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JP2002507421A - ＧＦＲα３およびその使用 - Google Patents

ＧＦＲα３およびその使用

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JP2002507421A
JP2002507421A JP2000538000A JP2000538000A JP2002507421A JP 2002507421 A JP2002507421 A JP 2002507421A JP 2000538000 A JP2000538000 A JP 2000538000A JP 2000538000 A JP2000538000 A JP 2000538000A JP 2002507421 A JP2002507421 A JP 2002507421A
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receptor
polypeptide
cells
gfrα3
nucleic acid
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ロバート ディー． クライン，
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アーノン ローゼンザル，
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ジェネンテク・インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＧＤＮＦ（すなわち、ＧＦＲ）レセプターファミリーの新規なα−サブユニットレセプターである哺乳動物ＧＦＲα３を発現する、発現配列タグ（ＥＳＴ）を含むヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチドプローブ、ポリペプチド、ベクターおよび宿主細胞、ならびにこの哺乳動物ＧＦＲα３に対する免疫付着因子および抗体に関する。本発明はさらに、チロシンキナーゼレセプター活性化（すなわち、自己リン酸化）、またはリガンド誘導α−サブユニットレセプターのホモ二量体化もしくはホモ−オリゴマー化に関連する他の活性を検出することによるα−サブユニットレセプターの活性化を測定するためのアッセイに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、新規なＤＮＡの同定および単離、ならびにα−サブユニッ
トレセプターであるＧＦＲα３配列の存在によって特徴付けられる新規なポリペ
プチドの組換え産生に関する。本発明はさらに、α−サブユニットレセプターの
リガンド誘導活性化を測定するためのアッセイに関し、このアッセイは、キナー
ゼレセプター活性化、酵素結合イムノソルベント検定法（ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ
）を使用するαレセプターのキナーゼドメイン−レセプタータンパク質チロシン
キナーゼ（ｒＰＴＫ）融合物の自己リン酸化の検出、またはα−サブユニットホ
モ二量体化を検出する他の手段による。
【０００２】 （序論） （背景） 神経栄養因子（例えば、インスリン様増殖因子、神経成長因子、脳由来神経栄
養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４／５、およびニュー
ロトロフィン−６、毛様体神経栄養因子、ＧＤＮＦ、ならびにニューツリン（ｎ
ｅｕｒｔｕｒｉｎ）は、特定のニューロン細胞の生存を増強するための潜在的な
手段として、例えば、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイ
マー病、発作、てんかん、ハンティングトン病、パーキンソン病、および末梢神
経障害）のための処置として、提唱されている。この目的のためのさらなる治療
を提供することが望ましい。タンパク質神経栄養因子、すなわちニューロトロフ
ィンは、脊椎動物の神経系の成長および発達に影響を及ぼし、脳および末梢にお
ける異なる群のニューロンの分化、生存、および機能を促進することにおいて重
要な役割を果たすと考えられる。神経栄養因子は、一部には、神経成長因子（Ｎ
ＧＦ）に関して確立された前例に基づいて、神経組織において重要なシグナル伝
達機能を有すると考えられている。ＮＧＦは、インビトロおよびインビボの両方
において、交感ニューロン、感覚ニューロン、および前脳脳幹ニューロン（ｂａ
ｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｎｅｕｒｏｎ）の生存を支持する。外因性ＮＧＦ
の投与は、発達間の細胞死からニューロンを救う。逆に、抗ＮＧＦ抗体の投与に
よる内因性ＮＧＦの除去または隔離によって、そのような細胞死は促進される（
Ｈｅｕｍａｎｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、１３２：１３３〜１５０（１９８７
）；Ｈｅｆｔｉ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、６：２１５５〜２１６２（１９８６
）；Ｔｈｏｅｎｅｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、６０：２８４〜
３３５（１９８０））。
【０００３】 ＮＧＦに関連するさらなる神経栄養因子がその後に同定されている。これらに
は、以下が挙げられる：脳由来神経栄養因子（ＢＤＧＦ）（Ｌｅｉｂｒｏｃｋら
、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：１４９〜１５２（１９８９）、ニューロトロフィン−
３（ＮＴ−３）（Ｋａｉｓｈｏら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２６６：１８７（１
９９０）；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６６（
１９９０）；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｎｅｕｒｏｎ，４：７６７（１９９０））
、およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）（Ｂｅｒｋｍｅｉｅｒら、
Ｎｅｕｒｏｎ，７：８５７〜８６６（１９９１））。
【０００４】 他のポリペプチド増殖因子と同様に、ニューロトロフィンは、細胞表面レセプ
ターとの相互作用を介してそれらの標的細胞に影響を及ぼす。現在のところの理
解に従って、２種の膜貫通糖タンパク質が、公知のニューロトロフィンについて
のレセプターとして作用する。平衡結合研究によって、ニューロトロフィン応答
性ニューロン細胞は、共通の低分子量（６５，０００〜８０，０００ダルトン）
、代表的にはｐ７５LNGFRまたはｐ７５と呼ばれる低親和性レセプター、および 高分子量（１３０，０００〜１５０，０００ダルトン）レセプターを有すること
が示されている。高親和性レセプターは、レセプターチロシンキナーゼのｔｒｋ
ファミリーのメンバーである。
【０００５】 レセプターチロシンキナーゼは、細胞の増殖、分化、および生存を促進する種
々のタンパク質因子のレセプターとして作用することが知られている。ｔｒｋレ
セプターに加えて、他のレセプターチロシンキナーゼの例には、上皮増殖因子（
ＥＧＦ）のレセプター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のレセプター、および血
小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のレセプターが挙げられる。代表的には、これら
のレセプターは細胞膜を貫通し、レセプターの１つの部分は、細胞内に存在し細
胞質と接触し、そしてレセプターの別の部分は細胞外に存在する。レセプターの
細胞外部分へのリガンドの結合は、レセプターの細胞内部分においてチロシンキ
ナーゼ活性を誘導し、種々の細胞内タンパク質のリン酸化が細胞シグナル伝達経
路に関与するするのを確実にする。
【０００６】 グリア細胞株由来神経栄養因子（「ＧＤＮＦ」）およびニューツリン（「ＮＴ
Ｎ」）は、近年に同定された２つの構造的に関連のある、交感感覚ニューロンお
よび中枢神経系ニューロンについての強力な生存因子である（Ｌｉｎら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６０：１１３０〜１１３２（１９９３）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０６２〜１０６４（１９９４）；Ｂｕｊ−Ｂｅｌｌ
ｏら、Ｎｅｕｒｏｎ １５：８２１〜８２８（１９９５）；Ｋｏｔｚｂａｕｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４：４６７〜４７０（１９９６））。近年、ＧＤＮＦは
、リガンド結合グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパ
ク質（ＧＤＮＦＲαと命名され；ＧＦＲ−α−１としても命名される）および膜
貫通レセプターチロシンキナーゼＲｅｔから構成される複数成分のレセプター系
を通じてその作用を媒介することが示された（Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３８２：８０〜８３（１９９６）；Ｊｉｎｇら、Ｃｅｌｌ ８５：１１１３〜
１１２４（１９９６）；Ｔｒｕｐｐら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：７８５〜７８９
（１９９６）；Ｄｕｒｂｅｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：７８９〜７９３（１９
９６））。ＮＴＮシグナルは、ＧＦＲα２（これはまた、Ｒｅｔ関連である）を
通じて伝達される。
【０００７】 膜結合タンパク質およびレセプターは、多細胞生物における形成、分化、およ
び維持において重要な役割を果たし得る。多くの個々の細胞の運命（例えば、増
殖、移動、分化、または他の細胞との相互作用）は、代表的には他の細胞から受
けた情報および／または直接的な環境によって支配される。この情報は、頻繁に
、分泌型ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞傷害性因子、分
化因子、神経ペプチド、およびホルモン）によって伝達され、次いでこれらのポ
リペプチドは、多様な細胞レセプターまたは膜結合タンパク質によって受容され
、そして妨げられる。そのような膜結合タンパク質および細胞レセプターには、
以下が挙げられるがそれらに限定されない：サイトカインレセプター、レセプタ
ーキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプ
ター、ならびにセレクチンおよびインテグリンのような細胞付着分子。例えば、
細胞増殖および分化を調節するシグナル伝達は、一部には、種々の細胞タンパク
質のリン酸化によって調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるタンパク
質チロシンキナーゼもまた、増殖因子レセプターとして作用し得る。例として、
線維芽細胞増殖因子レセプターおよび神経成長因子レセプターが挙げられる。
【０００８】 膜結合タンパク質およびレセプター分子は、製剤および診断剤を含む種々の産
業上の適用を有する。例えば、レセプター免疫付着因子は、レセプター−リガン
ド相互作用をブロックするための治療剤として使用され得る。この膜結合タンパ
ク質はまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチドインヒ
ビターまたは低分子インヒビターのスクリーニングのために使用され得る。
【０００９】 これらのレセプターチロシンキナーゼのいずれか１つの異常な発現または制御
されていない調節は、異なる悪性疾患および病理学的障害を生じ得る。従って、
レセプターチロシンキナーゼ経路関連障害および細胞プロセスの診断および治療
のための新規かつさらなる手段を提供するために、レセプターチロシンキナーゼ
（「ＲＴＫ」）、それらのリガンド、またはそれらが結合するα−サブユニット
レセプター分子（例えば、ＧＰＩ結合α−サブユニットレセプター）を調節、制
御、および操作する手段を同定する必要性が存在する。本願は、臨床医および研
究者に、特定のレセプター遺伝子およびそれらの遺伝子産物との相互作用に特異
的である新しい分子を提供することによってそのような手段を提供する。本明細
書中において提供されるこれらの化合物およびその使用方法は、非常に優れた治
療的制御および特異性を可能にする。従って、本発明の目的の１つは、特定の神
経栄養性シグナル伝達経路が役割を果たす神経学的状態および他の状態の予防お
よび／または処置のための改良された治療を提供することである。
【００１０】 （要旨） 本出願人らは、本出願において「ＧＦＲα３」として命名される新規なヒトポ
リペプチドまたはそのホモログをコードするｃＤＮＡのファミリーを同定した。
このＧＦＲα３は、α−サブユニットレセプター、リガンド結合に応答してβサ
ブユニットレセプターと複合体化するレセプターである。α−サブユニットはリ
ガンド結合成分を提供し、そしてβサブユニットはチロシンキナーゼ活性のよう
な触媒性シグナル伝達活性を提供する。ＧＦＲα３レセプターファミリーメンバ
ーは、Ｒｅｔと称されるβサブユニットレセプターと複合体化する。このヘテロ
複合体は、シグナル伝達を生じる。本発明は、一部には、α−サブユニットがリ
ガンド結合の際に二量体化し得、そしてさらにこの二量体化は、α−サブユニッ
トレセプターのリガンド−結合ドメインに融合したキナーゼ触媒ドメインのキナ
ーゼ活性を活性化し得るという知見に基づく。
【００１１】 １つの実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸２７〜４
００、配列番号１７のアミノ酸２７〜３６９、もしくは配列番号５のアミノ酸２
７〜３７４の配列を含むＧＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸配列、または
（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補体、に対して少なくとも約６５％の配列同一性を
有する単離された核酸分子を提供する。別の実施態様において、上記の核酸配列
は、配列番号１５のアミノ酸８４〜３６０のＧＦＲα３ポリペプチドのリガンド
結合ドメイン、配列番号１７のアミノ酸８４〜３２９のＧＦＲα３ポリペプチド
のリガンド結合ドメイン、もしくは配列番号２０のアミノ酸１１０〜３８６の配
列のＧＦＲα３ポリペプチドのリガンド結合ドメイン、またはそれらの相補的核
酸を含む。この単離された核酸は、好ましくは、本発明のＧＦＲα３ポリペプチ
ドをコードする核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＧＦ
Ｒα３コード配列を含む。この配列同一性は、好ましくは少なくとも約７５％、
より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最
も好ましくは少なくとも９５％である。１つの局面において、このコードされる
ポリペプチドは、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ま
しくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして最も
好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を、配列番号１５のアミノ酸残基２７
〜４００、配列番号１７のアミノ酸２７〜３６９、配列番号５のアミノ酸２７〜
３７４、または配列番号１５のアミノ酸８４〜３６０のＧＦＲα３ポリペプチド
のリガンド結合ドメイン、配列番号１７のアミノ酸８４〜３２９のＧＦＲα３ポ
リペプチドのリガンド結合ドメイン、もしくは配列番号２０のアミノ酸１１０〜
３８６の配列のＧＦＲα３ポリペプチドの配列に対して有する。好ましくは、こ
の同一性は、配列番号１５のアミノ酸残基２７〜４００およびそれをコードする
ＤＮＡに対しての同一性である。さらなる実施態様において、この単離された核
酸分子は、配列番号１５のアミノ酸残基２７〜４００を有するＧＦＲα３ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを含むか、またはそのようなコード核酸配列に相補的
であり、そして少なくとも適度な（ｍｏｄｅｒａｔｅ）ストリンジェンジェンシ
ー条件下、そして必要に応じて高いストリンジェンジェンシー条件下でその核酸
に安定に結合したままである。別の局面において、本発明は、クローンＤＮＡ４
８６１３、ＤＮＡ４８６１４、またはマウスＧＦＲα３（クローン１３）の全長
タンパク質の核酸を提供する。これらは、ＡＴＣＣに、それぞれ受託番号ＡＴＣ
Ｃ２０９７５２（名称：ＤＮＡ４８６１３−１２６８）、ＡＴＣＣ２０９７５１
（名称：ＤＮＡ４８６１４−１２６８）、およびＡＴＣＣ として１９９８年
４月７日に寄託されている。
【００１２】 なお別の実施態様において、本発明は、ＧＦＲα３ポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含むベクターを提供する。そのようなベクターを含む宿主細胞もまた提
供される。例として、この宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、または酵母
細胞であり得る。さらに、ＧＦＲα３ポリペプチドを産生するためのプロセスが
提供され、そしてこのプロセスは、ＧＦＲα３の発現に適切な条件下で宿主細胞
を培養する工程、およびこの細胞培養物からＧＦＲα３を回収する工程を包含す
る。
【００１３】 なお別の実施態様において、本発明は、単離されたＧＦＲα３ポリペプチドを
提供する。詳細には、本発明は、単離されたネイティブ配列ＧＦＲα３ポリペプ
チドを提供し、１つの実施態様においてこのポリペプチドは、配列番号１５の残
基２７〜４００を含むアミノ酸配列を含む。特に、配列番号１５中のネイティブ
シグナル配列（アミノ酸１〜２６）を含むかまたは含まず、そして開始メチオニ
ンを含むかまたは含まない、ネイティブＧＦＲα３ポリペプチドが含まれる。な
お別の実施態様において、配列番号１５のアミノ酸残基２７〜４００、配列番号
１７のアミノ酸２７〜３６９、配列番号５のアミノ酸２７〜３７４、または配列
番号１５のアミノ酸８４〜３６０のＧＦＲα３ポリペプチドのリガンド結合ドメ
イン、配列番号１７のアミノ酸８４〜３２９のＧＦＲα３ポリペプチドのリガン
ド結合ドメイン、もしくは配列番号２０のアミノ酸１１０〜３８６の配列のＧＦ
Ｒα３ポリペプチドのリガンド結合ドメインを含むポリペプチドが提供される。
あるいは、本発明は、上記の受託番号の下に寄託された核酸によってコードされ
るＧＦＲα３ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、必要に応じて、Ｇ
ＰＩアンカーと関連する疎水性配列を欠いている。
【００１４】 なお別の実施態様において、本発明は、異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列
に融合されたＧＦＲα３ポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。そのような
キメラ分子の例には、エピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域に融
合した、ＧＦＲα３ポリペプチドが挙げられる。このキメラ分子は、α−サブユ
ニットレセプターのリガンド結合ドメイン、チロシンキナーゼレセプターの細胞
内触媒ドメイン、およびフラッグエピトープを含み得る。
【００１５】 なお別の実施態様において、本発明は、ＧＦＲα３ポリペプチドに特異的に結
合する抗体を提供する。必要に応じて、この抗体はモノクローナル抗体である。
【００１６】 本明細書中での、α−サブユニットレセプターがリガンド結合の際に二量体化
し得、さらにそのような二量体化が、α−サブユニットレセプターに融合したキ
ナーゼドメインを活性化し得るという驚くべき知見を考慮して、リガンド誘導α
サブユニットレセプター活性化（すなわち、ホモ二量体化またはホモオリゴマー
化）を測定するための方法が本明細書中で提供される。１つの実施態様において
、好ましくはα−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメインおよびレセプ
タータンパク質チロシンキナーゼの細胞内触媒ドメインを含むポリペプチド融合
物のレセプタータンパク質チロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ）自己リン酸化を測定す
ることによって、アゴニストまたはリガンドによって誘導されるαサブユニット
レセプター活性化（すなわち、ホモ二量体化またはホモオリゴマー化）を測定す
る、感度の良い信頼性のあるアッセイが提供される。この構築物はさらに、必要
に応じて活性化（例えば、二量体化、リン酸化）されたα−サブユニットレセプ
ターの捕捉および検出を促進するフラッグエピトープを含み得る。このアッセイ
は、α−サブユニットレセプター活性化を定性的または定量的に測定するため、
ならびに選択されたα−サブユニットレセプターについての潜在的なアゴニスト
およびアンタゴニストの同定および特徴付けを促進するために望ましく有用であ
る。本発明のさらなる目的は、リガンド−レセプター相互作用が、任意の選択さ
れたα−サブユニットレセプター、好ましくはＧＦＲαサブユニットレセプター
について研究されるのを可能にするアッセイを提供することである。
【００１７】 このアッセイは、高処理能力、すなわち比較的短い時間（例えば、１日）に多
数のサンプルを確実に評価する能力を有なさなくてはならない。このアッセイは
、理想的には、放射活性物質を使用せず、そしてまた自動化を受け易い。
【００１８】 本発明の少なくとも１つの実施態様において、所望の特徴を有するレセプター
特異的捕捉薬剤が利用可能であるか否かにかかわらず、目的のα−サブユニット
レセプターが研究されるのを可能にする一般的アッセイが提供される。さらに、
本発明の目的は、インサイチュでα−サブユニットレセプターのリガンド結合活
性を実質的に示すアッセイを提供することである。このことは、このレセプター
とこのリガンドとの間の相互作用の変化が、このレセプターが膜に結合していな
い結果として生じ得るという可能性を低減する限り、望ましい。このアッセイの
１つの実施態様において、セリン−トレオニンキナーゼリン酸化、細胞内キナー
ゼのリン酸化、およびα−サブユニットレセプターに融合した触媒ドメインのホ
スファターゼ活性を検出することによる、リガンド結合を測定するための方法が
提供される。従って、本発明は、ホモ二量体化またはホモオリゴマー化を検出し
、次いで目的のα−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメインに融合して
いる触媒ドメインのキナーゼまたはホスファターゼ活性（すなわち、自己リン酸
化による）を測定することによる、α−サブユニットレセプター構築物キメラの
活性化またはリガンド結合を測定するためのアッセイを提供する。
【００１９】 このアッセイは、２つの主要な段階に分けられ得、一般にその各々は、別々の
アッセイプレートにおいて行われる。このアッセイの第１段階は、好ましくはア
ッセイのＫＩＲＡ段階においてα−サブユニット構築物を活性化する工程を包含
する。アッセイの第２段階は、レセプター構築物の活性化を測定する工程を包含
する。簡便には、これは、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を使
用して、レセプター構築物活性化を測定して達成する。
【００２０】 このアッセイのＫＩＲＡ段階は、α−サブユニットレセプターの細胞外ドメイ
ンが細胞の外部環境に面し、膜貫通ドメインが細胞膜に位置し、そして触媒性キ
ナーゼドメインが細胞内に位置するように、真核生物細胞の細胞膜に位置するα
−サブユニットレセプター−キナーゼレセプター融合構築物を活性化する工程を
包含する。アッセイ全体のこの段階は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を包含する
： （ａ）細胞（通常には、哺乳動物細胞株）が、第１の固相（例えば、第１のア
ッセイプレートのウェル）に付着するように、この細胞の実質的に均一の集団で
この固相をコートする。頻繁に、この細胞は付着性であり、それによってこの第
１の固相に自然に付着する。本発明の１つの実施態様において、この細胞は、触
媒性キナーゼドメインに融合されたα−サブユニットレセプターリガンド結合ド
メインを含むポリペプチドレセプター構築物をコードするＤＮＡ、または以下に
さらに規定される「レセプター構築物」をコードするＤＮＡで形質転換されてお
り、このＤＮＡは、このレセプターまたはレセプター構築物がその細胞膜に適切
に位置するように、この細胞によって発現される。
【００２１】 このレセプター構築物はさらに、好ましくはフラッグポリペプチドとの融合を
含む。このフラッグポリペプチドは、このアッセイのＥＬＩＳＡ部分において、
捕捉薬剤（頻繁には、捕捉抗体）によって認識される。本明細書中において開示
されるレセプター構築物の使用は、特に有利である。なぜなら、この使用は、必
要とされる特徴を有するレセプター特異的捕捉薬剤が利用可能であるか否かにか
かわらず、任意のキナーゼレセプタードメインの自己リン酸化が測定され得る「
一般的」アッセイを提供するからである。頻繁には、このレセプター構築物は、
選択されたα−サブユニットレセプターのＥＣＤ、別の十分に特徴付けられたチ
ロシンキナーゼ（例えば、Ｒｓｅレセプター）の触媒性ＩＣＤ（および可能性と
しては、膜貫通ドメイン）を含む融合タンパク質である。
【００２２】 （ｂ）次いで、このレセプター構築物がこの分析物に曝露（または接触）され
るように、この付着している細胞を有するウェルに分析物を添加する。このアッ
セイは、目的のα−サブユニットアッセイについてのアゴニストリガンドおよび
アンタゴニストリガンドの同定を可能にする。アゴニストリガンドによるこのレ
セプターの結合および／または活性化をブロックするアンタゴニストリガンドの
存在を検出するために、この付着している細胞を、最初にアンタゴニストリガン
ドである疑いのあるもの、次いでアゴニストリガンド（または、アゴニストおよ
びアンタゴニストの混合物）に曝露し、レセプター結合および活性化の競合的阻
害を測定し得る。また、このアッセイは、アゴニストリガンドに結合しそれによ
ってキナーゼドメインに結合してそれを活性化する能力を低減または排除する、
アンタゴニストを同定し得る。そのようなアンタゴニストを検出するために、レ
セプターについてのアンタゴニストと疑われるものおよびアゴニストをともにイ
ンキュベートし、次いで付着している細胞を、このリガンド混合物に曝露する。
【００２３】 （ｃ）この分析物への曝露後に、この付着している細胞を、溶解緩衝液（これ
は、その中に溶解化界面活性剤を有する）および緩やかな攪拌を使用して溶解し
、それによって細胞溶解物を遊離させ、この細胞溶解物を、この細胞溶解物の濃
縮または浄化の必要なく、このアッセイのＥＬＩＳＡ部分に直接的に供し得る。
従って、このアッセイは、驚くべきことにＥＬＩＳＡの前にこの細胞溶解物を濃
縮することを必要としない限り、ＫｎｕｔｓｏｎおよびＢｕｃｋ（前出）、Ｋｌ
ｅｉｎら（前出）、およびＨａｇｉｎｏら（前出）によって記載されるアッセイ
に対して顕著な改変を提供する。さらに、本アッセイにおいて、他のアッセイと
は異なり、細胞は、細胞のホモジナイズ、遠心分離、または浄化の必要なく、緩
やかな攪拌を用いて溶解緩衝液中に溶解され得る。次いで、このように調製され
た細胞溶解物は、アッセイのＥＬＩＳＡ段階に供される準備をされる。驚くべき
ことに、この第１のアッセイプレートは、このアッセイのＥＬＩＳＡ段階の前に
有意な時間（少なくとも６ヶ月）、凍結温度（すなわち、約−２０℃〜−７０℃
）にて保存され得ることが発見された。これは、このアッセイのＫＩＲＡおよび
ＥＬＩＳＡ段階が別々の日に実施され得る限り、有意な知見である。
【００２４】 このアッセイのＥＬＩＳＡ構成は、以下に記載される工程（ｄ）〜（ｈ）を含
む。
【００２５】 （ｄ）第１の工程として、この第２の固相（通常には、ＥＬＩＳＡマイクロタ
イタープレートのウェル）を、このレセプター構築物、好ましくは必要に応じて
存在するフラッグポリペプチドに特異的に結合する捕捉薬剤（頻繁には、捕捉抗
体）でコートする。この第２の固相のコーティングを、この捕捉薬剤がこの第２
の固相に付着するように行う。この捕捉薬剤は、一般にモノクローナル抗体であ
るが、本明細書中の実施例において記載されるように、ポリクローナル抗体もま
た使用され得る。
【００２６】 （ｅ）このアッセイの上述のＫＩＲＡ段階の工程（ｃ）において得られる細胞
溶解物を、このレセプター構築物がこの第２の固相に付着する（または、捕捉さ
れる）ように、この付着している捕捉薬剤に曝露するか、または接触させる。本
発明のアッセイは、Ｋｌｅｉｎらのアッセイとは異なり、このレセプターまたは
レセプター構築物のこの第２の固相への適切な固定を達成するために、レセプタ
ーに対するリガンドならびにキナーゼインヒビターが存在していることを必要と
しない。
【００２７】 （ｆ）次いで、結合していない細胞溶解物を除去し、この捕捉されたレセプタ
ーまたはレセプター構築物を残すように、洗浄工程を行う。
【００２８】 （ｇ）次いで、付着しているかまたは捕捉されたレセプター構築物を、チロシ
ンキナーゼレセプタードメイン中のリン酸化チロシン残基を同定する抗ホスホチ
ロシン抗体に曝露またはそれと接触させる。好ましい実施態様において、この抗
ホスホチロシン抗体は、非放射活性発色試薬の発色変化を触媒する酵素に（直接
的または間接的に）結合している。従って、このレセプターのリン酸化は、この
試薬のその後の発色変化によって測定され得る。この酵素は、抗ホスホチロシン
抗体に直接的に結合され得るか、または結合している分子（例えば、ビオチン）
が、抗ホスホチロシン抗体に結合され得、続いて、この酵素は、この結合してい
る分子を通じてこの抗ホスホチロシン抗体に結合され得る。
【００２９】 （ｈ）最終的に、この捕捉されたレセプター構築物へのこの抗ホスホチロシン
抗体への結合は、例えば発色試薬における発色変化によって測定され得る。
【００３０】 本発明はまた、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡアッセイにおける使用のために特に有用
であるＲｓｅフラッグ試薬に関する。このＲｓｅフラッグ試薬は、Ｒｓｅ ｒＰ
ＴＫの細胞内ドメインのカルボキシル末端へのフラッグポリペプチド（通常は、
本明細書中に記載されるｇＤフラッグ）の融合を含むポリペプチドである。一般
には、Ｒｓｅの膜貫通ドメインおよび目的の別のｒＰＴＫの細胞外ドメインもま
た、この融合ポリペプチド試薬中に存在する。この試薬をコードする核酸および
それで形質転換された細胞もまた本願発明である。
【００３１】 なおさらなる局面において、本発明は、上記に開示されるＫＩＲＡ ＥＬＩＳ
Ａにおいて使用され得るキットに関し、このキットは、抗フラッグポリペプチド
捕捉薬剤（例えば、捕捉抗体）（これは、通常、本明細書中に記載されるような
第２の固相に結合している）、およびレセプター構築物を含む。従って、このキ
ットは、一般に、抗フラッグポリペプチド捕捉抗体がそのウェルに付着している
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを提供する。必要に応じて、このキットが
、頻繁には標識されている抗ホスホチロシン抗体も提供するか、または抗ホスホ
チロシン抗体を標識するための試薬が、このキットに供給される。時に、本明細
書中に記載されるレセプター構築物で形質転換された細胞の均一の集団もまた、
このキットとともに提供される。このキットはまた、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡを実
施するための指示書を含み得る。
【００３２】 （好ましい実施態様の詳細な説明） （Ｉ．定義） 本明細書中で使用される用語「ＧＦＲα３」、「ＧＦＲα３ポリペプチド」お
よび「ＧＦＲα３ホモログ」は、ネイティブ配列ＧＦＲα３およびＧＦＲα３改
変体（これは、さらに本明細書中以下で定義される）を含む。このＧＦＲα３は
、種々の供給源から（例えば、ヒト組織型から、または別の供給源から）単離さ
れ得るか、または組換え方法もしくは合成方法によって調製され得る。「ネイテ
ィブ配列ＧＦＲα３」は、天然由来のＧＦＲα３と同じアミノ酸配列を有するポ
リペプチドを含む。そのようなネイティブ配列ＧＦＲα３は、天然から単離され
得るか、または組換え手段もしくは合成手段によって生成され得る。用語「ネイ
ティブ配列ＧＦＲα３」は、特に、ＧＦＲα３の天然に存在する短縮形態または
分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、ＧＦＲα３の天然に存在する改変体
形態（例えば、選択的スプライシング形態）およびＧＦＲα３の天然に存在する
対立遺伝子変異体を含む。本発明の１つの実施態様において、このネイティブ配
列ＧＦＲα３は、Ｎ末端シグナル配列を含むかまたは含まず、そして１位の開始
メチオニンを含むかまたは含まない、配列番号１５のアミノ酸１〜４００を含む
、成熟または全長のネイティブ配列ＧＦＲα３である。
【００３３】 「ＧＦＲα３改変体」は、（ａ）そのネイティブシグナル配列を含むかもしく
は含まない、ＧＦＲα３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（
ａ）のＤＮＡ分子の相補体、に対して少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性
を有する、以下に定義されるような活性なＧＦＲα３を意味する。特定の実施態
様において、このＧＦＲα３改変体は、全長ネイティブ配列ＧＦＲα３について
の配列番号１５に示される推定アミノ酸配列を有するＧＦＲα３と少なくとも約
８０％アミノ酸配列相同性を有する。このようなＧＦＲα３改変体は、例えば、
配列番号１５の配列のＮ末端またはＣ末端に１つ以上のアミノ酸残基が付加また
は欠失しているＧＦＲα３ポリペプチドを含む。好ましくは、この核酸配列同一
性またはアミノ酸配列同一性は、少なくとも約７５％であり、より好ましくは少
なくとも約８０％であり、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９０％であ
り、そしてなおさらにより好ましくは少なくとも約９５％である。
【００３４】 本明細書中において同定されるＧＦＲα３配列に関する「アミノ酸配列同一性
パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列を
整列させ、そして必要な場合にはギャップを導入した後に、ＧＦＲα３配列にお
けるアミノ酸残基と同一である（任意の保存的置換は配列同一性の部分として考
えない）候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。ア
ミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者
の範囲内の種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩ
ＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公けに
利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成され得る。当業者は、比較さ
れる配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要とされる任
意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを
決定し得る。
【００３５】 本明細書中において同定されるＧＦＲα３配列に関する「核酸配列同一性パー
セント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列を整列
させ、そして必要な場合にはギャップを導入した後に、ＧＦＲα３配列における
ヌクレオチドと同一である候補配列におけるヌクレオチドのパーセンテージとし
て定義される。核酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメン
トは、当業者の範囲内の種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ
−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアの
ような公けに利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成され得る。当業
者は、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必
要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切な
パラメータを決定し得る。
【００３６】 本明細書中において開示される種々のポリペプチドを記載するために使用され
る「単離された」は、その天然の環境の成分から同定され、そして分離および／
または回収されたポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、ポリ
ペプチドについての診断的使用または治療的使用を代表的に阻害する物質であり
、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質様溶質または非タンパク質様溶
質を含み得る。好ましい実施態様において、このポリペプチドは、（１）回転カ
ップ配列決定機（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｅｒ）の使用に
よってＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得る
ために十分な程度まで、または（２）クマシーブルー、または好ましくは銀染色
を使用して、非還元条件下または還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質
になるまで精製される。単離されたポリペプチドは、組換え細胞内にインサイチ
ュでポリペプチドを含む。なぜなら、ＧＦＲα３天然環境のうちの少なくとも１
つの成分は存在しないからである。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、
少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００３７】 「単離された」ＤＮＡ４８６１３核酸分子は、ＤＮＡ４８６１３核酸の天然の
