JP2002517472A

JP2002517472A - レクチンおよび血液凝固因子からなる結合体

Info

Publication number: JP2002517472A
Application number: JP2000553140A
Authority: JP
Inventors: ペータートゥレツェック，; フランツガボア，; ミカエルウィルス，
Original assignee: バクスターアー．ゲー．
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2002-06-18
Also published as: AU4121899A; EP1089762A1; WO1999064072A1

Abstract

(57)【要約】血液から回収可能なタンパク質に、投与に安定な様式において結合されたレクチンを含む、薬学的調製物が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、レクチンおよび薬学的作用物質を含む、薬学的調製物に関する。

【０００２】薬物標的化（ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｉｎｇ）の概念は、多くの薬物が取り込
みまたは作用のそれらの細胞部位に関して選択的ではないとい事実に基づく。特
に、癌の化学療法の分野において、非標的細胞において使用される薬物物質の作
用は、首尾良い治療を危うくし得る望ましくない重篤な副作用を生じる（１）。
特定の標的細胞への標的化された薬物物質の送達の実現は、今までは、罹患した
（標的）細胞と特異的に相互作用し得る適切なキャリア分子を発見することが非
常に困難であることにより妨害されている。バイオテクノロジーの進歩により、
特定の部位に特異的に結合し得るモノクローナル抗体（２）および組換えタンパ
ク質（３）は、活性かつ標的化された薬物送達についてかなり有望な候補体とし
て確立された。さらに、コロイド状粒子（例えば、アルブミンまたはポリスチレ
ンミクロスフェア）は、薬物を特定の区画に受動的に輸送するために使用された
（４、５）。

【０００３】細胞／細胞相互作用および細胞／マトリックス相互作用における、生物学的な
シグナル伝達において重要な役割を果たすレクチンは、標的化された薬物投与の
ために使用されることが予測される、１つのさらなる分子のグループである。レ
クチン（もともとは、植物抽出物中のタンパク質として同定された）、特定のオ
リゴサッカリドグループに結合し得ることが公知である（６）。この炭水化物特
異的相互作用を利用して、標的特異的薬物送達（「ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ
」）系においてレクチンを使用することが提唱された（７）。なぜなら、細胞の
グリコシル化パターンは、悪性の形質転換の後に変更されるからである（８）。

【０００４】コムギ麦芽凝集素（ｗｈｅａｔｇｅｒｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＷＧＡ）
は、３５ｋＤＡの分子量を有する２つの同一のサブユニットからなる二量体の無
炭水化物タンパク質である。各々の単量体サブユニットは、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンについての２つの同一かつ独立した結合部位を含む（９）。約３０
０ｍｇＷＧＡ／ｋｇを含む胚芽コムギ（１０）は、ヒトの通常の栄養に属する
ことから、経口毒性は、無視し得るはずである。ＷＧＡは、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミン含有構造に特異的に結合する。蛍光標識したレクチンを用いる飽和
分析によって、結腸癌細胞（Ｃａｃｏ−２細胞）のＷＧＡ結合能力は、ヒト結腸
細胞のその能力の１３倍高いことが見出された。（１１）。

【０００５】従って、本発明の課題は、標的細胞の認識におけるレクチン系の利点が、標的
細胞における実質的な副作用（特に、毒性の副作用）または非標的細胞に対する
作用によって生じる副作用を生じずに、特定の標的細胞への薬物の標的特異的な
送達に利用され得る薬学的調製物を提供することである。

【０００６】本発明に従って、この課題は、血液から回収可能なタンパク質（特に、血液凝
固因子）またはその組換え等価物が投与に安定な様式で結合されたレクチンを含
む、薬学的調製物によって解決される。

【０００７】レクチンとして、好ましくは、植物起源のレクチンが使用され、ここで主に、
ヒトの通常の栄養源として知られるような植物（例えばまた、コムギ、ダイズ、
コメ、マメ、オオムギ、ライムギなど）のレクチンが使用される。ほとんどの公
知のレクチンについて、レクチンの特異性は、既に十分記載されている（Ｓｔｒ
ｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（１９９４）、３３１および３５９
頁、Ｒｏｅｍｐｐ，Ｃｈｅｍｉｅｌｅｘｉｋｏｎ，第１０版（１９９７）、２３
８２−２３８４頁を参照のこと）。しかし、公知の方法によっても分析され得る
（例えば、新たに発見されたレクチンまたは改変レクチンについて）。これは、
特に、選択された標的細胞の特定の炭水化物構造についてのそれぞれの結合特異
性に適用される。

【０００８】本発明の範囲内で、好ましくはまた、長い間公知でありかつ十分に記載されて
いる、例えば、コンカナバリンＡ、アブリン、リシン、フェイシン（Ｐｈａｓｉ
ｎ）またはＷＧＡのようなレクチンが使用される。なぜなら、これらの系におい
てまた、改変は、多大な出費を伴わずに行われ得るからである。このような改変
（例えば、血液から回収可能なタンパク質への結合部位に関して、または標的細
胞の炭水化物構造についての認識領域において）はまた、あまり十分に記載され
ていないかまたは完全に新規なレクチンにおいて、当業者に公知の方法によって
行い得るが、これは、ほとんどの場合において、公知のレクチンをにおけるより
骨が折れる。

【０００９】本発明に従って、ＷＧＡの利用が、特に実証された。なぜなら、これは、特に
、少しの経口毒性もなく、そして悪性細胞に対して高度な特異性を有するからで
ある。特に、結腸癌細胞に対するその高度な特異性のために、ＷＧＡは、これら
の細胞への標的特異的薬物送達において特に適切である。本発明に従って、ＷＧ
Ａとは、（ネイティブの）ＷＧＡの本質的な特性を有するかまたは結合特性が標
的化されかつ制御的に変更されている、化学的に改変されたＷＧＡ分子またはＷ
ＧＡ誘導体と理解される。

【００１０】本発明に従って、投与に安定な化合物とは、その保存、その投与、および患者
における標的部位へのその経路において本発明に従う調製物の十分な安定性が保
証される化合物であると理解される。この化合物が標的区画においてレクチンと
血液から回収可能なタンパク質との間を切断され得ること、またはその薬物が別
の様式におけるその効果を発揮することもまた、必須である。従って、例えば、
酸または塩基に対して不安定である（ｐＨ感受性）化合物、または標的区画特異
的酵素（例えば、プロテアーゼまたはヌクレアーゼ）によって切断され得る化合
物が使用される。本発明の範囲内で、標的区画とは、例えば、細胞、組織、また
は組織の部分（特に、血液または組織液）であると理解される。

【００１１】本発明に従って調製物は、標的細胞に対して高度な抗増殖効果を示す。なぜな
ら、血液から回収可能な結合体化タンパク質は、容易かつ効果的に、標的細胞ま
たは標的区画にそれぞれ取り込まれる。従って、本発明に従う調製物の細胞内蓄
積が生じる。ＷＧＡ系において、酸に不安定なシス−アコニチル（ａｃｏｎｉｔ
ｙｌ）化合物は、標的細胞のリボソーム領域においてはじめて、血液から回収可
能なタンパク質の放出を可能にする。

