JP2002528381A

JP2002528381A - 脂質媒介式の遺伝子及び化合物導入を利用する化合物に対する細胞の感作

Info

Publication number: JP2002528381A
Application number: JP2000530237A
Authority: JP
Inventors: マクラクラン，イアン; ダブリュ．グラハム，ロジャー; エス．バコウスキー，スーザン
Original assignee: イネックスファーマシューティカルズコーポレイション
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1999-02-03
Publication date: 2002-09-03
Also published as: EP1053022A2; AU754611B2; US20050118253A1; US6410328B1; AU2405699A

Abstract

(57)【要約】本発明は、化合物、例えばプロドラッグに対して細胞を敏感にする方法及び組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は細胞を化合物、例えばプロドラッグに対して感受性にするための方法
及び組成物に関連する。

【０００２】発明の背景ｉｎｖｉｖｏヒト遺伝子治療についての作業システムが現在確立されている
。遺伝子治療用ベクターはヒト細胞にｉｎｖｉｖｏで、直接（局部）注射又は
吸入を介して；修飾アデノウィルスを介して（Englehardt，J.F.“Methods for
Adenovirus-Mediated Gene Transfer to Airway Epithelium”Chapter 11，Meth
ods in Molecular Medicine，Gene Therapy Protocols，Ed．P．Robbins，1997,
Humana Press Inc.，Totowa，NJ参照）；レトロウィルスを介して（Olsen，J.C
．ら“Methods for the Use of Retroviral Vectors for Transfer of the CFTR
Gene to Airway Epithelium，“Chapter 10、同書）；カチオン性脂質プラスミ
ド凝集物を介して（Nabel，G.J．ら“Methods for Liposome-Mediated Gene Tra
nsfer to Tumor Cells in Vivo，”Chapter 21）同書；Son，K.,ら“Cationic L
iposome-Mediated Gene Transfer to Tumor Cells in Vitro and In Vivo，Chap
ter 23、同書）；又は単に裸ＤＮＡの導入を介して（米国特許第 5,589,466号 F
elgner、ら参照）、導入することができる。

【０００３】ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療のための全身導入、即ち、生体系、例えば循環系を
介するベクターの末梢標的細胞への輸送はあまり十分に開発された手段ではない
が、例えば公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／４０９６４、米国特許第５，７０５，
３８５号、並びに１９９８年１０月９日出願の米国特許出願第０８／４８５，４
５８、０８／４８４，２８２、０８／６６０，０２５、０８／８５６，３７４、
６０／０６３，４７３及び０９／１６９，５７３号（全て本発明の譲受人に譲受
され、引用することで本明細書に組入れる）に開示の如き脂質プラスミド粒子を
利用して達成されている。この方式はベクターを血清中でのヌクレアーゼ分解か
ら守り、非免疫原性であり、小さく、且つ長い循環半減期を有する完全に封入さ
れた脂質プラスミド粒子を供している。

【０００４】治療的処置のために有用な基礎的な遺伝子治療技術の変異法は遺伝子導入式酵
素プロドラッグ治療（「ＧＤＥＰＴ」）である。ＧＤＥＰＴは「自殺遺伝子／プ
ロドラッグ」システムとも称され、そしてMoolten，F.L．Cancer Res．46 : 527
6-5281（1986）により最初に開発されたものである。ＧＤＥＰＴの更なる詳細に
ついてはMoolten，F.L．Chapter 11(1995)，The Internet Book of Gene Thera
py，Cancer Therapeutics，Eds，Sobol，R.E.，Scanlon，K.J.，Appelton & Lan
geを参照のこと。この方法では、細胞があまり感受性でない第一化合物（即ち、
「プロドラッグ」）を細胞がより感受性である第二化合物へと代謝するのを促進
する酵素をコードする異種遺伝子を細胞に導入している。細胞はこの遺伝子を取
り込み、そしてそれを発現する。次いでこのプロドラッグを細胞に導入する。こ
の酵素はプロドラッグを第二化合物へと進行させ、そしてそれに応じて応答が起
こる。Mooltenにより提唱されている適切なシステムは単純ヘルペスウィルス−
チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子、及びプロドラッグガンシクロビルで
ある。この方法は最近になって例えばZerrouquiら、Cancer．Gen．Therapy 3（
6）: 385-392（1996）の研究に採用されている。カチオン性脂質−核酸凝集物は
ＴＫ遺伝子のマウス腫瘍への局所導入のために利用されている（Sugaya，S.ら、
Hum．Gen．Ther．7 : 223-230(1996)）。ウィルスベクターを採用するＧＤＥＰ
Ｔシステムを利用するヒト臨床試験が提案されている（Hum．Gene Ther．8 : 59
7-613(1997)及びHum．Gen．Ther．7 : 255-267(1996)参照）。

【０００５】ＧＤＥＰＴ法に関連する特許出願は下記の番号で公開示されている：ＷＯ９７
／１９１８０；ＷＯ９７／０７１１８；ＷＯ９６／２２２７７；ＷＯ９７／１９
１８３；ＷＯ９６／１６１７９；ＷＯ９６／０３５１５；ＷＯ９６／０３５１５
；ＷＯ９６／０３１５１；ＥＰ６９０１２９；ＥＰ６５７５４１；ＥＰ６５７５
３９；ＷＯ９５／０５８３５及びＥＰ４１５７３１。

【０００６】従来技術は数多くの欠点に悩まされている。まず、ＧＤＥＰＴにおいて現在ま
でに採用されているベクターシステムはベクターの局所導入のためにだけデザイ
ンされている。このようなシステムは高度に免疫原性でもあり、従って反復投与
の妨げとなる。これはＧＤＥＰＴについての適用範囲を制約する。第二に、プロ
ドラッグの非特異的毒性はプロドラッグの形質転換細胞で作用するために十分な
量の導入を妨げうる。更に、従来技術のプロドラッグ製剤は血液から迅速に浄化
され、それ故あまり望ましくない処置対、例えば反復注射又は静脈点滴を要する
。

【０００７】従来技術の方法のその他の欠陥は、研究者が遺伝子導入システムを改良しよう
と努力はしているが、プロドラッグ導入システムの改良について、又はプロドラ
ッグ及びベクターを導入する中間省略短縮（ｓｙｎｃｏｐａｔｉｎｇ）法の可能
性のある利点について検討した研究が事実上ないことにある。明らかに、当業界には、自殺遺伝子／プロドラッグシステムの双方の要素を同
一の対象器官、腫瘍又は疾患部位に対してターゲッティングする問題を解決する
方法についてのニーズが残っている。この方法が自殺遺伝子／プロドラッグ要素
の非特異的毒性を抑え、しかも血中でのその半減期を延長できるなら有利であろ
う。本発明はこのようなニーズ及びその他のニーズを満たすものである。

【０００８】発明の概要本発明は、とりわけ、細胞を化合物、例えばプロドラッグに対して感受性にす
るための方法及び組成物を提供する。一の態様において、本発明は細胞を化合物
に対して感受性にする方法を提供し、ここでこの方法は（ａ）第一化合物（例え
ばプロドラッグ）の第二化合物への進行、即ち、変換を促進する遺伝子産物（例
えばポリペプチド又はＲＮＡ）を産生するヌクレオチド配列を含んで成る核酸（
例えばベクター）で細胞をトランスフェクションし；そして（ｂ）当該細胞に脂
質製剤中の当該第一化合物を導入する；ことを含んで成り、ここで当該細胞は当
該第一化合物よりも前記第二化合物に対して一層感受性である。

【０００９】上記の方法において、核酸及び第一化合物は共に、同じでも異なるものでもよ
い脂質製剤で導入されうる。この脂質製剤は、核酸又は第一化合物（例えばプロ
ドラッグ）のいずれを導入するのに利用されるものであろうと関係なく、様々な
脂質、脂質接合体及び当業界において公知の他の適合成分から調製されうる。こ
の脂質製剤は例えばスフィンゴミエリン及びコレステロールから調製できる。更
に、この脂質製剤はその特性又は性質、例えば漏出性、循環系内での寿命、低毒
性、封入効率、等を向上せしめる追加成分を含んでよい。かかる成分には、例え
ば、カチオン性脂質、ＡＴＴＡ−脂質接合体、ＰＥＧ−脂質接合体、ターゲッテ
ィング剤、等が挙げられうる。一旦調製できたら、この脂質製剤は当業者に公知
の様々な技術を利用して細胞に投与又は導入されうる。例えば、この脂質製剤は
全身、局部又は局所的に導入されうる。

【００１０】好適な態様において、この核酸は脂質製剤、例えばｉｎｖｉｖｏ投与のため
に調製される脂質封入製剤でも導入される。別の好適な態様において、この核酸
はカチオン性脂質核酸凝集物又は粒子とする。この核酸は例えば修飾アデノウィ
ルス、修飾レトロウィルス、又は裸ＤＮＡであってよい。この遺伝子産物は第一
化合物の、対象の細胞が感受性又は受容性である第二化合物への進行、即ち、変
換を促進する任意の産物であってよい。適当な遺伝子産物の例には、限定するこ
となく、単純ヘルペスウィルス、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、キ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼ、チトクロームＰ４５０２Ｂ１及びそれらの類似体が挙げられる
。本発明の方法において利用するのに適当なその他の遺伝子産物は当業者にすぐ
に明らかとなるであろう。

【００１１】好適な態様において、この第一化合物はプロドラッグ、即ち、対象の細胞が当
初はそれに対して感受性でない化合物であるが、遺伝子産物がその化合物を対象
の細胞が感受性である化合物へと変換せしめる化合物である。適当なプロドラッ
グの例には、限定することなく、ガンシクロビル、アシクロビル、ブロモビニル
デオキシウリジン、５−フルオロシトシン、６−チオキサンチン、ＭｅＰ−ｄｒ
及びシクロホスファミドが挙げられる。本発明の方法において利用するのに適当
なプロドラッグは当業者にすぐに明らかとなるであろう。

【００１２】別の態様において、本発明は細胞を化合物に対して感受性にする方法であって
、ａ）第一化合物の第二化合物への進行を促進する酵素を細胞に導入し；そして
ｂ）当該細胞に脂質製剤中の当該第一化合物を導入する；ことを含んで成り、こ
こで当該細胞は当該第一化合物よりも前記第二化合物に対して一層感受性である
、方法を提供する。現状好適な態様において、酵素及び第一化合物の双方を脂質
製剤で導入する。

【００１３】更なる別の態様において、本発明はヒトの症状（例えばヒトの医学的障害又は
疾患状態）を処置するための組成物を提供し、ここで当該組成物は脂質製剤中の
プロドラッグ及び医薬的に許容される担体を含んで成る。現状好適な態様におい
て、この組成物は脂質製剤中の核酸又は酵素を更に含んで成る。更なる別の態様において、本発明はヒトの医学的障害の処置のためのキットを
提供し、ここでこのキットはａ）脂質製剤中の核酸；及びｂ）脂質製剤中のプロ
ドラッグ；を含んで成る。

【００１４】更に、本発明は本発明の方法の実施において利用できる脂質製剤化プロドラッ
グ、核酸及び酵素を調製するための方法を提供する。本発明及びその好適な態様のその他の特徴、課題及び利点は以下の詳細な説明
により明らかとなる。図面の簡単な説明図１は透析バッファー中のクエン酸濃度と脂質−プラスミド粒子の調製のため
の脂質中のＤＯＤＡＣのmol ％の関係を示す。べた塗り点は高い会合効率（２４
０％）、小サイズ（＜１００nm）及びＮＩＣＯＭＰ粒子サイザーに基づく低いサ
イズ多分散値（１０未満、好ましくは３未満のカイニ乗）を有する良好な品質の
製剤を示す。星印は凝集物を含むか又は高い多分散値を有する製剤を示し、そし
て白丸は低い会合効率（＜４０％）を有する製剤を示す。クエン酸バッファー濃
度のカチオン性脂質電荷に対する適正な調節は製剤を改善せしめる。他のアニオ
ン性バッファーも、そのカウンターイオンがディタージェント除去工程の際のカ
チオン性脂質の凝集を防ぐことができるなら、使用してよい。

【００１５】図２はＣ５７−ＬｅｗｉｓＬｕｎｇマウスにおける３０３ｉの様々な器官（
即ち、血液、脾臓及び肝臓）中の生体分布を示す。図３はＣ５７マウスにおける腫瘍部位においての３０３ｉの蓄積を示す。図４は末梢（転移性）腫瘍部位においての経時的な遺伝子産物活性を示す。図５はＬＳ１８０腫瘍における遺伝子発現を示す（４８hr後の３０３ｉの投与
応答）。

【００１６】図６は腹膜腫瘍内のＨＳＶ−ＴＫ遺伝子発現のパターンを示す。図７（Ａ）は腫瘍モデルを利用するｉｎｖｉｖｏ効能研究を示す。図７（Ｂ）は腫瘍接腫後の試験マウスに対する１６日間処置養生を示す。図８（Ａ）は腫瘍増殖の評価を示し、空の製剤が最大の腫瘍容積を示す。図８（Ｂ）は本発明の自殺遺伝子ＳＰＬＰの効能を示す。

【００１７】図９はリポソームＧＣＶの血清クリアランスを示す。血漿を表示の時点で回収
し、そして³Ｈ−ガンシクロビル又は¹⁴Ｃ−ＣＨＥ脂質についてアッセイした。
結果は±ＳＥＭで示し、ｎ＝４である。図１０はＧＣＶ放出のｉｎｖｉｖｏ反応速度を示す。血漿を表示の時点で回
収し、そして³Ｈ−ガンシクロビル及び¹⁴Ｃ−ＣＨＥ脂質についてアッセイした
。リポソームＧＣＶ中のガンシクロビルの保持はガンシクロビル、対、脂質の比
をモニターすることにより評価した。

【００１８】図１１Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤは末梢組織内のリポソームＧＣＶの蓄積を示す。器官
を表示の時点で回収し、そして³Ｈ−ガンシクロビル及び¹⁴Ｃ−ＣＨＥ脂質につ
いてアッセイした。結果は±ＳＥＭで示し、ｎ＝４である。図１１Ａ：肝臓；図
１１Ｂ：脾臓；図１１Ｃ：肺；そして図１１Ｄ：腎臓。図１２はリポソームＧＣＶの腫瘍蓄積を示す。腫瘍を表示の時点で回収し、そ
して³Ｈ−ガンシクロビル及び¹⁴Ｃ−ＣＨＥ脂質についてアッセイした。結果は
±ＳＥＭで示し、ｎ＝４である。

【００１９】図１３はＢ１６ＴＫ腫瘍モデルにおけるリポソームガンシクロビルの効能を示
す。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後方脇腹にＨＳＶ−ＴＫが安定的にトランスフェ
クションされた１５０，０００個のＢ１６ネズミメラノーマ細胞を皮下播種した
。５日目から開始して、マウスをリポソーム又は遊離ＧＶＣ（２５mg／kgのガン
シクロビル）又はＨＢＳ（ヘペス緩衝食塩水）により１日置きに全部で６回の注
射で処置した。１８日目での測定は、コントロールマウス中の腫瘍が処置グルー
プのそれよりも５倍以上に大きいことを示した。腫瘍容積は腫瘍をノギスで三次
元測定することにより決定した。

