JP2003088383A - 生細胞からの生体分子の採取方法 - Google Patents
生細胞からの生体分子の採取方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生きた細胞からRNAなどの生体分子を採取す
る手段を提供する。 【解決手段】 少なくとも以下の（１）及び（２）の工
程を含むことを特徴とする生体分子の採取方法。 （１）採取しようとする生体分子と結合し得る針を、微
細な位置制御が可能な装置を用いて、生細胞に刺し込む
工程 （２）前記針を、前記装置を用いて、生細胞から引き抜
く工程
る手段を提供する。 【解決手段】 少なくとも以下の（１）及び（２）の工
程を含むことを特徴とする生体分子の採取方法。 （１）採取しようとする生体分子と結合し得る針を、微
細な位置制御が可能な装置を用いて、生細胞に刺し込む
工程 （２）前記針を、前記装置を用いて、生細胞から引き抜
く工程
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生きている状態の
細胞から種々の生体分子を採取する方法、及びその方法
を利用した生細胞内で発現している遺伝子の同定方法に
関する。本発明の方法により、一つの細胞における遺伝
子発現等の変化を経時的に調べることが可能になる。
細胞から種々の生体分子を採取する方法、及びその方法
を利用した生細胞内で発現している遺伝子の同定方法に
関する。本発明の方法により、一つの細胞における遺伝
子発現等の変化を経時的に調べることが可能になる。
【０００２】
【従来の技術】最近の生物学研究の大きな流れの一つ
は、個々の生物試料の個性を調べようというものであ
る。タンパク質などの生体高分子にしても、たくさんの
分子からなる溶液中の酵素活性などといった全体の性質
を調べるだけでなく、一分子の活性を調べるというもの
で、これらの学問は一分子生化学と呼ばれている。
は、個々の生物試料の個性を調べようというものであ
る。タンパク質などの生体高分子にしても、たくさんの
分子からなる溶液中の酵素活性などといった全体の性質
を調べるだけでなく、一分子の活性を調べるというもの
で、これらの学問は一分子生化学と呼ばれている。
【０００３】細胞生物学の分野においても一つ一つの細
胞の個性を調べる研究が行われるようになってきた。例
えば、脳のある領域の神経細胞では、従来は同じ種類の
細胞の集まりとして扱われてきた。これら同じ種類の細
胞集団の中の個々細胞のレセプターなどの微妙な発現の
違いを調べることにより、より複雑な機能解析を行うこ
とができるのではないかと考えられるようになってき
た。一分子生化学に対して一細胞生物学と呼ぶことがで
きよう。
胞の個性を調べる研究が行われるようになってきた。例
えば、脳のある領域の神経細胞では、従来は同じ種類の
細胞の集まりとして扱われてきた。これら同じ種類の細
胞集団の中の個々細胞のレセプターなどの微妙な発現の
違いを調べることにより、より複雑な機能解析を行うこ
とができるのではないかと考えられるようになってき
た。一分子生化学に対して一細胞生物学と呼ぶことがで
きよう。
【０００４】一つの細胞での遺伝子発現変化などを観察
するためには細胞を生きたまま、そこからわずかな量の
生体分子を取り出し解析する技術が不可欠である。今ま
では同じ状態にあると思われる複数の細胞間での比較を
行ってきたが、今後微妙な細胞間の変化などを調べる一
細胞生物学を行うには十分な方法とはいえない。
するためには細胞を生きたまま、そこからわずかな量の
生体分子を取り出し解析する技術が不可欠である。今ま
では同じ状態にあると思われる複数の細胞間での比較を
行ってきたが、今後微妙な細胞間の変化などを調べる一
細胞生物学を行うには十分な方法とはいえない。
【０００５】最近、複数の鋤鼻神経細胞の一つ一つから
cDNAライブラリーを作り、それらを比較することによ
り、微妙な遺伝子の発現を調べて、フェロモンレセプタ
ーのクローニングなどが行われた。この方法は大変画期
的であるが、今までの方法と同じように細胞を殺してし
まうため、経時的な変化を一つの細胞で調べることがで
きない。
cDNAライブラリーを作り、それらを比較することによ
り、微妙な遺伝子の発現を調べて、フェロモンレセプタ
ーのクローニングなどが行われた。この方法は大変画期
的であるが、今までの方法と同じように細胞を殺してし
まうため、経時的な変化を一つの細胞で調べることがで
きない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】以上述べたように、従
来の生体分子の採取方法は、採取源とする細胞を殺すこ
とを前提としており、細胞を生かした状態で生体分子を
採取しようとする方法は知られていなかった。
来の生体分子の採取方法は、採取源とする細胞を殺すこ
とを前提としており、細胞を生かした状態で生体分子を
採取しようとする方法は知られていなかった。
【０００７】本発明は、このような技術的な背景の下に
なされたものであり、その目的は、生きた細胞からRNA
などの生体分子を採取する手段を提供し、個々の細胞に
ついて経時的な変化を連続的に記録することにある。
なされたものであり、その目的は、生きた細胞からRNA