【００１２】血液から回収可能であり、かつ本発明において使用されるタンパク質として、
基本的に、レクチンとの結合を形成し得るどの血液タンパク質またはその組換え
等価物も適切である。この結合はまた、ネイティブなレクチンとの結合が可能で
ない場合、特定の結合部位またはアミノ酸側鎖の改変によって可能になり得る。
血液から回収可能な公知のタンパク質から逸脱して、本発明に特に適切な誘導体
化された血液タンパク質はまた、レクチンに結合し得るように「設計（ｄｅｓｉ
ｇｎ）」され得る。糖衣（Ｇｌｙｃｏｃａｌｙｘ）（全ての真核生物を取り囲み
、そして膜に局在する糖タンパク質および糖脂質からなる組織特異的多糖層）の
異常な変化（これはしばしば、悪性の形質転換と関連する）により、本発明に従
うレクチン−薬物標的（ｄｒｕｇｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は、細胞増殖抑制性剤
または癌処置剤の投与に素晴らしく適している。

【００１３】本発明に従って使用される血液タンパク質の例としては、凝固因子（例えば、
プロトロンビンまたは第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、
第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、もしくは第ＸＩＩＩ因子、ｚＷＦ）、イ
ンヒビター（例えば、ＡＴＩＩＩ）、またはヘパリン、プロテインＣ、プロテイ
ンＳ、α₁酸糖タンパク質、あるいは組織因子、ならびに必要に応じてこれらの
タンパク質の前駆体が挙げられる。

【００１４】これらの物質（例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ））は、好ましくは、酸に不
安定な結合（例えば、ＷＧＡに対するシス−アコニチル架橋）を介して結合され
得る、そしてまた、本発明を例示するためのモデル例として使用され得る。ＷＧ
ＡへのＤＯＸの２工程カップリング反応（実施例を参照のこと）は、２４ｍｏｌ
ＤＯＸ／ｍｏｌＷＧＡの置換度を有する水溶性プロドラッグ（ＤＯＸ−ＷＧ
Ａ）を生じることが示される。このプロドラッグは、中性環境において安定であ
り、ｐＨ４．０では、ＷＧＡに結合したＤＯＸの４６±７％が、２４時間以内に
放出される。従って、この細胞増殖抑制剤は、リボソーム内の酸性環境において
始めて利用可能となる。結腸癌細胞のＤＸ−ＷＧＡ結合能力は、ヒト結腸細胞お
よびリンパ芽球ＭＯＬＴ−４細胞のその能力よりも少なくとも４．５倍高く、赤
血球への結合は測定不可能である。

【００１５】この結合体からの薬物の放出速度を考慮して、癌細胞に置ける結合体形態のこ
の薬物の細胞増殖抑制作用は、遊離の細胞増殖抑制剤のその作用よりも少なくと
も１．５倍高い。しかし、リンパ芽球に対するＤＯＸ−ＷＧＡの抗増殖効果は、
遊離の活性剤のその効果より６５％低い。しかし、遊離の活性剤とは対照的に、
副作用の割合の莫大な減少は、本発明の標的特異的送達によって可能であり、非
標的細胞に対するよりわずかな有害作用によるか、または細胞増殖抑制剤の使用
の減少による（用量減少による）。この様式において、腫瘍の治療（例えば、結
腸癌の治療）は、ＤＯＸ−ＷＧＡによってはるかにより快適となる。

【００１６】タンパク質ベースの薬物は、標的特異的投与に加えて、部分的、また実質的に
、レクチン（これは、脆弱なタンパク質薬物に非常に有用であり得る）への連結
によって安定化されるので、本発明に従う系は、首尾良くかつ標的された高分子
量タンパク質薬物（例えば、血液凝固因子）、血液から回収可能な他のタンパク
質（例えば、インヒビターまたは補因子）またはそれらの組換え等価物を投与す
ることを、レクチンへの連結によって可能にし得る。

【００１７】ほとんどのレクチン、特に、ＷＧＡのような植物由来のレクチンは、胃腸で安
定であるので、本発明に従う調製物は、経口投与され得、ここで単に必要に応じ
て、さらに治療を容易にする一般的な胃液耐性被覆層が提供され得る。

【００１８】本発明に従う系はまた、例えば、遺伝子療法またはアンチセンス療法のための
核酸の投与に素晴らしく適している。そのような場合、核酸（例えば、ｃＤＮＡ
、アンチセンスＲＮＡなど）は、正常な血液タンパク質のように、レクチンに結
合され得る。ＷＧＡを用いると、これはまた、当然のことながら、酸に不安定な
結合部位を介してもたらされ得る。

【００１９】本発明に従う調製物は、好ましくは、血液から回収可能なそれぞれのタンパク
質を支持する投与の通常の形態で提供される。その投薬量は、タンパク質につい
ての一般的な投薬量に配向され得、特に、より効率的な投与によって、投与量の
減少が考慮され得る。また、その薬物のための一般的に首尾良い補助物質が使用
され得るが、しばしば、本発明に従う処方物は改善された水溶性（レクチンによ
り生じる）を含む、それにより、例えば、溶解補助剤を減少し得るか、または省
略さえし得る。本発明に従う調製物の増加した安定性により、また、大量の安定
化剤の使用が回避され得る。

【００２０】本発明は、ここで、上記の実施例および図面により、より詳細に説明されるが
、限定はされるべきではない。

【００２１】（実施例）（材料および方法）（化学薬品）Ｔｒｉｔｉｃｕｍｖｕｌｇａｒｅからのコムギ胚アグルチニン、およびその
フルオレセイン標識アナログ（フルオレセイン／タンパク質モル比＝３．２）を
ＶｅｋｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｕ．Ｓ．Ａ
．）から得た。ドキソルビシン、ｃｉｓ−アコニット酸無水物、Ｎ，Ｎ’−ジシ
クロヘキシル−カルボジイミド、ε−アミノ−ｎ−カプロン酸およびＮ−ヒドロ
キシ−スクシンイミドは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．
）から得た；すべての他の化学薬品は、分析的に純粋（「分析グレード」）とし
てＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＤＥ）から購入した。組織培養試薬は、Ｂ
ｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗｏｒｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）から入手し、ＸＴＴ試
験セット（ＥＺ４Ｕ）およびＢｒｄＵ試験セットは、それぞれ、Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａ（Ｗｉｅｎ、Ｏｅｓｔｅｒｒｅｉｃｈ）およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ（Ｗｉｅｎ、Ｏｅｓｔｅｒｒｅｉｃｈ）から得た。

【００２２】（ドキソルビシンのＷＧＡとの結合体化）Ｎ−ｃｉｓ−アコニチル−ドキソルビシンは、ＹａｎｇおよびＲｅｉｓｆｅｌ
ｄ（１２）に従い、改変して調製した。すべての反応は、光からの保護下で実施
し、そして移動相としてクロロホルム／メタノール／水９＋９＋１．８または
８＋１０＋２．５（ｖ／ｖ／ｖ）を用いてＫＧＦ₂₅₄に対するＴＬＣによりモニ
ターした。ＤＯＸ（１．７９μｍｏｌ）を、１．５ｍｌのメタノールに溶解し、
そしてｃｉｓ−アコニット酸無水物（５．２μｍｏｌ）のエーテル溶液とともに
室温で１時間攪拌した。５００μｌまでエバポレートした後、ドキソルビシン−
ｃｉｓ−アコニテートを、７．２μｍｏｌのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カル
ボジイミドおよび７．２μｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応によ
り活性化した。この反応混合物を、室温で２時間そして４℃で一晩攪拌した。ジ
シクロヘキシル尿素を、１ｍｌの３％重炭酸ナトリウム水溶液を添加することに
より沈殿させ、そして７５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により集めた。残存す
るメタノールをエバポレーションにより上清液から除去した。

