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JP2002525558A - 逆相イオン対高速液体クロマトグラフィーにより核酸を分離するためのモノリシックマトリックス - Google Patents

逆相イオン対高速液体クロマトグラフィーにより核酸を分離するためのモノリシックマトリックス

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JP2002525558A
JP2002525558A JP2000570305A JP2000570305A JP2002525558A JP 2002525558 A JP2002525558 A JP 2002525558A JP 2000570305 A JP2000570305 A JP 2000570305A JP 2000570305 A JP2000570305 A JP 2000570305A JP 2002525558 A JP2002525558 A JP 2002525558A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】液体クロマトグラフィーによって生物有機分子を分離するためのモノリシック重合体マトリックスを提供する。 【解決手段】１つの具体例では、マトリックスは（ｉ）疎水性単量体、（ii）架橋剤、および（iii）ポロゲン溶媒またはポロゲン成分の混合物を含む重合混合物から形成される。本発明のモノリシックマトリックスは逆相イオン対形成クロマトグラフィーによってサンプル中のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を分離するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生物有機分子の分離に関する。特に、本発明は逆相イオン対形成クロ
マトグラフィーによってポリヌクレオチドを分離するためのモノリシック重合体
マトリックスを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリヌクレオチド分離は近年ますます重要なものとなっている。サンプル中に
含まれるポリヌクレオチド種を分離することは、例えば、増幅反応の産物である
ＤＮＡの検出および／または定量において、および変異体ＤＮＡ（例えば、多形
または変異）の検出において有用である。しかしながら、多分に、かかる分子の
構造が複雑でサイズが大きいために、現在までに考案された分離技術のうち完全
に申し分ないと証明されたものはない。
【０００３】 従来は、ポリヌクレオチド分離はスラブゲル電気泳動、またはより最近ではキ
ャピラリー電気泳動などの電気泳動法を用いて実施されてきた。一般に、これら
の方法は注目される種を含有する混合物が注入されている媒質に電流を通すこと
を含んでいる。各種類の分子は、その電荷および大きさによって異なる速度で媒
質中を移動する。残念ながら、この電気泳動法はある不利な点と関連している。
例えば、スラブゲル電気泳動は相対的に遅い速度、サンプルの検出が困難、定量
性に乏しい、かつ、大きな労働力を要するという欠点がある。キャピラリー電気
泳動はより迅速で、かつ、あまり労働力を要求しないものの、毛管性能の変化お
よび相対的に乏しい定量性のために分離の再現性がないという欠点がある。
【０００４】 液体クロマトグラフィーは電気泳動分離法の代替法を提供してきた。一般に、
液体クロマトグラフィー法は、流動する移動相と固定相間の分配挙動における差
異によって混合物中の成分を分離する。カラムチューブ、またはその他の支持体
が固定相を保持し、移動相がそれを通してサンプルを運ぶ。固定相に強く分配す
るサンプル成分はカラム中でより長い時間を費やし、主として移動相にとどまり
、カラムをより迅速に通る成分と分離される。成分がカラムから溶出するにつれ
て、検出器によって定量し、かつ／またはさらなる分析のために回収することが
できる。
【０００５】 液体クロマトグラフィーにおいて用いられる、典型的な固定相および溶質とそ
れらの相互作用は以下のとおり。
【０００６】
【表１】
【０００７】 液体クロマトグラフィー法は電気泳動分離技術に関し、いくつかの利点を有す
るものの、欠点がないわけではない。サイズ排除クロマトグラフィーは分離能が
低いという欠点があるので、典型的には、許容される分離能を得るにはＤＮＡ分
子はサイズが５０〜１００％違ったものでなければならない。イオン交換クロマ
トグラフィーは高い分離能を提供するが、ＤＮＡ配列組成に基づく変則的な溶出
順序に影響され得る。イオン交換クロマトグラフィーに関してはまた、溶出され
たＤＮＡが不揮発性バッファーで著しく汚染されていることも多く、これにより
サンプル回収はさらに複雑なものとなり得る。逆相クロマトグラフィーは相対的
に高い分離能を持ち得るが、固定相として特に小さな直径の粒子を用いないと超
高速では実施できない。逆相クロマトグラフィーに用いられるシリカをベースと
する粒子は、高ｐＨ条件では低速および不安定という欠点があった。重合粒子は
サンプル成分の高回収率または高い分離速度を提供することができなかった。
【０００８】 特にＤＮＡ分離に関しては、逆相イオン対高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ
−ＩＰ ＨＰＬＣ）として知られている技術が上記で論じられたいくつかの問題
から、限られた量ではあるが軽減をもたらしてきた。例えば、ＲＰ−ＩＰ ＨＰ
ＬＣは強力な陰イオン交換体を含む充填層で起こることが多い変則的な溶出順序
という問題を防止する。ＲＰ−ＩＰ ＨＰＬＣでは、典型的には固定相はカラム
