JP2002524421A - 微小血管障害の処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のような脈管形成因子の投与により、損傷した血管を含む内皮損傷および組織の損傷の予防ならびに処置に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は内皮細胞損傷の処置に関する。より詳細には、本発明は、血管および
損傷した血管を含む組織の内皮の処置に関する。本発明は、具体的に、血管の損
傷の予防または修復、そして特に、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）のような微小血
管障害によって特徴づけられる障害の処置に関する。本発明はまた、糸球体およ
び間隙の脈管構造の損傷または萎縮に関連する腎臓疾患の処置ならびに肺の内皮
の損傷に起因する低酸素症または高炭酸ガス症または線維症の処置に関する。

【０００２】 （発明の背景） 小血管の急性損傷および引き続く、損傷した血管が位置付けられる組織の機能
不全（微小血管傷害）は、腎臓、心臓、および肺のような種々の器官の様々な疾
患の病理の共通の特徴である。損傷はしばしば、内皮細胞損傷または内皮細胞死
および凝固または血栓症の産物の存在に関連する。例えば、損傷の因子は、毒素
、免疫因子、感染因子、代謝的もしくは生理的ストレス、または体液性もしくは
細胞性免疫系の成分であり得、またはまだ未同定の因子であり得る。そのような
疾患の亜群は、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）の存在により統一され、そして非免
疫性溶血性貧血、血小板減少症、および／または腎不全により臨床的に特徴付け
られる。最も一般的なＴＭＡの原因は溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）であり、こ
の疾患は幼児期においてより頻繁に発生し、それは急性腎不全の最も一般的な原
因であるが、成人にも発症し、成人ではより重症な臨床経過がしばしば観察され
る。ＨＵＳの病因は十分に解明されていないが、これらの症例の大多数はベロ毒
素産生菌株、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７の腸内感染に関連することが広範に認めら
れている。Ｅ．ｃｏｌｉにより産生されるベロ毒素は、糸球体内皮細胞（ＧＥＮ
）損傷を誘発し、ほとんどの流行性ＨＵＳにおける腎臓の血栓性微小血管症を発
生する（Ｂｏｙｃｅら、Ｎ.Ｅｎｇｌ.Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：３６４〜３６８（１
９９５））。何人かの患者は、特に成人は、腎臓関与の相対的欠失を有し得、そ
して時々、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を有するものとして分類される
。しかし、血栓性微小血管症はまた、妊娠の合併症（子かん）として、腎臓への
照射に続く悪性高血圧症とともに、移植後（しばしば、シクロスポリン処理また
はＦＫ５０６処理の補助）、癌の化学療法とともに（特にマイトマイシンＣ）、
特定の感染症とともに（例えば、赤痢菌またはＨＩＶ）、全身性狼瘡または抗リ
ン脂質症候群と関連して発生し得るか、あるいは血栓性微小血管症は特発性また
は家族性であり得る。実験データは、内皮細胞損傷がＨＵＳ／ＴＴＰの病因にお
ける共通の特徴であることを示唆する。例えば、Ｋａｐｌａｎら、Ｐｅｄｉａｔ
ｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．４：２７６（１９９０）を参照のこと。内皮細胞損傷は、
後の事象のカスケードを誘発し、その事象には、局所的脈管内凝固、フィブリン
沈着および血小板の活性化および凝集が挙げられる。この事象を媒介する機構は
十分に理解されていない。ベロ毒素により媒介されるＨＵＳの場合において、内
皮の損傷は、局所的な血小板の活性化および消耗、フィブリン沈着、および細血
管異常性溶血症とともに、剥離および死に導く。

【０００３】 腎小体（一般には糸球体を言う）は、有窓内皮の薄層により裏打ちされる毛細
管網；周囲にメサンギウムマトリックスを有するメサンギウム細胞の中心領域；
内臓性上皮細胞および関連する基底膜；ならびに基底膜を有するボーマン嚢の壁
側板から構成される。２つの上皮層の間に、尿空間（ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ
ｓｐａｃｅ）と呼ばれる狭い腔が存在する。糸球体は、血漿の限外ろ過が生じる
原因である。内皮細胞は、毛細管腔から尿空間まで血液成分の通路に対する最初
の障壁を形成する。通常の条件下で、赤血球、白血球および血小板のような形成
された血液の成分は、内皮下空間へのアクセスを獲得しない。さらに、それらの
表面が負に荷電している理由で、内皮細胞が、糸球体毛細管壁の電荷特異的特性
に貢献する。腎臓において、糸球体および管周囲性毛細管および細動脈への損傷
は虚血、急性尿細管壊死を生じ、そして重症の場合には、斑状または局所皮質性
壊死を導き得る。さらなる詳細は、Ｂｒｅｎｎｅｒ＆Ｒｅｃｔｏｒ’ｓ：Ｔｈｅ
Ｋｉｄｎｅｙ、第５版．、Ｂａｒｒｙ Ｍ．Ｂｒｅｎｎｅｒ編、Ｗ.Ｂ．Ｓａ
ｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．、 １９９６もまた参照のこと。

【０００４】 幼児におけるＨＵＳの今の処置は主に、支持療法からなる（透析、輸血および
体液および電解質の平衡への注意）。しかし、成人、および幼児の不応性の場合
において、血漿注入治療および／または血漿交換治療もまた加えて実施される。
ＲｅｍｕｚｚｉおよびＲｕｇｇｅｎｅｔｉ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４７：２〜
１９（１９９５）。血漿交換治療を支持するデータは決定的ではく、非管理の試
行が潜在的有益性を示唆し、特に、血小板減少症、貧血、および関連する神経的
徴候（混乱、知覚異常、および偶発的昏睡（ｏｃｃａｓｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｍ
ａ）からなる）を改善するという点に関して示唆した。ほとんどの患者はその急
性発症から回復するが、３〜８％という死亡率が時折報告されている。Ｂｒａｎ
ｄｔおよびＡｖｎｅｒ、Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｕｒｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ
ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｐｕｒ
ｐｕｒａ。Ｉｎ：ＮｅｉｌｓｏｎおよびＣｏｕｓｅｒ、編、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐ
ｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６、ｐｐ．１１６１〜１１８１。しかし、患者
の何人かが彼らの腎臓機能を十分に回復せず、２０％と４０％の間の患者が、１
０〜１５年以内に腎臓の機能障害または高血圧症をある程度発症させ、半分の患
者が透析に進行する。ＢｒａｎｄｔおよびＡｖｎｅｒ、（前出）。１９９５年に
おいて、ＨＵＳは透析患者の２．４％の割合を占める。糸球体関連、細動脈疾患
、または皮質性壊死をともなう５０％よりも多くの患者が危険な状態にある。Ｈ
ａｂｉｂら、Ａｖｄ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ １１：９９〜１２８（１９８２）
。

【０００５】 微小血管傷害、および特に、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）の処置のための新し
い治療薬剤についての大きな必要性が存在する。細胞を保護し、そして血管が損
傷している、または損傷した器官の通常の機能を維持する方法を見い出すことが
特に必要である。現在、内皮細胞損傷を予防し、減少させる工程および損傷した
内皮細胞の修復を刺激する工程にて標的とされている、微小血管傷害の処置につ
いての治療方法は提案されていない。実際、臨床使用中のほとんどの薬剤が、未
知の因子の除去もしくは注入（血漿交換／血漿注入）、血小板作用の阻害（抗血
小板薬剤）、または免疫系のブロック（ステロイドおよびビンクリスチン）のい
ずれかを目的としている。

【０００６】 損傷した糸球体血管を包囲する糸球体内皮細胞および組織に対する損傷に関与
する腎臓疾患の処置、特に、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の処置への新しいア
プローチについてのさらなる必要性が存在する。

【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、内皮細胞損傷の予防もしくは減少、またはすでに損傷した内皮細胞
の修復についての組成物および方法に関する。損傷した内皮細胞の修復は新しい
血管の形成（新脈管形成）により付随され得るが、新脈管形成は、本発明に従う
処置の主要機構であるとはみなされない。

【０００８】 一つの局面において、有効量の脈管形成因子もしくはそのアゴニスト、または
脈管形成因子の産生を刺激する因子を投与することにより血管の損傷を予防もし
くは修復する方法に関する。特定の実施態様において、この損傷は、血栓性微小
血管症（ＴＭＡ）のような微小血管症に関連している。さらなる実施態様におい
て、本発明は、微小血管症（例えば、腎臓、心臓、または肺のＴＭＡ）の処置に
関する。特に好ましい実施態様において、本発明は，血栓性血小板減少性紫斑病
（ＴＴＰ）を含む溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に関連する血管の損傷の予防ま
たは修復に関する。

【０００９】 特定の実施態様において、本発明は、抗生物質、コルチコステロイドまたは他
の免疫抑制薬、抗癌剤、血漿交換、血塊溶解剤などのような病因または血管損傷
に指向される他の治療との組み合わせにおける脈管組織の損傷の予防または修復
についての方法に関する。

【００１０】 別の局面において、本発明は、有効量の脈管形成因子もしくはそのアゴニスト
、または脈管形成因子の産生を刺激する因子を投与することにより、非血管組織
で働く血管の損傷に関連するその組織の損傷の予防または修復についての方法に
関する。処置は、好ましくは、腎臓、心臓、または肺のような非血管組織を含む
器官の通常の機能を維持する。

【００１１】 さらなる局面において、本発明は、ＨＵＳを発症しているかまたはＨＵＳと診
断された危険な状態にある患者に対し、有効量の脈管形成因子もしくはそのアゴ
ニスト、または脈管形成因子の産生を刺激する因子を投与することによる溶血性
尿毒症症候群（ＨＵＳ）の処置についての方法に関する。

【００１２】 また別の局面において、本発明は、血管の損傷の予防または修復のための組成
物に関し、その組成物は、キャリヤーとの混合物中で、有効量の脈管形成因子も
しくはそのアゴニスト、または脈管形成因子の産生を刺激する因子を含む。

【００１３】 なおさらに別の局面において、本発明は、非血管組織で働く血管の損傷に関連
するその組織の損傷の予防または修復についての組成物に関し、その組成物は、
キャリヤーとの混合物中で、有効量の脈管形成因子もしくはそのアゴニスト、ま
たは脈管形成因子の産生を刺激する因子を含む。この組成物は、抗生物質、コル
チコステロイドまたは他の免疫抑制薬、抗癌剤、血塊溶解剤などのような血管損
傷の病因に指向される治療において効果的な１つ以上のさらなる薬剤を必要に応
じて含む。

【００１４】 本発明はまた、以下を含む製品に関する：容器、脈管形成因子もしくはそのア
ゴニスト、または脈管形成因子の産生を刺激する因子を含む容器内の組成物、お
よび血管の損傷の予防または修復のためにこの組成物を使用する説明書。

【００１５】 本発明はまた、以下を含む製品に関する：容器、脈管形成因子もしくはそのア
ゴニストの有効量、または脈管形成因子の産生を刺激する因子を含む容器内の組
成物、および非血管組織で働く血管の損傷に関連するその組織の損傷の予防また
は修復のためにこの組成物を使用する説明書。

【００１６】 また別の局面において、本発明は、以下を含む製品に関する：容器、脈管形成
因子もしくはそのアゴニスト、または脈管形成因子の産生を刺激する因子を含む
容器内の組成物、および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の処置のためにこの組成
物を使用する説明書。

【００１７】 異なる局面において、本発明は、血管性内皮細胞の損傷の予防または修復につ
いての方法に関し、この方法は、脈管形成因子または細胞保護的因子、それらの
アゴニスト、もしくは脈管形成因子または細胞保護的因子の産生を刺激する因子
をコードするポリヌクレチドをそのような内皮細胞に導入する工程を包含する。

【００１８】 さらなる局面において、本発明は、非血管組織で働く血管の損傷に関連するそ
の組織の損傷の予防または修復についての方法に関し、この方法は、脈管形成因
子、それらのアゴニスト、もしくは脈管形成因子の産生を刺激する因子をコード
するポリヌクレチドをそのような非血管組織に導入する工程を包含する。

【００１９】 すべての局面および実施態様において、例えば、脈管形成因子は、血管内皮増
殖因子（ＶＥＧＦ）または、塩基性維芽細胞増殖因子もしくは酸性線維芽細胞増
殖因子（ｂＦＧＦまたはａＦＧＦ）であり得る。好ましくは、このＶＥＧＦはｈ
ＶＥＧＦ₁₂₁またはｈＶＥＧＦ₁₆₅であり、例えば、これはホモ二量体型またはヘ
テロ二量体型になり得、そして部分的または完全にグリコシル化され得ない。好
ましくは、ＶＥＧＦのような脈管形成因子は、主に新しい血管形成を誘導する以
外の効果によって活性を発揮する。