【００２３】ドキソルビシン−ｃｉｓ−アコニテート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エ
ステルを、５００μｌの３％重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．０水溶液中の０．０３
３μｍｏｌのＷＧＡを含む溶液の滴下様式の添加によりＷＧＡと結合させた。４
℃で一晩インキュベートした後、この結合体（ＤＯＸ−ＷＧＡ）を、４℃で、２
０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ７．４に対して、４６８ｎｍにおけ
る透析媒体の分光光度法アッセイによってもはや遊離の薬物が検出されなくなる
まで（検出限界：２μｇ／ｍｌＤＯＸ）透析した。ＴＬＣによると、ＤＯＸ−
ＷＧＡのみが観察された蛍光化合物であり、検出可能な遊離のＤＯＸが存在しな
かったことを示した。

【００２４】（結合速度の測定）ＷＧＡ分子あたりに結合したＤＯＸ分子の数は、ＤＯＸを較正に用いて、２０
ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中のＷＧＡに関して４６８ｎｍにおける吸
光度から計算された（Ｕ−３０００ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計、Ｈｉｔａｃｈｉ
）。

【００２５】（ＷＧＡ上のアミノ残基の決定）誘導体化に接近可能なＷＧＡアミノ基の総数は、改変されたトリニトロベンゼ
ンスルホン酸（ＴＮＢＳ）／アジピン酸−ジヒドラジド（ＡＤＨ）試験（１３）
により測定した。要するに、２００μｌの、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
中にＷＧＡの１２５〜１７５μｇを含む溶液を、２００μｌの、飽和四ホウ酸ナ
トリウム／蒸留水（１＋１、ｖ／ｖ）中０．０２％のＴＮＢＳと混合し、そして
７０℃で１０分間インキュベートした。１００μｌの０．５ＭＡＤＨ水溶液の
添加および穏やかにボルテックスした後、トリニトロベンゼン−アジピン酸−ジ
ヒドラゾンの吸光度を、５２０ｎｍで読みとった。アミノ残基の数は、ε−カプ
ロン酸を用いた較正曲線から計算した。この試験は、８０〜６８０ｎｍｏｌのア
ミノ残基／ｍｌの定量を可能にする。

【００２６】（結合体化ドキソルビシンのインビトロ放出）この結合体からのＤＯＸのインビトロ放出に関する試験を、光から保護して３
７℃で実施した。７．５μｇのＤＯＸに相当する、２５０μｌのＤＯＸ−ＷＧＡ
を含む小透析チューブ（ＭＷカットオフ１２ｋＤａ）を、１．５ｍｌの０．１Ｍ
リン酸／クエン酸緩衝液、ｐＨ４．０で満たしたスクリュー管中に置いた。放出
されたＤＯＸの妨害を受けない拡散を確実にするために、気泡を膜の表面から注
意深く除去した。透析媒体を攪拌しながら、５００μｌのアリコートを、規則的
な間隔で採り、そして４６８ｎｍにおける吸光度を読み取った後、直ちに容器中
に戻した。結合体から放出されたＤＯＸの量は、ＤＯＸ較正曲線から計算した。

【００２７】（細胞および培養条件）ヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２およびヒトリンパ芽球細胞株ＭＯＬＴ−４を、
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、ＭＬ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から得た。これら細胞は、１０％ウシ胎児
血清、４ｍＭＬ−グルタミンおよび７５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＲＰ
ＭＩ−１６４０からなる培養培地中、３７℃で加湿５％ＣＯ₂／９５％空気雰囲
気中で増殖させ、そしてトリプシン処理により継代培養した。

【００２８】ヒト結腸細胞を、切除した結腸癌標本に隣接する正常組織から得た。この組織
を、コラゲナーゼ溶液（１０００Ｕ／ｍｌ培地）中３７℃で約１時間のインキュ
ベーションにより、光学顕微鏡により示されるように、単細胞が放出されるまで
、解離させた。細胞は、４℃における１３００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により
ＰＢＳを用いて繰り返し洗浄した。ペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁し、そして調
製物を、ＣａｓｙｌＤＴ細胞カウンターおよびアナライザーシステム（Ｓｃｈ
ａｅｒｆｅ、ＤＥ）を用いて分析した。従って、この細胞調製物は、光学顕微鏡
で観察したとき、主に赤血球細胞である、１×１０⁶結腸細胞／ｍｌ（直径７〜
１０μｍ）、および７μｍより小さい直径を示す１７×１０⁶細胞／ｍｌから構
成された。

【００２９】（ヒト結腸細胞、Ｃａｃｏ−２およびＭＯＬＴ−４細胞へのＤＯＸ−ＷＧＡの
結合）９６ウェルのマイクロタイタープレートを用いて、５０μｌのＰＢＳ中の細胞
懸濁液（５×１０⁴結腸細胞またはリンパ芽球）、１００μｌの２０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ、ｐＨ７．４、および５０μｌの、ＨＥＰＥＳ中に３．６μｇ、１．８μ
ｇまたは０．９μｇのＤＯＸ−ＷＧＡを含む溶液を、４℃で１時間、２時間また
は１２時間インキュベートした。細胞を遠心分離し（１０００ｒｐｍ、５分、４
℃）、そして１２０μｌの上清液を捨てた。１２０μｌのＨＥＰＥＳの添加の後
、この洗浄工程を同様に繰り返した。細胞を、１．８ｍｌのＣｅｌｌＰａｃｋ
中に再懸濁し、そしてフローサイトメトリーによりアッセイした。

【００３０】各実験において、非標識細胞からなるネガティブコントロールを、自己蛍光を
測定するために含めた。各濃度を４重に試験し、そして少なくとも２回繰り返し
た。

【００３１】（フローサイトメトリー）フローサイトメトリー測定を、ＥｐｉｃｓＸＬ−ＭＬＣ分析フローサイトメ
ーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＦＬ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）上で実施した．標識細胞を、個
々の細胞集団の登録のために、ならびに細胞残渣および細胞凝集体を排除するた
めに「前方向、対、側面散乱ゲート（Ｆｏｒｗａｒｄｖｅｒｓｕｓｓｉｄｅ
ｓｃａｔｔｅｒｇａｔｅ）」を用い、分析した。蛍光を、５７５ｎｍ（１０
ｎｍバンド幅）で検出し、そして個々のピークの対数蛍光強度のチャンネル数の
平均値をさらなる計算に用いた。蛍光シグナルの増幅は、非標識細胞の自己蛍光
を、４ディケイド（ｄｅｃａｄｅ）からなる対数範囲の最初のディケイド中に置
くように調節した。５０００細胞を、各測定について蓄積した。