に充填された疎水性表面基を有する個々の粒子からなる。溶出剤はＤＮＡ上の負
に荷電したリン酸塩基ともカラム中の粒子の疎水性表面とも相互作用し得るトリ
エチルアンモニウムイオン（０．１Ｍ）などの陽イオン種を含んでいる。従って
、陽イオン種はＤＮＡとカラムの間を結合する分子と考えられる。移動相が、例
えばアセトニトリルの濃度を高めることで、徐々に有機性になるにつれ、ＤＮＡ
断片は大きさの順に溶出される。
【０００９】 ＤＮＡ分離に関するＲＰ−ＩＰ ＨＰＬＣの利点にもかかわらず、この技術に
もやはり、カラムチューブ中に小粒子（例えば、ビーズ）を充填して層を形成す
る、すべての液体クロマトグラフィー技術に共通の問題を抱えている。例えば、
粒子分離媒質の製造は複雑で、かつ、時間のかかるものであり得る。ひと度製造
してしまうと、再現性があり、かつ、効率よく、カラムに粒子を充填することは
困難である。特に、直径１ｍｍ未満のカラムなどの小径のカラムを効率よく充填
することは困難であった。多角形の横断面（例えば、薄層または長方形）などの
、非円形の横断面を有するカラムは粒状充填物質から製造するのは極めて困難で
あろう。また、充填ビーズを基にしたカラムは充填物質の移動および溝または気
孔の発達によって失敗することもあり得る。さらなる不利な点として、小粒子の
使用は高いカラム作業圧力をもたらすことも多く、これにより、３，０００ｐｓ
ｉまたはそれより大きい流動圧を許容し得るカラムチューブ、ポンプ、インジェ
クターおよびその他の構成要素が必要となる。
【００１０】 現行のクロマトグラフィー理論は、充填粒子からなる層に関し、分離効率はサ
ンプル分子の固定相への集団移動のための拡散距離によって決定されると予測し
ている。この作用はかかる層に用いられる粒子の既知の形状寸法に基づいて容易
にモデル化される。かかる理論によれば、最大分離能は、固定相が分離される分
子のストークス径の少なくとも３倍の孔径を有する場合に生じる。この理論は、
分子は拡散プロセスによって固定相に運ばれ、かつ、より小さな孔は拡散障害を
引き起こすという仮定に基づいている。ＤＮＡ分離に関しては、このことは１，
０００塩基対の大きさのサンプルのためには、少なくとも１マイクロメートルの
孔径が必要となることを意味する。かかる大きな孔を必要とすることがＤＮＡの
分離のために支持体に充填された多孔性粒状物質の使用を事実上排除するが、こ
れはかかるマトリックスが高速液体クロマトグラフィーにおいて生じる作業圧力
で使用されるために求められる物理的強度を欠くからである。
【００１１】 多孔性充填物と比較した拡散距離の減少のため、ＤＮＡ分離には無孔粒状物質
が好まれる。無孔充填物に関しては、孔径は充填層の隙間寸法によって求められ
る。隙間寸法は球形充填粒子の直径の約１／３である。孔径の下限は大きなＤＮ
Ａ分子をトラップすることや剪断することを避ける必要によって課され得る。上
限は大きな粒子を用いる場合に生じる効率の損失によって課されるであろう。大
きな粒子を用いる分離は、伴われる低い作業圧力のために有利であろうが、分離
効率の損失はあまりにも大きい。
【００１２】 さらなる不利な点として、球形充填物は約０．４の隙間気孔率に近い密度での
み安定層に充填され得る。幾分、より変動しやすいものの、非球形充填物も約０
．４の気孔率で最適に充填される。さらに、充填された粒子層は充填物物質の粒
子径により決定される、固定表面積、固定隙間距離、および固定圧力低下を有す
る。ＤＮＡは０．３４ミクロン／１，０００塩基対の長さに近い物理的大きさを
有し、かつ、効率は隙間距離が分離されている分子のストークス径の３〜１０倍
である場合に最高となるので、１，０００塩基対のＤＮＡ用に設計されるカラム
は１〜３ミクロンの隙間距離を必要とする。直径が３〜１０マイクロメートルの
充填物を含むカラムがかかる距離を提供する。３マイクロメートルの充填物で充
填されたカラムは使用時に高い作業圧力を有し、一方、１０マイクロメートルの
充填物で充填されたカラムはより長い拡散路および表面積の減少による低い結合
能のために限定された効率しか示さないであろう。直径１マイクロメートルなど
の極めて小さい粒子で充填されたカラムは３００塩基対の長さまでのサンプルに
は有用であり得るが、カラム作業圧力は極めて高く、３００塩基対よりも大きい
ＤＮＡは剪断またはトラップされ得る。充填ビーズからなる典型的なカラムは直
径が２．１マイクロメートルの粒子を用い、典型的な使用下で高い作業圧力を有
する。
【００１３】 充填粒子層に関する上記の理論は、集団移動が拡散と対流プロセスの組み合わ
せであり得る、連続モノリシック層における高分子の挙動を予測するには特に有
用ではない。 本発明はポリヌクレオチドを含有する混合物を分離するためのモノリシック層
を教示するが、これは、モノリスは小さな球形粒子で充填されたカラムの分離能
を維持しながら、大粒子固定相の使用に対応して圧力低下の減少を提供するとい
う発見に幾分基づいている。さらに詳しくは、逆相モノリシックマトリックスは
ＤＮＡ分子の高速分離のための改良法を提供し得、かかる分離はこれまでに利用
できた方法と比較して大きく減少した作業圧力で高分離能で実施され得るという
ことが発見されている。この驚くべき発見により、今や既存の技術ではあり得な
い条件下でのポリヌクレオチドの高分離能分離が可能となっている。さらに、本
発明のモノリシックカラムは充填層を用いて利用できるものとはかなり異なる固
定相形状寸法で構築できる。高分子の分離に対するかかる新規形状寸法の作用は
、現行のクロマトグラフィー理論では今のところ予測されていない。
【００１４】 本発明のモノリシックカラムは、長時間をかけてビーズを製造し、それを効率
のよいカラムに充填する必要なく、ポリヌクレオチド分離のためのこれまでの最