供給源中で通常結合されている少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定および単
離された核酸分子である。単離されたＤＮＡ４８６１３核酸分子は、天然におい
て見出される形態または様式以外である。従って、単離されたｄ４８６１３核酸
分子は、天然細胞中に存在する場合に、ＤＮＡ４８６１３核酸分子と区別される
。しかし、単離されたＤＮＡ４８６１３核酸分子は、例えば、その核酸分子が天
然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある場合に通常にＤＮＡ４８６１
３を発現する細胞に含まれるＤＮＡ４８６１３核酸分子を含む。
【００３８】 用語「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結したコード配列
の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切である制御配列は、例えば、
プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含
む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハン
サーを利用することが知られている。
【００３９】 核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、「作動可能に連結
」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、ポリ
ペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプ
チドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは
、コード配列の転写に影響を及ぼす場合にそのコード配列に作動可能に連結され
ており；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている
場合にコード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結され
ている」は、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり、そして分泌リーダーの
場合に連続的かつ読み取り相中にある。しかし、エンハンサーは、連続的である
必要はない。連結は、便利な制限部位での連結によって達成される。そのような
部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、
従来の実施に従って使用される。
【００４０】 ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容
易に決定可能であり、そして一般にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存
する実験計算値である。一般に、プローブが長いほど適切なアニーリングのため
により高い温度が必要であるが、プローブが短いほどより低い温度を必要とする
。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がそれらの融解温度より下の環境
に存在する場合、変性されたＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プロ
ーブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用
され得る相対温度はより高い。結果として、より高い相対温度は反応条件をより
ストリンジェントにする傾向にあるが、より低い温度はより低いストリンジェン
トにするということができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシ
ーのさらなる詳細および説明について、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。
【００４１】 本明細書中で定義される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェ
ンシー条件」は、以下によって同定され得る：（１）洗浄のために、低イオン強
度および高温を使用する条件（例えば、５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム
／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）；（
２）ハイブリダイゼーション間に、ホルムアミドのような変性剤を使用する条件
（例えば、４２℃にて５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドおよび０．１％ウシ血清ア
ルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５
の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエ
ン酸ナトリウム）；または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（
０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナ
トリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液
、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および
１０％硫酸デキストランを使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸
ナトリウム）および０．１％ＳＤＳ中４２℃で洗浄する条件；または（４）５５
℃にて１０％硫酸デキストラン、２×ＳＳＣ、および５０％ホルムアミドの緩衝
液を使用し、続いてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシ
ー洗浄を５５℃にて行う条件。
【００４２】 「適度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によっ
て記載されるように同定され得、そして上記のストリンジェントより低いストリ
ンジェントの洗浄液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン
強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。適度にストリンジェントな条件の例は、
２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三
ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液
、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを
含む溶液中での３７℃での一晩のインキュベーション、続く約３７〜５０℃での
１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブ長などのような
因子を適合させるのに必要な温度、イオン強度などを調整する方法を理解する。
【００４３】 「ｒＰＴＫ」は、レセプタータンパク質チロシンキナーゼを意味する。
【００４４】 「ＥＣＤ」、「ＴＭドメイン」、および「ＩＣＤ」は、それぞれ、ｒＰＴＫの
細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインをいう。
【００４５】 本出願を通して使用される場合、「キナーゼレセプター活性化」または「ＫＩ
ＲＡ」は、細胞結合レセプター構築物（代表的には、ｒＰＴＫ ＩＣＤドメイン
を有する）が、このレセプター構築物のｒＰＴＫ部分の細胞内ドメイン中のチロ
シン残基のリン酸化を誘導し得る（または誘導し得ない）可能性のあるアゴニス
ト／アンタゴニストリガンドに曝露される、本願のアッセイの第１の段階をいう
。ＫＩＲＡは、一般に、本明細書中において定義される「第１のアッセイプレー
ト」において実施される。米国特許第５，７６６，８６３号およびその対応ＷＯ
公開（題「Ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｓｓａ
ｙ」）が、レセプター細胞外ドメインおよび置換酵素ドメイン（例えば、チロシ
ンキナーゼドメイン）の組換え発現されたタンパク質融合物を使用するＫＩＲＡ
アッセイを教示するためにその全体が本明細書によって本明細書中に援用される
。
【００４６】 「酵素結合イムノソルベント検定法」または「ＥＬＩＳＡ」は、本願アッセイ
の第２段階をいい、そしてレセプター構築物のキナーゼドメインのチロシンリン
酸化を測定する工程を包含する。ＥＬＩＳＡは、通常、本出願において開示され
るような「第２のアッセイプレート」中で行われる。ＥＬＩＳＡは、第２の固相
（通常には、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル）にレセプター構築
物を捕捉する工程を包含する限り、「サンドウィッチＥＬＩＳＡ」である。ＥＬ
ＩＳＡアッセイは、一般に、酵素−抗体結合体の調製を含む。この結合された酵
素は、基質を切断し、分光測定法によって検出され得る発色性反応生成物を生じ
る。このアッセイにおいて、個々のマイクロタイターウェル中の発色した溶液の
吸光度は、ホスホチロシンの量に比例する。ＥＬＩＳＡの概説は、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻
、第１１章（１９９１）に見出される。用語「ＥＬＩＳＡ」は、本願のアッセイ
の第２段階を記載するために使用されるが、これは、本発明の好ましい実施態様
であるのみである。なぜなら、本明細書中に開示されるように、酵素検出以外の
技術が、活性化されたレセプターへの抗ホスホチロシン抗体の結合を測定するた
めに利用可能であるからである。
【００４７】 用語「チロシンキナーゼ」、「チロシンキナーゼレセプター」、「レセプター
タンパク質チロシンキナーゼ」、および「ｒＰＴＫ」は、本明細書中において交
換可能に使用され、そしてそのＩＣＤにおいてフェノール基を受容する少なくと
も１つのリン酸を有するタンパク質をいう。このタンパク質は、通常には、リガ
ンド結合ＥＣＤ、ＴＭドメイン、およびＩＣＤを有する限り、レセプターである
。このＩＣＤは、通常、触媒キナーゼドメインを含み、そしてチロシン残基を受
容する１つ以上のリン酸を有する。チロシンキナーゼレセプターの例には、以下
が挙げられる：インスリンレセプター、インスリン関連レセプター、上皮増殖因
子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子レセプターＡおよびＢ（ＰＤ
ＧＦ−Ｒ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｒ−Ｂ）、インスリン様増殖因子１レセプター（
ＩＧＦ−１−Ｒ）、マクロファージコロニー刺激性因子レセプター（Ｍ−ＣＳＦ
−Ｒ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂＢ−２レセプター、ＨＥＲ３／ｃ−ｅｒ
ｂＢ−３レセプター、Ｘｍｒｋレセプター、ＩＲＲレセプター、線維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ）レセプターであるｂｅｋおよびｆｌｇ、ｃ−ｋｉｔレセプター、
Ｆｌｋ／ｋＤＲレセプター、Ｒｓｅレセプター、Ｅｐｈ、Ｅｌｋ、Ｅｃｋ、Ｅｅ
ｋ、Ｅｒｋ、Ｃｅｋ４／Ｍｅｋ４／ＨＥＫ、およびＣｅｋ５レセプター、Ａｘｌ
レセプター、肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦ−Ｒ）、Ｆｌｔ１ ＶＥＧＦレ
セプター、ＳＡＬ−Ｓ１レセプター、ＨｐＴＫ ５レセプター、ｔｒｋＡレセプ
ター、ｔｒｋＢレセプター、およびｔｒｋＣレセプター。例えば、Ｕｌｌｒｉｃ
ｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ ８１：２０３〜２１２（１９９
０）；Ｆａｎｔｌら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：４５３〜４８
１（１９９３）；Ｍａｒｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（１４）：１０７２０〜１０７２８（１９９４）；
およびＷＯ９３／１５２０１を参照のこと。
【００４８】 上述の用語は、少なくとも、選択されたα−サブユニットレセプターの細胞外
ドメインおよびキナーゼレセプター（好ましくは、ｒＰＴＫ）の細胞内ドメイン
、そして必要に応じて同じまたは別のチロシンキナーゼの膜貫通ドメイン、そし
てさらに必要に応じてフラッグエピトープを含む、キメラ「レセプター」分子、
または「レセプター構築物」、または「α−サブユニットレセプター構築物」を
含む。当然のことながら、目的のα−レセプターは、それが１つを有する場合、
膜貫通ドメインを提供し得る。これらの用語はまた、種々のα−サブユニットレ
セプターのアミノ酸配列改変体および共有結合誘導体を含み、これらがなおＫＩ
ＲＡ ＥＬＩＳＡにおいてキナーゼリン酸化活性を示すという条件の下で、これ
らが融合するｒＰＴＫキナーゼドメインを含む。従って、この改変体は、一般に
、保存的アミノ酸改変を有する。α−サブユニットレセプターキナーゼの個々の
ドメインは、関連するファミリーおよび疎水性プロットにおける公知のレセプタ
ーに対する配列相同性に基づいて表現され得る。例えば、疎水性膜貫通ドメイン
は、容易に決定され得、そしてＥＣＤおよびＩＣＤは、存在する場合、通常、膜
貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーに対して、それぞれ、アミノ末端およびカル
ボキシル末端である。簡便には、Ｒｓｅレセプターの膜貫通ドメインおよびＩＣ
Ｄは、代表的にはＧＰＩ−アンカー配列とともに、目的のα−サブユニットレセ
プターのＥＣＤに融合され、それによって本明細書中で言及されるようなレセプ
ター構築物を示す用語に含まれるキメラレセプターを形成し得る。
【００４９】 好ましい実施態様において、このα−サブユニットレセプターは、ＧＦＲａ１
、ＧＦＲａ２、ＧＦＲａ３、およびＧＦＲａ４からなる群から選択される。
【００５０】 「自己リン酸化」は、このレセプター構築物のｒＰＴＫ部分の触媒性キナーゼ
ドメインの活性化（この活性化によって、少なくとも１つの固有のチロシン残基
がリン酸化される）を意味する。一般に、自己リン酸化は、アゴニスト分子がα
−サブユニットレセプターの細胞外ドメインに結合する場合に生じる。任意の特
定の作用機構に限定されることなく、アゴニスト分子の結合は、触媒性キナーゼ
ドメインの活性化を生じるレセプター構築物のオリゴマー化を生じる。
【００５１】 「固相」は、細胞（このアッセイのＫＩＲＡ段階において）または捕捉薬剤が
（このアッセイのＥＬＩＳＡ段階において）付着し得る非水性マトリクスを意味
する。通常には、この固相は、アッセイプレートのウェルを含むが、本発明は決
してこの実施態様に限定されない。例えば、この固相は、別個の粒子の不連続な
固相を含み得る。この粒子は、多孔性であり、そして多くの異なる物質（例えば
、ポリサッカリド（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン
、ポリビニルアルコール、シリコーン、およびグラス）から形成され得る。適切
な特定の固相の例について、米国特許第４，２７５，１４９号を参照のこと。
【００５２】 「ウェル」は、水性サンプルが置かれ得るくぼみまたは保持空間を意味する。
このウェルは、「アッセイプレート」中に提供される。本発明は、通常には、「
第１のアッセイプレート」を使用し、このアッセイプレートは、それに対する細
胞（レセプターまたはレセプター構築物を有する）の付着を至適化する物質（例
えば、ポリスチレン）から形成される。一般に、第１のアッセイプレートの個々
のウェルは、容量に対する表面積の高い比を有し、従って、適切な形状は、平底
ウェル（ここに、細胞は付着する）である。「第２のアッセイプレート」は、一
般に、それに対する捕捉薬剤の付着を至適化する物質（例えば、ポリスチレン）
から形成される。第２のアッセイプレートは、第１のアッセイプレートと同じ一
般的構造および／または特徴を有し得る。しかし、このアッセイのＫＩＲＡ段階
およびこのアッセイのＥＬＩＳＡ段階について別々のプレートが使用される。
【００５３】 本発明の好ましい実施態様において、第１のアッセイプレートおよび第２のア
ッセイプレートは両方とも「マイクロタイター」プレートである。本明細書中で
使用される場合、用語「マイクロタイター」プレートは、約３０〜２００の間の
個々のウェル（通常には、９６ウェル）を有するアッセイプレートをいう。頻繁
には、このマイクロタイタープレートの個々のウェルは、約２５０μｌの最大容
量を保持する。簡便には、第１のアッセイプレートは、自動化を可能にする、９
６ウェルのポリスチレンまたはプラスチック性の細胞培養マイクロタイタープレ
ート（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、Ｌｉｎｃ
ｏｌｎ Ｐａｒｋ、ＮＪにより販売される）である。頻繁には、細胞培養培地と
その中に懸濁された細胞を含む水性サンプルの約５０μｌ〜３００μｌ、より好
ましくは１００μｌ〜２００μｌを、このアッセイのＫＩＲＡ段階における第１
のアッセイプレートの各ウェルに添加する。１ウェルあたり１×１０4〜３×１ ０5の間の細胞を播種することが望ましい。より好ましくは、１ウェルあたり５ ×１０4〜１×１０5細胞を播種する。通常には、第２のアッセイプレートは、ポ
リスチレンマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（例えば、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉ
ｓｏｒｐ，Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄ、Ｄｅｎｍａｒｋによって販売されるプレート）
を含む。
【００５４】 用語「細胞の均一の集団」は、その集団における細胞の少なくとも約８０％、
そして好ましくは約９０％が同じ細胞型である、細胞の実質的に均一の集団をい
う。従って、細胞株を使用することが簡便である。細胞株は、真核生物細胞株、
通常には動物細胞株、そして望ましくは哺乳動物細胞株である。
【００５５】 この細胞は、選択されたレセプター構築物を有するか、またはそれを産生する
ように形質転換される。従って、この細胞は、このレセプター構築物をコードす
る核酸で形質転換され、そしてこの核酸は、レセプターのＥＣＤが細胞の外部環
境に面し、そして膜貫通ドメインが細胞膜内に位置し、そしてキナーゼドメイン
が細胞内に位置するように発現される。一般的な提案として、最小数約１×１０ 4 レセプター／細胞が必要とされる。
【００５６】 細胞を記載するために本明細書中で使用される用語「付着性」は、第１の固相
（頻繁には、第１のアッセイプレートのウェル）に自然に付着し、それによって
ウェルの内側表面に細胞の一定のコーティングを形成する細胞をいう。細胞の一
定のコーティングは、一般には、第１のアッセイプレートのウェルにおける細胞
の約８〜１６時間のインキュベーション後に形成する。インキュベーションの後
、非付着性細胞および細胞培養培地を、第１のアッセイプレートから廃棄する。
インキュベーションは、通常、細胞増殖について至適な温度（すなわち、約３７
℃）にて実施される。付着性細胞株の例には、ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂおよび
Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１
６（１９８０））、ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ２２）、２９３細胞（Ｇｒ
ａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、Ｓｗｉｓｓ
ａｌｂｉｎｏ ３Ｔ３線維芽細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ９２）、および
Ｕ９３７マクロファージ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １５９３）が挙げら
れる。
【００５７】 「フラッグポリペプチド」は、エピトープ（それに対して、「捕捉薬剤」が作
製され得る）（好ましくは、線状エピトープ）を提供するに十分な残基を有し、
なおそれが、キナーゼドメインまたはリガンド結合ドメインの活性を妨害しない
ほど十分に短い、短いポリペプチドを含む。このフラッグポリペプチドはまた、
それに対する捕捉薬剤がこのアッセイ中の他の試薬に結合しないように、十分に
独特である。「独特の」フラッグポリペプチド配列の選択は、例えばＧｅｎｂａ
ｎｋまたはＥＭＢＬ中の他の公知の配列に対して提案されたフラッグポリペプチ
ドの配列を比較することによって達成され得る。適切なフラッグポリペプチドは
、一般に少なくとも６アミノ酸残基を有し、そして通常には約８〜８０アミノ酸
残基（好ましくは約９〜３０の間のアミノ酸残基）を有する。
【００５８】 「レセプター構築物」は、α−サブユニットレセプターリガンド結合ドメイン
とキナーゼレセプター触媒性ドメイン、そして必要に応じて先に定義されるフラ
ッグポリペプチドとの融合物を含むポリペプチドを意味する。このフラッグポリ
ペプチドは、以下のようなレセプター構築物における位置に提供される：ａ）こ
のフラッグポリペプチドがこのレセプターに対するリガンド結合を妨害しない；
ｂ）このフラッグポリペプチドが、このレセプターの自己リン酸化を妨害しない
；ｃ）このフラッグポリペプチドが、このアッセイのＥＬＩＳＡ段階において捕
捉薬剤に結合し得るような適切な配置で提示される。頻繁には、このポリペプチ
ドフラッグは、このレセプター構築物のＮ末端に存在する。あるいは、このフラ
ッグポリペプチドは、このレセプター構築物のＣ末端に存在し得る。Ｒｓｅ．ｇ
Ｄ構築物が好ましい。本明細書中に開示されるＲｓｅ構築物は、特に有用である
。なぜなら、そのＩＣＤ（および必要に応じて、膜貫通ドメイン）は、目的のレ
セプターのＥＣＤに融合され、それによってこのフラッグポリペプチドが目的の
レセプターに関して位置すべきである場所を確立する必要を排除し得るからであ
る。
【００５９】 「Ｒｓｅ．ｇＤ」は、Ｒｓｅレセプタータンパク質チロシンキナーゼＩＣＤド
メインを有するレセプター構築物であって、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質
Ｄ（ｇＤ）フラッグポリペプチドがそのＣＯＯＨ末端に融合されているレセプタ
ー構築物をいう。
【００６０】 「Ｒｓｅ．フラッグ試薬」は、そのＣＯＯＨ末端でフラッグポリペプチド（通
常、ｇＤフラッグポリペプチド）に融合されるＲｓｅレセプターのＩＣＤを含む
ポリペプチドをいう。時に、目的のα−サブユニットレセプターのＥＣＤとＲｓ
ｅのＴＭドメインもまた、Ｒｓｅ．ｇＤ試薬中に存在する。「レセプターＥＣＤ
／Ｒｓｅ．ｇＤキメラ」は、ｇＤフラッグポリペプチドにＣＯＯＨ末端に融合さ
れるＲｓｅのＴＭドメインおよびＩＣＤドメインへの、目的のα−サブユニット
レセプターリガンド結合ドメインのＥＣＤの融合物をいう。
【００６１】 「捕捉薬剤」は、本明細書中で規定されるように第２の固相に付着し得、そし
てレセプター構築物について選択性である化合物または薬剤を意味する。従って
、この捕捉薬剤は、第２のアッセイプレートのウェルにレセプター構築物を捕捉
する。通常には、この捕捉薬剤は、目的のレセプターに融合されているフラッグ
ポリペプチドに選択的に結合する。この捕捉薬剤の結合は、レセプターに結合し
たリガンドの存在または非存在によって影響を及ぼされず、そして捕捉の際にレ
セプター活性化を誘導しない。さらに、この捕捉薬剤は、抗ホスホチロシン抗体
によってリン酸化チロシンへの接近を立体的にブロックしない。適切な捕捉薬剤
を選択するための手段を本明細書中に記載する。一般に、捕捉薬剤は、抗体（例
えば、アフィニティー精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）
を含むが、「ｓｔｒｅｐタグ」ポリペプチドに選択的に結合するストレプトアビ
ジンのような他の選択性薬剤もまた使用され得る（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（１）：１０９〜１２２（１９９３）を参
照のこと）。ストレプトアビジンは、例えば、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、ＣＡから商業的に購入され得る。あ
るいは、この捕捉薬剤は、プロテインＡ（これは、免疫グロブリンに特異的に結
合する）を含み得る。本発明のこの実施態様において、細胞溶解物中に存在する
活性化されたレセプター−構築物は、それに特異的に結合する抗体とともにイン
キュベートされ、それによってレセプター−抗体複合体を形成する。この複合体
は、その複合体中に存在する抗体への特異的な結合によって、プロテインＡによ
って捕捉され得る。プロテインＡは、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから商業的に購
入され得る。
【００６２】 最も好ましい実施態様において、この捕捉薬剤は、フラッグポリペプチド（こ
れは、レセプター構築物中に存在する）に特異的に結合するモノクローナル抗体
である。適切なフラッグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの捕捉抗体の例に
は、ｆｌｕ ＨＡフラッグおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９〜２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃフラ
ッグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１
０抗体（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ５（１２）：３６１０〜３６１６（１９８５））；ならびに単純ヘル
ペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）フラッグおよびそれに対する５Ｂ６抗体（
Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３（６）：５
４７〜５５３（１９９０）およびＭａｒｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（１４）：１０７２０〜１０７２８
（１９９４））が挙げられる。他のフラッグポリペプチドが開示されている。例
には、Ｆｌａｇ−ペプチド（Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１
２０４〜１２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１９２〜１９４（１９９２））；α−チューブリン
エピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１
５１６３〜１５１６６（１９９１））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチ
ドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３９３〜６３９７（１９９０））が挙げられる。一旦
このフラッグポリペプチドが上記のように選択されると、それに対する捕捉抗体
は、本明細書中に開示される技術を用いて生成され得る。
【００６３】 用語「分析物」は、通常には、目的のα−サブユニットレセプターを活性化す
る（または、その活性化を妨害する）能力を調査するために、研究されるべき化
合物または組成物をいう。この分析物は、チロシンキナーゼレセプターについて
のリガンドを含むことが知られているか、または含むことが疑われる体液（例え
ば、血漿または羊水）または組成物を含み得る。この分析物はまた、目的のα−
サブユニットレセプターに対するリガンドを有する細胞を含み得る。
【００６４】 本明細書中で使用される「リガンド」は、目的の細胞外α−サブユニットレセ
プターまたはその公知のアゴニストに結合し得る分子をいう。このリガンドは、
通常、レセプターについてのアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００６５】 「アゴニスト」は、細胞外α−サブユニットレセプター部分への結合の際にレ
セプター構築物の細胞内キナーゼドメインを活性化し得る分子を意味する。頻繁
には、このアゴニストは、増殖因子（すなわち、細胞分裂を刺激し得るポリペプ
チド）を含む。例示的な増殖因子は、アルテミン、ニューツリン、ＧＤＮＦ、お
よびペルセフィンを含む。あるいは、このアゴニストは、実施例において本明細
書中において示されるレセプターまたはさらにそのフラッグ配列に対する抗体で
あり得る。しかし、他の非タンパク質アゴニスト（例えば、有機低分子）もまた
、本発明に含まれる。
【００６６】 「アンタゴニスト」は、アゴニスト作用をブロックする分子を意味する。通常
には、このアンタゴニストは、以下のいずれかである：（ａ）α−サブユニット
レセプター部分に結合し、それによってレセプターに対するアゴニストによるレ
セプターの結合および／もしくは活性をブロックする（アンタゴニストは、レセ
プターのＥＣＤに結合し得るが、このことは、必ずしも絶対ではない）；または
（ｂ）アゴニストに結合し、これによりアゴニストによるレセプターの活性化を
妨害する。このアッセイは、アンタゴニストの両方の型の検出を容易にする。ア
ンタゴニストは、例えば、レセプターについての内因性アゴニストリガンドのレ
セプター結合ドメインを含むペプチドフラグメントを含み得る。アンタゴニスト
はまた、レセプターのＥＣＤに対して、またはレセプターの公知のアゴニストに
対して指向される抗体であり得る。しかし、他の非タンパク質分子もまた、この
用語に含まれる。
【００６７】 用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そしてより詳細には、単一の抗Ｇ
ＦＲα３モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を
含む）、およびポリエピトープ特異性を有する抗ＧＦＲα３抗体組成物を含み得
る。本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一の抗
体の集団から得られる抗体をいい、すなわちこの集団を含む個々の抗体は、少量
で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いては同一である。
【００６８】 本明細書中での目的のための「活性な」または「活性」は、文脈が示すように
、ネイティブもしくは天然に存在するＧＦＲα３、またはレセプターの生物学的
活性および／あるいは免疫学的活性を保持する、ＧＦＲα３またはα−サブユニ
ットレセプターの形態をいう。好ましい活性は、アゴニストまたは天然のリガン
ドに結合し影響を及ぼす（例えば、その活性をブロックまたは他の様式で調節す
る）能力である。この活性は、好ましくはは、ニューロン機能の調節を含む。
【００６９】 「ＧＦＲα３リガンド」は、ネイティブ配列ＧＦＲα３に結合し、そして好ま
しくはそれを活性化する分子である。ＧＦＲα３に結合する分子の能力は、例え
ば、アッセイプレートにコートされたＧＦＲα３免疫付着因子に結合する推定リ
ガンドの能力によって決定され得る。結合の特異性は、ＧＦＲα１または２への
結合を比較することによって決定され得る。
【００７０】 用語「抗ホスホチロシン抗体」とは、ｒＰＴＫのキナーゼドメイン中のリン酸
化チロシン残基に選択的に結合する分子（通常、抗体）をいう。この抗体は、ポ
リクローナルであり得るが、望ましくは、モノクローナル抗体である。抗ホスホ
チロシンポリクローナル抗体は、ＷｈｉｔｅおよびＢａｃｋｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０１：６５−６７（１９９１）において開
示される技術を用いて作製され得、そしてモノクローナル抗ホスホチロシン抗体
は、例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（ＵＢＩ、Ｌ
ａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）から商業的に得られ得る。
【００７１】 本明細書中で使用される場合、用語「標識」とは、分子（例えば、抗ホスホチ
ロシン抗体）と直接的または間接的に結合体化される、検出可能な化合物または
組成物をいう。この標識は、それ自体が検出可能であり得る（例えば、放射性同
位体標識または蛍光標識）か、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合
物または組成物の化学的変化を触媒し得る。好ましい標識は、非放射性発色試薬
の変色を触媒する酵素標識である。
【００７２】 「洗浄する」とは、固相を、非結合材料（例えば、非付着細胞、非付着捕捉薬
剤、非結合リガンド、レセプター、レセプター構築物、細胞溶解物、または抗ホ
スホチロシン抗体）がそこから除去されるように、水溶液（通常、緩衝液または
細胞培養培地）に曝露することを意味する。バックグラウンドノイズを低下させ
るために、洗浄溶液中に界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）を含むことが
好都合である。通常、水性洗浄溶液は、洗浄後にアッセイプレートのウェルから
デカントされる。簡便には、洗浄は、自動化洗浄デバイスを使用して達成され得
る。時に、数回の洗浄工程（例えば、約１〜１０洗浄工程の間）が必要とされ得
る。
【００７３】 「ブロック緩衝液」とは、捕捉薬剤でコートされない第二の固相の曝露された
表面に結合し得る少なくとも１つのブロッキング化合物を含む、水性のｐＨ緩衝
溶液を意味する。このブロッキング化合物は、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ゼラチン、カゼイン、または粉乳のようなタンパク質であり、そしてアッ
セイにおける試薬（例えば、抗ホスホチロシン抗体および検出試薬）のいずれと
も交差反応しない。ブロック緩衝液は、一般に、約７〜７．５の間のｐＨで提供
され、そして適切な緩衝化剤としては、リン酸緩衝液およびＴＲＩＳ緩衝液が挙
げられる。
【００７４】 「溶解緩衝液」とは、可溶化界面活性剤、１つ以上のプロテアーゼインヒビタ
ー、および少なくとも１つのホスファターゼインヒビター（例えば、オルトバナ
ジウム酸ナトリウム）を含む水性のｐＨ緩衝溶液を意味する。用語「可溶化界面
活性剤」とは、真核生物細胞の細胞膜を溶解するが、レセプター構築物を変性ま
たは活性化しない、水混和性の非イオン性の界面活性剤をいう。適切な非イオン
性界面活性剤の例は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、Ｔｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳ
、およびＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ４０）（例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）を含む。多くの他
の非イオン性界面活性剤は、当該分野で利用可能である。適切なプロテアーゼイ
ンヒビターの例は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペ
プチン、ペプスタチン、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンス
ルホニルフルオリド塩酸−ベスタチン、キモスタチン、およびベンズアミジンを
含む。保存剤（例えば、チメロサール）、および溶液の等張性を維持する１つ以
上の化合物（例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）またはスクロース）、および
緩衝液（例えば、ＴｒｉｓまたはＰＢＳ）もまた、通常、存在する。一般的に、
溶解緩衝液のｐＨは、約７〜７．５の範囲である。
【００７５】 通常、溶解緩衝液を第一のアッセイプレートに添加した後、この第一のアッセ
イプレートを「穏やかに攪拌」し、そしてこの表現は、第一のアッセイプレート
をかなり低い速度で（通常、円運動を用いて）物理的に振盪させる動作をいう。
「穏やかな攪拌」とは、細胞を機械的に破壊する（例えば、この細胞をホモジナ
イズまたは遠心分離することにより）ことを包含しない。模範的な振盪速度は、
例えば、Ｂｅｌｉｃｏ回転振盪器において、２００〜５００ｒｐｍ、好ましくは
、３００〜４００ｒｐｍの大きさである。
【００７６】 （ＩＩ．本発明の組成物および方法） （Ａ．全長ＧＦＲα３） 本発明は、本願においてＧＦＲα３と呼ばれるポリペプチドをコードする、新
規に同定および単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、出願人は、ＧＦ
Ｒα３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し、そして単離した。このこと
は、以下、実施例においてさらに詳細に開示する。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２
およびＦａｓｔＡ配列整列コンピュータープログラムを用いて、出願人は、全長
ネイティブ配列ＧＦＲα３（配列番号１５）が、ＧＦＲα１およびＧＦＲα２と
３４％アミノ酸配列同一性を有することを見出した。従って、現時点では、本願
に開示されたＧＦＲα３は、ＧＦＲタンパク質ファミリーにおいて新規に同定さ
れたメンバーであり、そしてＧＦＲタンパク質ファミリーに代表的なニューロン
細胞活性化機能を有し得ると考えられる。しかし、ＧＦＲα１およびＧＦＲα２
に比べてＧＦＲα３の分布が限定されていることは、ＧＦＲα３およびそのアゴ
ニストを、投与されるときに望ましくない副作用を避けるのに好ましい分子とす
る。
【００７７】 グリア細胞株由来神経栄養因子（「ＧＤＮＦ」）およびニューツリン（Ｎｅｕ
ｒｔｕｒｉｎ）（「ＮＴＮ」）は、交感神経感覚神経ニューロンおよび中枢神経
系ニューロンの２つの構造的に関連した強力な生存因子である（Ｌｉｎら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６０：１１３０−１１３２（１９９３）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０６２−１０６４（１９９４）；Ｂｕｊ−Ｂｅｌ