【００３２】（共焦点顕微鏡法）細胞を、１００μｌの細胞懸濁液（２×１０⁶／ｍｌＨＥＰＥＳ）を、１０
０μｌのＤＯＸ−ＷＧＡ（６９μｇ／ｍｌＨＥＰＥＳ）またはフルオレセイン
標識ＷＧＡ（１００μｇ／ｍｌＨＥＰＥＳ）との３７℃における１時間のイン
キュベーションにより染色した。細胞を遠心分離し（５分、１０００ｒｐｍ）、
なお１５０μｌのＨＥＰＥＳを用いて、上記のように２回洗浄し、そして顕微鏡
法のためのキャリアに付与した。蛍光標識細胞の共焦点画像を、共焦点Ｚｅｉｓ
ｓＡｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡を用いることにより得た。透過光および蛍光画像は
、４０倍の倍率で得、そして細胞内ＤＯＸおよびフルオレセインは、４８８ｎｍ
における励起および＞５１５ｎｍの発光により検出した。

【００３３】（細胞増殖試験）細胞増殖は、細胞培養用の無色の補填したＲＰＭＩ１６４０培地を用いるこ
とにより、製造業者の指示書に従って実施した、ＸＴＴおよびＢｒｄＵ試験によ
り測定した。

【００３４】Ｃａｃｏ−２の細胞増殖に対するＷＧＡおよびＦ−ＷＧＡの影響を計算するた
めに、１００μｌの細胞懸濁液（２×１０⁴細胞）および７５μｌのＷＧＡおよ
びＦ−ＷＧＡの各々の１つの希釈系列（０、０．０６、０．１５、０．２、０．
３、０．４、０．６、１．５、３、６および３０μｇ）を、組織培養条件下で３
日間インキュベートし、次いで２０μｌのＸＴＴ試薬溶液を添加した。形成され
たホルマザンの吸収を、培地およびＸＴＴ試薬溶液からなるネガティブコントロ
ールに対して４５０ｎｍで測定した（ＡｎｔｈｏｓＥＬＩＳＡＲｅａｄｅｒ
２００１）。

【００３５】ＤＯＸ−ＷＧＡの細胞障害性活性は、上記のようにＸＴＴ試験により測定し、
しかし、ここで、１０⁴ ＭＯＬＴ−４またはＣａｃｏ−２細胞／１００μｌの
ＲＰＭＩ１６４０培地、および７５μｌのＤＯＸ（０．１５または０．１０μ
ｇ）、ＷＧＡ（０．４５または０．３２μｇ）またはＤＯＸ−ＷＧＡ（０．５７
または０．４１μｇ）を含む溶液をそれぞれ用いた。

【００３６】さらに、ＤＯＸ−ＷＧＡで前処理したＣａｃｏ−２細胞の細胞増殖を試験し、
ここでは、比色免疫試験であるＢｒｄＵ試験を用いた。７５ｍｌの、ＨＥＰＥＳ
中にＷＧＡ（０．６、０．４３、０．３０μｇ）、ＤＯＸ（０．１５、０．１１
、０．０７５μｇ）またはＤＯＸ−ＷＧＡ（０．５７、０．４１、０．２８５μ
ｇ）を含む各溶液を、１００μｌの細胞懸濁液（５×１０³Ｃａｃｏ−２細胞）
を含むマイクロタイタープレートのウェル中に添加した。細胞培養条件下９６時
間のインキュベーションの後、２０μｌのＢｒｄＵ標識溶液を添加し、次いでさ
らに１４時間インキュベートした。上清液を捨て、そして２００μｌのＦｉｘＤ
ｅｎａｔ溶液の添加の後、細胞を固定し、そしてＤＮＡを変性した。上清液を３
０分後に取り出し、そして１００μｌのＢｒｄＵ抗体ペルオキシダーゼを添加し
た。９０分のインキュベーションの後、細胞を、２００μｌの洗浄緩衝液で３回
洗浄し、そして１００μｌの基質を添加した。１０分後、酵素活性を、２５μｌ
の１Ｍ硫酸を添加することにより停止し、そして４５０ｎｍで、吸光度を、上記
のように調製が細胞を含まないブランク値に対して測定した。

【００３７】すべての試験を４重で行い、そして少なくとも２回繰り返した。さらに、ポジ
ティブコントロールを、試験された基質を省くことにより各実験に含めた。

【００３８】（結果）ｃｉｓ−アコニチル−結合ドキソルビシン−ＷＧＡ（ＤＯＸ−ＷＧＡ）の調製
および特徴付けＤＯＸの標的されたプロドラッグ送達のためのキャリアタンパク質としてＷＧ
Ａを用いるために、細胞増殖抑制試薬を、２工程の方法で、このタンパク質に共
有結合させた。最初に、この薬物を、ダウノス−アミンの遊離のアミノ残基のｃ
ｉｓ−アコニット酸無水物との反応により、対応するカルボン酸誘導体に定量的
に変換した（Ｒｆ_produkt＝０．２１、Ｒｆ_DOX＝０．１４；クロロホルム／メタ
ノール／水、９＋９＋１．８（ｖ／ｖ／ｖ））。文献（１２）に記載される以外
に、この変換は、無水媒体中にＮ−ｃｉｓ−アコチニル−ＤＯＸのみを生じた。
α−およびβ−モノアミド異性体の両方の形成にもかかわらず、唯一の染色がＴ
ＬＣの後に観察された．タンパク質の予備活性化によるＷＧＡの架橋を避けるために、このＮ−ｃｉｓ
−アコニテート−ＤＯＸを、ジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドと、カップリングの前に活性中間体エステル産物を形成する（１
４）ように反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水８＋１０＋２
．５（ｖ／ｖ／ｖ））により示されるように、このＮ−ｃｉｓ−アコニチル誘導
体（Ｒ_f＝０．２４）は、約７５％の程度まで，対応するＮ−ヒドロキシ−スク
シンイミドエステル（Ｒ_f＝０．８８）に変換された。ｃｉｓ−アコニテート−
ドキソルビシンのβ−またはγ−カルボキシル残基のいずれかの活性エステルの
関与の下、この薬物は、ＷＧＡの接近可能なアミノ残基と、アミド結合を形成し
て結合した。精製された結合体のＵＶ差異分光光度測定は、キャリアタンパク質
上のＤＯＸの共有結合を確認し、これにより、約２４ｍｏｌのＷＧＡのＤＯＸ／
モルの結合数が得られた。ＷＧＡは、ＴＮＢＳ／ＡＤＨ試験により測定されると
き、２４±１．５３アミノ基（平均値±ＳＤ、ｎ＝６）を含むイソレクチンの混
合物を構成するので、カップリング反応は、密にコートされるが、しかしなお自
由に水に溶けるレクチンを生じた。

【００３９】ｃｉｓ−アコニチルスペーサーは、結合薬物のリソソーム内放出のためのｐＨ
感受性結合であったと報告されているので（１５）、ｐＨ４．０における結合Ｄ
ＯＸのインビトロ放出プロフィールは、結合体の排除について透析チューブを用
いて分光光度法により測定した。４．０のｐＨにおける２４時間以内のインキュ
ベーションで、４６±７％の結合ＤＯＸがＷＧＡから放出された；しかし、より
長いインキュベーションの後、放出速度は、顕著に増加しなかった。なぜなら、
ＤＯＸ−ＷＧＡに対する、酸性環境への１６８時間の曝露は、５１±６％の結合
ＤＯＸの放出に至ったからである。放出プロフィールにより示されるように、利
用可能な薬物の半分が６５分後に放出された（図１）。