良の技術（すなわち、アルキル化無孔重合体ビーズからなる充填層）の利点のす
べてを提供する。本発明によって提供されるカラムは単純なプロセスを用いて容
易に製造され、ひと度製造すれば、位置を移動する個々のビーズはないので、充
填層内の移動によって失敗することはあり得ない。
【００１５】 新規カラム製造の改良された容易さおよびビーズ移動がないことに加え、本明
細書に記載されたモノリシックカラムは、作業圧力を標準化した場合に充填球か
らなるカラムに関して予測されるものよりも、少なくとも５８％よりよい分離能
を提供し得るという点で既存の技術を超える驚くべき利点を提供する。
【００１６】
【発明の概要】
本発明の１つの態様は、少なくとも１種のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ
および／またはＲＮＡ）を含有する混合物を分離する方法を提供する。本方法に
よれば、混合物は支持体によって固定されたモノリシック重合体マトリックスを
通される。この混合物はイオン対逆相クロマトグラフィーによって分離される。 １つの具体例では、モノリシック重合体マトリックスは疎水性表面基を有する
。モノリシック重合体マトリックスは、少なくとも一部分はポリメタクリレート
およびポリスチレンからなる群から選択される重合体からなり得る。１つの具体
例では、重合体はポリメタクリレートである。
【００１７】 １つの具体例によれば、モノリシック重合体マトリックスは疎水性単量体、架
橋剤およびポロゲン(porogen)を含む重合混合物から形成される。ポロゲンは（
ｉ）ポロゲン溶媒、（ii）ポロゲン溶媒の混合物、または（iii）孔形成に寄与
する、少なくとも１種の重合添加物を含有する１種以上のポロゲン溶媒であって
よい。疎水性単量体はアルキルメタクリレートであり得る。 １つの具体例では、本方法はイオン対形成剤を含有する溶出剤をモノリシック
マトリックスに通す工程をさらに含む。分離は適正圧力（例えば、約５，０００
ｐｓｉ未満）の駆動力下で実施される。
【００１８】 支持体に関しては、１つの具体例では円形の横断面を有するカラムチューブの
使用が考慮されている。もう１つの具体例では非円形、例えば、多角形の横断面
を有するカラムチューブの使用が考慮されている。 さらなる具体例では、支持体としてプレートの使用が考慮されている。モノリ
シック重合体マトリックスはプレートに形成された溝を満たしてもよいし、また
はプレート上の薄いフィルムの形態をとってもよい。
【００１９】 なお、さらなる具体例では、支持体としてチップ（例えば、半導体技術におい
て用いられる技術によって加工されたような）の使用が考慮されている。この具
体例では、マトリックスはチップに形成された微細加工溝の中に保持されている
。関連する具体例では、チップに複数の微細加工溝が形成されており、かつ、チ
ップ上で実質的に同時に複数の分離が実施される。 本発明のもう１つの態様は、マクロ多孔性モノリシックメタクリレートをベー
スとした重合体マトリックスを保持する支持体を含んでなるクロマトグラフィー
装置を提供する。１つの具体例では、重合体マトリックスは逆相イオン対クロマ
トグラフィーによってポリヌクレオチドを分離するためにイオン対形成剤の疎水
基と相互作用し得る疎水面を有する。この重合体マトリックスは相対的に高い気
孔率（例えば、約０．６より大きい）を有し得る。
【００２０】 本発明のさらなる態様は、逆相イオン対クロマトグラフィーによってポリヌク
レオチドを分離するためのキットを提供する。 １つの具体例では、キットは（ｉ）疎水性表面基を有する単量体、架橋剤およ
びポロゲンを含む重合混合物、ならびに（ii）ポリヌクレオチドの負に荷電した
リン酸塩基および単量体の疎水性表面基とも相互作用し得るイオン対形成剤を含
む。
【００２１】 もう１つの具体例では、キットは（ｉ）支持体によって固定された、疎水性表
面基を有するモノリシック重合体マトリックス、ならびに（ii）ポリヌクレオチ
ドの負に荷電したリン酸塩基および単量体の疎水性表面基とも相互作用し得るイ
オン対形成剤を含む。 本発明のこれらおよびその他の特性ならびに利点は、以下の記載から明らかと
なろう。
【００２２】
【定義】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）の重合体を指し、これは一本鎖または二本鎖であってよ
く、所望により、ＤＮＡまたはＲＮＡ重合体に組み込むことができる合成、非天
然、または変更ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチ
ド類似体を組み込んでいてよい。ポリヌクレオチドはいずれの三次元構造を有し
ていてもよく、かつ、所望により部分的にまたは完全に変性していてもよい。限
定されるものではないが、以下はポリヌクレオチドの例である。遺伝子または遺
伝子断片（例えば、制限断片）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ
、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオ
チド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離Ｄ
ＮＡ、いずれかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。
【００２３】 本明細書において「カラム」とは、物理的横断面または層の寸法にかかわらず
、流動移動相が固定層を通って移動される装置を含むよう意図される。 カラム層の「浸透性」とは大径の孔の存在量の尺度である。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明の好ましい具体例に関する以下の考察は、本質的に単に例示的なもので
