の範囲第８項 に記載の組成物。 １０． オリゴデオキシヌクレオチドが配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２および ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３ よりなる群から選択される配列を有する請求の範囲第７項に記載の組成物。 １１． オリゴデオキシヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０のヌクレオチ ド配列を有する請求の範囲第１０項に記載の組成物。 １２． ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少な くとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有し、前記オリゴヌクレオチドが 前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうることを特徴とするオリゴヌクレ オチド。 １３． 少なくとも１２量体からなる請求の範囲第１２項に記載のオリゴヌクレ オチド。 １４． 翻訳開始コドンの約４０ヌクレオチド以内に存在するｃ−ｋｉｔ ｍＲ ＮＡの１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１３項に記載 のオリゴヌクレオチド。 １５． ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物の翻訳開始コドンを含む前記転写物の１部 に対し相補的なデオキシヌクレオチド配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド である請求の範囲第１３項に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。 １６． オリゴヌクレオチドが１２〜４０量体オリゴデオキシヌクレオチドから なる請求の範囲第１３項に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。 １７． アルキルホスホネートオリゴデオキシヌクレオシドまたはホスホロチオ エートオリゴデオキシヌクレオチドである請求の範囲第１６項に記載のオリゴデ オキシヌクレオチド。 １８． １５〜３０量体からなる請求の範囲第１６項に記載のオリゴデオキシヌ クレオチド。 １９． １８〜２６量体からなる請求の範囲第１８項に 記載のオリゴデオキシヌクレオチド。 ２０． １８〜２１量体からなる請求の範囲第１９項に記載のオリゴデオキシヌ クレオチド。 ２１． 配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２および ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３ を有するオリゴデオキシヌクレオチドの群から選択される請求の範囲第１６項 に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。 ２２． ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０を有する請求の範囲第２１ 項に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。 ２３． 処置を必要とする宿主または前記宿主から集めた細胞に対し、ヒトｃ−ｋｉｔ 遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配 列 を有するオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイ ズしうるオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを含む、ｃ−ｋｉｔの発現 を特徴とする血液学的腫瘍の生体内もしくは生体外の処置方法。 ２４． オリゴヌクレオチドが少なくとも１２量である請求の範囲第２３項に記 載の方法。 ２５． オリゴヌクレオチドが、翻訳開始コドンの約４０ヌクレオチド以内に存 在するｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡの１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する請 求の範囲第２４項に記載の方法。 ２６． オリゴデオキシヌクレオチドが、ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物の翻訳開 始コドンを含む前記転写物の１部に対し相補的なデオキシヌクレオチド配列を有 するオリゴデオキシヌクレオチドである請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２７． オリゴヌクレオチドが１２〜４０量体オリゴデオキシヌクレオチドから なる請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２８． オリゴデオキシヌクレオチドがアルキルホスホネートオリゴデオキシヌ クレオシドまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである請求の 範囲第２７項に記載の方法。 ２９． オリゴデオキシヌクレオチドが配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２および ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３ を有するオリゴデオキシヌクレオチドの群から選択される請求の範囲第２７項 に記載の方法。 ３０． 吸引した骨髄細胞を処置すると共に処置後の宿主に吸引細胞を戻す請求 の範囲第２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９項のいずれかに記載の 方法。 ３１． 血液学的腫瘍が慢性骨髄白血病からなる請求の範囲第２３項に記載の方 法。 ３２． 血液学的腫瘍が急性骨髄白血病からなる請求の範囲第２３項に記載の方 法。 ３３． ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも１部に対し相補的 なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの有効量を宿主に対し投与し、 前記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡ転写物に対しハ イブリダイズしうることを特徴とする赤血球の増殖を制御する方法。 ３４． オリゴヌクレオチドが少なくとも１２量体である請求の範囲第３３項に 記載の方法。 ３５． オリゴヌクレオチドが、翻訳開始コドンの約４０ヌクレオチド以内に存 在するｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡの１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する請 求の範囲第３４項に記載の方法。 ３６． オリゴヌクレオチドが、ｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡ転写物の翻訳開始コドン を含む前記転写物の１部に対し相補的なデオキシヌクレオチド配列を有するオリ ゴデオキシヌクレオチドである請求の範囲第３４項に記載の方法。 ３７． オリゴヌクレオチドが１２〜４０量体オリゴデオキシヌクレオチドから なる請求の範囲第３４項に記載の方法。 ３８． オリゴデオキシヌクレオチドがアルキルホスホネートオリゴデオキシヌ クレオシドまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである請求の 範囲第３７項に記載の方法。 ３９． オリゴデオキシヌクレオチドが１５〜３０量体である請求の範囲第３７ 項に記載の方法。 ４０． オリゴデオキシヌクレオチドが１８〜２６量体である請求の範囲第３９ 項に記載の方法。 ４１． オリゴデオキシヌクレオチドが１８〜２１量体 である請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４２． オリゴデオキシヌクレオチドが配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２および ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３ よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第４１項に記 載の方法。 ４３． 処置を必要とする宿主に対し、ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物 の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド の有効量を投与し、前記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブ リダイズしうることを特徴とする悪性黒色腫の処置方法。 ４４． オリゴヌクレオチドが少なくとも１２量体からなる請求の範囲第４３項 に記載の方法。 ４５． オリゴヌクレオチドが１２〜４０量体オリゴデ オキシヌクレオチドからなる請求の範囲第４４項に記載の方法。 ４６． オリゴヌクレオチドが、翻訳開始コドンの約４０ヌクレオチド以内に存 在するｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡの１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する請 求の範囲第４５項に記載の方法。 ４７． オリゴヌクレオチドがアルキルホスホネートオリゴデオキシヌクレオシ ドまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである請求の範囲第４ ５項に記載の方法。 ４８． 処置を必要とする宿主に対し、ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子のｍＲＮＡ転写物 の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド の有効量を投与し、前記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブ リダイズしうることを特徴とする精巣もしくは卵巣腫瘍の処置方法。 ４９． オリゴヌクレオチドが少なくとも１２量体からなる請求の範囲第４８項 に記載の方法。 ５０． オリゴヌクレオチドが１２〜４０量体オリゴデオキシヌクレオチドから なる請求の範囲第４９項に記載の方法。 ５１． オリゴヌクレオチドが、翻訳開始コドンの約４０ヌクレオチド以内に存 在するｃ−ｋｉｔ ｍＲＮＡの１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する請 求の範囲第５０項に記載の組成物。 ５２． オリゴヌクレオチドがアルキルホスホネートオリゴデオキシヌクレオシ ドまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである請求の範囲第５ ０項に記載の方法。[Claims] 1. A pharmaceutical carrier, and an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to at least a part of the mRNA transcript of the human c- kit gene, wherein the oligonucleotide is capable of hybridizing to the mRNA transcript. A pharmaceutical composition. 2. 2. The composition according to claim 1, wherein the oligonucleotide comprises at least a 12-mer. 3. 3. The composition according to claim 2, wherein the oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary to a portion of the c- kit mRNA present within about 40 nucleotides of the translation initiation codon. 4. 3. The composition according to claim 2, wherein the oligonucleotide is an oligodeoxynucleotide having a deoxynucleotide sequence complementary to a portion of the c- kit mRNA transcript, including a translation initiation codon. 5. 3. The composition according to claim 2, wherein the oligonucleotide comprises a 12-40 mer oligodeoxynucleotide. 6. 6. The composition according to claim 5, wherein the oligodeoxynucleotide is an alkyl phosphonate oligodeoxynucleotide or a phosphorothioate oligodeoxynucleotide. 7. The composition according to claim 5, wherein the oligodeoxynucleotide comprises a 15 to 30-mer. 8. The composition according to claim 7, wherein the oligodeoxynucleotide comprises an 18- to 26-mer. 9. 9. The composition according to claim 8, wherein the oligodeoxynucleotide comprises an 18-21 mer. 10. The oligodeoxynucleotide has the sequence: SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID 8. The composition according to claim 7, having a sequence selected from the group consisting of No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 and SEQ ID No. 13. 11. The composition according to claim 10, wherein the oligodeoxynucleotide has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 10. 12. An oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to at least a part of an mRNA transcript of a human c- kit gene, wherein the oligonucleotide is capable of hybridizing to the mRNA transcript. 13. 13. The oligonucleotide according to claim 12, comprising at least a 12-mer. 14． 14. The oligonucleotide according to claim 13, having a nucleotide sequence complementary to a portion of the c- kit mRNA present within about 40 nucleotides of the translation initiation codon. 15. 14. The oligodeoxynucleotide according to claim 13, which is an oligodeoxynucleotide having a deoxynucleotide sequence complementary to a part of the c- kit mRNA transcript, including a translation initiation codon. 16. 14. The oligodeoxynucleotide according to claim 13, wherein the oligonucleotide comprises a 12-40 mer oligodeoxynucleotide. 17． 17. The oligodeoxynucleotide according to claim 16, which is an alkyl phosphonate oligodeoxynucleoside or a phosphorothioate oligodeoxynucleotide. 18. The oligodeoxynucleotide according to claim 16, comprising a 15 to 30 mer. 19. The oligodeoxynucleotide according to claim 18, comprising an 18- to 26-mer. 20. 20. The oligodeoxynucleotide according to claim 19, comprising an 18-21 mer. 21. Sequence: SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, 17. The oligodeoxynucleotide according to claim 16, wherein the oligodeoxynucleotide is selected from the group of oligodeoxynucleotides having SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, and SEQ ID No: 13. 22. 22. The oligodeoxynucleotide according to claim 21 having the nucleotide sequence SEQ ID No: 10. 23. An oligonucleotide having a nucleotide sequence that is complementary to at least a portion of an mRNA transcript of the human c- kit gene for a host in need of treatment or for cells collected from said host; A method for in vivo or in vitro treatment of a hematological tumor characterized by expression of c- kit , comprising administering an effective amount of a hybridizable oligonucleotide. 24. 24. The method according to claim 23, wherein the oligonucleotide is at least 12 quantities. 25. 25. The method of claim 24, wherein the oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary to a portion of the c- kit mRNA present within about 40 nucleotides of the translation initiation codon. 26. 25. The method of claim 24, wherein the oligodeoxynucleotide is an oligodeoxynucleotide having a deoxynucleotide sequence that is complementary to a portion of the c- kit mRNA transcript including the translation initiation codon. 27. The method according to claim 24, wherein the oligonucleotide comprises a 12-40 mer oligodeoxynucleotide. 