【００４０】（Ｃａｃｏ−２細胞、ヒト結腸細胞およびリンパ芽球へのＤＯＸ−ＷＧＡの結
合）標的細胞および非標的細胞の結合体結合能力を測定するために、漸増量のＤＯ
Ｘ−ＷＧＡを、特定数の異なる起源の細胞と相互作用させ、そしてそれらを、フ
ローサイトメトリーによりアッセイした。この技法は、細胞結合蛍光強度のみの
定量を可能にする（１６）。Ｃａｃｏ−２細胞を、悪性に形質転換された細胞の
代表として用い、その一方、ヒト結腸細胞およびヒトリンパ芽球ＭＯＬＴ−４細
胞を、非影響細胞または親細胞のモデルとしてそれぞれ含めた。細胞の自己蛍光
（０．６±０．１）と比較したとき、Ｃａｃｏ−２細胞の細胞結合蛍光強度の平
均値は、ＤＯＸ−ＷＧＡの添加の後に、明らかに増加し、そして結合体の濃度の
増加と同時に、１１．８±０．７〜３７．９±０．１の相対蛍光強度を与えた。
その一方、非標的細胞に対するＤＯＸ−ＷＧＡの漸増量の結合は、それぞれ、２
．４±０．０５〜８．５±１．０（ヒト結腸細胞）および２．５±０．０７〜９
．３±０．１（ＭＯＬＴ−４）の範囲の、かなりわずかでそして小さい増加の細
胞結合蛍光強度をもたらした。細胞結合蛍光強度の平均値は、漸増量のＤＯＸ−
ＷＧＡの添加の後に増加したので、アッセイされた細胞株への結合は、特異的な
相互作用に起因し得た（図２）。

【００４１】ヒト結腸細胞の調製物は、異なる型の細胞の９４％が、主に赤血球である細胞
を含み、結合体結合は、＜７μｍの細胞集団排他的に記録するように、「前方向
、対、側面散乱ゲート（ＦｏｒｗａｒｄｖｅｒｓｕｓＳｉｄｅＳｃａｔｔ
ｅｒｇａｔｅ）」を調節することによりアッセイされた。０．３の平均相対蛍
光強度は、これら細胞の自己蛍光範囲をカバーしたので、赤血球へのＤＯＸ−Ｗ
ＧＡ結合は無視され得る。

【００４２】一般に、Ｃａｃｏ−２細胞のＤＯＸ−ＷＧＡ結合能力は、ヒト結腸細胞のそれ
より４．６±０．３倍高い。ＭＯＬＴ−４細胞に結合したＤＯＸ−ＷＧＡの量は
、ヒト結腸細胞のそれと同じオーダーであり、わずかに１０±３％より高かった
。Ｃａｃｏ−２膜への結合のみならず、ＤＯＸ−ＷＧＡの取り込みもまた、この
結合体と予備インキュベートされた生存Ｃａｃｏ−２細胞の共焦点レーザー走査
顕微鏡により観察された（図３）。３７℃における１時間のインキュベーション
後、蛍光ＤＯＸ−ＷＧＡ結合体は、分裂するＣａｃｏ−２細胞の核膜の近傍に集
まった。その一方、蛍光標識されたＷＧＡを有するＣａｃｏ−２細胞が、同じ条
件下で染色された場合、レクチンは、存在する顆粒領域がいくらか強く染色され
て、細胞質に亘って分布し、これは、小胞蓄積を示した。従って、結合体の細胞
結合には、プロドラッグの取り込みが続き、しかし、細胞内分布パターンは、結
合体化に用いた物質に依存する。

【００４３】（腫瘍細胞およびリンパ芽球に対するＤＯＸ−ＷＧＡの抗増殖効果）ＷＧＡ、Ｆ−ＷＧＡ、ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＷＧＡの腫瘍細胞の増殖に対する
効果を、ＸＴＴ試験により調べた。この試験では、テトラゾール−塩ＸＴＴが、
生存細胞により代謝的に減少し、細胞増殖の指標である、可溶性の高度に染色さ
れたホルマザンを生じる。ＷＧＡは、用量依存様式でＣａｃｏ−２細胞の増殖を
阻害し、そしてＢｏｌｔｚｍａｎによるＳ字形曲線から計算したとき、５３０±
４０ｎｇのＷＧＡ／２×１０⁴Ｃａｃｏ−２細胞の細胞増殖の５０％阻害（ＩＣ₅ ₀ ）を示したが、＜６０ｎｇ／ウェルのＷＧＡ濃度は、細胞増殖に対して本質的
な影響を有さなかった（図４）。その一方、フルオロセイン−イソチオシアネー
トを用いることによるＷＧＡの標識は、レクチンの阻害活性を変化させ、そして
ＩＣ₅₀＝６２３±８４ｎｇＦ−ＷＧＡ／２×１０⁴Ｃａｃｏ−２細胞に至った。
さらに、Ｆ−ＷＧＡの５４ｎｇより少ない量の添加の後に、標識レクチンは、Ｃ
ａｃｏ−２細胞の増殖を刺激した。

【００４４】ＤＯＸ−ＷＧＡの阻害活性に対する非改変キャリアタンパク質の影響を考慮し
て、ＸＴＴ試験に用いたＷＧＡおよびＤＯＸの濃度は、得られたデータの比較性
を提供するために結合体と同一とした。ＷＧＡは、Ｃａｃｏ−２細胞増殖を、４
０．３±１４．６％（４５０ｎｇＷＧＡ／１０⁴細胞において）および６．７
±３．３％（３２０ｎｇ／１０⁴細胞において）の程度まで阻害したが、Ｃａｃ
ｏ−２細胞に対するＤＯＸ−ＷＧＡの細胞増殖抑制活性は、それぞれ、１４．３
±８．３％および３４．０±６．１％だけ、ＷＧＡ濃度の同時の減少をともなっ
て増加した（図５Ａ）。その一方、相当量のＤＯＸ−ＷＧＡは、６３％または４
６％のＤＯＸの抗増殖効果を生じた。

【００４５】Ｃａｃｏ−２細胞に比較して、同じ量の試験された物質は、リンパ芽球ＭＯＬ
Ｔ−４細胞の生存率に対し、より少ない影響を奏した（図５Ｂ）。ＤＯＸは、細
胞増殖を、約１３±５．２％の程度まで阻害したが、ＤＯＸ−ＷＧＡのＭＯＬＴ
−４細胞に対する阻害活性は、９．４±３．２％（４５０ｎｇ／１０⁴細胞にお
いて）および５．０±２．６％（３２０ｎｇ１０⁴細胞において）であった。

【００４６】ＸＴＴ試験とは対照的に、Ｃａｃｏ−２細胞の増殖に対するキャリアタンパク
質単独の影響は、ＢｒｄＵ試験でＤＮＡ含量の定量により測定したとき、極めて
異なるものであった。キャリアタンパク質の濃度は、６００から３００ｎｇＷＧ
Ａ／５０００細胞に減少したが、最初は、本質的な阻害活性は観察されず（４．
６±１２．３％）、なおこの活性は、Ｃａｃｏ−２細胞増殖の漸増刺激に変換さ
れた（図６）。その一方、ＤＯＸ−ＷＧＡに比較したとき、等量の遊離の薬物は
、平均して９５．２±２．１％の増殖阻害に至った高い細胞増殖抑制性活性を示
した。ＤＯＸ−ＷＧＡとのＣａｃｏ−２細胞の予備インキュベーション後、等量
のＤＯＸの抗増殖活性は、２０±５．６％だけ増加した。