ある。従って、この考察は本発明の範囲、本発明の適用または本発明の使用を何
ら限定するものではない。 本発明は生物有機分子を分離するための、モノリシック層、その製造および使
用方法を提供する。
【００２５】 本発明のカラムは重合混合物から製造され、これは１つの具体例では（１）単
量体、（２）架橋剤、および（３）ポロゲン（例えば、ポロゲン溶媒またはポロ
ゲン成分の混合物）を含む。この具体例では、混合物は好適に成形された型に入
れられ、重合開始剤の影響を受けて重合プロセスを開始し、最後には適正な圧力
（例えば、約５，０００ｐｓｉ未満）の駆動力下で、液体がマトリックスに通さ
れ得るような多孔性を含む、マクロ多孔性重合体マトリックスを生じる。
【００２６】 単量体、または単量体の組み合わせは、重合されたマトリックスがポリヌクレ
オチドと相互作用し得る表面基を含み、イオン対クロマトグラフィーに基づいた
分離を提供するように選択される。１つの好ましい具体例では、疎水性表面基を
有する種類を単量体として用いている。所望により、単量体を所望の疎水度を示
すよう改変してもよい。例えば、当技術分野で公知の方法によって適当なリガン
ドを単量体に共有結合させて、その逆相クロマトグラフィーの媒質としての有効
性を向上させる。あるいは、またはさらに、重合されたマトリックス自身を処理
してリガンドを結合させて、それに所望の疎水度を付与してもよい。重合混合物
に用いるために選択された、単量体、または単量体の組み合わせが、別途、所望
の疎水特性を示さない場合には、適当なリガンド（例えば、脂肪族表面基）を付
加する処理がカラムを逆相分離にとって有用にするために必要となり得る。
【００２７】 １つの具体例では、重合混合物に用いられる単量体は逆相クロマトグラフィー
の疎水基として利用できる少なくとも１種のアルキル基を有している。好ましい
アルキル基は約３〜３０個の炭素を有するものであり、最も好ましくは約４ない
し１８個の炭素の範囲内である。本発明を実施するのに有用な例示的な単量体と
しては、ヘキシルメタクリレート、オクチルメタクリレート、およびドデシルメ
タクリレートが挙げられる。また、本発明ではスチレン単量体の使用も考慮して
いる。
【００２８】 本発明のモノリシックマトリックスの形成には、当業者に公知の好適な架橋剤
のいずれを用いてもよい。好ましい架橋単量体は、開始剤の存在下で重合し得る
少なくとも２個の炭素−炭素二重結合を含む。例示的な架橋単量体としては、ジ
ビニルベンゼン、ブタジエン、トリメチロールプロパントリメタクリレート（Ｔ
ＲＩＭ）などが挙げられる。 単一種が単量体および架橋剤の双方を含んでなってもよいということが理解さ
れるはずである。例えば、疎水性架橋剤はこれらの両役割を果たすことができる
。この点に関して、本発明の１つの具体例では重合混合物における唯一の単量体
、ならびに唯一の架橋剤としてＴＲＩＭの使用が考慮されている。
【００２９】 単量体、または単量体の組み合わせは、一般に重合混合物中に約２０ないし８
０容量％の量、より好ましくは約３５ないし５０容量％の量で存在する。 通常のフリーラジカル生成重合開始剤を使用して重合を開始してもよい。好適
な開始剤の例としては、ＯＯ−ｔ−アミル−Ｏ−（２エチルヘキシル）モノペル
オキシカーボネート、ジプロピルペルオキシジカーボネート、およびベンゾイル
ペルオキシドなどのペルオキシドならびにアゾビスイソブチロニトリル、２，２
’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド、および２，２’−ア
ゾビス（イソブチルアミド）ジヒドレートなどのアゾ化合物が挙げられる。開始
剤は一般に重合混合物中に単量体の約０．１ないし２重量％の量で存在する。
【００３０】 用いるポロゲンは種々の異なる種類の物質から選択してよい。ポロゲンは（ｉ
）単一のポロゲン溶媒、（ii）ポロゲン溶媒の混合物、または（iii）孔形成に
寄与する、少なくとも１種の重合添加物を含有する１種以上の溶媒であり得る。
好適な液体ポロゲンとしては脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル、アル
コール、ケトン、エーテル、可溶性重合体溶液、およびそれらの混合物が挙げら
れる。例えばポロゲン溶媒としては、イソオクタンおよび異なるパーセンテージ
の２−オクタノン、トルエン、またはエチルプロプリオネートを含むイソオクタ
ンが挙げられる。例えば孔形成に寄与する重合添加物としては、ポリメチルメタ
クリレートおよびポリスチレンが挙げられる。ポロゲンは一般に重合混合物中に
約２０ないし８０容量％、より好ましくは約５０ないし６５容量％の量で存在す
る。
【００３１】 ＴＲＩＭをベースとした重合混合物に関しては、例えば、ポロゲン溶媒として
純イソオクタンを使用した結果高浸透性モノリスが得られる。低浸透性は、例え
ば、２−オクタノン、トルエン、および／またはエチルプロプリオネートなどの
５ないし２０％の、その他の溶媒のイソオクタンへの添加の結果得られる。浸透
性は架橋剤に対する疎水性単量体の割合を高めることによっても、混合物中のポ
ロゲン溶媒の割合を低めることによっても低下し得る。さらに、開始剤の選択を
孔分布を制御する手段として用いることもできる。
【００３２】 例示的な具体例では、モノリシックマトリックスはアルキルメタクリレート、
アルカンポロゲン溶媒またはポロゲン成分の混合物、およびフリーラジカル開始
剤を含む重合混合物から製造される。例えば、重合混合物をトリメチロールプロ
パントリメタクリレート、アルキルメタクリレート、イソオクタンおよびアゾビ
