JP2002515729A

JP2002515729A - 新規ｇ−ｃｓｆ受容体アゴニスト

Info

Publication number: JP2002515729A
Application number: JP51445997A
Authority: JP
Inventors: ザーフルー，リンダ，エル．; クライン，バーバラ，ケイ．; マックファーター，チャールズ，エイ．; フェン，イイクイン; マッキャン，ジョン，ピー．; ブラフォード−ゴールドバーグ，サラ，ルース
Original assignee: ジー．ディー．サールアンドカンパニー
Priority date: 1995-10-05
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 2002-05-28

Abstract

(57)【要約】Ｇ−ＣＳＦリガンド受容体アゴニストタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ造血性受容体アゴニストタンパク質をコードするＤＮＡ、Ｇ−ＣＳＦ造血性受容体アゴニストタンパク質の製造方法、およびＧ−ＣＳＦ造血性受容体アゴニストタンパク質の使用方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】新規Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニスト本出願は、３５ＵＳＣ６１１９（ｅ）に従って、１９９５年１０月５日出願の米国仮出願第６０／００４，３８２号の優先権を主張する。発明の分野本発明は、造血細胞の分化と拡張に対する活性を有するヒトＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストに関する。発明の背景ヒトの血液形成（造血）系は、多様な白血球（好中球、マクロファージ、および好塩基球／肥満細胞を含む）、赤血球、および凝固生成性細胞（巨核球／血小板）を置き換える。平均的男性の造血系は、１年に４．５×１０¹¹個のオーダーの顆粒球と赤血球を産生すると推定されており、これは１年に全体重分が置き換わることに等しい（デキスター（Dexter）ら、BioEssays，2:154-158，1985）。少量のいくつかの造血増殖因子が、少数の始原細胞「幹細胞」の多様な血液細胞系への分化、これらの細胞系の膨大な増殖、およびこれらの細胞系からの成熟血球の最終的分化、を担っていると考えられている。造血増殖因子は極めて少量しか存在しないため、これらの因子の検出と同定は、人工的条件下で培養した細胞に及ぼす刺激作用に基づいて、異なる因子を区別できるのみである、一連の測定法に依存してきた。米国特許第４，９９９，２９１号は、ＤＮＡとＧ−ＣＳＦの作成方法を開示している（参考のためこの全体が本明細書に組み込まれる）。米国特許第４，８１０，６４３号は、ＤＮＡとＧ−ＣＳＦの作成方法、およびＧ−ＣＳＦのＣｙｓからＳｅｒへの置換変種を開示している。クガ（Kuga）ら（Bioochem．+Biophys．Res．Comm．159:103-111，1988）は、一連のＧ−ＣＳＦ変種を作成して、構造−機能相関を部分的に規定した。クガ（ Kuga）らは、内部かつＣ−末端の欠失により活性がなくなり、一方１１アミノ酸までのＮ−末端の欠失と１、２、および３位のアミノ酸置換では活性があることを見いだした。ワタナベ（Watanabe）ら（Anal．Biochem．195:38-44，1991）は、変種を作成して、タンパク質の放射ヨード化のためにアミノ酸１と３をＴｙｒに変化させたＧ−ＣＳＦ受容体の結合を研究した。ワタナベ（Watanabe）らは、このＴｙｒ¹ 、Ｔｙｒ³Ｇ−ＣＳＦ変種が活性があることを見つけた。ＷＯ９５／２７７３２号は、分子が生物活性を有し、６８／６９位に切断点を有する環状に置換されているＧ−ＣＳＦリガンドは、Ｇ−ＣＳＦの元々の６９位に新しいＮ−末端を有し、Ｇ−ＣＳＦの元々の６８位に新しいＣ−末端を有する環状に置換されているＧ−ＣＳＦを形成することを記載しているが、証明はしていない。ＷＯ９５／２７７３２号はまた、環状に置換されているＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−４を開示している。タンパク質配列の並べ替え進化において、ＤＮＡ配列の並べ替えはタンパク質構造と機能の多様性を生み出す重要な役割を果たしている。特に基礎的な突然変異速度は遅いため（ドリトル（Doolittle）、Protein Science 1:191-200，1992）、遺伝子の複製とエキソンの組み替えは、急速に多様性を与え、従って競合的優位性を有する生物を提供する。組換えＤＮＡ法の開発により、タンパク質の折り畳み、構造および機能に及ぼす配列位置の移動の影響を研究することが可能になった。新しい配列を作成するのに使用されるアプローチは、そのアミノ酸配列の線状の再構成により、関連するタンパク質の天然に存在する対の再構成に類似している（カニンガム（Cunnin gham）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．76:3218-3222，1979；ティーサーとアーフル（Teather & Erfle）、J．Bacteriol．172:3837-3841，1990;シミング（Schimming）ら、Eur．J．Biochem．204:13-19，1992；ヤミウチとミナミカワ（Yamiuchi and Minamikawa）、FEBS Lett．260:127-130，1991、マグレゴー（M acGregor）ら、FEBS Lett．378:263-266，1996）。このタイプの並べ替えのタンパク質へのインビトロの最初の応用は、ゴールデンバーグとクレイトン（Golden berg and Creighton）により記載された（J．Mol．Biol．165:407-413，1983）。元々の配列の内部の部位（切断点）で新しいＮ−末端が選択され、この新しい配列は、切断点から元々のＣ−末端またはその近くのアミノ酸に達するまで、元々のアミノ酸と同じ順序を有する。この点で、直接または配列の追加部分（リンカー）を介して、新しい配列は、元々のＮ−末端またはその近くのアミノ酸に結合され、この新しい配列は、元々の配列の切断点部位のＮ−末端であったアミノ酸またはその近くの点に達するまで元々の配列と同じ配列で続き、この残基は鎖の新しいＣ−末端を生成する。このアプローチは、５８〜４６２アミノ酸の範囲のサイズのタンパク質に応用されている（ゴールデンバーグとクレイトン（Goldenberg and Creighton)、J． Mol．Biol．165:407-413，1983；リーとコフィノ（Li & Coffino）、Mol．Cell ．Biol．13:2377-2383，1993）。調べたタンパク質は、広範囲の構造クラスであり、α−らせん（インターロイキン−４；クレイトマン（Kreitman）ら、Cytoki ne 7:311-318，1995）、β−シート（インターロイキン−１；ホーリック（Horl ick）ら、Protein Eng．5:427-431，1992）、またはこの２つの混合物（酵母ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ；ルガー（Luger）ら、Science 243:2 06-210，1989）を主に含有するものがある。これらの配列の再構成研究で、広範囲のタンパク質の機能が見いだされている。酵素Ｔ４リゾチームザング（Zhang）ら、Biochemistry 32:12311-12318（1993）ザング（Zhang）ら、Nature Struct．Biol．1:434-438（1995）ジヒドロ葉酸レダクターゼブフワルダー（Buchwalder）ら、Biochemistry 31:1621-1630（1994）プロタソバ（Protasova）ら、Prot．Eng．7:1373-1377（1995）リボヌクレアーゼＴ１ムリンズ（Mullins）ら、J．Am．Chem．Soc．116:5529-5533（1994）ガレット（Garrett）ら、Protein Science 5:204-211（1996）バシルスβ−グルカンセハーン（Hahn）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:10417-10421（1994）アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼヤングとシャクマン（Yang & Schachman）、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A． 90:11980-11984（1993）ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼルガー（Luger）ら、Science 243:206-210,（1989）ルガー（Luger）ら、Prot．Eng．3:249-258（1990）ペプシン／ペプシノーゲンリン（Lin）ら、Protein Science 4:159-166（1995）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼビグネス（Vignais）ら、Protein Science 4:994-1000（1995）オルニチンデカルボキシラーゼリーとコフィノ（Li & Coffino）、Mol．Cell．Biol．13:2377-2383（1993）酵母ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼリトコーボンソビシ（Ritco-Vonsovici）ら、Biochemistry 34:16543-16551（ 1995）酵素インヒビター塩基性膵トリプシンインヒビターゴールデンバーグとクレイトン（Goldenberg and Creighton）、J．Mol．Biol ．165:407-413（1983）サイトカインインターロイキン−１β ホーリック（Horlick）ら、Protein Eng．5:427-431（1992）インターロイキン−４クレイトマン（Kreitman）ら、Cytokine 7:311-318（1995）チロシンキナーゼ認識ドメイン α−スペクトリンＳＨ３ドメインヴィグエラ（Viguera）ら、J．Mol．Biol．247:670-681（1995）トランスメンブランタンパク質ｏｍｐＡケーブニックとクレーマー（Koebnik & Kramer）、J．Mol．Biol．250:617-62 6（1995）キメラタンパク質インターロイキン−４−シュードモナス（Pseudomonas）外毒素融合分子クレイトマン（Kreitman）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:6889-6893 （1994）これらの研究の結果は、大きく異なっている。多くの場合は、実質的に低い活性、溶解度または熱力学的安定性が観察された（大腸菌（E．coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ｏｍｐＡ、酵母ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）。他の場合には、配列が並べ替えられたタンパク質は、天然のものとほとんど同じ多くの性質を有するようであった（塩基性膵トリプシンインヒビター、Ｔ４リゾチーム、リボヌクレアーゼＴ１、バシルスβ−グルカナーゼ、インターロイキン−１β、α−スペクトリンＳＨ３ドメイン、ペプシノーゲン、インターロイキン−４）。例外的な場合には、天然の配列のある性質が予想外に改良されているものが観察された。例えば、並べ替えられたα−スペクトリンＳＨ３ドメイン配列の溶解度および再折り畳み速度、および並べ替えたインターロイキン−４−シュードモナス（Pseudomonas）外毒素融合分子の受容体親和性と抗癌活性（クレイトマン（Kreitman）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:688 9-6893(1994)；クレイトマン（Kreitman）ら、Cancer Res．55:3357-3363，1995 ）。これらのタイプの研究の主要な動機は、タンパク質の折り畳みおよび安定性の狭い範囲や広い範囲の相互作用の役割を研究することであった。このタイプの並べ替えは、元々の配列中の広い範囲の相互作用のサブセットを新しい配列の狭い範囲の相互作用に変換、およびその逆の変換をする。これらの配列の並べ替えの多くが、少なくともある活性を有するコンフォメーションを達成することができるという事実は、タンパク質の折り畳みが複数の折り畳み経路で起きることの説得力のある証拠である（ビグエラ（Viguera）ら、J．Mol．Biol．247:670-681， 1995）。α−スペクトリンのＳＨ３ドメインの場合は、β−ヘアピンの曲がり角に対応する位置で新しい末端を選択することにより、安定性が少し低いがそれでも折り畳みができるタンパク質が得られた。ここで引用した研究で使用される内部切断点の位置は、タンパク質の表面のみに見いだされ、末端または中間部に向かって明らかに偏ることなく線状の配列内に分布している（元々のＮ−末端から切断点への相対的距離の変動は、配列の全長の約１０〜８０％である）。これらの研究で元々のＮ−末端とＣ−末端をつなぐリンカーは、０〜９残基の範囲である。ある場合には（ヤングとシャクマン（ Yang & Schachman）、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．90:11980-11984，1993）、配列の一部が元々のＣ−末端セグメントから欠失し、端を切り取ったＣ−末端から元々のＮ−末端に接続されている。ＧｌｙやＳｅｒのような柔軟性のある親水性残基が、しばしばリンカーに使用される。ビグエラ（Viguera）ら（J．Mol ．Biol．247:670-681，1995）は、元々のＮ−末端とＣ−末端の３−残基リンカーまたは４−残基リンカーへの結合を比較した。３−残基リンカーは熱力学的に少し不安定であった。プロタソバ（Protasova）ら（Protein Eng．7:1373-1377 ，1994）は、大腸菌（E．coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼの元々のＮ−末端をつなぐのに３−または５−リンカーを使用した。３−リンカーのみが高収率でタンパク質を産生した。発明の要約本発明の修飾されたヒトＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストは、以下の式で表される：Ｘ¹−（Ｌ）ａ−Ｘ² （式中、ａは０または１であり、Ｘ¹は、残基ｎ＋１からＪまでの配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ²は、残基１からｎまでの配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドであり、ｎは、１からＪ−１までの範囲の整数であり、そしてＬはリンカーである）。上記式において、ヒトＧ−ＣＳＦの構成アミノ酸残基は、アミノ末端からＣ−末端に１からＪまで順に番号が付けられている。このタンパク質の中の一対の隣接アミノ酸は、それぞれｎとｎ＋１で番号が付けられ、ｎは１からＪ− １までの整数である。残基ｎ＋１は、新しいＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの新しいＮ−末端になり、残基ｎは、新しいＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの新しいＣ− 末端になる。本発明は、以下の式の新規Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストに関する：（式中、１位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ＴｙｒまたはＧｌｙであり、２位のＸａａは、ＰｒｏまたはＬｅｕであり、３位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＴｙｒまたはＳｅｒであり、１３位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＴｈｒまたはＰｒｏであり、１６位のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり、１７位のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり、１８位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＣｙｓであり、２２位のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｌａであり、２４位のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｙｒまたはＬｅｕであり、２７位のＸａａは、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり、３０位のＸａａは、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＧｌｙであり、３４位のＸａａは、ＬｙｓまたはＳｅｒであり、３６位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、４２位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、４３位のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＣｙｓまたはＬｅｕであり、４４位のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＴｈｒであり、４６位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＡｌａであり、４７位のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒであり、４９位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり、５０位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、５４位のＸａａは、ＬｅｕまたはＨｉｓであり、６４位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、６７位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＣｙｓであり、７０位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり、７４位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、１０４位のＸａａは、Ａｓｐ、ＧｌｙまたはＶａｌであり、１０８位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＧｌｙであり、１１５位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＡｌａであり、１２０位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、１２３位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＰｈｅまたはＴｈｒであり、１４４位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、１４６位のＸａａは、ＡｒｇまたはＧｌｎであり、１４７位のＸａａは、ＡｒｇまたはＧｌｎであり、１５６位のＸａａは、Ｈｉｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、１５９位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、１６２位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、１６３位のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＡｌａであり、１６９位のＸａａは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＣｙｓであり、１７０位のＸａａは、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり、Ｎ−末端から１〜１１アミノ酸、およびＣ−末端から１〜５アミノ酸は随時欠失させることができ、Ｎ−末端は、直接、またはＮ−末端をＣ−末端に結合させることができ、アミノ酸：で新しいＣ−末端およびＮ−末端を有することができるリンカーを介して、Ｃ− 末端に結合される）。