【００４７】（考察）インビトロにおける結腸癌細胞への薬物の標的特異的送達のためにＣａｃｏ−
２細胞およびヒト結腸細胞の非常に異なるＷＧＡ結合能を利用するために（１１
）、酸感受性ｃｉｓ−アコニット酸結合を介して、２段階機構によって、ＤＯＸ
をＷＧＡに共有結合させた（１２）。ＷＧＡは、４つのイソレクチンの混合物で
ある（１７）ので、結合効率の評価についてＡＤＨとＴＮＢＳ試験とを組み合わ
せることにより、ＷＧＡに対するアミノ残基の数が、２４±１．４であることが
見出された。結合は、ＵＶ／ＶＩＳ示差分光光度計によって質および量において
確認され、これは、ＷＧＡ１モル当たり２４モルのＤＯＸを含む、検出可能な非
共有結合薬物を含まない結合体を与えた。接近可能なＷＧＡのアミノ残基のほぼ
全ての誘導体化にもかかわらず、ＤＯＸ−ＷＧＡの水溶性は保持された。文献（
１５）によれば、薬物とＷＧＡとの間のｃｉｓ−アコニチル結合は、ｐＨ感受性
であり、この結合はｐＨ７．０で安定であり、そしてｐＨ４．０では１時間の半
減期を有した。しかし、１６８時間内では、抗体結合体化ダウノマイシンが３．
０のｐＨ値でほぼ１００％放出される（１４）のに対して、薬物含量の５０％し
か、ＤＯＸ−ＷＧＡから放出されなかった。本発明者らの研究では、非プロトン
性環境では、Ｎ−ｃｉｓアコニチル−ドキソルビシンが活性化された。これは、
β−カルボキシルおよびγ−カルボキシルの両方のＮ−ヒドロキシ−スクシンイ
ミドエステルをおそらく等量で生じた。遊離ｃｉｓ−カルボン酸官能基は、結合
のｐＨ感受性にとって必要である（１５）ので、結合体化ＤＯＸの半分のみの放
出は、ＷＧＡと、Ｎ−ｃｉｓ−アコチニル−ドキソルビシンのα−モノアミドエ
ステル異性体のβ−カルボキシルとの間のアミド結合に起因し得る。

【００４８】Ｆ−ＷＧＡおよびＤＯＸ−ＷＧＡの共焦点レーザ走査顕微鏡によって確認され
るように、細胞増殖抑制性薬剤との結合体化後も、Ｎ−アセチルグルコサミン特
異的レクチンは、その生体接着性および細胞侵襲性の特性を保持した。

【００４９】ＤＯＸ−ＷＧＡがリソソーム区画の酸性環境に達する場合、結合の酸感受性に
起因して、結合体化ＤＯＸのリソソーム内放出が予想される。誘導体化の結果と
して、ＷＧＡの細胞内分布パターンは変化し、これにより、Ｃａｃｏ−２細胞の
核膜近辺のＤＯＡ−ＷＧＡの蓄積に至った。

【００５０】ＤＯＸ−ＷＧＡ由来の細胞結合蛍光強度のフローサイトメトリーによる決定に
よって、結合体の結合特異性を評価した。曝露時間にかかわらず、ＤＯＸ−ＷＧ
Ａは、標的細胞および非標的細胞への用量依存結合を示した。しかし、その程度
は、非常に異なった。平均して、結腸癌細胞Ｃａｃｏ−２の結合能は、ヒト結腸
細胞およびリンパ芽球ＭＯＬＴ−４細胞の結合能より４．５倍高かった。さらに
、ＤＯＸ−ＷＧＡのヒト赤血球への結合は検出されなかった。これらの結果は、
結合体の高い標的特異性を示す。高い程度の結合を考慮に入れると、ヒト結腸細
胞に対するＣａｃｏ−２細胞への結合の１３：１（Ｆ−ＷＧＡ、１１）から４：
１（ＤＯＸ−ＷＧＡ）への比の減少は、免疫結合体について観察された（１８）
ような、疎水性の抗癌薬によるレクチンの高密度の誘導体化に関連し得る。

【００５１】ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を決定することにより有糸分裂に対する
ＷＧＡおよびＦ−ＷＧＡの効果を研究した場合、Ｒｙｄｅｒら（１９）によれば
Ｃａｃｏ−２の細胞増殖に対する逆の活性が観察された：匹敵する濃度では、ネ
イティブなレクチンは、フルオレセインの結合体化後でさえも、Ｃａｃｏ−２細
胞増殖の用量依存性阻害を示した。この阻害効果は、２×１０⁴細胞当たり５４
ｎｇ未満のＦ−ＷＧＡの濃度で刺激を逆転した。Ｋａｗａｍｏｔｏら（２０）に
より観察されるように、上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、ｎＭ範囲で上皮Ａ４３１癌
細胞の増殖を阻害したが、それでも、ＥＧＦは、このｐＨ範囲で、有糸分裂効果
を有した。ＷＧＡによって、ＥＧＦレセプターのチロシンキナーゼ活性は、上皮
増殖因子により誘導された改善（２１）と類似の程度にまで活性化された。この
効果は、おそらく、ＷＧＡのＥＧＦレセプター結合に起因し得る。

【００５２】しかし、Ｃａｃｏ−２細胞に対する結合体の抗増殖効果に対する、ＤＯＸ−Ｗ
ＧＡのキャリアタンパク質の寄与は、等量のＷＧＡおよびＤＯＸ−ＷＧＡの阻害
活性がそれぞれ６．７±３．３％および３９±６．１％であったので、むしろか
なりわずかであった。従って、ＤＯＸ−ＷＧＡの細胞増殖抑制活性は、主として
結合体化薬物に由来した。ＤＯＸ−ＷＧＡは、遊離ＤＯＸの細胞増殖抑制活性の
約６０％を生じる。非標的細胞についてのモデルとしてリンパ芽細胞ＭＯＬＴ−
４細胞を用いるＸＴＴ試験を実施するとき、ＤＯＸ−ＷＧＡによって、細胞増殖
は、遊離ＤＯＸ（１００％）と比較してせいぜい３５％の程度で、用量依存様式
で阻害された。非標的細胞に対する等量のＤＯＸのこの抗増殖活性の減少は、Ｗ
ＧＡとの結合後の抗癌剤の標的特異的送達に起因し得る。