ｌｏら、Ｎｅｕｒｏｎ １５：８２１−８２８（１９９５）；Ｋｏｔｚｂａｕｅ
ｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４：４６７−４７０（１９９６））。ＧＤＮＦは、そ
の作用を、リガンド結合グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連
結タンパク質（ＧＤＮＦＲαまたはＧＦＲα１と称される）および膜貫通チロシ
ンキナーゼＲｅｔで構成される多成分レセプター系によって媒介することが示さ
れた（Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：８０−８３（１９９６）；Ｊ
ｉｎｇら、Ｃｅｌｌ ８５：１１１３−１１２４（１９９６）；Ｔｒｕｐｐら、
Ｎａｔｕｒｅ ３８１：７８５−７８９（１９９６）；Ｄｕｒｂｅｃら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３８１：７８９−７９３（１９９６））。ＮＴＮシグナルは、ＧＦＲα
２により伝達され、それはまたＲｅｔと会合する。本明細書中には、ＧＦＲα３
と称されるＧＰＩ連結タンパク質およびその遺伝子の単離、配列、および組織分
布が記載されている。これは、ＮＴＮおよびＧＤＮＦファミリーにおける新規な
リガンドに対する応答を調整することが示されている。ＮＴＮに対する細胞応答
の場合、細胞は、ＧＦＲα２の存在を要求する。リガンド結合ＧＦＲα２は、チ
ロシンキナーゼレセプターＲｅｔのリン酸化を誘導する。これらの所見は、Ｒｅ
ｔおよびＧＦｒＲα２を、それぞれＮＴＮおよび関連リガンドのレセプターのシ
グナル伝達成分およびリガンド結合成分として同定する。このことは、共有され
た膜貫通タンパク質チロシンキナーゼ（Ｒｅｔ）およびリガンド特異的ＧＰＩ連
結タンパク質成分（ＧＦＲα）を含む、レセプターの新規な神経栄養および分化
因子レセプターファミリーを定義する。
【００７８】 グリア細胞株由来神経栄養因子（「ＧＤＮＦ」）（Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６０：１１３０−１１３２（１９９３）；ＷＯ９３／０６１１６、これらは
、その全体が本明細書中に参考として援用される）は、中脳ドパミン作用ニュー
ロン（Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１１３０−１１３２（１９９３）；
Ｓｔｒｏｅｍｂｅｒｇら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１２４：４０１−４１２（
１９９３）；Ｂｅｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：３３９−３４１（１９９５）
；Ｋｅａｒｎｓら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、６７２：１０４−１１１（１９９５
）；Ｔｏｍａｃら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：３３５−３３９（１９９５））、脊
髄運動ニューロン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０６２
−１０６４（１９９４）；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：３４
４−３４６（１９９５）；Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：３４１−３４４（
１９９５））、およびノルアドレナリン作用ニューロン（Ａｒｅｎａｓら、Ｎｅ
ｕｒｏｎ、１５：１４３６−１４７３（１９９５））の強力な生存因子である。
これらは、それぞれ、パーキンソン病（Ｈｉｒｓｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３３４
：３４５−３４８（１９８８）；Ｈｏｒｎｙｋｉｅｗｉｃｚ、Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ
Ｊ． Ｍｅｄ．、５５：１１−２０（１９８８））、筋萎縮側索硬化（Ｈｉｒ
ａｎｏら、Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａ
ｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｐ．Ｒｏｗ
ｌａｎｄ編（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．９１〜１０
１頁（１９９１））、およびアルツハイマー病（Ｍａｒｃｙｎｕｉｋら、Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．７６：３３５−３４５（１９８６）；Ｃａｓｈら、Ｎｅｕ
ｒｏｌｏｇｙ、３７：４２−４６（１９８７）；Ｃｈａｎ−Ｐａｌａｙら、Ｃｏ
ｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２８７：３７３−３９２（１９８９））において変性す
る。ＧＤＮＦを欠損するように遺伝的に操作されたマウスに基づいて、ＧＤＮＦ
に関するさらなる生物学的役割が報告されている：その役割は、腸ニューロン、
交感神経ニューロン、および感覚ニューロン、および腎臓系の発達および／また
は生存であって、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるカテコールアミン作用ニューロ
ンではない（Ｍｏｏｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：７６−７９（１９９６）；
Ｐｉｃｈｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：７３−７６（１９９６）；Ｓａｎｃｈ
ｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：７０−７３（１９９６））。ＧＤＮＦの生理学
的および臨床的重要性にも関わらず、その作用機構に関してはほとんど知られて
いない。
【００７９】 サイトカインレセプターは、頻繁に、多サブユニット複合体に集合する。時に
、この複合体のαサブユニットは、同族の増殖因子への結合に関与し、そしてβ
サブユニットは、細胞にシグナルを伝達する能力を含み得る。理論に縛られるこ
とを望まないが、これらのレセプターは、形成される複合体に依存して３つのサ
ブファミリーに割り当てられる。サブファミリー１は、ＥＰＯ、顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキ
ン−７（ＩＬ−７）、成長ホルモン（ＧＨ）、およびプロラクチン（ＰＲＬ）に
対するレセプターを包含する。このサブファミリーに属するレセプターに対する
リガンド結合は、レセプターのホモ二量体化を生じると考えられる。サブファミ
リー２は、ＩＬ−３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）
、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、白
血球阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、および毛様体神経栄養
因子（ＣＮＴＦ）に対するレセプターを包含する。サブファミリー２レセプター
は、リガンド結合のためにαサブユニット、およびシグナル伝達のためにβサブ
ユニット（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−５レセプターの共有されたβ
サブユニット、またはＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ、およびＣＮＴＦレセプターの
ｇｐ１３０サブユニットのいずれか）を有するヘテロ二量体である。サブファミ
リー３は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプターのみを含む。ＩＬ−２
レセプター複合体のβおよびγサブユニットは、非関連Ｔａｃ抗原のα−サブユ
ニットと会合するサイトカイン−レセプターポリペプチドである。
【００８０】 本発明は、ＧＦＲα３の発見に基づく。これは、その天然リガンドが未知であ
る、ＧＦＲファミリー中のタンパク質である。本明細書中に記載の実験は、この
分子が、新規なＧＤＮＦファミリーリガンドに対する応答を媒介することにおい
て役割を果たすようであるレセプターであることを実証する。特に、このレセプ
ターは、種々の組織および細胞集団（ニューロンを含む）に存在することが見出
され、従って、ＧＦＲα３リガンド（例えば、アゴニスト抗体）は、ＧＦＲα３
含有細胞およびＲｅｔ含有細胞の増殖、成長、生存、分化、代謝、または再生を
刺激するために使用され得ることが示される。
【００８１】 （Ｂ．ＧＦＲα３改変体） 本明細書中に記載の全長ネイティブ配列ＧＦＲα３に加えて、ＧＦＲα３改変
体が調製され得ることが意図される。ＧＦＲα３改変体は、ＧＦＲα３ ＤＮＡ
に適切なヌクレオチド変化を導入することによるか、または所望のＧＦＲα３の
ポリペプチド合成により、調製され得る。当業者は、アミノ酸変化が、ＧＦＲα
３の翻訳後プロセスを変化させ得る（例えば、グリコシル化部位の数または位置
を変化させるか、あるいは膜付着特性を変化させる）ことを認識する。実際、ス
プライスＧＦＲα３スプライス改変体は、ＤＮＡ４８６１４によってコードされ
、そしてマウス改変体は、配列番号４によってコードされる。他の改変体として
は、実施例において記載のように作製されたＩｇＧタグ化およびｇＤ−ＲＳＥキ
メラが挙げられる。
【００８２】 ネイティブな全長配列ＧＦＲα３における、または本明細書中に記載のＧＦＲ
α３の種々のドメインにおける改変は、例えば、保存的および非保存的変異につ
いてのいずれかの技術および指針（例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に
おいて記載）を用いて作製され得る。改変は、ネイティブ配列ＧＦＲα３と比較
して、ＧＦＲα３のアミノ酸配列の変化を生じる、ＧＦＲα３をコードする１つ
以上のコドンの置換、または欠失、または挿入であり得る。随意には、この改変
は、ＧＦＲα３のドメインの１つ以上における、少なくとも１つのアミノ酸と任
意の他のアミノ酸での置換による。所望の活性に有害に影響することなくどのア
ミノ酸残基が挿入、置換または欠失され得るかを決定する指針は、ＧＦＲα３の
配列を、相同な公知のタンパク質分子の配列と比較し、そして高相同性領域にお
いて作製されたアミノ酸配列変化の数を最少にすることにより見出され得る。ア
ミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の構造および／または化学特性を有する別
のアミノ酸で置換した結果（例えば、ロイシンのセリンでの置換（すなわち、保
存的アミノ酸置換））であり得る。挿入または欠失は、随意には、１〜５アミノ
酸の範囲であり得る。可能とされる改変は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失、ま
たは置換を系統的に作製し、そして以下の実施例に記載のインビトロアッセイに
おいて活性について、得られた改変体を試験することにより決定され得る。
【００８３】 改変体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸２７〜４００、配列番号１７のアミ
ノ酸２７〜３６９、もしくは配列番号５のアミノ酸２７〜３７４の配列を含むＧ
ＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸配列、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の
相補体、に対して少なくとも約６５％配列同一性を有する、単離された核酸分子
によってコードされた改変体であり得る。さらに、改変体は、配列番号１５のア
ミノ酸８４〜３６０；配列番号１７のアミノ酸８４〜３２９；もしくは配列番号
２０のアミノ酸１１０〜３８６の配列の、ＧＦＲα３ポリペプチドのリガンド結
合ドメインを含む核酸分子配列、またはそれらの相補的な核酸によってコードさ
れ得る。これらの単離された核酸分子は、好ましくは本発明のＧＦＲα３ポリペ
プチドをコードする核酸配列にストリンジェントな条件下で優先的にハイブリダ
イズするＧＦＲα３コード配列を含む。配列同一性は、好ましくは少なくとも約
７５％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも
約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。代表的に
は、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸残基２７〜４００を有するポリペ
プチド、配列番号１７のアミノ酸２７〜３６９を有するポリペプチド、配列番号
５のアミノ酸２７〜３７４を有するポリペプチド、配列番号１５のアミノ酸８４
〜３６０の配列のＧＦＲα３ポリペプチドのリガンド結合ドメイン、配列番号１
７のアミノ酸８４〜３２９の配列のＧＦＲα３ポリペプチドのリガンド結合ドメ
イン、もしくは配列番号２０のアミノ酸１１０〜３８６の配列のＧＦＲα３ポリ
ペプチドのリガンド結合ドメインと、少なくとも約７５％、好ましくは少なくと
も約８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくと
も９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する。好ま
しくは、同一性は、配列番号１５のアミノ酸残基２７〜４００およびそれをコー
ドするＤＮＡに対してである。単離された核酸分子は、配列番号１５のアミノ酸
残基２７から４００を有するＧＦＲα３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含み
得るか、またはこのようなコード核酸配列に対して相補的であり、そして少なく
とも中程度の条件下、随意には高いストリンジェンシーの条件下でそれに安定し
て結合したままである。タンパク質はまた、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ ２０９
７５２（名称：ＤＮＡ４８６１３−１２６８）、ＡＴＣＣ ２０９７５１（名称
：ＤＮＡ４８６１４−１２６８）、およびＡＴＣＣ で、１９９８年４月７日
にＡＴＣＣに寄託された、クローンＤＮＡ４８６１３、ＤＮＡ４８６１４、もし
くはマウスＧＦＲα３（クローン１３）の全長タンパク質をコードする核酸、ま
たはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする核酸によりコードさ
れ得る。
【００８４】 改変は、当該分野で公知の方法（例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異
的）変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異誘発）を用いて作製さ
れ得る。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．、１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．、１０：６４８７（１９８７））、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇ
ｅｎｅ ３４：３１５（１９８５））、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈ
ｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ、３１７：４１５
（１９８６））、または他の公知の技術が、ＧＦＲα３改変体ＤＮＡを生成する
ためにクローン化ＤＮＡに対して実施され得る。
【００８５】 スキャニングアミノ酸分析がまた、連続した配列に沿って１つ以上のアミノ酸
を同定するために用いられ得る。好ましいスキャニングアミノ酸の中には、比較
的小さな中性アミノ酸がある。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシ
ン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、このグループ間にお
いて、代表的に好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、これは、β炭
素を超える側鎖を排除しており、そして改変体の主鎖のコンフォメーションを変
えるとはあまり思われないからである。アラニンはまた、それが最も一般的なア
ミノ酸であるので、代表的に好ましい。さらに、それは、包埋された位置および
露出された位置の両方において頻繁に見られる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏ
ｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９７６））。アラニン置換が
十分な量の改変体を生じない場合、イソステリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ
酸が使用され得る。
【００８６】 （Ｃ．ＧＦＲα３の修飾） ＧＦＲα３の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の１
つのタイプは、ＧＦＲα３の標的化されたアミノ酸残基を、ＧＦＲα３のＮ末端
またはＣ末端残基の選択された側鎖と反応し得る有機誘導体化剤と反応させるこ
とを包含する。二官能性薬剤での誘導体化は、例えば、抗ＧＦＲα３抗体を精製
するための方法において使用するために、ＧＦＲα３を水溶性支持マトリックス
または表面に架橋させるため、およびその逆のために有用である。一般的に使用
される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニ
ルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例え
ば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、ホモ二官能性イミドエステル（ジス
クシンイミジルエステル（例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプ
ロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド
−１，８−オクタン）、およびメチル−３−（（ｐ−アジドフェニル）ジチオ）
プロピオイミデート）のような薬剤が挙げられる。
【００８７】 他の修飾としては、グルタミニル残基およびアルパラギニル残基のそれぞれ対
応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよび
リジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基の
リン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のａ−アミノ基のメチル
化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａ
ｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９〜８６頁（１９８３））、Ｎ末
端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げら
れる。
【００８８】 本発明の範囲内に含まれるＧＦＲα３ポリペプチドの共有結合的修飾の別のタ
イプは、ポリペプチドのネイティブグリコシル化パターンの変化を包含する。「
ネイティブグリコシル化パターンの変化」とは、本明細書中の目的では、ネイテ
ィブ配列ＧＦＲα３において見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させるこ
と、および／またはネイティブ配列ＧＦＲα３に存在しない１つ以上のグリコシ
ル化部位を付加すること、および／またはグリコシル化部位に結合された糖残基
の割合および／または組成の変化を意味することが意図される。
【００８９】 ＧＦＲα３ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変化
させることにより達成され得る。この変化は、例えば、ネイティブ配列ＧＦＲα
３への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはこれらの残基によ
る置換（Ｏ−連結グリコシル化部位について）によって行われ得る。ＧＦＲα３
アミノ酸配列は、必要に応じて、ＤＮＡレベルでの変化（特に、所望のアミノ酸
に翻訳するコドンが生成されるように、予め選択した塩基の位置でＧＦＲα３ポ
リペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって）を通じて変化され得
る。
【００９０】 ＧＦＲα３ポリペプチドにおける炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、
ポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的カップリングによる。この
ような方法は、当該分野で、例えば、ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１
１日に公開）ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９〜３０６頁（１９８１）において記載されてい
る。
【００９１】 ＧＦＲα３ポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的にもしくは
酵素的に、またはグリコシル化のための標的としての役割を有するアミノ酸残基
をコードするコドンの変異置換によって達成され得る。化学的脱グリコシル化技
術は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇ
ｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１）に記載されてい
る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）により記載されるように
、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成さ
れ得る。
【００９２】 ＧＦＲα３の共有結合修飾の別のタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号
；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号
；第４，７９１，１９２号；または第４，１７９，３３７号に記載の様式におけ
る種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロ
ピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つへのＧＦＲα３ポリペ
プチドの連結を包含する。
【００９３】 本発明のＧＦＲα３はまた、別の異種のポリペプチドまたはアミノ酸配列に融
合されたＧＦＲα３を含むキメラ分子を形成するように修飾され得る。１つの実
施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピト
ープを提供するタグポリペプチドとのＧＦＲα３の融合物を含む。エピトープタ
グは、一般に、ＧＦＲα３のアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。
ＧＦＲα３のこのようなエピトープタグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対
する抗体を用いて検出され得る。また、エピトープタグの提供は、ＧＦＲα３が
、抗タグ抗体、またはエピトープタグに結合する別のタイプの親和性マトリクス
を用いるアフィニティー精製により容易に精製されるようにすることを可能にす
る。代替の実施態様では、キメラ分子は、ＧＦＲα３と免疫グロブリンもしくは
免疫グロブリンの特定の領域との融合を含み得る。キメラ分子の二価形態につい
て、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してであり得る。
【００９４】 種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体が当該分野で周知であ
る。例としては、ポリヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グ
リシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびそ
の抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５
９−２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれらに対する８Ｆ９、３
Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０−３６１６
（１９８５））；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグお
よびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
、３（６）：５４７−５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチ
ドには、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１
２０４−１２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２−１９４（１９９２））；ａ−チューブリン
エピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１
５１６３−１５１６６（１９９１））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチ
ドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３−６３９７（１９９０））が含まれる。
【００９５】 （Ｄ．ＧＦＲα３の調製） 以下の記載は、主に、ＧＦＲα３核酸を含むベクターで形質転換またはトラン
スフェクトされた細胞を培養することによるＧＦＲα３の生成に関する。もちろ
ん、当該分野で周知である代替の方法が、ＧＦＲα３を調製するために使用され
得ることは考慮される。例えば、ＧＦＲα３配列、またはその部分は、固相技術
を用いる直接ペプチド合成によって生成され得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、
Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５４（
１９６３）を参照のこと）。インビトロでのタンパク質合成は、手動技術を用い
てまたは自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、製造者の指示を用いて行われ得る。ＧＦＲα
３の種々の部分は、別個に化学合成され、そして化学的方法もしくは酵素的方法
を用いて組み合わされて、全長ＧＦＲα３を生成し得る。
【００９６】 （１．ＧＦＲα３をコードするＤＮＡの単離） ＧＦＲα３をコードするＤＮＡは、ＧＦＲα３ ｍＲＮＡを有し、かつ検出可
能なレベルでそれを発現すると考えられている組織から調製されたｃＤＮＡライ
ブラリーから得られ得る。従って、ヒトＧＦＲα３ ＤＮＡは、実施例に記載の
ような、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから好都合に得られ得る
。ＧＦＲα３をコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから、またはオリ
ゴヌクレオチド合成によって得られ得る。
【００９７】 ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を同
定するように設計されたプローブ（例えば、ＧＦＲα３に対する抗体または少な
くとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を用いてスクリーニングされ得
る。選択されたプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリ
ーをスクリーニングすることは、標準的な手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載の手順）を用いて実施され得る。ＧＦ
Ｒα３をコードする遺伝子を単離するための代替の手段は、ＰＣＲ技術（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、前出；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を使用することである。
【００９８】 以下の実施例は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術を記
載する。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最小限
になるのに十分な長さであり、かつ十分に明白であるべきである。このオリゴヌ
クレオチドは、好ましくは、それが、スクリーニングされるライブラリー中のＤ
ＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出され得るように標識される。標識化
の方法は、当該分野で周知であり、そして32Ｐ標識化ＡＴＰのような放射性標識
、ビオチン化、または酵素標識の使用を包含する。ハイブリダイゼーション条件
（中程度のストリンジェンシーまたは高度のストリンジェンシーを含む）は、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、前出において提供される。
【００９９】 このようなライブラリースクリーニングによって同定された配列は、公共のデ
ータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）または他の私有の配列データベースにお
いて寄託されそして入手可能な他の公知の配列に対して、比較および整列され得
る。分子の所定の領域内でのまたは全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸また
はヌクレオチドのいずれかのレベルで）は、相同性を測定するために種々のアル
ゴリズムを使用するコンピューターソフトウェアプログラム（例えば、ＢＬＡＳ
Ｔ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、およびＩＮＨＥＲＩＴ）を
用いる配列アラインメントを通じて決定され得る。
【０１００】 タンパク質コード配列を有する核酸は、最初に、選択されたｃＤＮＡライブラ
リーまたはゲノムライブラリーを、本明細書中において開示された推定アミノ酸
配列を用いてスクリーニングし、そして必要であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前
出）に記載のような従来のプライマー伸長手順を用いて、前駆体を検出し、そし
てｃＤＮＡに逆転写されなかったかもしれないｍＲＮＡの中間体をプロセシング
することによって得られ得る。
【０１０１】 （２．宿主細胞の選択および形質転換） 宿主細胞は、ＧＦＲα３生成のための本明細書中に記載の発現ベクターもしく
はクローニングベクターを用いてトランスフェクトまたは形質転換され、そして
プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコー
ドする遺伝子を増幅するのに適切なように改変された従来の栄養培地において培
養される。培養条件（例えば、培地、温度、ｐＨなど）は、過度の実験を行うこ
となく当業者によって選択され得る。一般に、細胞培養物の生産性を最大にする
ための原理、プロトコル、および実用的な技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ
、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ、編、（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９１）およびＳａｍｂｒ
ｏｏｋら、前出において見出され得る。
【０１０２】 トランスフェクションの方法は、当業者に公知である（例えば、ＣａＰＯ4お よびエレクトロポレーション）。使用した宿主細胞に依存して、形質転換は、こ
のような細胞に適切な標準的な技術を使用して実施される。塩化カルシウムを使
用するカルシウム処理（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載のような）、またはエ
レクトロポレーションは、一般に、原核生物またはかなりの細胞壁障壁を含む他
の細胞のために使用される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓを用いる感染は、Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ、２３：３１５（１９８３）および
ＷＯ８９／０５８５９（１９８９年６月２９日公開）において記載されるように
、特定の植物細胞の形質転換のために使用される。このような細胞壁のない哺乳
動物細胞については、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿方法が使用さ
れ得る。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な局面は、米国特許第４，３９９
，２１６号において記載されている。酵母への形質転換は、代表的には、Ｖａｎ
Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）およびＨ
ｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６：３８２
９（１９７９）の方法に従って実施される。しかし、ＤＮＡを細胞に導入するた
めの他の方法（例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション
、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン（例えば
、ポリブレン、ポリオルニチン））もまた使用され得る。哺乳動物細胞を形質転
換するための種々の技術について、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７−５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【０１０３】 本明細書中においては、ベクターにおいてＤＮＡをクローニングするかまたは
発現させるための適切な宿主細胞は、原核生物細胞、酵母細胞、または高等真核
生物細胞を包含する。適切な原核生物は、真正細菌（例えば、グラム陰性または
グラム陽性生物（例えば、腸内細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）））を含むが、こ
れらに限定されない。種々のＥ．ｃｏｌｉ株は、公的に入手可能である（例えば
、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４６６）；Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ
２７，３２５）；およびＫ５ ７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５））。
【０１０４】 原核生物に加えて、真核生物微生物（例えば、糸状菌または酵母）が、ＧＦＲ
α３コードベクターについての適切なクローニング宿主または発現宿主である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般的に用いられる下
等真核生物宿主微生物である。
【０１０５】 グリコシル化ＧＦＲα３の発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来
する。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）ならびに植物細胞が挙げられる。
有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃ
ＨＯ）およびＣＯＳ細胞が挙げられる。より詳細な例には、ＳＶ４０により形質
転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト
胚性腎臓株（２９３または懸濁培養中の増殖のためにサブクローニングされた２
９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６；５９（１９７７）
）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂおよ
びＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２
１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ
．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８
、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；およ
びマウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が含まれる。適切
な宿主細胞の選択は、当業者の能力の範囲内であると考えられる。
【０１０６】 （３．複製可能ベクターの選択および使用） ＧＦＲα３をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、ク
ローニング（ＤＮＡの増幅）のためにまたは発現のために複製可能ベクターに挿
入され得る。種々のベクターは、公的に入手可能である。ベクターは、例えば、
プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。適切