【００２０】図１４ＡはｐＩＮＥＸＬ０１８プラスミド構築体の詳細及び地図を示す。図１４ＢはｐＩＮＥＸＴＫ１０プラスミド構築体を示す。定義「感作」又は「感受性にする」とは指定の系、例えば細胞の感受性を高める能
力を意味する。この意味の中には、細胞を、化合物であってもとはそれに対して
感受性でない又は感受性が弱かった化合物に対してより応答性となるように変え
ることが含まれる。感作及び「一層感受性」には、本来非殺傷性である物質に対
する曝露が細胞死をもたらしてしまうように細胞の感受性を高めることも含まれ
る。

【００２１】「核酸ベクター」又は「ベクター」とは遺伝子産物をコードする核酸配列を含
んで成る組成物を意味する。これは通常プラスミド又はウィルスゲノムであるが
、線形核酸、タンパク質／核酸接合体、等の如きその他の組成物も含まれる。用
途に応じて、ベクターはウィルス封入又はタンパク質被覆方式で導入された核酸
を意味し、この場合組成物全体がベクターとして認識される。

【００２２】「脂質製剤」とは化合物を導入するのに利用されうる任意の脂質組成物、例え
ば限定することなくリポソーム（この場合、水性物質が両親媒性脂質二重層によ
り封入される）、脂質粒子（この場合、脂質が巨大分子成分、例えばプラスミド
を含んで成る内部をコーティングし、水性の内部は少ない）、又は脂質凝集物も
しくはミセル（この場合、封入される成分は比較的無秩序な脂質混合物内に収容
されている）を意味する。「脂質封入」とは、化合物に完全封入、部分封入、又
はその両者を施す脂質製剤に関連しうる。

【００２３】本明細書で使用する「治療的有効量」とは、所望の治療的効果を奏するのに十
分な又は必要な量を意味する。治療効果は直接又は間接的に得られるものであっ
てよい。例えば、治療剤が他の治療剤の活性化を招くものであっても、又は別の
治療剤と組合せて働くものであってもよい。本明細書で使用する「遺伝子産物」とは遺伝子の産物、例えばＲＮＡ転写物を
意味する。ＲＮＡ転写物はアンチセンスもしくはリボザイム転写プラスミドの場
合のようにそれ自身が治療剤であることができ、又はＲＮＡ転写物はポリペプチ
ドへと翻訳されうる（これも遺伝子産物である）。

【００２４】脂質／治療用核酸粒子との関係での「血清−安定性」とは、この粒子が遊離Ｄ
ＮＡを有意に分解するであろう血清又はヌクレアーゼアッセイにかけた後に有意
に分解されないことを意味する。適当なアッセイには、例えば標準の血清アッセ
イ又は実施例の章に記載の如きＤＮＡｓｅアッセイが挙げられる。本明細書で使用する「全身導入」とは、生体内での化合物の広い生体分布をも
たらす導入を意味する。いくつかの投与技術は所定の化合物だけの全身導入をも
たらしうる。全身導入は有用な、好ましくは治療的な量の化合物が身体のほとん
どの部分に晒されること意味する。広い生体分布を得るには一般に化合物が投与
部位から遠位の疾患部位に到達するまで迅速に分解又は浄化されない（例えば、
一時通過器官（肝臓、肺、他）により、又は迅速な非特異的細胞結合により）血
液寿命を要する。脂質／治療用核酸粒子の全身導入は静脈内導入により得るのが
好ましい。

【００２５】発明の詳細な説明及び好適な態様本発明は遺伝子をコードする核酸及びプロドラッグの一方又は双方のための脂
質製剤を採用することによるＧＤＥＰＴシステムに対する質的改善を供与する。
本発明の好適な態様において、核酸及びプロドラッグの双方を別々に脂質製剤で
導入する。本態様において、本発明の好ましくは脂質−核酸粒子を使用し、ここ
で当該核酸は完全に封入されてヌクレアーゼ分解から保護され、そして当該粒子
は小さな直径（５０〜２００nm）を有し、且つ全身導入のために適当なその他の
特質を有する。この製剤中の脂質の組成は所望の効能に応じて同一でも異なって
いてもよい。他方、この核酸及びプロドラッグは一緒に同一の脂質製剤で同時に
導入されてよい。プロドラッグのための脂質製剤の使用は、核酸のための脂質製
剤を伴って又は伴わずに、今までに知られていないＧＤＥＰＴに対する申し分の
ない感受性を供する。

【００２６】一般に患者の治療は以下の通りにして本発明の方法を利用して達成できる。第
一段階において、遺伝子産物を細胞の中で疾患部位又は標的部位において発現さ
せ、かかる細胞の感受性を高めなくてはならない。従って、第一段階は核酸の疾
患部位への導入を要する。当業界において公知の任意の導入方法が本発明の方法
において採用できうる。局所（局部）導入は核酸、例えば裸ＤＮＡ、修飾ウィル
ス、カチオン性脂質−プラスミド凝集物の疾患部位への直接注射により、又は吸
入により、及びその他の当業者に公知の手段により達成できうる。全身導入、例
えば静脈内の投与の場合、完全に封入された脂質−核酸粒子が好ましい。かかる
粒子はより優れた生体分布及び長い循環系半減期の利点を供し、またプラスミド
の微視的な又は本来なら注射不可能な疾患部位への導入を可能にする。

【００２７】核酸を細胞にｉｎｖｉｖｏで導入するいくつかのアプローチが利用されてい
る。これらには全身投与（例えば静脈内及び腹腔内導入等の非経口投与）、気管
支内注入、エアゾール化遺伝子導入、等によるリポソームベース遺伝子導入が挙
げられる。例えば、ＤｅｂｓａｎｄＺｈｕＷＯ９３／１２２４０、Ｄｅｂ
ｓＷＯ９２／１１０８及びＤｅｂｓ米国特許第５，６４１，６６２号は全て哺
乳動物への脂質ＤＮＡ複合体のエアゾール化遺伝子導入を述べている。同様に、
Striblingら、PNAS 89 : 11277-11281(1992)にはマウスへの脂質導入が記載さ
れている。McLachlanら、Gene Therapy 2 : 614-622（1995）にはマウスへのｈ
ＣＦＴＲのＤＯＴＡＰ−媒介脂質導入が記載されている。Canonicoら、AM．J．R
espir．Cell Mol．Biol．10 : 24-29(1994)及びCanonicoら、The American Phy
siological Society 415-419（1994）にはエアゾール化遺伝子導入によるウサギ
へのｈｒ１ＡＴのリポフェクチン−媒介遺伝子導入が記載されている。Altonら
、Nature Genetics 5 : 135-142(1993)にはマウスへのエアゾール又は気管注入
によるｈＣＦＴＲ及びｔ−ｇａｌのＤＣ−ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ−媒
介導入が記載されてるい。Capelenら、Nature Medicine，1(1) : 39(1995)に
は、McLachlanら、Gene Ther．3(12) : 1113-1123(1996)のようにＤＣ−Ｃｈ
ｏｌ／ＤＯＰＥ媒介手順を利用するヒトの鼻上皮へのＣＦＴＲの導入が記載され
ている。非経口投与による脂質−ＤＮＡ複合体の投与の様々な報告が、例えばＢ
ｒｉｇｈａｍＷＯ９１／０６３０９及び米国特許第５，６７６，９５４号；並
びにＤｅｂｓａｎｄＺｈｕＷＯ９３／２４６４０等でなされてもいる。従
って、脂質−媒介技術を利用してｉｎｖｉｖｏで細胞に形質導入を施す様々な
手順が知られている。好適な製剤の詳細は、以下に示す。

【００２８】核酸を細胞に導入するために採用される局所又は全身導入は核酸が取り込まれ
、そして細胞をプロドラッグに対して感作せしめるのに十分に発現されることを
確実にしなければならない。当業者は自殺遺伝子産物の発現を向上せしめるのに
利用できる様々な核酸強化手段を知っている。かかる強化手段には、限定するこ
となく、核酸の細胞内局在化を補助する化合物又は配列、ＤＮＡ配列の転写又は
翻訳を向上させるプロモーター、遺伝子産物の細胞内局在化を向上させる特徴、
等が挙げられる。多種多様な核酸を機能性にする可能性は本発明の範囲に属する
。

【００２９】第２のステップにおいて、脂質製剤中のプロドラッグは細胞にデリバリーされ
る。脂質製剤の使用は、ＧＤＥＰＴシステムにおける遊離ドラッグのデリバリー
に優る多くの驚くべきかつ以前には発見されていない利点、例えばこれらに限ら
ないが、核酸によりトランスフェクトされた病巣へのターゲッティングの改良、
長い循環半減期、薬剤負荷量の増加、非標的組織に対する毒性の減少、治療様式
の改善、例えばＩＶトリップと対照的な単一ボーラス注入等を有する。これらの
利点は先行技術のＧＤＥＰＴの明白な制限を克服する。更に、本プロドラッグの
リポソーム製剤は、好ましくは脂質核酸製剤と同様の生体分布を供し、これによ
り病気の部位で核酸及びプロドラッグの両方を濃縮するであろう。

【００３０】通常、本核酸は、プロドラッグの到着より前に自殺遺伝子産物の合成を許容す
るように、プロドラッグに先立って標的細胞にデリバリーされよう。核酸及びプ
ロドラッグの別個の投与により、又は核酸製剤が標的部位に迅速に蓄積して本核
酸を送り出し、プロドラッグ製剤がその有効量（ｐａｙｌｏａｄ）をよりゆっく
りと蓄積し又は送り出すように同時に製剤を供することにより、時間的な分離を
行うことができる。それゆえ、本発明の組成物及び方法を用いて、核酸は細胞に
送られて自殺遺伝子産物の合成を指示し、それにより細胞は感作され、プロドラ
ッグが細胞に送られ、患者の治療、即ち腫瘍の大きさ、炎症又は感染負荷の減少
等が達成される。

【００３１】Ａ．核酸の調剤核酸の調剤は、先行技術の方法のいずれかを用いて行うことができる。全身（
即ち静脈内又は他の非経口的な）デリバリーのための好ましい方法により、少量
の核酸が遊離溶液に露出され、又は脂質粒子の外部表面に吸着される高効率カプ
セル化を行うことができる。このような方法は、全てが本発明の譲受人に譲渡さ
れ、引用により本明細書に組み込まれる。公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／
４０９６４、米国特許第５，７０５，３８５号及び米国特許出願通し番号０８／
４８５，４５８、０８／４８４，２８２、０８／６６０，０２５、０８／８５６
，３７４、６０／０６３，４７３、０８／９９６，７８３、０６／０８２，６６
５及び６０／０８６，９１７に開示される。好ましい製剤の特定の実施形態は以
下の実施例に記載される。一般に、高効率カプセル化は、全身デリバリーのため
に注入した時に低い免疫原性及び改良された許容性を供する。更に、これらの脂
質−プラスミド粒子は局所的デリバリー法に用いるカチオン性脂質−プラスミド
凝集物と比べてキャラクタライズ及び規定するのが比較的容易である。

【００３２】好ましいカプセル化法は実施例の節に記載される。これらの方法により得られ
た脂質治療核酸粒子は、本発明における使用のために適したものにする同定可能
な特徴を有する。例えば、それらは、典型的には約５０〜約２００nm、好ましく
は約６０〜約１３０nmの平均粒径を有する小さな粒子である。最も好ましくは、
粒子は、比較的均一な大きさのものであり、約３未満、より好ましくは約１未満
、より好ましくは約０．５未満のＸ²（カイニ乗）値を有する。

【００３３】更に、本発明の脂質治療核酸粒子は血清安定性であり、これにより遊離ＤＮＡ
を有意に分解するであろう血清又はヌクレアーゼアッセイに露出した後に有意に
分解されない。血清安定性を測定するための好適なアッセイは標準的血清アッセ
イ又は（実施例の節に記載される）ＤＮａｓｅアッセイがある。ヌクレアーゼ耐
性／血清安定性は、試験管内アッセイ又は循環におけるヌクレアーゼ消化から治
療用核酸を保護する製剤の能力の基準である。本発明のカプセル化粒子は、（カ
チオン性複合体としても知られる）脂質−プラスミド凝集物、例えばＤＯＴＭＡ
／ＤＯＰＥ（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^TM）製剤より大きなヌクレアーゼ耐性及び血
清安定性を有する。

【００３４】更に、本発明の脂質治療核酸粒子は、種々のレベルで調剤することができる核
酸対脂質比を有する。本発明の方法に用いるために、その粒子は、脂質１mmol当
り少くとも約３mgの核酸、より好ましくは脂質１mmol当り少くとも約１４mgの核
酸、更により好ましくは脂質１mmol当り約２５mgの核酸の薬剤対脂質比を有する
。好ましい粒子は、直ちに投与できる製剤に調製する場合、脂質１mmol当り約６
０〜８０mgの核酸である（即ちそれらは“高比率”製剤である）。高比率製剤を
作るための方法は、より低比率の製剤を得るための少い量のＤＮＡを用いても用
いることができる。本明細書に用いる場合、“薬剤対脂質比”は、同量の脂質の
量で割った所定量の調製物中の治療用核酸の量（即ちカプセル化されて、血液へ
の露出により迅速に分解しないであろう核酸の量）をいう。これは、モル当りの
モルベースで、重量当りの重量ベースで、又はモル当りの重量ベースで決定する
ことができる。最終的な直ちに投与できる製剤のために、薬剤対脂質比は、可能
なら、透析、クロマトグラフィー及び／又はヌクレアーゼ消化を用いて外部から
関連する治療剤を等しく除去した後に計算される。薬剤対脂質比は、製剤の能力
の基準である。但し、最も高い可能な薬剤対脂質比が最も能力のある製剤である
とは限らない。

【００３５】本発明の脂質−核酸粒子の別の記述は、関連する活性ローディング過程をきわ
だたせ、低効率又は受動的カプセル化と対照をなす“高効率”製剤である。当該
技術分野で知られている脂質粒子中の核酸の受動的カプセル化は治療剤の１５％
未満のカプセル化を達成し、脂質１mmol当り３mg未満の核酸を有する低比率粒子
を生ずる。本発明の好ましい脂質／治療核酸粒子は、約３０％を超えるカプセル
化効率を有する。本明細書に用いる“カプセル化効率”とは、絶対効率、即ち投
与コンピテント製剤になる出発混合物に添加されるＤＮＡの全量をいう。時折、
相対効率が計算され、これでは、出発混合物の薬剤対脂質比は最終的な投与コン
ピテント製剤の薬剤対脂質比で割られる。調剤過程の間に失われた脂質の量を計
算することができる。効率は製剤の消耗及び費用の基準である。

【００３６】本発明の好ましい粒子の使用により出てくる他の有益な特徴、例えば低い非特
異的毒性、生体分布の改善、治療効能及び製造の容易さは当業者に明らかであろ
う。カプセル化の別の方法により上述のような粒子を開発することも可能である
。これらの方法は、慣用的な薬剤に用いるために公知であるリポソームのローデ
ィングのための標準的な技術を用いることができる。これらの方法には、凍結−
解凍押出、脱水／再水和、逆相エバポレーション等があり、それらのいくつかは
Monnardら、“Entrapment of nucleicacids in liposome”，Biochem．Biophys
．Acta．1329 : 39-50（1997）に開示される。これらの方法は、高いカプセル化
効率調剤でも高効率調剤でもないが、その開示は遠位の腫瘍部位に対する遺伝子
治療の使用におけるこれらの粒子の利用性を示唆する。