などの生体分子を採取する手段を提供し、個々の細胞に
ついて経時的な変化を連続的に記録することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、一つの細胞
での遺伝子発現変化などを観察するためには、生きた状
態の細胞から生体分子を取り出すことが必要であるとい
う着想を得、この着想を基に本発明を完成した。
での遺伝子発現変化などを観察するためには、生きた状
態の細胞から生体分子を取り出すことが必要であるとい
う着想を得、この着想を基に本発明を完成した。
【０００９】即ち、本発明は、少なくとも以下の（１）
及び（２）の工程を含むことを特徴とする生体分子の採
取方法である。 （１）採取しようとする生体分子と結合し得る針を、微
細な位置制御が可能な装置を用いて、生細胞に刺し込む
工程 （２）前記針を、前記装置を用いて、生細胞から引き抜
く工程 また、本発明は、少なくとも以下の（１）及び（２）の
工程を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺
伝子の同定方法である。 （１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程 （２）前記mRNAと、発現が予想される遺伝子に特異的な
配列を含むオリゴヌクレオチドとを共存させ、前者を鋳
型とし、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応
が起きるかどうかを調べる工程 更に、本発明は、少なくとも以下の（１）〜（３）の工
程を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺伝
子の同定方法である。 （１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程 （２）前記mRNAからcDNAを合成する工程 （３）前記cDNAを、発現が予想される複数の遺伝子断片
が固定されているDNAチップに近づけ、前記cDNAと固定
されている遺伝子断片間に生じる力を測定する工程
及び（２）の工程を含むことを特徴とする生体分子の採
取方法である。 （１）採取しようとする生体分子と結合し得る針を、微
細な位置制御が可能な装置を用いて、生細胞に刺し込む
工程 （２）前記針を、前記装置を用いて、生細胞から引き抜
く工程 また、本発明は、少なくとも以下の（１）及び（２）の
工程を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺
伝子の同定方法である。 （１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程 （２）前記mRNAと、発現が予想される遺伝子に特異的な
配列を含むオリゴヌクレオチドとを共存させ、前者を鋳
型とし、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応
が起きるかどうかを調べる工程 更に、本発明は、少なくとも以下の（１）〜（３）の工
程を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺伝
子の同定方法である。 （１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程 （２）前記mRNAからcDNAを合成する工程 （３）前記cDNAを、発現が予想される複数の遺伝子断片
が固定されているDNAチップに近づけ、前記cDNAと固定
されている遺伝子断片間に生じる力を測定する工程
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】本発明の生体分子の採取方法は、少なくと
も以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とす
るものである。
も以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とす
るものである。
【００１１】工程（１）では、採取しようとする生体分
子と結合し得る針を、微細な位置制御が可能な装置を用
いて、生細胞に刺し込む。
子と結合し得る針を、微細な位置制御が可能な装置を用
いて、生細胞に刺し込む。
【００１２】生体分子としては、mRNA、tRNA、rRNA、DN
A、タンパク質、脂質、糖などを挙げることができる。
A、タンパク質、脂質、糖などを挙げることができる。
【００１３】使用する針は、生体分子と結合し得るもの
であればどのようなものでもよく、例えば、金属酸化物
のウィスカー（例えば、ZnOウィスカーなど）、カーボ
ンナノチューブなどを使用することができる。ウィスカ
ー等は、そのままの状態でも物理的吸着力によって生体
分子と結合できるが、結合性を向上させるため、生体分
子と特異的に結合し得る物質で修飾することが好まし
い。生体分子と特異的に結合し得る物質としては、例え
ば、mRNAを採取する場合であればオリゴdTを例示するこ
とができ、タンパク質、脂質、糖を採取する場合であれ
ば抗体を例示することができる。また、特定の配列を持
つ核酸を採取しようとする場合には、その核酸と相補的
な配列を持つ核酸で針を修飾してもよい。