な核酸配列は、種々の手順によってベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡは
、当該分野で公知の技術を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入さ
れる。ベクター成分は、一般に、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上
のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配
列を含むが、これらに限定されない。これらの成分の１つ以上を含む適切なベク
ターの構築は、当業者に公知の標準的な連結技術を使用する。
【０１０７】 ＧＦＲα３は、直接的だけでなく、異種ポリペプチド（これは、シグナル配列
または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的開裂部位を有する
他のポリペプチドであり得る）との融合ポリペプチドとしてもまた、組換えによ
り生成され得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、また
はそれは、ベクターに挿入され得るＧＦＲα３ ＤＮＡの一部であり得る。シグ
ナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、また
は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル
配列であり得る。酵母選択について、シグナル配列は、例えば、酵母インベルタ
ーゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ａ−因子リーダーを含み、後者は、米国特許第５，０１０，
１８２号に記載）または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグル
コアミラーゼリーダー（ＥＰ３６２、１７９（１９９０年４月４日公開））、ま
たはＷＯ９０／１３６４６（１９９０年１１月１５日公開）に記載のシグナルで
あり得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列は、タンパク質の分泌
を指向させるために使用され得る（例えば、同じまたは関連した種の分泌ポリペ
プチド由来のシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー）。
【０１０８】 発現ベクターおよびクローニングベクターの両方が、ベクターが、１つ以上の
選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含む。このよう
な配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミド
ｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌について適切であり
、２：プラスミド起点は酵母に適切であり、そして種々のウイルス起点（ＳＶ４
０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、もしくはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞
におけるクローニングベクターのために有用である。
【０１０９】 発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、選択遺伝子（選択
性マーカーとも呼ばれる）を含む。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もし
くは他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もし
くはテトラサイクリン）に対する耐性を与えるタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠
損を補足するタンパク質、または（ｃ）複合培地から利用可能ではない必須栄養
素を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤ−
アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。哺乳動物細胞についての適切な選択
マーカーの例は、ＧＦＲα３核酸の取り込み能を有する細胞の同定に可能にする
マーカーである（例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼ）。野生型ＤＨＦＲ
が使用される場合の適切な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０）により記載のように調
製され増殖された、ＤＨＦＲ活性が欠損するＣＨＯ細胞株である。酵母における
使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１
遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７
９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍ
ｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１０：１５７（１９８０））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプ
トファンで増殖する能力を欠損する酵母の変異株の選択マーカーを提供する（例
えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１）（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、８５：１２（１９７７））。
【０１１０】 発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、ＧＦＲα３核酸配列に作
動可能に連結されたプロモーターを含み、ｍＲＮＡ合成を指向させる。種々の潜
在的な宿主細胞により認識されるプロモーターは、周知である。原核生物宿主と
共に使用するために適切なプロモーターとしては、ｂ−ラクタマーゼおよびラク
トースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：６１５（１９７
８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：５４４（１９７９））、アルカ
リホスファターゼ、ａ−トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７（１９８０）；Ｅ
Ｐ３６，７７６）、およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモー
ター）（ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
０：２１−２５（１９８３）が挙げられる。細菌系において使用するためのプロ
モーターはまた、ＧＦＲα３をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイ
ンダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１１１】 酵母宿主と共に使用するための適切な促進配列の例としては、３−ホスホグリ
セリン酸キナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２５５：２０７３（１９８０））または他の解糖酵素のプロモーター（Ｈ
ｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．、７：１４９（１９６８）；Ｈ
ｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７：２０７３（１９７８））（例
えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコー
ス−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およ
びグルコキナーゼ）が挙げられる。
【０１１２】 他の酵母プロモーター（これは、増殖条件により制御される転写のさらなる利
点を有する誘導性プロモーターである）は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イ
ソシトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、メタロチ
オネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルト
ースおよびガラクトース利用を担う酵素、についてのプロモーター領域である。
酵母発現における使用のための適切なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３
，６５７においてさらに記載されている。哺乳動物宿主細胞におけるベクターか
らのＧＦＲα３転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、トリ
水痘ウイルス（ＵＫ ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日に公開））、ア
デノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉
腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およ
びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターによ
り、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グ
ロブリンプロモーター）から得られるプロモーターにより、および熱ショックプ
ロモーターから得られるプロモーターにより、このようなプロモーターが宿主細
胞系と適合性である限り、制御される。
【０１１３】 高等真核生物によるＧＦＲα３をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配
列をベクターに挿入することにより増大され得る。エンハンサーは、その転写を
増大させるためにプロモーターに対して作用する、通常１０〜３００ｂｐのＤＮ
Ａのシス作用エレメントである。多くのエンハンサー配列は、いまや、哺乳動物
遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトプロテイン、および
インスリン）から公知である。しかし、代表的には、当業者は、真核生物ウイル
スからのエンハンサーを使用する。例は、複製起点の後ろ側（ｂｐ１００−２７
０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン
サー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン
ハンサーを含む。エンハンサーは、ＧＦＲα３コード配列に対して５’位または
３’位でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから
５’側の部位に位置する。
【０１１４】 真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞
生物からの有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結のためにお
よびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物
またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５’および、場合によっては３’の
非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、ＧＦＲα３をコードす
るｍＲＮＡの非翻訳領域においてポリアデニル化フラグメントとして転写される
ヌクレオチドセグメントを含む。組換え脊椎動物細胞培養物におけるＧＦＲα３
の合成に対して適合させるために適切なさらなる他の方法、ベクター、および宿
主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０−６２５（１９８
１）；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ
１１７，０６０；およびＥＰ１１７，０５８に記載されている。
【０１１５】 （４．遺伝子増幅／発現の検出） 遺伝子増幅および／または発現は、本明細書中に提供された配列に基づいて、
適切な標識化プローブを用いて、サンプルにおいて直接的に（例えば、従来のサ
ザンブロッティング、ノーザンブロッティング（ｍＲＮＡの転写を定量するため
）（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５
２０１−５２０５（１９８０））、ドットプロッティング（ＤＮＡ分析）、また
はインサイチュハイブリダイゼーションにより）測定され得る。あるいは、特異
的二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二
重鎖、もしくはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が、用いら
れ得る。この抗体は、次に、標識化され得、そしてこのアッセイは、二重鎖が表
面に結合され、従って、表面上での二重鎖の形成の際に、二重鎖に結合される抗
体の存在が検出され得るように、実行され得る。
【０１１６】 あるいは、遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量するために、免疫
学的方法（例えば、細胞もしくは組織切片の免疫組織学的染色、および細胞培養
物もしくは体液のアッセイ）によって測定され得る。サンプル液体の免疫組織学
的染色および／またはアッセイのために有用な抗体は、モノクローナルまたはポ
リクローナルのいずれかであり得、そして任意の哺乳動物において調製され得る
。好都合には、この抗体は、ネイティブ配列ＧＦＲα３ポリペプチドに対して、
または本明細書中で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、また
はＧＦＲα３ ＤＮＡに融合され、かつ特異的抗体エピトープをコードする外因
性配列に対して、調製され得る。
【０１１７】 （５．ポリペプチドの調製） ＧＦＲαの形態は、培養培地から、または宿主細胞溶解物から回収され得る。
膜結合型である場合、それは、適切な界面活性溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００）を使用して、または酵素的切断によって膜から放出され得る。ＧＦＲα
３の発現に用いられる細胞は、種々の物理的または化学的手段（例えば、凍結−
解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤）によって破壊
され得る。組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＧＦＲα３を精製する
ことが望まれ得る。以下の手順は、適切な精製手順を代表する：イオン交換カラ
ム上での分画；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；シリカもしくはカチオン交換樹
脂（例えば、ＤＥＡＥ）上でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；ゲルろ過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−７５を使用する）；夾雑物（例えばＩｇＧ）を除去するためのプロテイ
ンＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；およびＧＦＲα３のエピトープタグ化形態を
結合するための金属キレート化カラム。タンパク質精製の種々の方法が用いられ
得、そしてこのような方法は、当該分野で公知であり、そしてＤｅｕｓｃｈｅｒ
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２（１９９０）；Ｓｃｏ
ｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９８２）に記載されている。選択される精製工程は、例えば、使用される
生成プロセスおよび生成される特定のＧＦＲα３の性質に依存する。
【０１１８】 （Ｅ．ＧＦＲα３についての使用） ＧＦＲα３をコードするヌクレオチド配列（またはそれらの相補体）は、分子
生物学の分野において種々の適用を有し、これは、染色体および遺伝子マッピン
グにおける、ならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの生成におけるハイブリ
ダイゼーションプローブとしての使用を含む。ＧＦＲα３核酸はまた、本明細書
中に記載の組換え技術によるＧＦＲα３ポリペプチドの調製に有用である。
【０１１９】 全長ネイティブ配列ＧＦＲα３（配列番号１４）遺伝子、またはその一部分は
、全長遺伝子を単離するためか、または配列番号１５に開示されるＧＦＲα３配
列に対する所望の配列同一性を有するなお他の遺伝子（例えば、ＧＦＲα３天然
に存在する改変体または他の種由来のＧＦＲα３をコードする遺伝子）を単離す
るための、ｃＤＮＡライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブと
して使用され得る。必要に応じて、このプローブの長さは、約２０〜約５０塩基
である。ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１４のヌクレオチド配列
に由来し得るか、またはネイティブ配列ＧＦＲα３のプロモーターエレメント、
エンハンサーエレメントおよびイントロンを含むゲノム配列に由来し得る。例と
して、スクリーニング方法は、約４０塩基の選択されたプローブを合成するため
に、公知のＤＮＡ配列を用いてＧＦＲα３遺伝子のコード領域を単離する工程を
含む。ハイブリダイゼーションプローブは、種々の標識（32Ｐまたは35Ｓのよう
な放射性ヌクレオチド、またはアビジン／ビオチンカップリング系を介してプロ
ーブとカップリングされるアルカリホスファターゼのような酵素的標識）によっ
て標識化され得る。本発明のＧＦＲα３遺伝子の配列に相補的な配列を有する標
識化プローブを使用して、このようなライブラリーのどのメンバーにこのプロー
ブがハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ま
たはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし得る。ハイブリダイゼーション
技術は、以下の実施例にさらに詳細に記載される。
【０１２０】 このプローブはまた、密接に関連するＧＦＲα３配列の同定のための配列のプ
ールを作製するために、ＰＣＲ技術において使用され得る。
【０１２１】 ＧＦＲα３をコードするヌクレオチド配列はまた、ＧＦＲα３をコードする遺
伝子をマッピングするための、および遺伝的障害を有する個体の遺伝子解析のた
めのハイブリダイゼーションプローブを構築するために、使用され得る。本明細
書に提供されるヌクレオチド配列は、公知の技術を用いて（例えばインサイチュ
ハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖解析、およびライ
ブラリーを用いたハイブリダイゼーションスクリーニング）、染色体および染色
体の特定の領域にマッピングされ得る。
【０１２２】 ＧＦＲα３のコード配列が、別のタンパク質に結合するタンパク質をコードす
る場合（例えば、ＧＦＲα３がレセプターである場合）、ＧＦＲα３は、結合相
互作用に関与する他のタンパク質または分子を同定するためのアッセイにおいて
使用され得る。このような方法によって、レセプター／リガンド結合相互作用の
インヒビターが、同定され得る。このような結合相互作用に関与するタンパク質
はまた、結合相互作用のペプチドまたは低分子のインヒビターもしくはアゴニス
トについてスクリーニングするために使用され得る。また、レセプターＧＦＲα
３は、相関性のリガンドを単離するために使用され得る。スクリーニングアッセ
イは、ネイティブなＧＦＲα３またはＧＦＲα３のレセプターの生物学的活性を
模倣するリード化合物を見出すように設計され得る。このようなスクリーニング
アッセイは、化学ライブラリーの高処理能力スクリーニングに適合したアッセイ
を含み、そのライブラリーを低分子薬物候補物の同定に特に適するものとされる
。意図される低分子は、合成有機化合物または無機化合物を含む。このアッセイ
は、種々の形式（タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニング
アッセイ、イムノアッセイおよび細胞ベースアッセイを含む、これらは、当該分
野で良く特徴付けられている）で実施され得る。
【０１２３】 ＧＦＲα３またはその修飾形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック
動物または「ノックアウト」動物（次に治療学的に有用な試薬の開発およびスク
リーニングにおいて有用である）のいずれかを生ずるために使用され得る。トラ
ンスジェニック動物（例えばマウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を
有する動物であり、その導入遺伝子は、誕生前（例えば、胚段階）にその動物に
、またはその動物の先祖に導入された。導入遺伝子は、トランスジェニック動物
が発生する細胞のゲノムに組込まれるＤＮＡである。１つの実施態様において、
ＧＦＲα３をコードするｃＤＮＡが、確立された技術に従って、ＧＦＲα３をコ
ードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得、そしてゲノム配列
ＧＦＲα３をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を
作製するために使用され得る。トランスジェニック動物（特にマウスまたはラッ
トのような動物）を作製するための方法は、当該分野において慣用的になってお
り、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，０
０９号に記載される。代表的には、特定の細胞は、組織特異的エンハンサーとの
ＧＦＲα３導入遺伝子組込みについて標的化される。胚段階で動物の生殖系列に
導入されたＧＦＲα３をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニッ
ク動物は、ＧＦＲα３をコードするＤＮＡの発現の増大の効果を試験するために
使用され得る。このような動物は、例えば、その過剰発現と関連した病理状態か
らの防御を付与すると考えられる試薬についての試験用動物として使用され得る
。本発明のこの面に従って、動物は、試薬で処置され、そして導入遺伝子を保有
する未処置の動物と比較した病理状態の発生率の減少は、その病理状態について
の治療的介入の可能性を示す。
【０１２４】 ＧＦＲα３の非ヒトホモログは、ＧＦＲα３をコードする内因性遺伝子と動物
の胚細胞に導入されるＧＦＲα３をコードする変更されたゲノムＤＮＡとの間の
相同組換えの結果として、ＧＦＲα３をコードする欠損遺伝子または変更された
遺伝子を有するＧＦＲα３「ノックアウト」動物を構築するために使用され得る
。例えば、ＧＦＲα３をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従ってＧＦＲ
α３をコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得る。ＧＦＲ
α３をコードするゲノムＤＮＡの一部分は、欠失され得るか、または別の遺伝子
（例えば、組込みをモニターするために使用され得る選択マーカーをコードする
遺伝子）で置換され得る。代表的には、数キロベースの変更されていない隣接Ｄ
ＮＡ（５’末端および３’末端の両方で）が、ベクター中に含まれる（例えば、
相同組換えベクターの記載については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、
Ｃｅｌｌ、５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。このベクターを、胚幹細
胞株に導入し（例えばエレクトロポレーションにより）、そして導入されたＤＮ
Ａが内因性ＤＮＡと相同的に組換えされた細胞を選択する（例えば、Ｌｉら、Ｃ
ｅｌｌ、６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。次いで、選択された細胞を
動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注入し、凝集キメラを形成する
（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍ
ｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）１
１３〜１５２頁を参照のこと）。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌養育動物
に移植し、そして胚を一定期間養育して「ノックアウト」動物を作出する。それ
らの原基細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡを保有する子孫が、標準的技術に
よって同定され得、そしてその動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含
む動物を繁殖させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の
病理状態に対して防御するための能力について、およびＧＦＲα３ポリペプチド
の非存在による病理状態のそれらの発達について特徴付けられ得る。
【０１２５】 ＧＦＲα３分子に結合する薬剤は、末梢神経系を含む疾患または状態の処置に
有用であり得る。例えば、このようなリガンドは、糖尿病、ＨＩＶ、化学治療剤
処置と関連した末梢神経障害を処置するために使用され得る。ＧＦＲα３に結合
するリガンドは、神経障害性疼痛の処置において有用であると期待され、ＧＦＲ
α３のアンタゴニストは、非神経性障害性質の慢性疼痛（例えば、種々の炎症状
態と関連した慢性疼痛、しかしこれに限定されない）を処置するのに有用である
と期待される。上記治療は、実施例５のデータと一致する。実施例５では、発達
中および成体の知覚神経節内でのＧＦＲα３の強力な発現が観察された。ＧＦＲ
α３またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストは、自律神経系機能障害を包
含する状態（血圧または心拍（ｃａｒｄｉａｃ ｒｈｙｔｈｍ）の不整、胃腸機
能、虚弱および尿節制を含むがそれらに限定されない）を処置するために使用さ
れ得る。ＧＦＲα３に結合するリガンドについての他の徴候は、ヘルペス後神経
痛、帯状ヘルペス、ぜん息、過敏性腸、炎症性腸、膀胱炎、頭痛（片頭痛）、関
節炎、脊髄損傷、便秘、高血圧、粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、口内乾燥症も
しくはドライアイ（ｄｒｙ ｍｏｕｔｈ ｏｒ ｅｙｅ）、線維素血症、慢性背
部疼痛、または創傷治癒を含む。これらの使用は、交感神経節において観察され
た発現と一致する。
【０１２６】 多くの器官（背部脳（ｎｏｔａｂｌｙ ｂｒａｉｎ）、腸および腎臓を含む）
におけるＧＦＲα３の発現の驚くべき相対的欠如は、このレセプターに結合する
リガンド（および他のアゴニストまたはアンタゴニスト）には、ＧＦＲα１およ
びＧＦＲα２（ＧＤＮＦおよびニューツリン）に結合するリガンドと関連し得る
いくらかの副作用がないことを示す。従って、ＧＦＲα３を介して作用するリガ
ンドは、末梢神経系の障害を処置するために特に有用であるが、体重減少、運動
機能、または腎臓機能に関して、ＧＦＲα１またはＧＲＦα２を介して作用する
リガンドよりも、低い効果を誘導する。
【０１２７】 （Ｆ．抗ＧＦＲα３抗体） 本発明は、抗ＧＦＲα３抗体をさらに提供する。例示的な抗体としては、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、および異
種結合体抗体が挙げられる。
【０１２８】 （１．ポリクローナル抗体） 抗ＧＦＲα３抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体を
調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物におい
て、例えば、免疫化剤（および所望される場合、アジュバント）の１回以上の注
射によって惹起され得る。代表的には、免疫化剤および／またはアジュバントは
、複数回の皮下注射または腹腔内注射により哺乳動物中に注射される。免疫化剤
は、ＧＦＲα３ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み得る。免疫される
哺乳動物において免疫原性であると公知のタンパク質に免疫化剤を結合体化する
ことは、有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および
ダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、それらに限定されない。用いら
れ得るアジュバントの例は、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭ
アジュバント（モノホスホリスリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノマイコ
レート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））を含む。免疫化プロトコルは、
過度の実験を行うことなく当業者によって選択され得る。
【０１２９】 （２．モノクローナル抗体） あるいは、抗ＧＦＲα３抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクロー
ナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４
９５（１９７５）により記載されるようなハイブリドーマ方法を使用して調製さ
れ得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主
動物が、代表的に、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し
得るリンパ球を誘起するように免疫化剤で免疫される。あるいは、リンパ球は、
インビトロで免疫化され得る。
【０１３０】 免疫化剤は、代表的には、ＧＦＲα３ポリペプチドまたはその融合タンパク質
を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球（「ＰＢ
Ｌ」）が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合、脾臓細
胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコ
ールのような適切な融合剤を使用して、不死化細胞株と融合されて、ハイブリド
ーマ細胞が形成される（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）５９〜１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転
換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である
。通常ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、
非融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含
む適切な培養培地において培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠
く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。これらの物質は、Ｈ
ＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【０１３１】 好ましい不死化細胞株は、効率良く融合し、選択された抗体産生細胞による抗
体の安定な高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性で
ある。より好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫株である。これは、例えば、
Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎ
ｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ およびアメリカンタイプ
カルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄより入手され
得る。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノ
クローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎ
ｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、（１９８７）５１〜６３頁）。
【０１３２】 ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、次いで、ＧＦＲα３に対するモ
ノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドー
マ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降による
か、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））により決定される。こ
のような技術およびアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル
抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって
決定され得る。所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、制限希
釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準方法（Ｇｏｄｉｎｇ、前出
）によって増殖され得る。この目的のために適切な培養培地としては、例えば、
ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。ある
いは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてインビボで増殖され得る
。
【０１３３】 サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン
精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロ
マトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィ
ー）により、培養培地または腹水から単離または精製され得る。モノクローナル
抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記
載される方法）により作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードする
ＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコード
する遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによ
って）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細
胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されると、ＤＮ
Ａは、発現ベクター中に位置され得、次いで、このベクターは、そうでなければ
免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、シミアンＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランス
フェクトされて、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡは
また、例えば、コード配列を、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖
の定常ドメインに置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎら、前出）かまたは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコ
ード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることに
よって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドが、本発明の抗
体の定常ドメインについて置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結
合部位の可変ドメインについて置換されて、キメラ二価抗体を作製し得る。
【０１３４】 抗体は、一価の抗体であり得る。一価の抗体を調製するための方法は、当該分
野において周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および改変
された重鎖の組換え発現を包含する。重鎖は、重鎖の架橋を防ぐように、一般的
にＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基は、架
橋を防ぐように別のアミノ酸残基で置換されるかまたは欠失される。
【０１３５】 インビトロでの方法もまた、一価の抗体を調製するのに適切である。抗体のフ
ラグメント、特にＦａｂフラグメントを生成するための抗体の消化は、当該分野
において公知の慣用的技術を用いて達成され得る。
【０１３６】 （３．ヒト化抗体） 本発明の抗ＧＦＲα３抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含む。非ヒ