【００２０】 （発明の詳細な説明） （定義） 本明細書中で使用される語句「脈管形成因子」とは、存在する内皮から新しい
毛細血管の成長を促進（新脈管形成）および／または血管の透過性を増加させ得
る任意の分子（ポリペプチド、ペプチドおよび低分子を含む）を言う。脈管形成
因子には、すべての形態の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（任意の動物種由来（
ヒトを含む）の天然配列のＶＥＧＦ分子およびそれらの機能的誘導体を含む）、
酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）のようなすべ
ての形態の線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ）（任意の動物種由来（ヒトを含む）の
天然配列のＦＧＦ分子およびそれらの機能的誘導体を含む）、ならびにＰＩＧＦ
、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＶＥＧＦ−Ｃ−ＶＲＰのようなＶＥＧＦ関連分子（任意
の動物種由来（ヒトおよびマウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネ
コのような他の哺乳動物種を含む）のすべての天然配列形態およびそれらの機能
的誘導体を含む）が挙げられるが、それらに限定されない。この定義は特に、こ
れらのおよび関連する分子のホモ二量体型およびヘテロ二量体型を含み、ここで
二量体化が、生物学的活性のために要求される。

【００２１】 語句「脈管形成因子の産生を刺激する因子」、およびその文法的等価物は、最
も広い意味で使用され、そしてこの刺激が達成される機構にかかわらず、脈管形
成因子、または脈管形成因子のレセプターの発現を刺激する化合物（ネイティブ
および改変体のポリペプチドおよびペプチド、低分子、抗体など）を含む。この
ような因子としては、例えば、全ての形態の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、
全ての形態のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インターロイキン−１
（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（Ｉｌ−６）、全ての形態のインスリン様
増殖因子（ＩＧＦ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、
アデノシン、プロスタグランジン、またはプロテインキナーゼＣ、プロテインキ
ナーゼＡもしくはｒａｓ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質を活性化する因子が挙
げられる。列挙した脈管形成因子の指示は具体的に、ヒトおよび他の哺乳動物種
（例えば、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコ）を含む任意の
動物種由来の全ての天然に存在する形態、ならびにそれらの機能的誘導体を含む
。

【００２２】 本明細書中で使用される場合、用語「血管内皮増殖因子」すなわち「ＶＥＧＦ
」は、ヒトおよび他の哺乳動物種（例えば、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ
、イヌまたはネコ）を含む任意の動物種由来の任意の天然で存在する（ネイティ
ブな）形態のＶＥＧＦポリペプチド（「血管透過性因子」すなわち「ＶＰＦ」と
しても公知）およびそれらの機能的誘導体をいう。「ネイティブなヒトＶＥＧＦ
」は、一般にホモダイマーとして生じる２つのポリペプチド鎖からなる。各モノ
マーは、１２１、１４５、１６５、１８９および２０６のアミノ酸残基長からな
る、５つのうちの１つの公知のアイソフォームとして生じる。これらのアイソフ
ォームを、本明細書中以後でそれぞれ、ｈＶＥＧＦ₁₂₁、ｈＶＥＧＦ₁₄₅、ｈＶＥ
ＧＦ₁₆₅、ｈＶＥＧＦ₁₈₉およびｈＶＥＧＦ₂₀₆という。任意のＶＥＧＦ種の名称
の前の接頭辞「ｒ」は、そのＶＥＧＦ種が組換えＤＮＡ技術により生成されたこ
とを意味する。例えば、ｒｈＶＥＧＦ₁₂₁とは、組換えヒトＶＥＧＦ₁₂₁をいう。
ヒトＶＥＧＦと同様に、「ネイティブなマウスＶＥＧＦ」および「ネイティブな
ウシＶＥＧＦ」もまた、通常ホモダイマーとして生じる、１２０、１６４および
１８８アミノ酸長のいくつかのアイソフォームで存在することが公知である。ｈ
ＶＥＧＦ₁₂₁を除いて、全てのネイティブなヒトＶＥＧＦポリペプチドは、塩基
性のヘパリン結合性分子である。ｈＶＥＧＦ₁₂₁は、ヘパリンに結合しない、弱
酸性ポリペプチドである。これらおよび類似のネイティブな形態は、公知であろ
うとまたは本明細書中で以後見出されようと、その調製態様にかかわらず、天然
から単離されようが、合成されようが、組換えＤＮＡ技術方法によって生成され
ようが、またはこれらおよび他の技術の任意の組み合わせによって生成されよう
が、「ネイティブなＶＥＧＦ」または「ネイティブな配列のＶＥＧＦ」の定義に
全て含まれる。用語「血管内皮増殖因子」すなわち「ＶＥＧＦ」は、モノマー形
態、ホモダイマー形態およびヘテロダイマー形態のＶＥＧＦポリペプチドを含む
。「ＶＥＧＦ」の定義はまた、１１０アミノ酸長のヒトＶＥＧＦ種（ｈＶＥＧＦ ₁₁₀ ）および他の哺乳動物種（例えば、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イ
ヌまたはネコ）におけるそのホモログ、ならびにそれらの機能的誘導体を含む。
さらに、用語「ＶＥＧＦ」は、一次アミノ酸構造の一部が、血小板由来増殖因子
のＡ鎖サブユニットまたはＢ鎖サブユニットのいずれかの一部に対応し、そして
一次アミノ酸構造の一部が血管内皮増殖因子の一部に対応する、キメラダイマー
タンパク質を包含する。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ分子の少なくとも一部を
含む第２鎖にジスルフィド結合された、血小板由来増殖因子のＡ鎖サブユニット
またはＢ鎖サブユニットの少なくとも一部を含む１つの鎖からなるキメラ分子が
提供される。このようなダイマーのさらなる詳細は、例えば、それらの開示が、
本明細書中に参考として明白に援用される、米国特許第５，１９４，５９６号お
よび同第５，２１９，７３９号、ならびに欧州特許ＥＰ−Ｂ ０ ４８４ ４０
１に提供される。ｈＶＥＧＦ₁₂₁およびウシＶＥＧＦ₁₂₀のヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列は、例えば、米国特許第５，１９４，５９６号および同第５，２
１９，７３９号、ならびにＥＰ ０ ４８４ ４０１に開示される。ｈＶＥＧＦ ₁₄₅ は、ＰＣＴ公開第ＷＯ ９８／１００７１号に記載され；ｈＶＥＧＦ₁₆₅は、
米国特許第５，３３２，６７１号に記載され；ｈＶＥＧＦ₁₈₉は、米国特許第５
，２４０，８４８号に記載され；そしてｈＶＥＧＦ₂₀₆は、Ｈｏｕｃｋら Ｍｏ
ｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５：１８０６−１８１４（１９９１）に記載される
。例えば、ｚｖｅｇｆ２（ＰＣＴ公開第ＷＯ ９８／２４８１１号）およびＶＲ
Ｐ（ＰＣＴ公開第ＷＯ ９７／０９４２７号）を含む、他のＶＥＧＦのポリペプ
チドおよびポリヌクレオチドが記載されており、そしてまた用語ＶＥＧＦによっ
て包含される。種々のヒトＶＥＧＦアイソフォームのヌクレオチドおよびアミノ
酸の配列の開示に関してはまた、Ｌｅｕｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３
０６−１３０９（１９８９）；Ｋｅｃｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０９
−１３１２（１９８９）；Ｔｉｓｈｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：
１１９４７−１１９５４（１９９１）；ＥＰ ０ ３７０ ９８９；およびＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９８／１００７１を参照のこと。ＶＦＧＥの形態を、図１に模式的
に示す。図２〜１１（配列番号１〜１０）は、種々のＶＥＧＦ種のヌクレオチド
およびアミノ酸の配列を示す。

【００２３】 フラグメント、アミノ酸配列改変体、グリコシル化改変体およびＶＥＧＦのよ
うな天然の脈管形成因子配列の誘導体が、内皮細胞の損傷を防止、減少および／
または復帰させる対応する天然の分子（例えば、ＶＥＧＦ）の質的能力（好まし
くは、必ずしも必要ではないが、新しい血管形成（新脈管形成）以外の機構に関
与する）を保持するかぎり、語句「機能的誘導体」は、フラグメント、アミノ酸
配列改変体、グリコシル化改変体およびＶＥＧＦのような天然の脈管形成因子配
列の誘導体を言うために使用される。

【００２４】 「フラグメント」は成熟した天然のポリペプチド配列内の領域を含み、そして
それらには、ＶＥＧＦ₁₁₀のようなタンパク分解性フラグメントが挙げられるが
、それらに限定されない。

【００２５】 機能的誘導体は特に、天然の脈管形成因子のアミノ酸配列改変体を含む。用語
「アミノ酸配列改変体」または「改変体」とは、ＶＥＧＦのような対応する天然
の脈管形成因子と比較して、それらのアミノ酸配列にいくつか違いのある脈管形
成因子分子を言う。通常、この改変体は、ＶＥＧＦポリペプチド天然配列のよう
な、天然の脈管形成因子と少なくとも約８０％のアミノ酸配列の同一、より好ま
しくは、少なくとも約８５％のアミノ酸配列の同一、さらにより好ましくは、少
なくとも約９０％のアミノ酸配列の同一、最も好ましくは、少なくとも約９５％
のアミノ酸配列の同一を有する。本発明の範囲内で生じるアミノ酸配列改変体は
、対応する天然分子の特定位置における置換、欠失、および／または挿入を有す
る。

【００２６】 置換性改変体は、除去されそして異なるアミノ酸により置換された、天然配列
におけるアミノ酸残基を少なくとも１つ有する。その分子内のただ１つのアミノ
酸が置換される場合には、その置換は１つであり得、または、２つ以上のアミノ
酸がその同じ分子内において置換される場合には、その置換は複数であり得る。
天然脈管形成因子（例えばＶＥＧＦ）分子の活性における実質的変化は、天然の
ポリペプチドバックボーンおよび／またはその置換領域におけるこの分子の側鎖
の電荷ならびに疎水性とは、電荷および／または構造にて、有意に異なる側鎖を
有するアミノ酸の置換により予想される。脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）の
活性の中程度の変化は、対応する天然の脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）の同
じ部位に存在するアミノ酸の側鎖と電荷および／または構造において類似する側
鎖を有するアミノ酸の置換により予想される。本明細書中のＶＥＧＦ分子の置換
性改変体は、特に生物学的活性に要求されない１つ以上の天然システイン残基が
異なるアミノ酸残基（好ましくは、セリン）によって置換されている改変体を含
む。１つ以上のシステイン残基の置換は分子内および分子間のジスルフィド結合
形成の機会を減少させ、それにより、より安定な分子を与える。ｈＶＥＧＦ₁₂₁
、ｈＶＥＧＦ₁₆₅ならびに対応するウシおよびマウスのポリペプチド内に９個の
システイン残基が存在する。最も好ましい置換性改変体は、９番目のシステイン
残基がセリン残基により置換されている。アミノ酸置換は、本明細書中に記載さ
れるＤＮＡ配列の部位特異的変異原性により、周知技術を使用して達成され得る
。例えば、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ １０：６４８７〜６５００を参照のこと。本明細書中で
ＶＥＧＦについて使用されたアミノ酸配列番号付けシステムは、このタンパク質
の成熟形態（すなわち、翻訳後プロセシング形態）に基づいている。従って、ヒ
トタンパク質において１を番号付けられたアミノ酸残基はアラニンであり、これ
は、単離されたこれらのタンパク質の成熟形態の第一アミノ酸残基である。

【００２７】 挿入性改変体は、天然のＶＥＧＦ分子内の特定位置のアミノ酸の直近に１つ以
上のアミノ酸が挿入された改変体である。アミノ酸の直近とは、そのアミノ酸の
αカルボキシ官能基またはαアミノ官能基のいずれかと結合されることを意味す
る。挿入は１つ以上のアミノ酸であり得る。通常、その挿入は１つまたは２つの
保存性アミノ酸、すなわち、挿入部位に隣接したアミノ酸の電荷および／または
構造に類似したアミノ酸である。生物学的特徴が顕著に変更され得る場合、挿入
部位に隣接するアミノ酸と実質的に異なる電荷および／または構造を有するアミ
ノ酸の１つ以上の置換もまた、所望され得る。脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ
）の挿入性改変体もまたＮ末端伸長を含み、ここで１つ以上のアミノ酸が開始メ
チオニンと天然のアミノ末端アミノ酸との間に挿入される。

【００２８】 欠失性改変体は、天然分子（例えば、ＶＥＧＦ）内の１つ以上のアミノ酸が除
去された改変体である。欠失性改変体は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにお
いて生成されたｒｈＶＥＧＦ₁₂₁のような、対応する天然（ＶＥＧＦ）分子と比
較されるＮ末端欠失およびＣ末端欠失を有する（ＶＥＧＦ）分子を特に含み、こ
れは、天然配列と比較される４つのＮ末端アミノ酸残基および１つのＣ末端アミ
ノ酸末端残基を切断される。

【００２９】 Ｃ末端ヘパリン結合ドメインにおける修飾をともなうＶＥＧＦ改変体は、ＷＯ
９８／３６０７５にて開示されるように、（この開示は、参照として本明細書中
に明確に援用される。）本発明のＶＥＧＦ「アミノ酸配列改変体」の範囲内に特
異的に存在する。