【００３７】Ｂ．プロドラッグの調剤脂質−プロドラッグの調剤は先行技術の方法のいずれかにより行うことができ
る。好ましい方法は、約０．１対０．２５（mol／mol）の要求される薬剤：脂
質比を生ずる。脂質−プロドラッグ製剤は、Hopeら(Biochem．Biophys．Acta 8
12 : 55-65(1985))に開示される標準的な凍結−解凍及び押出技術を用いて合成
することができる。用いることができる他の薬剤ローディング及びカプセル化技
術は、米国特許出願通し番号０８／３９９６９２、０８／５８８５４２、０８／
７４１６２２に開示され、これらの教示内容は引用により本明細書に組込まれる
。脂質製剤のサイジングは、押出機、加圧セル、及び当業者に知られた他の道具
を用いて行うことができる。

【００３８】本明細書に開示される脂質に加えて、本明細書に開示されるリポソーム製剤の
デリバリー又はターゲッティングを増強するために用いることができるおびただ
しい数の更なる脂質及び非脂質成分がある。更なる脂質成分には、これらに限ら
ないが、中性、アニオン性、カチオン性又は両性イオン性ヘッドグループを有す
る脂質等がある。これらの標準的な成分は当該技術分野及び引用により本明細書
に組み込まれる上述の特許出願に記載される。本発明で特に好ましい荷電した脂
質は、引用により本明細書に組み込まれ本発明の譲受人に譲受された現在発行さ
れている米国特許第５，７５３，６１３号の主題であるＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ
，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）；及びその教示が引用に
より本明細書に組み込まれる米国特許出願通し番号０８／８５６，３７４の主題
である１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡ
Ｐ）である。

【００３９】核酸及びプロドラッグ製剤は、両方とも、広範囲の種々の脂質、脂質コンジュ
ゲート及び当該技術分野で知られた適合する更なる成分から選択される更なる成
分を含んでもよい。例えば、コレステロール及びその誘導体は、本発明の核酸及
びプロドラッグ製剤に用いることができる。更に別の製剤は、脂質カプセル化前
にＤＮＡを小さな大きさに凝縮することができるポリカチオン化合物を用いるこ
とができる。化合物の中でもとりわけ、ポリリシン及びポリエチレンイミンがこ
の能力において当業者に用いられている。凝縮した粒子も本発明の方法に用いる
ことができる。

【００４０】更に、宿主免疫系による排出を減少させるためにクローキング（ｃｌｏａｋｉ
ｎｇ）剤を用いることができる。このようなクローキング剤には、例えば、１９
９８年２月２日に出願された米国特許出願通し番号０８／９９６，７８３号（Ｔ
ＴＣＡｔｔｏｒｎｅｙＤｏｃｋｅｔＮｏ．１６３０３−６０５８００）に
開示されるＡＴＴＡ−脂質及び米国特許出願通し番号０８／４８６，２１４、０
８／３１６，４０７及び０８／４８５，６０８号に開示されるＰＥＧ−脂質コン
ジュゲートがある。これら文献の教示内容は引用により本明細書に組み込まれる
。これらの成分は、脂質製剤が病気の領域又は標的部位に蓄積するのを助長する
ターゲッティング剤であってもよい。更に、これらの成分は製剤の特徴、例えば
漏れやすさ、循環の寿命、毒性の減少、カプセル化効率等を改善する化合物であ
ってもよい。これらの成分及び本発明の製剤に通常、含まれ得る他の成分の例は
、当業者に知られており、彼らに用いられている。

【００４１】核酸製剤及びプロドラッグ製剤の両方に関して、プログラム可能な融合原性（
ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）脂質製剤を用いることが時折好ましい。これは、細胞膜と
融合する傾向がほとんどなく、所定のシグナルが発生するまでその有効量（ｐａ
ｙｌｏａｄ）を送り出す製剤をいう。これは、その脂質製剤が、生物又は病気の
部位への注入又はデリバリーの後、それが細胞と融合する前に、より均一に分散
するのを可能にする。シグナルの発生は、例えばpH、温度、イオン環境又は単に
時間の変化であり得る。この最後の出来事において、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲ
ート又はＰＥＧ−脂質コンジュゲートのような融合遅延又は“クローキング”成
分は、単に経時的にリポソーム膜の外側を交換し得る。製剤は体内に適切に分散
する時まで、融合原性であるのに十分なクローキング剤を失うように計算される
。他のシグナル発生に関して、炎症の部位での温度の増加のような病気の部位又
は標的細胞に関連したシグナル発生を選択することが要求され得る。

【００４２】本発明のプロドラッグ製剤の可能な脂質成分は、当該技術分野で典型的に用い
られる全ての成分、例えばこれらに限らないが、米国特許第５，５４３，１５２
号及び米国特許出願通し番号０８／５３６５８４、０８／３１６３９９、０８／
４８５６０８、０８／４４２２６７に開示されるスフィンゴソームである。Ｃ．核酸／プロドラッグコンビネーション自殺遺伝子／プロドラッグコンビネーションのいずれをも本明細書に開示され
る様式で用いることができる。本発明の方法に用いるために適したいくつかの自
殺遺伝子／プロドラッグコンビネーションは、引用により本明細書に組み込まれ
るSikora in OECK Documents，Gene Delivery System at pp．59-71(1996)に言
及され、これらに限らないが、以下のものがある：自殺遺伝子産物少い活性のプロドラッグ活性化されたドラッグ単純ヘルペウィルスガンシクロビル（GCV)、リン酸ｄＧＴＰ１型チミジンキナーゼアシクロビル、アナログ（ＨＳＶ−ＴＫ）ブロモビニル−デオキシウリジン、又は他の基質シトシンデアミナーゼ５−フルオロシトシン５−フルオロウラシル（ＣＤ）キサンチン−グアニン６−チオキサンチン６−チオグアノ− −ホスホリボシルトラ（６ＴＸ）シネモノホスフェートンスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）プリンヌクレオシドＭｅＰ−ｄｒ６−メチルプリンホスホリラーゼシトクロム P450 2B1 シクロホスファミド〔細胞毒性代謝物〕リナマラーゼアミグダリンシアニド（Linamarase）（amygdalin）ニトロレダクターゼＣＢ１９５４ニトロベンズアミジン β−ラクタマーゼＰＤＰＤマスタード β−グルクロニダーゼａｄｒｉａ−ｇｌｕアドリアマイシン（adriamycin）カルボキシペプチダーゼＭＴＸ−アラニンＭＴＸグルコースオキシダーゼグルコースペルオキシドペニシリンアミダーゼａｄｒｉａ−ＰＡアドリアマイシンスーパーオキシドＸＲＴＤＮＡ損傷剤ジスムターゼリボヌクレアーゼＲＮＡ開裂産物いずれのプロドラッグも、それが異種遺伝子産物により細胞がよりセンシティ
ブである化合物に代謝されるなら、用いることができる。好ましくは、細胞は、
その代謝物よりプロドラッグに対して少くとも１０倍、感受性が少い。

【００４３】本発明に役立ち得るＧＤＥＰＴシステムの改変には、例えば、改変したＴＫ酵
素構成物の使用がある。ここでは、ＴＫ遺伝子がプロドラッグからドラッグへの
より迅速な変換を引きおこすように変異されている（例えばBlackら、PNAS(US
A)，93 : 3525-3529（1996）を参照のこと）。あるいは、ＴＫ遺伝子は、その効
果を増強する別の遺伝子と共に、ビシストロン性構成物によってデリバリーする
ことができる。例えば、（トランスフェクトされた細胞の近傍の細胞も殺される
）“近隣（ｎｅｉｇｈｂｏｒ）効果”としても知られる“バイスタンダー（ｂｙ
ｓｔａｎｄｅｒ）効果”を増強するため、ＴＫ遺伝子は、コネキシン４３のよう
なギャップ結合タンパク質のための遺伝子と共にデリバリーすることができる。
コネキシンタンパク質は、１つの細胞から他の細胞へのＴＫ遺伝子の毒性産物の
拡散を許容する。ＴＫ／コネキシン４３構成物は、内部リボソームエントリー配
列及びコネキシン４３コーディング核酸によりＴＫ遺伝子に作用可能に連結した
ＣＭＶプロモーターを有する。

【００４４】ＧＤＥＰＴシステムに加えて、本発明に用いることができる極めて広範囲の種
々の治療用核酸が存在する。それらの核酸は、ヒト、非ヒト（即ち他の植物、動
物又は微生物のいずれかからのもの）又は全体が合成したもの（即ち非天然）で
あってもよい。その核酸は、被検体の細胞に対して内在性であっても外来性であ
ってもよく、その核酸が通常、被検体の細胞内に見い出されないことを意味する
。腫瘍形成の治療はデリバリーされた核酸の長期の又は安定した発現を必ずしも
要求しないので、一時的発現システムに有効な遺伝子、例えば毒素又は免疫刺激
タンパク質も本発明の方法に役立つ。

【００４５】治療用核酸が被検体に対して内在性のものである場合、改変された配列、増加
されたコピー数、又はネイティブ遺伝子に対して増加した転写活性を有する構成
物をデリバリーすることができる。遺伝子産物は、直接的毒性のものでも間接的
毒性のものでも、又はアポトーシスもしくは細胞分化を誘導し得るものでもよい
。最も好ましいシステムにおいて、治療用遺伝子の遺伝子産物は、非標的組織に
対する低い毒性、及び病気の部位に対する高い毒性を示すであろう。例えば、本
発明の好ましい脂質−核酸粒子でデリバリーする場合、遺伝子産物は、好ましく
は、肝臓又は脾臓細胞より腫瘍細胞に対して大きい毒性を有し、ここで粒子の大
部分は通常、除去される。病気の部位への特異性は、遺伝子転写又は翻訳のため
の組織／病気特異的プロモーターを用いることによっても増強することができる
。組織特異的プロモーター、及びそれらを治療用核酸と関連づける方法は、当業
者に知られている。

【００４６】本発明の方法に用いるために適した好ましい内在性遺伝子には、これらに限ら
ないが、プロアポトーシス遺伝子；ポレイフィリン（ｐｏｒｅｉｆｉｒｉｎ）；
腫瘍サプレッサー遺伝子（ｐ５３等）；サイトカイン（ＩＬ−２，ＩＬ−１２，
ＩＬ−１５，ＧＭ−ＣＳＦ等）；ヒートショックプロテイン；イムノドミナント
Ａｇ（又は腫瘍特異的タンパク質遺伝子）；胚でのみ活性化される遺伝子；ＴＩ
ＭＰ−２（メタロプロティナーゼ−２の組織インヒビター）及び他の転移阻害タ
ンパク質；置換遺伝子、例えばＣＦＴＲ，ＤＭＤ；ＬＤＬ−Ｒ等；並びに抗血管
形成遺伝子、例えばエンドスタチン又はアンギオスタチンがある（ＷＯ９７／１
５６６６；ＷＯ９５／２９２４２；Boehmら、Nature，309 : 404-407(1997)；
及びKerbelら、Nature，309 : 335(1997)を参照のこと）。ＩＬ−１２は本発明
において治療用核酸として用いることができる好ましい内在性遺伝子である（Ta
hara，H.及びLotze，M.T.，Gene Ther．2 : 96-106（1995）を参照のこと）。デ
リバリーのための適切なＩＬ−１２プラスミド構成物）は、University of Mich
igan(Ann Arbor，Michigan)のNational Gene Therapy Vector Laboratoryによ
り供されるｐＮＧＶＬ３−ｍＩＬ１２である。

【００４７】患者の細胞中に自然には見つからない外因性の遺伝子は、それらの遺伝子産物
も免疫応答を誘導するのに役立つことがあるから、有益であり得る。たとえば、
自殺遺伝子／プロドラッグシステムに用いられる遺伝子はこの効果を有すること
がある。好ましい外因性遺伝子は、限定するものではないが、ＧＤＥＰＴ組合わせ（プ
ロドラッグと同時の治療）、に用いられる遺伝子、リボザイムまたはリボザイム
もしくはアンチセンストランスクリプトをコードする転写プラスミド、トキシン
遺伝子、たとえば、サポニン、リシン、ジフテリアトキシン及びクロレラトキシ
ン（または、あらゆる他の植物、細菌または真菌遺伝子）、ウィルスのタンパク
質遺伝子、たとえば、Ｅ１Ａ、変異Ｅ６、ＳＶ４０Ｔａｇ等を含む。他の本発
明の方法で用いるために適当な外因性遺伝子は当業者には容易に分かるだろう。

【００４８】本明細書に開示された治療上の核酸を運ぶプラスミドまたはベクターを構築す
る方法は当業者に周知である〔たとえば、「分子生物学における最近のプロトコ
ル（ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯ
ＬＯＧＹ）」Ausubel他（編）、（1995）参照。この教示を参照により本明細書
に組み入れる〕。治療活性は、転写または翻訳プロモーター及び他の核酸要素の
添加により増強することができる。再度いうが、これらのすべては当業者に知ら
れている。

【００４９】好ましいプロドラッグは、ガンキクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、のエ
ライジン酸エステル類似体（「Ｅ−ＧＣＶ」）である。Ｅ−ＧＣＶは、本発明の
プロドラッグ／リポソーム製剤により、プロドラッグのカプセル化及び送達を増
強し得る親油性部分を有する。このリポソームを用いる増強された送達は、「Ｅ
−ＧＣＶ化合物とその合成方法」(Balzarini他「Gene Therapy」5 : 419-426，
1998)を記載する研究に提示された利益を増強し得る。

【００５０】Ｄ．全身送達による病気部位のターゲティング本発明の卓越した利点の一つは、広範囲の病気部位のターゲティングにおける
多目的に利用できることである。特に、脂質カプセル化製剤は、腫瘍細胞及び他
の新形成、またはある他の機能を成し遂げるように有用に感受性にすることがで
きる他の細胞型をターゲティングし、かつ殺すことに有用に用いられる。他の細
胞型は、限定するものではないが、炎症部位、遺伝子が異常に発現される部位、
感染部位等である。

【００５１】好ましい態様では、核酸及びプロドラッグの両方を静脈内投与により脂質カプ
セル化製剤において送達する。この方法は、特定のターゲティング面なしであっ
ても、腫瘍及び新形成に蓄積する脂質カプセル化製剤の既知の傾向を利用する。
この能力は、小さいサイズの脂質粒子が容易に侵入する新形成の部位での「漏り
やすい」血管系の結果であると考えられる（R.K．Jain 「Sci．Am.」271 : 58-6
5(1994)参照）。

【００５２】特異的細胞型ターゲティングが好ましいところでは、脂質製剤は、たとえば、
外表面に標的細胞上のレセプターにより認識されるか、またはレセプターを認識
する、抗原またはマーカーを含有する。このようなターゲティング方法の例は、
たとえば、「フォーラム：動物モデルにおけるリポソームターゲティング（L．H
uang編）」、Juounal of Liposome Research 7(4) : 315-534（1997）に見るこ
とができ、この教示を参照により本明細書に組み入れる。