ト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配
列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（
例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、または抗体の他の抗原結合 部分配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由
来残基が、所望の特異性、親和性および許容を有する非ヒト種（ドナー抗体）（
例えば、マウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲ由来の残基によって置換される
、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ある場合、ヒト免疫グロブ
リンのＦｖ枠組み残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体は
また、レシピエント抗体においても、および移入されたＣＤＲ配列もしくは枠組
み配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なく
とも１つの、および代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そこ
では、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ
領域に対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリ
ンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定
常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一
部分を最適に含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１
９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９（１
９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２
：５９３−５９６（１９９２））。
【０１３７】 非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般的
に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入される１つ以上の
アミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基
といわれ、これは、代表的には、「移入」可変ドメインから採取される。ヒト化
は、基本的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａ
ｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、げっ歯類Ｃ
ＤＲまたはＣＤＲ配列にヒト抗体の対応する配列を置換することによって、実行
され得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許
第４，８１６，５６７号）、ここでは、インタクトなヒト可変ドメインより実質
的により少ないものか、非ヒト種由来の対応する配列によって置換された。実際
には、ヒト化抗体は、代表的にはいくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつ
かのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基によって置換されるヒ
ト抗体である。
【０１３８】 ヒト抗体はまた、当該分野で公知の種々の技術（ファージディスプレイライブ
ラリーを含む）を使用して産生され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔ
ｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｌｅらおよびＢ
ｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である
（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）ならび
にＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５（１９
９１））。
【０１３９】 （４．二重特異性抗体） 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原について結合特異性を有する
モノクローナル（好ましくは、ヒトまたはヒト化）抗体である。本場合、結合特
異性の一方は、ＧＦＲα３についてであり、他方は、任意の他の抗原について、
および好ましくは、細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサ
ブユニットについてである。
【０１４０】 二重特異性抗体を生成するための方法は、当該分野において公知である。古典
的には、二重特異性抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖対
の同時発現に基づき、この場合、２つの重鎖が異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７−５３９（１９８
３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為な組み合せのために、これらの
ハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ））は、１０の異なる抗体
分子の潜在的混合物を生成し、それらの１つのみが正確な二重特異性構造を有す
る。正確な分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によっ
て達成される。同様の手順が、ＷＯ ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日
公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ．Ｊ．，１０：３６５５−３６
５９（１９９１）に開示される。
【０１４１】 所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫
グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。融合物は、好ましくは、免疫グロ
ブリン重鎖定常ドメインであり、これは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少
なくとも部分を含む。融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖の結合に必要な部
位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリ
ン重鎖融合物、および所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、
別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェク
トされる。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅ
ｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９
８６）を参照のこと。
【０１４２】 （５．異種結合体抗体） 異種結合体抗体もまた、本発明の範囲内にある。異種結合体抗体は、２つの共
有結合された抗体で構成される。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ま
ない細胞に対して標的化すること（米国特許第４，６７６，９８０号）、および
ＨＩＶ感染の処置（ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ
０３０８９）について提唱されている。抗体は、合成タンパク質化学における公
知の方法（架橋剤を包含する方法を含む）を使用してインビトロで調製され得る
ことが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、また
はチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に対して適
切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチル
イミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示される試薬
が挙げられる。
【０１４３】 （Ｇ．抗ＧＦＲα３抗体についての使用） 本発明の抗ＧＦＲα３抗体は、種々の利用性を有する。例えば、抗ＧＦＲα３
抗体は、ＧＦＲα３についての診断アッセイ（例えば、特定の細胞、組織または
血清中のその発現を検出する）において使用され得る。当該分野において公知の
種々の診断アッセイ技術（例えば、競合結合アッセイ、直接的もしくは間接的サ
ンドイッチアッセイおよび異質相または同質相のいずれかにおいて行われる免疫
沈降アッセイ）が使用され得る（Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）１４７−１５８頁）。診断アッセイにおいて使用
される抗体は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接的かま
たは間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得るべきである。例えば
、検出可能な部分は、放射性同位元素（例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、また は125Ｉ）、蛍光化合物または化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチ オシアネート、ローダミン、またはルシフェリン）、あるいは酵素（例えば、ア
ルカリホスホターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダー
ゼ）であり得る。当該分野において公知の、検出可能な部分と抗体とを結合体化
させるための任意の方法（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１
９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：１０１４（１９７
４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０：２１９（１９８１
）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ
．、３０：４０７（１９８２）により記載される方法を含む）が、使用され得る
。
【０１４４】 抗ＧＦＲα３抗体はまた、組換え細胞培養物または天然の供給源からのＧＦＲ
α３のアフィニティー精製に有用である。このプロセスにおいて、ＧＦＲα３に
対する抗体は、当該分野で周知の方法を用いて適切な支持体（例えば、Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ樹脂または濾紙）上で固定化される。次いで、固定化抗体は、精製され
るべきＧＦＲα３を含むサンプルと接触され、その後、その支持体は、ＧＦＲα
３を除くサンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒を用いて洗浄さ
れ、ＧＦＲα３は固定化抗体に結合される。最終的に、その支持体は、ＧＦＲα
３を抗体から放出させるのに適切な別の溶媒を用いて、洗浄される。
【０１４５】 （Ｈ．リガンド誘導Ａ−サブユニット活性についてのアッセイ） 本発明の化合物および方法は、ＧＦＲα３シグナル伝達を活性化するかまたは
阻害する分子を検出するためのアッセイにおいて使用され得、そして実際は、リ
ガンドまたは他のアゴニストによる活性化の際にホモ二量体化するかまたはホモ
オリゴ量体化する他のα−サブユニットレセプター分子（例えばＧＦＲα１、Ｇ
ＦＲα２、ＧＦＲα４）に適用され得る。このアッセイは、リガンド結合の際、
α−サブユニットレセプターがホモ二量体化、またはホモオリゴ量体化し得ると
いう驚くべき事実に基づく。そして、さらなることに、キナーゼ活性、好ましく
はチロシンキナーゼ活性が可能なレセプタータンパク質キナーゼ細胞内ドメイン
に融合される場合、α−サブユニットのこの二量体化は、キナーゼ活性（例えば
、容易に検出可能な自己リン酸化）をもたらす。本明細書中の方法および構築物
は、本明細書中に開示される１つのまたは別のＧＦＲαサブユニットレセプター
について議論されているが、その方法は、α−サブユニットレセプターファミリ
ー（α−サブユニットレセプターが、代表的には、リガンド活性化α−サブユニ
ットがβサブユニットに結合する際に活性化されるチロシンキナーゼ活性を含む
、βサブユニットを含む多サブユニットシグナル伝達複合体のリガンド結合パー
トナーである、ファミリー）において、任意のα−レセプターに容易に適用され
る。
【０１４６】 キナーゼ活性、および特にチロシンキナーゼ活性を測定する種々のアッセイが
、開発されている。これらのアッセイのいくつかは、チロシンキナーゼ酵素が合
成基質ポリペプチドをリン酸化する能力を測定する。例えば、ＡＴＰのγ−リン
酸の適切なアクセプター基質への転移を触媒するキナーゼの能力を測定すること
によって、増殖因子刺激チロシンキナーゼ活性を測定するアッセイが開発されて
いる。例えば、Ｐｉｋｅ、Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１４６：３５３−３６２（１９８７）およびＨｕｎｔｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７（９）：４８４３−
４８４８（１９８２）を参照のこと。このアッセイにおいて、（γ−32Ｐ）ＡＴ
Ｐの使用は、リン酸化基質（これは、合成チロシンを含むペプチドである）の放
射性標識を許容する。他にも、タンパク質キナーゼアッセイが記載されており、
そこでは、チロシンキナーゼレセプター（例えば、ＥＧＦレセプター（Ｄｏｎａ
ｔｏら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．３：２５９−２６８（１９９
２）を参照のこと））、インスリンレセプター（Ｋａｓｕｇａら、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７（１７）：９８
９１−９８８４（１９８２）およびＫａｓｕｇａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０９：６０９−６２１（１９８５）を参照のこと）なら
びに肝臓成長ホルモンレセプター（Ｗａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２４）：１７３９０−１７３９
６（１９９２）を参照のこと）への32Ｐの取り込みが測定される。
【０１４７】 Ｒｓｅまたは他のチロシンキナーゼドメインへの融合物を含むαレセプター構
築物の構築、そのような構築物を発現するためのベクター、これらの構築物を発
現するトランスフェクトされた宿主細胞または形質転換された宿主細胞、ならび
に細胞表面でそれらの発現を増大するための手段は、例えば、ＧＦＲα３の発現
について本明細書中に記載されるような技術を用いて、当該分野で公知のように
達成される。いくつかの特定の好ましい手段は、以下に提供される。
【０１４８】 （１．キナーゼレセプター活性化−ＫＩＲＡ） 本発明のアッセイの第１段階は、レセプター構築物のキナーゼドメインのリン
酸化を包含し、ここで、そのレセプター構築物は、真核生物細胞の細胞膜に存在
する。レセプター構築物は、細胞に形質転換され得るレセプター構築物（本明細
書中に記載されるように）をコードする核酸由来であり得る。本発明の１つの実
施態様において、レセプター構築物をコードする核酸は、細胞へ形質転換される
。レセプターまたはレセプター構築物の核酸のいずれかを用いて細胞を形質転換
するための好ましくかつ例示的な技術は、以下である。
【０１４９】 （ａ．細胞の形質転換） 本発明は、インサイチュでのα−サブユニットレセプターの活性をより正確に
反映すると考えられる範囲で、インビトロでの可溶性キナーゼレセプターアッセ
イを超える実質的な改善を提供する。レセプター構築物が、細胞膜において適切
にそれ自体を集合させて、そしてなおアッセイのＥＬＩＳＡ段階において検出さ
れ得るキナーゼ活性を保持するように、真核生物細胞をレセプター構築物（α−
サブユニットレセプターおよびキナーゼドメイン融合物、ならびに必要に応じて
アミノ末端フラッグポリペプチドまたはカルボキシ末端フラッグポリペプチドの
いずれかを含む）で形質転換することが可能であることが発見された。これは、
リガンド結合の際にホモ二量体化するか、またはホモオリゴ量体化する目的の任
意のα−サブユニットレセプターの、融合物のキナーゼアッセイを介した、リガ
ンド結合活性を測定するための一般的なアッセイを提供する。
【０１５０】 本明細書中に記載されるような適切な捕捉薬剤が、選択されたレセプター構築
物について入手可能である場合、細胞は、フラッグポリペプチドを有さない、レ
セプター構築物のみをコードする核酸で形質転換され得る。
【０１５１】 レセプター構築物をコードする核酸を提供するために、α−サブユニットレセ
プターをコードする核酸は、その３’末端で、膜貫通ドメインを含むレセプター
キナーゼ（好ましくはｒＰＴＫ）の細胞内触媒性キナーゼドメインをコードする
核酸に融合され、そして必要に応じてフラッグポリペプチドのＮ末端に融合され
る。あるいは、α−サブユニットレセプター−キナーゼドメイン融合物をコード
する核酸は、その５’末端で、フラッグポリペプチドのカルボキシ末端をコード
する核酸に融合される。従って、このフラッグポリペプチドは、レセプター構築
物のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかにおいて、提供される。適切な
フラッグポリペプチドの例は、上記に提供される。他の適切なフラッグポリぺプ
チドの選択は、本明細書中に記載の技術を用いて可能である。
【０１５２】 Ｒｓｅ．フラッグ試薬と目的のα−サブユニットレセプターとの間の融合を生
ずるために、目的のα−サブユニットレセプターのＥＣＤ（またはＧＰＩアンカ
ーマイナス改変体）をコードする核酸が、その３’末端で、Ｒｓｅ．フラッグ試
薬のアミノ末端をコードする核酸に融合される。
【０１５３】 シグナル配列の発現ベクターへの組み込みは、レセプター構築物が、ＥＣＤが
細胞の外部環境に直面するようにそれが位置するように、細胞膜へ輸送されなけ
ればならないため、必要とされる。従って、このような様式でレセプター構築物
を配置するために適切なシグナル配列が使用される。このシグナル配列は、一般
的に、ベクターの成分であるか、またはそのベクターに挿入されるレセプター構
築物ＤＮＡの一部であり得る。異種のシグナル配列が用いられる場合、それは、
宿主細胞により認識され、そしてプロセッシングされる（すなわち、シグナルペ
プチダーゼにより切断される）配列由来である。
【０１５４】 （ｂ．アッセイにおける使用のための細胞の選択） 上記のように、アッセイに供される細胞は、好ましくは、レセプター構築物で
形質転換された細胞である。このアッセイにおける使用のための細胞の適合性が
試験される。
【０１５５】 細胞株がレセプター構築物（フラッグポリペプチドを有さない）で形質転換さ
れる場合、細胞株がこのアッセイにおける使用のために適切か否かは、容易に発
見され得る。第１の工程の際、レセプター構築物をコードする核酸の首尾良い形
質転換および発現が決定される。米国特許第５，７６６，８６３号、またはその
対応ＷＯ公開物（「キナーゼレセプター活性化アッセイ」と称される）に見出さ
れる戦略に従い得る。レセプター構築物のＥＣＤが細胞表面上に存在するか否か
を同定するために、フローサイトメトリー分析が、α−サブユニットレセプター
のＥＣＤに対する抗体を用いて実施され得る。その抗体は、本明細書中で議論さ
れる抗体を産生するための技術を用いて作製され得る。フローサイトメトリー分
析は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｃｏｌｉｇｅｎら編、Ｗｉｌｅｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、第一巻および
第二巻に記載される技術を用いて、実行され得る。手短には、フローサイトメト
リー分析は、インタクトな細胞（レセプターを有する）をそのＥＣＤに対する抗
体と共にインキュベートし、続いて洗浄する工程を含む。次いで、抗体が結合し
た細胞が、蛍光色素に結合体化された種特異的抗−抗体抗体とインキュベートさ
れる。洗浄後、標識化細胞は、ＥＣＤがその細胞表面上に存在するか否かを検出
するために、蛍光活性化フローサイトメトリーにより分析される。
【０１５６】 以下の工程において、細胞結合レセプターが活性化される能力が試験される。
これを決定するために、形質転換された細胞は、レセプターに対する公知のアゴ
ニスト（例えば、内因性リガンドまたはそのレセプターのアゴニスト抗体）に曝
露される。ＧＦＲα３の場合、天然リガンドは、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）
である。曝露後、その細胞は、適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水
中のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ＰＢＳ中のＳＤＳ）中に溶解され
、そして、以下に記載されるような抗ホスホチロシン抗体を用いてウェスタンブ
ロッティングに供される：例えば、Ｗａｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ５（１２）：３６４０−３６４３（１９８５）
；Ｇｌｅｎｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ １０９：２７７−２８５（１９８８）；Ｋａｍｐｓ、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０１：１０１−１１０（１９９１）；Ｋ
ｏｚｍａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０１：２８−４
３（１９９１）；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５−１０（
１９９２）；またはＣｏｒｆａｓら、ＰＮＡＳ．ＵＳＡ ９０：１６２４−１６
２８（１９９３）。
【０１５７】 ウェスタンブロッティング工程が、レセプター構築物が活性化され得ることを
示すと仮定すると、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ試験の実行が、形質転換された細胞株
がアッセイに用いられ得るか否かをさらに確立するために実施され得る。
【０１５８】 本発明の好ましい実施態様において、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡは、目的の任意の
α−サブユニットレセプターがレセプター特異的試薬（すなわち、捕捉薬剤）の
利用可能性に関わらず研究され得る範囲で、「一般的な」アッセイである。この
実施態様は、そのレセプターのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに
フラッグポリペプチドを有するレセプター構築物を使用する。
【０１５９】 フラッグポリペプチドがＮＨ2末端にて提供される場合（例えば、ｇＤ．ｔｒ ｋＡ、ＢおよびＣレセプター構築物）、このアッセイにおける使用のための形質
転換された細胞株を選択するための手順は、上記の手順と類似している。この実
施態様において、細胞は、本明細書中に先に記載されるように、フラッグポリペ
プチド−レセプター構築物で形質転換される。レセプターおよびフラッグポリペ
プチド（すなわち、本実施例中のレセプター構築物）の首尾良い形質転換が確認
される。このことを研究するために、二次元フローサイトメトリー分析が、フラ
ッグポリペプチドおよびレセプターのＥＣＤの両方に対する抗体を用いて実施さ
れ得る。二次元フローサイトメトリー分析についての技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出に開示される。
【０１６０】 Ｃ末端フラッグポリペプチドを有するレセプター構築物で首尾良く形質転換さ
れた細胞はまた、このアッセイにおける使用に適切である。細胞の形質転換後、
レセプターの首尾良い形質転換は、例えば、目的のレセプターのＥＣＤに対する
抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定される。フローサイトメトリ
ー分析は、実質的に上記のように実行され得る。
【０１６１】 次いで、レセプター構築物全体（ＣＯＯＨ末端フラッグポリペプチドを含む）
の首尾良い形質転換が分析される。これは、細胞の溶解（本明細書中に開示され
る細胞の溶解についての技術を用いて）、および目的のα−サブユニットレセプ
ターに対する抗体を用いた膜抽出物の免疫沈降によって達成され得る。次いで、
この免疫沈降膜抽出物は、フラッグポリペプチドに特異的な抗体を用いたウェス
タンブロット分析に供される。あるいは、抗フラッグポリペプチド捕捉膜溶解物
のα−サブユニット特異的ＥＬＩＳＡ分析が、実行され得る。手短には、これは
、適切なフラッグ特異的捕捉薬剤でＥＬＩＳＡウェルをコーティングすることを
包含する。このウェルを、ブロックし、洗浄し、次いで、溶解物をウェル中でイ
ンキュベートする。非結合レセプター構築物を、洗浄により除去する。次いで、
このウェルを、ＨＲＰＯに直接的にかまたは間接的に結合体化されたレセプター
特異的抗体（単数または複数）と反応させる。このウェルを洗浄し、次いで、Ｈ
ＲＰＯを色素生産性基質（例えばＴＭＢ）に曝露する。レセプター活性化の検出
およびＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ試験の実施は、基本的に上記の工程と同じである。
【０１６２】 一旦、有用な細胞が同定されると、それらを本願請求のアッセイのＫＩＲＡ段
階に供する。
【０１６３】 （ｃ．細胞での第１の固相のコーティング） 第１の固相（例えば、第１のアッセイプレートのウェル）を、先の章に従って
形質転換された細胞で、コートする。
【０１６４】 好ましくは、付着細胞株は、細胞が第１の固相に天然に付着するように選択さ
れる。しかし、付着細胞株の使用は、必須ではない。例えば、非付着細胞（例え
ば、赤血球）が、例えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、
Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙにより市販されるようなアッ
セイプレートの丸底ウェルに、添加され得る。次いで、このアッセイプレートを
プレートキャリア中に配置し、それらのウェルの底に付着する細胞のペレットを
作製するために遠心分離する。細胞培養物の上清を、ピペットを用いて除去する
。従って、付着細胞の使用は、非付着細胞よりも明らかに有利である。なぜなら
ば、それは、このアッセイにおける変動性を減少させるからである（すなわち、
丸底ウェルのペレット中の細胞は、代替的な方法を用いる場合に、上清と共に採
取され得る）。
【０１６５】 第１のアッセイプレートのウェルに添加される細胞を、組織培養フラスコ中に
維持し得、そして約７０％〜９０％のコンフルエンシーな細胞密度が達せられる
場合に利用し得る。次いで、一般的に、１つの平底ウェルあたり、約１×１０4 から３×１０5（および好ましくは５×１０4〜１×１０5）の間の細胞を、例え ば、ピペットを用いて播種する。上記の細胞濃度の添加が、その前に細胞または
細胞溶解物を濃縮または澄明化する必要なく、アッセイのＥＬＩＳＡ段階で測定
されるレセプター構築物の活性化を可能にするのに十分であることが、予想に反
して見出された。しばしば、細胞は、マイクロタイタープレートのウェル中に播
種される前に培養培地で希釈され、所望の細胞密度にされる。
【０１６６】 通常、それらのウェルへの付着を最適化するのに充分であるが、細胞が悪化し
始めるほど長すぎない時間で、細胞をマイクロタイタープレート中で培養する。
従って、細胞が生理的に最適である温度で（通常約３７℃）、約８〜１６時間の
インキュベーションが好ましい。細胞の培養に適切な培地を、上記の第１Ａ章に
記載する。５％ＣＯ2中の培養を推奨する。
【０１６７】 一晩のインキュベーション後、ウェルの上清をデカンテーションし、そして過
剰の上清は吸着基材（例えば、ペーパータオル）を用いて、マイクロタイタープ
レートを軽くタンピングすることによりさらに除去され得るが、スポンジは同等
に作用する。従って、実質的に均一な付着細胞層が、マイクロタイタープレート
の個々のウェルの内部表面に残ったままである。次いで、これらの付着細胞を分
析物に曝露する。
【０１６８】 （ｄ．分析物の調製および添加） 上記のように、分析物は、目的のα−サブユニットレセプターについてのアゴ
ニストリガンド（もしくはアゴニストの疑いのある）またはアンタゴニスト（も
しくはアンタゴニストの疑いのある）を含み得る。このリガンドは、内因性ポリ
ペプチド、または合成分子（例えば、無機分子または有機分子）であり得る。通
常、このリガンドは、ポリペプチドである。このアッセイは、目的のα−サブユ
ニットレセプターを活性化する（または活性化を拮抗する）分子をスクリーニン
グするために有用である。従って、このアッセイは、治療学的に有効な分子の開
発に使用され得る。
【０１６９】 リガンドがアゴニストである場合、分子は、ネイティブな増殖因子（例えば、
アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）、ニューツリン、ＧＤＮＦ、およびペルセフィン
（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ））を含み得る。これらの増殖因子の多くは市販されてい
る。あるいは、増殖因子は、本明細書中に記載されるペプチド合成または組換え
技術によって作製され得る。合成低分子アゴニストは、同様に、従来の化学合成
技術を使用して、当業者によって作製され得る。好ましくは、１つは、アゴニス
ト抗体またはアンタゴニスト抗体についてアッセイすることである。
【０１７０】 リガンドが生物学的流体中に存在する場合、分析物は、当該分野で周知の技術
を用いて調製され得る。血液または羊水のような体液を直接使用し得るが、濃縮
液が要求され得る。試験されるべき分析物が特定の組織を含む場合、それらの細
胞を、細胞培養物中で増殖し得、そして上清を分泌リガンドについて試験し得る
。
【０１７１】 しばしば、そのリガンドは、水性希釈剤（例えば、細胞培養培地）に希釈され
、その結果、標準曲線が作成され得る。しかし、そのリガンドは、細胞または細
胞成分（例えば、細胞膜）において存在し得る。特に、そのアッセイを使用して
、選択した細胞株の細胞膜においてリガンドの存在を検出し得ることが見い出さ
れた。これは、公知のα−サブユニットレセプターについて新規の内在性リガン
ドを発見することに明らかに有用である。
【０１７２】 例えば、このリガンド組成物を、ピペットを用いて、付着する細胞を含む各ウ
ェルに添加する。少なくとも１つのコントロールウェル（例えば、そのリガンド
に対する水性希釈剤が添加されたもの）がそのアッセイに含まれる。
【０１７３】 付着する細胞は通常、そのシグナルについて最適化するに充分な時間であるが
、長すぎない期間刺激され、その結果、そのシグナルが、そのレセプターの内在
性ホスファターゼによる脱リン酸化の結果として減少する。適切な刺激時間は、
その細胞について生理的に最適な温度（通常約３７℃）において、約１０分〜６
０分の間であり、好ましくは約３０分である。
【０１７４】 活性化後、ウェルの上清をデカントし、次いでそのプレートを、吸収基質を軽
く詰めて過剰の上清を除去し得る。
【０１７５】 このアッセイを使用して、目的のレセプターに対するアンタゴニストリガンド
を検出し得る。アンタゴニストは、一般に、２つのカテゴリーに分類される：（
ａ）そのレセプターに結合し、そしてそのことにより、そのレセプターに対する
アゴニストによるそのレセプターの結合および／または活性化をブロックするも
の（このアンタゴニストは、ＥＣＤに結合し得るが、これは、必ずしもそうであ
るとは限らない）、ならびに（ｂ）そのアゴニストに結合し、従って、そのアゴ
ニストによるレセプターの活性化を妨害するもの。
【０１７６】 上記カテゴリー（ａ）からアンタゴニスト分子を検出するために、その細胞を
、上記に実質的に言及した疑いのあるアンタゴニストリガンドに対して曝露する
。そのアンタゴニストへの曝露後、そのウェル上清をデカントし、そしてそのプ
レートを軽く叩く。次いで、公知のアゴニスト（例えば、内因性増殖因子）を、
前パラグラフにおいて実質的に記載したように洗浄した細胞に対して添加する。
その後、ウェル上清をデカントし、そしてプレートを軽く叩く。あるいは、その
アンタゴニストおよびアゴニストの両方を含む組成物を、実質的に上記に記載の
ように付着する細胞へと添加し得る。続いて、そのレセプターの結合および／ま
たは活性化をブロックする、疑われるアンタゴニストの能力は、以下に議論され
るようにＥＬＩＳＡによって測定され得る。
【０１７７】 上記カテゴリー（ｂ）からアンタゴニスト分子を検出するために、公知のアゴ
ニストを、そのアッセイのＫＩＲＡ段階の前に、疑われるアンタゴニストと予備
インキュベートする。このインキュベーションを、アンタゴニスト−アゴニスト
の複合体が形成することを可能にするに十分な期間のあいだ行う（例えば、３０
分〜１２時間）。次いで、この複合体を、複合体化していないアゴニストおよび
アンタゴニストをコントロールとして使用したアッセイに供する。
【０１７８】 そのアゴニスト（および必要に応じてそのアンタゴニスト）リガンドへの曝露
後、その細胞を、以下に記載のように溶解する。
【０１７９】 （ｅ．細胞の溶解） そのアッセイのこの工程において、その細胞を、そのアッセイのＥＬＩＳＡの
段階について、活性化されたまま（すなわち、チロシン残基はリン酸化されたま
まである）であるように、そのレセプター構築物を可溶化するように溶解した。
従って、この細胞を、上記のように、レセプター構築物を可溶化する働きをする
溶解緩衝液を用いて溶解するが、なお、そのレセプター構築物を脱リン酸化も変
性もさせない。
【０１８０】 マイクロタイタープレートを、上記のように使用する場合、約７５〜２００μ
ｌの溶解緩衝液を、各ウェルに添加する。次いで、このプレートを、プレートシ
ェーカー（例えば、Ｂｅｌｌｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ
，ＮＪにより販売されるプレートシェーカー）を用いて、約１〜２時間緩やかに
振盪し得る。振盪は、室温で実施され得る。
【０１８１】 （２．酵素結合イムノソルベント検定法−ＥＬＩＳＡ） このアッセイの第二段階は、第二のアッセイプレートにおいて実施されるサン
ドイッチＥＬＩＳＡを含む。このＥＬＩＳＡを行うために、捕捉薬剤を調製する
。
【０１８２】 （ａ．捕捉薬剤の調製） 上記に言及したように、捕捉薬剤はしばしば、ポリクローナル抗体（通常、ア
フィニティー精製したポリクローナル抗体）またはモノクローナル抗体を含む。
他の捕捉薬剤は、上記の定義の節において触れられそして説明されている。捕捉
薬剤は、そのレセプター、またはそのフラッグポリペプチド（すなわち、抗原）
のいずれかに特異的に結合する。
【０１８３】 抗原（そのレセプターまたはそのフラッグポリペプチドのいずれか）に対する
ポリクローナル抗体は、一般に、その抗原またはその抗原性フラグメント（しば
しば、αサブユニットレセプターのＥＣＤ）およびアジュバントの複数の皮下（
ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物中で惹起される。その抗原または
その標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫されるべき種において免疫原
性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）に対して、
二官能性薬剤または誘導体化薬剤を用いて、結合体化させることは有用であり得
る。
【０１８４】 宿主動物またはそれから培養される抗体産生細胞に対して免疫原を投与するた
めの経路およびスケジュールは、一般的に、抗体の刺激および産生について確立
され、そして慣用される技術を用いて維持する。マウスは、しばしば、試験モデ
ルとして使用されるが、任意の哺乳動物被験体（ヒト被験体またはそれから得ら
れた抗体産生細胞を含む）を、本発明のプロセスに従って操作して、哺乳動物（
ヒト、ハイブリッド細胞株を含む）の産生のための基礎として作用させ得ること
が意図される。
【０１８５】 動物を、代表的に、免疫原性結合体または誘導体に対して、１ｍｇまたは１μ
ｇの結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を、３容量のフロイント
完全アジュバントと組み合せること、および複数部位で溶液を皮内に注射するこ
とによって免疫する。１ヵ月後、その動物を、フロイント完全アジュバント（ま
たは、他の適切なアジュバント）中で、結合体のもとの量の１／５〜１／１０の
量で、複数の部位での皮下注射によって、追加免疫する。７〜１４日後に動物か
ら採血し、そしてその血清を、抗抗原力価についてアッセイする。動物を、力価
がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、その動物を、同一の抗原で
はあるが異なるタンパク質とおよび／または異なる架橋剤を介して結合体化され
ている結合体を用いて追加免疫する。結合体をまた、組換え細胞培養物中で、タ
ンパク質融合体として作製し得る。また、凝固剤（例えば、ミョウバン）を使用
して、免疫応答を増強する。
【０１８６】 免疫後、モノクローナル抗体を、免疫した動物から免疫細胞（代表的には、脾
臓細胞またはリンパ節組織からのリンパ球）を回収すること、およびその細胞を
、従来の様式（例えば、ミエローマ細胞との融合またはエプスタインバーウイル
ス（ＥＢ）ウイルスでの形質転換による）不死化すること、および所望の抗体を
産生するクローンについてスクリーニングすることによって調製し得る。Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１