【００５３】等量のキャリアタンパク質とプレインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞の妨げ
られない増殖がＤＯＸ−ＷＧＡの抗増殖活性の明白な算定に必要であるので、分
裂細胞数に従って、ＤＮＡ合成の際のＢｒｄＵ取り込みを決定した。ＤＯＸ−Ｗ
ＧＡに比較して等濃度のＷＧＡおよびＤＯＸでは、キャリアタンパク質単独が、
Ｃａｃｏ−２細胞増殖をわずかにのみ阻害したか、またはこれを刺激した。そし
て遊離薬物が、平均して、９５％増殖阻害を示した。結合ＤＯＸの抗増殖活性は
、７８％の平均値を有した。結合されたＤＯＸはインビトロで単に５０％のみを
放出すると仮定すると、結合体化ＤＯＸの部位特異的効率に起因するＤＯＸ−Ｗ
ＧＡの細胞増殖抑制活性は、遊離薬物の細胞増殖抑制活性に等しいか、または幾
分高いものであり得る。

【００５４】（ＷＧＡ−プロトロンビン結合体の調製）プロトロンビン（血液凝固因子ＩＩ）は、７２，０００ダルトンの分子量を有
するビタミンＫ依存性タンパク質の群に由来する血漿タンパク質である。プロト
ロンビンは、治療的に利用され、そしてプロトロンビン複合体因子の先天性また
は後天性不全によって引き起こされる出血の予防および治療のために使用される
プロトロンビン複合体濃縮物の必須成分である。

【００５５】Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉｓ（２３）に従って、リン酸カルシウム上で吸着させ、
そしてリン酸ナトリウムを用いて溶出することにより、プロトロンビン複合体濃
縮物からプロトロンビン（第ＩＩ因子）を調製し、そしてＤＥＡＥＳｅｐｈａ
ｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵｐｐｓａｌａＳｃｈｗｅｄｅｎ）に
おけるアニオン交換クロマトグラフィー、ならびにフェニル−セファロースにお
ける疎水性クロマトグラフィーによって精製した。続く合成のために、１ｍｌの
クエン酸緩衝液（１３．６ｍＭクエン酸ナトリウム、１３７ｍＭＮａＣｌ、
ｐＨ７．０）当たり１２．３ｍｇＦＩＩの第ＩＩ因子含量を有する調製物を使
用した。

【００５６】以下の原理に従って、精製プロトロンビンをＷＧＡと結合体化させた。

【００５７】ジスクシンイミジルスクシネート溶液（プレ活性化スペーサー）を、Ｎ−ヒロ
ドキシスクシンイミドおよび無水コハク酸をカルボジイミドとインキュベートす
ることによって調製し、そしてフルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識プロトロンビン
の活性化のために用いた。ＷＧＡへの結合のために、このように調製された、活
性Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基を有する誘導体化プロトロンビン
を引き続き用いた。このようにして、２つの異なるサンプルを調製した（それぞ
れ、混合物１および２による合成）。

【００５８】（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）での第ＩＩ因子の標識）フルオレセインで第ＩＩ因子を標識するために、第ＩＩ因子溶液と反応緩衝液
（２５ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）との混合物中に
ＦＩＴＣを溶解し、そして穏やかに攪拌しながら室温で５時間（混合物１）およ
び一晩（混合物２）インキュベートした。与えられたモル比を、プロトロンビン
の２９の遊離アミノ基（Ｎ末端およびリジン残基）に基づいて計算した。

【００５９】（混合物１（１ｍｏｌのＮＨ₂当たり２ｍｏｌのＦＩＴＣ））２．９ｍｇのＦＩＴＣ（７．５μｍｏｌ）７５０μｌのＦＩＩ溶液（０．１３μｍｏｌ当たり９．２ｍｇのＦＩＩ）７５０μｌの緩衝液（混合物２（１ｍｏｌのＮＨ₂当たり０．３ｍｏｌのＦＩＴＣ））０．４５ｍｇのＦＩＴＣ（１．１６μｍｏｌ）７５０μｌのＦＩＩ溶液（０．１３μｍｏｌ当たり９．２ｍｇのＦＩＩ）７５０μｌの緩衝液。

【００６０】標識された第ＩＩ因子からこれら試薬を分離するために、ＤＭＳＯ／Ｈｅｐｅ
ｓ緩衝液（ｐＨ８．０；１：１混合）中のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ、ＵｐｐｓａｌａＳｃｈｗｅｄｅｎ）でクロマトグラフィーを行
った。溶出容積（約２．０ｍｌ）中の画分を採取し、そしてさらなる合成のため
に使用した。

【００６１】（プレ活性化スペーサーの合成）プレ活性化スペーサーを、３ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で１
４ｍｇ（１２５μｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、５ｍｇ（５０μｍ
ｏｌ）の無水コハク酸、および９６ｍｇ（５００μｍｏｌ）の１−エチル−３−
ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を、穏やかに振盪しなが
ら、２０分間、インキュベートすることによって調製した。

【００６２】（ＦＩＴＣ標識プロトロンビンの活性化）以下の２つの反応混合物を用いて、ＦＩＴＣ標識プロトロンビンの活性化を行
った。混合物をそれぞれ、穏やかに攪拌しながら、室温で１時間インキュベート
した。

【００６３】（混合物１）３００μｌの可変スペーサー２．７ｍｌのＤＭＳＯ２．０ｍｌのＦＩＴＣ標識プロトロンビン（混合物２）７５μｌの可変スペーサー２．９２５ｍｌのＤＭＳＯ２．０ｍｌのＦＩＴＣ標識プロトロンビン。

【００６４】反応後、それぞれＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐ
ｓａｌａＳｃｈｗｅｄｅｎ）（ＤＭＳＯ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液＝１：１中）；緩
衝系：２５ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０によって二連
でクロマトグラフィーを行った。この目的のために、各２．５ｍｌを、カラムに
付与した。溶出容積中の画分を合わせ、そしてＷＧＡとの結合のために使用した
。

【００６５】（活性化プロトロンビン誘導体とＷＧＡとの反応）ＷＧＡ（企業Ｖｅｃｔｏｒより）との結合を、室温で、一晩穏やかに振盪させ
ながら、固体レクチンを活性化プロトロンビンの溶液に添加することにより行っ
た。

【００６６】（混合物１）１．２５ｍｇのＷＧＡ１．８ｍｌ活性化プロトロンビン溶液（混合物２）１．７ｍｇのＷＧＡ３．７ｍｌ活性化プロトロンビン溶液。

【００６７】最後に、５ｍｇのグリシンを各混合物に添加し、そしてそれぞれ０．９％Ｎａ
Ｃｌ溶液（混合物１）および２５ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．２（混合物２）中のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムでクロマトグラフ
ィーを行った。クロマトグラフィーは、混合物２について、２回カラム実行を行
った。

【００６８】（ＨＰＬＣ分析）合成の全ての中間産物を、ＨＰＬＣゲル濾過カラムを用いたＨＰＬＣ分析にお
いて調べた。ＨＰＬＣシステム：Ｂｉｏ−ＲａｄＭｏｄｅｌ８４４１ＡＴ（Ｍｏｄｅｌ１７９０ＵＶ／ＶＩＳモニターを備えた）カラム：Ｂｉｏ−ＲａｄＢｉｏ−ＳｉｌＳＥＣ１２５、３００×７．８ｍｍ（分離範囲：約５，０００〜１５０，０００Ｄａ）溶出：ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２流速：０．５ｍｌ／分２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の測定。