スイソブチロニトリルを用いて調製した。混合物を空のＨＰＬＣカラムチューブ
に注ぎ入れ、キャップをし、６５〜７０℃で８〜２４時間重合した。次いで、重
合したマトリックスにエンドフィッティングを取り付け、溶媒で洗い流して未反
応成分を除去した。
【００３３】 本発明に従って構築された、典型的なモノリシックカラムは５，０００ｎｍ未
満の範囲ないし約１０ｎｍまでの孔を有する。大きな孔サイズは極めて大きなＤ
ＮＡおよび／または顕微鏡試験を用いて決定される。例えば、本発明のカラムは
２，０７２、２，６４７および３，１４７塩基対の長さのＤＮＡ産物を分離する
ために用いられている。これらのうち最大のものは、少なくとも１ミクロンの分
子の大きさに相当するであろう。従って、このＤＮＡを分離するために用いられ
るモノリシックカラムは、少なくとも１ミクロンの直径を有する孔を含むと予想
される。このことは直径６ミクロンの見かけの粒子、または約２ミクロンの孔サ
イズを示す浸透性計算値と一致する。顕微鏡試験は、本発明の典型的なマトリッ
クスは、１〜５ミクロンのサイズ範囲の孔を有する連続構造物中に融合された直
径が約１〜２ミクロンの小球を含むということを示した。このことは浸透性およ
びＤＮＡ断片クロマトグラフィーを基に予想された孔サイズと一致する。
【００３４】 本発明のカラムはＤＮＡを約１７塩基対まで分離するためにも使用されている
。相対的に小さい１００塩基対の長さのＤＮＡは３４ｎｍの大きさしかない。従
って、本発明によって可能となった高分離能は、分離されるＤＮＡ分子の長さの
少なくとも約１７０倍までの孔を有するカラムに保持されている。いずれの特定
の理論に拘束されるものでもないが、本発明のカラムを用いて可能な低い作業圧
力の原因となる顕著な特性であり得る。
【００３５】 ひと度製造すれば、本発明のモノリシックマトリックスは、例えば、勾配また
は定組成液体クロマトグラフィーによって生物有機分子を分離するのに有用であ
る。例示的な使用では、上記のように製造した本発明のカラムを用いてサンプル
に含まれるポリヌクレオチドの分離を実施している。1つの具体例では、双方と
もイオン対形成剤を含有する水およびアセトニトリルを、勾配液体クロマトグラ
フィーに用いてカラムに注入されたポリヌクレオチドを溶出す。
【００３６】 核酸を有するイオン対を形成し得る従来のイオン対形成剤を本発明に用いても
よい。本発明を実施するのに好適なイオン対形成剤としては、有機または無機酸
のアルキルアンモニウム塩などの陽イオン疎水性種、例えば、テトラメチル、テ
トラエチル、テトラプロピルおよびテトラブチルアンモニウムアセテート、ハロ
ゲン化物などが挙げられる。中でも、ジメチルブチルアンモニウム、ジメチルヘ
キシルアンモニウム、ジメチルシクロヘキシルアンモニウムおよびジイソプロピ
ルアンモニウムアセテートが有効なイオン対形成剤である。ＴＥＡＡ（トリエチ
ルアンモニウムアセテート）はメタクリレートおよびスチレンをベースとしたカ
ラムの双方において有効なイオン対形成剤であると分かった。テトラブチルアン
モニウムブロミドは、少なくとも１，０００塩基対までの長さのＤＮＡ断片の分
離に有効なイオン対形成剤であると分かった。
【００３７】 種々の指示体構造を本発明のモノリシックマトリックスとともに用いてもよい
。例えば、1つの具体例では延長カラムチューブの使用が考慮されている。もう1
つの具体例では、モノリシックマトリックスはキャピラリーチューブの管腔中に
保持されている。これらの具体例では、マトリックスはチューブの横断面面積全
体にわたって広がっている。チューブはいずれの所望の横断面、例えば円形、多
角形またはその他の形であってもよい。モノリシックマトリックスはチューブ内
で現場重合させてもよいし、またはチューブの外で形成し、次いでいずれかの好
適な手段によって挿入してもよい。
【００３８】 別の具体例では、モノリシックマトリックスは（ｉ）プレート上の溝(channel
)または溝(groove)の中に保持されているか、または（ii）プレートを渡る薄い
フィルムとして塗布されている。本発明のモノリスは実質上いずれの大きさのお
よびいずれの好適な物質からなる、支持体または支持プレート上にも提供され得
るが、本発明の1つの具体例では、従来の物質および手段を用いて構築され得る
、標準サイズの支持プレートを使用することが考慮されている。従って、この具
体例では、その長さおよび幅が通常用いられる５．０３０”×３．３６５”（１
２７．７６ｍｍおよび８５．４７ｍｍ）という標準に一致する、注入成形長方形
プラスチックプレートが好ましい。同様に、単一プレートは適正であればいずれ
の数の部位でも支持できるが、通常使用される「９６ウェル」マイクロタイター
プレート形式に対応する構築物が好ましい。従って、１つの好ましい構築物は、
標準サイズの支持プレートに配置された８×１２配列の部位を含んでいる。各部
位は1種以上の分離モノリスを支持し得る。支持プレート上の部位の位置および
間隔も同様に標準でよい（例えば、中心と中心が約９ｍｍ間隔）。プレート枠の
標準外部寸法、ならびにプレート上の部位の標準間隔を利用することで、所望に
より自動ディスペンサーまたは光学リーダーなどの既存の装置をつけたプレート
の使用が促進される。かかる装置は複数の同時および並行分離を処理し得るとい
うことが理解されるはずである。
【００３９】 さらなる具体例では、モノリシックマトリックスはマイクロチップ上に形成さ
れた1個以上の溝を満たしている。例えば、標準的な微細加工技術、例えば、写
真平版術の手順および化学湿式エッチングを用いてガラス製マイクロチップ支持
体上に複数の溝を形成し得る。所望により、カバープレートは溝を覆って支持体