９７６）によってもともと記載され、そしてまた、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．５６３〜６８１頁（１９８１）に記
載されるハイブリドーマ技術は、多数の特定の抗原に対して高レベルのモノクロ
ーナル抗体を分泌するハイブリッド細胞株を産生するために広汎に適用されてい
る。
【０１８７】 ある種の細胞と、別の種の細胞とを融合させることも可能である。しかし、免
疫された抗体産生細胞およびミエローマの供給源は、同じ種由来であることが好
ましい。
【０１８８】 ハイブリッド細胞株を、細胞培養培地中での培養物において維持し得る。本発
明の細胞株は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地にお
いて連続的な細胞株を含む組成物中で選択および／または維持され得る。事実、
一旦、そのハイブリドーマ細胞株が確立されると、これは、種々の栄養的に適切
な培地において維持され得る。さらに、ハイブリッド細胞株は、かなり多数の慣
用的な方法において貯蔵および保存され得る。これには、凍結および液体窒素下
での貯蔵が含まれる。凍結細胞株は、モノクローナル抗体の再開された合成およ
び分泌によって無限に再生および培養され得る。
【０１８９】 分泌された抗体は、沈降、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどのような従来の方法によって組織培養上清から回収される
。本明細書において記載される抗体はまた、事情が許せば、ＩｇＧまたはＩｇＭ
の精製のため従来の方法によって、ハイブリドーマ細胞培養物から回収される。
これらの従来の方法は、プールした血漿からこれらの免疫グロブリンを精製する
ためにこれまで使用されてきた（例えば、エタノール沈降手順またはポリエチレ
ングリコール沈降手順）。次いで、精製した抗体を、濾過滅菌する。この抗体が
ポリクローナル抗体である場合、一般に、目的の抗原から実質的に特異的な捕捉
抗体を提供するように生成したアフィニティーカラムを用いてアフィニティー精
製する。アフィニティークロマトグラフィーには、通常、他の精製技術（例えば
、液体クロマトグラフィー）が先行する。
【０１９０】 さらなる実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅ
ｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技
術を介して、フラッグポリペプチド、αサブユニットレセプター、またはそれら
のフラグメントを用いて生成した抗体ファージライブラリーから単離して、適切
な抗体または抗体フラグメントを選択し得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラ
リーを用いるマウスおよびヒトの抗体の単離を記載する。後続の刊行物は、鎖シ
ャフリング（Ｍａｒｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３（１
９９２））による高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生、ならびに非常に大き
なファージライブラリーを構築するための戦略としての組合せ感染およびインビ
ボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２
６５−２２６６（１９９３））を記載する。従って、これらの技術は、本発明に
包含される「モノクローナル」抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体
ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替である。
【０１９１】 本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（
例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合
し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離および配列
決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給
源として働く。一旦単離されると、このＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、
次いで、これを、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しないミエローマ
細胞のような宿主細胞へとトランスフェクトされて、組換え宿主細胞においてモ
ノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同性マウス配列
の代わりにヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインをコードする配列を置換するこ
と（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５
１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列のす
べてまたは部分を、免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、
改変され得る。この様式で、本明細書中の抗レセプターまたは抗フラッグポリペ
プチドのモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリ
ッド」抗体を調製する。従って、この抗体は、組換えＤＮＡ方法（Ｃａｂｉｌｌ
ｙら、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【０１９２】 捕捉薬剤の結合は、そのレセプターに結合したリガンドの存在または非存在に
よっては影響されず、そしてその捕捉薬剤は、抗ホスホチロシン抗体によってリ
ン酸化されたチロシンへの接近を、立体的にブロックしない。さらに、この捕捉
薬剤は、当然、目的のレセプターを活性化しない。
【０１９３】 第一に、一旦、捕捉薬剤（例えば、抗体またはストレプトアビジン）が選択さ
れると、レセプターまたはフラッグポリペプチドのいずれかへの結合（ここで、
レセプター構築物は、そのアッセイにおいて使用される）が確認される。これは
、例えば、フローサイトメトリ分析、免疫沈降または抗原コーティングＥＬＩＳ
Ａによって決定され得る。フローサイトメトリ分析は上記に記載されている。免
疫沈降は、通常、適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中の非イオン性界面活性剤（
例えば、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で、その細胞（レセプター構
築物を有する）を溶解することを包含し、次いでこのようにして得られたこの細
胞溶解物は、潜在的な抗レセプターまたは抗フラッグポリペプチド捕捉薬剤とイ
ンキュベートされる。免疫複合体は、（ａ）その免疫複合体の沈降を増強するポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下での抗捕捉薬剤抗体を用いるか、また
は（ｂ）不溶性の（例えば、アガロース結合）プロテインＡまたはプロテインＧ
のいずれかを用いて、沈降される。次いで、免疫沈降した物質は、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析される。抗原コーティングＥＬＩ
ＳＡについて、ＥＬＩＳＡウェルは、精製したレセプター、精製したフラッグポ
リペプチド、または精製したレセプター構築物のいずれかを用いて一晩コーティ
ングされる。次いで、このコーティングウェルは、潜在的な捕捉薬剤に対して曝
露され、そしてＨＲＰＯ結合体化された種特異的な抗捕捉薬剤抗体を用いてスク
リーニングされる。
【０１９４】 この捕捉薬剤が、そのレセプターに対するリガンドの存在下でそのレセプター
またはフラッグポリペプチドに結合する能力もまた、確認される。これは、その
レセプター構築物を、そのレセプターに対する公知のリガンド（例えば、内因性
増殖因子またはそれに対するアゴニスト抗体）とともにインキュベートすること
によって分析され得る。次いで、フローサイトメトリ分析、免疫沈降法、または
抗原コーティングＥＬＩＳＡが、上記に実質的に記載されるように実施されて、
その捕捉薬剤の結合が調査され得る。
【０１９５】 この捕捉薬剤が、上記の２工程によって決定される場合に適切であると仮定す
ると、次いで、その捕捉薬剤は、細胞溶解の前または後のいずれかでレセプター
活性化（すなわち、自己リン酸化）を誘導しないことが示される。従って、その
細胞結合レセプター構築物は、潜在的な捕捉薬剤またはネガティブコントロール
（例えば、そのレセプターを活性化しないコントロール抗体）のいずれかに曝露
される。細胞溶解後、そのレセプター構築物は、標識された抗ホスホチロシン抗
体を用いたウェスタンブロット分析に供される。例えば、Ｇｌｅｎｎｅｙら、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０９：
２７７−２８５（１９８８）；Ｋａｍｐｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ２０１：１０１−１１０（１９９１）；Ｋｏｚｍａら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０１：２８−４３（１９９１）；または
Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５−１０（１９９２）を参照
のこと。その捕捉薬剤が細胞溶解後にレセプター活性化を誘導するか否かを確立
するために、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ（上記のようなその捕捉薬剤およびネガティ
ブコントロールの両方を用いた）の試行が行われ得る。
【０１９６】 最後に、抗ホスホチロシン抗体（例えば、ビオチン化抗ホスホチロシン抗体）
が、潜在的捕捉薬剤の存在下で活性化レセプターを結合する能力は、本明細書に
おいて開示したＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおける試行によって確認される。
【０１９７】 その捕捉薬剤が、上記に特定した基準の全てを満たすと仮定すると、ＫＩＲＡ
ＥＬＩＳＡにおける使用のための良好な潜在性を有する。
【０１９８】 一旦適切な捕捉薬剤が調製されると、第二の固相がそれでコーティングされる
。約０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの間の捕捉薬剤は、例えば、ピペットを
使用して第二のアッセイプレートの各ウェルに添加され得る。捕捉薬剤は、しば
しば、高ｐＨ（例えば、約７．５〜９．６）の緩衝液中に提供され、その結果、
それは、増加した全体の荷電を有し、そしてそれゆえ、その第二のアッセイプレ
ートへの結合の増加を示す。通常、その捕捉薬剤は、約８〜７２時間の間にわた
ってウェル中でインキュベートされて、捕捉薬剤の充分なコーティングがそのウ
ェルの内側の壁上で形成されることを可能にする。このインキュベーションは、
一般に、低温（例えば、約３〜８℃）で行われて、捕捉薬剤の分解を回避または
減少させる。
【０１９９】 インキュベーション後、そのプレートのウェルをデカントし、そして吸着基質
を軽く詰める。次いで、非特異的結合をブロックする。これを達成するために、
ブロック緩衝液をウェルに添加する。例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
含むブロック緩衝液（例えば、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｐｕｒｃｈ
ａｓｅ、ＮＹによって販売されるもの）が適切である。約１００〜２００μｌの
間のブロック緩衝液の各ウェルへの添加に続く室温での１〜２時間の間の緩和の
振盪が、非特異的な結合をブロックするのに充分であることが見出されている。
また、第二のアッセイプレートではなく以前の工程において得られた細胞溶解物
に直接ブロック緩衝液を添加することも可能である。
【０２００】 この後、捕捉薬剤コートプレートを何回か洗浄緩衝液で洗浄する（通常、約３
〜８回）。この洗浄緩衝液は、例えば、リン酸緩衝化生理緩衝液（ＰＢＳ）、ｐ
Ｈ７．０〜７．５を含み得る。しかし、他の洗浄緩衝液もまた利用可能であり、
これもまた、使用され得る。簡便には、自動プレート洗浄器（例えば、Ｓｃａｎ
Ｗａｓｈｅｒ ３００（Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ. 、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）がこれに使用され得、そして他のものがそのアッセ
イの洗浄工程に使用され得る。
【０２０１】 （Ｂ．チロシンリン酸化の測定） 次いで、活性化し、可溶化されたレセプター構築物を、それに付着する捕捉薬
剤を有するウェルに添加する。一般的な提唱として、上記の節において言及した
ように得られた約８０％の細胞溶解物を各ウェルに添加し得る（すなわち、その
ウェルのもとの容量に依存して約６０〜１６０μｌ）。この溶解物を、適切な期
間、捕捉薬剤とともにインキュベートして、レセプター構築物がそのウェルにお
いて捕捉されることを可能にする（例えば、１〜３時間）。インキュベーション
は、室温で実施され得る。
【０２０２】 次いで、結合していない細胞溶解物を、洗浄緩衝液で洗浄することによって除
く。この洗浄工程後、以前に添加したブロック緩衝液の量と等量、またはそれ未
満の量の抗ホスホチロシン抗体を各ウェルに添加する。例えば、約０．３〜０．
５μｇ／ｍｌの抗体を適切な緩衝液中に有する約５０〜２００μｌの抗ホスホチ
ロシン抗体調製物を（例えば、溶解緩衝液中に含まれるもののような界面活性剤
を有するＰＢＳ）、そのウェルに添加する。これにつづいて、洗浄工程を行って
、結合していない抗ホスホチロシン抗体を除く。
【０２０３】 次いで、チロシンリン酸化は、第二固相への抗ホスホチロシン抗体結合の量に
よって定量される。抗体の存在を検出するための多くの系が当業者に利用可能で
ある。いくつかの例を続ける。
【０２０４】 一般に、抗ホスホチロシン抗体は、検出可能な標識で直接的または間接的のい
ずれかで標識される。一般に以下のカテゴリーにグループ分けされ得る多くの標
識が利用可能である： （ａ）放射性同位体（例えば、35Ｓ、14Ｃ，125Ｉ、3Ｈおよび131Ｉ）。この 抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ、前出に記載される技術を用いて放射性同位体を用いて標識され得、そし
て放射能はシンチレーション計数を使用して測定され得る。
【０２０５】 （ｂ）蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフ
ルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサ
ミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッドが利用可能である。この蛍光標
識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ、前出に開示される技術を用いて抗体と結合体化され得る。蛍光は、蛍光測
定器（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を用いて定量され得る。
【０２０６】 （ｃ）種々の酵素基質標識が利用可能であり、そして米国特許第４，２７５，
１４９号は、それらのいくつかの概説を提供する。酵素は、一般的に、色素原性
基質の化学変化を触媒し、その変化は、種々の技術を用いて測定され得る。例え
ば、その酵素は、基質における色の変化を触媒し得、これは、分光光度的に測定
され得る。あるいは、その酵素は、その基質の蛍光または化学発光を変化させ得
る。蛍光の変化を定量するための技術は上記に記載されている。化学発光基質は
、化学反応によって電気的に励起され、次いで、これは、測定され得る（例えば
、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００化学発光測定器を使用して）光を発光し得る
か、または蛍光アクセプタへエネルギーを付与する。酵素標識の例は、ルシフェ
ラーゼ（例えば、蛍ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，
７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、マレ
イン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ））、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グル
コースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウレアーゼおよび
キサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ
などを含む。酵素を抗体と結合体化するための技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙ
ｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ
．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ
ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、７３：１４７−１６６（１９８１）およびＣｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｃｏｔｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出に記載さ
れる。
【０２０７】 酵素−基質の組合せの例は、例えば、以下を含む： （ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを用いる西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰＯ）、ここでこの水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体（例えば、オル
トフェニレンジアミン（ＯＰＤ））または３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸化する。
【０２０８】 （ｉｉ）色素原基質としてパラ−ニトロフェニルリン酸塩を用いるアルカリホ
スファターゼ（ＡＰ） （ｉｉｉ）色素原基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ）または蛍光原性基質（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ）を用いるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ） 多くの他の酵素−基質の組合せは当業者に利用可能である。これらの一般的な
概説については、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８
０号を参照のこと。
【０２０９】 ときに、その標識は、その抗体と間接的に結合体化される。当業者は、これを
達成するための種々の技術を知っている。例えば、その抗体は、ビオチンと結合
体化され得、そして上記に言及した３つの広汎なカテゴリーの標識のいずれかが
、アビジンと結合体化され得、またはその逆をなされ得る。ビオチンは、選択的
にアビジンに結合し、そして従って、その標識は、この間接的な様式でその抗体
と結合体化され得る。ビオチン−アビジン結合体に関する技術の総説については
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出を
参照のこと。あるいは、この標識の抗体との間接的な結合体化を達成するために
、その抗体は、小さなハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合体化される。そし
て、上記において言及した標識の異なる型のいずれか一つが、抗ハプテン抗体と
結合体化される（例えば、抗ジゴキシン抗体）。従って、この標識の抗体との間
接的な結合体化が達成され得る。
【０２１０】 本発明の別の実施態様において、抗ホスホチロシン抗体は、標識される必要が
ない。そして、その存在は、標識抗−抗ホスホチロシン抗体（例えば、ＨＲＰＯ
と結合体化した抗マウス抗ホスホチロシン抗体）を使用して検出され得る。
【０２１１】 好ましい実施態様において、抗ホスホチロシン抗体は、酵素標識で標識される
。この酵素標識は、基質（例えば、テトラメチルベンズイミジン（ＴＭＢ）また
はオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ））の色の変化を触媒する。従って、放射
性物質の使用が回避される。試薬の色の変化は、適切な波長で分光光度的に決定
され得る（例えば、ＴＭＢについて４５０ｎｍ、およびＯＰＤについて４９０ｎ
ｍ、ここで参照波長は、６５０ｎｍである）。
【０２１２】 （３．細胞内キナーゼ活性） 本明細書中に記載されるアッセイはまた、αサブユニットレセプターに融合さ
れた細胞内キナーゼドメイン（例えば、細胞質チロシンキナーゼおよび／または
細胞質セリンスレオニンキナーゼを形成する）のリン酸化および／または活性化
を測定することによって、使用される。これらの分子のリン酸化は、キナーゼレ
セプターまたは「レセプター複合体」（これは、細胞膜に存在する１以上のキナ
ーゼレセプターを含む）による細胞内キナーゼドメインのトランスリン酸化の結
果として生じ得る。細胞内チロシンキナーゼの例としては、例えば、インスリン
レセプター基質（ＩＲＳ−１）、Ｓｈｃ，ＲａｓおよびＧＲＢ２が挙げられる。
ヒトＳｈｃ、ヒトＲａｓおよびＧＲＢ２に対する抗体は、ＵＢＩ，ＮＹから商業
的に入手され得る。これは、これらのチロシンキナーゼについての捕捉薬剤とし
て使用され得る。細胞内セリンスレオニンキナーゼの例としては、ＭＥＫおよび
ＭＡＰＫが挙げられる。
【０２１３】 これらのキナーゼからの触媒ドメインを含むレセプター構築物のリン酸化を測
定するためには、その手順は、本質的に上記されているとおりであり、キメラは
、「キナーゼ構築物」と称される。一般に、真核細胞生物は、キナーゼ構築物を
コードする核酸を用いて形質転換される。この核酸の発現の際に、このキナーゼ
構築物は、細胞内（すなわち、細胞質）に存在する。キナーゼ構築物を含む細胞
は、上記のＫＩＲＡに供される。このアゴニストへの曝露は、細胞内キナーゼ構
築物のトランスリン酸化を生じ得、これは、上記で詳説するようにＥＬＩＳＡに
おいて定量され得る。ＥＬＩＳＡ中の捕捉薬剤は、細胞内キナーゼ構築物または
フラッグポリペプチドのいずれかへ結合する。
【０２１４】 （４．セリンスレオニンキナーゼ活性） このアッセイは、αサブユニットレセプターに融合されたセリンスレオニンキ
ナーゼＩＣＤドメインのリン酸化および／または活性化について測定することに
よってさらに使用される。用語「セリンスレオニンキナーゼ」とは、少なくとも
１つのホスフェート受容アルコール基を有する基質をリン酸化するキナーゼをい
う。セリンスレオニンキナーゼは、それが、リガンド結合性ＥＣＤ、ＴＭドメイ
ンおよびＩＣＤを有する限り通常「レセプター」である。ＩＣＤは、通常、触媒
キナーゼドメインを含み、そして一般に、１つ以上のホスフェート受容セリンお
よび／またはスレオニンの残基を有する。細胞内セリンスレオニンキナーゼの例
としては、ＭＥＬおよびＭＡＰＫが挙げられる。細胞内セリン−スレオニンキナ
ーゼのリン酸化を測定することは、本明細書に記載されるようになされ得る。レ
セプター構築物を作製するための融合について適切なＩＣＤドメインを提供し得
るセリンスレオニンキナーゼレセプターの例は、ｄａｆ−１、アクチビンＩＩ型
レセプター（ＡｃｔＲ−ＩＩ）、アクチビンＩＩＢ型レセプター（ＡｃｔＲ−Ｉ
ＩＢ）、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプター（ＴβＲ−ＩＩ）、アクチビンレセプター
様キナーゼ（ＡＬＫ）−１、ＡＬＫ−２、ＡＬＫ−３、ＡＬＫ−４、およびＴＧ
Ｆ−βＩ型レセプター（ＴβＲ−１）／ＡＬＫ−５を含む。ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ
ら、前出を参照のこと。セリンスレオニンキナーゼアッセイは、上記においてチ
ロシンキナーゼについて記載したものと、リン酸が抗ホスホセリン抗体および／
または抗ホスホスレオニン抗体を用いて定量されることを除いて本質的に同じで
ある。抗ホスホセリンモノクローナル抗体および抗ホスホスレオニンモノクロー
ナル抗体は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入され得る。
【０２１５】 （５．ホスファターゼ活性） ホスファターゼ活性は、同様に、本明細書中上記に記載したアッセイを用いて
測定され得る。ホスファターゼ酵素は、リン酸化したチロシン、セリンおよび／
またはスレオニンの残基を脱リン酸化し得る（すなわち、そのようなアミノ酸残
基のリン酸エステルから無機ホスフェートを遊離し得る）。一般に、ホスファタ
ーゼ酵素は、チロシン残基またはセリンスレオニン残基のいずれかについて特異
的であるが、ときには、チロシン、セリンおよびスレオニンの残基を脱リン酸化
し得る。時に、「内因性」ホスファターゼ活性が測定され、そしてこれを、選択
される細胞において天然に存在するホスファターゼ酵素の活性と呼ぶ。内因性ホ
スファターゼ活性を定量するために、少なくとも１つホスファターゼを有する細
胞は、１以上のホスファターゼインヒビターの存在下および非存在下で刺激され
る。タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）インヒビターの例とし
ては、オルトバナジン酸ナトリウム、およびモリブデン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が挙げられる。ＩＣ
Ｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓは、オカダ酸を供給する。このオカダ酸は、セリ
ンスレオニンホスファターゼのインヒビターである。一般的な提唱として、約１
〜１０μＭの間のホスファターゼインヒビターがそのアッセイプレートの各ウェ
ルに添加され得る。他の全ての面において、このアッセイは、本質的に上記に記
載したとおりに実施される。従って、内因性ホスファターゼが、選択される細胞
においてキナーゼを脱リン酸化する能力が定量され得る。
【０２１６】 好ましい実施態様において、目的のホスファターゼ酵素が研究され得る。タン
パク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）の例としては、ＰＴＰ１Ｂ、Ｐ
ＴＰＭＥＧ、ＰＴＰ１ｃ、Ｙｏｐ５１、ＶＨ１、ｃｄｃ２５、ＣＤ４５、ＨＬＡ
Ｒ、ＰＴＰ１８、ＨＰＴＰα、およびＤＰＴＰ１０Ｄが挙げられる。Ｚｈａｎｇ
およびＤｉｘｏｎ、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍ．６８：１−３６（１９９４）を参照の
こと。タンパク質セリンスレオニンホスファターゼの例としては、ＰＰ１、ＰＰ
２Ａ、ＰＰ２ＢおよびＰＰ２Ｃが挙げられる。Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．Ｈｕｎｔ
ｅｒおよびＳｅｆｔｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
、２０１：３８９−３９８（１９９１）を参照のこと。これらのタンパク質は、
市販され得るか、または本明細書に記載の組換え技術を使用して作製され得る。
ホスファターゼ活性を測定するために、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡは、上記に本質的
に記載のように、以下の改変を伴って実施され得る。キナーゼまたはキナーゼ構
築物（例えば、レセプター構築物）の第二の固相への捕捉および洗浄工程（結合
していない細胞溶解物を除去するために）の後に、目的のホスファターゼを、第
二のアッセイプレートのウェルに添加し、そして付着するキナーゼまたはキナー
ゼ構築物とともにインキュベートする。例えば、適切な希釈緩衝液（Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍ．ＨｕｎｔｅｒおよびＳｅｆｔｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓ
ｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１：４１６−４４０（１９９１）を参照のこと）中
にある約５０〜２００μｌの間のホスファターゼが各ウェルに添加され得る。こ
の後に、一般に、室温（または３７℃）で約３０分から２時間の間にわたる緩和
の振盪を行って、そのホスファターゼにそのキナーゼを脱リン酸化させる。洗浄
してそのホスファターゼを除いた後、コントロール（すなわち、ホスファターゼ
の添加なし）に比してそのキナーゼの減少した程度のリン酸化は、本明細書にお
いて上記に記載したようにＥＬＩＳＡによって定量される。
【０２１７】 （６．キット） 簡便さのために、試薬は、その分析物が目的のαサブユニットレセプターを活
性化するかまたは活性化を妨害する能力をアッセイするにおいてその分析物と組
合せるために、キット（すなわち、試薬の包装された組合せ）中で提供され得る
。このキットの成分は、所定の比率で提供される。従って、キットは、アッセイ
のための特定の第二の固相および抗フラッグポリペプチド捕捉薬剤（別個に包装
されるか、または第二の固相（例えば、マイクロタイタープレート）へ捕捉され
ているかのいずれか）を含む。通常、他の試薬（例えば、酵素標識で直接または
間接的に標識された抗ホスホチロシン抗体）もまた、そのキット中に提供される
。検出可能な標識が酵素である場合、そのキットは、基質およびその酵素が必要
とする補因子（例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を提供する基質前駆体
）を含む。さらに、他の添加物（例えば、安定化剤、緩衝剤（例えば、ブロック
緩衝液および溶解緩衝液）など）もまた含まれ得る。簡便には、このキットはま
た、そのレセプター構築物で形質転換した均質な集団の細胞を供給し得る。相対
的な量の種々の試薬が試薬の溶液における濃度を提供するために広汎に変動され
得、これは、実質的にそのアッセイの感受性を最適化する。特に、その試薬は、
乾燥粉末（通常凍結乾燥される）（これは、溶解すると、適切な濃度を有する試
薬溶液を提供する賦形剤を含む）として提供され得る。このキットはまた、適切
には、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡを実施するための指示書を含む。
【０２１８】 （７．アッセイのための使用） 本出願は、信頼の高い、高感度な、そして定量的なキナーゼ活性化の検出のた
めに有用である２つのアッセイを提供する。キナーゼ活性化は、ホモダイマー化
またはホモオリゴマー化によって生じるαサブユニットレセプターによるリガン
ド結合を反映する。本明細書において記載される所望の特性を有するレセプター
特異的な捕捉抗体が利用可能であるか、または調製されている場合、第一のアッ
セイが使用され得る。第二のアッセイは、任意のレセプター構築物の活性化がフ
ラッグポリペプチドおよびそれに特異的に結合する捕捉薬剤の使用を介して測定
されることを可能にする包括的なアッセイである。
【０２１９】 これらのアッセイは、選択されるレセプターについて新規のアゴニスト／アン
タゴニストを同定するために有用である。また、このアッセイは、リガンド−レ
セプター相互作用を研究するため（すなわち、力学的研究）の手段を提供する。
また、内因性レセプターの選択される細胞株における存在は、そのアッセイを使
用して定量され得る。そのアッセイは、さらに、生物学的なサンプルにおいて選
択されるレセプターについてのリガンドの存在を同定するために、および例えば
、増殖因子が精製手順に従って単離されたか否かを確立するために、有用である
。これらの増殖因子がそれらのそれぞれのレセプターを活性化する能力を測定す
るためのアッセイを有することが所望される。
【０２２０】 このアッセイはまた、ヒトから採取した生物学的サンプル中で選択されるレセ
プター（例えば、ＧＦＲα３レセプター）についてのリガンドの存在を検出する
ための臨床適用を有する。従って、上昇または下降したレベルのリガンドを有す
る患者が同定され得る。これは、上昇または下降したレベルのリガンドが病因的
状態を生じる場合に特に所望される。従って、選択されるリガンド（例えば、イ
ンスリン）の投与のための候補は、この診断方法を通じて同定され得る。本明細
書において開示したアッセイを用いて、患者に投与したアゴニストまたはアンタ
ゴニストのｐＫをアッセイすることが可能である。このアッセイはまた、生物学
的サンプルにおいて隠れたレセプターの検出を容易にする。
【０２２１】 このアッセイはまた、内因性ホスファターゼのホスファターゼの活性、または
好ましい実施態様においては目的のホスファターゼを定量するために有用である
。これは、例えば、ホスファターゼインヒビターをスクリーニングするために使
用され得る。
【０２２２】 以下の実施例は、例示的な目的のみに提供される。そして、いかなる方法にお
いても本発明の範囲を制限することを意図しない。本明細書において引用したす
べての特許文献および刊行物文献は、本明細書において参考としてその全体が援
用される。
【０２２３】 （実施例） 実施例において言及される市販の試薬は、特に言及しない限り、製造業者の指
示に従って使用した。以下の実施例においておよび本明細書を通して、ＡＴＣＣ
受託番号によって示されるそれらの細胞の供給源は、アメリカンタイプカルチャ
ーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄである。
【０２２４】 （実施例１：マウスＧＦＲα３のクローニング） ニューツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）レセプター（現在では、ＧＦＲα２（「
神経膠細胞株由来神経栄養因子ファミリーレセプターα」として知られる）から
の配列を用いて、ＧＦＲαファミリーの新規の潜在的なメンバーを、公の遺伝子
データベース中でマウスＥＳＴとして同定した（受託番号、Ｗ９９１９７（配列
番号１）、ＡＡ０４１９３５（配列番号２）、およびＡＡ０５００８３（配列番
号３））。この潜在的に新しいレセプターに対応するＤＮＡフラグメントを、マ
ウスＥ１５ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を、テンプレート
として、およびマウスＥＳＴに由来するＰＣＲプライマーを用いたＭａｒａｔｈ
ｏｎ ＰＣＲによって得た。次いで、このＰＣＲ産物を用いて、λｇｔ１０マウ
スＥ１５ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．ＵＳＡ）をスクリーニング
して、全長クローンを得た。この全長マウスｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、配
列番号４に提供する（図１Ａ〜１Ｂ）。単離されたＤＮＡによってコードされる
タンパク質配列（配列番号５；図１Ａ〜１Ｂを参照のこと）を、ＧＦＲα３と命
名した。なぜなら、これは、ＧＦＲα１（以前は、ＧＤＮＦレセプターα）およ
びＧＦＲα２（以前は、ニューツリンレセプターα；ＮＴＮＲα）と配列同一性
を有する新規なタンパク質であると決定されたからである。３９７アミノ酸のマ
ウスＧＦＲα３タンパク質配列（配列番号５）の、ラットＧＦＲα１（配列番号
８）およびラットＧＦＲα２（配列番号９）との比較を、図２に提供する。ｍＧ
ＦＲα３配列は、ＧＦＲレセプターファミリーに属するホモログの新規なシリー
ズを同定すると考えられる。潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が図２に斜線で
示される。ＧＰＩアンカーに関与する疎水性配列を、図２に上書きする。潜在的
なＧＰＩ結合部位を、アステリスクで示す。マウスＧＦＲα３ ＤＮＡの改変体
は、図１Ａにおける２９０位にて「Ｔ」塩基の欠失を含み、これは、フレームシ
フトおよび短縮型タンパク質改変体を生じる。それにもかかわらず、改変体ＤＮ
Ａは、ハイブリダイゼーション、診断、および本明細書を通じて議論されるＤＮ
Ａの他の使用（全長タンパク質産生を除く）について有用である。この塩基のす
ぐ上流のＧＦＲα３コード領域を含むＤＮＡ（８９位〜２８９位）は、本発明に
おける使用を見出す。直ぐ下流（２９１〜１２７９）の配列を含むＤＮＡは、本
発明の別の有用な実施態様を提供する。
【０２２５】 マウスＧＦＲα３をコードするＤＮＡを用いたインサイチュハイブリダイゼー
ション研究によって、末梢感覚ニューロンおよび交感神経ニューロンにおける発
現のパターンが示された（データは示さず）。
【０２２６】 （実施例２：ヒトＧＦＲα３をコードするｃＤＮＡクローンの単離） この新しいレセプターのヒトホモログが、存在し得るか否かを迅速に同定する
ために、発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（専有的ＥＳＴデータベー
ス、ＬＩＦＥＳＥＱTM、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を検索し、そしてＥＳＴ（ＩＮＣ３５７４２０９）は、
以下の配列を有すると同定された：
【０２２７】
【化１】
【０２２８】 この配列は、マウスＧＦＲα３と６１％の同一性を有した。
【０２２９】 対応する全長ｃＤＮＡをクローニングするために、ｃＤＮＡライブラリーのパ
ネルを、以下のプライマーを使用してスクリーニングした：
【０２３０】
【化２】
【０２３１】 このライブラリーからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）のとお
りに、そのＰＣＲプライマー対を用いるＰＣＲ増幅によってスクリーニングした
。 強力なＰＣＲ産物を、分析したすべてのライブラリー中に同定した（胎児肺、胎
児腎臓、および胎盤）。
【０２３２】 このタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために、ヒト胎児肺
ｐＲＫ５ベクターライブラリーを、ｎｅｗａ３．Ｒプライマーを用いる乳房／肛
門（ｄｕｇ−／ｂｕｎｇ−）宿主中で増殖させたプラスミドライブラリーからの