本発明のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストは、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含有してもよく、Ｎ−末端およびＣ−末端の片方または両方にアミノ酸欠失を有してもよい。新しいＣ−末端およびＮ−末端を作成することができるより好適な切断点は、３８−３９、３９−４０、４０−４１、４１−４２、４８−４９、５３−５４、５４−５５、５５−５６、５６−５７、５７−５８、５８−５９、５９−６０、６０−６１、６１−６２、６２−６３、６４−６５、６５−６６、６６−６７、６７−６８、６８−６９、６９−７０、９６−９７、１２５−１２６、１２６− １２７、１２７−１２８、１２８−１２９、１２９−１３０、１３０−１３１、１３１−１３２、１３２−１３３、１３３−１３４、１３４−１３５、１３５− １３６、１３６−１３７、１３７−１３８、１３８−１３９、１３９−１４０、１４０−１４１および１４１−１４２である。新しいＣ−末端およびＮ−末端を作成することができる最も好適な切断点は、３８−３９、４８−４９、９６−９７、１２５−１２６、１３２−１３３および１４１−１４２である。本発明の好適な実施態様において、Ｎ−末端をＣ−末端に結合させるリンカー（Ｌ）は、以下よりなる群から選択されるポリペプチドである：ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号２）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号６１）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号６２）、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号６３）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号６４）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号６５）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号６６）、およびＧｌｙＧｌｙＳｅｒＡｓｐＭｅｔＡｌａＧｌｙ（配列番号６７）。本発明はまた、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、造血増殖因子（ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても知られている）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ− １０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、好酸球分化因子および、スティール因子（steel factor）またはｃ−ｋｉｔとしても知られている幹細胞因子（ＳＣＦ）があるが、これらに限定されない）（これらは、本明細書ではまとめて「コロニー刺激因子」または「ＣＳＦ］と呼ぶ）の１つまたはそれ以上の追加のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）と、同時にまたは順に投与される、組換えヒトＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストを包含する。これらの同時に投与される混合物は、ペプチドの両方の通常の活性を有することを特徴するか、または混合物は、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストまたは第２のコロニー刺激因子単独の存在の機能の単なる合計より大きな生物学的または生理学的活性を有することをさらなる特徴とする。同時投与はまた、Ｇ−ＣＳＦリガンドまたは第２のコロニー刺激因子の存在により予測される活性またはこれとは異なる活性に対する増強作用も提供する。同時投与はまた、未変性のヒトＧ−ＣＳＦに伴う好ましくない生物活性の低下を含む、上記リスト以外に、ＷＯ９４／１２６３９号およびＷＯ９４／１２６３８号に記載のＩＬ−３変種は、本発明のポリペプチドと同時投与することができる。さらに、インビトロの使用には、拡張した細胞を患者に注入する前に、骨髄、血球活性化と増殖を刺激する活性を含むことが企図される。図面の簡単な説明図１は、タンパク質の並べ替えを略図で示す。未変性のタンパク質のＮ−末端（Ｎ）とＣ−末端（Ｃ）は、リンカーを介して結合しているかまたは直接結合している。タンパク質は切断点で開いており、新しいＮ−末端（新しいＮ）と新しいＣ−末端（新しいＣ）ができており、新しい線状のアミノ酸配列を有するタンパク質が生成している。並べ替えられた分子は、新たに（de novo）合成されても、または元々のＮ−末端とＣ−末端の結合し切断点でタンパク質が開くという工程を受けなくてもよい。図２は、未変性のタンパク質の元々のＮ−末端とＣ−末端がリンカーで結合して、このタンパク質の異なるＮ−末端とＣ−末端が作成された、新しいタンパク質の作成を示す方法Ｉの略図を示す。この例では、配列の並べ替えにより、元々のタンパク質のアミノ酸９７で作成された新しいＮ−末端、リンカー領域を介してアミノ酸１１（アミノ酸１〜１０は削除される）に結合した元々のＣ−末端（アミノ酸１７４）、および元々の配列のアミノ酸９６で作成された新しいＣ−末端とを、有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が得られる。図３は、未変性のタンパク質の元々のＮ−末端とＣ−末端がリンカー無しで結合して、このタンパク質の異なるＮ−末端とＣ−末端が作成された、新しいタンパク質の作成を示す方法IIの略図を示す。この例では、配列の並べ替えにより、元々のタンパク質のアミノ酸９７で作成された新しいＮ−末端、元々のＮ−末端に結合した元々のＣ−末端（アミノ酸１７４）、および元々の配列のアミノ酸９６で作成された新しいＣ−末端とを、有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が得られる。図４は、未変性のタンパク質の元々のＮ−末端とＣ−末端がリンカーで結合して、このタンパク質の異なるＮ−末端とＣ−末端が作成された、新しいタンパク質の作成を示す方法IIIの略図を示す。この例では、配列の並べ替えにより、元々のタンパク質のアミノ酸９７で作成された新しいＮ−末端、リンカー領域を介してアミノ酸１に結合した元々のＣ−末端（アミノ酸１７４）、および元々の配列のアミノ酸９６で作成された新しいＣ−末端とを、有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が得られる。発明の詳細な説明本発明の受容体アゴニストは、造血系の顆粒球のレベルの低下を特徴とする疾患の治療に有用となり得る。Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストは、好中球減少症の治療または予防に有用となり得る。多くの薬物が、骨髄抑制または造血系欠乏を引き起こす。このような薬物の例としては、ＡＺＴ、ＤＤＩ、アルキル化剤および化学療法に使用される抗代謝物剤、抗生物質（例えば、クロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビル、ダウノマイシン、およびサルファ剤）、フェノチアゾン類、精神安定剤（例えば、メプロバメート）、麻酔剤（例えば、アミノピリンやジピロン）、抗けいれん剤（例えば、フェニトインまたはカルバマゼピン）、抗甲状腺剤（例えば、プロピルチオウラシルやメチマゾール）、および利尿剤がある。Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストは、これらの薬物で治療されている患者で発生する骨髄抑制または造血系欠乏の防止または治療に有用であるかも知れない。造血系欠乏はまた、ウイルス、微生物または寄生体感染の結果として、および腎疾患または腎不全の治療（例えば、透析）の結果として起きる可能性がある。本ペプチドはこのような造血系欠乏の治療に有用である可能性がある。本発明の別の面は、これらの新規Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストの発現法で使用されるプラスミドＤＮＡベクターを提供する。これらのベクターは、本発明の新規ポリペプチドをコードする上記の新規ＤＮＡ配列を含有する。Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストを発現することができる微生物を形質転換することができる適切なベクターには、使用される宿主細胞に応じて選択される、転写および翻訳制御配列に結合したＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストをコードするヌクレオチド配列からなる発現ベクターを含む。上記の修飾配列を取り込んだベクターは本発明に含まれ、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドの産生に有用である。この方法で使用されるベクターはまた、本発明の配列をコードするＤＮＡと協調して作用し、選択された宿主細胞中でその複製および発現を指令することができる、選択された制御配列を含有する。本発明の別の面として、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの新規ファミリーを産生する新規方法が提供される。本発明の方法では、新規Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターで形質転換した、適切な細胞または細胞株を培養する。適切な細胞または細胞株には、大腸菌（E．coli）のような細菌の種々の株、酵母、哺乳動物細胞、または昆虫細胞があり、本発明の方法において宿主細胞として利用できる。本発明の他の面は、上記症状を治療するための方法および治療用組成物である。このような組成物は、薬剤学的に許容される担体と混合された、治療上有効量の１つまたはそれ以上の本発明のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストを含む。この組成物は、非経口的に、静脈内にまたは皮下に投与することができる。投与される時、本発明で使用される治療用組成物は、好ましくは発熱物質のない、非経口的に受容される水溶液の形である。このような、ｐＨ、等張性、安定性などが関係する非経口的に受容されるタンパク質溶液の調製は、当該分野の範囲である。上記症状を治療するための方法に関与する投与計画は、薬物の作用に影響する種々の要因（例えば、患者の症状、体重、性および食事、感染があればその重症度、投与時期、および他の臨床的因子）を考慮して、担当医師が決定するであろう。一般に１日の投与量は、体重１kg当たり非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニスト０．５〜１５０μg/kgの範囲である。投与量は特定の受容体アゴニストの活性に対して調整され、１日に体重１kg当たり０．１μgの少量から１mgの多量までの範囲を含むことが非現実的であるということはない。さらに、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストの投与量が、体重１kg当たり０．５〜１５０μgの範囲より多いかまたは少ないように調整される特定の状況もある。これらには、他のＣＳＦまたは増殖因子との同時投与、化学療法剤および／または放射線照射との同時投与、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストの使用、およびこのセクションですでに記載した種々の患者に関する条件がある。前述のように、治療法および組成物はまた、他のヒト因子との同時投与を含んでもよい。本発明のポリペプチドとの同時投与または連続的同時投与のための他の適切なヘマトポエチン、ＣＳＦおよびインターロイキンの非限定的リストには、ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても知られている）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ −１３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、好酸球分化因子および、スティール因子（ steel factor）またはｃ−ｋｉｔとしても知られている幹細胞因子（ＳＣＦ）、（これらは、本明細書ではまとめて「コロニー刺激因子」と呼ぶ）、またはこれらの組合せがある。上記リスト以外に、ＷＯ９４／１２６３９号およびＷＯ９４／１２６３８号に記載のＩＬ−３変種は、本発明のポリペプチドと同時投与できる。本発明のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストは、末梢血中の造血始原細胞の動員に有用であり得る。末梢血由来の始原細胞は、自己骨髄移植の環境に患者を再構成するのに有用であることが証明されている。Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含む造血増殖因子は、末梢血中の循環始原細胞および幹細胞の数を増やすことが証明されている。このため、末梢血幹細胞の採取が容易になり、血漿交換が必要な回数が減少することによりコストが大幅に低下した。Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストは、幹細胞の動員に有用であり、末梢幹細胞移植の効果をさらに増強し得る。本発明のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストはまた、多分化能造血細胞のエクスビボ拡張に有用であるかも知れない。Ｇ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、単独で投与されるか、他のコロニー刺激因子と同時投与されるか、しばしばこのような高用量化学療法の結果である好中球減少症を治療するための高用量化学療法後の骨髄移植と組合せて、投与される。しかし、重症の好中球減少症は、完全には排除できないこともある。単球（マクロファージ）、顆粒球（好中球を含む）および巨核球からなる骨髄系統は、生死に関わる感染症や出血を防止するのに決定的に重要である。好中球減少症はまた、疾患、遺伝的障害、薬物、毒物、放射線照射、および多くの治療処置（例えば、通常の癌治療）の結果でもある。骨髄移植は、この患者集団の治療に使用されている。しかし、骨髄を使用して易感染性宿主の造血系を再構成することにはいくつかの問題がある：１）骨髄または他の組織の幹細胞の数は限られている、２）移植片対宿主反応病、３）移植片拒絶、および４）腫瘍細胞の混入の可能性。幹細胞および始原細胞は、骨髄、脾臓および末梢血中の有核細胞のほんの一部を構成する。より多くの数の多分化能性造血始原細胞が造血系の回復を増強するような用量応答が存在することは明らかである。従って幹細胞のインビトロでの拡張は、造血系の回復と患者の生存を増強するはずである。移植用の骨髄を提供するのに、同種のドナーからの骨髄が使用されている。しかし、移植片対宿主反応病および移植片拒絶が、ＨＬＡの一致した兄弟姉妹のドナーの受容者でさえ骨髄移植を制限している。同種骨髄移植の代替法は、自己骨髄移植である。自己骨髄移植では、骨髄切除治療法（例えば、高用量化学療法）の前に患者自身の骨髄の一部を採取し、後に患者自身に戻す。自己移植は、移植片対宿主反応病や移植片拒絶のリスクが無い。しかし、自己骨髄移植には、骨髄中の幹細胞の数が限定されていること、および腫瘍細胞が混入している可能性があることなどの問題がある。多分化能性始原細胞の数が限定されている問題は、多分化能性始原細胞をエクスビボで拡張させることにより克服できる。さらに、幹細胞はＣＤ３４＋のような特異的表面抗原の存在により特異的に単離して、骨髄移植体の腫瘍細胞の混入量を減少させることができる。以下の特許は、幹細胞、ＣＤ３４＋細胞の分離、造血因子を用いるこれらの細胞の培養、造血系疾患を有する患者の治療のためのこれらの細胞の使用、および細胞拡張と遺伝子治療のための造血因子の使用について、さらに詳細に説明する。５，０６１，６２０号は、特定の細胞から幹細胞を分離することにより提供されるヒト造血幹細胞からなる組成物に関する。５，１９９，９４２号は、（１）患者から造血始原細胞を得て、（２）ＩＬ− ３、ｆｌｋ３リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＧＭ− ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質、およびこれらの組合せよりなる群から選択される増殖因子で、細胞をエクスビボ拡張し、（３）患者に細胞調製物を投与することからなる、自己造血細胞移植のための方法を記載する。