【００３０】 機能的誘導体はまた、天然の脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）のグリコシル
化改変体を含み、同一条件下で、同じ宿主細胞において発現される場合、そのグ
リコシル化パターンが、対応する天然の脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）のグ
リコシル化パターンと異なる。例えば、本発明のＶＥＧＦグリコシル化改変体は
、グリコシル化され得ず、ヘテロ二量体の形態で存在し得（一方のモノマーはグ
リコシル化されず、他方のモノマーはグリコシル化されている二量体、または２
つのモノマーに異なるグリコシル化がされている二量体）るか、または１つ以上
の天然のグリコシル化部位および／または対応する天然のＶＥＧＦポリペプチド
に存在する部位以外の１つ以上のグリコシル化部位を欠如し得る。Ｎ結合グリコ
シル化部位の導入は、式Ａｓｐ―Ｘ―Ｓｅｒまたは式Ａｓｐ―Ｘ―Ｔｈｒのトリ
ペプチド配列を要求し、ここで、Ｘはプロリン（Ｐｒｏ）以外の任意のアミノ酸
であり、これはグリコシル化を防止する。Ｏ結合グリコシル化を必要とする場合
、Ｎアセチルグルコサミン、ガラクトース、またはキシロースと、この分子の適
切な領域に位置するいくつかのヒドロキシアミノ酸残基（最も一般には、セリン
残基もしくはスレオニン残基）、または５−ヒドロキシプロリン残基、または５
−ヒドロキシリジン残基のうちの1つとの間にＯグリコシド結合が起こる。ｈＶ
ＥＧＦ₁₂₁をコードするＤＮＡ配列の発現は、位置７５において、Ｎ結合グリコ
シル化によリ修飾されたおよそ５０％の分子を生じる。両方のサブユニットがグ
リコシル化されるか、またはグリコシル化されない同定された二量体タンパク質
種および一方のサブユニットがグリコシル化され、他方のサブユニットがグリコ
シル化されない同定された二量体タンパク質が存在する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて
発現される場合、ＶＥＧＦおよび他の脈管形成因子が、非グリコシル化形態で産
生される。このようなすべてのグリコシル化改変体は、厳密に言えば本明細書の
範囲内である。

【００３１】 「共有結合性誘導体」はまた、機能的誘導体の意味の中に含まれる。共有結合
性改変は、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と標的化
アミノ酸残基を反応させることにより、その分子内に導入され得る。例えば、さ
らに詳細なこのような共有結合性改変が、米国特許第５，３３２，６７１号にお
いて供給される。この開示は、参照として本明細書中に明白に援用される。

【００３２】 「配列同一性」は、配列同一の最大パーセントを達成するように、必要の場合
には配列を並べ、ギャップを導入した後の、天然のポリペプチド配列におけるア
ミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義
され、いずれの保存的置換も配列同一の一部とは見なさない。この％配列同一値
は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ Ｐ
ＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新しい世代のタンパク質データベース検索プログラム」によ
り限定されるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウエアによって作製される（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２５：３３８９〜３４０２）。そのパラメ
ーターは、ミスマッチに対するペナルティーを除いては、デフォールト値に設定
され、それは−１へ設定される。

【００３３】 語句「脈管形成因子の刺激」およびその文法的な別形は、脈管形成因子または
それらの受容体の産生を刺激する因子を言うために使用され、これには、血小板
由来の増殖因子（ＰＧＤＦ）、形質転換増殖因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴ
ＮＦ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ
−２）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢＥ
ＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、アデノシン、プロスタグランジン、プロテイ
ンキナーゼＣを活性化する薬剤、プロテインキナーゼＡ、またはｒａｓＧＴＰア
ーゼ活性化タンパク質およびそれらのアゴニストが挙げられるが、それらに限定
されない。

【００３４】 用語「アゴニスト」は、最も広い意味で用いられ、そしてネイティブなポリペ
プチドの脈管形成因子（例えば、本明細書中に開示されるＶＥＧＦ）の生物学的
活性を模倣する任意の分子を含む。適切なアゴニスト分子としては具体的には、
アゴニスト抗体または抗体フラグメント、ネイティブな脈管形成ポリペプチド、
ペプチド、および有機低分子のフラグメントまたはアミノ酸配列改変体、が挙げ
られる。

【００３５】 「低分子」は、本明細書中で、約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義
される。

【００３６】 「ネイティブな抗体」および「ネイティブな免疫グロブリン」は通常、２つの
同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０
００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有
結合性ジスルフィド結合によって重鎖へと連結されるが、ジスルフィド結合の数
は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽
鎖はまた、調節的に間隔をあけられた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は
、一方の末端に、可変ドメイン（Ｖ_H）、続いて多数の定常ドメインを有する。
各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（Ｖ_L）を、そして他方の末端に定常ドメ
インを有する；この軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと整列さ
れ、そして軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のア
ミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると
考えられる。

【００３７】 それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、
異なるクラスに割り当てられ得る。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇ
Ｍという５つの主要なクラスの免疫グロブリンが存在し、そしてこれらのうちの
いくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、
ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）に分けられ得る。異なるクラスの
免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよ
びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのこのサブユニット構造および
三次元配置は、周知である。

【００３８】 用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列が極めて異な
り、そしてその特定の抗原に関する各特定の抗体の結合および特異性において用
いられるという事実をいう。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均
質に分布するわけではない。可変性は、ともに軽鎖および重鎖の可変ドメインに
おける相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメント
に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク
（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、３つ
のＣＤＲ（βシート構造を連結し、そしていくつかの場合にはβシート構造の一
部を形成するループを形成する）によって連結された４つのＦＲ領域（大部分は
βシート配置をとっている）を含む。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって
極めて近位に一緒に保持され、そして他の鎖からのＣＤＲと一緒になって、抗体
の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．第９１−
３２４２号，第Ｉ巻、６４７−６６９頁（１９９１）を参照のこと）。定常ドメ
インは、抗原へ抗体を結合させることには直接は関与しないが、抗体依存性細胞
毒性における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を示す。

【００３９】 本明細書中で用いられる場合、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う、抗体
のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」
由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ
１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイ
ンにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３
）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌ
ｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａ
ｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．［１９９１］））、ならびに／または「超可
変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（
Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメ
インにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（
Ｈ３）；ＣｌｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０
１−９１７［１９８７］）を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」残基は
、本明細書中に定義したような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【００４０】 用語「抗体」は、本明細書中で最も広い意味で用いられ、そして具体的には、
所望の生物学的活性を示す限り、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクロー
ナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される複数特異性（ｍｕ
ｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体（例えば、２特異性抗体）、および抗体フラグメ
ントを包含するがこれらに限定されない。

【００４１】 「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな
抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、例
えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｖフラグメント；ダイアボ
ディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ
．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］）；単鎖抗体分子；および抗体
フラグメントから形成される複数特異性抗体が挙げられる。

【００４２】 本明細書中で用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質
な抗体集団から得られた抗体をいう。すなわち、この集団が含む個々の抗体は、
微量に存在し得る、潜在的な、天然に存在する変異以外は同一である。モノクロ
ーナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して指向される。さ
らに、代表的には、種々の決定基（エピトープ）に対して指向される種々の抗体
を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル
抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。修飾語句「モノクローナル
な」は、実質的に均質な抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして
任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするとは解釈されるべきでない。例
えば、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，
Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５［１９７５］によって最初に記載されたハイブリ
ドーマ方法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特
許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。「モノクロー
ナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２
４−６２８［１９９１］およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２
：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラ
リーから単離され得る。

【００４３】 本明細書中のモノクローナル抗体としては具体的に、所望の生物学的活性を示
す限りは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域が、１つの哺乳動物種（代表的には
、げっ歯類、例えば、マウス、ラットまたはウサギ）から誘導され、一方、定常
領域が異なる哺乳動物種(代表的にはヒト)から誘導される、「キメラ」抗体、な
らびにこのような抗体のフラグメントが挙げられる（米国特許第４，８１６，５
６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，８１：６８５１−６８５５［１９８４］）。

【００４４】 非ヒト（例えば、マウス）の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘
導される最小配列を含む。たいてい、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ由来
の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウ
サギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換され
ている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、
ヒト免疫グロブリンのＦｖ ＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換され
ている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、導入されたＣＤＲ配列
もしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。ヒト化抗体は、
最適にはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的はヒ
ト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については
、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；および
Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９［１９８８］を
参照のこと。ヒト化抗体としては、抗体の抗原結合領域が、マカクサルを目的の
抗原で免疫することによって生成される抗体から誘導される、ＰＲＩＭＡＴＩＺ
ＥＤ^TM抗体が挙げられる。

【００４５】 「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_Hドメインお
よびＶ_Lドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中
に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦＶが、抗原結合に望
、ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶ_Hドメインと
Ｖ_Lドメインとの間に含む。ｓＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔ
ｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６９−３１５頁（１９９４）を参照
のこと。

【００４６】 用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメ
ントをいい、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（
Ｖ_L）に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_H）を含む（Ｖ_H−Ｖ_L）。同じ鎖上の２
つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより
、このドメインは、別の鎖の相補ドメインとの対合を強制し、そして２つの抗原
結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ
９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに充分に記
載される。

【００４７】 「脈管形成因子をコードする配列を含むポリヌクレオチド」は、任意の上記脈
管形成因子をコードする配列を含有するポリヌクレオチドを含む。多くのこのよ
うなポリヌクレオチド（例えば、上記の参照におけるものを含めて）が開示され
ており、ここでＶＥＧＦが開示される。コードされるポリペプチドが生物学的に
活性である、すなわちそれが新脈管形成および／または血管透過性を増加させる
限り、この用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で開示さ
れた配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。

【００４８】 用語「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「構築物」および「ポリ
ヌクレオチド構築物」は、本明細書において交換可能に使用される。本発明のポ
リヌクレオチドベクターは、任意のいくつかの形態になり得、これには、ＲＮＡ
、ＤＮＡ、アデノウイルスコート内にカプセル化されたＤＮＡ、別のウイルス形
態またはウイルス様形態（単純疱疹、およびＡＡＶ）にパッケージングされたＤ
ＮＡ、リポソーム内にカプセル化されたＤＮＡ、ポリリジンと複合体化されたＤ
ＮＡ、合成ポリカチオン性分子と複合体化されたＤＮＡ、トランスフェリンと接
合したＤＮＡ、免疫学的にこの分子を「マスク」するため、および／または半減
期を増加させるためにＰＥＧのような成分と複合体化されたＤＮＡ、または非ウ
イルス性タンパク質と接合したＤＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。
本発明のポリヌクレオチドベクターは、本明細書に記載されている任意の運搬ビ
ヒクルの形態になり得る。好ましくは、このポリヌクレオチドはＤＮＡである。
本明細書にて使用されるように、「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧだけで
なく、これら塩基の任意のアナログまたは改変体を含み、例えばそれらには、メ
チル化されたヌクレオチド、非電荷性結合および硫黄化のように内部改変された
ヌクレオチド、糖を使用したアナログ、ならびにポリアミドのような改変化およ
び／または代替的バックボーン構築物がある。

【００４９】 「転写制御下」は、当該分野において周知の用語であり、ポリヌクレオチド配
列（一般的に、ＤＮＡ配列）が、結合状態に寄与するかまたは転写を促進するエ
レメントに作動可能（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）に連結されることに依存するこ
とを示す。

【００５０】 「宿主細胞」は、本発明の任意のベクターのレシピエントになり得るかまたは
レシピエントである個々の細胞または細胞培養を含む。宿主細胞は、単一宿主細
胞の子孫を含み、そしてその子孫は、自然的、偶発的、もしくは意図的変異およ
び／または変化の理由で、必ずしも初めの親細胞と完全に同一（形態学的におい
て、または全ＤＮＡ補完物において）であり得る必要はない。宿主細胞は、イン
ビボにおいて、脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターでト
ランスフェクトされるか、または感染された細胞を含む。

【００５１】 「個体」は脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。

【００５２】 処置の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物、
ヒト、家庭内および農場の動物、および動物園の動物、競技用の動物またはペッ
ト動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）を言う。好まし
くは、この哺乳動物はヒトである。

【００５３】 「有効量」は、有益な臨床結果または所望される臨床結果をもたらすのに十分
な量である。効果的な量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明の目的のた
めに、脈管形成因子の効果的な量は、疾患状態の進行を軽減し、改善し、安定化
し、後進させ、減速または遅延させるために十分な量である。本発明の好ましい
実施態様において、「有効量」は、内皮細胞損傷または周辺組織への損傷を予防
し、減少または後進させ得る量として定義される。

【００５４】 損傷の「修復」は、すでに発生した損傷の減少、または器官組織の機能の部分
的回復のような、完全修復および部分的修復を含む。

【００５５】 本明細書において使用されるように、「処置」は有益な臨床結果または所望さ
れる臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な臨
床結果または所望される臨床結果には、症状の軽減、疾患のある程度の減少、疾
患の状態の安定化（すなわち、改悪しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患
状態の改善または軽減、および回復（部分的か、または全体的かのいずれか）、
検出可能か否か、が挙げられるが、それらに限定されない。「処置」はまた、処
置を受けない場合に予想される生存と比較した長期的生存を意味する。「処置」
とは、治療的処置および予防または防止の手段の両方を言う。処置の必要にある
人は、すでにその障害にかかっている人、および予防され得る障害をもつ人を含
む。好ましい実施態様において、本発明の文脈における「処置」は、危険な状態
にある患者の内皮細胞の損傷または周辺組織への損傷の進行を防止し、および／
または処置される患者の内皮細胞の損傷または周辺組織への損傷を減少または後
進させる意図で実施される介入である。