【００５３】一般に静脈内投与をする時、核酸及び／またはプロドラッグ製剤は適当な医薬
担体で製剤化されるだろう。多くの医薬として許容し得る担体を本発明の組成物
及び方法に用いることができる。本発明において用いるために適当な製剤化方法
は、たとえば、「Remingtoris Pharmaceutical Sciences」（Mark Publishing
Company,ペンシルバニア州フィラデルフィア，17版，1985）に見い出される。多
数の水性担体を用いることができ、それはたとえば、水、緩衝化水、０．４％生
理食塩水、０．３％グリシン等を包含し、安定性を増強するための糖タンパク質
、たとえば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等を包含し得る。一般に
通常の緩衝化生理食塩水（１３５〜１５０mM ＮａＣｌ）が医薬として許容し得
る担体として用いられるであろうが、他の適当な担体は十分であろう。

【００５４】これらの組成物は慣用のリポソーム殺菌技術、たとえば、ろ過により殺菌する
ことができる。組成物は、ほぼ生理的条件に必要な医薬として許容し得る補助物
質、たとえば、pH調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤化剤等、たとえば、酢酸ナ
トリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、
ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有し得る。
これらの組成物は、上記技術を用いて殺菌することができるか、またはそれらを
無菌条件下に製造することができる。得られる水溶液は使用するために包装する
か、無菌状態でろ過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥製剤は投与の前に滅
菌水溶液と組み合わされる。核酸またはプロドラッグ製剤を当業界で既知の他の
非経口方法、たとえば、皮下注射、腫瘍内注射または筋内注射、吸入等により送
達する時、担体も用い得る。

【００５５】本発明は、カプセル化プロドラッグが関連するシステムの抗体指向酵素プロド
ラッグ療法（「ＡＤＥＰＴ」）（Bagshawe，K他「B.J．Cancer」58 : 700-703
（1988）も改良することを示す。このシステムでは、標的化抗体が酵素を直接に
腫瘍または病気の細胞に送達するのに用いられる。しばしば、これらの酵素は、
上記細胞に近い細胞外マトリックスにおいて機能する。標的部位で、プロドラッ
グは酵素により毒性代謝物に変換される。明らかに、脂質製剤中のプロドラッグ
の送達は、ＧＤＥＰＴシステムにおいて示されたものと同様な利点、たとえば、
遺伝子／酵素送達とのシンコペーション、減少した毒性、改良されたターゲティ
ング、長期の循環等を有するだろう。

【００５６】Ｅ．核酸及びプロドラッグの投薬量ＧＤＥＰＴシステムの一部としてまたは組合わせ療法の一部としてのいずれで
あれ、患者に投与すべき正確な投薬量は、究極的には居合わせる医者の裁量及び
職業的判断に依存し、そして、ある程度、患者の年令、体重及び異常な新形成の
ような因子に依存するだろう。量及び正確な養生法は、もちろん、治療すべき症
状の重症度を含む他の因子に依存するだろう。

【００５７】他のシステムにおいては、正確な投薬養生法は個々の臨床医が決定する必要が
あるだろう。それは送達される核酸の性質及び治療される症状により制御される
だろうが、ある程度の一般的なガイダンスは与えることができる。一般に、投薬
量は、約０．１μｇから１ｇ以上の核酸に容易に変動することができる。より好
ましくは、核酸の服用量は典型的な７０kgの患者について約０．１μｇ〜約５mg
／kgに変動するだろう。そして、核酸（ウィルス粒子を含む）の服用量は治療上
の核酸と等量を生産するように計算される。

【００５８】ＧＤＥＰＴ系において、当該核酸脂質粒子の適切な投与量は、約５００〜約２
０００００酵素単位／ｍ²（例えば２００００酵素単位／ｍ²）を生じる核酸の
量であろう。当該プロドラッグの投与量は、有利には、１日あたり受容者の体重
１kgに付き約０．１〜２５０mgであり、好ましくは約０．１〜１００mgであろう
。

【００５９】典型的には、当該核酸を患者に投与し、細胞への取り込み及びトランスフェク
ションを、例えば、標的新生組織の生検試料の回収及び分析により、監視する。
患者に一定範囲の試験投与量を投与し、そして標的の細胞又は腫瘍におけるトラ
ンスフェクションの程度を測定することによる臨床試験により、これを決定する
ことができる。本発明の方法では、一般的に、遺伝子産物をコードする当該核酸
の投与に続いて、当該プロドラッグを投与する。

【００６０】本発明を、Canadian Council on Animal Care，Vol．2nd Ed.,“Guide to the
care and use of experimental animals,”Eds．Olfert，E.，Cross，B．and M
cWilliam，A.（1993）に従って行った特定の実施例により、詳細に記載する。説
明のために、しかし限定するつもりはなく、以下の実施例を示す。当業者は、本
質的に同一の結果を導く様に変更又は改変することができる決定的でないパラメ
ーターを容易に認識するであろう。実施例Ａ．実施例１この実施例では、全身性に供給するための脂質−プラスミド粒子の合成を説明
する。

【００６１】材料：プラスミドは、好ましくは、スーパーコイル型で、長さ４０００〜１５
０００bpであり、希望通りに、遺伝子及びエンハンサー要素をコードする。実施
例で使用するプラスミドは以下のものである：ｐＩＮＥＸＬ０１８：Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺
伝子（Promega，Madison，WI）がＣＭＶプロモーターの支配下にある発現ベクタ
ー。その他の遺伝子及び配列を図１４Ａに示す。

【００６２】ｐＩＮＥＸ−ＴＫ１０：“ハイパー”ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子に連結されたＣＭＶ
プロモーターを有するｐＢＲ３２２由来プラスミドを含んで成る発現ベクター（
Black et al.，PNAS USA，93 : 3525-3529（1996）参照）。その他の遺伝子及び
配列を図１４Ｂに示す。ｐＩＮＥＸ−ＩＬ−１２：治療用遺伝子が、ＣＭＶプロモーターに連結された
ＩＬ−１２遺伝子を含んで成ること以外は、ｐＩＮＥＸ−ＴＫ１０と同様である
。

【００６３】カチオン性脂質であるＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムク
ロライド（“ＤＯＤＡＣ”）及びモノメトキシポリエチレン２０００グリコール
スクシネート−（Ｃ８：Ｏ−セラミド）（“ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ８”）を、Ｉｎ
ｅｘＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＣｏｒｐ．で合成した。ジオレイル−
ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｐｉ
ｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒから得た。標準的透析膜：Ｓｐｅｃｔｏｒ／Ｐｏｒ５
再生型セルロース（１２〜１４，０００MWCO）をＶＷＲから入手した（製造元：
Spectrum Medical Industries Inc.）。クエン酸ナトリウムをＢＤＨから入手し
た。塩化ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びオクチル−ベーターＤ−グ
ルコピラノシド（“ＯＧＰ”）をＶＷＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ又はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙか
ら入手した。ＩＮＥＸ３０３（又は調製物１．１）プラスミド（５０〜４００μｇ）を、ＤＯＤＡＣと、準備溶液（０．２Ｍ OG
P／１５０mM ＮａＣｌ，５mM ＨＥＰＥＳ pH７．４を含む）５００μｌ中で
３０分間室温でインキュベーションする。この混合液を、同上の準備溶液５００
μｌ中で、ＤＯＰＥとＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ１４又はＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０又は
ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ８との混合物に加える。総脂質濃度は５又は１０mg／mlであ
り、ＤＯＰＥ：ＤＯＡＣ：ＰＥＧ−Ｃｅｒ物のモル比は８４：６：１０であった
。この混合液を、１５０mM ＮａＣｌ，５mM ＨＥＰＥＳ（pH７．４）に対して
３６〜４８時間、２回緩衝液を交換して、透析した。

【００６４】封入されなかったＤＮＡを、ＤＥＡＥセファロースカラム（１×４cm）上でア
ニオン交換クロマトグラフィーにより取り除いた。１２．５ml超遠心チューブ中
のスクロース密度勾配液の頂上に、ＤＥＡＥカラム上で共溶離した脂質／ＤＮＡ
試料をプールすることにより、空のリポソームを取り除いた。この勾配液は、底
から頂上に連続的に重積した各３mlの１０％スクロース、２．５％スクロース及
び１％スクロース／ＨＢＳから成る。この勾配液を、ＢｅｃｋｍａｎＯｐｔｉ
ｍａｌＸＬ−１００Ｋ超遠心機で、ＳＷ−２８ローターを用いて、３６０００
rpm（１６００００ｇ）で２時間２０℃で超遠心した。頂上から底まで分離した
バンドを取り出した。ＢｅｃｋｍａｎＬＳ６５００シンチレーションカウンタ
ーを用いて、二重標識シンチレーション計数により、³Ｈ−プラスミド及び¹⁴Ｃ
−ＣＨＥについて、分画を検査した。脂質に封入されたプラスミドＤＮＡは、２
．５％と１０％スクロースとの中間面に狭くバンド化した。一方、未結合の脂質
は、勾配液の頂上から、１％と２．５％スクロースとの中間面まで幅広く存在し
た。この調製物を、５０００００MW ＰＥＧ（ＡｑｕａｃｉｄｅII）に対して、
１２〜１４，０００MWCO透析チューブ中で濃縮することができる。希望した容量
に達した時点で、当調製物を新しい透析バッグに移し、ＨＢＳに対して一晩透析
して、そのＮａＣｌ濃度を１５０mMに合わせた。ＩＮＥＸ３５１脂質濃度：５．０mg／ml（すなわち５．３mM）プラスミド濃度：２００μｇ初期容量：１．０ml 脂質保存溶液：（９５：５ベンゼン：メタノール、２：１クロロホルム：メタノ
ール又はエタノール中で）mg単位では、１０〜２０mg／mlが適当である（好まし
くは前記溶媒中で１０mg／ml、この様な低濃度では無水エタノールが適当である
）。モル単位で計算すると（９５：５ベンゼン：メタノール又は２：１クロロホ
ルム：メタノール中に溶解して）^*、ＤＯＰＥ（７４４ｇ／mol）：４０mM ＤＯＤＡＣ（５８２ｇ／mol）：４０mM ＰＥＧ−Ｃ８（２５１５ｇ／mol）：２０mM。３５１用の調製：４２．５：４２．５：１５（mol ％）ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ：
ＰＥＧ−Ｃ８ＤＯＰＥＤＯＤＡＣＰＥＧ−Ｃ８ mg 1.68 1.315 2.005 mole％ 42.5 42.5 15 μmol 2.25 2.25 0.8 μｌ 56.2 56.2 40 調製方法（１ml規模）脂質保存溶液の一定量を清潔で乾燥したテストチューブに入れ、Ｎ₂ガス流、
次に少くとも２時間の真空乾燥により、脂質膜になるまで乾燥する。２ＭＯＧ
Ｐ５０μｌを加え、２倍強度の透析緩衝液５００μｌを加え、プラスミド２０
０μｇを加え、そしてボルテックスにより撹拌して、当脂質膜を溶解する。滅菌
脱イオン水で１．０mLに合わせ、撹拌し、室温で約３０分間インキュベーション
する。この溶液を透析バッグに入れ、透析緩衝液２Ｌに対して４０〜４８時間、
途中約２４時間後に１〜２回緩衝液を交換して、透析する。自重計測したチュー
ブ中で重量測定することにより（密度を１．０と仮定して）当試料の容量を決定
する。これらの過程に続いて、前記通り、ＤＥＡＥによる精製、及び／又は、ス
クロース密度勾配遠心を行い得る。

【００６５】前記通りのＤＥＡＥ精製及びスクロース密度勾配遠心の後に、最終のＩＮＥＸ
３５１調製物は、約２００μｇ／mlプラスミド及び５mg／ml総脂質を含有する。ＩＮＥＸ３５１に関する注記：注記１：適当な透析緩衝液の濃度ｐ５３：１５０mM ＮａＰＯ₄＋１５０mM ＮａＣｌ（試しに１４０〜１６０mM ＮａＣｌ），pH７．４ｐＬｕｃ＋１７５mM ＮａＣｌ（約１５０〜１７０mM ＮａＣｌ），pH ７．４注記２：１５０mM ＮａＰＯ₄緩衝液、pH７．４：３５．７７ｇ第二リン酸ナトリウム（Ｎａ₂ＨＰＯ₄）６．６２ｇ第一リン酸ナトリウム（ＮａＨ₂ＰＯ₄）脱イオン水２Ｌ（最終容量）に溶解した適量のＮａＣｌを、撹拌しながら加える。最終pHは約７．３〜約７．４で変動し得る。これは、通常調整されないし、当調製物の性能に影響しない。注記３：当該脂質／プラスミド／界面活性剤の溶液と共に、０．２μｍで濾過した緩衝液を用いる。注記４：２倍強度の透析緩衝液を加える代りに、当プラスミドを、予じめ透析緩衝液に対して透析することができ、そしてその調製物を、最終容量まで標準強度の透析緩衝液により希釈することができる。これは、緩衝液濃度が少し異なることを意味するが、封入効率又は生成する粒子サイズに影響しない。注記５：当調製物の容量が増加した場合（例えば５ml超）、別の透析交換を追加する。注記６：カラムへの非特異的脂質の結合を防ぐために、押出し又は超音波により形成した１０mg／mlの１：１ホスファチジルコリン：コレステロールの小胞５０μｌを溶出させることにより、ＤＥＡＥセファロースカラムをしばしば前処理する。

【００６６】ＩＮＥＸ３５１調製物のカチオン性表面荷電を減らすために、使用するカチオ
ン性脂質（すなわちＤＯＤＡＣ）の量を減らすことが望ましいであろう。ＤＯＤ
ＡＣの量を変更した場合、脂質総量を同一に維持する様にＤＯＰＥの量を変換す
る。好ましくは、総脂質１０mg中、ＤＯＤＡＣが３０％未満である調製物を作成
する。透析緩衝液を、以下の表１に示す通り、変更することができる：表１．代表的な大規模の調製物の特性濃度開始容量緩衝液封入効率粒子サイズ (nm)^ａ 42.5％ 30ml 150mM NaPO₄，130mM 49％ 131 NaCl 30％ 12ml 150mM NaPO₄ 56.8％ 109 24％ 12ml 130mM NaPO₄ 50.7％ 250 20％ 15ml 105mM NaPO₄ 63％ 178 ａ：ＤＥＡＥ精製及び単離の前の、平均粒子サイズのＮｉｃｏｍｐ分析、ガウス分布、容量計測。ＩＮＥＸ３２１本発明では、１０〜３０％ＤＯＤＡＣを有する脂質−プラスミド粒子も有用で
ある。それらを、前記通り、又は下記通り調製することができる。

【００６７】脂質保存溶液：各脂質の個別の保存溶液を、最終濃度２又は２０mg／mlになる
様に、クロロホルム／メタノール（２：１ｖ／ｖ）中に溶解して作成した。ＯＧＰ溶液：ＭｉｌｌｉＱレベルの水で１．０ＭＯＧＰ溶液を調製した。クエン酸塩緩衝液：当調製物から界面活性剤を除くための透析に、クエン酸ナ
トリウム緩衝液を用いた。クエン酸塩の濃度を、ＤＯＤＡＣの量に応じて変更し
た。緩衝液は、更に、特に指示しない限り、１５０mM ＮａＣｌ及び５mM ＨＥ
ＰＥＳ pH７．４を含有する。一般に、１０倍溶液を調製し、透析のために、メ
スシリンダーを用いてＭｉｌｌｉＱＰｌｕｓ水により１：１０に希釈した。