５，２４０，８５６号は、細胞分離工程を自動的に制御する装置を含む、細胞分離器に関する。ＷＯ９１／１６１１６号は、細胞の混合物から標的細胞を選択的に単離および分離するための装置と方法を記載する。ＷＯ９１／１８９７２号は、中空糸バイオリアクターを使用して骨髄細胞の懸濁物をインキュベートすることによる、骨髄のインビトロ培養法を記載する。ＷＯ９２／１８６１５号は、移植で使用するためのサイトカインの特異的混合物を含有する培地中で、骨髄細胞を維持し拡張する方法に関する。ＷＯ９３／０８２６８号は、（ａ）ＣＤ３４＋幹細胞を他の細胞から分離し、（ｂ）分離した細胞を選択的培地中でインキュベートして、幹細胞を選択的に拡張する工程からなる、幹細胞を選択的に拡張させる方法に関する。ＷＯ９３／１８１３６号は、末梢血由来の哺乳動物細胞のインビトロでの支持のための方法に関する。ＷＯ９３／１８６４８号は、遺伝性または後天性の好中球減少症を治療するための、骨髄芽球および前骨髄球の高含量のヒト好中球始原細胞からなる組成物に関する。ＷＯ９４／０８０３９号は、ｃ−ｋｉｔタンパク質を発現する細胞の選択によるヒト造血幹細胞の濃縮法を記載する。ＷＯ９４／１１４９３号は、向流水簸法を用いて単離される、ｃｄ３４＋でありサイズの小さい幹細胞集団を記載する。ＷＯ９４／２７６９８号は、異種細胞混合物から有核異種細胞集団を選択的に分離するための、免疫親和性分離と連続流遠心分離を組合せた方法に関する。ＷＯ９４／２５８４８号は、標的細胞の採取と操作のための細胞分離装置を記載する。ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６またはＧＭ−ＣＳＦを含有する培養物中のヒト骨髄からの造血始原細胞の高度濃縮ＣＤ３４＋始原細胞の長期培養が、ブラント（Brandt）ら、J．Clin．Invest．86:932-941，1990、で考察されている。本発明の１つの面は、幹細胞の選択的エクスビボ拡張法を提供する。「幹細胞」という用語は、多分化能造血細胞、ならびに骨髄、脾臓または末梢血から単離できる初期始原細胞および前駆細胞を意味する。「拡張」という用語は、細胞の増殖と分化を意味する。本発明は、（ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｂ）分離した幹細胞を、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストと随時第２のコロニー刺激因子を含有する選択的培地で培養し、および（ｃ）培養した幹細胞を採取する、工程からなる、幹細胞の選択的エクスビボ拡張法を提供する。好中球、赤血球、血小板などになるように運命付けられている幹細胞ならびに始原細胞は、これらの細胞表面上のＣＤ３４のような特定の始原細胞マーカー抗原の有無および／または形態的特徴により、他の細胞から区別される。高度に濃縮されたヒト幹細胞画分の表現型は、ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−１＋およびｌｉｎ−として報告されているが、本発明はこの幹細胞集団の拡張に限定されないことに注意されたい。ＣＤ３４＋が濃縮されたヒト幹細胞画分は、ＣＤ３４＋のような表面抗原に対する抗体を使用して、親和性カラムまたはビーズ、磁性ビーズ、またはフローサイトメトリーなどの多くの報告された方法により分離できる。さらに、向流水簸法のような物理的分離法が、造血始原細胞の濃縮に使用できる。ＣＤ３４＋始原細胞は不均一であり、異なる系統関連細胞表面結合分子の同時発現の有無により特徴付けられるいくつかの亜集団に分類される。最も未成熟な始原細胞は、既知の系統関連マーカー（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、またはＣＤ３８）を発現しないが、ＣＤ９０（ｔｈｙ−１）を発現することがある。ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲ、またはｃ−ｋｉｔのような他の表面抗原も、造血始原細胞を選択的に単離するのに使用できる。分離された細胞は、培養フラスコ、無菌バッグまたは中空糸中の選択培地中でインキュベートされる。細胞を選択的に拡張するために、種々のコロニー刺激因子が利用できる。骨髄のエクスビボ拡張のために利用されている代表的な因子には、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ｆｌｔ−３リガンドまたはこれらの組合せがある。幹細胞の増殖は、インキュベート後に標準的方法（例えば、血球計算計、ＣＦＵ、ＬＴＣＩＣ）またはフローサイトメトリーにより、幹細胞および他の細胞の数を計測することにより、追跡することができる。ｃ−ｋｉｔリガンド（ブラント（Brandt）ら、Blood 83:1507-1514，1994;マケンナ（McKenna）ら、Blood 86:3413-3420，1995）；ＩＬ−３（ブラント（Bra ndt）ら、Blood 83:1507-1514，1994；サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1 993）、Ｇ−ＣＳＦ（サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993）、ＧＭ−ＣＳＦ（サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993）、ＩＬ−１（ムエンチ（Mu ench）ら、Blood 81:3463-3473，1993）、ＩＬ−６（サト（Sato）ら、Blood 82 :3600-3609，1993）、ＩＬ−１１（レモリ（Lemoli）ら、Exp．Hem．21:1668-16 72，1993；サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993）、ｆｌｔ−３リガンド（マケンナ（McKenna）ら、Blood 86:3413-3420，1995）、および／またはこれらの組合せ（ブラント（Brandt）ら、Blood 83:1507-1514，1994；ヘイロック（ Haylock）ら、Blood 80:1405-1412，1992；コラー（Koller）ら、Biotechnology 11:358-363，1993；レモリ（Lemoli）ら、Exp．Hem．21:1668-1672，1993）、マケンナ（McKenna）ら、Blood 86:3413-3420，1995；ムエンチ（Muench）ら、B lood 81:3463-3473，1993;パッチェン（Patchen）ら、Biotherapy 7:13-26，199 4；サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993；スミス（Smith）ら、Exp．Hem ．21:870-877，1993；スティーン（Steen）ら、Stem Cells 12:214-224，1994；ツジノ（Tsujino）ら、Exp．Hem．21:1379-1386，1993）を含む、種々のコロニー刺激因子を使用して、多くの選択法と拡張法を利用する、幹細胞のエクスビボ拡張のいくつかの方法が報告されている。各コロニー刺激因子の中で、ｈＩＬ− ３は、末梢血ＣＤ３＋細胞を拡張するのに最も強力なものの１つであることが証明されている（サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993；コバヤシ（Kobaya shi）ら、Blood 73:1836-1841，1989）。しかし、単一の因子で、複数の因子の組合せのように有効なものは証明されていない。本発明は、新規Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストを利用するエクスビボ拡張法を提供する。本発明の他の面は、本発明のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストを補足したＨＳ−５（ＷＯ９６／０２６６２号、レクレインとトロック−ストロブ（Roecklein and Torok-Strob）、Blood 85:997-1105，1995）のような間質性細胞株への暴露により調整される培地を有する、培養容器中に細胞を接種することを含む、造血前駆細胞を維持および／または拡張する方法を提供する。増殖因子の他の目的とする臨床応用は、遺伝子治療法のための造血始原細胞と幹細胞のインビトロでの活性化である。造血始原細胞の寿命の長さと体全体へのその娘細胞の分布のため、造血始原細胞は、エクスビボ遺伝子トランスフェクションの良好な候補である。目的の遺伝子を造血始原細胞または幹細胞のゲノム内に取り込むために、細胞分裂およびＤＮＡ複製を刺激することが必要である。造血幹細胞のサイクルの頻度は非常に低く、これは、遺伝子導入を促進し、従って遺伝子治療法の臨床的期待を増大させるのに、増殖因子が有用であり得ることを意味する。遺伝子治療の応用の可能性（総説クリスタル（Crystal）、Science 2 70:404-410，1995）には、１）多くの先天性代謝障害および免疫不全症（ケイとウー（Kay and Woo）、Trends Genet．10:253-257，1994）、２）神経障害（フリードマン（Friedmann）、Trends Genet．10:210-214，1994）、３）癌（カルバーとブラエセ（Culver and Blaese）、Trends Genet．10:174-178，1994）、および４）感染症（ギルボアとスミス（Gilboa and Smith）、Trends Genet．10 :139-144，1994）がある。遺伝物質を宿主細胞に導入するための、当業者に公知の種々の方法がある。初代細胞に治療用遺伝子を移すために、ウイルス性および非ウイルス性の多くのベクターが開発されている。ウイルス性のベクターには、１）複製欠損組換えレトロウイルス（ボリス−ローリーとテミン（Boris-Lawrie and Temin）、Curr．Op in．Genet．Dev．3:102-109，1993；ボリス−ローリーとテミン（Boris-Lawrie and Temin）、Annal．New York Acad．Sci．716:59-71，1994；ミラー（Miller ）、Current Top．Microbiol．Immunol．158:1-24，1992）、および複製欠損組換えアデノウイルス（バークナー（Berkner）、BioTechniques 6:616-629，1988 ；バークナー（Berkner）、Current Top．Microbiol．Immunol．158:39-66，199 2；ブローディとクリスタル（Brody and Crystal）、Annal．New York Acad．Sc i．716:90-103，1994）がある。非ウイルス性のベクターには、タンパク質／ＤＮＡ複合体（クリスチアーノ（Cristiano）ら、PNAS USA．90:2122-2126，1993 ；クリエル（Curiel）ら、PNAS USA 88:8850-8854，1991；クリエル（Curiel）ら、Annal．New York Acad．Sci．716:36-58，1994）、電気穿孔法および陽イオン性リポソームのようなリポソーム介在送達（ファーフッド（Farhood）ら、Ann al．New York Acad．Sci．716:23-35，1994）がある。本発明は、改良された生物活性および／または物理的性質を有するＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストを利用する方法を提供するという点で、新しい遺伝物質が導入されている造血細胞を拡張するための既存の方法の改良を提供する。リンカーの決定リンカーのアミノ酸配列の長さは、経験的にまたは構造情報を参考にして、または２つのアプローチの組合せにより選択することができる。構造情報が手に入らない場合は、０〜５０Åの範囲にわたるように長さを変化させ、配列が表面露出（親水性、ホップとウッズ（Hopp & Woods）、Mol．Immun ol．20:483-489，1983；カイトとドリトル（Kyte & Doolittle）、J．Mol．Bio1 ．157:105-132，1992；溶媒に露出される表面積、リーとリチャーズ（Lee & Ric hards）、J．Mol．Biol．55:379-400，1971）と、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストのコンフォメーションを変化させることなく必要なコンフォメーションを取る能力（コンフォメーション的に柔軟性がある；カープラスとシュルツ（Karplus & Schulz）、Naturwissenschaften 72:212-213，1985）に一致するように選択される、デザインを使用して試験するために調製される。残基当たり２．０〜３．８ Åの翻訳の平均を仮定すると、これは、試験すべき長さは０〜３０残基であり、０〜１５残基が好ましい範囲であることを意味する。このような経験的シリーズの例は、ｎ回（ｎは、１、２、３、または４である）繰り返されるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２）のようなカセット配列を使用してリンカーを作製することであろう。当業者は、リンカーとして作用する長さまたは組成が変化する多くのこのような配列があり、最初に考慮すべきことは、これらが過剰に長くなくまた短くもないこと（サンズウ（Sandhu）、Critlcal Rev．Biotech．1 2:437-462，1992）であり、もし長すぎるなら、エントロピー作用が３次元の折り畳みを不安定にする可能性があり折り畳みを速度論的に不可能にし、そして短すぎるなら、ねじれ力または立体的ひずみのため分子を不安定にする可能性があることは、理解されるであろう。タンパク質の構造解析の当業者は、鎖の末端の間の距離（ｃ−アルファ炭素間の距離として定義される）を使用することは、使用される配列の長さを定義するか、または少なくとも、リンカーの経験的選択で試験しなければならないいくつかのの可能性の数を限定するために使用できることは認識できるであろう。また、ポリペプチド鎖の末端の位置は、Ｘ線回折または核磁気共鳴分光分析データから得られるモデルでは、時に正しく定義されていないことがあり、また正しい場合はこれを考慮して、必要なリンカーの長さを正しく推定する必要があることも理解できるであろう。その位置が正しく定義されている残基から、鎖の末端に配列が近い２つの残基が選択され、そのｃ−アルファ炭素間の距離を使用して、その間のリンカーのおよその長さが計算される。次に計算された長さを指標として使用して、ある範囲の数の残基（残基当たり２〜３．８Åを使用して計算される）を有するリンカーが選択される。これらのリンカーは、元々の配列（必要に応じて短くなっていても長くなっていてもよい）から構成され、長くなっている場合は、前述のように柔軟で親水性を有するように追加の残基が選択されるか、または、配列は、一連のリンカーを使用して随時置換してもよく、その一例は前述のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２）カセットアプローチであり、または、元々の配列と、適切な全体の長さを有する新しい配列の組合せが随時使用される。Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストのアミノ末端およびカルボキシ末端の決定生物活性のある状態に折り畳むことができるＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの配列は、元々のポリペプチド鎖内から初め（アミノ末端）と終わり（カルボキシ末端）の位置を適切に選択して、一方リンカー配列を前述のように使用することにより、調製できる。アミノ末端およびカルボキシ末端は後述のガイドラインに従って、切断点領域と呼ばれる、配列の共通の部分内から選択される。従って、新規のアミノ酸配列は、同じ切断点内からアミノ末端およびカルボキシ末端を選択することにより作成される。多くの場合、新しい末端の選択は、カルボキシ末端の元々の位置がアミノ末端の直前にあるようなものであろう。しかし、この領域内の任意の場所で末端を選択したものは機能し、これらは有効に、新しい配列のアミノ末端またはカルボキシ末端への欠失または付加となることは、当業者は容易に理解できるであろう。タンパク質の一次アミノ酸配列がその生物的機能の発現に必要な３次元構造への折り畳みを支配するということは、分子生物学の中心的教義である。単一のタンパク質結晶のＸ線回折またはタンパク質溶液の核磁気共鳴分光学的分析を使用して、３次構造情報を得て解釈する方法は当業者に公知である。切断点の同定に関係する構造情報の例としてはタンパク質の２次構造の位置とタイプ（アルファおよび３〜１０らせん、平行および非平行のベータシート、鎖の逆転および回転、およびループ；カブシュとサンダー（Kabsch & Sander）、Biopolymers 22:25 77-2637，1983、アミノ酸残基の溶媒への露出の程度、残基同士の相互作用の程度とタイプ（チョチア（Chothia）、Ann．Rev．Biochem．53:537-572，1984）、およびポリペプチド鎖に沿ったコンフォメーションの静的および動的分布（アルバーとマシューズ（Alber & Mathews）、Methods Enzymol．154:511-533，1987 ）がある。残基の溶媒露出について追加の情報がある場合もある。１つの例はタンパク質の表面で必要な炭水化物の翻訳後の付着部位である。実験的構造情報が入手できない時または得ることが現実的でない時、一次アミノ酸配列を解析してタンパク質の３次構造および２次構造、溶媒の近づき易さ、および回転やループの存在を推定する方法がある。直接的構造法が現実的でない場合、表面露出を経験的に決定する生化学的方法もある。例えば表面露出を推定するために限定的タンパク質分解を行った後、鎖の切断の部位を同定する（ゲンチルとサルバトーレ（Gentile & Salvatore）、Eur．J．Biochem．218:603-621，1993）。すなわち、実験的に得られる構造情報または予測方法（例えば、スリニビサンとローズ（ Srinivisan & Rose）、Proteins:Struct.，Funct．& Genetics，22:81-99，1995 ）を使用して親のアミノ酸配列を調べて、これらが２次および３次構造の維持に必要であるかどうかにより領域を分類する。周期的２次構造（アルファおよび３〜１０らせん、平行および非平行のベータシート）に関与することがわかっている領域内の配列の存在は避けるべき領域である。同様に、保存されているかまたは溶媒露出の程度が低いことが観察されるか予測されるアミノ酸配列の領域は、いわゆるタンパク質の疎水性の核の一部である可能性があり、アミノ末端およびカルボキシ末端の選択のためには避けるべきである。