【００６９】タンパク質濃度を概算するため、および反応の間のタンパク質サイズの変動を
検出するために、本方法を用いた。

【００７０】（最終産物の特徴付け）両最終産物についてのＨＰＬＣ分析は、ゲル濾過カラムの溶出容積中に１つの
みのシグナルを示した。このことは、１５０，０００Ｄａ以上の分子量を示唆す
る。ＷＧＡおよびプロトロンビンは検出されなかった。

【００７１】１２．５％非還元ゲルを用いるＳＤＳゲル電気泳動、および続く銀染は、両サ
ンプルについて以下のバンドを示す：（サンプル１）ＷＧＡは検出されず弱い第ＩＩ因子バンド（約７０，０００Ｄａ）別の二重バンド（弱い）（約２５０，０００Ｄａ）最大部分のタンパク質は付与部位に存在する（１×１０⁶Ｄａより大きい）（サンプル２）弱いＷＧＡバンド（約３０，０００Ｄａ）が検出可能明確な第ＩＩ因子バンド（約７０，０００Ｄａ）が認識可能約１５，０００Ｄａから１×１０⁶Ｄａより大きい結合体（非常に強いバンド
）が認識可能。

【００７２】従って、両方の合成混合物を介して、プロトロンビンとＷＧＡとの結合が達成
され得た。ここで、誘導体化の程度は、反応条件の選択および結合パートナーの
活性化の程度によって制御され得た。

【００７３】（フルオレセイン標識プロトロンビン−ＷＧＡ結合体の細胞接着特性の特徴付
け）結合体（混合物１）の細胞接着特性の決定を、フローサイトメトリーによって
実施した。ここでは、もっぱら、細胞結合型の蛍光物質が検出される。結合研究
は、コムギレクチンによって引き起こされる考えられるインターナリゼーション
プロセスを排除するために、４℃で実施した。この温度範囲では、全てのエネル
ギー依存転移プロセスは、結腸癌細胞の細胞表面への結合速度のみが検出される
ように、大いに排除される。

【００７４】腸細胞についてのモデルとして、Ｃａｃｏ−２単細胞を使用した。その分化パ
ターンは、ヒト腸細胞に対応し、そして、これは、ヒト小腸についてのインビト
ロモデルとして確立されており、そして上述されている。

【００７５】（手順）５０μｌのＣａｃｏ−２細胞懸濁液（１ｍｌ当たり６，０００，０００細胞）
を５０μｌの結合体溶液（未希釈、１＋４希釈）および１００μｌのＰＢＳ緩衝
液（ＣａおよびＭｇを含有する）と、４℃で３０分間インキュベートした。続い
て、細胞懸濁液を遠心分離し（１０００ｒｐｍ）、そして１３０μｌ上清を取り
出し、そしてＰＢＳに替えた。２回洗浄した後、１０００μｌのＰＢＳ（粒子非
含有）を添加し、そしてこれをフローサイトメーターにおいて分析した。

【００７６】ＰＢＳ中の対応する細胞懸濁液をブランク値として供し、比較として、同様に
調製した、蛍光標識プロトロンビンを有する調製物を使用した。

【００７７】（結果）細胞懸濁液は、細胞結合蛍光のシグナルを全く示さなかった。蛍光標識第ＩＩ
因子は、Ｃａｃｏ−２細胞に対して極わずかな結合率を示した（未希釈：１．６
２、１＋４、希釈２．５７、平均細胞結合蛍光強度）が、蛍光標識第ＩＩ因子お
よびコムギレクチンの結合体は、Ｃａｃｏ−２細胞に対して極度に強く結合した
。平均細胞結合蛍光強度はそれぞれ、３１１（未希釈）および１０３．４（希釈
１＋４）に達した。

【００７８】従って、蛍光標識プロトロンビンは、コムギレクチンに結合された後になって
初めて、Ｃａｃｏ−２細胞の表面に結合した（図７を参照のこと）。示された結
果は、選択的薬物標的化によって、血液凝固因子プロトロンビンが標的区画（示
した実験の場合、小腸の上皮についてのモデル細胞）に送達され得ることを示す
。従って、コムギレクチンは、細胞接着特性を付与し、これは、第ＩＩ因子の可
能な再吸収能にとって必要であるものである。一方では、非特異的エンドサイト
ーシスによって、および他方では、単に細胞外空間と細胞内空間との間の濃度勾
配を局所的に増大することにより、細胞表面への接着を介して、拡散、および従
って経口適用後の再吸収能の増大が可能である。

【００７９】（参考文献）

【００８０】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＤＯＸ−ＷＧＡからのＤＯＸのインビトロ放出プロフィールを示す。

【図２】図２は、ＤＯＸ−ＷＧＡの細胞に結合した蛍光強度を示す。

【図３】図３は、ＤＯＸ−ＷＧＡとともにインキュベートした、Ｃａｃｏ−２細胞を示
す。

【図４】図４は、Ｃａｃｏ−２細胞増殖に対するＦ−ＷＧＡおよびＷＧＡの効果を示す
。

【図５】図５は、ＷＧＡ、ＤＯＸ−ＷＧＡおよびＤＯＸの抗増殖作用を示す。

【図６】図６は、Ｃａｃｏ−２細胞増殖に対するＷＧＡ、ＤＯＸ−ＷＧＡおよびＤＯＸ
の作用を示す。

【図７】図７は、標識したプロトロンビンおよびプロトロンビン−ＷＧＡとともにイン
キュベートした後の、Ｃａｃｏ−２細胞の蛍光強度を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウィルス，ミカエルオーストリア国アー−1160 ウィーン，フベルガッセ 11 Ｆターム(参考） 4C076 AA45 BB01 EE59 FF25 4C084 AA02 BA41 DC10 DC50 MA34 MA52 NA14 NA15 ZA531

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】薬学的調製物であって、該薬学的調製物は経口的に非毒性の
レクチンを含有し、該レクチンに対して、血液から回収可能なタンパク質、特に
、血液凝固因子またはその組換え等価物が投与に安定な様式において結合されて
いる、薬学的調製物。
【請求項２】前記レクチンが植物レクチンであることを特徴とする、請求
項１に記載の薬学的調製物。
【請求項３】前記レクチンがＷＧＡであることを特徴とする、請求項１ま
たは２に記載の薬学的調製物。
【請求項４】レクチンと前記タンパク質との間の前記投与に安定な結合が
、酸に不安定な共有結合であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項
に記載の薬学的調製物。
【請求項５】レクチンと前記タンパク質との間の前記投与に安定な結合が
、標的区画に特異的なプロテアーゼによって切断されることを特徴とする、請求
項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的調製物。
【請求項６】前記レクチンが改変レクチンであることを特徴とする、請求
項１〜５のいずれか１項に記載の薬学的調製物。
【請求項７】前記レクチンが、前記薬物に対するその標的区画において改
変されたレクチンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載
の薬学的調製物。
【請求項８】前記レクチンが、標的区画に対するその結合部位で改変され
たレクチンであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学
的調製物。
【請求項９】経口投与のために糖剤化されており、そして必要に応じて胃
液耐性コーティングを有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に
記載の薬学的調製物。
【請求項１０】前記レクチンがＷＧＡであり、そして前記タンパク質が、
前記酸に不安定なシスアコニチル結合を介してＷＧＡに結合されることを特徴と
する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬学的調製物。
【請求項１１】プロドラッグ処方物として提供されることを特徴とする、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬学的調製物。