一本鎖ＤＮＡの伸長によって陽性ｃＤＮＡクローンについて選択し、そして富化
した。ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児肺組織から単離し
た。ｃＤＮＡクローンを単離するために使用したｃＤＮＡライブラリーを、市販
の試薬（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈなど）を用いる標準的な方法によって構築した。このｃＤＮＡを、Ｎｏ
ｔＩ部位を含むオリゴｄＴを用いてプライミングし、ＳａｌＩヘミキナーゼ化ア
ダプターに対する平滑末端を用いて連結し、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動に
よって適切にサイズ分けし、そして適切なクローニングベクター中に所定の方向
で、独特なＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位において、クローニングした（ｐＲＫＢ
またはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体で
ある；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３；１２７８−１２８０（１９９
１）を参照のこと）。陽性ｃＤＮＡクローンについて富化するために、プライマ
ー伸長反応物は、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、
ＵＳＡ）、１μｌ ｄＮＴＰ（２０ｍＭ）、１μｌライブラリーＤＮＡ（２００
ｎｇ）、１μｌプライマー、８６．５μｌ Ｈ2Ｏおよび１μｌのＡｍｐｌｉｔ ａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）（これは、ホットスタート後に添加
した）を含んでいた。この反応物を、９５℃で１分間変性し、６０℃で１分間ア
ニールし、次いで、７２℃で１５分間伸長した。そのＤＮＡを、フェノール／ク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈降させ、次いで、ＤＨ１０Ｂ宿主細菌にエ
レクトロポレーションによって形質転換した。形質転換混合物の全体を、１０の
プレートに播種し、そしてコロニーを形成させた。コロニーを、ナイロンメンブ
レン上にリフトし、そしてＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴに由来するオリゴヌクレオチド
プローブ（ｎｅｗａ３．プローブ：５’ＴＣＴ ＣＧＣ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＧ
Ａ ＣＣＣ ＣＣＴ ＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＡＧ ＣＣＧ ＡＣＴ ＣＡ
３’（配列番号１３））を用いてスクリーニングした。フィルターをそのプロー
ブと、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１０×デンハルト溶液、０
．０５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、
および５０μｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中で、一晩ハイブリダイ
ズさせた。次いで、フィルターを、２×ＳＳＣ中でリンスし、０．１×ＳＳＣ，
０．１％ ＳＤＳ中で洗浄し、次いで、Ｋｏｄａｋ Ｘ Ｒａｙフィルムに一晩
曝露した。５つの陽性クローンを同定した。純粋な陽性クローンを、コロニー精
製および二次スクリーニングの後に得た。
【０２３３】 単離されたクローンのうち２つを配列決定した。これらのｃＤＮＡ配列を、Ｄ
ＮＡ４８６１３（配列番号１４）およびＤＮＡ４８６１４（配列番号１６）と命
名した。ＤＮＡ４８１６３のアミノ酸配列分析によって、推定２６アミノ酸長の
Ｎ末端シグナルペプチドを有する４００アミノ酸長のオープンリーディングフレ
ームの配列（配列番号１５）が示された。推定成熟タンパク質は、約４１ｋＤａ
の計算分子量を有し、３７４アミノ酸長である。潜在的なＮ結合型グリコシル化
部位は、マウス配列におけるホース（ｈｏｓｅ）と類似する。マウスおよびヒト
のＧＦＲα３タンパク質配列を、図３において比較する。
【０２３４】 ＤＮＡ４８１６４の推定アミノ酸配列（配列番号１７）および配列番号１５に
対する比較によって、この推定アミノ酸配列は、図４に示されるように、３０ア
ミノ酸の欠失（開始メチオニンから数えて、アミノ酸１２７位〜１５７位）を有
する、ＤＮＡ４８１６３の選択的にスプライシングされた形態であることが示さ
れた。興味深いことに、このクローンにおいてシステインは全く欠失されなかっ
た。クローンであるＤＮＡ４８６１３、ＤＮＡ４８６１４およびｍＧＦＲα３（
クローン１３）改変体をＡＴＣＣに寄託し、そしてそれぞれ、ＡＴＣＣ受託番号
２０９７５２（名称：ＤＮＡ４８６１３−１２６８）、２０９７５１（名称：Ｄ
ＮＡ４８６１４−１２６８）および が割り当てられた。ＤＮＡ４８
６１３をコードする核酸配列とヒトＧＦＲα１をコードする核酸配列およびＧＦ
Ｒα２をコードする核酸配列との比較を、図５Ａ〜Ｂに提供する。クローニング
されたＤＮＡ４８６１３における開始ＡＴＧのすぐ上流の５’非翻訳ＧＦＲα３
配列は、以下である：
【０２３５】
【化３】
【０２３６】 以下に議論されるように、ＤＮＡ４８６１３によってコードされるタンパク質
のＧＦＲα１およびＧＦＲα２に対する配列比較（図６）は、２つのヒトタンパ
ク質がＧＦＲαレセプターファミリーの新たなメンバーであり、そしてマウスＧ
ＦＲα３のヒトホモログであることを示した。従って、ＤＮＡ４８６１３は、ヒ
トＧＦＲα３と命名されたタンパク質をコードし、そしてＤＮＡ４８６１４は、
そのスプライス改変体をコードする。
【０２３７】 ＧＦＲαファミリーメンバー間のアミノ酸配列比較を、全長配列のＢＬＡＳＴ
−２およびＦａｓｔＡ配列アラインメント分析に基づいて、表１に提供する。
【０２３８】
【表１】
【０２３９】 配列比較から、ヒトＧＦＲα３は、ＧＦＲα１またはＧＦＲα２のいずれかよ
りも、その齧歯類ホモログへの関連が少ないことが理解され得る。さらに、ＧＦ
Ｒα３は、ＧＦＲα１とＧＦＲα２とが互いに関連するよりも、ＧＦＲα１およ
びＧＦＲα２への関連が遠いようである。
【０２４０】 （実施例３：ハイブリダイゼーションプローブとしてのＧＦＲα３の使用） 以下の方法は、ＧＦＲα３をコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼー
ションプローブとしての使用を記載する。
【０２４１】 ＧＦＲα３のコード配列（配列番号４、配列番号１４、または配列番号１６に
示される）を含むＤＮＡまたはそのフラグメントをプローブとして利用して、相
同なＤＮＡ（例えば、天然に存在するＧＦＲα３またはＧＦＲα３の改変体をコ
ードするＤＮＡ）についてヒト組織ｃＤＮＡライブラリー、ヒト組織ゲノムライ
ブラリー、組織から単離されたＲＮＡ、インサイチュでの組織調製物、または染
色体調製物（例えば、染色体マッピングのため）においてスクリーニングする。
【０２４２】 いずれかのライブラリーを含むフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗
浄を、以下の高ストリンジェンシー条件下で行う。放射標識したＧＦＲα３由来
プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションを、５０％ ホルムアミド、
５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハルト溶液、および１０％ リン酸デ
キストランの溶液中で４２℃にて２０時間行う。このフィルターの洗浄を、０．
１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳの水溶液中、４２℃にて行う。
【０２４３】 次いで、全長のネイティブＧＦＲα３の配列をコードするＤＮＡとの所望の配
列同一性を有するＤＮＡを、当該分野で公知の標準的な技術を用いて同定し得る
。
【０２４４】 （実施例４：ノザンブロット分析） ヒト組織におけるＧＦＲα３ ｍＲＮＡの発現を、ノザンブロット分析によっ
て試験した。複数のヒト組織ＲＮＡブロットを、ランダムプライミングによって
標識したヒトＧＦＲα３ ｃＤＮＡのコード領域全体を含む32Ｐ標識ＤＮＡプロ
ーブにハイブリダイズした。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）およびヒト成体ＲＮＡブロットＭＴＮ−１およびＭＴＮ−Ｉ
Ｉ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＤＮＡプローブとともにインキュベートする。ブロッ
トを、ハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ；１０×デンハルト溶液；０
．０５Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ６．５、５０μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子Ｄ
ＮＡ；５０％ホルムアミド；０．１％ピロリン酸ナトリウム）中、１×１０6ｃ ｐｍ／ｍｌのプローブとともに、４２℃で一晩インキュベートした。このブロッ
トを、２×ＳＳＣ中、室温で１０分間洗浄し、次いで、０．１％ ＳＤＳ中０．
２×ＳＳＣ中で、４２℃で３０分間洗浄した。このブロットを、ｘ線フィルムに
曝し、そして一晩曝した後、ホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇ
ｅｒ）分析（Ｆｕｊｉ）によって現像した。
【０２４５】 図７に示されるように、ＧＦＲα３ ｍＲＮＡ転写物が検出された。心臓、消
化管（膵臓、小腸、結腸）、胸腺、精巣および前立腺における高レベルでの発現
が観察された。
【０２４６】 （実施例５：ＧＦＲα３のインサイチュハイブリダイゼーションによる位置決
定） 以下の組織を、ＧＦＲα３ ｍＲＮＡ発現について、インサイチュハイブリダ
イゼーションによって調査した：１３日目のマウス胚、１５日目および１７日目
の胚のマウス脳、生後一日目のマウス脳、成体マウス脳（視神経とともに）、成
体マウス脊髄、成体マウス三叉神経節および三叉神経根、成体マウス網膜、なら
びに数段階の胚性卵形嚢。
【０２４７】 インサイチュハイブリダイゼーションについては、Ｅ１３．５マウス胚を４℃
で一晩、４％ パラホルムアミド中で浸漬固定し、１５％ スクロース中で一晩
凍結防止し、Ｏ．Ｔ．Ｃ．中に包埋し、そして液体窒素で凍結した。成体マウス
脊髄、三叉神経節、網膜、およびＰ１マウス脳を、Ｏ．Ｔ．Ｃ．中に包埋し、そ
して液体窒素で新鮮に凍結させた。成体マウス脳を、粉末化ドライアイスで新鮮
に凍結した。切片を１６μｍで切り出し、そしてＧＦＲα３についてのインサイ
チュハイブリダイゼーションのために、以前に記載された方法（Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：２９０（１９９０））により処理した。３３Ｐ
−ＵＴＰを使用して、標識ＲＮＡプローブを、マウスＧＦＲα３をコードする３
２６ｂｐフラグメントとともにＴ７ポリメラーゼを用いて、記載のように（Ｍｅ
ｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５（１９８４
））作製した。
【０２４８】 Ｅ１３マウスにおいて、ＧＦＲα３ ｍＲＮＡは、後根神経節において、交感
神経節において、および末梢神経において非常に強く発現した。前庭神経節はま
た、強いシグナルを示した。中程度の発現は、ひげパッド（ｗｈｉｓｋｅｒ ｐ
ａｄ）において、腋窩の領域において、および膀胱周辺にみられた。中程度の発
現はまた、胸椎脊髄の灰白質の中間外側領域、腹内側視床下部（ｖｅｎｔｒｏｍ
ｅｄｉａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ）、および背側菱脳における細胞クラス
タにおいてみられた。脳の大部分の他の領域は、実証可能なシグナルを欠いてい
た。多くの他の器官（肺、心臓、肝臓、消化管、および腎臓を含む）は、弱いか
または検出不能かのいずれかのシグナルを発現した。
【０２４９】 発生後期（Ｅ１５、Ｅ１７、Ｐ１、および成体）において、ＣＮＳ内のＧＦＲ
α３発現は、非常に制限された。脳および脊髄の大部分の領域は、センス鎖コン
トロールプローブとハイブリしたコントロール切片においてみられたバックグラ
ウンドレベルを超えるハイブリダイゼーションシグナルを示さなかった。このこ
との例外は、菱脳において見出された細胞クラスタであった。成体においては、
三叉神経節ニューロンの亜集団は非常に強く標識されたが、衛星細胞においても
神経根においても標識がみられなかった。視神経はまた、検出可能なシグナルを
示さなかった。
【０２５０】 成体マウスの心臓の切片において、心臓伝導系と関連する増加したシグナル焦
点領域を有する心房および心室の心筋に拡散性シグナルが存在した。
【０２５１】 ＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＧＦＲα３での標識の比較を、図８に示す。Ｇ
ＦＲα３の発現は、他のレセプターと比較して非常に制限され、そして局在して
いれる。
【０２５２】 センス配列ＧＣＧＣＧＣＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧ（ｇｆｒｐ１と命名さ
れた；配列番号２２）およびアンチセンス配列ＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧ
ＧＣＧ（ｇｆｒｐ２．ｒ．ｃ．と命名された；配列番号２３）を含むプライマー
を使用して、マウスＧＦＲα３に由来する６７１ｂｐのハイブリダイゼーション
プローブを生成した。センス配列ＣＣＴＧＡＡＣＣＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧ（
配列番号２４）およびアンチセンス配列ＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＣＴＡＣＣ（
配列番号２５）を含むプライマーを使用して、マウスＧＦＲα３に由来する３７
８ｂｐのハイブリダイゼーションプローブを生成した。
【０２５３】 試験したＥ１２〜Ｅ１６週におけるヒト胎児組織は、胎盤、臍帯、肝臓、腎臓
、副腎、甲状腺、肺、心臓、大きな血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、
脳、脊髄、体壁（ｂｏｄｙ ｗａｌｌ）、骨盤および下肢を含んでいた。試験し
た成体組織は、腎臓（正常および末期）、副腎、心筋、大動脈、肺、皮膚、眼（
網膜を含む）、膀胱、肝臓（正常、肝硬変、および急性不全）、腎臓癌腫、およ
び軟組織肉腫を含んでいた。試験した非ヒト霊長類組織は、チンパンジーの唾液
腺、胃、甲状腺、上皮小体、皮膚および胸腺を含んでいた。３７８塩基対のアン
チセンス鎖プローブに対するハイブリダイゼーションは、胎児および成体のヒト
ＤＲＧ、胎児の末梢神経（胎児の体壁および下肢において見られるように）、な
らびに腸間膜神経において検出された。胎児脊髄においても脳においても発現は
観察されなかった。試験された神経芽細胞腫において発現は観察されなかった。
【０２５４】 ６７１塩基対のアンチセンスプローブを使用して、ＧＦＲα３ ｍＲＮＡハイ
ブリダイゼーションは、初期および後期および成体ラットにおいて、Ｅ１４神経
節、三叉神経、皮膚および骨格筋の末梢神経；Ｅ１７皮膚、背側根節、末梢神経
、軟骨、骨格筋、および脳；Ｅ１９背側根節、末梢神経、脳、皮膚の角質層、歯
、骨格筋、軟骨、肝臓および腸において検出された。特異的なシグナルは、胎仔
ラット膵臓においても成体ラット膵臓においても検出されなかった。本節の実施
例例の全てにおいて、対応するセンスプローブは、予測され得るようにハイブリ
ダイズしなかった。
【０２５５】 （実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＦＲα３の発現） ＧＦＲα３（例えば、ヒトＧＦＲα３）をコードするＤＮＡ配列を、最初に、
選択したＰＣＲプライマーを使用して増幅した。このプライマーは、選択された
発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含むべきである。種々
の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例は、アンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ由来；Ｂｏｌｉｖ
ａｒら、Ｇｅｎｅ ２：９５（１９７７）を参照のこと）である。ベクターを、
制限酵素を用いて消化し、そして脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅した配列
を、ベクターに連結する。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒ
ｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６ＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配
列、およびエンテロキナーゼ切断部位を含む）、哺乳動物ＧＦＲα３コード領域
、λ転写終結因子、およびａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
【０２５６】 次いで、連結混合物を使用して、選択されたＥ．ｃｏｌｉ株をＳａｍｂｒｏｏ
ｋら（前出）に記載の方法を用いて形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレート
上で増殖する能力によって同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。
プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認
し得る。
【０２５７】 選択されたコロニーを、液体培養培地（例えば、抗生物質を補充したＬＢブロ
ス）中で一晩増殖させ得る。一晩培養物を引き続き用いて、大規模培養物へ接種
し得る。次いで、細胞を所望の光学密度まで増殖させ、その間に発現プロモータ
ーのスイッチを入れる（ｔｕｒｎ ｏｎ）。
【０２５８】 さらに数時間細胞を培養した後、細胞を遠心分離によって採取し得る。遠心分
離によって得た細胞ペレットを、当該分野で公知の種々の薬剤を用いて可溶化し
得、次いで、可溶化した哺乳動物ＧＦＲα３タンパク質を、このタンパク質の強
固な結合を可能にする条件下で金属キレートカラムを使用して精製し得る。
【０２５９】 （実施例７：哺乳動物細胞におけるＧＦＲα３の発現） 本実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現によって哺乳動物ＧＦＲα３の
グリコシル化形態の調製を例示する。
【０２６０】 ベクターｐＲＫ５（例えば、１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第３
０７，２４７号を参照のこと）を発現ベクターとして使用する。必要に応じて、
ＧＦＲα３ ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されたような連結方
法を用いて、選択された制限酵素でｐＲＫ５に連結して、ＧＦＲα３ ＤＮＡの
挿入を可能にする。得られたベクターをｐＲＫ５−ＧＦＲα３と呼ぶ。
【０２６１】 １つの実施態様において、選択された宿主細胞は、２９３細胞であり得る。ヒ
ト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）をウシ胎仔血清、ならびに必要に
応じて栄養成分および／または抗生物質を補充したＤＭＥＭのような培地中で組
織培養プレートでコンフルエントになるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５
−ＧＦＲα３ ＤＮＡをＶＡ ＲＮＡ遺伝子（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅ
ｌｌ ３１：５４３（１９８２））をコードする約１μｇのＤＮＡと混合し、そ
して５００μｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２
７Ｍ ＣａＣｌ2中に溶解する。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰ ＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ4を滴下 して添加し、そして沈澱物を２５℃で１０分間にわたって形成させる。沈澱物を
懸濁し、そして２９３細胞に添加し、そして３７℃で約４時間にわたって沈ませ
る。培養培地を吸引除去し、そして２ｍｌのＰＢＳ中の２０％ グリセロールを
３０秒間にわたって添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮
な培地を添加し、そして細胞を約５日間インキュベートする。
【０２６２】 トランスフェクションの約２４時間後、培養培地を取り除き、そして培養培地
（単独）または２００μＣｉ／ｍｌ 35Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍ
ｌ 35Ｓ−メチオニンを含む培養培地に置き換える。１２時間のインキュベーシ
ョン後、馴化培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、そして１５％ ＳＤＳ
ゲルにロードする。処理したゲルを乾燥し、そしてゲルを、選択された時間にわ
たりフィルムに曝して、哺乳動物ＧＦＲα３ポリペプチドの存在を明らかにし得
る。トランスフェクトした細胞を含む培養物は、さらなるインキュベーションを
（無血清培地において）受け得、そして培地を、選択したバイオアッセイにおい
て試験する。
【０２６３】 代替的な技術において、哺乳動物ＧＦＲα３をＳｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２：７５７５（１９８１）によって記載
された硫酸デキストラン法を使用して一過性に２９３細胞へ導入し得る。２９３
細胞をスピナーフラスコ中に最大密度まで増殖させ、そして７００μｇのｐＲＫ
５−ＧＦＲα３ ＤＮＡを添加する。細胞を、最初にスピナーフラスコから遠心
分離によって濃縮し、そしてＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈澱物を
、４時間にわたり細胞ペレット上でインキュベートする。細胞を、２０％ グリ
セロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、そして組織培養培地、５μ
ｇ／ｍｌウシインスリンおよび０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むス
ピナーフラスコへ再導入する。約４日後に、馴化培地を遠心分離し、そして濾過
して細胞および細片を取り除く。次いで、発現された哺乳動物ＧＦＲα３を含む
サンプルを濃縮して、そして任意の選択された方法（例えば、透析および／また
はカラムクロマトグラフィー）によって精製し得る。
【０２６４】 別の実施態様において、哺乳動物ＧＦＲα３を、ＣＨＯ細胞で発現させ得る。
ｐＳＵｉ−ＧＦＲα３を、公知の試薬（例えば、ＣａＰＯ4またはＤＥＡＥ−デ キストラン）を使用して、ＣＨＯ細胞へトランスフェクトし得る。上記のように
、細胞培養物をインキュベートし得、そして培養培地（単独）または放射性標識
（例えば、35Ｓ−メチオニン）を含む培地で培地を置き換え得る。哺乳動物ＧＦ
Ｒα３ポリペプチドの存在を決定した後に、培養培地を無血清培地で置き換え得
る。好ましくは、培養物を約６日間インキュベートし、次いで、馴化培地を回収
する。次いで、発現された哺乳動物ＧＦＲα３を含む培地を濃縮し、そして任意
の選択された方法によって精製し得る。
【０２６５】 エピトープタグ化哺乳動物ＧＦＲα３もまた、宿主ＣＨＯ細胞において発現さ
せ得る。哺乳動物ＧＦＲα３をｐＲＫ５ベクターからサブクローニングし得る。
サブクローン挿入物はＰＣＲを受けて、選択されたエピトープタグ（例えば、ポ
リｈｉｓタグ）を用いて発現ベクターへインフレームで融合され得る。次いで、
ポリｈｉｓタグ化した哺乳動物ＧＦＲα３挿入物を、安定なクローンについての
選択のための選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）を含むＳＶ４０駆動ベクターへ
サブクローニングし得る。最後に、ＣＨＯ細胞を、ＳＶ４０駆動ベクターで（上
記のように）トランスフェクトし得る。標識を上記のように行って、発現を確認
し得る。次いで、発現したポリＨｉｓタグ化哺乳動物ＧＦＲα３を含む培養培地
を、濃縮し、そして任意の選択された方法（例えば、Ｎｉ2+キレートアフィニテ
ィークロマトグラフィー）によって精製し得る。
【０２６６】 （実施例８：バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＧＦＲα３の発現） 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＧＦＲα３の組換え発
現を記載する。
【０２６７】 ＧＦＲα３をバキュロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープタグの上
流で融合した。このようなエピトープタグはポリｈｉｓタグおよびイムノグロブ
リンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域のような）を含む。ＧＦＲα３−ＩｇＧ融合物のア
ミノ酸配列を、配列番号１８に提供する。種々のプラスミド（ｐＶＬ１３９３（
Ｎｏｖａｇｅｎ）のような市販のプラスミド由来のプラスミドを含む）を利用し
得る。手短に述べると、細胞外ドメインをコードするＧＦＲα３配列を、５’領
域および３’領域に相補的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。この５’プ
ライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を取り込む。次いで、この産
物を、それらの選択された制限酵素で消化し、そして発現ベクターにサブクロー
ニングした。昆虫細胞におけるＧＦＲα３−ＩｇＧの発現のためのベクターは、
ｐｂ．ＰＨであった（ここで、バキュロウイルスにおける発現は、ポリヘドリン
プロモーターの制御下にあった）。
【０２６８】 組換えバキュロウイルスを、上記のプラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に、リポフェク
チン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販される）を用いて同時トランスフェクトする
ことによって生成した。２８℃でインキュベートして４〜５日後、遊離したウイ
ルスを採取し、そしてさらなる増幅のために使用した。ウイルス感染およびタン
パク質発現を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｏ
ｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）に
記載のように行った。ＩｇＧタグ化（またはＦｃタグ化）ＧＦＲα３の精製を、
公知のクロマトグラフィー技術（プロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマ
トグラフィーを含む）を用いて行った。
【０２６９】 あるいは、発現されたポリｈｉｓタグ化ＧＦＲα３を、例えば、Ｎｉ2+キレー
トアフィニティークロマトグラフィーによって以下のとおり精製し得る。抽出物
を、Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：１７５−１７９（１９９３）に記
載のように、組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から調製する。簡潔には、Ｓｆ９細
胞を洗浄し、超音波処理緩衝液（２５ｍｌのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５
ｍＭ ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％ グリセロール；０．１％ ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）中に懸濁し、そして氷上で２０秒間、２回超音
波処理する。超音波処理した物を遠心分離によって明澄化し、そして上清をロー
ディング緩衝液（５０ｍＭ リン酸、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロー
ル、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、そして０．４５Ｆｍのフィルターを通して
濾過する。Ｎｉ2+−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販される）を
、５ｍｌのベッド容積で調製し、２５ｍｌの水で洗浄し、そして２５ｍｌのロー
ディング緩衝液で平衡化する。濾過した細胞抽出物を、このカラムに１分あたり
０．５ｍｌでロードする。カラムを、ローディング緩衝液でＡ280が基線になる まで洗浄し、この時点で、フラクション収集を開始させる。次いで、カラムを、
非特異的結合タンパク質を溶出させる二次洗浄緩衝液（５０ｍＭ リン酸；３０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄する。再びＡ28 0 が基線に達した後、カラムを、二次洗浄緩衝液中０〜５００ｍＭ イミダゾー ルの勾配で展開する。１ｍＬの画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および銀染色
またはアルカリホスファターゼに結合体化したＮｉ2+−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）
を用いたウェスタンブロットによって分析する。溶出されたＨｉｓ10タグ化ＧＦ
Ｒα３を含む画分をプールし、そしてローディング緩衝液に対して透析する。
【０２７０】 （実施例９：ＧＦＲα３への結合） 任意の公知のＧＤＮＦファミリーのメンバー（リガンドＧＤＮＦ、ニューツリ
ン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）（ＮＴＮ）またはパーセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ
）（ＰＳＮ））がＧＦＲα３に結合し得るか否かを決定するために、各リガンド
をマイクロタイタープレート上にコーティングして、実施例８で調製したＧＦＲ
α１−ＩｇＧ、ＧＦＲα２−ＩｇＧ、またはＧＦＲα３−ＩｇＧ（配列番号１８
）のいずれかとともにインキュベートした。次いで、ＧＦＲα−ＩｇＧの結合を
、そのＩｇＧ部分に対する二次抗体を用いて検出した。ＧＤＮＦ、ＮＴＮ、およ
びＰＳＮを５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中、１μｇ／ｍｌでマイクロタ
イタープレートに４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、ＰＢＳ／
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで、ＰＢＳ／０．０５％ ＢＳＡ／
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で１〜２時間室温でブロッキングした。種々の濃度
のＩｇＧタグ化キメラレセプター（ＧＦＲα１−ＩｇＧ、ＧＦＲα２−ＩｇＧ、
ＧＦＲα３−ＩｇＧ；１μｇ／ｍｌ〜１．９５ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し
、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを上記
のように洗浄し、そしてヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（１：１０００）の
存在下で、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、結合したＨＲＰを、ＯＰ
Ｄ基質に５〜１０分間曝し、次いで、４９０ｎｍでプレートを読みとった。結果
を図９Ａ〜Ｃに示す。
【０２７１】 ＧＦＲα１はＧＤＮＦに結合し（図９Ａ）、ＧＦＲα２はＧＤＮＦおよびＮＴ
Ｎに結合する（図９Ｂ）が、ＧＦＲα３は、これらの分子のいずれにも結合しな
い（図９Ｃ）。従って、ＧＦＲα３は、オーファンレセプターである。
【０２７２】 （実施例１０：ＧＦＲα３アゴニストについてのアッセイ） ＧＤＮＦファミリーのリガンドは、独自のレセプターシステムを使用する：Ｇ
ＰＩ連結リガンド結合タンパク質（α成分）およびシグナル伝達成分、チロシン
キナーゼレセプターＲｅｔ。この多成分レセプター複合体の活性化の機構は、未
だ未知であるが、チロシンキナーゼレセプターは、リガンド誘導ダイマー化の際
に活性化されることが公知である。従って、ＧＦＲ活性化のあり得る機構は、α
成分ダイマー化を誘導する、α成分に対する結合リガンドによるものである。次
に、２つのα鎖は２つのＲｅｔ分子を複合体にし、この複合体は、キナーゼドメ
インの活性化およびレセプターおよび／または他のシグナル伝達分子上の標的チ
ロシン残基のリン酸化を導く。
【０２７３】 リガンドがα成分のダイマー化を確かに誘導することを実証するために、ラッ
トＧＦＲα２の細胞外ドメインならびにＴＰＯレセプター（ｃ−ｍｐｌ）または
Ｒｓｅチロシンキナーゼレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインから
構成されるキメラレセプターを構築した。これらの２つのレセプターは、異なる
レセプターのファミリーに属するが、ともに、リガンド誘導ダイマー化またはア
ゴニスト−抗体誘導ダイマー化によって活性化されることが公知である。
【０２７４】 （ＧＦＲα２−ｃ−ｍｐｌ） ｇＤエピトープタグ、次いで、ｒＧＦＲα２細
胞外ドメイン（ＧＰＩシグナルを除く）、次いで、ＴＰＯレセプターの膜貫通ド
メインおよび細胞内ドメインから構成されるキメラレセプターを、ＣＭＶプロモ
ーターの制御下で、ｐＲＫｔｋｎｅｏベクターへ組換えＰＣＲによってアセンブ
リした。Ｂａ／Ｆ３細胞を、ＮｏｔＩで線状化したｐＲＫｔｋｎｅｏ−ＧＦＲα
２−ｍｐｌとともにエレクトロポレーションし、そしてクローンを、限界希釈に
より得た。個々のクローンを、抗ｇＤ抗体を用いてＦＡＣＳ分析により、レセプ
ターの発現について分析した。陽性クローンを選択し、そしてＮＴＮ刺激（ＧＦ
Ｒα２についてのリガンド）に応答して増殖するそれらの能力についてさらに特
徴付けした。図１０に示されるように、ＧＦＲα２−ｍｐｌを発現するＢａ／Ｆ
３細胞は、3Ｈチミジン取り込みによって評価されるように、ＮＴＮ刺激に応答 して増殖し得る。
【０２７５】 （ＧＦＲα２−Ｒｓｅ） キメラレセプターを、ｇＤエピトープタグ、次いで
、ラットＧＦＲα２細胞外ドメイン（ＧＰＩシグナルを除く）、次いで、Ｒｓｅ
チロシンキナーゼレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、ならびに
別のｇＤエピトープタグを用いて構築し、そしてＳＶ４０プロモーターの制御下
でｐＳＶｉベクターへ組換えＰＣＲによってアセンブリした。このｇＤ−ＧＦＲ
α２−Ｒｓｅ−ｇＤ配列を、配列番号１９に示す。ＣＨＯ細胞をリポフェクタミ
ン法によりトランスフェクトした（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）。単一のトランスフェ
クトしたＣＨＯクローンを拾い、そして抗ｇＤ抗体を用いるＦＡＣＳ分析により
レセプターの発現について分析した。次いで、レセプター陽性クローンをＫＩＲ
Ａアッセイ（例えば、米国特許第５，７０９，８５８号）を使用して、ＮＴＮ刺
激の際のレセプター誘導リン酸化について分析した。図１１に示すように、ＮＴ
Ｎ刺激は、レセプターの自己リン酸化を引き起こした。
【０２７６】 （ＧＦＲα３−Ｒｓｅ） ともに、上記のデータはＧＦＲの活性化がリガン
ド誘導ダイマー化によって媒介され、そしてそれらのリガンドに加えて、種々の
レセプターが抗体媒介活性化に感受性であることを示す。従って、１つの実施態
様において、哺乳動物ＧＦＲα３についてのアゴニスト抗体および天然のリガン
ド（または他のアゴニスト）を同定するアッセイは、ＧＦＲα２−Ｒｓｅについ
ての上記の方法に従う。キメラＧＦＲα３レセプターを、ｇＤエピトープタグ、
次いで、マウスＧＦＲα３細胞外ドメイン（ＧＰＩシグナルを除く；好ましくは
、ヒトＧＦＲα３が使用される）、次いで、Ｒｓｅチロシンキナーゼレセプター
の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインならびに第２のｇＤタグを用いて、組換
えＰＣＲを使用して、ｐＳＶｉベクター中へＳＶ４０プロモーターの制御下で構
築した。ＣＨＯ細胞を、リポフェクタミン法によりトランスフェクトした（ＧＩ
ＢＣＯ−ＢＲＬ）。単一のトランスフェクトしたクローンを拾い、そして抗ｇＤ
抗体を用いるＦＡＣＳ分析によりＧＦＲα３キメラレセプターの発現について分
析した。次いで、陽性クローンを、ＧＤＮＦ、ＮＴＮまたはＰＳＮのいずれかで
の処理の際のレセプター誘導リン酸化について分析した。結果を図１２に示す。
この結果によって、ＧＦＲα３がＧＤＮＦファミリーの新規なリガンドについて
のレセプターであることが確認された。ｇＤ−ＧＦＲα３−Ｒｓｅ−ｇＤの配列
を、配列番号２０に示す。この構築物の配列および他のＧＦＲファミリーメンバ
ーに対するその相同性から明らかなように、十分なリガンド結合領域は、配列番
号２０のアミノ酸１１０〜アミノ酸３８６であり、これは、配列番号１５のアミ
ノ酸残基８４〜３６０に対応する。本発明のＧＦＲα３の天然のリガンドは、ア
ルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）として同定され（Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ ２
１：１２９１−１３０２（１９９８））、これは、本発明のＧＦＲα３およびそ
のｇＤ−ＧＦＲα３−Ｒｓｅ−ｇＤ融合物と結合することが見出された。ＧＦＲ
α３（または他の候補アゴニスト）に対して生成された抗体を、ＣＨＯ細胞にお
いて発現されたＧＦＲα３構築物を使用してアゴニスト活性についてスクリーニ
ングし得る。あるいは、アンタゴニストを、このアッセイにおいて、アゴニスト
機能を阻害するそれらの能力によってスクリーニングする。