これに対して表面回転またはループ内にあることが既知であるか予測される領域、特に生物活性に必要でないことが明らかな領域は、ポリペプチド鎖の端の位置には好適な部位である。上記基準に基づいて好適なアミノ酸配列の連続的部分は切断領域と見なされる。表１オリゴヌクレオチド表２ＤＮＡ配列表３タンパク質配列材料と方法組換えＤＮＡ法特に明記しない場合、すべての特殊化学薬品は、シグマ社（Sigma Co.）（セントルイス、ミズーリ州）から得た。制限エンドヌクレアーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）（ビバリー、マサチューセッツ州）またはベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannhei m）（インディアナポリス、インディアナ州）から得た。大腸菌（E．coli）株の形質転換大腸菌（E．coli）株ＤＨ５α（登録商標）（ライフテクノロジーズ（Life Te chnologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）およびＴＧ１（アマシャム社（Amersham Corp.）、アーリントンハイツ（Arlington Heig hts）、イリノイ州）は結合反応の形質転換に使用され、哺乳動物細胞をトランスフェクションするためのプラスミドＤＮＡの供給源である。大腸菌株（例えば、ＭＯＮ１０５およびＪＭ１０１）は、細胞質または細胞周辺空腔中の本発明のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストを発現するために使用することができる。ＭＯＮ１０５ＡＴＣＣ＃５５２０４：Ｆ−、ラムダー、ＩＮ（ｒｒｎＤ、ｒｒＥ）１、ｒｐｏＤ＋、ｒｐｏＨ３５８ＤＨ５α（登録商標）：Ｆ−、ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５、ｄｅｌｔａ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４ｌａｍｄａ−、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１ＴＧ１：ｄｅｌｔａ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＤ５／Ｆ’（ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５）ＤＨ５α（登録商標）サブクローニング効率細胞はコンピタントな細胞として購入し、製造業者のプロトコールを使用して形質転換が可能であるが、大腸菌（ E．coli）株ＴＧ１とＭＯＮ１０５はＣａＣｌ₂法を使用してＤＮＡを摂取できるようにコンピタントにする。典型的には、２０〜５０mlの細胞をＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１５０mM ＮａＣｌ）で、バウシュとローム（Baush & Lomb）スペクトロニック（Spectronic）分光光度計（ローチェスター、ニューヨーク州）で測定する時６００nm（ＯＤ６００）で約１．０光学密度単位まで増殖させる。細胞を遠心分離して集め、培養物の５分の１量のＣａＣｌ₂溶液（５０mM ＣａＣｌ₂、１０mMトリス−Ｃｌ，ｐＨ７．４）に再懸濁し、４℃で３０分維持する。細胞を遠心分離して再度集め、培養物の１０分の１量のＣａＣｌ₂溶液に再懸濁する。結合したＤＮＡを、０．２mlのこれらの細胞に加えて、試料を４℃に１時間維持する。試料を２分間４２℃に移し、１．０mlのＬＢを加えてから、３７℃で１時間振盪する。これらの試料からの細胞を、アンピシリン耐性形質転換体について選択する時はアンピシリン（１００マイクログラム／ml、μg/ml）を含有するプレート（ＬＢ培地＋１．５％バクト寒天）に広げ、スペクチノマイシン耐性形質転換体について選択する時はスペクチノマイシン（７５μg/ml）を含有するプレートに広げる。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。単一のコロニーを拾い上げ、適切な抗生物質を補足したＬＢで３７℃で６〜１６時間振盪して増殖させる。コロニーを取り上げ、適切な抗生物質（１００μg/mlアンピシリンまたは７５ μg/mlスペクチノマイシン）を含有するＬＢに接種し、３７℃で振盪して増殖させる。培養物を採取する前に、１μｌの細胞をＧ−ＣＳＦ遺伝子の存在についてＰＣＲで解析する。Ｇ−ＣＳＦ遺伝子および／またはベクターにアニーリングするプライマーの組合せを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲ完了後、充填色素を試料に加え、次に前述のように電気泳動を行う。予測されるサイズのＰＣＲ産物が観察される時は、ベクターに遺伝子が結合している。新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子の作成方法方法Ｉ．リンカー領域を含有する新しいＮ−末端／ｃ−末端を有する遺伝子の作成元々のＣ−末端とＮ−末端を分離するリンカー領域を含有する新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子は、基本的にエル・エス・ムリンズ（L.S．Mullins）らの記載した方法（J．Am．Chem．Soc．116:5529-5533，1994）により作成できる。タンパク質の一次アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を並べ替えるのに、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）増幅の複数の工程が使用できる。その工程を図２に例示する。第１の工程で、第１のプライマーセット（「新しい開始点」と「リンカー開始点」）を使用して、元々の遺伝子配列から、新しいタンパク質の新しいＮ−末端部分と、その後に続く元々のタンパク質のＣ−末端とＮ−末端をつなぐリンカーを、コードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片開始点」）を、作成し増幅する。第２の工程で、プライマーセット（「新しい停止点」と「リンカー停止点」）を使用して、元々の遺伝子配列から、前記のものと同じリンカーとその後に続く新しいタンパク質のＣ−末端をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片停止点」）を、作成し増幅する。「新しい開始点」と「新しい停止点」プライマーは、発現プラスミド中への新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限酵素認識部位を含むように設計する。典型的なＰＣＲ条件は、９５℃溶解を２分が１サイクル、９４℃変性を１分、５０℃アニーリングを１分、および７２℃ 伸長を１分が、２５サイクル、および７２℃伸長を７分が１サイクルである。パーキン・エルマー・ジーンアンプＰＣＲコア試薬（Perkin-Elmer Gene Amp PCR Core Reagents）キットが使用される。１００μｌの反応物は、１００pmolの各プライマーと１μgの鋳型ＤＮＡ、および１×ＰＣＲ緩衝液、２００μM ｄＧＴＰ、２００μM ｄＡＴＰ、２００μM ｄＴＴＰ、２００μM ｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタク（Amp1iTaq）ＤＮＡポリメラーゼと２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社（Perkin-Elmer Corporation）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）で行う。リンカー領域中に相補的配列と、リンカーの両側に２つのアミノ酸のコード配列を有する「断片開始点」と「断片停止点」を、第３のＰＣＲ工程で結合させて新しいタンパク質をコードする完全長遺伝子を作成する。ＤＮＡ断片「断片開始点」と「断片停止点」を１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、キアエックス（Qiaex）ゲル抽出キット（キアゲン（Quiagen））で単離する。これらの断片を等モル量で組合せ、７０℃で１０分加熱しゆっくり冷却して「リンカー開始点」と「リンカー停止点」中の共通の配列を介してアニーリングさせる。第３のＰＣＲ工程で、アニーリングした断片にプライマー「新しい開始点」と「新しい停止点」を加えて完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅する。典型的なＰＣＲ条件は、９５℃溶解を２分が１サイクル、９４℃変性を１分、６０℃アニーリングを１分、および７２℃伸長を１分、が２５サイクル、および７２℃伸長を７分が１サイクルである。パーキン・エルマー・ジーンアンプＰＣＲコア試薬（Perkin-Elmer GeneAmp PCR Core Reagents）キットを使用する。１００μｌの反応物は、１００pmolの各プライマーと約０．５μgのＤＮＡ、および１×ＰＣＲ緩衝液、２００μM ｄＧＴＰ、２００μM ｄＡＴＰ、２００μ MｄＴＴＰ、２００μM ｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタク（Amp1iTaq）ＤＮＡポリメラーゼと２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応物はウィザードＰＣＲプレプス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ（Promega））を使用して精製する。方法II．リンカー領域の無い新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子の作成ＰＣＲ増幅と平滑末端結合の２つの工程を使用して、元々のＮ−末端とＣ−末端を結合させるリンカー領域の無い新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子が作成できる。工程を図３に例示する。第１の工程で、プライマーセット（「新しい開始点」と「Ｐ−ｂｌ開始点」）を使用して、元々の遺伝子配列から、新しいタンパク質の新しいＮ−末端部分をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片開始点」）を作成し増幅する。第２の工程で、プライマーセット（「新しい停止点」と「Ｐ−ｂｌ停止点」）を使用して、元々の遺伝子配列から、新しいタンパク質の新しいＣ−末端部分をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片停止点」）を、作成し増幅する。「新しい開始点」と「新しい停止点」プライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、９５℃溶解を２分が１サイクル、９４ ℃変性を１分、５０℃アニーリングを４５秒、および７２℃伸長を４５秒が、２５サイクルである。ディープベント（Deep Vent）ポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボズ（New England Blolabs））を使用して、製造業者の勧める条件でオーバーハングの発生を低下させる。ＦＰ−ｂｌ開始点」と「Ｐ−ｂｌ停止点」プライマーは５’末端でリン酸化して、以後の「断片開始点」と「断片停止点」の互いの平滑末端結合を補助する。１００μｌの反応物は、１５０pmolの各プライマーと１μgの鋳型ＤＮＡ、および１×ベント（Vent）緩衝液（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs））、３００μM ｄＧＴＰ、３００ μM ｄＡＴＰ、３００μＭｄＴＴＰ、３００μM ｄＣＴＰ、および１単位のディープベント（Deep Vent）ポリメラーゼを含有した。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社（Perkin-Elmer Corpora tion）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）で行った。ＰＣＲ反応生成物はウィザードＰＣＲプレプス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ（Prom ega））を使用して精製する。プライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限酵素認識部位を含むように設計される。典型的には、「断片開始点」は、ＮｃｏＩ制限部位を作成するように設計され、「断片停止点」はＨｉｎｄIII 制限部位を作成するように設計される。制限消化反応物は、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（Magic DNA Clean-up Systemkit）（プロメガ（Prom ega））を使用して精製される。断片開始点と断片停止点は、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、キアエックス（Qiaex）ゲル抽出キット（キアゲン（Quiagen））を使用して単離する。これらの断片を、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIベクター断片の末端に組合せて、５０℃で１０分加熱してアニーリングし、ゆっくり冷却する。３つの断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））を使用して結合させる。結果は、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を含有するプラスミドである。結合反応物の一部を使用して、大腸菌（E．coli）株ＤＨ５α 細胞（ライフテクノロジーズ（Llfe Technologies）、ゲーサーズバーグ（Gaith ersburg）、メリーランド州）を形質転換する。プラスミドＤＮＡを精製し、配列を下記のように確認する。方法III．縦列（tandem）複製法による新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子の作成新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子は、アール・エー・ホーリック（R.A．Horli ck）らの記載した方法（Protein Eng．5:427-431，1992）により作成できる。新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子のポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）増幅は、縦列に複製した鋳型ＤＮＡを使用して行われる。その工程を図４に例示する。縦列に複製した鋳型ＤＮＡは、クローニングにより作成され、遺伝子の２つのコピーの元々のＣ−末端とＮ−末端をつなぐリンカーをコードするＤＮＡ配列により分離される遺伝子の２つのコピーを含有する。特異的なプライマーセットは、縦列に複製した鋳型ＤＮＡから、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端を作成し増幅するのに使用される。これらのプライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、９５℃溶解を２分が１サイクル、９４℃変性を１分、５０℃アニーリングを１分、および７２℃伸長を１分が、２５サイクル、および７２℃伸長を７分が１サイクルである。パーキン・エルマー・ジーンアンプＰＣＲコア試薬（Perkin-Elmer GeneAmp PCR Core Reagents）キット（パーキン・エルマー（ Perkin-Elmer）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）が使用される。１００μlの反応物は、１００pmolの各プライマーと１μgの鋳型ＤＮＡ、および１×ＰＣＲ緩衝液、２００μM ｄＧＴＰ、２００μM ｄＡＴＰ、２００μM ｄＴＴＰ、２００μM ｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタク（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼと２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社（Perkin-Elmer Corporation）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）で行った。ＰＣＲ反応物はウィザードＰＣＲプレプス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ（Promega））を使用して精製する。ＤＮＡ単離と性状解析プラスミドＤＮＡは、いくつかの異なる方法および当業者に公知の市販のキットを使用して単離することができる。そのような方法のいくつかをここに示す。プロメガ（Promega）ウィザード（登録商標）ミニプレプ（Miniprep）キット（マジソン、ウィスコンシン州）またはキアゲンキアウェルプラスミド単離キット（Quiagen QIAwell Plasmid isolation kit）（チャッツワース（Chatsworth）、カリホルニア州）またはキアゲンプラスミドミジキット（Quiagen Plasmid Mi di kit）を使用して、ブラスミドＤＮＡを単離する。これらのキットは、プラスミドＤＮＡ単離について同じ一般的方法を用いる。簡単に説明すると、細胞を遠心分離（５０００×ｇ）してペレットにし、順にＮａＯＨ／酸で処理してプラスミドＤＮＡが放出し、細胞破片を遠心分離（１００００×ｇ）して除去する。上清（プラスミドＤＮＡを含有）を、ＤＮＡ結合樹脂を含有するカラムにのせカラムを洗浄し、プラスミドＤＮＡをＴＥで溶出する。目的のプラスミドを有するコロニーについてスクリーニングした後、大腸菌（E．coli）細胞を適切な抗生物質を含有する５０〜１００mlのＬＢ中に接種し、振盪しながら空気インキュベーター中で３７℃で一晩増殖させる。精製したプラスミドＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定のために使用し、さらに制限酵素消化し、ＤＮＡ断片をさらにサブクローニングし、哺乳動物細胞、大腸菌（E．coli）細胞、または他の細胞中にトランスフェクションする。配列の確認精製したプラスミドＤＮＡをｄＨ₂Ｏに再懸濁し、バウシュとローム（Bausch & Lomb）スペクトロニック（Spectronic）６０１ＵＶ分光光度計で２６０／２８０の吸光度を測定して定量した。