【００５６】 疾患を「軽減」することは、処置なしの状態と比較して、疾患状態の程度およ
び／または望ましくない臨床的徴候を減少させ、および／または進行の時間経過
を減速または延長させることを意味する。

【００５７】 １つ以上のさらなる治療薬剤「と組み合わせて」の投与とは、任意の順序で同
時的（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）および連続的に投与することを含む。

【００５８】 語句「溶血性尿毒症症候群」または「ＨＵＳ」は、広範な意味において使用さ
れ、そして腎不全が主な特徴か否かとは関係なく、血栓性微小血管溶血性貧血お
よび種々の損傷器官により特徴付けられるすべての疾患および状態を含む。この
疾患は特に、幼児において頻繁であり、ここで、それは急性腎不全のほとんど共
通の原因である。しかし、本明細書において定義されるように、この語句は、代
表的に成人において観察される症候群を特に含み、これはまた血栓性血小板減少
性紫斑病（ＴＴＰ）まで言及され、そして一般的に、主な血栓性血球減少症およ
び神経学的損傷によって特徴付けられるが、潜在的な病理学的損傷として血栓性
微小血管症を有する。

【００５９】 用語「限局性糸球体硬化症」は、潜在的原因とは無関係に、微小血管症に関連
し、そして腎臓の糸球体の限局性硬化損傷の存在により特徴付けられる状態を言
うために使用する。限局性糸球体硬化症は、特発性ネフローゼ症候群において、
共通であり、そして乏しい病気経過の見通しの指標として使用されるが、次に、
感染（例えば、ヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）感染）、薬物および薬物治療（
例えば、薬物乱用、ＮＳＡＩＤ、鎮痛剤乱用）、腎臓全体の縮小、（例えば、ｉ
ｎｏｌｉｇｎｅｐｈｒｏｎｉａ、片側腎臓無発育症、腎臓形成異常症など）また
は直接、上皮細胞に損害を与える過程および糸球体硬化症を支持する血流力学的
変化（例えば、真性糖尿病、過敏性動脈硬化症、炎症後瘢痕、または壊死後瘢痕
）を誘導する過程に関連する広範で種々の他の糸球体疾患および多系疾患をも引
き起こし得る。

【００６０】 用語「アミロイド症」とは、不溶性微小繊維タンパク質の細胞外沈着の存在に
より特徴付けられる慢性的な浸潤性疾患の種々のファミリーを言う。アミロイド
症は、進歩的な腎臓機能不全がしばしば後に続く腎臓ネフローゼ症候群の発達を
頻繁に生じる。

【００６１】 用語「糸球体腎炎」または「ＧＮ」は、広範な意味で使用され、そして糸球体
の毛細管網の構造または機能が、腎臓に大部分限られる過程の結果として妨害さ
れる、すべての主な糸球体疾患を含む。この用語は、原因となる因子および潜在
的病変に関係なく、特に、急性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、および慢性
糸球体腎炎を含む。

【００６２】 用語「糖尿病」は、広範な意味で使用され、そして特に、インスリン依存性真
性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）、およびインスリン非依存性真性糖尿病（Ｎ
ＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を含む。部分的には、内皮細胞損傷による血管性合併
症の理由で、ＩＤＤＭの患者は死亡率を増加させている。

【００６３】 語句「全身性紅斑性狼瘡」、または「ＳＬＥ」は、２次的糸球体疾患であり、
腎臓関連であることが十分に立証されている。ＳＬＥのほとんどの患者が、糸球
体Ｉｇおよび沈着成分の補体を有し、そしてしばしば、細管萎縮、細胞間線維症
、糸球体硬変、線維状半月体、癒着および動脈硬化のような慢性の変化を表す、
糸球体の損傷を示すものと一般に思われている。

【００６４】 本明細書で使用される「キャリア」は、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤
、または安定化剤を含み、これらは、投薬量および使用される濃度でそれらに曝
露される細胞または哺乳動物に対して毒性がない。生理学的に受容可能なキャリ
アは、しばしば、水性のｐＨ緩衝溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの
例は、リン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を
含む酸化防止剤；低分子量ポリペプチド（１０残基未満）；血清アルブミン、ゼ
ラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのよ
うな疎水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたは
リジンのようなアミノ酸；モノサッカライド、ジサッカライドおよびグルコース
、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレ
ート化剤；マンニトール、またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウ
ムのような塩形成化カウンターイオン；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）
、ポリエチレンリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）の
ような非イオン性界面活性化剤）を含む。

【００６５】 慢性的「投与」とは、初期の治療効果（活性）を長期間持続するための、急性
の態様に対して連続的態様における薬剤の投与をいう。

【００６６】 「断続的な」投与は、中断なく連続的に行われるのではなく、むしろ周期的な
性質の処置である。

【００６７】 （一般的な技術） 本発明の実施は、特に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微
生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を利用し、これらは当
該分野の技術範囲内である。このような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第二版（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」
（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．
Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ Ｖｅｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．
Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃ
ｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；および「Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃ
ｏｌｉｇａｎら編、１９９１）のような文献に充分に説明されている。

【００６８】 （発明の実施態様） 本発明は、脈管形成因子、それらのアゴニスト、または脈管形成の産生を刺激
する因子を投与することによる、血管に対する損傷を予防および／または修復す
るための方法および組成物に関する。特定の実施態様において、本発明は、微小
血管障害、特に血栓性微小血管障害と関連する血管障害を予防および／または修
復するための方法および組成物に関する。本発明はさらに、血管に対する損傷に
関連する非血管性組織に対する傷害の予防および／または修復のための方法およ
び組成物に関連し、そのような組織に、脈管形成因子、そのアゴニスト、または
脈管形成因子の産生を刺激する因子の投与を介して作用する。

【００６９】 （Ａ．脈管形成因子） 例示的な脈管形成因子は、上記に列挙されている。一般に、脈管形成因子は、
簡単な、または複雑な有機または無機の分子、ペプチド、またはタンパク質のよ
うな生物学的または化学的な化合物であり得る。化合物の広範なアレイが合成さ
れ得（例えば、オリゴペプチド、ならびに種々のコア構造に基づいた合成無機化
合物および有機化合物）、これらもまた包含される。本発明の目的にとって好ま
しい脈管形成因子には、本明細書上記に定義されるように、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ
、およびｂＦＧＦが含まれるが、これらに限定されない。

【００７０】 （Ｂ．天然の脈管形成性因子のアミノ酸配列改変体） 天然の脈管形成因子（例えば、天然のＶＥＧＦポリペプチド）のアミノ酸配列
における改変には、天然のポリペプチド配列における１つ以上のアミノ酸の置換
、欠失、および／または挿入が含まれる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、
類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸に置換した結果で
あり得る（例えば、ロイシンのセリンでの置換（すなわち、保存的アミノ酸置換
））。挿入または欠失は、必要に応じて１〜５アミノ酸の範囲であり得る。可能
な改変は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に作成し、そし
てその得られる改変体を高血圧の任意のアッセイ（例えば、以下の実施例に記載
されるアッセイ）において活性について試験することによって決定され得る。

【００７１】 アミノ酸配列改変体の好ましい群において、ＶＥＧＦ構造における１つ以上の
システイン残基は、別のアミノ酸によって置換される。このような置換は、分子
間および分子内のジスルフィド結合の形成についての機会を減少させ、それによ
り、その分子をより安定にする。ｈＶＥＧＦ１２０、ｈＶＥＧＦ１６５、および
対応するウシホモログ中に存在する９つのシステイン残基が存在する。これらの
うち、８つが、ＰＤＧＦとともに保存されている。従って、最も好ましいアナロ
グは、９つのシステイン残基がセリンによって置換されているものである。この
システイン残基は、ｈＶＥＧＦ１６５の１６０位、およびｈＶＥＧＦ１２１の１
１６位およびウシ形態のその対応する位置に表される。ＶＥＧＦ分子の改変体形
態についてのいくつかのさらなる情報は、米国特許第５，３３２，６７１号に提
供される。本発明に詳細に包含されるのは、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／３６０７
５に記載される改変体ＶＥＧＦ分子であり、その開示は、参考として明確に援用
される。このようなＶＥＧＦ分子は、薬物動態学的プロフィールの機能的改変を
生じることが記載されているＣ末端ヘパリン結合ドメインに改変を含み、そして
その対応するヘパリン結合ネイティブＶＥＧＦ分子と比較して減少したクリアラ
ンス速度を有する分子を生じる。好ましい実施態様には、ヘパリン結合ＶＥＧＦ
種のヘパリン結合ドメイン内での正に荷電したアミノ酸の、負に荷電したかまた
は中性のアミノ酸での置換が含まれる。さらに、Ｃ末端ヘパリン結合ドメインの
部分が欠失したＶＥＧＦ改変体は、本発明の範囲に含まれる。その改変体は、オ
リゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、および
ＰＣＲ変異誘発のような当該分野で公知の方法を使用して作製され得るか、また
は組換え産生から選択された宿主の固有の特性の結果として生じ得る。部位特異
的変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４３３
１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０：６
４８７（１９８７）］、カセット変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３
１５（１９８５）］、制限選択変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａ
ｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］ま
たは他の公知の技術が、クローン化されたＤＮＡ上で行われて、ＶＥＧＦ改変体
をコードするＤＮＡを産生し得る。

【００７２】 スキャニングアミノ酸分析はまた、連続する配列に沿って１つ以上のアミノ酸
を同定するために利用され得る。好ましいスキャニングアミノ酸の中には、比較
的小さな中性のアミノ酸がある。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン
、セリン、およびシステインが含まれる。アラニンは、代表的には、この群のう
ち、好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、それは、β炭素を超えて
側鎖を排除し、そして改変体の主鎖の立体構造を変更する可能性が低いからであ
る［ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８
１−１０８５（１９８９）］。アラニンはまた、代表的には、好ましい。なぜな
ら、それは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、それは、頻繁に
、包埋された位置および露出した位置の両方において見出される［Ｃｒｅｉｇｈ
ｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．
Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］
。アラニン置換が適切な量の改変体を生じない場合、等配電子のアミノ酸が使用
され得る。

【００７３】 （Ｃ．脈管形成因子のアゴニスト） （抗体） 本発明に従ういくつかの薬物候補は、脈管形成因子（好ましくは、ＶＥＧＦ）
の、血管傷害、または非血管性組織（そのような組織に作用する血管に対する損
傷と関連する）に対する傷害の防止および／または修復する能力を模擬するアゴ
ニスト抗体である。

【００７４】 ポリクローナル抗体を調製する方法は、当該分野において公知である。ポリク
ローナル抗体を、例えば、免疫化剤およびアジュバント（所望される場合）の１
回以上の注射によって、哺乳動物において惹起し得る。代表的には、免疫化剤お
よび／またはアジュバントを、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、哺
乳動物に注射する。免疫化剤を、免疫する哺乳動物において免疫原性であること
が公知のタンパク質（例えば、血清アルブミン、またはダイズトリプシンインヒ
ビター）に結合体化させることは有用であり得る。使用され得るアジュバントの
例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭが挙げられる。

【００７５】 １つのアプローチに従って、モノクローナル抗体を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ
ｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）に記載の方法のよう
なハイブリドーマ方法を使用して調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス
、ハムスター、または他の適切な宿主動物を、免疫化剤に特異的に結合する抗体
を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘発するために、代表的に、免疫化剤
で免疫する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫し得る。一般的に、ヒト起
源の細胞が所望される場合には末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用するか、または
非ヒト哺乳動物の供給源が所望される場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞を使
用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、適切な融合剤（例えば、ポリ
エチレングリコール）を用いて不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を
形成する［Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
（１９８６）、第５９〜１０３頁］。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺
乳動物細胞であり、詳細にはげっ歯類起源、ウシ起源、およびヒト起源の骨髄腫
細胞である。通常は、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用する。ハイブリ
ドーマ細胞を、好ましくは融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害
する１つ以上の物質を含む適切な培養培地において培養し得る。好ましい不死化
細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベ
ル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞株で
ある。

【００７６】 次いで、ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地を、使用される特定の脈管形
成因子（例えば、ＶＥＧＦ）に対して指向されるモノクローナル抗体の存在につ
いてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノ
クローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によるかまたはインビトロ結合アッセ
イ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント
検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定する。このような技術およびアッセイは、
当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Ｍ
ｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０
（１９８０））のスキャッチャード分析によって決定し得る。

【００７７】 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、このクローンを限界希釈手順によ
ってサブクローニングし、そして標準的方法［Ｇｏｄｉｎｇ、前出］によって増
殖する。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イ
ーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリド
ーマ細胞を、哺乳動物において腹水としてインビボで増殖させ得る。

【００７８】 サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリ
ン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグ
ラフィーのような）によって、培養培地または腹水から単離または精製し得る。

【００７９】 あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載さ
れるような、組換えＤＮＡ方法によって作製され得る。本発明のモノクローナル
抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖
および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用することによって）、容易に単離および配列決定され得る。上記に議論
されるハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ
。一旦単離されると、このＤＮＡは、発現ベクター内に配置され得、次いで、こ
の発現ベクターは、他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例え
ば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細
胞）内にトランスフェクトされて、この組換え宿主細胞においてモノクローナル
抗体の合成を得る。