【００６８】脂質／ＤＮＡ／ＯＧＰ混合物の調製：典型的な調製物は、ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰ
Ｅ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ８の脂質１０mg及びＤＮＡ２００μｇを含有した。Ｄ
ＯＤＡＣ，ＤＯＰＥ及びＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ８を含有する保存溶液の適量（当調
製物中では通常１５モル％）を、ガラス製テストチューブ中で混合した。ＤＯＤ
ＡＣ量を変更する場合、総脂質を１０mgに維持する様にＤＯＰＥ量を変更する。
その溶媒を、先ずＮ₂ガス流により、次に３〜５時間の真空下のインキュベーシ
ョンにより取り除く。その脂質に、０．２mLの１ＭＯＧＰを加えた。その懸濁
液を、脂質が総て溶解し、その溶液が透明になるまでボルテックスで撹拌した。
次に、２００μｇＤＮＡ及び０．６mL ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）又は
クエン酸塩緩衝液（図１に示した濃度）を含有する０．２mL ＤＮＡ（１mg／ml
）溶液を、最終濃度１mLになるまで加えた。その溶液が透明にならなかった場合
、少量のＯＧＰ（５０μＬ）を加えた。その溶液を室温で１時間インキュベーシ
ョンし、その成分を平衡化した。

【００６９】透析：透析チューブを６０％エタノール（または、滅菌が不要の場合、蒸留水
）中に３０分間浸漬した。次にＤＮＡ／脂質／ＯＧＰの当該混合溶液を透析チュ
ーブに移した。その試料を、２〜４Ｌのクエン酸塩緩衝液（図１に記載した濃度
）中で２日間、合計２回毎日緩衝液を変えて、透析した。調製後、前記通り、ＤＥＡＥ精製及びスクロース密度勾配遠心により空のリポ
ソームを除くことができる。種々の脂質−プラスミド粒子の調製が、この実施例
の全身性供給のために適することが分かっているので、当業者には、例えばプラ
スミド供給を、そして／又は細胞内発現を改善するために、１又は複数の可能性
のある変種を用いてそれらを改変することが明白であろう。以下のタイプの変種
が示唆される：ＰＥＧ−脂質の割合；ＰＥＧのサイズ；疎水性（アンカー）鎖の
長さ；pH感受性ＰＥＧ−脂質；ＡＴＴＡによるＰＥＧの置換（米国特許出願０８
／９９６７８３、出願１９９７年１２月２３日、及び０６／０７３８５２、出願
１９９８年２月２日に開示されており、これらは全て、本発明の譲受人に譲渡さ
れている）；膜修飾性の脂質、例えばコレステロール又はＤＯＰＥの追加；代り
のカチオン性脂質、例えばＤＭＲＩＥ，ＤＯＴＡＰ，ＤＯＴＭＡ，ＤＯＤＭＡ，
ＡＬ−１等の使用；フソジェニック成分、例えばpH感受性脂質、ペプチド（ＥＡ
ＬＡ）又はポリマー（ＰＥＡＡ）の使用；ターゲティング因子の使用；ＤＮＡ濃
縮性ペプチド（すなわちポリリシン又はスペルミン）又はポリマー（すなわちＰ
ＥＩ）の使用；陰荷電脂質、例えばホスファチジルセリンの使用；あるいは、代
りのＰＥＧ−脂質リンカー、例えばＳＰＤＰ又はＰＤＰＨ（米国特許出願０８／
５３６５８４に開示されており、本発明の譲受人に譲渡されている）の使用。調製物１．４調製物１．４は、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ：ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（８３：７
：１０）（モル％）を含有する。この合成方法は以下の通りである。脂質保存溶
液（エタノール中）の一定量を、オートクレーブした清潔な、乾燥した丸底フラ
スコに入れる。その溶液を、回転蒸発器（ｒａｔｏｖａｐ）を用いて、６５℃の
水槽中で一晩真空乾燥させて、脂質膜にする。オクチルグルコピラノシド（ＯＧ
Ｐ）を含有するＨＢＳを、ＯＧＰ終濃度が２００mMになる様に加える。その混合
液を撹拌して脂質膜を溶解する。必要ならば、脂質を完全に溶解するために、３
７℃に加熱する。次に溶解した脂質膜に、プラスミドＤＮＡ（４００μｇ／１０
mg脂質）を加える。室温で３０分間インキュベーションした後、生じた溶液を、
予め濾過滅菌した蒸留水に浸漬し、そしてオートクレーブした透析バッグに入れ
る。透析緩衝液（５mM ＨＥＰＥＳ，１５０mM ＮａＣｌ，pH７．４，０．２ミ
クロン滅菌フィルター濾過滅菌した）２０Ｌに対して、２回緩衝液を交換して、
一晩透析する。

【００７０】ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム上でアニオン交換クロマトグラフィー
を行って、封入されなかったＤＮＡを除いた。溶離液中に現れた粒子懸濁液を集
め、Ａｍｉｃｏｎダイフィルトレーション系（ＹＭ３０膜）により濃縮した。次
にスクロース密度勾配遠心により空のリポソームを除いた。この勾配液を、１０
％スクロース、５．０％スクロース及び２．５％スクロース／ＨＢＳ，pH７．４
を重積することにより作成した。試料を、２．５％スクロース層の頂上に浮かせ
る様に添加し、ＢｅｃｋｍａｎＯｐｔｉｍａＸＬ−１００Ｋ超遠心機及びＳ
Ｗ−２８ローターを用いて、２８０００rpmで１８時間２０℃で遠心する。遠心
後、注射器及び注射針により、より低いバンドを取り出し、試料をプールする。
Ａｍｉｃｏｎ系により、スクロースを除くと同時に、試料を濃縮する。０．２ミ
クロン膜により、その最終容量を濾過滅菌する。ＤＮＡ濃度をＰｉｃｏｇｒｅｅ
ｎ検査により、脂質濃度をＨＰＬＣにより、そして粒子サイズをＮｉｃｏｍｐ分
析により分析する。調製物１．５この方法は、ＷＯ９６／４０９６４に開示されたものであり、脂質／核酸粒子
を高効率に調製する代替方法である。本質的には、それは、有機溶媒中で脂質−
治療用核酸粒子を調製する方法である。以下の脂質保存溶液を１００％エタノー
ル中で調製する：ＤＳＰＣ−２０mg／mL（２０mol ％）＝１２８．４μＬ；Ｃｈ
ｏｌ−２０mg／mL（２５mol ％）＝１１３．１μＬ；ＤＯＤＡＰ−４０mg／mL（
４５mol ％）＝４４．５μＬ；ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（ｏｒＣ１４）−５０mg
／mL（１０mol ％）＝６７．６μＬ。

【００７１】各脂質を互いに混合し、その容量を１００％エタノールで総容量０．４００mL
まで増やす。適量の３００μＭクエン酸塩緩衝液（pH３．３）をＤＮＡに加え、
最終容量６００μＬ及びpH３．８に合わす。それらの２つの溶液を２分間６５℃
に加温する。ＤＮＡのチューブをボルテックスで撹拌しながら、そのＤＮＡ溶液
に、パスツールピペットを用いて脂質（エタノール中）を滴下する。生じた溶液
は濁り、そして泡立つことがあるが、凝集物が存在することはないであろう。そ
の溶液を、予め浸漬した透析チューブ（１２〜１４，０００MWCO）に入れ、３０
０μＭクエン酸塩緩衝液（pH３．７〜４．０）に対して１時間透析する。その透
析チューブをＨＢＳ（pH７．５）の中に移し、そして１２時間透析する。ＨＢＳ
で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラム上でアニオン交換クロマトグラフィー
により、封入されなかったＤＮＡを取り除いた。必要ならば、Ａｍｉｃｏｎ系（
ＹＭ３０膜）により、最終調製物を濃縮することができる。ＤＮＡ濃度をＰｉｃ
ｏｇｒｅｅｎ検査により、そして脂質濃度をＨＰＬＣにより分析する。

【００７２】上記の全ての脂質−治療用核酸調製物は、本発明の方法での使用に適する様に
させる有益な特性を有する。この様な特性には、限定でなく、以下のものが含ま
れる：先ず、それらは、平均サイズが約５０〜約２００nm、より好ましくは約６
０〜約１３０nmである小粒子である。最も好ましくは、それらの粒子は比較的均
一なサイズであり、そして３未満、より好ましくは１未満、更に好ましくは０．
５未満の↑２値を有する。二番目に、それらは、血清に安定であり、従って血清
に接触させた後、又は遊離ＤＮＡを有意に分解するであろうヌクレアーゼ検査の
後に、有意に分解されることがない。三番目に、それらの核酸対脂質の比率を、
種々のレベルに調合することが可能である。本発明の方法で使用するために、そ
れらの粒子は、少くとも約３mg核酸／mmol脂質、より好ましくは少くとも約１４
mg／mmol脂質、そして最も好ましくは約２５mg超／mmol脂質である。本発明の脂
質−核酸粒子は、他の有利な特性、例えば非特異的毒性の低さ、生体内分布の向
上、治療効率、及び製造の簡便さ、を有する。血清安定性の検査前記の技術に従って調製した脂質／治療用核酸粒子の血清安定性を、種々の方
法で検査することができる。

【００７３】例えば、典型的なＤＮａｓｅＩ消化では、注目の当該粒子に封入された１μｇ
ＤＮＡを、総容量１００μＬの５mM ＨＥＰＥＳ，１５０mM ＮａＣｌ，１０
．０mM ＭｇＣｌ₂，pH７．４中でインキュベーションする。その試料を、１０
０又は１０ＵのＤＮａｓｅＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で処理する。コントロール
実験では、脂質調製物が直接当酵素を不活性化しないことを確認するために、１
．０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え得る。試料を３７℃で３０分間インキ
ュベーションした後、そのＤＮＡを、５００μＬのＤＮＡＺＯＬの添加、続いて
１．０mLのエタノールの添加により単離する。その試料を、卓上小型遠心機で１
５０００rpmで３０分間遠心する。上清を流し捨て、生じたＤＮＡペレットを８
０％エタノールで２回洗浄し、そして乾燥する。このＤＮＡを、ＴＥ緩衝液３０
μＬに再度懸濁する。この試料２０μＬを、ＴＡＥ緩衝液中で１．０％アガロー
スゲル電気泳動にかける。

【００７４】典型的な血清検査では、５０μｇの遊離のＤＮＡ、封入されたＤＮＡ、又は封
入されたＤＮＡ＋０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１．５mLエッペンドルフ
チューブに分注した。そのチューブに、４５μｌの標準的なマウス又はヒトの血
清、及びｄＨ₂Ｏ（最終容量を５０μｌに合すため）を加えた。そのチューブを
パラフィルムで密封し、そして３７℃でインキュベーションした。ヌクレアーゼ
消化しなかった（基準の）遊離ＤＮＡ、封入されたＤＮＡ又は封入されたＤＮＡ
＋０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の各試料を、エッペンドルフチューブ中で
液体窒素により凍結し、そして−２０℃で保存した。種々の時点で一定量を抜き
取り、その反応を止めるために、プロテイナーゼＫ（１３３μｇ／mL）を含有す
るＧＤＰ緩衝液に加え、即座に液体窒素により凍結した。全ての時点の試料を集
めてから、それらの試料を水槽中で５５℃でインキュベーションすることにより
、プロテイナーゼＫを活性化し、それにより残存しているエキソヌクレアーゼを
変性させた。プロテイナーゼＫで消化した試料をポリアクリルアミドゲルにかけ
、エキソヌクレアーゼによる分解レベルを評価した。

【００７５】前記処理の結果として、１００ＵのＤＮａｓｅＩの存在下ですら、５％未満の
、好ましくは検出不能レベルのＤＮＡ分解（部分又は全部）を示すことにより、
前記粒子の血清安定性が証明される。好ましくは、これが、前記処理により完全
に分解される遊離ＤＮＡ、及びＤＮＡが実質的（すなわち２０％超、しばしば８
０％）に分解されるプラスミド／脂質複合体（例えばＤＯＴＭＡ又はＤＯＤＡＣ
：ＤＯＰＥ複合体）と対比される。Ｂ．実施例２この実施例では、脂質に封入されたＨＳＶ−ＴＫがトランスフェクションされ
た皮下腫瘍に対する、脂質で調製されたガンシクロビルの治療効果の測定を説明
する。

【００７６】

【表１】

【００７７】ｐＩＮＥＸ−ＴＫ１０構成体は、“ハイパー”ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子と連結した
ＣＭＶプロモーター、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、及びカナマイシ
ン耐性遺伝子を含有するｐＢＲ３２２由来のプラスミドから成る。“ハイパー”
ＨＳＶ−ＴＫは、Black et al.，PNAS(USA)，93 : 3525-3529（1996）の開示通
り、より活性型のＨＳＶ−ＴＫ遺伝子である。使用した当プラスミド構成体を図
１４Ｂに示す。プラスミドＬ０１８は、ＣＭＶプロモーターに連結されたルシフ
ェラーゼリポーター遺伝子を含有する。

【００７８】０日目に、２４匹の雌のＣ５７マウス（Harlan Sprague Dawley，Inc.，India
napolis，IN）の皮下に、総容量５０μＬで１０００００個のＢ１６マウスメラ
ノーマ細胞（ＮＣＩカタログＢ１６ＢＬ−６）を移植する（群Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）
。皮膚用のカリパスを用いて腫瘍の長さ、幅及び高さを測定することにより、で
きるだけ早い時期に、それ以降毎日、腫瘍容積を定量する。群Ａ〜Ｄに、最初に
５日目の午前９時に、そしてそれ以降毎日、実施例１に従って調製した適当な脂
質プラスミド調製物により、２００μｇのプラスミドを投与する。そのプラスミ
ド調製物を、総量２００μＬのＰＢＳにより、尾の静脈内に注射する。群Ｂ及び
Ｄに、最初に５日目の午後３時に、そしてそれ以降毎日、実施例３に従って調製
した脂質ガンシクロビル調製物を投与する。０．５mgのガンシクロビル（〜２５
mg／kg）を、総量２００μＬのＰＢＳにより、尾の静脈内に注射する。２１日目
にマウスを殺し、腫瘍を回収し、そしてその重量を測定する。

【００７９】得られた結果から、群Ｄのマウスでは、腫瘍が発達しないか、あるいは、コン
トロール群Ｃのマウスに比べて有意により遅く腫瘍が発達したことが示される。Ｃ．実施例２Ａこの実施例では、ヒト（ＳＫＯＶ−３）腹腔内（ＩＰ）腫瘍を有するＳＣＩＤ
マウスに対する、脂質で調製されたガンシクロビルの全身供給の治療効果の測定
を説明する。