28. 28. The method according to claim 27, wherein the oligodeoxynucleotide is an alkyl phosphonate oligodeoxynucleoside or a phosphorothioate oligodeoxynucleotide. 29. The oligodeoxynucleotide has the sequence: SEQ ID NO: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID 28. The method of claim 27, wherein the method is selected from the group of oligodeoxynucleotides having No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, and SEQ ID No. 13. 30. 30. The method according to any of claims 23, 24, 25, 26, 27, 28 or 29, wherein the aspirated bone marrow cells are treated and the aspirated cells are returned to the treated host. 31. 24. The method according to claim 23, wherein the hematological tumor comprises chronic myeloid leukemia. 32. 24. The method according to claim 23, wherein the hematological tumor comprises acute myeloid leukemia. 33. Administering to the host an effective amount of an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to at least a portion of the mRNA transcript of the human c- kit gene, wherein the oligonucleotide is capable of hybridizing to the mRNA transcript. A method for controlling the growth of red blood cells, which is a feature. 34. 34. The method according to claim 33, wherein the oligonucleotide is at least a 12-mer. 35. 35. The method of claim 34, wherein the oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary to a portion of the c- kit mRNA present within about 40 nucleotides of the translation initiation codon. 36. 35. The method of claim 34, wherein the oligonucleotide is an oligodeoxynucleotide having a deoxynucleotide sequence that is complementary to a portion of the c- kit mRNA transcript, including the translation initiation codon. 37. 35. The method according to claim 34, wherein the oligonucleotide comprises a 12-40 mer oligodeoxynucleotide. 38. 38. The method of claim 37, wherein the oligodeoxynucleotide is an alkyl phosphonate oligodeoxynucleoside or a phosphorothioate oligodeoxynucleotide. 39. The method according to claim 37, wherein the oligodeoxynucleotide is a 15-30 mer. 40. The method according to claim 39, wherein the oligodeoxynucleotide is an 18- to 26-mer. 41. 41. The method according to claim 40, wherein the oligodeoxynucleotide is an 18-21 mer. 42. The oligodeoxynucleotide has the sequence: SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID 42. The method of claim 41, comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, and SEQ ID No. 13. 43. A host in need of treatment is administered an effective amount of an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to at least a portion of the mRNA transcript of the human c- kit gene, and the oligonucleotide is administered to the mRNA transcript. A method for treating malignant melanoma, which is capable of hybridizing. 44. 44. The method according to claim 43, wherein the oligonucleotide comprises at least a 12-mer. 45. The method according to claim 44, wherein the oligonucleotide comprises a 12-40 mer oligodeoxynucleotide. 46. 46. The method of claim 45, wherein the oligonucleotide has a nucleotide sequence that is complementary to a portion of the c- kit mRNA that is within about 40 nucleotides of the translation initiation codon. 47. The method according to claim 45, wherein the oligonucleotide is an alkyl phosphonate oligodeoxynucleoside or a phosphorothioate oligodeoxynucleotide. 48. A host in need of treatment is administered an effective amount of an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to at least a portion of the mRNA transcript of the human c- kit gene, and the oligonucleotide is administered to the mRNA transcript. A method for treating a testis or ovarian tumor, which is capable of hybridizing. 49. 49. The method according to claim 48, wherein the oligonucleotide comprises at least a 12-mer. 50. 50. The method according to claim 49, wherein the oligonucleotide comprises a 12-40 mer oligodeoxynucleotide. 51. 51. The composition of claim 50, wherein the oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary to a portion of the c- kit mRNA present within about 40 nucleotides of the translation initiation codon. 52. The method according to claim 50, wherein the oligonucleotide is an alkyl phosphonate oligodeoxynucleoside or a phosphorothioate oligodeoxynucleotide.
JP51182692A 1991-05-09 1992-04-08 Antisense oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and uses thereof Ceased JP2002507186A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US682,812 1991-04-09
US68281291A 1991-05-09 1991-05-09
PCT/US1992/002854 WO1992019252A1 (en) 1991-04-09 1992-04-08 Antisense oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002507186A true JP2002507186A (en) 2002-03-05