【００８０】 抗体（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂または抗体の他の抗原結合部
分配列のような、抗体フラグメントを含む）は、ヒト化され得る。ヒト化抗体は
、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。より詳細には、ヒト化抗体
において、ヒト免疫グロブリン（レシピエント）の相補性決定領域（ＣＤＲ）由
来の残基は、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたは
ウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換される
。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基はまた
、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体、
あるいは移入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにおいても見出さ
れない残基をさらに含み得る［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−
５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−
３２９（１９８８）］。

【００８１】 非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般的に、ヒ
ト化抗体は、非ヒト供給源からこのヒト化抗体に導入された１以上のアミノ酸残
基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ
）」残基と称され、これらは、代表的には「移入」可変ドメインから取られる。
ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法［Ｊｏｎｅｓら、
Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、
Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、げっ歯
類ＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって、行われ得る。
さらに、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏ
ｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）
；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］を含
む、当該分野で公知の種々の技術を使用して生成され得る。ＣｏｌｅらおよびＢ
ｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である
（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ ７７頁（１９８５）および
Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９
１）］。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物（例えば、マウス）内へ
のヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって作製され得、このトランスジェニ
ック動物において、内因性の免疫グロブリン遺伝子は、部分的または完全に不活
化されている。チャレンジの際に、ヒト抗体の生成が観察され、これは、遺伝子
の再編成、アセンブリおよび抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトに
おいて観察される生成と密接に類似する。このアプローチは、例えば、米国特許
第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５
号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，
０１６号、ならびに以下の科学文献：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６
８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）；Ｌｏ
ｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３
６５−９３（１９９５）に記載される。

【００８２】 抗体は、二重特異性であり得、ここで、一方の特異性は脈管形成因子に対し、
他方の特異性は別のタンパク質（例えば、第２の脈管形成因子、または同じ脈管
形成因子の異なるエピトープ）に対する。

【００８３】 （薬物候補についてのスクリーニングアッセイ） 薬物候補についてのスクリーニングアッセイを設計して、本発明の方法および
組成物で使用される、脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）のアゴニスト（例えば
、抗体または低分子アゴニスト）を同定する。このようなスクリーニングアッセ
イは、化学ライブラリーの高スループットスクリーニングに順応可能なアッセイ
を含み、このアッセイを低分子の薬物候補の同定に特に適合させる。意図される
低分子としては、以下を含む、合成の有機化合物または無機化合物が挙げられる
：ペプチド（好ましくは、可溶性ペプチド）、（ポリ）ペプチド−免疫グロブリ
ン融合体、および抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびに
抗体フラグメント、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、およびこのような抗体あ
るいはフラグメントのキメラバージョンまたはヒト化バージョン、ならびにヒト
抗体およびヒト抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない）。このアッ
セイは、当該分野でよく特徴付けられる、種々の形態（タンパク質−タンパク質
結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞ベー
スのアッセイを含む）において行われ得る。

【００８４】 好ましくは、薬物候補の生物学的活性は、処置されるべき状態の適切な動物
モデルにおいて試験される。脈管形成因子が、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）の処
置において有用性を見出すという認識は、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）ラット
モデルにおいて行われた研究に基づいている。最近まで、ＴＭＡまたはＨＵＳの
良好な動物モデルは存在しなかった。これは、部分的には、ＨＵＳをヒトにおい
て引き起こす主要な毒素（これは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７によって産生される
ベロ毒素（Ｓｈｉｇａ毒素）である）が、ヒト糸球体内皮に存在するが、齧歯類
の腎臓には存在しないＧ３ｂレセプターに結合することによって、内皮損傷を引
き起こすようであるからである。ＲｅｍｕｚｚｉおよびＲｕｇｇｅｎｅｔｉ，Ｋ
ｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，４７：２−１９（１９９５）。レクチン、シクロスポリン
、またはその他の薬剤によって誘導される糸球体内皮損傷のモデルのわずかな報
告が存在するが、これらのいずれも、ヒトにおいてＨＵＳに特徴的な臨床的症候
群を生じていない。Ｎａｎｇａｋｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．
Ｈｙｐｅｒｔ．７：４５７−４６２（１９９８）。

【００８５】 最近、腎ＴＭＡの新たなモデルが、ラットに対する異種抗ラット糸球体内皮細
胞（抗ＧＥＮ）抗体の受動的投与による多くのＨＵＳの特徴を有して開発されて
いる。Ｎａｎｇａｋｕら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５２：１８４−１９４（１９
９７）；Ｎａｎｇａｋｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒ．９：５９０−４９
７（１９９８）；Ｎａｎｇａｋｕら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５２：１５７０−
１５７８（１９９７）を参照のこと。抗体は、ヤギを、培養にて増殖させた全ラ
ット糸球体内皮細胞で免疫することによって生成され、その結果、糸球体に反応
性であり、そしてより低い程度に、ラットのその他の小血管および大血管内皮細
胞に対して反応性である高力価の抗体を得た。この抗体をラットの腎大動脈中に
注入する（２０〜８０ｍｇ／ｋｇの範囲）ことによって、糸球体および大血管内
皮細胞傷害およびアポトーシス、局所性剥離、血小板活性化および局在化、なら
びに尿細管傷害を生じる。ラットは、循環血小板数およびヘマトクリットにおい
て有意な減少を有し、そして末梢血スメアに対して細血管異常性の変化を示す。
コントロールの非還流腎臓が、注入の時点で外科的に除去された場合、そのラッ
トは、腎不全の迅速な開始を発達させる（Ｎａｎｇａｋｕら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉ
ｎｔ．５２：１８４−１９４（１９９７））。この動物モデルを、ｈＶＥＧＦ_{12 1} を試験するために使用したが、それは、さらなる脈管形成因子（ＶＥＧＦ改変
体、それらのアゴニスト、および脈管形成因子の産生を刺激する因子を含む）の
生物学的活性を試験するために等しく適している。ＨＵＳのラットモデルを使用
するさらなる詳細が、本明細書以下に提供される例から明らかである。

【００８６】 （治療標的） 上記のように、微小血管傷害は、より小さな血管に対する損傷および引き続く
組織（ここにそれらの血管が存在する）の不全によって特徴づけられる種々の障
害において起こる。その傷害は、しばしば、内皮細胞死および凝固または血栓の
産物の存在に関連する。傷害の薬剤は、毒素、免疫因子、感染性因子、代謝スト
レスおよび生理学的ストレス、体液性または細胞性免疫系の成分であり得、また
は未だに同定されていないものであり得る。血栓性微小障害はまた、妊娠（子癇
）、悪性高血圧などの合併症としても生じ得る。このような微小血管傷害（血栓
性微小血管障害を含む）は、腎臓、心臓および肺のような種々の器官において発
症し得る。

【００８７】 本発明は、特に、内皮細胞傷害が公知または未知の毒素によって媒介される状
態（例えば、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、毒素ショック症候群、毒液への曝
露、または化学物質、医薬、または免疫学的毒素への曝露において生じるような
もの）における、ならびに、内皮細胞傷害が、高血圧によって媒介される状態に
おける、血管に対する損傷の処置（予防を含む）、およびこのような血管を含む
組織に対する傷害の処置（予防を含む）に関する。

【００８８】 本発明はさらに、糸球体および間質の血管系の障害または萎縮症に関連する腎
臓疾患の処置（予防を含む）に関する。

【００８９】 本発明はまた、血管内皮への傷害の処置（予防を含む）に関し、そして過凝固
状態、血小板活性化または凝固、血栓、あるいは凝固カスケードのタンパク質の
活性化、あるいは、子癇前症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、汎発性血
管内凝固症候群、敗血症、膵炎のような凝固または血小板凝固の活性化に関連す
る疾患においてこのような傷害を受けた血管を含有する組織に対する傷害の処置
（予防を含む）に関する。

【００９０】 本発明はまた、血管に対する損傷または傷害を受けた血管（減少した血圧に起
因する減少した血流、あるいは、アテローム性硬化症、血栓症、機械的外傷、血
管壁切除、外科的切除、または正常な血流もしくは血圧に対する任意の他の障害
に起因する完全または部分的な血管の閉鎖の結果として生じる）に隣接する周囲
の組織に対する傷害の処置（予防を含む）のための方法を提供する。詳細には、
本発明は、急性の腎不全、付随する血栓崩壊治療を伴うかまたは伴わない心筋梗
塞、虚血性腸疾患、一過性虚血攻撃、ならびに発作の処置（予防を含む）のため
の方法を提供する。

【００９１】 本発明はまた、傷害性の免疫刺激、毒素、曝露、感染、または虚血（急性の呼
吸窮迫症候群、毒性肺胞傷害（煙の吸入によって生じる）、肺炎（ウイルス性お
よび細菌性感染を含む）、および肺塞栓を含むが、これらに限定されない）によ
って生じる肺の内皮への傷害から生じる低酸素または過炭酸症または線維症の処
置（予防を含む）のための方法を提供する。

【００９２】 本発明はさらに、肺内皮に対する傷害（誕生時未熟児（ｂｉｒｔｈ ｐｒｅｍ
ａｔｕｒｉｔｙ）、および肺の高血圧の一次的および二次的原因から生じる障害
を含む）から生じる肺機能不全の処置（予防を含む）のための方法および手段を
提供する。

【００９３】 本明細書に開示される方法はまた、血管傷害と関連する真皮の任意の傷害性損
傷から生じる創傷の処置に使用され得る。

【００９４】 本発明はまた、内皮および血管に対する損傷の処置（予防を含む）のための、
および、傷害性免疫刺激（例えば、免疫サイトカイン）、免疫複合体、補体カス
ケードのタンパク質に起因して傷害された血管を含む組織に対する傷害（全ての
型の血管炎、アレルギー性反応、急性および遅延型の過敏症の疾患、自己免疫疾
患のような疾患が含まれるが、これらに限定されない）の処置（予防を含む）の
ための方法を提供する。

【００９５】 本発明の方法は、器官同種移植（腎臓、心臓、肺、膵臓、皮膚、骨、腸、およ
び異種移植片の移植を含むがこれらに限定されない）の機能の保存または増強に
おいてさらに有用である。

【００９６】 本発明の方法を使用して処置しうる特定の腎臓疾患には、ＨＵＳ、局所性糸球
体硬化症、アミロイド沈着症、糸球体腎炎、糖尿病、ＳＬＥ、および慢性低酸素
／萎縮症が含まれる。

【００９７】 （脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドを含む送達ビヒクル） 本発明はまた、脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達（
インビボ、エキソビボ、またはインビトロのいずれに拘わらず）に適切な送達ビ
ヒクルを提供する。一般に、脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドは、プ
ロモーターおよび異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結している。脈管形成因
子をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を使用して、クロー
ニングまたは発現ベクター内に、またはウイルスベクター内に含まれ得る。これ
らのベクター（特に、発現ベクター）は、次いで、例えば、標的細胞への送達お
よび／または進入を促進し得る任意の数の形態を仮定するために操作され得る。
本発明のポリヌクレオチド構築物の真核生物細胞（特に、哺乳動物細胞、より詳
細には、腎臓の遠位尿細管（ｄｉｓｔａｌ ｔｕｂｕｌｅ）細胞）への送達は、
任意の適切な当該分野で公知の方法によって達成され得る。送達は、インビボ、
エキソビボ、またはインビトロで達成され得る。

【００９８】 本発明は、このような発現構築物を細胞へ移入するため、特にインビボで本発
明の方法を行うための方法および組成物を提供する。基礎となる血管傷害および
／または非血管性組織に対する関連する損傷の予防または修復を提供することに
よって、上記に列挙した状態の処置（予防を含む）のための組成物を提供するこ
ともまた本発明の目的である。

【００９９】 導入のための本発明の脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドの、宿主細
胞への取り込みに適切な送達ビヒクルには、非ウイルス性ビヒクルおよびウイル
スベクターが含まれる。ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ
３８９：２３９−２４２。

【０１００】 脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドの送達のための広範な種々の非ウ
イルス性ビヒクルは、当該分野で公知であり、そして本発明に包含される。脈管
形成因子をコードするポリヌクレオチドは、裸のＤＮＡとして細胞に送達され得
る（米国特許第５，６９２，６２２号；ＷＯ９７／４０１６３）。あるいは、脈
管形成因子をコードするポリヌクレオチドは、カチオン性脂質；生体適合性ポリ
マー（天然のポリマーおよび合成ポリマーを含む）；リポタンパク質；ポリペプ
チド；ポリサッカリド；リポポリサッカリド；人工的ウイルスエンベロープ；金
属粒子；および細菌が含まれるが、これらに限定されない種々の物質（送達の形
態）に種々の様式で関連する細胞に送達され得る。送達ビヒクルは、微小粒子で
あり得る。これらの種々の物質の混合物または結合体はまた、送達ビヒクルとし
て使用され得る。脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドは、これらの種々
の送達の形態と非共有結合的にまたは共有結合的に結合し得る。リポソームは、
特定の細胞型（例えば、糸球体内皮細胞）に標的化され得る。