【００８０】

【表２】

【００８１】０日目に、２４匹の雌のＣ５７マウスが、総計５００μｌ（グループＡ，Ｂ，
Ｃ，Ｄ）における５，０００，０００ＳＫ−ＯＶ−３ヒト卵巣腺ガン細胞（ＡＴ
ＣＣＨＴＢ−７７）で腹膜内に接種される。グループＡ〜Ｄは、５日目の午前９
：００を始まりとして日に１度及びそれ以降毎日、例１に従い調製される、適当
な脂質で調製したプラスミドの２００μｇプラスミドによって処理される。前記
プラスミド調製物を、合計２００μｌのＰＢＳ中、尾の静脈におけるIVに注入す
る。処理は２週間続ける。

【００８２】グループＢ及びＤは、５日目の午後３：００を始まりとして日に１度及びそれ
以降毎日、例３に従い調製される、脂質で調製したガンシクロヴィル（ｇａｎｃ
ｉｃｌｏｖｉｒ）により処理される。０．５mgのガンシクロヴィル（〜２５mg／
kg）を合計２００μｌのＰＢＳ中、尾の静脈におけるIVに注入する。マウスは生存している間監視される。腫瘍が発育するならば、マウスは犠牲に
なり、そして前記ガンは回収及び検量される。

【００８３】得られた結果はグループＤのマウスのどれも腫瘍を発育させず、又はその代わ
りにコントロールのグループＣのマウスより、ガンが有意に遅く発育したことを
証明する。Ｄ．実施例３この実施例は、スフィンゴミエリン／コレステロール脂質調製物における脂質
で調製はガンシクロヴィルの調製のための実験計画案を例示する。１．必要な量よりもわずかに過剰な脂質の検量。１mL調製物のために、１００mg
（１８０μmole）の脂質を使用する。５５mol ％がスフィンゴミエリン（９９μ
mole）であり、そして４５mol ％がコレステロール（Northern Lipids，Vancouv
er，BC）である。各脂質を１mLのクロロホルム中に溶解する。５５／４５のスフ
ィンゴミエリン／コレステロール混合物を得るために、各脂質の必要な量を等分
する。２．¹⁴Ｃ−ＣＨＥ（¹⁴Ｃ−コレステリルヘキサデシルエーテル）の４５００dpm
／μmoleの脂質を加える。３．窒素下でほぼ乾燥するまで前記脂質を乾かす。４．一晩凍結乾燥機に適用する。５．エタノール／ＨＢＳ（ＨＢＳは２０mM Ｈｅｐｅｓ，１４５mM ＮａＣｌ，
pH７．４５である）の３０／７０％溶液作製。６．１mLの３０／７０％エタノール／ＨＢＳ中での１００mgガンシクロヴィル（
１０９mgガンシクロヴィル−Ｎａ，Hoffman LaRoche Ltd.）の溶解。よくボルテ
ックスする。４２００dpm／moleの³Ｈ−ＧＣＶ（７．５mlの１μCi／mLストッ
ク）を加える。７．前記脂質フィルムにガンシクロヴィル溶液を加え、よくボルテックスする。
前記溶液が均一になるまでボルテックスする。８．５周期の凍結解凍（液体窒素及び６５℃）。水浴に浸す前に、凍結容器をわ
ずかに温める。９．２〜１０μＬのあらかじめ押し出した試料を採収し、そして二重標識プログ
ラムを用いる放射活性のためのアッセイをする。最終容量に注意し、そして脂質
及びＧＣＶ、両方のための比活性を決定するためにこれを使用する。１０．３５０psiで、６５℃で、２×〜３×の１００nmフィルターに前記試料を
押し出す。１１．合計１０回押し出しを続ける。１２．押し出し後の試料を２〜１０μｌ採収し、そして放射活性をアッセイする
。１３．１５分間、ｄＨ₂Ｏ中での透析チューブ（分子量１２，０００〜１４，０
００をカットオフ）でいくつかを水和化。１４．前記チューブ内での、押し出し試料の押し込み、及び２ＬのＨＢＳに対す
る１時間の透析。１５．新しい緩衝液への交換及び一晩の透析。１６．２〜１０μＬの試料の採収及び放射活性のアッセイ。１７．押し出し前と透析後の³Ｈ／¹⁴Ｃを比較することによるパーセント荷重の
決定。例えば：押し出し前の³Ｈ／¹⁴Ｃ＝１２．０；透析後の³Ｈ／¹⁴Ｃ＝１．
２；１．２／１２．０×１００％＝１０％包入。Ｅ．実施例３Ａ実施例４及び４Ａにおける使用のための、ＨＳＶ−ＴＫによるＢ１６腫瘍細胞
の安定形質転換は、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ、第３版、９〜１３から９〜１５ページにおける記載、又は
以下の修飾を有するその記載の様に達成される。前記方法に従い、以下の材料を
使用した：プラスミド：ｐＣＭＶＴＫＩＲＥＳネオは、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−Ｔ
Ｋ遺伝子、リポソーム内侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎ
ｔｒｙｓｉｔｅ）及びネオマイシン耐性遺伝子を含む。Ｌ０１８は前記と同様
であるが、ＨＳＶ−ＴＫの位置にルシフェラーゼ遺伝子を有する。１．１０％のＦＢＳ及びグルタミンを加えた１０mlのＭＥＭ培地中で、５×１０
⁵細胞／フラスコで、組織培養フラスコ（Ｔ−７５）においてＢ１６マウス黒色
腫細胞を接腫し、そして３７℃のＣＯ₂インキュベーターにおいて、７０％コン
フルエントまで成育する。２．培地を吸引し、トランスフェクションの２時間前にフラスコ当たり、３．８
mlの新しい培地を細胞に与える。３．以下の様に取扱い説明書に従い、ポリスチレンチューブ中でプラスミド／脂
質リポフェクチン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）の集合体を調製する： −滅菌蒸留水中での２０μｇ／mlへのプラスミドの希釈。

【００８４】 −ゲネタイシン（Ｇ４１８）における選別のためのコントロールとしてのルシ
フェラーゼがＬ１０８の使用、ＴＫネオ安定細胞のためのチミジンキナーゼ（ネ
オマイシン）２０Ａの使用。 −滅菌蒸留水中での脂質の１mMへの希釈。 −滅菌蒸留水中での電荷化１への脂質の希釈（１．２ml脂質／８ml水） −ボルテックスする間、滴下による脂質（ＣＲ１）の量に等しいＤＮＡの量（
２０mg／ml）の添加。

【００８５】 −室温での３０分間のＤＮＡ／脂質複合体のインキュベート。４．１．２mlのＤＮＡ／脂質複合体をＴ７５フラスコにゆっくり加え、おだやか
に混合し、そして３７℃のＣＯ₂インキュベーター中で２４時間インキュベート
する（複合体は培地中で１：４に希釈される）。５．培地を吸引し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、そして各Ｔ７５フラスコを２〜１０
０×２０mm組織培養ディッシュに分ける。６．ディッシュへのプレティングの２４時間後、非トランスフェクション細胞を
殺し、一方トランスフェクションしたＴＫネオを有する細胞を生存させておく、
適当な濃度で、選択剤、ゲネタイシン（Ｇ４１８）を加える。ルシフェラーゼコ
ントロール細胞は死ぬはずである。７．２〜３日ごとに、死細胞の残骸を除去するために培地を交換する。８．１０日以内に、クローンは１００mmディッシュの底で見えるようになり、こ
れはネオマイシン耐性及びＴＫポジティブである。９．２４穴プレート中の１ml培養液へクローンを投入し、Ｔ−７５フラスコに広
げる。１０．次に、安定にＴＫを発現する細胞を、マウスへの局所的、域的又は全身系
の注射のために使用することができる。１１．ＴＫ発現が同定されるクローンをスクリーニングするために： −１５０ml容量の９６穴プレートにおいて２０００細胞／穴でまき、そして３
７℃のＣＯ₂インキュベーターにおいて４８時間生育する。

【００８６】 −２．５倍濃度で作製したプレートを通す連続希釈物中で、ＴＫ、ガンシクロ
ヴィルにとって特異的なプロドラッグを加え、そして１００mL／穴加える（１５
０mL容量に加える）。 −３７℃のＣＯ₂インキュベーター中で３日間インキュベート。 −穴から培地を吸引し、そして取扱い説明書通りにアラマーブルー（Ａｌａｍ
ａｒＢｌｕｅ）（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を加え
る（培地中で１：１０希釈）。

【００８７】 −１００μｌ／穴及び１，２，４時間のインキュベート、そして蛍光プレート
リーダー上で、時間間隔ごとにプレートを読む（５５０，５９５nm；７５０Ｖ；
７０オフセット；１００msの統合時間）。Ｆ．実施例４この実施例は、ＨＳＶ−ＴＫで安定にトランスフェクションしたＢ１６皮内腫
瘍を有するマウスにおける腫瘍の生育に対する、組織由来脂質調製ガンシクロヴ
ィルの効果を例示する。

【００８８】

【表３】

【００８９】３２匹の雌のＣ５７マウス（Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis）
が、０日目に合計５０μｌのリン酸緩衝塩溶液中の１５０，０００細胞の投与量
で、安定にトランスフェクションし、そしてＨＳＶ−ＴＫを発現するＢ１６腫瘍
細胞（Ｂ１６ＴＫ）（以前の実施例において調製）で皮内により接腫された。可
能な限り素速く、そして毎日その後に、皮膚がパスを用いて、前記腫瘍の長さ、
幅及び高さを計測することによって、日ごとに皮内の腫瘍体積を決定した。

【００９０】前記マウスは、ガンシクロヴィルプロドラッグ、例３において調製した脂質を
用いて、４日目を始まりとして２日に１回及びそれ以後２日ごとに扱った。０．
５mg（〜２５mg／kg）のガンシクロヴィル投与量を、合計２００μｌのＰＢＳ（
リン酸緩衝塩溶液）中で、IVで注射された。マウスは合計９つの処理を受けた。
２１日目、マウスは犠牲になった。腫瘍は、切片化のための固定の前に回収及び
検量がされた。

【００９１】脂質で調製したガンシクロヴィルによる全身処理をしたとき、ＨＳＶ−ＴＫに
より安定にトランスフェクションされた皮内腫瘍は計測不可能な生育を示した。
未処理のＢ１６腫瘍、及び処理した、ＴＫ無しのＢ１６腫瘍は、前記薬剤によっ
て影響されなかった。Ｇ．実施例４ＡＨＳＶ−ＴＫで安定にトランスフェクションされ、そして静脈から植え付けら
れるＢ１６腫瘍細胞における、ＴＫ遺伝子発現に対する脂質で調製されたガンシ
クロヴィルの効果を決定するために、この研究を行った。

【００９２】

【表４】

【００９３】１６匹の雌のＣ５７マウスは、０日目に合計２００μＬのリン酸緩衝塩溶液中
、１５０，０００細胞の投与量で、尾の静脈注射によって、ＨＳＶ−ＴＫを安定
に発現するＢ１６腫瘍細胞で接腫された。２日目を始まりとして毎日１回、及び
それ以後２日間、ガンシクロヴィルプロドラッグ、実施例３において調製した脂
質によって前記のマウスは処理された。０．５mg（〜２５mg／kg）のガンシクロ
ヴィル投与量が、合計２００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）中で、IVから注
入された。マウスは合計３つの処理を受けた。２１日目、マウスは犠牲となり、
そして腫瘍を計測した。肝臓、肺、脾臓及び膵臓を写真に収めた。

【００９４】脂質−ガンシクロヴィル調製物で処理したマウスの転移腫瘍集合体は、未処理
のマウスのものより有意に小さかった。Ｈ．実施例５この実施例は、ＩＮＥＸ３０３脂質プラスミド粒子を用いて、末端の転移腫瘍
における遺伝子発現を例示する。

【００９５】０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６匹のマウス（Harlan Sprague Dawley，Inc.，India
napolis，IN）は、合計２００μＬでの静脈／尾の静脈注射によって、３００，
０００LL／２（Mouse Lewis Lung Carcinoma）細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６４
２）を接腫される。１０日目に、前記マウスは、実施例１に従い調製したＺＮＥ
Ｘ３０３プラスミド−脂質粒子を、静脈注射される。前記粒子は、ＣＭＶプロモ
ーターに連結したルシフェラーゼ遺伝子を含む標準的なコンストラクトである、
プラスミドＬ０１８を有する。プラスミド注射後の様々な時間点で、マウスが犠
牲となり、そして器官及び腫瘍が素速く液体窒素中で凍り、−７０℃で保存され
る。器官／腫瘍は、前記の器官／腫瘍部位への輸送を証明するために、ルシフェ
ラーゼ遺伝子でアッセイされる。器官用の生物学的分布結果を、図２において示
す。腫瘍部位での滞積を図３において例示する。サザンブロットのデータは、少
なくとも９６時間まで増やした場合の腫瘍部位での、完全なプラスミドの存在を
示す。器官／腫瘍由来の細胞タンパク質もまた調製され、そして標準的な技術に
従うルシフェラーゼのためのアッセイが行われる。末端（転移）腫瘍部位での遺
伝子生成物活性のタイムコースを図４において示す。Ｉ．実施例６この実施例は、ｉｎｖｉｖｏヒト腫瘍における、全身系のベクター輸送及び
遺伝子発現を例示する。

【００９６】ＳＣＩＤマウス（Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN）が、０
日目に皮下注射によって１×１０⁶のＬＳ１８０ヒト結腸腺ガン細胞（ＡＴＣＣ
ＣＬ−１８７）を接腫される。１１日目に、グループＡ，Ｂ及びＣのマウスが
合計２００μＬ容量で、実施例１に従い調製される、脂質調製物ＩＮＥＸ３０３
中のＬ０１８プラスミドの指示した投与量を、静脈注射される。１７日目に、グ
ループＤ及びＥのマウスが、合計２００μＬの容量で、実施例１に従うＣ８又は
Ｃ２０ＰＥＧ−Ｃｅｒを用いて、脂質調製物ＩＮＥＸ３２０中のＬ０１８プラス
ミドを静脈注射される。プラスミド注射後の指示した時間において、マウスが犠
牲になり、そして器官（肝臓、脾臓及び肺）及び腫瘍が採収される。酵素ルシフ
ェラーゼの発現は、全てのサンプルについて、標準的な技術に従いアッセイされ
る。

【００９７】得られたデータは、本発明の脂質−核酸粒子を用いて、ｉｎｖｉｖｏヒト腫
瘍において達成されるレポータールシフェラーゼの過剰なトランスフェクション
及び発現を示す（図５参照）。

【００９８】

【表５】

【００９９】Ｊ．実施例７この実施例は、実施例１に従い調製した脂質−核酸粒子を用いる、ＨＳＶ−Ｔ
Ｋ遺伝子を含むベクターのｉｎｖｉｖｏ腫瘍部位での全身系輸送及び発現を示
す。０日目に合計２００μＬＰＢＳの容量で、Ｃ５７マウスは１００，０００の
Ｂ１６腫瘍細胞を腹膜から接腫される。１４日目に、試験マウスが実施例１に従
い調製されるＩＮＥＸ３５１プラスミド調製物（１００μｇＤＮＡ／５００μ
ＬＰＢＳ）を注射される。使用するプラスミドベクターは前述のｐＣＭＶＴ
ＫＩＲＥＳネオである。２４時間後、マウスは犠牲となり、そして腫瘍が単離さ
れ、５分以内で固定化され、そして標準的な技術を用いるパラフィン切断が調製
される。末端の腫瘍部位でのＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の発現は、当業界で標準的な技
術を用いるｉｎｓｉｔｕＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションによってア
ッセイされる。その様な技術の１つを以下に要約する。