であればどのようなものでもよく、例えば、金属酸化物
のウィスカー（例えば、ZnOウィスカーなど）、カーボ
ンナノチューブなどを使用することができる。ウィスカ
ー等は、そのままの状態でも物理的吸着力によって生体
分子と結合できるが、結合性を向上させるため、生体分
子と特異的に結合し得る物質で修飾することが好まし
い。生体分子と特異的に結合し得る物質としては、例え
ば、mRNAを採取する場合であればオリゴdTを例示するこ
とができ、タンパク質、脂質、糖を採取する場合であれ
ば抗体を例示することができる。また、特定の配列を持
つ核酸を採取しようとする場合には、その核酸と相補的
な配列を持つ核酸で針を修飾してもよい。
【００１４】針の修飾方法は、修飾する物質及び針の種
類に応じて適宜決めることができる。例えば、オリゴdT
でZnOウィスカーを修飾する場合は、表面にアミノ基を
導入したウィスカーとオリゴdTを含み5'チオール化した
オリゴDNAとを、適当な架橋剤と反応させることにより
行うことができる。
類に応じて適宜決めることができる。例えば、オリゴdT
でZnOウィスカーを修飾する場合は、表面にアミノ基を
導入したウィスカーとオリゴdTを含み5'チオール化した
オリゴDNAとを、適当な架橋剤と反応させることにより
行うことができる。
【００１５】微細な位置制御が可能な装置は、生細胞を
殺すことなく、針の刺し込み操作及び後述する引き抜き
操作が可能なものであればどのようなものでもよく、市
販のマイクロマニピュレーターや原子間力顕微鏡を使用
することができる。
殺すことなく、針の刺し込み操作及び後述する引き抜き
操作が可能なものであればどのようなものでもよく、市
販のマイクロマニピュレーターや原子間力顕微鏡を使用
することができる。
【００１６】針の生細胞への刺し込みは、例えば、原子
間力顕微鏡のカンチレバーに針を固定し、カンチレバー
を採取しようとする生細胞の上方に移動させた後、下方
に移動させることにより行うことができる。針のカンチ
レバーへの固定は一般的な方法、例えば、エポキシなど
を用いて行うことができる。このような針の刺し込み等
の操作は顕微鏡観察下で行うのが好ましい。
間力顕微鏡のカンチレバーに針を固定し、カンチレバー
を採取しようとする生細胞の上方に移動させた後、下方
に移動させることにより行うことができる。針のカンチ
レバーへの固定は一般的な方法、例えば、エポキシなど
を用いて行うことができる。このような針の刺し込み等
の操作は顕微鏡観察下で行うのが好ましい。
【００１７】採取源とする生細胞はどのようなものでも
よく、例えば、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞など
を例示できるが、これらに限定されるわけではない。
よく、例えば、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞など
を例示できるが、これらに限定されるわけではない。
【００１８】工程（２）では、前記針を、前記装置を用
いて、生細胞から引き抜く。
いて、生細胞から引き抜く。
【００１９】針の刺し込みから引き抜きまでの時間は特
に限定されないが、細胞へのダメージを考えれば短い方
がよく、より多くの生体分子を取り出すには長い方がよ
い。刺し込みから引き抜きまでは、通常5〜10秒程度で
ある。
に限定されないが、細胞へのダメージを考えれば短い方
がよく、より多くの生体分子を取り出すには長い方がよ
い。刺し込みから引き抜きまでは、通常5〜10秒程度で
ある。
【００２０】以上の生体分子の採取方法を利用して、生
細胞内で発現している遺伝子の同定を行うことができ
る。即ち、生細胞内からmRANを採取し、そのmRNAがどの
遺伝子に由来するかを調べることにより、生細胞内でど
のような遺伝子が発現していたかがわかる。具体的な方
法としては、以下の第一の方法、及び第二の方法を例示
できる。
細胞内で発現している遺伝子の同定を行うことができ
る。即ち、生細胞内からmRANを採取し、そのmRNAがどの
遺伝子に由来するかを調べることにより、生細胞内でど
のような遺伝子が発現していたかがわかる。具体的な方
法としては、以下の第一の方法、及び第二の方法を例示
できる。
【００２１】第一の方法は、少なくとも以下の（１）及
び（２）の工程を含むことを特徴とするものである。 （１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程 （２）前記mRNAと、発現が予想される遺伝子に特異的な
配列を含むオリゴヌクレオチドとを共存させ、前者を鋳
型とし、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応
が起きるかどうかを調べる工程 mRNAが、予想した遺伝子由来のものであればポリメラー
ゼ連鎖反応による増幅断片が生じるが、予想した遺伝子
由来のものでなければ増幅断片は生じない。従って、増
幅断片の有無を電気泳動等により調べることにより、生
細胞内で発現していた遺伝子がどのようなものであった
かがわかる。
び（２）の工程を含むことを特徴とするものである。 （１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程 （２）前記mRNAと、発現が予想される遺伝子に特異的な