【０１０１】 ウイルスベクターには、ＤＮＡウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、
単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）およびパルボ
ウイルス（アデノ随伴ウイルスを含む）に基づくもの）；ならびにＲＮＡウイル
スベクター（レトロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない）が
含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターには、マウス白血
病ウイルス、およびレンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス）が含まれ
る。Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７。

【０１０２】 脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドを含む非ウイルス送達ビヒクルは
、当該分野で公知の任意の方法（例えば、リン酸カルシウム共沈澱技術によるト
ランスフェクション；エレクトロポレーション；電気的透過化（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）；リポソーム媒介トランスフェクション；
弾道トランスフェクション；微小粒子ボンバードメント、ジェットインジェクシ
ョン、ならびにニードルおよびシリンジインジェクションを含む微粒子銃プロセ
ス；あるいはマイクロインジェクション）によって宿主細胞および／または標的
細胞に導入され得る。トランスフェクションの多数の方法は、当該分野の当業者
に公知である。

【０１０３】 ウイルス送達ビヒクルは、感染によって細胞に導入され得る。あるいは、ウイ
ルスビヒクルは、細胞への送達のために上記に記載される任意の非ウイルス送達
ビヒクルへと取り込まれ得る。例えば、ウイルスベクターは、カチオン性脂質と
混合され得る（ＨｏｄｇｓｏｎおよびＳｏｌａｉｍａｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３３９−３４２）；または層状リポソーム（
Ｗｉｌｓｏｎら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４：３４７１；およびＦａｌｌｅｒら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：２
６９）。

【０１０４】 インビボ送達のために、送達ビヒクルは、任意の多数の方法（その各々は当該
分野で周知である）によって個体に導入され得る。

【０１０５】 （薬学的組成物） 本発明の方法において使用される薬学的組成物は、脈管形成因子をコードする
ポリヌクレオチドを包含し得る。あるいは、薬学的組成物は、脈管形成因子自体
を含み得る。

【０１０６】 適切な形態は、部分的に、使用または進入の経路（例えば、経口、経皮、吸入
、注入による）に依存する。このような形態は、薬剤または組成物が、標的細胞
に到達することを可能にするべきである（その標的細胞が、多細胞宿主または培
養物中に存在するか否かに拘わらず）。例えば、血流中に注入されるべき薬理学
的薬剤または組成物は、可溶性であるべきである。その他の因子は、当該分野で
公知であり、そしてその薬剤または組成物がその効果を発揮することを防止する
毒性および形態のような考慮を含む。

【０１０７】 脈管形成因子または脈管形成因子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物
はまた、薬学的に受容可能な塩（例えば、酸付加塩）および／またはその複合体
として処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、これらが投与される濃度で非毒
性である。薬学的に受容可能な塩には、硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩、スルホン酸
塩、スルファミン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタ
ンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−スルスルホ
ン酸塩、シクロヘキシスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファメート、およびキ
ナ酸塩を含有するもののような酸付加塩が含まれる。薬学的に受容可能な塩は、
塩酸、硫酸、リン酸、スルホン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒
石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、
ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルホン酸、シクロヘキシルスルファ
ミン酸、およびキナ酸のような酸から得られ得る。このような塩は、例えば、産
物の遊離の酸または塩基形態を、塩が不溶性である溶媒または媒体中で、または
水のような溶媒中で適切な塩基または酸の１つ以上の等価物と反応させ、次いで
、その水を減圧下または凍結乾燥によって除去することによって、または存在す
る塩のイオンを適切なイオン交換樹脂上の別のイオンと交換することによって、
調製され得る。

【０１０８】 キャリアまたは賦形剤はまた、化合物の投与を容易にするために使用され得る
。キャリアおよび賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の
糖（例えば、ラクトース、グルコース、スクロースまたは種々のデンプン）、セ
ルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および生理学的
に適合し得る溶媒が含まれる。組成物または薬学的組成物は、静脈内、腹腔内、
皮下、および筋肉内、経口、局所、または経粘膜を含むが、これらに限定されな
い異なる経路によって投与され得る。

【０１０９】 この組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウムまたは他の薬学的に受容可能な
薬剤（例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、ポリエチレングリ
コール、マンニトールおよびソルビトールのようなポリオール）、または無機溶
質もしくは有機溶質を用いて達成され得る。

【０１１０】 抗原性因子または抗原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成
物は、種々の投与様式（例えば、全身投与および局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）投与
または局部的（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）投与）のために処方され得る。技術および
処方物は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａ
ｓｔｏｎ，ＰＡ １９９０に見出され得る。ＷａｎｇおよびＨａｎｓｏｎ「Ｐａ
ｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎ
ｄ Ｐｅｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」
、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．１０、補遺４
２−２Ｓ（１９８８）もまた参照のこと。適切な投与方式は、各患者個々の医学
的担当者により最良に決定され得る。

【０１１１】 全身投与については、注射は、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、鞘内
（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、または脳血管内が好ましい。注射に関しては、本
発明の化合物は、好ましくは、生理学的に適合可能な緩衝液（たとえは、ハンク
ス溶液またはリンゲル溶液）中で、液体形態に処方される。あるいは、本発明の
化合物は、ＵＳＰ基準により規定される程度に一般に受容される１つ以上の賦形
剤（例えば、ポリエチレングリコール）中で処方される。それらは、例えば、不
活性油（適切には、例えば、ゴマ油、落花生油、オリーブ油のような植物油、ま
たは他の受容可能なキャリア）中に懸濁され得る。好ましくは、それらは、水性
キャリア（例えば、約ｐＨ５．６〜７．４の等張性緩衝溶液）中に懸濁される。
これらの組成物は、従来の安定化技術により安定化され得るか、または濾過滅菌
され得る。この組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて薬学的
に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ緩衝化剤）を含み得る。有用な緩衝液とし
ては、例えば、酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液が挙げられる。持続性（ｒｅｐｏｓ
ｉｔｏｒｙ）またはデポー徐放性調製物の形態は、治療的に有効な量の調製物を
経皮的な注射もしくは送達の後に数時間または数日かけて血流に送達するように
使用され得る。さらに、化合物は、固体形態で処方され得、そして使用直前に再
溶解され得るか、または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた含まれ得る。

【０１１２】 あるいは、この化合物は、経口的に投与され得る。経口投与に関しては、この
化合物は、便利な経口投薬形態（例えば、カプセル剤、錠剤および強壮薬）に処
方される。

【０１１３】 全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段であり得る。またはこの分子は、
経口投与され得る。経粘膜的または経皮的投与に関しては、透過されるべき障壁
に適切な透過剤（ｐｅｎｅｔｒａｎｔ）を処方物中に使用する。このような透過
剤は、一般に当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜的投与に関しては、
胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、界面活性剤が透過を容
易にするために使用され得る。経粘膜的な投与は、例えば、鼻スプレーを通して
、または坐剤によってであり得る。

【０１１４】 経口投与に関しては、分子は、従来の経口投与投薬形態（例えば、カプセル剤
、錠剤および液体調製物）に処方される。

【０１１５】 吸入による投与に関しては、通常吸入可能な乾燥散剤組成物またはエアロゾル
組成物を使用し、ここで粒子もしくは小滴のサイズは、活性成分が確実に気道の
所望の部分（例えば、咽頭、上部気道または肺）に沈着するように選択される。
その投与ための吸入可能な組成物およびデバイスは、当該分野で周知である。例
えば、吸気用のエアロゾル医薬を送達するためのデバイスが、公知である。１つ
のこのようなデバイスは、デバイスの各作動毎に患者に同じ投薬量の医薬を送達
する定量噴霧型吸入器である。定量噴霧型吸入器は、代表的には、医薬のリザー
バを含むキャニスターおよび加圧されたプロペラントおよび一定容量定量チャン
バー（ｆｉｘｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ｍｅｔｅｒｄ ｄｏｓｅ ｃｈａｍｂｅｒ）
を備える。このキャニスターは、本体中のレセプタクル（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ
）または患者に医薬を送達するためのマウスピースもしくはノーズピースを有す
る基部へ挿入される。患者は、本体へ向かってキャニスターを手で押してデバイ
スを使用し、充填バルブを閉鎖し、そしてチャンバー内部の定量の医薬を捕捉し
、そして用量チャンバ中の捕捉された一定容量の医薬をエアロゾル噴霧として大
気へ解放する解放バルブを開放する。同時に、患者はマウスピースを通して噴霧
を確実に気道へ吸入する。次いで、患者は、次の医薬投与のために用量チャンバ
を再充填するために、解放バルブを閉鎖し、そして充填バルブを開放して、キャ
ニスターを解放する。例えば、米国特許第４，８９６，８３２号およびＡｅｒｏ
ａｏｌ Ｓｈｅａｔｈｅｄ Ａｃｔｕａｔｏｒ ａｎｄ Ｃａｐとして知られる
３Ｍ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販される製品を参照のこと。

【０１１６】 別のデバイスは、呼吸作動型（ｂｒｅａｔｈ ａｃｔｕａｔｅｄ）定量噴霧型
吸入器である。これは、患者の吸気努力に応答して自動的に一定用量を提供する
ように動作する。１つの方式の呼吸作動型デバイスは、吸気努力が放出バルブの
引き金を引くために機械的レバーを動かすときに一定用量を解放する。別の方式
は、熱線風速計（ｈｏｔ ｗｉｒｅ ａｎｅｍｏｍｅｔｅｒ）により検出される
場合、検出されたフローが予備設定された閾値を超えて上昇したときに用量を放
出する。例えば、米国特許第３，１８７，７４８号；同第３，５６５，０７０号
；同第３，８１４，２９７号；同第３，８２６，４１３号；同第４，５９２，３
４８号；同第４，６４８，３９３号；同第４，８０３，９７８号を参照のこと。

【０１１７】 デバイスはまた、乾燥散剤化薬物を患者の気道に送達し（例えば、米国特許第
４，５２７，７６９号を参照のこと）、そして固体のエアロゾル前駆体物質を加
熱することによりエアロゾルを送達する（例えば、米国特許第４，９２２，９０
１号を参照のこと）ために存在する。これらのデバイスは、代表的には、リザー
バから気道に薬物を引き上げるか、または加熱要素を作動して固体のエアロゾル
前駆体を揮発させるために患者の吸気流に依存することによって患者の吸気の初
期段階の間に薬物を送達するように動作する。

【０１１８】 エアロゾルの粒子サイズを制御するためのデバイスもまた公知である（例えば
、米国特許第４，７９０，３０５号；同第４，９２６，８５２号；同第４，６７
７，９７５号；および３，６５８，０５９号を参照のこと）。

【０１１９】 局所的投与に関しては、本発明の化合物は、当該分野で一般に公知であるよう
に、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに
処方される。

【０１２０】 所望であれば、上記の組成の溶液は、濃稠化剤（例えば、メチルセルロース）
を用いて濃化し得る。それらは、油中水型または水中油型のいずれかで乳化形態
に調製され得る。任意の広範な種々の薬学的に受容可能な乳化剤が利用され、こ
れらとしては、例えば、アカシア粉末、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅ
ｅｎ）またはイオン性界面活性剤（例えば、アルカリ性ポリエーテルアルコール
スルフェートまたはスルホネート（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ））が挙げられる。

【０１２１】 本発明において有用な組成物は、成分を一般に受け入れられる手順に従って混
合することにより調製される。例えば、これらの選択された成分は、ブレンダー
または他の標準的なデバイスで単に混合されて、濃縮された混合物を生成し得る
。次いで、これは、水または濃稠化剤および、おそらくはｐＨを調節するための
緩衝剤もしくは等張性を制御するための溶質を添加することにより最終的な濃度
および粘性に調節され得る。

【０１２２】 投与されるべき、本発明の方法において使用される種々の化合物の量は、標準
的手順により決定され得る。一般に、治療的に有効な量は、患者の年齢およびサ
イズ、ならびに患者と関連する疾患もしくは障害に依存して、約１００ｍｇ／ｋ
ｇと１０^-12ｍｇ／ｋｇとの間である。一般に、この量は、処置される個体につ
いて、約０．０５と５０ｍｇ／ｋｇとの間の量であり、好ましくは、１と２０ｍ
ｇ／ｋｇとの間の量である。

【０１２３】 医師による使用に関しては、この組成物は、脈管形成因子の量を含む投薬単位
形態で提供される。

【０１２４】 以下の実施例は、本発明を制限するためではなく、例示のために提供される。
本明細書全体（実施例を含む）を通して引用される全ての参考文献は、明らかに
本明細書中に参考として援用される。