【０１００】腹膜の腫瘍内のＨＳＶ−ＴＫ遺伝子発現のパターンを図６に示す。遺伝子発現
の全ての場合において、Ｂ１６細胞又は内皮細胞の細胞含量としてポジティブな
シグナルが認められる。ポジティブに染色される細胞は、血管又は末梢領域と関
連する増殖的な区域に局在する。全身系輸送されるプラスミドによってトランスフェクションされるｉｎｖｉｖ
ｏの腫瘍のＲＮＡ／ＲＮＡｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための
実験計画腫瘍は、パラフィンで取り込みそして染めることによって、ｉｎｓｉｔｕで
の調査のために調製される。特に、腹膜の腫瘍は４％パラホルムアルデヒド／Ｐ
ＢＳ固定液（Sigma Chemical Co.）中に集められ、そして４℃で一晩固定される
。前記試料を特級エタノール中で脱水し、クロロホルムを除き、そしてパラフィ
ンロウ（ＰａｒａｐｌａｓｔＰｌｕｓ，Ｆｉｓｈｅｒ）に取り込まれた後、連
続的な５μｍの切片が調製される。

【０１０１】直ちに使用する場合、調製した試料は１０分間２回のキシレン交換処理がなさ
れ、それぞれ特級エタノール溶液において、５０％エタノールに水化される。試
料は標準的なすすぎ、０．２５％（ｖ／ｖ）の無水酢酸を含む、pH８．０の０．
１Ｍトリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液でのインキュベーションによってプ
レハイブリダイゼーションされ、続いて４０％の脱イオン化ホルムアミド、１０
％デキストラン硫酸、１×デンハルト溶液（０．０２％フィコール、０．０２％
ポリビニルピロリドン、１０mg／ml ＲＮアーゼ無しの牛血清アルブミン）４×
ＳＳＣ，１０mM ＤＴＴ，１mg／ml酵母ｔ−ＲＮＡ、及び１mg／mlの変性し、そ
して短かくなったサケの精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、
５６℃で少なくとも６０分間処理される。

【０１０２】ＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ転写によるＲＮＡプローブの標識は、以下の様に行
われた。ＨＳＶ−ＴＫ（ｐＴＫ１０）由来の５９９bp（５３２〜１１３１）のフ
ラグメントは、ベクターｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（ｐＴＫ１１）のＫｐｎＩ及び
ＢａｍＨＩ部位にクローン化された。前記プラスミドは標準的な技術によってク
ローン化され、そしてＱｉａｇｅｎｅ５００（Qiagen，Inc.）を用いて調製さ
れる。アンチセンスのプローブのために、このプラスミドは、ｃＤＮＡＨＳＶ
−ＴＫの元々の５′末端のＫｐｎＩでそれを切断することによって直鎖化され、
そして精製される。センス（コントロール）のプローブのために、同一の論理を
使用する（すなわち、ＢｓｓＨII又はＢａｍＨ又はＳａｃＩによってインサート
の３′末端側で切断する）。前記プラスミドはエタノール沈澱によって精製され
る。次に、以下のものは氷上の１．５mLの滅菌ＲＮアーゼ無しのマイクロ遠心チ
ューブ内で混合される：４μＬ（４μｇ）精製し、直鎖化したプラスミドＤＮＡ
，５μＬの１０倍濃縮したＤＩＧＲＮＡ標識混合液、１０μＬの５倍濃縮した
転写緩衝液（４００mMトリス塩酸（pH８．０，２０℃）、６０mM ＭｇＣｌ₂，
１００mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）２０mMスペルジミン）、２μＬのＲＮア
ジン、３μＬのＲＮＡポリメラーゼ（アンチセンス用ＳＰ６又はセンス用のＴ７
）、及び合計の反応容量を５０μＬにするための、滅菌し、再蒸留した水。

【０１０３】前記成分を混合し、そして簡単に遠心し、そして次に３７℃で（Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼ用）又は４０℃で（ＳＰ６ポリメラーゼ用）、２時間インキュベー
トする。注意：より長いインキュベーションは、標識されるＤＮＡの収率を増大
しない。より大量のＲＮＡを調製するために反応成分を大規模にする。インキュ
ベーション後、３μＬのＤＮＡアーゼＩ、ＲＮアーゼ無し及び１μＬのＲＮアジ
ンを前記チューブに加え、そして３７℃で１５分間インキュベートする。次に多
量化反応を停止するために、２．５μＬの０．５ＭＥＤＴＡを加える。

【０１０４】標識されるＲＮＡ転写物は、以下の段階を行うことによって沈澱する：前記反
応チューブに６．２５μＬの４ＭＬｉＣｌ及び１８０μＬのあらかじめ冷やし
た（−２０℃）の１００％エタノールを加え、−７０℃で一晩インキュベートす
る。４℃で１５分間、前記遠心チューブを遠心する（１３，０００×ｇ）。上清
を捨てる。沈澱を５０μＬの氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄する。４℃
で５分間、前記チューブを遠心する（１３，０００×ｇ）。上清を捨て、そして
沈澱を室温で乾燥させる。前記ＲＮＡ沈澱を、３７℃又は（室温）で３０分間、
２０μＬのＤＥＰＥＣ（ジエチルピロカルボネート）処理し、滅菌し、再蒸留し
た水に溶解し、そして２０μＬの脱イオン水ホルムアミド及び１μＬのＲＮアジ
ンを加える。−２０℃又は−７０℃で転写を維持する。

【０１０５】標識反応において得られるＤＩＧ−標識ＲＮＡの正確な定量は、様々な膜又は
ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術における、最適な及び再現性のある
結果のために最も重要である。ハイブリダイゼーション混合液における、高過ぎ
るプローブ濃度は、通常バックグラウンドを引き起こし、一方、低過ぎる濃度は
弱いシグナルとなる。収率の評価は、標識キットにおいて提供されるＤＩＧ標識
されたコントロールと、ＤＩＧ標識した試料核酸との平行比較によって行うこと
ができる。両者の希釈連級物が調製され、そして１枚の膜上に点を打つ。次に、
前記の膜は比色分析的に検出される。試料及びコントロールの強度の直接的な比
較は、標識の収率の評価を与える。

【０１０６】次にハイブリダイゼーション反応が行われる。プレハイブリダイゼーションさ
れたスライドからプレハイブリダイゼーション緩衝液を排出し、そして０．２〜
１ngのジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブを含む２００μＬのハイブリダイ
ゼーション緩衝液（０．２ng／Ｌ）で各部分を塗った。２４×３０mmの疎水性の
プラスチックカバースリップで試料を覆う。給湿室で５６℃で一晩切片をインキ
ュベートする。洗浄はバックグラウンドを減少するが、同様にシグナルを減らす
ＲＮアーゼを含むかもしれない。洗浄の間ずっと、組織切片を湿らせておくこと
は重要である。

【０１０７】２×ＳＳＣ中、５５℃で３０分間スライドを洗浄。５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中、６５℃で３０分間洗浄。２×ＳＳＣ中、３回３７℃で５分それぞれ洗浄。ＲＮアーゼ１０μｇ／ml洗浄溶液中、３７℃で３０分間洗浄。５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中、６５℃で３０分間洗浄。

【０１０８】２×ＳＳＣ中、３７℃で１５分間洗浄。０．２×ＳＳＣ中５回、３７℃で５分間それぞれ洗浄。ハイブリダイゼーション後、細胞をＤＩＧ−特異的抗体とインキュベートする
。ＴＢＳ中、室温で３０分間スライドを洗浄。ブロッキング溶液（ＴＢＳ及び２
％羊血清）を用い、室温で１時間切片をインキュベートする。ブロッキング溶液
をデカントし、そして羊抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ（Ｆａｂフラグメント
）希釈液１：５００を用い、室温で１時間切片をインキュベートする。ＴＢＳ中
、室温で３０分間、スライドを洗浄する。

【０１０９】基質緩衝液（１００mMトリス塩酸（pH９．５）、１００mM ＮａＣｌ，５０mM
ＭｇＣｌ₂）中、室温で３０分間スライドを洗浄する。１０mLの基質緩衝液、５０μＬＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）及び
３７μＬＢＣＩＰを含む、色素溶液を調製する。室温で１〜２時間又は４℃で
２〜３日間、スライドは色素溶液中に浸される。スライドを水で洗浄し、そして
光学顕微鏡で観察する。結果を図６に示す。Ｋ．実施例８本実施例は、本発明の方法を使用した腫瘍の処理について記載する。特に、本
実施例は、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）による処置後のＭＣＡ−
２０７腫瘍の増殖の抑制における配合１．１（Ｆｏｒｍｕｌｅｔｉｏｎ１．１
）におけるｐＩＮＥＸ−ＴＫ１０の効果を示す。一般的方法を図７Ａと７Ｂに示
す。

【０１１０】

【表６】

【０１１１】２４匹の雌Ｃ５７マウスに、０日目に皮膚内注射により（S．Rosenberg，Nati
onal Center Institule，Frederick/Bethesda，MDにより提供された）１００，
０００のＭＣＡ−２０７線維肉腫腫瘍細胞を接種した。この腫瘍細胞は、１０％
胎児子ウシ血清を含むＲＰＭＩ培地を使用した標準的な技術に従って培養され、
そして調製されていた（例えば、Carrent Protocols in Molecular Biologyを参
照のこと）。５日目から、全ての動物を、上記表（前掲）中に列記した脂質／治
療用核酸配合品により処置した。配合品を、尾静脈を介して脈管内にデリバリー
した。８０μｇのｐＩＮＥＸ−ＴＫ１０ＤＮＡを、２００μＬの合計容量にお
いて注射した。処置を、５，７，９，１１、及び１３日目に行った。

【０１１２】５日目から、全ての動物を、１日に２回ガンシクロビルで処置した。１mg（〜
５０mg／kg）を、２００μＬＰＢＳの合計容量において腹腔内注射した。処置
は、毎日２回、１２日間続いた（図７Ａと７Ｂを参照のこと）。マウスを腫瘍の
成長についてモニターした。図８Ａは、より定量的に、上記処置の効果を示す。配合１．１におけるＨＳＶ
−ＴＫにより処置されたマウスは、対照処置マウスに比較して、大きく減少され
た腫瘍をもつ。空リポソームとガンシクロビルによる処置が腫瘍減少効果を全く
もっていないということを示す対照マウスのデータは、示されていない。図８Ｂ
は、腫瘍接種後１６日目の対照マウスに比較したテスト・マウスについての上記
処置の効果を示す。Ｌ．実施例９１．材料スフィンゴミエリンとコレステロールを、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｐｉｄｓ（
Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）から得た。¹⁴Ｃ−コレステリール・ヘキサデシル・
エーテル（¹⁴Ｃ−ＣＨＥ）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏ
Ｎ）から購入した。エタノール、クロロホルム、メタノール、Ｎ−（２−ヒドロ
キシエチル）ピペラジンＮ′−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、過酸
化水素、及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を、ＶＷＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（
Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から得た。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ
）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ソルバブル（商標
）（Ｓｏｌｖａｂｌｅ（登録商標））及びピコフルオル（商標）（Ｐｉｃｏｆｌ
ｕｏｒ（登録商標））シンチレーション液は、ＣａｎｂｅｒｒａＰａｃｋａｒ
ｄＣａｎａｄａ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）により提供された。ガンシ
クロビル（ＧＣＶ）を、ＨｏｆｆｍａｎＬａＲｏｃｈｅＬｔｄ．（Ｍｉｓ
ｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から得た。³Ｈ−ＧＣＶを、ＮｏｒａｖｅｋＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂｒｅａ，ＣＡ）から購入した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス
を、ＨａｒｌａｎｄＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ，ＩＮ）から得た。Ｂ１６セルラインを、ＮＣＩ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ）から得た。Ｂ１６ＴＫ細胞は、標準的な方法に従ってＩｎｅｘに
おいて生産された（前実施例を参照のこと）。

【０１１３】２．ＧＣＶ−ＴＣＳの調製大きな単層小疱を、Hope，et al.，Biochim．Biophys．Acta 812 : 55-65（19
85）の方法に従って調製した。５５モル％のスフィンゴミエリン及び４５モル％
のコレステロールを、一滴のメタノールと約０．０３５μCiの¹⁴Ｃ−ＣＨＥを含
むクロロホルムに溶解した。脂質を窒素気流下で乾燥させ、そして得られた脂質
フィルムを次に少なくとも３時間高真空下に置いた。³Ｈ−ＧＣＶを含むガンシ
クロビルの溶液を、サンプル・サイズに従って、５０又は１００mg／mLに、３０
％エタノール、７０％ＨＢＳ（２０mM Ｈｅｐｅｓ，１４５mM ＮａＣｌ pH７
．４５）中で調製した。脂質対ＧＣＶ重量比は、開始時、１対１であった。上記
ＧＣＶ溶液を上記脂質フィルムに添加した。この脂質−ＧＣＶ溶液を５分間で６
５℃に加熱し、そして均質溶液を得るために十分にボルテックスした。得られた
溶液を、６５℃に加熱した押出し装置（ＬｉｐｅｘＢｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ
）を使用した１００nmフィルターを通したエクストルージョンの前に５回の凍結
−解凍サイクルに供した。追加の１mLのバッファーを、上記エクストルージョン
の第３パスの後に上記溶液に添加した。一旦、押出しされると、上記配合品を、
１時間の透析の後に、１回のバッファー交換をもって一夜ＨＢＳに対して透析し
た。上記配合品を準弾性光散乱（ｑｕａｓｉｅｌａｓｔｉｃｌｉｇｈｔｓｃ
ａｔｔｅｒｉｎｇ（ＱＥＬＳ））粒子サイズ測定装置（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）
を使用してサイズ測定した。脂質濃度を、¹⁴Ｃ−ＣＨＥラベルのシンチレーショ
ン計数により測定した。ＧＣＶ濃度を、³Ｈ−ＧＣＶの計数及びＢｌｉｇｈＤ
ｙｅｒアッセイにより測定した。

【０１１４】３．方法時間点毎に４匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群に、１５０，０００のＢ１６腫
瘍細胞を皮下注射した。腫瘍を１４日間成長させ、その時点で、遊離ＧＣＶ又は
リポソームＧＣＶの単一静脈内投与を、側方尾静脈を介して行った。合計２００
μＬにおいて与えられた上記投与は、約５．６mg（１０μモル）の脂質と０．５
mg（１．９６μモル）のＧＣＶを含み、それぞれ、３００mg／kgと２５mg／kgの
脂質とＧＣＶ投与量をもたらした。脂質とＧＣＶの循環レベルを、リポソームＧ
ＣＶ群について、１５分、１、８、２４、及び４８時間目に測定した。ＧＣＶの
レベルを、遊離ＧＣＶ群について、１５分、及び１時間目に測定した。各時間点
において、ケタミン／キシラジン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ／ｘｙｌａｚｉｎｅ）で動
物を麻酔し、血液を、心穿刺を介して集めた。血液を、ＥＤＴＡコートされたマ
イクロティナー（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒｓ）に入れ、そして血液細胞をペレッ
ト化し、そして血漿を得るために１０分間５００ｇで遠心分離した。血漿中の脂
質とＧＣＶレベルを測定した。脂質とＧＣＶを、¹⁴Ｃ−ＣＨＥと³Ｈ−ＧＣＶの
計数により計測した。１００又は２００μＬアリコートの血漿を、Ｂｅｃｋｍａ
ｎＬＳ３８０１シンチレーション、カウンター上で計測した。