に直接接着させてもよい。複数のサンプルでの複数の分離を、単一の支持体チッ
プ上で実質的に平行して実施することができる。
【００４０】 有利なことに、本発明のカラムは充填層の固定表面積、圧力低下および隙間拡
散距離によって限定されない。気孔率は本明細書において教示されるモノリシッ
クカラムにおいてはかなり高くなり得るので、これらの因子すべてを所与の適用
の性能を向上させるために操作できる。例えば、同一の気孔率および大きく異な
る圧力低下を有するカラムを製造でき、または同一の圧力低下を有するが異なる
隙間距離を有するカラムを製造できる。特定の実施例では、本発明において製造
された、ＤＮＡ分離を十分に実施するいくつかのカラムが約０．７の気孔率を有
している。０．７という気孔率は個々の粒子を充填することによる無孔充填物で
は示し得ない。
【００４１】
【実施例】
以下の実施例は例示を意図するものであって、本発明の範囲を限定するもので
はない。実施例１： 一本鎖オリゴヌクレオチドの分離 １．０ｍｌのトリメチロールプロパントリメタクリレート、０．３２ｍｌのヘ
キシルメタクリレート、２．４ｍｌのイソオクタンおよび約２０ｍｇのアゾビス
イソブチロニトリルを含有する混合物を調製し、一方の端をエンドフィッティン
グおよびプラグで閉じた空の４．６ｍｍＩＤ×５ｃｍ長のＨＰＬＣカラムチュー
ブに注入した。満たしたチューブのもう一方の端をエンドフィッティングおよび
プラグで閉じ、次いで、６５℃の水浴に一晩浸漬した。反応後、プラグおよびエ
ンドフィッティングを除去し、付属のポリエチレンフリットでエンドフィッティ
ングした。完成したカラムをテトラヒドロフランで洗い流した。
【００４２】 図１は、上記の方法で構築されたＣ６モノリシックカラムでの、一本鎖オリゴ
チミジル酸の分離を示すクロマトグラムである。詳しくは、サンプルは１０マイ
クロリットルの１２ないし１８ユニットの間の長さのオリゴチミジル酸であった
。２ｍｌ／分の流速で、１００ｍMの水性トリエチルアンモニウムアセテート、
１０ｍMのＥＤＴＡ二ナトリウム、ｐＨ７．０中の０〜１２％アセトニトリルの
勾配を用いて、オリゴヌクレオチドを溶出した。検出は、２５４ｎｍでのＵＶ吸
光度を用いて実施した。分離の間、わずか１５０ｐｓｉという極めて低いＨＰＬ
Ｃ系圧力が認められた。実施例２： 二本鎖ＤＮＡの分離 １．２５ｍｌのトリメチロールプロパントリメタクリレート、０．３０ｍｌの
ラウリルメタクリレート、２．６ｍｌの９５％イソオクタンと５％トルエンの混
合物および１７ｍｇのアゾビスイソブチロニトリルを含有する混合物を調整し、
一方の端をエンドフィッティングおよびプラグで閉じた空の４．６ｍｍＩＤ×５
ｃｍ長のＨＰＬＣカラムチューブに注入した。満たしたチューブのもう一方の端
をエンドフィッティングおよびプラグで閉じ、次いで、６５℃の水浴に一晩浸漬
した。反応後、プラグおよびエンドフィッティングを除去し、付属のポリエチレ
フリットでエンドフィッティングした。完成したカラムはテトラヒドロフランで
洗い流した。
【００４３】 図２は、上記の方法で構築されたモノリシックＣ１２カラムでの、二本鎖ＤＮ
Ａ断片の分離を示すクロマトグラムである。詳しくは、サンプルは３マイクロリ
ットルのＭＳＰ Ｉ制限酵素で消化されたｐＵＣ１８ＤＮＡであった。１．０ｍ
ｌ／分の流速で、２０ｍMの水性テトラプロピルアンモニウムブロミド、２ｍMの
ＥＤＴＡ二ナトリウム、ｐＨ７．０中の２０ｍＭのテトラプロピルアンモニウム
ブロミドを含有する３５〜６０％アセトニトリルの１０分の勾配を用いて、ＤＮ
Ａ断片を溶出した。検出は２５４ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて実施した。０．５
ｍｌ／分で５０ｐｓｉというＨＰＬＣ系圧力が認められた。分離能は、図２Ａに
おいて矢印で示されたピークに関して算出した。
【００４４】 比較目的のために、無孔重合体球で充填されたカラムを用いて同様の分離を実
施した。これに関しては、図２Ｂは２．１μｍ径の無孔ビーズで充填されたカラ
ムでの、二本鎖ＤＮＡ断片の分離を示すクロマトグラムである。この比較実験で
は、サンプルは３マイクロリットルのＭＳＰ Ｉ制限酵素で消化されたｐＵＣ１
８ＤＮＡであった。０．５ｍｌ／分の流速で、１００ｍＭの水性トリエチルアン
モニウムアセテート、１０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、ｐＨ７．０中の８．７
５〜１５％のアセトニトリルの１０分の勾配を用いてＤＮＡ断片を溶出した。検
出は２５４ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて実施した。０．５ｍｌ／分で１３４０ｐ
ｓｉというＨＰＬＣ系圧力が認められた。分離能は、図２Ｂにおいて矢印で示さ
れたピークに関して算出した。
【００４５】 上記の実験からのクロマトグラフィーのデータが表１に要約されている。印を
つけたピークの分離能は、図２Ａのモノリシックカラムに関しては４．０４、図
２Ｂにおける無孔球で充填されたカラムに関しては５．８３であると分かった。
標準浸透度計算値（Introduction to Modern Liquid Chromatography, 第2版, L
.R. Snyder and J.J. Kirkland, John Wiley and Sons, New York, 1979, 37頁
）を用いることにより、図２Aのカラムは６．２２ミクロン径の球で充填された
カラムのものと同等の作業圧力を有し、他方、図２Bにおいては１．２０ミクロ
ンと同様と評価されると算出できる。これらの異なる有効粒子サイズを基にする
と、図２Aのカラムは予想されるよりも５８％高い分離能を有している。クロマ