【０１２５】 （実施例１：実験的ＴＭＡにおけるＶＥＧＦによる急死の減少） Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２００ｇ以上）を、エキセシン（ケタ
ミン、アセプロマジンおよびキシラジンの組み合わせ）で麻酔し、次いで、開腹
して左腎臓を取り出した。次いで、大動脈を切り離し、そして右腎動脈の小孔の
上および下の大動脈周辺に結紮を配置した。次いで、結紮を上腸間膜動脈周辺に
配置し（右腎臓動脈の反対である）、そして右腎臓への血流をステンレス鋼クリ
ップで一時的に停止させた。この上部をリン酸緩衝化生理食塩水（０．５ｍｌ）
で灌流して、腎臓から血液を洗い流し、次いで１ｍｌの４０ｍｇ／ｋｇのヤギ抗
ラット糸球体内皮細胞抗体（Ｎａｎｇａｋｕら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５２：
１５７０−１５７８（１９９７）に記載される抗ＧＥＮ ＩｇＧ；モデルを記載
する、Ｎａｎｇａｋｕら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５２：１８２−１９４（１９
９７）およびＮａｎｇａｋｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｏｈｒｏｌ．Ｈｙｐ
ｅｒｔｅｎｓ ７：４５７−４６２（１９９８）もまた参照のこと）で灌流した
。灌流後、腎臓血流を元に戻し（合計の虚血時間は常に１０分未満）、そして針
を取り出し、そしてゲル発泡体（ｇｅｌｆｏａｍ）で出血を止めた。次いで、創
傷を閉じ、そして動物を暖めたランプの下で回復させた。抗体灌流後の最初の１
時間に、ラットに盲検様式でｈＶＥＧＦ₁₂₁（５０ｇ／ｋｇ）またはビヒクルの
いずれかを皮下（ｓ．ｃ．）に１２時間ごとに注射した。この研究において、エ
ンドポイントは、最初の４時間の間の死亡率である。これを、この用量で最初の
２４時間に生じるＢＵＮにおける顕著な上昇を与えた重篤な腎不全の原因である
と推測した（Ｎａｎｇａｋｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｏｈｒｏｌ．Ｈｙｐ
ｅｒｔ．７：４５７−４６２（１９９８））。

【０１２６】 この結果を以下に示す。

【０１２７】

【表４】 これらの結果は、ＶＥＧＦ灌流が実験的ＴＭＡにおける急死を低減する能力を
有し得るという、強くかつ示唆的な証拠を提供する。

【０１２８】 （実施例２：実験的ＴＭＡにおけるＶＥＧＦ灌流による皮質壊死の減少） 本発明者らは、実施例１に記載した動物モデルにおいて皮質壊死を予防するｈ
ＶＥＧＦ₁₂₁の効果を試験した。実施例１におけるコントロールラットの疾患の
重篤度および高死亡率のために、非灌流腎臓を取り出さないように、本研究を改
変した（これは、正常腎臓の存在に起因する腎不全の発生を予防する）。この実
験を、高用量の抗糸球体内皮細胞抗体（抗ＧＥＮ ＩｇＧ、８０ｍｇ／ｋｇ）を
上腸間膜動脈を通しての右腎臓の選択的灌流により投与したことを除いて、他の
点では、本質的に実施例１に記載の通り行った。このモデルを用いた初期の研究
は、皮質および髄質両方の梗塞が高用量の抗ＧＥＮ抗体を灌流したときに生じた
ことを実証した。本発明者らは、ＶＥＧＦの初期投与がこの合併症を予防し得る
かどうかと考えた。従って、本発明者らは、８０ｍｇ／ｋｇ用量の抗ＧＥＮ抗体
の注射後の最初の１時間にｒｈＶＥＧＦ₁₂₁（５０μｇ／ｋｇ）を注射した。コ
ントロール動物にはＰＢＳを与えた。異なる部位に１２時間間隔で１日に２回、
投与を皮下で行い、そしてこれを７日間続けた。灌流して１０分後、４日後、お
よび７日後にラットを麻酔し、そして腎臓生検を行った。組織をｍｅｔｈｙｌｃ
ａｒｎｏｙ'ｓ固定液で固定し、そしてパラフィン包埋し、切片化し（４μｍ）
、そして過ヨウ素酸／シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色するか、または以下の抗原の
免疫染色のために処理した：１Ａ４（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）を
用いたα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、平滑筋細胞のマーカー）；ＲＥＣＡ−１
抗体（Ｈａｒｌａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｎａｎｇａｋｕら、Ｋｉｄｎｅ
ｙ Ｉｎｔ．５２：１８２−１９７（１９９７）もまた参照のこと）を用いた内
皮細胞；およびマウス抗ｅＮＯＳ抗体（Ｌｏｍｂａｒｄｉら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎ
ｓｉｏｎ ３３：１０１３−１０１９（１９９９）に以前に記載されたとおり、
Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）を用いた内
皮細胞一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ、ＮＯＳ ＩＩＩ））。注射した抗ＧＥ
Ｎ ＩｇＧ抗体の糸球体内皮細胞結合を確認するために、ウサギ抗ヤギＩｇＧ（
Ｃａｐｐｅｌ，Ｏｒｇａｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ
）を用いるＩｇＧ灌流の１０分後に得た４μｍの凍結組織切片で免疫蛍光を行っ
た（Ｎａｎｇａｋｕら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５２：１８２−１９７（１９９
７）（前出））。ＲＥＣＡ−１陽性糸球体密度およびαＳＭＡ陽性脈管の形態計
測分析を、コンピューター補助画像分析ソフトウェア（Ｏｐｔｉｍａｓ，ｖ．６
．２，Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ，
ＭＤ）およびデジタル化画像を用いて行った。壊死組織の占める面積％を、上記
のＯｐｔｉｍａｓシステムを用いて、ＰＡＳ染色切片における壊死面積％を測定
することにより、各生検の全皮質および髄質に対して２．５倍で測定した。ＲＥ
ＣＡ−１陽性糸球体およびＳＭＡ陽性脈管の数を、皮質および髄質近傍領域の５
×視野で定量し、そして平均数／ｍｍ²を計算した。

【０１２９】 （結果） ７日目に、灌流した腎臓の表面を、ＶＥＧＦ非処置群における介入性赤色領域
とともに黄白色領域をカバーした（図１３）。目に見える異常は、灌流した左腎
臓では観察されなかった（データは示さず）。細胞表面には、皮質および髄質に
分布した一様でない黄白色領域がみられた（図１３Ｂ）。被膜の直下の皮質は、
比較的保護されていた。組織学的には、種々の大きさの代表的な壊死領域があっ
た（図１４、矢印）。これは、糸球体および細管において核を喪失した壊死組織
から構成される中心的死領域（ｃｅｎｔｒａｌ ｄｅａｄ ｚｏｎｅ）（図１４
Ｂ）、糸球体および細管の核が喪失し、そして多形質細胞侵襲を有する周辺死領
域（図１４Ｂ、矢印）、および種々の程度の壊死、細管再生および線維症を有す
る辺縁の領域を有する（図１４Ｃ）。

【０１３０】 抗ＧＥＮ ＩｇＧ灌流後７日間にわたるｒｈＶＥＧＦ₁₂₁の全身投与は、大部
分のラットにおいて目に見える壊死の証拠の排除を生じた（図１３Ｃ、Ｄ）。切
断表面では、壊死領域は主に髄質に分布した。組織学的研究によって、壊死領域
が皮質で５％未満になり、そして髄質においては３６％に減少したことが示され
た（図１４Ｄ、表１）。（非壊死領域においては、糸球体の約半分がメサンギウ
ムの増加を示し、一方、残りの半分は、かなり正常に見えた）。細管の拡大およ
び萎縮症は、外側髄質で顕著であった（図１４Ｅ）。２つの群の間の病原性ヤギ
ＩｇＧの沈着に、差異はなかった（データは示さず）。

【０１３１】 ｒｈＶＥＧＦ₁₂₁投与は、腎臓脈管系を保護することがわかった。７日目に、
インタクトな裏打ち内皮細胞を有する糸球体の数は、コントロール群よりＶＥＧ
Ｆ処置群においてより大きかった（表１、図１５Ｅ）。コントロール群において
、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）陽性脈管（小動脈を示す）は、髄質におい
てはほとんど観察されなかった（図１５Ａ）が、α−ＳＭＡ陽性脈管の多数は、
ＶＥＧＦ処置群において脈管束に分布した（図１５Ｂ）。α−ＳＭＡ陽性脈管は
、ＶＥＧＦ非処置群の表面皮質において比較的保存されていた（図１５Ａ）が、
ＶＥＧＦ処置群と比較すると、α−ＳＭＡ陽性脈管の数はなお有意に減少した（ 表１、図１５Ｂ）。

【０１３２】 本発明者らは、４時間の時点で免疫染色および／またはウェスタンブロッティ
ングによって内皮細胞一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の発現をモニターした
。抗ＧＥＮ抗体のみを与えた群においては、ｅＮＯＳは、いくつかの動脈、小動
脈、および皮質の糸球体の内皮細胞に局在し、そして髄質においてはｅＮＯＳは
ほとんど染色されなかった（図１５Ｃ）。ＶＥＧＦ処置ラットにおいて、ｅＮＯ
Ｓは、糸球体および脈管内皮細胞に、ならびに細管上皮細胞および髄質中の脈管
束に広範に分布した（図１５Ｄ）。本発明者らは、糸球体中のＰＣＮＡ陽性細胞
の数もまた試験した。これは、２つの群の間で有意差を示さなかった（表１）。

【０１３３】

【表１】 ＨＵＳのこのモデルにおいて、内皮細胞に対する損傷は、特異的抗体の結合に
よって誘導された内皮細胞膜に活性化された補体が局在することにより媒介され
る。ＶＥＧＦが循環する毒素（例えば、補体タンパク質）により誘導された損傷
に対する保護効果を発揮し得るか否かを決定するために、本発明者らは、インビ
トロで細胞死のモデルにおけるＶＥＧＦ₁₂₁の効果を試験した。ヒト臍静脈内皮
細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した慣用的な培養培
地中で組織培養ウェルにプレートした。次いで、細胞を無血清培地（これは、カ
スパーゼ３Ｃの活性化により決定されるように、いくらかの細胞死を誘導した）
中に配置した（表２）。表２に示されるように、細胞の１０％ザイモサン活性化
ウサギ血清（ザイモサンは、補体カスケードを活性化する）への曝露は、細胞死
が増加したことを実証した。ザイモサン活性化血清に曝す前に、５０ｎｇ／ｍｌ
のＶＥＧＦに４時間または１４時間曝した細胞は、細胞損傷の補体媒介による増
大に対して完全な保護を示した。

【０１３４】

【表２】 （考察） 本研究は、ｒｈＶＥＧＦ₁₂₁の投与が内皮細胞アポトーシスの減少、糸球体毛
細管を含む脈管構造の保護および抗ＧＥＮ抗体によって誘導されたＨＵＳ様モデ
ルにおける腎壊死の保護を導くことを実証する。本発明者らはまた、ｒｈＶＥＧ
Ｆ₁₂₁がインビトロで活性化補体により誘導された内皮細胞損傷を阻害すること
を示した。従って、腎損傷に対するＶＥＧＦの防御効果は、このモデルにおいて
内皮細胞損傷の保護に帰する。ＶＥＧＦは、血清飢餓（Ｇｅｒｂｅｒら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０３３６−３０３４３（１９９８））またはＴＮ
Ｆ−α（Ｓｐｙｒｉｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏ
ｌ．２９：１３２１−１３３０（１９９７）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄ
ｉｏｌ．３０：８９７（１９９８）において発表された誤植（ｅｒｒａｔｕｍ）
）により誘導された培養内皮細胞アポトーシスを予防し得ることが以前報告され
た。ＶＥＧＦ阻害は、内皮細胞アポトーシスおよび新生仔における発生または種
々の器官の欠陥を生じた（Ｇｅｒｂｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：
１１４９−１１５９（１９９９））。しかし、本研究の前、成体において、内皮
細胞に対するＶＥＧＦの保護効果は、腫瘍組織においてのみ示された。本研究は
、成体における非腫瘍脈管に対するＶＥＧＦの防御効果を示す、最初の研究であ
る。ＶＥＧＦの別の重要な公知の作用は、新脈管形成であり、そしてＶＥＧＦは
、成体における虚血性疾患に対する潜在的な治療因子として試験されてきた。し
かし、本研究においては、ＰＣＮＡ陽性細胞の数は、４日目または７日目の２つ
の群の間で有意差を示さなかった。さらに、ＶＥＧＦで処置した虚血性組織にお
ける毛細管密度および血流の増加を観察するには少なくとも２週間が必要である
ことが報告された（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３
：６６２−６７０（１９９４））。従って、７日目で腎壊死の改善を微小血管再
生の増強とすることは疑わしい。本発明者らは、どんな特定の理論に束縛される
ことも意図しないが、ＶＥＧＦの腎の防御効果の可能な機構は、ＮＯにより媒介
されるその血管拡張性（ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒｙ）、抗血小板および／または
抗凝固作用と関連づけらる。本発明者らは、以前、疾患の誘導の４〜２４時間後
に、このモデルにおける糸球体ＶＥＧＦおよびｅＮＯＳ免疫染色の一時的な増強
を観察した（Ｎａｎｇａｋｕら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５２：１８２−１９４
（１９９７））。糸球体ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルはまた、２４時間で一時的に
上昇し、７日目に正常未満になった（未発表データ）。従って、糸球体内皮細胞
損傷に対する自己防御機構としてＶＥＧＦおよびＮＯレベルの上昇を考慮するこ
とは可能であるが、これは、損傷の進行をブロックするには不十分である。外因
性ＶＥＧＦの投与は、内因性防御機構の強化であり得る。