【０１１５】４．結果ａ．Ｂ１６腫瘍形成マウスにおけるＧＣＶ−ＴＣＳの薬理動態本実施例は、遊離ガンシクロビルとリポソーム・ガンシクロビルの血漿クリア
ランス速度（ｐｌａｓｍａｃｌｅａｒａｎｃｅｒａｔｅｓ）を示す。脂質と
ＧＣＶのレベルを、¹⁴Ｃ−ＣＨＥと³Ｈ−ＧＣＶラベルをトレースすることによ
り上記血漿中でモニターした。遊離ＧＣＶとリポソームＧＣＶの薬理動態特性の
直接比較を、１５分目と１時間目に行った。図９は、リポソーム封入が、遊離薬
に比較して高められた循環寿命をもたらす、ＧＣＶの高められた薬理動態を与え
ることを示す。投与１時間後の血清薬物レベルにおける１００倍の上昇が見られ
た。１時間後、遊離ＧＣＶのたった０．４％が残ったのに比べて、リポソームＧ
ＣＶの注射された投与量の４１％が、循環中に残った。リポソームＧＣＶで処置
された動物は、４８時間後においてさえ循環中かなりの量の薬物（注射された投
与量の１．５％）をもっていた。

【０１１６】ｂ．ＧＣＶ放出のインビボ動態静脈内投与後の脂質−配合ＧＣＶの生物学的利用能を、尾静脈注射後の各時点
における血漿中の脂質レベルとガンシクロビル・レベルを比較することにより測
定した。得られた血漿中の薬物対脂質比を測定した。インビボにおける薬物対脂
質比における低下は、ＧＣＶの一部がもはや上記リポソーム配合品と会合してい
ないということを示している。この遊離ＧＣＶは、循環から速やかに除去される
。図１０に示す相対パーセント回収（ｒｅｌａｔｉｖｅｐｅｒｃｅｎｔｒｅ
ｃｏｖｅｒｙ）における減少は、段階的なインビボにおける薬物の放出を示唆す
る。Ｍ．実施例１０本実施例は、体内分布試験を示す。

【０１１７】１．方法体内分布データを、上記薬理動態試験で使用したマウスから集めた。心穿刺後
、マウスを、頸部切断により殺生した。各動物から組織を収穫し、そして計量し
た。Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジェナイザー（肝）又はＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商
標）装置のいずれかによる均質化の前に各臓器に添加した。組織を、５０℃で３
〜１６時間、Ｓｏｌｖａｂｌｅ中で可溶化した。次にサンプルを、それぞれ、Ｅ
ＤＴＡと過酸化水素による消泡と脱色の前に室温まで冷却した。ピコフルオルシ
ンチレーション（Ｐｉｃｏｆｌｕｏｒｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ）液を、シン
チレーション・カウンター上での計数の前に上記サンプルに添加した。

【０１１８】２．結果ａ．Ｂ１６腫瘍形成マウスにおけるＧＣＶ−ＴＣＳの体内分布腫瘍担持マウスを、遊離ＧＣＶ又はリポソームＧＣＶで処置した。肝臓、肺、
脾臓、及び腎臓を、脂質とガンシクロビル含量について分析した。多くの薬物の
ための主要な除去経路は肝臓である。図１１Ａ，Ｂ，Ｃ、及びＤは、遊離ガンシ
クロビルが、１５分の時間点において腎臓中に見られた、少量、全注射投与量の
３．５±１．８％を除き、アッセイされた臓器の全てから本質的に非存在であっ
たということを示している。この発現は、静脈内投与されたガンシクロビルが尿
中で速やかに除去されるということを発見したヒトにおける先の研究と一貫して
いる。Paul，et al.，J．Am．Med．Sci.，304 : 272-277(1992)、及びMarkham，
et al.，Drugs，48(3) : 455-484（1994）を参照のこと。このために、遊離Ｇ
ＣＶ体内分布データを、１時間を超えては採集しなかった。同様の量の遊離ＧＣ
Ｖ、開始注射投与量の３．１±０．１％が、投与１５分後に肝臓中に存在したが
、これは、この臓器の大きなサイズによるかなり低い相対投与量を提示している
。

【０１１９】リポソームＧＣＶの体内分布は、遊離薬物の体内分布とはかなり異なる。リポ
ソーム配合品は、網内皮系（ＲＥＳ）の臓器、脾臓及び肝臓による循環から典型
的に除去される。Lim．et al.，J．Pharmacol．Exp．Ther.，281(1) : 566-573
(1997)，Gregoridis，et al.，Drugs，45(1) : 15-28（1993）及びCullis，e
t al.,“Liposomes as Pharmaceuticals，”Liposomes(Ostro，M．Ced.)，Marc
el Dekker : New York，pp．39-72(1987)）を参照のこと。図１１Ａは、時間に
わたる肝臓中のリポソームＧＣＶ蓄積における有意な増加、投与４８時間後の全
注射投与量の１３．６±３．１％の最大蓄積を示す。また、肝臓は、初期の時間
点において同様の量の脂質を蓄積した。しかしながら、２４と４８時間目には、
脂質投与量のかなり大きなパーセンテージが肝臓中に蓄積している。これは、空
リポソーム粒子の蓄積又はリポプロテインの形態における同時取り込みを伴う脂
質成分のリモデリンブを示しているのかもしれない。

【０１２０】脾臓におけるリポソームＧＣＶの取り込みの動態は、肝臓における状況とはか
なり異なる。図１１Ｂは、１時間目における全注射リポソームＧＣＶ投与量の８
．５±４．８％と同様の量を脾臓が速やかに蓄積していることを示している。こ
の時間点において、遊離薬物のたった０．０４±０．０２％が脾臓内に残存して
いる。この動態における差異は、たぶん、マクロファージの帰巣（ｈｏｍｉｎｇ
）によるリポソームの取り込み及び再指示（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）を含む、
力学的な差異を示唆する。リポソームＧＣＶの静脈内投与は、１〜４８時間持続
する腎臓（図１１Ｄ参照）及び肺（図１１Ｃ参照）内でＧＣＶの最小の蓄積をも
たらした。この腎臓内でのＧＣＶの維持は、それが生物学的に利用可能となると
きの、血液からのＧＣＶの速いクリアランスを反映している。全時間経過にわた
る遊離ＧＣＶ又はリポソームＧＣＶの最小蓄積（全注射投与量の０．３５％未満
）が、肺において観察された。このサイズのリポソーム（１００nm）は、典型的
には、肺内に蓄積しない。

【０１２１】簡単に言えば、遊離ＧＣＶは腎臓中にかなりの程度蓄積し、一方、リポソーム
ＧＣＶは、脾臓及び肝臓中に蓄積した。ｂ．ＧＣＶ−ＴＣＳの腫瘍蓄積腫瘍担持マウスを、２５mg／kgの遊離ＧＣＶ又はリポソームＧＣＶで静脈内処
置した。脂質とＧＣＶを、¹⁴Ｃ−ＣＨＥと³Ｈ−ＧＣＶラベルを使用して定量し
た。図１２は、腫瘍中の遊離ＧＣＶと封入ＧＣＶの両者の蓄積が初期の時間点に
おいて類似しているが、封入されたＧＣＶが、病変部位において生物学的利用能
を高めているということを示している。遊離ガンシクロビルは、腫瘍から速やか
に除去される。１時間目において検出された腫瘍１ｇ当り、全注射投与量のほん
の１．１±０．１％であった。リポソーム配合品は、実験の経過にわたる腫瘍中
のＧＣＶの維持をもたらす。処置後４８時間目にも、腫瘍組織１ｇ当り、全注射
投与量の３．９±０．５％が未だ存在している。腫瘍における高い薬物対脂質比
は、もはや脂質と会合していないＧＣＶのいくらかが、そこに蓄積していること
を示唆する。ＧＣＶの作用機構は、ＤＮＡポリメラーゼの阻害及び鎖停止を介し
たＤＮＡ合成の終結を含む（Paul，et al.，J．Am．Med．Sci.，304 : 272-277
(1992)，Markham，et al.，Drugs，48(3) : 455-484（1994）及びOja，et al.,
BBA，1281 : 31-37（1996）を参照のこと）。遊離ＧＣＶが蓄積している短い時
間期間の間のＤＮＡ合成を全ての腫瘍細胞が経験することは期待できないので、
かつ、ＧＣＶ、ＧＣＶ−ＭＰ、及びＧＣＶ−ＴＰの細胞内安定性はよく理解され
ていないので、長期間の、連続したＧＣＶ暴露に関係するかなりの利益が存在す
ると信じられている。かなり重要なことであるが、本明細書中に記載するリポソ
ーム配合品は、遊離に比較して病変部位において高められた生物学的利用能をも
っている。Ｎ．実施例１１本実施例は、効能試験を示す。

【０１２２】１．方法４又は５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群に、ＨＳＶ−ＴＫにより安定してト
ランスフェクトされたＢ１６細胞を皮膚内注射した。一旦、腫瘍が計測されるこ
とができたとき（５日目）、上記マウスに、リポソームＧＣＶを静脈内注射した
（２５mg／kg ＧＣＶ）。６回の注射について１日おきに注射を続けた。腫瘍計
測は、典型的には、１日おきに行った。

【０１２３】２．結果ａ．Ｂ１６ＴＫモデルにおけるＧＣＶ−ＴＣＳのインビボにおける効能脂質配合ガンシクロビルがその生物学的活性を保持しているからテストするた
めに、インビボにおける効能試験を行った。マウスに、ＨＳＶ−ＴＫにより安定
してトランスフェクトされたＢ１６メラノーマ細胞を接種した。図１３は、リポ
ソームＧＣＶによるマウスの処置が、Ｂ１６−ＴＫメラノーマの成長をかなり阻
害することを示している。１８日目における計測は、対照ＨＢＳ−処置マウスに
おける腫瘍が、上記処置群における腫瘍よりも５倍大きかったことを示した。こ
れらの結果は、上記配合プロセスが、ＧＣＶの構造的完全性を傷つけていなかっ
たということを確信させ、そして上記薬物の生物学的利用能の追加の証拠を提供
している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/16 Ａ６１Ｋ 47/16 47/24 47/24 47/42 47/42 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号６０／１０１，４２９ (32)優先日平成10年９月22日(1998．9．22) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／１１２，３８４ (32)優先日平成10年12月14日(1998．12．14) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／２４３，１０４ (32)優先日平成11年２月２日(1999．2．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者グラハム，ロジャーダブリュ．カナダ国，ブリティッシュコロンビアブイ６ケー１ゼット１，バンクーバー，ウエストセブンスアベニュ 2638 (72)発明者バコウスキー，スーザンエス．カナダ国，ブリティッシュコロンビアブイ６ケー４ジー６，バンクーバー，トルッチストリート 1996，アパートメント 101 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 BA26 CA02 CA09 DA02 DA03 EA04 FA02 GA13 HA17 4C076 AA19 BB11 BB13 CC03 CC26 CC35 CC41 CC42 DD37 DD52 FF15 FF16 GG46 4C084 AA13 AA17 AA19 AA20 DC22 MA22 MA24 MA66 NA05 NA10 NA13 NA14 NA15 ZB211 ZB212 ZB262 ZB332 ZC192 ZC412 ZC752 4C086 AA01 AA02 CB05 CB06 EA16 MA02 MA03 MA05 MA24 MA66 NA05 NA10 NA13 NA14 NA15 ZB21 ZB26 ZB33 ZC19 ZC20 ZC41 ZC75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ある化合物に対しある細胞を敏感にする方法であって：ａ）第１化合物から第２化合物へのプロセッシングを促進する遺伝子産物を生
産するヌクレオチド配列を含む核酸で、細胞をトランスフェクトし；そしてｂ）上記細胞に、脂質配合品中の上記第１化合物をデリバリーする；を含み、ここで、上記細胞が、上記第１化合物よりも上記第２化合物に対して
敏感である、前記方法。
【請求項２】前記核酸が、脂質配合品中に存在する、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】前記核酸が、脂質封入配合品中に存在する、請求項２に記載
の方法。
【請求項４】前記核酸が、前記脂質封入配合品内に完全に封入されている
、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記核酸が、カチオン脂質−核酸凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔ
ｅ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記核酸がベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記核酸が修飾アデノウィルス又は修飾レトロウィルスを含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記核酸が、裸ＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】前記脂質配合品が、カチオン脂質、及び循環からの前記脂質
配合品のクリアランスを遅らせる化合物を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】前記脂質配合品が、ＤＯＤＡＣ、及び脂質に結合したポリ
アミド・オリゴマーを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】前記脂質配合品が、スフィンゴ・ミエリンとコレステロー
ルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記脂質配合品が、カチオン脂質を含み、かつ、前記核酸
が、カチオン脂質を含む脂質配合品内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記細胞が、生物内に存在し、そして前記核酸が全身にデ
リバリーされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】前記細胞が、生物内に存在し、そして前記核酸が、ある領
域内に又は局所的にデリバリーされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】前記生物が哺乳動物である、請求項１２又は１３に記載の
方法。
【請求項１６】前記遺伝子産物がポリペプチドである、請求項１に記載の
方法。
【請求項１７】前記遺伝子産物が、単純ヘルペス・ウィルス・チミジンキ
ナーゼ、シトシン・デアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシル・トラ
ンスフェラーゼ、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ、チトクロームＰ４５
０２Ｂ１及びそれらの同族体から成る群から選ばれたメンバーである、請求項
１に記載の方法。
【請求項１８】前記第１化合物が、ガンシクロビル、アシクロビル、ブロ
モビニルデオキシウリジン、５−フルオロシトシン、６−チオキサニチン、Ｍｅ
Ｐ−ｄｒ、及びシクロホスファミドから成る群から選ばれたプロドラッグである
、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】前記プロドラッグがガンシクロビルであり、かつ、前記脂
質配合品がスフィンゴミエリンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】ある化合物に対してある細胞を敏感にする方法であって：ａ）第１化合物から第２化合物へのプロセッシングを促進する酵素を、細胞に
デリバリーし；そしてｂ）上記細胞に、脂質配合品中の上記第１化合物をデリバリーする；を含み、ここで、上記細胞が、上記第１化合物よりも上記第２化合物に対してよ
り敏感である、前記方法。
【請求項２１】ヒトの医学的失調の治療のためのキットであって：ａ）脂質配合品中の核酸；及びｂ）脂質配合品中のプロドラッグ；を含む、前記キット。
【請求項２２】脂質配合品中のプロドラッグ及び医薬として許容される担
体を含む組成物。
【請求項２３】前記組成物が核酸をさらに含む、請求項２０に記載の組成
物。
【請求項２４】前記核酸がベクターを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】前記核酸が、脂質配合品中に存在する、請求項２１に記載
の組成物。
【請求項２６】前記組成物が酵素をさらに含む、請求項２０に記載の組成
物。
【請求項２７】前記酵素が、脂質配合品中に存在する、請求項２３に記載
の組成物。