トグラフィー分離の卓越性を表す決定的な値は、単位圧力あたりの効率または分
離能である。＜表１＞のデータから、モノリシックカラムは無孔球で充填された
カラムと比較して、単位圧力あたりの分離能の大規模な増大を提供するというこ
とが分かる。
【００４６】
【表２】
【００４７】実施例３： 部分的に変性した二本鎖ポリヌクレオチドの分離 本発明はまた、部分的に変性した二本鎖ポリヌクレオチドの分離を可能にする
。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、多孔性モノリシックカラムを用いて３０
４塩基対の長さのＤＮＡ断片を分離した。図３Ａでは、サンプルは単一種のＤＮ
Ａを含み、他方、図３Ｂでは、サンプルは図３Ａにおいて見られた種類と単一塩
基対置換を含む変異体配列の混合物を含んでいた。選択された温度で、図３Ｂの
サンプルは単一塩基対置換を含む部分的に変性したＤＮＡを表す第２のピークを
示す。
【００４８】 詳しくは、図３Ａに関しては、上記のように製造したモノリシックＣ１２カラ
ムで３０４塩基対の長さの配列を有するホモ二重らせんＤＮＡを分離した。分離
の実施の際、以下の＜表２＞に示されるような条件が認められた。
【００４９】
【表３】
【００５０】 図３Ｂのデータを得る際にも、サンプルが図３Ａの３０４塩基対のホモ二重ら
せんＤＮＡの他にも、単一塩基対置換を有する変異体へテロ二重らせんＤＮＡ種
を含むという点を除いては、同様の条件が認められた。図３Ｂ中の矢印で印をつ
けたピークは、この変異体ＤＮＡの存在を示している。比較実験Ａ Frechetらの米国特許第５，３３４，３１０号によると、充填された粒状物質
からなるカラム層に関連するいくつかの上記の問題に対する１つの解決方法は、
大きな分子の分離のための連続層の使用であろうと示唆している。しかしながら
、’３１０特許は最も有利な方法、ＲＰ−ＩＰ ＨＰＬＣによるＤＮＡの分離に
好適なマトリックスの選択を可能にする詳細または手引きを全く提供していない
。
【００５１】 比較目的のために、’３１０特許の実施例IIIおよびVIに従ってカラムを構築
した。簡潔に述べれば、これらの実施例は本質的に疎水性であるモノリシックカ
ラムを記載している。’３１０特許に記載のように、これらの組成物の重合後、
エンドフィッティングを取り付け、カラムをメタノールで洗い流した。’３１０
特許の実施例IIIによって製造された組成物は、外観上は半透明で極めて高い作
業圧力（メタノールを用いる０．２５ｍｌ／分で２，０００ｐｓｉより高い）を
有しており、ＤＮＡに関する実用的なＨＰＬＣにおけるその使用を不可能にした
。’３１０特許の実施例VIによって製造された組成物は、白色で相対的に低い作
業圧力を有していた。しかしながら、この後者のカラムは、逆相イオン対形成条
件下ではＤＮＡ制限断片の有用な分離を提供しなかった。本発明のマトリックス
を用いれば有用な分離を提供するであろう条件下で分離を試みた場合には、典型
的なピークパターンは認められなかった。これらの発見は、非改変ポリスチレン
／ジビニルベンゼン構造物を含むカラムはＤＮＡ分離に望ましくないという文献
中のこれまでの示唆と一致する。
【００５２】 当業者ならば、前記の記載から、本発明の広範な教示は種々の形態で実行され
得るということを理解できるであろう。特定の具体例および実施例を挙げて本発
明を説明したが、本発明の真の範囲は、かかるものに限定されるべきではない。
添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲から逸脱することなく、種々
の変更および改変がなされ得る。
【図面の簡単な説明】
本発明の構造および操作法は、そのさらなる目的および利点とともに、添付の
図面に関連して記載された以下の記載を参照して理解するのが最良である。
【図１】 本発明の具体例に従って構築されたＣ６モノリシックカラムでの、１２ないし
１８ユニットの間の長さのオリゴチミジル酸の分離を示すクロマトグラムである
。
【図２】 図２Ａは、本発明の具体例に従って構築されたＣ１２モノリシックカラムでの
、二本鎖ＤＮＡ断片の分離を示すクロマトグラムである。図２Ｂは、比較目的の
ための、２．１マイクロメートル無孔ビーズで充填されたカラムで実施された、
図２Ａのものに類似の二本鎖ＤＮＡ断片の分離結果を示すクロマトグラムである
。
【図３】 図３Ａは、本発明の具体例に従って構築された多孔性モノリシックＣ１２カラ
ムでの、３０４塩基対の長さのホモ二重らせんＤＮＡ断片の分離を示すクロマト
グラムである。図３Ｂは、本発明の具体例に従って構築された多孔性モノリシッ
クＣ１２カラムでの、図３Ａと同種のホモ二重らせんＤＮＡ断片ならびに単一塩
基対置換を含む変異体配列を含有する混合物の分離を示すクロマトグラムである
。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月６日（２０００．１１．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 HA20 4D017 AA03 BA07 CA13 CB01 DA03 EA01 4G066 AB01A AB03A AB05A AB07A AC11B AC14B AC17B AE04B CA20 DA07 EA01 FA09 4J011 PA23 PA25 PA26 PA27 PA30 PB40 PC02 PC08

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有する混合物を分離する方法であって
    、 少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有する前記混合物を支持体によって固