【０２７７】 （実施例１１：ＧＦＲα３と結合する抗体の調製） 本実施例は、ＧＦＲα３と特異的に結合し得るモノクローナル抗体の調製を例
示する。モノクローナル抗体を調製する技術は当該分野で公知であり、そして例
えば、Ｇｏｄｉｎｇ（前出）に記載される。使用され得る免疫原は、精製ＧＦＲ
α３、ＧＦＲα３を含む融合タンパク質、および細胞表面上で組換えＧＦＲα３
を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、過度な実験をすることなく、当業者に
よってなされ得る。マウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ）を、フロイント完全アジュ
バント中に乳化され、そして１〜１００μｇの量で皮下または腹腔内に注射され
たＧＦＲα３免疫原で免疫する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバン
ト（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌ
ｔｏｎ，ＭＴ）中に乳化し、そして動物の後肢パッドに注射する。次いで、免疫
したマウスを１０〜１２日後に、選択されたアジュバント中で乳化した、さらな
る免疫原で追加免疫する。その後、数週間にわたって、マウスをまた、さらなる
免疫注射で追加免疫し得る。血清サンプルを、眼窩採血により、ＥＬＩＳＡアッ
セイにおいて試験するためにマウスから周期的に得て、ＧＦＲα３抗体を検出し
得る。
【０２７８】 適切な抗体力価が測定された後、抗体「陽性」である動物に、最後のＧＦＲα
３の静脈内注射により注射し得る。３〜４日後、マウスを屠殺し、そして脾臓細
胞を採取する。次いで、この脾臓細胞を、選択したマウス骨髄腫細胞株（例えば
、Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能）と（３
５％ポリエチレングリコールを用いて）融合する。この融合物は、非融合細胞、
骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、次
いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含有
する９６ウェル組織培養プレートにプレートされるハイブリドーマ細胞を生成す
る。
【０２７９】 ハイブリドーマ細胞を、ＧＦＲα３に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスク
リーニングする。ＧＦＲα３に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽
性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当該分野の技術範囲内である。陽性ハイブリ
ドーマ細胞を、同系Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、抗ＧＦＲα３モノク
ローナル抗体を含む腹水を生成し得る。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織
培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖させ得る。腹水中で生成されたモノ
クローナル抗体の精製を、硫酸アンモニウム沈澱、次いで、ゲル排除クロマトグ
ラフィーを用いて達成し得る。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧへの
抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを利用し得る。
【０２８０】 （実施例１２：ダイマー化スクリーニングアッセイ） 候補アゴニスト（例えば、ＧＦＲファミリー（例えば、ＧＦＲα３、ＧＦＲα
２、またはＧＦＲα１）のαサブユニットレセプターに対して生成された抗体）
を、ＣＨＯ細胞またはＫＩＲＡアッセイにおける他の適切な細胞中で発現された
αレセプター−Ｒｓｅ様構築物を用いてアゴニスト活性についてスクリーニング
し得る。ｇＤ−ＧＦＲα２−Ｒｓｅ構築物のｇＤ部分に対するモノクローナル抗
体を使用する例示的なＫＩＲＡプロトコルを示す。
【０２８１】 ｇＤ−ＧＦＲα２−Ｒｓｅ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞培養物を調製
し、そして以下のとおり培養した。１日目に、培養フラスコ由来のトランスフェ
クトＣＨＯ細胞は、好ましくは７０〜９０％コンフルエント（浮遊している（剥
がれた）細胞がほとんどない）である。培養プレートは、カバー付きのＦａｌｃ
ｏｎ（１２７０）平底９６ウェル滅菌組織培養プレートであった。剥離緩衝液は
、１：５０希釈 ５ｍＭ ＥＤＴＡ（２５０ｍＭ ストック）含有ＰＢＳであっ
た。細胞培養培地は、ＮａＨＣＯ３（５０：５０）＋１０％ ダイアフィルトレ
ーションしたＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有のＧ
ＨＴを含まないＨａｍ Ｆ−１２で、グリシンを含まない低グルコースＤＭＥＭ
であった。２日目に、刺激培地は、Ｅｘｃｅｌｌ−４０１昆虫細胞培地（ＪＲＨ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号１４４０１−７８頁）および０．５％
ＢＳＡであった。溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．５％ Ｔｒ
ｉｔｏｎ−Ｘ １００含有１５０ｍＭ ＮａＣｌであった。使用前に溶解緩衝液
に添加したプロテアーゼインヒビターは、１：１００希釈を使用する１００×Ａ
ＥＢＳＦ（１００ｍＭ）ストック、１：１０００希釈を使用する１０００×アプ
ロチニン（液体）ストック、および１：１０００希釈を使用する１０００×ロイ
ペプチン（５０ｍＭ）ストックであった。使用前に溶解緩衝液に添加したホスフ
ァターゼインヒビターは、１：５０希釈を使用する５０×オルトバナジン酸（ｏ
ｒｔｈｏｖａｎｉｄａｔｅ）ナトリウム（１００ｍＭ）ストックであった。
【０２８２】 ＥＬＩＳＡ形式は、以下の材料を使用した。固体支持体は、Ｎｕｎｃ Ｍａｘ
ｉｓｏｒｐイムノプレート４−３９４５４であった。コーティング緩衝液は、Ｐ
ＢＳ ｐＨ７．４であった。洗浄緩衝液は、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．４）であった。ブロッキング緩衝液は、０．５％ ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳであった。アッセイ緩衝液は、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
２０および５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）であった。基質は、Ｋｉ
ｒｋｅｇａｒｄ ａｎｄ ＰｅｒｒｙからのＴＭＢ基質キット（２ボトル：Ａ；
ＴＭＢ基質、Ｂ；ＴＭＢ過酸化物溶液）であった。停止溶液は、１．０Ｍ Ｈ3 ＰＯ4であった。抗原は、細胞培養ウェル由来の可溶化し、トランスフェクトし た「レセプター．ｇＤ」であった（細胞溶解物）。抗体は、（一次）３Ｃ８（抗
ｇＤペプチド）濃縮物１．０μｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌストック（ロット２
４５６４−７＃１７６６）の１：１３００希釈物、（二次）ビオチン化４Ｇ１０
（ＵＢＩ）濃縮物、４℃ストック（５０μｇ／ｍｌ）＃１００７９６からの１：
１０００であった。結合体は、ストレプトアビジン／ＨＲＰ Ｚｙｍｅｄ 濃縮
物１：５００００、ロット＃２６２４６−９１、（１：１００凍結ストック）で
あった。
【０２８３】 細胞を組織培養フラスコから細胞培養上清を吸引することによって採取し、滅
菌ＰＢＳで１回リンスし、そして１０ｍｌの細胞剥離緩衝液を添加した。細胞を
３７℃で約１０分間細胞が剥がれるまでインキュベートした。剥がれた細胞を遠
心管に移し、そして等容量の細胞培養培地を添加した。細胞計数を血球計算盤で
行った。細胞を遠心分離し、上清を吸引によって取り除き、そして細胞を１×１
０6細胞／ｍｌになるように懸濁した。１００μｌの細胞懸濁物を各ウェルに添 加した（最終、約１×１０5細胞／ウェル）。プレートを３７℃で一晩インキュ ベートした。
【０２８４】 レセプター活性化を以下のとおり、行った。代表的には、リガンドのストック
（本実施例においては２ｍｇ／ｍｌのｈＮＴＮＦＰ調製物）を使用して、各ウェ
ルでのＮＴＮの最終濃度を０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．
００６２５、０．００３１２、０．００１、および０．０μｇ／ｍｌとした。マ
イクロタイタープレート中の溶液を、外部の振盪によって穏やかに混合した。１
００μｌのサンプル、コントロール、またはＮＳＢを各ウェルに添加し、そして
３７℃で２５分間インキュベートした。プレートの穏やかな混合を行った。各ウ
ェルに１３０μｌのプロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビタ
ー含有溶解緩衝液を添加した。細胞溶解を組織培養プレート中で３０分間進行さ
せた。保存のために、細胞溶解物を−７０℃においた。
【０２８５】 ＥＬＩＳＡを、以下のようにおこなった。ＥＬＩＳＡプレートをコーティング
するために、１００μｌの一次ｍＡｂ（一次；３Ｃ８ １μｇ／ｍｌ）溶液を各
ウェルに添加し、そしてウェルに一晩４℃でコーティングさせた。捕捉（ＥＬＩ
ＳＡ）プレートにおいてアッセイを行うために、コーティング溶液を廃棄し、そ
して１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウェルに添加した。ブロッキングを１
時間継続させた。細胞溶解物を穏やかに攪拌しながら解凍する。ＥＬＩＳＡプレ
ートを、洗浄緩衝液で（Ｓｋａｔｒｏｎ Ｓｃａｎ Ｗａｓｈｅｒ ３００を用
いて）３回リンスした。各捕捉ＥＬＩＳＡプレートのウェルに、１００μｌの細
胞溶解物を、各移動ごとに新しいピペットチップを使用して移した。プレートを
室温で２時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。アッセイ緩衝液中に
ビオチン化４Ｇ１０（二次Ａｂ；二次抗体；４℃）１：１０００希釈物を調製し
た。各ウェルを洗浄緩衝液で１０回リンスした。各ウェルに１００μｌの二次Ａ
ｂを添加し、次いで、室温で２時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした
。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。アッセイ緩衝液中にストレプトアビジ
ン／ＨＲＰ １：５００００希釈物を調製した。各ウェルに１００μｌの希釈し
たＳｔｒＡｖ／ＨＲＰを添加し、次いで、室温で１時間、穏やかに攪拌しながら
インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。各ウェルに、１０
０μｌの基質溶液：１容量のＫ＆Ｐ ＴＭＢ基質および１容量のＫ＆Ｐ ＴＭＢ
過酸化物溶液を添加した。反応色を、１５分間発色させ、次いで、５０μｌの１
．０Ｍ Ｈ3ＰＯ4の添加によって発色をクエンチした。各ウェルについてのＯ．
Ｄ．（４５０ｎｍ）を読みとった。図１３は、３つの異なるアゴニスト抗体を使
用した活性化の結果を示す−−この場合においては、抗体をｇＤ ｆｌｒａｇエ
ピトープに対して惹起したが、αサブユニットオリゴマー化および引き続くチロ
シンキナーゼドメイン（Ｒｓｅ領域）活性化を誘導し得た。
【０２８６】 （材料の寄託） 以下の材料を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
ＭＤ，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【０２８７】
【表２】
【０２８８】 この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
およびその条約に基づく規則（ブタペスト条約）の規定の下でなされた。これは
、寄託の日から少なくとも３０年間にわたって寄託物の可能な培養物生存の維持
を保証する。寄託物は、ブタペスト条約の規約の下でＡＴＣＣによって分譲され
、そしてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の合意を条件として、
この寄託物は、適切な米国特許の発行の際に、任意の米国特許出願または外国特
許出願が公に公開される際に、どちらが先であろうと、公に寄託物の培養物の子
孫が永久的にかつ制限なく利用可能であることを保証し、そして米国特許商標庁
長官によって米国特許法１２２条および米国特許法１２２条に拠るこの長官の規
則（米国特許施行規則１．１４条（特に８８６ＯＧ６３８を参照して）を含む）
に従って、そこに権利を与えることが決定されたものへのこの子孫の利用可能性
、を保証する。
【０２８９】 適切な条件下で培養したときに寄託した材料の培養物が死滅するか、もしくは
失われるか、もしくは破壊された場合には、その通告に対して、この培養物が、
同一の別の培養物で迅速に補充されることを、本特許出願の譲受人は同意した。
寄託物の利用可能性は、いずれの政府機関当局の下でその特許法に従って譲渡さ
れた権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されるべきではない
。
【０２９０】 前述の記載された明細書は、当業者が本発明を実施することを可能とするに十
分であると見なされる。本発明は、寄託された構築物によって範囲を制限される
べきではない。なぜなら、寄託された実施態様は、本発明の特定の局面の一例示
として意図され、そして機能的に等価である任意の構築物が、本発明の範囲内に
あるからである。本明細書中の材料の寄託物は、本明細書中に含まれる記載され
た説明（その最良の実施形態を含む）が本発明の任意の局面の実施を可能とする
に不適切であるという認証を構成するのでもなく、それが示す特定の例示に請求
の範囲を制限することが解釈されるのでもない。事実、本明細書中に示され、そ
して記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明から当業者に
明らかであり、添付の請求の範囲の範囲内に入る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜Ｂは、マウスＧＦＲα３のネイティブ配列のヌクレオチド配列および
推定アミノ酸配列を示す。
【図２】 図２は、マウスＧＦＲα３（配列番号５）、ラットＧＦＲα１（配列番号８）
、およびラットＧＦＲα２（配列番号９）のアミノ酸配列のアラインメントを示
す。Ｎ末端シグナルペプチドを示す。ＧＰＩアンカーと関連するＣ末端疎水性配
列の上方に線を付す。アステリスクは、ＧＰＩアンカー付着のためのアミノ酸を
示す。可能性のあるグリコシル化部位を、影付き四角で示す。保存された同一の
残基を四角で囲む。
【図３】 図３は、マウスＧＦＲα３アミノ酸配列とヒトＧＦＲα３アミノ酸配列との間
のアラインメント比較を示す。保存された残基を四角で囲む。
【図４】 図４は、ヒトＧＦＲα３（ＤＮＡ４８６１３より）とそのスプライス改変体（
ＤＮＡ４８６１４より）との間のアラインメント比較を示す。保存された配列を
四角で囲む。３０アミノ酸欠失配列を示す。
【図５】 図５Ａ〜Ｂは、ヒトＧＦＲα３をコードするＤＮＡ配列（配列番号１４）と、
それぞれ、ヒトＧＦＲα１（配列番号６）をコードするＤＮＡ（配列番号２１）
およびヒトＧＦＲα２（配列番号７）をコードするＤＮＡ（配列番号２２）との
核酸配列アラインメントを示す。
【図６】 図６は、ヒトＧＦＲα３（配列番号１５）、ヒトＧＦＲα１（配列番号６）、
およびヒトＧＦＲα２（配列番号７）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図７】 図７は、プローブとしてＧＦＲα３を使用する複数の組織のノーザンブロット
を示す。
【図８】 図８は、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＧＦＲα３に特異的なＤＮＡプローブ
を使用するインサイチュハイブリダイゼーションによって決定されたＲＮＡ発現
局在化を比較する。
【図９Ａ】 図９Ａ〜Ｃは、ＩｇＧタグ化レセプターＧＦＲα１（図９Ａ）、ＧＦＲα２（
図９Ｂ）、またはＧＦＲα３（図９Ｃ）への、リガンド結合（ラットＧＤＮＦ、
ヒトニューツリン（ＮＴＮ）、またはヒトペルセフィン（ＰＳＮ））の結果を示
す。
【図９Ｂ】 図９Ａ〜Ｃは、ＩｇＧタグ化レセプターＧＦＲα１（図９Ａ）、ＧＦＲα２（
図９Ｂ）、またはＧＦＲα３（図９Ｃ）への、リガンド結合（ラットＧＤＮＦ、
ヒトニューツリン（ＮＴＮ）、またはヒトペルセフィン（ＰＳＮ））の結果を示
す。
【図９Ｃ】 図９Ａ〜Ｃは、ＩｇＧタグ化レセプターＧＦＲα１（図９Ａ）、ＧＦＲα２（
図９Ｂ）、またはＧＦＲα３（図９Ｃ）への、リガンド結合（ラットＧＤＮＦ、
ヒトニューツリン（ＮＴＮ）、またはヒトペルセフィン（ＰＳＮ））の結果を示
す。
【図１０】 図１０は、ＮＴＮまたはＧＤＮＦに応答した組換えキメラＧＦＲα２−ｍｐｌ
を発現する細胞の増幅を示す。
【図１１】 図１１は、ＮＴＮに応答した、組換えによって発現されたレセプターＧＦＲα
２−Ｒｓｅの自己リン酸化を示す。
【図１２】 図１２は、ＧＤＮＦ、ＮＴＮ、またはＰＳＮによる、レセプターＧＦＲα２ま
たはＧＦＲα３の刺激についてのアッセイを示す。
【図１３】 図１３は、ｇＤ−ＧＦＲα２−ＲｓｅＫＩＲＡアッセイにおける種々の抗ｇＤ
抗体のアゴニスト活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 17/02 ４Ｃ０８５ 17/02 25/02 ４Ｈ０４５ 25/02 25/06 25/06 27/02 27/02 Ｃ０７Ｋ 14/71 Ｃ０７Ｋ 14/71 16/28 16/28 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/42 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/68 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 クライン， ロバート ディー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301， パロ アルト， ウェブスター ストリ ート 1044 (72)発明者 フィリップス， ハイジ エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94070， サン カルロス， パイン アベニュー 15 (72)発明者 ローゼンザル， アーノン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， バーリンゲイム， チューリップ コー ト 40 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA13 BB20 BB22 CA26 CB01 CB21 CB26 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA80 FB02 FB03 FB04 FB05 FB06 FB08 JA20 4B024 AA01 AA11 BA43 BA63 CA01 CA07 DA02 DA06 DA12 HA15 4B063 QA08 QA18 QQ02 QQ79 QQ96 QR48 QS33 QX01 4B065 AA26X AA72X AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA06 AA07 AA17 BA22 CA53 NA14 4C085 AA14 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA74

Claims (62)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１７のアミノ酸２７〜３６９の配列を含むＧ
    ＦＲα３（グリア細胞株由来神経栄養因子ファミリーレセプターα−３）ポリペ
    プチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補体、に対し
    て少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸を含む、単離された核酸。
  2. 【請求項２】 （ａ）配列番号１７のアミノ酸１〜３７９の配列を含むＧＦ
    Ｒα３ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の相
    補体、に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸を含む、請求項１に
    記載の単離された核酸。
  3. 【請求項３】 前記核酸が、（ａ）配列番号１７のアミノ酸２７〜３６９の
    配列を含むＧＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）
    の核酸分子の相補体、に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項
    １に記載の核酸。
  4. 【請求項４】 配列番号１７のアミノ酸残基２７〜３６９を有するＧＦＲα
    ３ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  5. 【請求項５】 配列番号１７のアミノ酸残基１〜３６９を有するＧＦＲα３
    ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  6. 【請求項６】 （ａ）ＡＴＣＣ受託番号２０９７５１（名称ＤＮＡ ４８６
    １４−１２６８）中のｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコ
    ードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体、に対して少なく
    とも６５％の配列同一性を有する核酸を含む、単離された核酸。
  7. 【請求項７】 ＡＴＣＣ受託番号２０９７５１（名称ＤＮＡ ４８６１４−
    １２６８）中のｃＤＮＡのＧＦＲα３コード配列、またはその配列に対してスト
    リンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、請求項６に記載の単離
    された核酸。
  8. 【請求項８】 （ａ）配列番号１７のアミノ酸８４〜３２９の配列を含むＧ
    ＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の
    相補体、に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸を含む、単離され
    た核酸。
  9. 【請求項９】 （ａ）配列番号１７のアミノ酸８４〜３２９の配列を含むＧ
    ＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の
    相補体、にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＧＦＲα３コード配
    列を含む、請求項８に記載の単離された核酸。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載の核酸を含む、ベクター。
  11. 【請求項１１】 前記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識され
    る制御配列に作動可能に連結された、請求項１０に記載のベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 前記細胞が、ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、または酵母細胞
    である、請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 ＧＦＲα３の発現に適切な条件下で請求項１２に記載の宿
    主細胞を培養する工程、および該細胞培養物からＧＦＲα３を回収する工程、を
    包含する、ＧＦＲα３ポリペプチドを産生するための方法。
  15. 【請求項１５】 配列番号１７のアミノ酸残基８４〜３２９と少なくとも６
    ５％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 単離されたネイティブ配列ＧＦＲα３ポリペプチドである
    、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 配列番号１７のアミノ酸残基２７〜３６９を含む、請求項
    １６に記載のポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 異種アミノ酸配列に融合された請求項１５に記載のＧＦＲ
    α３ポリペプチドを含む、キメラ分子。
  19. 【請求項１９】 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求
    項１８に記載のキメラ分子。
  20. 【請求項２０】 前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である
    、請求項１８に記載のキメラ分子。
  21. 【請求項２１】 請求項１５に記載のＧＦＲα３ポリペプチドに特異的に結
    合する、抗体。
  22. 【請求項２２】 アゴニスト抗体である、請求項２１に記載の抗体。
  23. 【請求項２３】 末梢のニューロン障害を処置するための、請求項２１に記
    載の抗体の使用。
  24. 【請求項２４】 α−サブユニットレセプターのアゴニスト結合ドメインを
    含むポリペプチドに対するアゴニスト結合を測定するための方法であって、細胞
    膜に位置する該ポリペプチドを候補アゴニストに曝露する工程、および該ポリペ
    プチドのホモ二量体化またはホモオリゴマー化を測定する工程、を包含する、方
    法。
  25. 【請求項２５】 前記α−サブユニットレセプターがＧＦＲα−レセプター
    である、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ポリペプチドがさらに、二量体化活性化酵素ドメイン
    またはオリゴマー化活性化酵素ドメインを含み、そしてホモ二量体化またはホモ
    オリゴマー化が該ポリペプチドの酵素活性を測定することによって検出される、
    請求項２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記酵素ドメインが、レセプターチロシンキナーゼの細胞
    内自己触媒ドメインであり、そしてホモ二量体化またはホモオリゴマー化が、該
    ポリペプチドの自己リン酸化を測定することによって検出される、請求項２６に
    記載の方法。
  28. 【請求項２８】 α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、チ
    ロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン、およびフラッグエピトープを
    含むポリペプチドレセプター構築物の自己リン酸化を測定する方法であって、以
    下の工程： （ａ）真核生物細胞が第１の固相に付着するように、該細胞の均一の集団で該
    第１の固相をコートする工程であって、ここで該細胞はその膜内に位置する該ポ
    リペプチドレセプター構築物を有する、工程； （ｂ）該付着している細胞を分析物に曝露する工程； （ｃ）該付着している細胞を溶解させ、それによって該細胞から細胞溶解物を
    遊離させる工程； （ｄ）該フラッグエピトープに特異的に結合する捕捉薬剤が、第２の固相に付
    着するように、該捕捉薬剤で該第２の固相をコートする工程； （ｅ）該レセプター構築物が該第２の固相に付着するように、該付着している
    捕捉薬剤を工程（ｃ）において得られる該細胞溶解物に曝露する工程； （ｆ）該第２の固相を洗浄し、結合していない細胞溶解物を除去する工程； （ｇ）該付着しているレセプター構築物を、該チロシンキナーゼレセプター中
    のリン酸化チロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に曝露する工程；およ
    び （ｈ）該付着しているレセプター構築物への該抗ホスホチロシン抗体の結合を
    測定する工程、 を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 前記細胞が、工程（ａ）の前に前記レセプター構築物をコ
    ードする核酸で形質転換される、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記細胞が哺乳動物細胞株を含む、請求項２８に記載の方
    法。
  31. 【請求項３１】 前記細胞が付着性である、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記捕捉薬剤が捕捉抗体を含む、請求項２８に記載の方法
    。
  33. 【請求項３３】 前記第１の固相が、第１のアッセイプレートのウェルを含
    む、請求項２８に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記抗ホスホチロシン抗体が標識される、請求項２８に記
    載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記標識が、発色試薬に曝露される酵素を含み、該発色試
    薬の色の変化が工程（ｈ）において測定される、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記フラッグポリペプチドが、前記α−サブユニットレセ
    プターリガンド結合ドメインのアミノ末端に融合される、請求項２８に記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】 前記フラッグポリペプチドが、前記チロシンキナーゼレセ
    プター細胞内触媒ドメインのカルボキシル末端に融合される、請求項２８に記載
    の方法。
  38. 【請求項３８】 前記チロシンキナーゼレセプターが、Ｒｓｅレセプター、
    ｔｒｋ Ａレセプター、ｔｒｋ Ｂレセプターまたはｔｒｋ Ｃレセプターであ
    る、請求項２８に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記α−サブユニットレセプターがＧＦＲα−レセプター
    である、請求項２８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記レセプター構築物がさらに前記Ｒｓｅレセプターの膜
    貫通ドメインを含み、そして前記フラッグエピトープが前記ｇＤポリペプチドを
    含む、請求項３８に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記分析物がα−サブユニットレセプターについてのアゴ
    ニストを含む、請求項２８に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記分析物がα−サブユニットレセプターについてのアン
    タゴニストを含む、請求項２８に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記アンタゴニストが、前記α−サブユニットレセプター
    に対するアゴニストによる該α−サブユニットレセプターの結合または活性化を
    競合的に阻害し、そして工程（ｂ）の後に、前記付着している細胞が該アゴニス
    トに曝露される工程が続く、請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記分析物が、前記α−サブユニットレセプターについて
    のアンタゴニストおよびアゴニストを含む組成物であり、そして前記アッセイが
    、該アゴニストに結合しそれによって該アゴニストによる前記ポリペプチド構築
    物の活性化を低減する該アンタゴニストの能力を測定する、請求項２８に記載の
    方法。
  45. 【請求項４５】 α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、チ
    ロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン、およびフラッグエピトープを
    含むポリペプチドレセプター構築物の自己リン酸化を測定するための方法であっ
    て、以下の工程： （ａ）付着性細胞が第１のアッセイプレートのウェルに付着するように、該細
    胞の均一の集団で該ウェルをコートする工程であって、ここで該細胞は、その細
    胞膜内に位置する該ポリペプチドレセプター構築物を有する、工程； （ｂ）該付着している細胞を分析物に曝露する工程； （ｃ）該付着している細胞を溶解させ、それによって該細胞から細胞溶解物を
    遊離させる工程； （ｄ）該ポリペプチドレセプター構築物に特異的に結合する捕捉薬剤が、第２
    のアッセイプレートのウェルに付着するように、該捕捉薬剤で該ウェルをコート
    する工程； （ｅ）該ポリペプチド構築物が該ウェルに付着するように、該付着している捕
    捉薬剤を工程（ｃ）において得られる該細胞溶解物に曝露する工程； （ｆ）該ウェルを洗浄し、結合していない細胞溶解物を除去する工程； （ｇ）該付着しているポリペプチドレセプター構築物を、該ポリペプチドレセ
    プター構築物中のリン酸化チロシン残基に選択的に結合する抗ホスホチロシン抗
    体に曝露する工程；および （ｈ）該付着しているポリペプチドレセプター構築物への該抗ホスホチロシン
    抗体の結合を測定する工程、 を包含する、方法。
  46. 【請求項４６】 前記α−サブユニットレセプターが、ＧＦＲ−αレセプタ
    ーである、請求項４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、フ
    ラッグポリペプチド、およびチロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン
    を含む、ポリペプチド。
  48. 【請求項４８】 前記フラッグポリペプチドがｇＤフラッグエピトープを含
    む、請求項４７に記載のポリペプチド。
  49. 【請求項４９】 前記チロシンキナーゼレセプターがＲｓｃレセプターであ
    る、請求項４７に記載のポリペプチド。
  50. 【請求項５０】 前記Ｒｓｅレセプターの膜貫通ドメインをさらに含む、請
    求項４９に記載のポリペプチド。
  51. 【請求項５１】 前記α−サブユニットレセプターがＧＦＲαレセプターで
    ある、請求項４７に記載のポリペプチド。
  52. 【請求項５２】 フラッグポリペプチドに特異的に結合する捕捉薬剤でコー
    トされた固相、ならびにα−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、
    フラッグポリペプチド、およびチロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイ
    ンを含むポリペプチドを含む、キット。
  53. 【請求項５３】 前記固相がマイクロタイタープレートのウェルを含む、請
    求項５２に記載のキット。
  54. 【請求項５４】 標識された抗ホスホチロシン抗体をさらに含む、請求項５
    ２に記載のキット。
  55. 【請求項５５】 前記標識が酵素を含む、請求項５４に記載のキット。
  56. 【請求項５６】 α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、フ
    ラッグポリペプチド、およびチロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン
    、を含むポリペプチドをコードする核酸で形質転換された細胞をさらに含む、請
    求項５２に記載のキット。
  57. 【請求項５７】 α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、キ
    ナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン、およびフラッグエピトープを含むポリ
    ペプチドレセプター構築物のリン酸化を測定するためのアッセイであって、以下
    の工程： （ａ）真核生物細胞が第１の固相に付着するように、該細胞の均一の集団で該
    第１の固相をコートする工程であって、ここで該細胞は該ポリペプチドレセプタ
    ー構築物を含む、工程； （ｂ）該付着している細胞を分析物に曝露する工程； （ｃ）該付着している細胞を溶解させ、それによって該細胞から細胞溶解物を
    遊離させる工程； （ｄ）該フラッグポリペプチドに特異的に結合する捕捉薬剤が、第２の固相に
    付着するように、該捕捉薬剤で該第２の固相をコートする工程； （ｅ）該レセプター構築物が該第２の固相に付着するように、該付着している
    捕捉薬剤を工程（ｃ）において得られる該細胞溶解物に曝露する工程； （ｆ）該第２の固相を洗浄し、結合していない細胞溶解物を除去する工程； （ｇ）該付着しているキナーゼ構築物を、該レセプター構築物中のリン酸化さ
    れた残基を同定する抗体に曝露する工程；および （ｈ）該付着しているレセプター構築物への該抗体の結合を測定する工程、 を包含する、アッセイ。
  58. 【請求項５８】 前記α−レセプターがＧＦＲα−レセプターである、請求
    項５７に記載のアッセイ。
  59. 【請求項５９】 前記キナーゼレセプターがセリン−トレオニンキナーゼレ
    セプターである、請求項５７に記載のアッセイ。
  60. 【請求項６０】 ホスファターゼ活性を測定する、請求項５７に記載のアッ
    セイ。
  61. 【請求項６１】 前記真核生物細胞がさらにホスファターゼを含み、そして
    工程（ｃ）の前に、該細胞をホスファターゼインヒビターに曝露する工程をさら
    に包含する、請求項６０に記載のアッセイ。
  62. 【請求項６２】 工程（ｆ）と（ｇ）との間に、前記付着しているキナーゼ
    構築物をホスファターゼに曝露する工程、次いで前記第２の固相を洗浄し、結合
    していないホスファターゼを除去する工程をさらに包含する、請求項６０に記載
    のアッセイ。
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