ＤＮＡ試料は、ＡＢＩプリズム（登録商標）ダイデオキシ（登録商標）ターミネーター配列決定化学（ABI PRISM^TMDyeDeoxy^TMT erminator terminator sequencing chemistry）（パーキンエルマー社（Perkin- Elmer Corporation）のアプライドバイオシステムズ部門（Applied Biosystems Division））キット（部品番号４０１３８８または４０２０７８）を、製造業者のすすめるプロトコールに従って、通常５％ＤＭＳＯを配列決定混合物に加えて修飾して使用して配列決定した。配列決定反応は、モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社（Perkin-Elmer Corporation）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）で、推薦されている増幅条件に従って行う。試料を精製して、セントリセッブ（Centri-Sep）スピンカラム（プリンストンセパレーションズ社（Princeton Separations Inc.）、アデルフィア（Adelphia ）、ニュージャージー州）を用いて、過剰のダイターミネーターを除去する。蛍光色素標識配列決定反応物を、脱イオン化ホルムアミドに再懸濁し、変性４．７５％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲルで、ＡＢＩモデル３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーを使用して配列を決定する。シーケンチャー（Sequencher）ｖ２．１ＤＮＡ解析ソフトウェア（ジーンコーズ社（Gene Codes Corporation）、アンアーバー（Ann Arbor）、ミシガン州）を使用して、重複ＤＮＡ配列断片を解析し、マスターＤＮＡコンチグス（contigs）に集める。哺乳動物細胞中のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの発現哺乳動物細胞トランスフェクション／調整培地の産生ＢＨＫ−２１細胞株は、ＡＴＣＣ（ロックビル（Rockville）、メリーランド州）から得られる。細胞を、２ミリモル（mM）のＬ−グルタミンと１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／高グルコース）中で培養する。この調製物をＢＨＫ増殖培地と呼ぶ。選択培地は、４５３単位／mlヒグロマイシンＢ（カルビオケム（Calbiochem）、サンジエゴ、カリホルニア州）を補足したＢＨＫ増殖培地である。ＢＨＫ−２１細胞株は、すでにＨＳＶトランス活性化タンパク質ＶＰ１６で安定にトランスフェクションされており、これはプラスミドｐＭＯＮ３３５９（ヒッペンマイアー（Hippenmeyer）ら、Bio/Technology，1037-1041，1993）上に存在するＩＥ１１０プロモーターをトランス活性化する。ＶＰ１６タンパク質は、ＩＥ１１０プロモーターの後ろに挿入された遺伝子の発現を指令する。トランス活性化タンパク質ＶＰ１６を発現するＢＨＫ−２１細胞は、ＢＨＫ−ＶＰ１６と呼ぶ。プラスミドｐＭ０Ｎ１１１８（ハイキン（Highkin）ら、Poultry Sci.，70:970-981，1991を参照）は、ＳＶ４０プロモーターからヒグロマイシン耐性遺伝子を発現する。ＡＴＣＣから同様のプラスミド（ｐＳＶ２−ｈｐｈ）が入手できる。ＢＨＫ−ＶＰ１６細胞を、６０ミリメートル（mm）の組織培養プレートに３× １０⁵細胞／プレートでトランスフェクションの２４時間前に接種する。細胞を、目的の遺伝子を含有するプレート当たり１０μgのプラスミドＤＮＡ、３μgのヒグロマイシン耐性プラスミドであるｐＭＯＮ１１１８、および８０μgのギブコビーアールエル（Gibco-BRL）「リポフェクタミン（LIPOFECTANIME）」（登録商標）を含有する３mlの「オプチメム（OPTIMEM）」（登録商標）（ギブコビーアールエル（Gibco-BRL）（ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）で１６時間トランスフェクションする。次に培地を吸引し、３mlの増殖培地と交換する。トランスフェクションの４８時間後、各プレートの培地を集め活性を測定する（一過性の調整培地）。プレートからトリプシン−ＥＤＴＡにより細胞を取り出し、１：１０に希釈し、１０mlの選択培地を含有する１００mmの組織培養プレートに移す。選択培地中で約７日後、耐性の細胞は増殖して直径数ミリメートルのコロニーになる。ろ紙（コロニーとほぼ同じサイズに切断し、トリプシン／ＥＤＴＡに浸漬した）でプレートからコロニーを取り、１mlの選択培地を含有する２４ウェルプレートの各ウェルに移す。コロニーをコンフルエンスになるまで増殖させ、調整培地を再測定し、陽性クローンを増殖培地に拡張する。大腸菌（E．coli）中のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの発現目的のプラスミドを有する大腸菌（E．coli）株ＭＯＮ１０５またはＪＭ１０１を、カザミノ酸含有Ｍ９培地中で、ニューブランズウィックサイエンティフィック（New Brunswick Scientific）（エジソン、ニュージャージー州）の空気インキュベーターモデルＧ２５中で３７℃で振盪して増殖させる。ＯＤ６００が１になるまでＯＤ６００で増殖を追跡し、ここで０．１ＮＮａＯＨ中のナリジキシン酸（１０mg/ml）を、最終濃度５０μg/mlになるように加える。次に、培養物を３７℃で３〜４時間振盪する。目的の遺伝子産物の産生を最大にするために、培養期間中、高度の通気を維持する。光学顕微鏡下で封入体（ＩＢ）の有無について細胞を調べる。培養物のアリコート１mlを取って、ペレットにした細胞を沸騰させ、これを還元緩衝液で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、１９８２）でタンパク質含量について解析する。培養物を遠心分離（５０００×ｇ）して細胞をペレットにした大腸菌（E．coli）中で封入体として蓄積するＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの封入体調製、抽出、再折り畳み、透析、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、および性状解析封入体の単離３３０mlの大腸菌（E．coli）培養物からの細胞ペレットを、１５mlの音波処理緩衝液（１０mM ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）１，３−プロパンジオール塩酸塩（トリス−塩酸）（ｐＨ８．０）＋１mMエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））に再懸濁する。ソニケーター（Sonicator）細胞破砕機（モデルＷ −３７５、ヒートシステムズ−ウルトラソニックス社（Heat Systems-Ultrasoni cs Inc.）、ファーミングダエール（Farmingdale）、ニューヨーク州）のマイクロチップを使用して、これらの再懸濁細胞を音波処理する。音波処理緩衝液中で３ラウンドの音波処理後、遠心分離して細胞を破砕し、封入体を洗浄する。最初のラウンドの音波処理は、３分間の破裂（burst）後に１分間の破裂、そして最後の２ラウンドの音波処理は１分ずつである。封入体ペレットからのタンパク質の抽出と再折り畳み最後の遠心分離工程後、封入体ペレットを、１０mlの５０mMトリス−塩酸（ｐＨ９．５）、８Ｍ尿素、および５mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）に再懸濁し、室温で約４５分間攪拌して、発現したタンパク質を変性させる。抽出溶液を、７０mlの５mMトリス−塩酸（ｐＨ９．５）と２．３Ｍ尿素を含有するビーカーに移し、静かに攪拌しながら４℃で１８〜４８時間空気に曝して、タンパク質を再度折り畳みをさせる。バイダック（Vydac）（ヘスペリア（Hespe ria）、カリホルニア州）Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム（０．４６×２５cm）で分析して、再折り畳みを追跡する。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する４０％〜６５％のアセトニトリルの直線勾配を使用して、再折り畳みしたものを追跡する。この勾配は、３０分かけて１．５ml／分の流速で展開する。変性タンパク質は、勾配液中で再折り畳みしたタンパク質より一般的に後ろに溶出する。精製再折り畳み後、混入している大腸菌（E．coli）タンパク質を酸沈降により除去する。１５％（v/v）酢酸（ＨＯＡｃ）を用いて、再折り畳み溶液のｐＨを５．０〜５．２になるように滴定する。この溶液を４℃で２時間攪拌し、次に１２，０００×ｇで２０分遠心分離して、不溶性のタンパク質をペレットにする。酸沈降工程からの上清を、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が３，５００ダルトンのスペクトラ／ポア（Spectra/Por）３膜を使用して透析する。透析は、４リットル（５０倍過剰）の１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．０）に対して合計１８時間行う。透析は試料の電気伝導率を下げ、ＤＥＡＥクロマトグラフィーの前に尿素を除去する。次に試料を遠心分離（１２，０００×ｇで２０分）して、透析後の不溶性のタンパク質をペレットにする。イオン交換クロマトグラフィーのために、バイオラッド（Bio-Rad）バイオースケール（Bio-Scale）ＤＥＡＥ２カラム（７×５２mm）を使用する。カラムを、１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液で平衡化する。平衡緩衝液中の０〜５００mM塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）勾配を使用して、タンパク質を４５分間溶出する。実験の間１ml／分の流速を使用する。勾配にわたってカラムの画分（２mlずつの画分）を集めて、バイダック（Vydac）（ヘスペリア（Hesperi a）、カリホルニア州）Ｃ１８カラム（０．４６×２５cm）のＲＰＨＰＬＣにより解析する。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する４０％〜６５％のアセトニトリルの直線勾配を使用する。この勾配は、１．５ml／分の流速で３０分にわたって展開する。次に、プールした画分を４リットル（５０〜５００倍過剰）の１０mM酢酸アンモニウム（ＮＨ₄Ａｃ）（ｐＨ４．０）に対して、合計１８時間透析を行う。透析は、ＭＷＣＯが３，５００ダルトンのスペクトラ／ポア（Spectra/Por）３膜を使用して行う。最後に、０．２２μmのシリンジフィルター（ミュースター（μStar）ＬＢシリンジフィルター、コスター（Costar）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を使用して試料を滅菌ろ過し、４℃に保存する。折り畳まれたタンパク質は、適当なマトリックスに結合したモノクローナル抗体または受容体サブユニットのような親和性試薬を使用して親和性精製できる場合がある。あるいは（または、さらに）、イオン交換、ゲルろ過、または疎水性クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーのようないずれかのクロマトグラフィー法を使用して、精製することができる。これらのまたは他のタンパク質精製法は、Enzymology，第１８２巻、「タンパク質精製のガイド（Guide to Protein Purification）」（ムレイ・ドイチャー（Murray Deutscher）編、アカデミックプレス（Academic Press）、サンジエゴ、カリホルニア州）（1990）に詳細に記載されている。タンパク質性状解析精製されたタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、電子噴霧質量スペクトル、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析される。タンパク質の定量は、アミノ酸組成、ＲＰ −ＨＰＬＣ、およびブラッドフォード（Bradford）タンパク質定量法により行われる。ある場合には、電子噴霧質量スペクトルとともにトリプシン性タンパク質マッピングを行って、タンパク質の本体を確認する。ＡＭＬ増殖測定法因子依存性細胞株ＡＭＬ１９３は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル（Rockville）、メリーランド州）から得られた。急性骨髄性白血病の患者から樹立されたこの細胞株は、ＧＭ−ＣＳＦ補足培地中で増殖の増強を示す増殖因子依存性細胞株である（ビー・ランゲ（Lange，B.）ら、B lodd 70:192，1987；エム・バルチエリ（Valtieri，M.）ら、J．Immunol．138:4 042，1987）。ヒトＩＬ−３の存在下でＡＭＬ１９３細胞が増殖できる能力も記載されている（ディー・サントリ（Santoli，D.）ら、J．Immunol．139:348，19 87）。細胞株変種であるＡＭＬ１９３１．３が使用され、これは増殖因子を洗浄し、増殖因子を２４時間不足させて、サイトカイン依存性ＡＭＬ１９３細胞を長期増殖に順応させた。次に細胞を２４ウェルプレート中で１００単位/mlのＩＬ−３を含有する培地に、１×１０⁵細胞／ウェルで再度広げた。細胞がＩＬ− ３中で急速に増殖するのに約２ヶ月を要した。以後、これらの細胞をＡＭＬ１９３１．３として、組織培養培地（下記参照）にヒトＩＬ−３を補足して維持した。冷ハンクス塩溶液（ＨＢＳＳ、ギブコ（Gibco）、グランドアイランド（Grand Island）、ニューヨーク州）中で細胞懸濁液を２５０×ｇで１０分間遠心分離し、次に上清をデカントして除去して、ＡＭＬ１９３１．３細胞を、６回洗浄する。ペレットになった細胞をＨＢＳＳに再懸濁し、この操作を６回の洗浄サイクルが完了するまで繰り返す。この操作で６回洗浄した細胞を、２×１０⁵〜５ ×１０⁵生存細胞／mlの範囲の密度で組織培養培地に再懸濁する。この培地は、イスコブ改変ダルベッコー培地（Iscove's modified Dulbecco's Medium）（ＩＭＤＭ、ヘーゼルトン（Hazelton）、レネクサ（Lenexa）、カンザス州）にアルブミン、トランスフェリン、脂質および２−メルカプトエタノールを補足して調製した。ウシアルブミン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer -Mannheim）、インディアポリス、インディアナ州）を５００μg/mlで加え、ヒトトランスフェリン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）、インディアポリス、インディアナ州）を１００μg/mlで加え、大豆脂質（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）、インディアポリス、インディアナ州）を５０ μg/mlで加え、２−メルカプトエタノール（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を５×１０^-5Ｍで加える。前述のように補足した組織培養培地中で三重のシリーズで、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストタンパク質の連続希釈物を、９６ウェルのコスター（Costar）３５９６組織培養プレート中に作成する。連続希釈が終了すると、各ウェルは、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストタンパク質を含有する培地５０μlを含有した。対照ウェルは、組織培養培地のみを含有した（陰性対照）。前述のように調製したＡＭＬ１９３１．３細胞懸濁液を５０μ１（２．５×１０⁴細胞）、ピペットで取って各ウェルに加える。組織培養プレートを、加湿空気中５％ＣＯ₂で３７℃で３日間インキュベートする。３日目に、０．５μCiの³Ｈ−チミジン（２Ci/mM、ニューイングランドヌクレア（New England Nuclear）、ボストン、マサチューセッツ州）を、５０μlの組織培養培地に加える。培養物を３７℃で加湿空気中５％ＣＯ₂で１８〜２４時問インキュベートする。トムテック（TOMTEC）細胞ハーべスター（トムテック（TOMTEC）、オレンジ（Orange）、コネチカット州）（これは、水洗サイクルの後に７０％エタノール洗浄サイクルがある）を使用して、細胞のＤＮＡをガラスフィルターマット（ファルマシア・エルケービー（Pharma cia LKB）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）に集める。フィルターマットを風乾し、次に試料バッグに入れ、ここにシンチレーション液（シンチバース（Scintiverse）II、フィッシャーサイエンティフィック（Fishe r Scientific）、セントルイス、ミズーリ州、またはベータプレートシンチレーションフルーイッド（BetaPlate Scintillation Fluid）、ファルマシアエルケービー（Pharmacia LKB）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を加える。各組織培養ウェルの試料のベータ放射線を、エルケービー・ベータプレート（LKB BetaPlate）モデル１２０５シンチレーションカウンター（ファルマシア・エルケービー（Pharmacla LKB）、ゲーサーズバーグ（Galthersbur g）、メリーランド州）中で計測し、データを各組織培養ウェルから細胞に取り込まれた³Ｈ−チミジンのｃｐｍとして表す。各Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストタンパク質調製物の活性は、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストの勾配濃度により誘導された細胞増殖（³Ｈ−チミジン取り込み）を測定することにより定量される。この測定法で典型的には、０．０５pM〜１０⁵p Mの濃度範囲が定量される。活性は、最大増殖の５０％（ＥＣ₅₀＝０．５×（試験したＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストのすべての濃度の三重培養物のウェル当たりの³Ｈ−チミジン取り込みの最大の平均カウント／分−因子が欠如している三重培養物で観察された³Ｈ−チミジン取り込みにより測定したバックグランド増殖））を与えるＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストタンパク質の用量を測定することにより定量される。