Family

ID=24741242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51182692A Ceased JP2002507186A (en) 1991-05-09 1992-04-08 Antisense oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and uses thereof

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0580795A4 (en)
JP (1) JP2002507186A (en)
AU (1) AU2335192A (en)
CA (1) CA2107915A1 (en)
WO (1) WO1992019252A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021534799A (en) * 2018-08-27 2021-12-16 ノース カロライナ ステート ユニバーシティNorth Carolina State University How to Target Kits Using Splice Switching Oligonucleotides to Induce Mast Cell Apoptosis

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5681600A (en) * 1995-12-18 1997-10-28 Abbott Laboratories Stabilization of liquid nutritional products and method of making
JP4055248B2 (en) 1998-05-25 2008-03-05 味の素株式会社 Purified human activin and method for producing the same
GB2425311A (en) * 2005-04-15 2006-10-25 Ist Superiore Sanita Micro RNA against kit protein

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021534799A (en) * 2018-08-27 2021-12-16 ノース カロライナ ステート ユニバーシティNorth Carolina State University How to Target Kits Using Splice Switching Oligonucleotides to Induce Mast Cell Apoptosis
JP7677628B2 (en) 2018-08-27 2025-05-15 ノース カロライナ ステート ユニバーシティ Targeting Kit with splice-switching oligonucleotides to induce apoptosis in mast cells - Patent Application 20070123333

Also Published As

Publication number Publication date
EP0580795A4 (en) 1995-11-15
AU2335192A (en) 1992-12-21
CA2107915A1 (en) 1992-11-12
EP0580795A1 (en) 1994-02-02
WO1992019252A1 (en) 1992-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5652222A (en) Selective inhibition of leukemic cell proliferation by bcr-abl antisense oligonucleotides
AU641636B2 (en) Antisense oligonucleotides to C-MYB proto-oncogene and uses thereof
US6277832B1 (en) Growth inhibitor for leukemia cells comprising antisense oligonucleotide derivative to wilms tumor gene (wt1)
US5618709A (en) Antisense oligonucleotides specific for STK-1 and method for inhibiting expression of the STK-1 protein
JPH08504083A (en) Synthetic antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them
EP0668782B1 (en) Combination of antineoplastic agent and antisense oligonucleotides for treatment of cancer
AU2011301712B2 (en) Method for reducing the number of certain circulating leukocytes in a human subject
CN102869386A (en) AntimiR-451 for the treatment of polycythemias
US5612212A (en) Selective inhibition of cell proliferation by vav antisense oligonucleotides
AU784358B2 (en) Antisense compositions and cancer-treatment methods
JP3904260B2 (en) Leukemia cell growth inhibitor comprising an antisense oligonucleotide derivative against Wilms tumor gene (WT1)
JP2002507186A (en) Antisense oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and uses thereof
US5989849A (en) Antisense of oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and in vitro methods
JPH05500217A (en) Antisense oligonucleotide against c-abl proto-oncogene
JPH07501525A (en) Treatment of melanoma with antisense oligonucleotides against the c-myb proto-oncogene
JPH06508130A (en) Treatment of colorectal cancer with antisense oligonucleotides against the c-myb proto-oncogene
JP2003527096A (en) C-MYC antisense-treated hematopoietic stem cell composition and method
CA1340369C (en) Antisense oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof
WO2008126085A2 (en) Method for treating bone marrow disorders
CA2004364C (en) Antisense oligonucleotides to c-myb oncogene and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A313 Final decision of rejection without a dissenting response from the applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A313

Effective date: 20040210

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20040302