【０１３５】 （実施例３：ＶＥＧＦは、ＴＭＡのモデルにおける再構築および組織修復を刺
激する） 本質的に実施例１に記載した同じ動物モデルにおいて、本発明者らは、ＶＥＧ
Ｆが、確立したＴＭＡを有するラットにおいて有益であり得るという仮説を試験
した。ＴＭＡを、ラットにおいて低用量の抗ＧＥＮ ＩｇＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）
の選択的右腎臓動脈灌流によって誘導した。２４時間後、１４日目までラットに
ｒｈＶＥＧＦ₁₂₁（５０μｇ／ｋｇ、ｂ．ｉ．ｄ．）またはビヒクル（コントロ
ール）を毎日与えた。この片方だけの灌流モデルにおける腎機能に対するＶＥＧ
Ｆ処置の効果を評価するために、非灌流（通常）左腎臓を１４日目に取り出し、
そして腎機能を１７日目に測定し、次いで、屠殺して腎臓生検を行った。

【０１３６】 内皮細胞染色の正常パターン（図１６Ａ）とは対照的に、損傷の２４時間後、
ＧＥＮおよびＰＥＮ両方の損傷は広がり、内皮細胞が存在しないことが大きな領
域で示された（図１６Ｂ）。引き続き１０日の間に、毛細管密度の有意な回復を
ビヒクル処置ラットにおいて証明することができた（図１６Ｃ）が、毛細管密度
は、ＶＥＧＦ処置ラットにおいて有意により大きかった（図１６Ｄ）。このこと
は、インタクトな糸球体数の増加、皮質容積の保存、およびより良好な腎機能と
関連づけられた（表３）。さらに、コントロールラットにおいて毛細管修復が生
じたが、ＶＥＧＦ処置ラットは、免疫染色により決定されたように、毛細管密度
のより大きな回復、増加した尿亜硝酸塩および増加したｅＮＯＳ発現を示した（
表３）。

【０１３７】

【表３】 コントロールラットは、微小血管損傷、糸球体損傷および尿細管間質性（ＴＩ
）線維症ならびに腎不全を発症した。損傷の２４時間後に開始したＶＥＧＦ処置
は、腎前方および小葉内の動脈密度（４．５８±０．２３対３．２５±０．３８
／ｍｍ²、ｐ＝０．０１）の増加と関連づけられ、糸球体虚血（０．０４±０．
０１対０．１４±０．０４虚脱した糸球体／ｍｍ²、ｐ＝０．０３）とはあまり
関連づけられなかった。ＶＥＧＦ処置はまた、減少したＴＩ線維症（１０．２±
３．７対２５．７±４．６％、ｐ＝０．０３）、増加した皮質厚（１．３２±０
．０５対１．１１±０．０２ｍｍ、ｐ＜０．０１）、および改善した腎機能（Ｂ
ＵＮ６８±８対１７２±４０ｍｇ／ｄｌ、ｐ＋０．０３）と関連づけられた。Ｖ
ＥＧＦ処置は、増加した尿硝酸塩／亜硝酸塩（ＮＯｘ）濃度と関連づけられた（
１９１３±１８０対７８６±４００ｎｍｏｌ／日、ｐ＝０．０２）。ＶＥＧＦを
抗体灌流の１時間後に投与する場合のＶＥＧＦの効果とは対照的に（実施例１）
、本発明者らは、腎梗塞に対してＶＥＧＦの効果がなかった（３．７±１．７対
１．９±２．２％、ｐ＝ＮＳ）ことに注目した。抗体の用量を、梗塞を最小にす
るように選択した。

【０１３８】 本発明者らは、急性ＴＭＡを確立した後に開始したＶＥＧＦ処置が、腎機能お
よび組織学を改善することを結論づける。

【０１３９】 古典的な流行性ＨＵＳにおいて、ベロ毒素誘導性ＧＥＮ損傷が疾患を媒介する
ことは充分に認められている。現在では、ＨＵＳ様モデル、すなわち、内皮細胞
損傷は、抗ＧＥＮ抗体での腎動脈の選択的灌流により誘導されている。ＨＵＳの
理想的な動物モデルにおいて、ＧＥＮ損傷は、ベロ毒素により誘導されている。
しかし、内皮細胞は、大部分の実験動物においてはベロ毒素に非感受性であり、
そしてＨＵＳの潜在的非感染性の原因が存在する（ここで、ＧＥＮ損傷は、この
疾患の病因において中枢的な役割を果たす）（ＲｅｍｕｚｚｉおよびＲｕｇｇｅ
ｎｅｎｔｉ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４８：２−１９（１９９５））。従って、
前述の実施例において記載したモデルは、病態生理およびＨＵＳの処置を試験す
るために非常に重要であると考えられる。このモデルにおける陽性の結果は、潜
在的なヒト臨床的有用性の指標である。

【０１４０】 これらの研究は、ＶＥＧＦ灌流が実験的ＴＭＡにおける皮質壊死を減少する能
力を有し得るという、強くかつ示唆的な証拠を提供する。皮質壊死が腎機能に関
して不幸な長期的結果を予測する重要な危険因子の１つである（Ｈａｂｉｂら、
Ａｄｖ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ １１：９９−１２８（１９８２））という観察
を考慮すると、これらの研究は、ＶＥＧＦがＨＵＳにおける急性および慢性の両
方の腎機能ならびに関連する血栓性微小血管障害に対して有益な効果を有し得る
ことを示唆する。最近、ＧＥＮ損傷がいくつかの形態で生じ、そして持続性のＧ
ＥＮ損傷が糸球体硬化症の発生に関連し得ることが報告された（Ｉｒｕｅｌａら
、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：１７１５−１７２７（１９９５）；Ｋｉｔ
ａｍｕｒａら、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：３２８−３３６（１９９８））。
ＶＥＧＦによる内皮細胞損傷の予防は、将来、慢性腎疾患の処置のための新たな
ストラテジーを提供し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって産生された、Ｖ
ＥＧＦの種々の形態の模式図である。ＶＥＧＦ遺伝子の８個のエキソンの各々に
よってコードされたこれらのタンパク質配列は、番号付けされたボックスによっ
て示される。エキソン６および７によってコードされた配列は、塩基性アミノ酸
残基が豊富であり、そして、ヘパリンおよびヘパリン様分子と相互作用する能力
を与える。アスタリスクは、Ｎ結合型グリコシル化部位を示す。エキソン１およ
びエキソン２の第１部分（より細いバーによって示される）は、このタンパク質
についての分泌シグナル配列をコードする。

【図２】 図２は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₂₁をコードするヌクレオチド配列（配列番号１
）を示す。

【図３】 図３は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₂₁のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図４】 図４は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₄₅をコードするヌクレオチド配列（配列番号３
）を示す。

【図５】 図５は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₄₅のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。

【図６】 図６は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₆₅をコードするヌクレオチド配列（配列番号５
）を示す。

【図７】 図７は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₆₅のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。

【図８】 図８は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₈₉をコードするヌクレオチド配列（配列番号７
）を示す。

【図９】 図９は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₈₉のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。

【図１０】 図１０は、天然のヒトＶＥＧＦ₂₀₆のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す
。

【図１１】 図１１は、天然のヒトＶＥＧＦ₂₀₆のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。

【図１２】 図１２は、天然のヒトＶＥＧＦ₁₁₀のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。

【図１３】 図１３は、ｒｈＶＥＧＦ₁₂₁の非存在下（パネルＡおよびパネルＢ）ならびに
ｒｈＶＥＧＦ₁₂₁の存在下（パネルＣおよびパネルＤ）における腎臓性微小血管
内皮細胞損傷のモデルマウスの腎臓の外見を示す。パネルＡおよびパネルＣは腎
臓全体の画像であり、パネルＣおよびパネルＤは腎臓の切片を示す。

【図１４】 図１４は、ｒｈＶＥＧＦ₁₂₁の非存在下（パネルＡ〜パネルＣ）ならびにｒｈ
ＶＥＧＦ₁₂₁の存在下（パネルＤおよびパネルＥ）において、パラフィン包埋し
、そして固定した腎臓組織切片の組織学的研究（濃く、そして薄く過ヨウ素酸／
シッフ試薬(ＰＡＳ）で染色した）の結果を示す。

【図１５Ａ】 図１５Ａは、ＶＥＧＦ非処理ラットの皮質の組織切片において染色したα平滑
筋アクチン（α−ＳＭＡ）の結果を示す。

【図１５Ｂ】 図１５Ｂは、ＶＥＧＦ処理ラットの皮質の組織切片において染色したα−ＳＭ
Ａの結果を示し、そしてＶＥＧＦ処理は大きな血管を維持することを説明してい
る。

【図１５Ｃ】 図１５Ｃは、ＶＥＧＦ非処理ラットの髄質の組織切片において染色したｅＮＯ
Ｓの結果を示す。

【図１５Ｄ】 図１５Ｄは、ＶＥＧＦ処理ラットの髄質の組織切片において染色したｅＮＯＳ
の結果を示す。ＶＥＧＦ非処理動物（１５Ｃ）とは対照的に、ＶＥＧＦ処理群に
おいて、かなり多くのｅＮＯＳ陽性血管が血管束内に分布された。

【図１５Ｅ】 図１５Ｅは、ＶＥＧＦ処理ラットの糸球体において染色したＲＥＣＡ−１の結
果を示す。

【図１６】 図１６は、ＶＥＧＦ注入が、ＨＵＳモデルにおいて、毛細管の再構築および脈
管形成を刺激することを示す。（Ａ）内皮の通常の染色パターン；(Ｂ）損傷の
２４時間後での内皮染色；(Ｃ）ビヒクル処理ラットの毛細管密度の回復；（Ｄ
）ＶＥＧＦ処理ラットの毛細管密度の回復。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/12 Ａ６１Ｐ 37/06 37/06 Ａ６１Ｋ 37/24 (31)優先権主張番号 ６０／１２６，６１５ (32)優先日 平成11年３月27日(1999．3．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 2450 ＢＡＹＳＨＯＲＥ ＰＡＲＫＷＡ Ｙ，ＭＯＵＮＴＡＩＮ ＶＩＥＷ，ＣＡＬ ＩＦＯＲＮＩＡ 94043，Ｕ．Ｓ．Ａ． Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA44 DB53 MA13 MA28 MA35 MA37 MA52 MA56 MA63 NA14 ZA362 ZA532 ZA592 ZA812 ZB082

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物患者において、損傷を受けているか、または損傷を
   受けた微小血管が従事する器官の機能を維持または改善するための方法であって
   、該方法は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、そのアゴニスト、またはＶＥＧＦ
   の産生を刺激する因子の有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記器官の通常の機能を維持または回復させる、請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 前記損傷が血栓性微小血管症である、請求項１に記載の方法
   。
4. 【請求項４】 前記器官が腎臓である、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 腎臓の通常の機能を維持または回復する、請求項４に記載の
   方法。
6. 【請求項６】 ＴＭＡ後の腎臓機能を改善する、請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ＴＭＡが慢性的腎臓疾患に関連する、請求項６に記載の
   方法。
8. 【請求項８】 前記ＴＭＡが急性腎臓疾患に関連する、請求項６に記載の方
   法。
9. 【請求項９】 前記ＴＭＡが溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に関連する、請
   求項６に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記器官が心臓である、請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記器官が肺である、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記ＶＥＧＦが天然の配列ヒトＶＥＧＦである、請求項１
    ２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記ＶＥＧＦがｈＶＥＧＦ₁₂₁またはｈＶＥＧＦ₁₆₅である
    、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の処置のための方法であっ
    て、該方法は、ＨＵＳを発症しているか、またはＨＵＳと診断される危険にある
    哺乳動物患者に、有効量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、そのアゴニスト、ま
    たはＶＥＧＦの産生を刺激する因子を投与する工程を包含する、方法。
16. 【請求項１６】 前記患者がヒトである、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記ＶＥＧＦが天然の配列ヒトＶＥＧＦである、請求項１
    ６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記ＶＥＧＦがｈＶＥＧＦ₁₂₁またはｈＶＥＧＦ₁₆₅である
    、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記ＨＵＳが血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）である
    、請求項１５に記載の方法。
20. 【請求項２０】 同種異系移植器官の機能を保存または促進するための方法
    であって、該方法は、移植患者に、有効量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、そ
    のアゴニスト、またはＶＥＧＦの産生を刺激する因子を投与する工程を包含する
    、方法。
21. 【請求項２１】 前記患者が、腎臓、心臓、肝臓、肺、膵臓、皮膚、骨、腸
    の移植または異種移植を受けた患者である、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の処置のために薬学的組成
    物を調製するための方法であって、該方法は、薬学的に受容可能なキャリアとと
    もに、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、そのアゴニスト、またはＶＥＧＦの産生
    を刺激する因子を混合する工程を包含する、方法。
23. 【請求項２３】 製品であって、該製品は、容器、該容器内に血管内皮増殖
    因子（ＶＥＧＦ）、そのアゴニスト、またはＶＥＧＦの産生を刺激する因子を含
    む組成物、および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の処置のための該組成物を使用
    するための説明書を含む、製品。