    定されたモノリシック重合体マトリックスに通し、さらに 前記マトリックスに通されている前記混合物をイオン対逆相クロマトグラフィ
    ーによって分離することを含んでなる方法。
  2. 【請求項２】 前記モノリシック重合体マトリックスが疎水性表面基を有する請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 前記モノリシックマトリックスに、アルキルアンモニウム塩であるイオン対形
    成剤を含有する溶出剤を通す工程をさらに含んでなる請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記モノリシック重合体マトリックスが少なくとも一部は、ポリメタクリレー
    トおよびポリスチレンからなる群から選択される重合体からなる請求項２に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】 前記重合体がポリメタクリレートである請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記モノリシック重合体マトリックスが疎水性単量体、架橋剤およびポロゲン
    を含む重合混合物から形成される請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記疎水性単量体がアルキルメタクリレートである請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 少なくとも１種の前記ポリヌクレオチドがＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から
    選択される請求項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記モノリシックマトリックスに、少なくとも１種の前記ポリヌクレオチドの
    負に荷電したリン酸塩基および前記モノリシック重合体マトリックスの前記疎水
    性表面とも相互作用し得るイオン対形成剤を含有する溶出剤を通す工程をさらに
    含んでなる請求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記混合物が約３，０００ｐｓｉ未満の駆動力を受ける請求項９に記載の方法
    。
  11. 【請求項１１】 前記支持体が円形の横断面を有するカラムチューブである請求項９に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 前記支持体が多角形の横断面を有するカラムチューブである請求項９に記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】 前記支持体がプレートである請求項９に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記モノリシック重合体マトリックスが前記プレートに形成された溝の中に保
    持されている請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記モノリシック重合体マトリックスが前記プレート上で薄いフィルムの形態
    をとっている請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記支持体がチップであり、かつ、前記マトリックスが前記チップに形成され
    た微細加工溝の中に保持されている請求項９に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記チップに複数の微細加工溝が形成されており、かつ、前記チップ上で実質
    的に同時に複数の分離が実施される請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 マクロ多孔性モノリシックメタクリレートをベースとする重合体マトリックス
    を保持する支持体を含んでなり、前記重合体マトリックスが逆相イオン対クロマ
    トグラフィーによってポリヌクレオチドを分離するためにイオン対形成剤の疎水
    性基と相互作用し得る疎水面を有するクロマトグラフィー装置。
  19. 【請求項１９】 前記重合体マトリックスが０．６より大きい気孔率を有する請求項１７に記載
    のクロマトグラフィーカラム。
  20. 【請求項２０】 逆相イオン対クロマトグラフィーによってポリヌクレオチドを分離するための
    キットであって、 疎水性表面基を有する単量体、架橋剤およびポロゲンを含む重合混合物、およ
    び 前記ポリヌクレオチドの負に荷電したリン酸塩基および前記単量体の前記疎水
    性表面基とも相互作用し得るイオン対形成剤を含んでなるキット。
  21. 【請求項２１】 逆相イオン対クロマトグラフィーによってポリヌクレオチドを分離するための
    キットであって、 支持体によって固定された、疎水性表面基を有するモノリシック重合体マトリ
    ックス、および 前記ポリヌクレオチドの負に荷電したリン酸塩基および前記単量体の前記疎水
    性表面基とも相互作用し得るイオン対形成剤を含んでなるキット。
JP2000570305A 1998-09-16 1999-09-08 逆相イオン対高速液体クロマトグラフィーにより核酸を分離するためのモノリシックマトリックス Expired - Fee Related JP4593785B2 (ja)

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