このＥＣ₅₀値はまた、１単位の生物活性に等しい。相対的活性レベルを割り当てることができるように、未変性のインターロイキン−３およびＧ −ＣＳＦを参照標準物質として使用して測定を行う。典型的には、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストタンパク質は、２０００pM〜０．０６pMの濃度範囲で、連続２倍希釈物中で試験した。各試料の活性は、４係数ロジスティックモデルにデータを適合させて５０％の最大応答を与える濃度から求めた。試料の上のプラトー（最大応答）と比較した標準物質のプラトーは異ならないことが観察された。従って、各試料の相対的活性の計算は、試料と前述の標準物質のＥＣ⁵⁰推定から求めた。他のインビトロの細胞に基づく増殖測定法当業者に公知の他のインビトロの細胞に基づく増殖測定法も、ＡＭＬ１９３１．３細胞増殖測定法で記載した方法と類似の方法で、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストの活性を測定するのに有用である。トランスフェクション細胞株細胞株（例えば、ＢＨＫまたはマウスｐｒｏＢ細胞株Ｂａｆ／３）は、細胞が持っていないヒトＧ−ＣＳＦ受容体のようなコロニー刺激因子受容体でトランスフェクションすることができる。これらのトランスフェクションした細胞株を使用して、受容体がトランスフェクションされたリガンドの活性を測定することができる。例１ｐＭＯＮ３４８５の作製材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ３４８５中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号７）とＬ−１１開始点（配列番号３）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［３８停止点（配列番号８）とＬ−１１停止点（配列番号４）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７（ＷＯ９５／２１２５４号）内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。プライマー［３９開始点（配列番号７）と３８停止点（配列番号８）］を使用して、アニーリングした断片開始点と停止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷遺伝子を作成し増幅した。新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（M agic DNA Clean-up System kit）（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。プラスミドｐＭＯＮ３９３４（ｐＭＯＮ３３５９の誘導体）を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、約３８００塩基対のベクター断片を得て、これをゲル精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（E．coli）ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Life Tech nologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４８５と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４８５でトランスフェクションした。配列番号２５の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４８５は、以下のアミノ酸配列をコードする：例２ｐＭＯＮ３４８６の作製材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ３４８６中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号９）とＬ−１１開始点（配列番号３）］を使用して、プラスミドｐＭ０Ｎ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［９６停止点（配列番号１０）とＬ−１１停止点（配列番号４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。プライマー［９７開始点（配列番号９）と９６停止点（配列番号１０）］を使用して、アニーリングした断片開始点と停止点から、完全長の新しいＮ− 末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷遺伝子を作成し増幅した。新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（M agic DNA Clean-up System kit）を使用してゲル精製した。プラスミドｐＭＯＮ３９３４を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、約３８００塩基対のベクター断片を得て、これをゲル精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（E．coli）ＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４８６と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４８６でトランスフェクションした。配列番号２６の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４８６は、以下のアミノ酸配列をコードする：例３ｐＭＯＮ３４８７の作製材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ３４８７中に新しいＮ−末端 /C−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号１１）とＬ−１１開始点（配列番号３）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［１２５停止点（配列番号１２）とＬ−１１停止点（配列番号４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。ブライマー［１２６開始点（配列番号１１）と１２５停止点（配列番号１２）］を使用して、アニーリングした断片開始点と停止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷遺伝子を作成し増幅した。新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアッブシステムキット（M agic DNA Clean-up System kit）を使用して精製した。プラスミドｐＭＯＮ３９３４を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、約３８００塩基対のベクター断片を得て、これをゲル精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（E．coli）ＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４８７と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４８７でトランスフェクションした。配列番号２７の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４８７は、以下のアミノ酸配列をコードする：例４ｐＭＯＮ３４８８の作製材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ３４８８中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号１３）とＬ−１１開始点（配列番号３）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［１３２停止点（配列番号１４）とＬ−１１停止点（配列番号４）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。プライマー［１３３開始点（配列番号１３）と１３２停止点（配列番号１４）］を使用して、アニーリングした断片開始点と停止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷遺伝子を作成し増幅した。新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（M agic DNA Clean-up System kit）を使用して精製した。プラスミドｐＭＯＮ３９３４を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、約３８００塩基対のベクター断片を得て、これをゲル精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（E．coli）ＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４８８と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４８８でトランスフェクションした。配列番号２８の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４８８は、以下のアミノ酸配列をコードする：例５ｐＭＯＮ３４８９の作製材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ３４８９中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号１５）とＬ−１１開始点（配列番号３）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［１４１停止点（配列番号１６）とＬ−１１停止点（配列番号４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。プライマー［１４２開始点（配列番号１５）と１４１停止点（配列番号１６）］を使用して、アニーリングした断片開始点と停止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷遺伝子を作成し増幅した。新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（M agic DNA Clean-up System kit）を使用して精製した。プラスミドｐＭＯＮ３９３４を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、約３８００塩基対のベクター断片を得て、これをゲル精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（E．coli）ＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４８９と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４８９でトランスフェクションした。配列番号２９の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４８９は、以下のアミノ酸配列をコードする：例６ｐＭＯＮ３４９０の作製材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ３４９０中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号７）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号５）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［３８停止点（配列番号８）とＰ−ｂｌ停止点（配列番号６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片停止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、消化した断片開始点と停止点は、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏｌ−ＨｉｎｄIIIベクター断片と一緒にして、これに結合させた。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４９０と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４９０でトランスフェクションした。配列番号３０の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４９０は、以下のアミノ酸配列をコードする：例７ｐＭＯＮ３４９１の作製材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ３４９１中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号９）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号５）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［９６停止点（配列番号１０）とＰ−ｂｌ停止点（配列番号６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片停止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、消化した断片開始点と停止点は、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏｌ−ＨｉｎｄIIIベクター断片と一緒にして、これに結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（E．col i）ＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４９１と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４９１でトランスフェクションした。配列番号３１の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４９１は、以下のアミノ酸配列をコードする：例８ｐＭＯＮ３４９２の作製材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ３４９２中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号１１）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号５）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［１２５停止点（配列番号１２）とＰ−ｂｌ停止点（配列番号６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片停止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、消化した断片開始点と停止点は、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片と一緒にして、これに結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（ E．coli）ＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４９２と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４９２でトランスフェクションした。配列番号３２の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４９２は、以下のアミノ酸配列をコードする：例９ｐＭＯＮ３４９３の作製材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ３４９３中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号１３）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号５）］を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［１３２停止点（配列番号１４）とＰ−ｂｌ停止点（配列番号６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片停止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、消化した断片開始点と停止点は、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏｌ−ＨｉｎｄIIIベクター断片と一緒にして、これに結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（ E．coli）ＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４９３と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４９３でトランスフェクションした。配列番号３３の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４９３は、以下のアミノ酸配列をコードする：例１０ｐＭＯＮ３４９４の作製材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ３４９４中に新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。ブライマーセット［１４２開始点（配列番号１５）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号５）］を使用して、プラスミドｐＭ０Ｎ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［１４１停止点（配列番号１６）とＰ−ｂｌ停止点（配列番号６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷配列から断片停止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片停止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、消化した断片開始点と停止点は、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏｌ−ＨｉｎｄIIIベクター断片と一緒にして、これに結合させた。結合反応物の一部を用いて、大腸菌（E．c oli）ＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３４９４と名付けた。タンパク質の発現とバイオアッセイのために、ＢＨＫ細胞をプラスミドｐＭＯＮ３４９４でトランスフェクションした。配列番号３４の遺伝子配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３４９４は、以下のアミノ酸配列をコードする：例１１〜２０例１〜１０のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストをコードする遺伝子は、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片としてＢＨＫベクターから切り出し、ｐＭＯＮ２３４１（ＷＯ９４／１２６３８号）の約３６３０塩基対のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIベクター断片と結合させた。得られたプラスミド（例１１〜２０）を表４に示す。プラスミドを大腸菌（E．coli）株ＪＭ１０１に形質転換し、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストタンパク質の発現を評価した。発現されたタンパク質は、すぐ前にメチオニン −アラニンジペプチドが存在したことを除いて、親ＢＨＫ発現ベクターで発現されたものと同じであり、メチオニンはメチオニンアミノペプチダーゼにより処理して除去される。一晩増殖させた細胞（２０クレット（Klette）単位）を、ビタミンＢ１と微量のミネラルを補足した最小Ｍ９培地１０mlに接種し、最初のクレット（ Klette）の読み値が約１２０単位になるまで３７℃で振盪してインキュベートした。１２０クレット（Klette）単位の時、５０μlの１０mg/mlナリジキシン酸を加えた。誘導の４時間後、１mlのアリコートを取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質発現を解析した。光学顕微鏡を使用して、細胞を封入体の存在についても試験した。ｐＭＯＮ３４５０とｐＭＯＮ３４５５のみが、タンパク質に対してＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの有意な発現レベルを有した。Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストの発現レベルを改良するために、遺伝子の５’末端を再操作して、ユニークなＮｃｏＩとＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の間にＡＴの豊富なコドンと大腸菌（E．coli）好適コドンを取り込んだ（例２１〜２８）。表４大腸菌（E．coli）発現プラスミド例２１ｐＭＯＮ２５１８４の作製合成オリゴマーの相補対［１４１ｆｏｒ．ｓｅｑ（配列番号２３）と１４１ｒｅｖ．ｓｅｑ（配列番号２４）］（ミッドランドサーティフアイドリエージェント社（Midland Certified Reagent Co.）、ミッドランド（Midland）、テキサス州）を、２０μlの反応混合物［２０mMトリス−塩酸（７．５）、１０mM ＭｇＣｌ₂、および５０mM ＮａＣｌを含有）中の２μgの各合成オリゴマーを８０℃で５分間加熱し、周囲温度までゆっくり（約４５分間）冷却してアニーリングさせた。アニーリングが充分な時は、オリゴマーは５’末端にＮｃｏＩ部位を形成し３’末端にＮｈｅＩ部位を形成する。約１５ngのアニーリングしたオリゴマー対を、ｐＭＯＮ３４５４のゲル精製した約４１２０塩基対のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩベクター断片と結合させた（およそのモル比１０：１）。得られた遺伝子は、遺伝子の５’末端に７つのコドンの変化を有した。結合反応物を使用して大腸菌（E ． coli）株ＤＨ５αを形質転換し、目的のコドンの変化をＤＮＡ配列解析により確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ２５１８４と名付けた。プラスミド（配列番号３８の遺伝子配列を含有するｐＭＯＮ２５１８４）ＤＮＡを、タンパク質発現のために大腸菌（E．coli）株ＪＭ１０１細胞に再形質転換した。発現されたタンパク質は、ｐＭＯＮ３４５４から発現されたものと同じである。例２２ｐＭＯＮ２５１８８の作製合成オリゴマーの相補対［１４１ｆｏｒ．ｓｅｑ（配列番号２３）と１４１ｒｅｖ．ｓｅｑ（配列番号２４）］（ミッドランドサーティファイドリエージェント社（Midland Certified Reagent Co.）、ミッドランド（Midland）、テキサス州）を、２０μlの反応混合物［２０mMトリス−塩酸（７．５）、１０mM ＭｇＣｌ₂、および５０mM ＮａＣｌを含有）中の２μgの各合成オリゴマーを８０℃で５分間加熱し、周囲温度までゆっくり（約４５分間）冷却してアニーリングさせた。アニーリングが充分な時は、オリゴマーは５’末端にＮｃｏＩ部位を形成し３’末端にＮｈｅＩ部位を形成する。約１５ngのアニーリングしたオリゴマー対を、約４１１０塩基対のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩゲル精製したｐＭＯＮ３４５９と結合させた（およそのモル比１０：１）。結合反応物を使用して大腸菌（E．coli ）株ＤＨ５αを形質転換し、目的のコドンの変化をＤＮＡ配列解析により確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ２５１８８と名付けた。得られた遺伝子は、遺伝子の５’末端に７つのコドンの変化を有した。プラスミド（配列番号４２の遺伝子配列を含有するｐＭＯＮ２５１８８）ＤＮＡを、タンパク質発現のために大腸菌（E．coli）株ＪＭ１０１細胞に再形質転換した。発現されたタンパク質は、ｐＭＯＮ３４５９から発現されたものと同じである。例２３ｐＭＯＮ２５１８３の作製重複ＰＣＲプライマー法を使用してｐＭＯＮ２５１８３を作製した。合成オリゴマー［１３２ｆｏｒ．ｓｅｑ（配列番号３２１）と１３２ｒｅｖ．ｓｅｑ（配列番号２２）］は、それぞれＮｃｏＩとＮｈｅＩ制限認識配列をコードする。ＰＣＲオプチマイザーキット（PCR Optimizer Kit）（インビトロゲン（InVitroge n））を使用してＤＮＡポリメラーゼチェイン増幅法により、増幅ＤＮＡを作成した。製造業者のすすめる条件により、パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を使用して、５×緩衝液Ｂ［３００mMトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、７５mM（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１０mM ＭｇＣｌ₂）を使用して、９４℃で１分、６５℃で２分、および７２℃で２分を７サイクル、次に９４℃で１分、および７２℃で３分を２０サイクル、そして最後に７２℃で７分を１サイクル行って、ＰＣＲ反応を行った。反応生成物をセントリセップ（Centri-Sep）スピンカラム（プリンストンセパレーションズ（Princeton Separations））を製造業者のすすめるプロトコールに従って使用して脱塩し、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、ジーンクリーン（ Gene Clean）（バイオ１０１（Bio 101））を使用してＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製し、ＤＮＡ生成物をｄＨ₂Ｏで溶出した。精製したＰＣＲ産物を、約４０９０塩基対のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩｐＭＯＮ３４５３ベクター断片に結合させた。ＡＴの豊富な置換挿入体を含有する陽性クローンを、例２１に記載したように同定した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ２５１８３と名付けた。得られた遺伝子は、遺伝子の５’末端に１４のコドンの変化を有した。プラスミド（配列番号３７の遺伝子配列を含有するｐＭＯＮ２５１８３）ＤＮＡを、タンパク質発現のために大腸菌（E．coli）株ＪＭ１０１細胞に再形質転換した。発現されたタンパク質は、ｐＭＯＮ３４５３から発現されたものと同じである。例２４ｐＭＯＮ２５１８７の作製重複ＰＣＲプライマー法を使用してｐＭＯＮ２５１８７を作製した。合成オリゴマー［１３２ｆｏｒ．ｓｅｑ（配列番号２１）と１３２ｒｅｖ．ｓｅｑ（配列番号２２）］は、それぞれＮｃｏＩとＮｈｅＩ制限認識配列をコードする。ＰＣＲオプチマイザーキット（PCR Optimizer Kit）（インビトロゲン（Invitrogen ））を使用してＤＮＡポリメラーゼチェイン増幅法により、増幅ＤＮＡを作成した。製造業者のすすめる条件により、パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を使用して、５×緩衝液Ｂ中で、９４℃で１分、６５℃で２分、および７２℃で２分を７サイクル、次に９４℃で１分、および７２℃で３分を２０サイクル、そして最後に７２℃で７分を１サイクル行って、ＰＣＲ反応を行った。反応生成物をセントリセップ（Centri-Sep）スピンカラム（プリンストンセパレーションズ（ princeton Separations））を製造業者のすすめるプロトコールに従って使用して脱塩し、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、ジーンクリーン（Gene Clean）（バイオ１０１（Bio 101））を使用してＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製し、ＤＮＡ生成物をｄＨ₂Ｏで溶出した。精製したＰＣＲ産物を、約４０８０塩基対のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩｐＭＯＮ３４５８ベクター断片に結合させた。ＡＴの豊富な置換挿入体を含有する陽性クローンを、例２１に記載したように同定した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ２５１８７と名付けた。得られた遺伝子は、遺伝子の５’末端に１４のコドンの変化を有した。プラスミド（配列番号４１の遺伝子配列を含有するｐＭＯＮ２５１８７）ＤＮＡを、タンパク質発現のために大腸菌（E．coli）株ＪＭ１０１細胞に再形質転換した。発現されたタンパク質は、ｐＭＯＮ３４５８から発現されたものと同じである。例２５ｐＭＯＮ２５１８２の作製例２３に記載した重複ＰＣＲプライマー法を使用してｐＭＯＮ２５１８２を作製した。合成オリゴマープライマー［１２５ｆｏｒ．ｓｅｑ（配列番号１９）と１２５ｒｅｖ．ｓｅｑ（配列番号２０）］をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応条件は、最初の７サイクルのアニーリング温度が６０℃であることを除いて例２３で使用された条件と同一とした。精製したＰＣＲ産物を、約４０７０塩基対のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩｐＭＯＮ３４５２ベクター断片に結合させた。ＡＴの豊富な置換挿入体を含有する陽性クローンを、例２１に記載したように同定した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ２５１８２と名付けた。得られた遺伝子は、遺伝子の５’末端に１９のコドンの変化を有した。プラスミド（配列番号３６の遺伝子配列を含有するｐＭＯＮ２５１８２）ＤＮＡを、タンパク質発現のために大腸菌（E．coli）株ＪＭ１０１細胞に再形質転換した。発現されたタンパク質は、ｐＭＯＮ３４５２から発現されたものと同じである。例２６ｐＭＯＮ２５１８６の作製例２３に記載した重複ＰＣＲプライマー法を使用してｐＭＯＮ２５１８６を作製した。合成オリゴマープライマー［１２５ｆｏｒ．ｓｅｑ（配列番号１９）と１２５ｒｅｖ．ｓｅｑ（配列番号２０）］をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応条件は、最初の７サイクルのアニーリング温度が６０℃であることを除いて例２３で使用された条件と同一とした。精製したＰＣＲ産物を、約４０６０塩基対のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩｐＭＯＮ３４５７ベクター断片に結合させた。ＡＴの豊富な置換挿入体を含有する陽性クローンを、例２１に記載したように同定した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ２５１８６と名付けた。得られた遺伝子は、遺伝子の５’末端に１９のコドンの変化を有した。プラスミド（配列番号４０の遺伝子配列を含有するｐＭＯＮ２５１８６）ＤＮＡを、タンパク質発現のために大腸菌（E．coli）株ＪＭ１０１細胞に再形質転換した。発現されたタンパク質は、ｐＭＯＮ３４５７から発現されたものと同じである。例２７ｐＭＯＮ２５１８１の作製オリゴマー［９６ｆｏｒ．ｓｅｑ（配列番号１７）と９６ｒｅｖ．ｓｅｑ（配列番号１８）］を使用して、鋳型としてｐＭＯＮ３４５１からＤＮＡ断片を増幅するためにＰＣＲを用いて、ｐＭＯＮ２５１８１を作製した。オリゴマー９６ｆｏｒ．ｓｅｑは、６コドンの変化を起こすように設計された。ＰＣＲ反応条件は、１０ngのｐＭＯＮ３４５１プラスミドＤＮＡを加えたことを除いて、例２５に記載した条件と同じであった。精製したＰＣＲ産物を、約３９８０塩基対のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩｐＭＯＮ３４５１ベクター断片に結合させた。ＡＴの豊富な置換挿入体を含有する陽性クローンを、例２１に記載したように同定した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ２５１８１と名付けた。得られた遺伝子は、遺伝子の５ ’末端に６コドンの変化を有した。プラスミド（配列番号３５の遺伝子配列を含有するｐＭＯＮ２５１８１）ＤＮＡを、タンパク質発現のために大腸菌（E．col i）株ＪＭ１０１細胞に再形質転換した。発現されたタンパク質は、ｐＭＯＮ３４５１から発現されたものと同じである。例２８ｐＭＯＮ２５１８５の作製オリゴマー［９６ｆｏｒ．ｓｅｑ（配列番号１７）と９６ｒｅｖ．ｓｅｑ（配列番号１８）］を使用して、鋳型としてｐＭＯＮ３４５１からＤＮＡ断片を増幅するためにＰＣＲを用いて、ｐＭＯＮ２５１８５を作製した。オリゴマー９６９７ｆｏｒ．ｓｅｑは、６コドンの変化を起こすように設計された。ＰＣＲ反応条件は、１０ngのpＭＯＮ３４５６プラスミドＤＮＡを加えたことを除いて、例２５に記載した条件と同じであった。精製したＰＣＲ産物を、約３９７０塩基対のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩｐＭＯＮ３４５６ベクター断片に結合させた。ＡＴの豊富な置換挿入体を含有する陽性クローンを、例２１に記載したように同定した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ２５１８５と名付けた。得られた遺伝子は、遺伝子の５’末端に６コドンの変化を有した。プラスミド（配列番号３９の遺伝子配列を含有するｐＭＯＮ２５１８５）ＤＮＡを、タンパク質発現のために大腸菌（E ．coli）株ＪＭ１０１細胞に再形質転換した。発現されたタンパク質は、ｐＭＯＮ３４５６から発現されたものと同じである。例２９本発明のＧ−ＣＳＦアミノ酸置換変種は、ＷＯ９４／１２６３９号およびＷＯ９４／１２６３８号に記載のＰＣＲ突然変異誘発法を使用して作成した。これらおよび他の変種（すなわち、アミノ酸置換体、挿入体または欠失体、およびＮ− 末端またはＣ−末端伸長体）は、合成遺伝子組立または部位特異的突然変異誘発を含む種々の他の方法（テーラー（Taylor）ら、Nucl．Acids Res.，13:7864-87 85，1985；クンケル（Kunkel）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:488-492， 1985；サムブルーク（Sambrook）ら、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク州、1 989、ＷＯ９４／１２６３９号およびＷＯ９４／１２６３８号）を使用して、当業者は作成することができる。これらの置換体は、１回に１つ、または他のアミノ酸置換体、および／または欠失体、および／または挿入体および／または伸長体と組合せて、作成することができる。変化の配列の証明後、産生のために、プラスミドＤＮＡを適切な哺乳動物細胞、昆虫細胞または細菌株（例えば、大腸菌（E．coli））にトランスフェクションすることができる。活性のあるＧ−ＣＳＦの既知の変種は、１位（ＴｈｒからＳｅｒ、ＡｒｇからＧｌｙ）、２位（ＰｒｏからＬｅｕ）、３位（ＬｅｕからＡｒｇまたはＳｅｒ）、および１７位（ＣｙｓからＳｅｒ）の置換、およびアミノ酸１〜１１の欠失を含む（クガ（Kuga）ら、Biochemical and Biophysical Research Comm．159:103-111，1989）。これらのＧ−ＣＳＦアミノ酸置換変種は、他の例で記載したようにアミノ酸配列の並べ替えの鋳型配列として作用すると理解される。Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換変種の生物活性測定Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換変種は、Ｂａｆ／３細胞株（ヒトＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクションした）増殖測定法で測定して、未変性のＧ−ＣＳＦに対する相対的生物活性を測定した。試験したＧ−ＣＳＦ変種とその相対的生物活性を、表５に示す。「＋」は、活性が未変性のＧ−ＣＳＦに匹敵することを示し、「 −」は、活性が有意に低下しているかまたは検出できないことを示す。表５ヒトＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクションしたＢａｆ／３細胞株中のＧ−ＣＳＦ変種の細胞増殖活性表５（続き）表５（続き）表５（続き）例３０〜３７例３０〜３７は、鋳型としてプラスミドｐＭＯＮ１３０３７を用い、表６に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、例６に記載の方法と類似の方法で作成した。得られる遺伝子、および記載したプラスミドｐＭＯＮ＃とコードされるタンパク質を、表６に示す。表６ｐＭＯＮ３６４０、ｐＭＯＮ３４６１、ｐＭＯＮ３４６２、ｐＭＯＮ３４６３、ｐＭＯＮ３４６４、ｐＭＯＮ３４６５、ｐＭＯＮ３４６６およびｐＭＯＮ３４６７中のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニスト遺伝子を、大腸菌（E．coli）発現ベクター（ｐＭＯＮ２３４１）に、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII制限断片として移して、それぞれｐＭＯＮ３４６８、ｐＭＯＮ３４６９、ｐＭＯＮ３４７０、ｐＭＯＮ３４７１、ｐＭＯＮ３４７２、ｐＭＯＮ３４７３、ｐＭＯＮ３４７４およびｐＭＯＮ３４９８を得た。例３８プラスミド（ｐＭＯＮ３４６８）は、大腸菌（E．coli）中で目的のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストは低い発現レベルであった。遺伝子の５’末端を再設計して、発現レベルを上げるために、ＡＴの豊富なコドン選択を使用した。オリゴヌクレオチドＺ４８４９ＡＴ．ｆｏｒ（配列番号８４）とＺ４８４９ＡＴ．ｒｅｖ（配列番号８５）を使用して、遺伝子を再構成した。遺伝子（配列番号９４）を含有する得られるプラスミドｐＭＯＮ３４９９は、配列番号１０３のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストをコードする。例３９Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストを、Ｂａｆ／３細胞株（ヒトＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクションした）（Ｂａｆ／３−Ｇ−ＣＳＦ）増殖測定法で測定して、未変性のＧ−ＣＳＦに対する相対的生物活性を測定した。受容体アゴニストの活性を、表７に示す。表７Ｂａｆ／３−Ｇ−ＣＳＦ細胞増殖測定法でのＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストの活性変種の遺伝子、組換えタンパク質発現、タンパク質精製、タンパク質性状解析、生物活性測定のさらなる方法は、ＷＯ９４／１２６３９号、ＷＯ９４／１２６３８号、ＷＯ９５／２０９７６号、ＷＯ９５／２１１９７号、ＷＯ９５／２０９７７号、ＷＯ９５／２１２５４号（これらは、参考のためその全体が本明細書に組み込まれる）に見いだされる。本明細書に引用したすべての文献、特許または出願は、参考のためその全体があたかも本明細書で記載されたように本明細書に組み込まれる。本明細書の開示を読んだ後、当業者は本発明の精神と範囲を逸脱することなく、種々の他の例が明らかであろう。しかし、そのような他のすべての例は、添付の請求の範囲の範囲内に含有されると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ０７Ｋ 14/535 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クライン，バーバラ，ケイ. アメリカ合衆国63131 ミズーリ州セントルイス，トッピングイーステイツドライブ 12917 (72)発明者マックファーター，チャールズ，エイ. アメリカ合衆国63011 ミズーリ州ワイルドウッド，サンダーヘッドキャニヨンコート 16564 (72)発明者フェン，イイクインアメリカ合衆国63130 ミズーリ州セントルイス，ミッションコート 423 (72)発明者マッキャン，ジョン，ピー. アメリカ合衆国63038 ミズーリ州セントルイス，バブラーメドウズドライブ 18612 (72)発明者ブラフォード−ゴールドバーグ，サラ，ルースアメリカ合衆国63108 ミズーリ州セントルイス，ウエストパインナンバー10 4111

Claims

【特許請求の範囲】１．式［式中、１位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ＴｙｒまたはＧｌｙであり、２位のＸａａは、ＰｒｏまたはＬｅｕであり、３位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＴｙｒまたはＳｅｒであり、１３位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＴｈｒまたはＰｒｏであり、１６位のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり、１７位のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり、１８位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＣｙｓであり、２２位のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｌａであり、２４位のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｙｒまたはＬｅｕであり、２７位のＸａａは、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり、３０位のＸａａは、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＧｌｙであり、３４位のＸａａは、ＬｙｓまたはＳｅｒであり、３６位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、４２位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、４３位のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＣｙｓまたはＬｅｕであり、４４位のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＴｈｒであり、４６位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＡｌａであり、４７位のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒであり、４９位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり、５０位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、５４位のＸａａは、ＬｅｕまたはＨｉｓであり、６４位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、６７位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＣｙｓであり、７０位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり、７４位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、１０４位のＸａａは、Ａｓｐ、ＧｌｙまたはＶａｌであり、１０８位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＧｌｙであり、１１５位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＡｌａであり、１２０位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、１２３位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＰｈｅまたはＴｈｒであり、１４４位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、１４６位のＸａａは、ＡｒｇまたはＧｌｎであり、１４７位のＸａａは、ＡｒｇまたはＧｌｎであり、１５６位のＸａａは、Ｈｉｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、１５９位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｙであり、１６２位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、１６３位のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＡｌａであり、１６９位のＸａａは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＣｙｓであり、１７０位のＸａａは、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり、Ｎ−末端から１〜１１アミノ酸、およびＣ−末端から１〜５アミノ酸は随時欠失させることができ、Ｎ−末端は、直接、またはＮ−末端をＣ−末端に結合させることができ、アミノ酸：で新しいＣ−末端およびＮ−末端を有することができるリンカーを介して、Ｃ− 末端に結合され、そしてＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドは、随時すぐ前に（メチオニン^-1）、（アラニン^-1）、または（メチオニン^-2、アラニン^-1）があってもよい］の修飾Ｇ−ＣＳＦアミノ酸配列からなる、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチド。２．請求の範囲第１項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドであって、リンカーは、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号２）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号６１）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号６２）、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号６３）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号６４）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号６５）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号６６）、およびＧｌｙＧｌｙＳｅｒＡｓｐＭｅｔＡｌａＧｌｙ（配列番号６７）。よりなる群から選択される、上記ポリペプチド。３．請求の範囲第１項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドであって、ポリペプチドは、よりなる群から選択される、上記ポリペプチド。４．請求の範囲第１項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる核酸分子。５．請求の範囲第２項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる核酸分子。６．請求の範囲第３項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる核酸分子。７．請求の範囲第６項に記載の核酸分子であって、よりなる群から選択される、上記分子。８．Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドの製造方法であって、請求の範囲第４、５、６、または７項に記載の核酸分子からなる複製可能なベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドの発現を可能にする方法で、適切な栄養条件下で増殖させ、そしてこのヒトＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドを回収することからなる、上記方法。９．請求の範囲第１、２、または３項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドと、薬剤学的に許容される担体と、からなる組成物。１０．請求の範囲第１、２、または３項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチド；コロニー刺激因子；および薬剤学的に許容される担体、からなる組成物。１１．請求の範囲第１、２、または３項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチド；ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ −１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、好酸球分化因子、および幹細胞因子よりなる群から選択されるコロニー刺激因子；および、薬剤学的に許容される担体、からなる組成物。１２．請求の範囲第１、２、または３項に記載のＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリペプチドを患者に投与する工程からなる、患者の造血細胞の産生を刺激する方法。１３．請求の範囲第９、１０または１１項に記載の組成物を患者に投与する工程からなる、患者の造血細胞の産生を刺激する方法。１４．幹細胞の選択的エクスビボ拡張方法であって、（ａ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｂ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、または３項に記載のポリペプチドを含む選択された培地で培養し、そして（ｃ）培養細胞を採取する、工程からなる上記方法。１５．幹細胞の選択的エクスビボ拡張方法であって、（ａ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｂ）分離した幹細胞を、請求の範囲第９、１０、または１１項に記載の組成物を含む選択された培地で培養し、そして（ｃ）培養細胞を採取する、工程からなる上記方法。１６．造血障害を有する患者の治療方法であって、（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、または３項に記載のポリペプチドを含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞を採取し、そして（ｅ）培養した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。１７．造血障害を有する患者の治療方法であって、（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第９項に記載の組成物を含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞を採取し、そして（ｅ）培養した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。１８．造血障害を有する患者の治療方法であって、（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１０項に記載の組成物を含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞を採取し、そして（ｅ）培養した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。１９．造血障害を有する患者の治療方法であって、（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１１項に記載の組成物を含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞を採取し、そして（ｅ）培養した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。２０．ヒトの遺伝子治療法であって、（ａ）患者から幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、または３項に記載の造血タンパク質を含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞にＤＮＡを導入し、（ｅ）形質導入した細胞を採取し、そして（ｆ）形質導入した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。２１．ヒトの遺伝子治療法であって、（ａ）患者から幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第９項に記載の組成物を含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞にＤＮＡを導入し、（ｅ）形質導入した細胞を採取し、そして（ｆ）形質導入した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。２２．ヒトの遺伝子治療法であって、（ａ）患者から幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１０項に記載の組成物を含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞にＤＮＡを導入し、（ｅ）形質導入した細胞を採取し、そして（ｆ）形質導入した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。２３．ヒトの遺伝子治療法であって、（ａ）患者から幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１１項に記載の組成物を含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞にＤＮＡを導入し、（ｅ）形質導入した細胞を採取し、そして（ｆ）形質導入した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。２４．幹細胞は末梢血から単離される、請求の範囲第１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３項に記載の方法。