配列を含むオリゴヌクレオチドとを共存させ、前者を鋳
型とし、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応
が起きるかどうかを調べる工程 mRNAが、予想した遺伝子由来のものであればポリメラー
ゼ連鎖反応による増幅断片が生じるが、予想した遺伝子
由来のものでなければ増幅断片は生じない。従って、増
幅断片の有無を電気泳動等により調べることにより、生
細胞内で発現していた遺伝子がどのようなものであった
かがわかる。
【００２２】第二の方法は、少なくとも以下の（１）〜
（３）の工程を含むことを特徴とするものである。 （１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程 （２）前記mRNAからcDNAを合成する工程 （３）前記cDNAを、発現が予想される複数の遺伝子断片
が固定されているDNAチップに近づけ、前記cDNAと固定
されている遺伝子断片間に生じる力を測定する工程 cDNAが予想した遺伝子断片に由来するものであれば、cD
NAを遺伝子断片に近づけると、両者間の引力、斥力に変
化が生じる。従って、この変化を調べることにより、生
細胞内で発現していた遺伝子がどのようなものであった
かがわかる。引力等の変化は、原子間力顕微鏡などによ
り測定することができる。
（３）の工程を含むことを特徴とするものである。 （１）上記方法によって生細胞からmRNAを採取する工程 （２）前記mRNAからcDNAを合成する工程 （３）前記cDNAを、発現が予想される複数の遺伝子断片
が固定されているDNAチップに近づけ、前記cDNAと固定
されている遺伝子断片間に生じる力を測定する工程 cDNAが予想した遺伝子断片に由来するものであれば、cD
NAを遺伝子断片に近づけると、両者間の引力、斥力に変
化が生じる。従って、この変化を調べることにより、生
細胞内で発現していた遺伝子がどのようなものであった
かがわかる。引力等の変化は、原子間力顕微鏡などによ
り測定することができる。
【００２３】
【実施例】１．ZnOウィスカーの修飾
ZnOウィスカーを無水トルエンで洗浄後、50％アミノプ
ロピルシランの入ったトルエン溶液中で一晩ローテータ
ーで攪拌し、ZnOウィスカー表面にアミノ基を導入し
た。反応終了後、ZnOをメタノールで３回洗浄し、その
後、メタノール中に保存した。次に、架橋剤（Sulfo-LC
-SPDP）を使って5'チオール化したオリゴDNA (AAACGACG
GCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGC(T)24)をZnOウィ
スカー表面に化学的に結合させた。
ロピルシランの入ったトルエン溶液中で一晩ローテータ
ーで攪拌し、ZnOウィスカー表面にアミノ基を導入し
た。反応終了後、ZnOをメタノールで３回洗浄し、その
後、メタノール中に保存した。次に、架橋剤（Sulfo-LC
-SPDP）を使って5'チオール化したオリゴDNA (AAACGACG
GCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGC(T)24)をZnOウィ
スカー表面に化学的に結合させた。
【００２４】修飾が上手くいったかどうかは、赤い蛍光
を発する色素を結合したポリAとの反応により調べた。
図１ＢにポリAとの反応により赤く染まったZnOウィスカ
ーを示す。 ２．ZnOウィスカーのAFMカンチレバーへの固定 実体顕微鏡（SZX12、オリンパス）にヒーター（MP200DM
SH、Kitazato）及びマイクロマニピュレータ（成茂科
学）をセットした。ヒーターの温度は70℃に設定した。
小さく切ったスライドガラス（約1.5cm角程度）を3個用
意し、それぞれにエポキシ（グレード1001、油化シェ
ル。融点64℃）、ZnOウィスカー、AFMチップを載せた。
を発する色素を結合したポリAとの反応により調べた。
図１ＢにポリAとの反応により赤く染まったZnOウィスカ
ーを示す。 ２．ZnOウィスカーのAFMカンチレバーへの固定 実体顕微鏡（SZX12、オリンパス）にヒーター（MP200DM
SH、Kitazato）及びマイクロマニピュレータ（成茂科
学）をセットした。ヒーターの温度は70℃に設定した。
小さく切ったスライドガラス（約1.5cm角程度）を3個用
意し、それぞれにエポキシ（グレード1001、油化シェ
ル。融点64℃）、ZnOウィスカー、AFMチップを載せた。
【００２５】エポキシが溶け、ZnOウィスカーが乾燥し
た時点で、以下の作業を開始した。実体顕微鏡で観察し
つつ、マニピュレータのマイクロピペットをエポキシに
少しだけ浸けた。これにより、ピペット先端にごく少量
のエポキシが、球状になって付着した。そのピペット先
端を、今度はAFMカンチレバー先端に軽く触れさせた。
これにより、カンチレバー先端にもごく少量のエポキシ
が付いた。次に、もうひとつのマニピュレータピペット
を使い、ZnOウィスカーをひとつだけ拾い上げた。ZnOウ
ィスカーに針先を触れさせると、静電気力によってZnO
ウィスカーがピペット先端に付着した。そして拾い上げ
たZnOウィスカーを、先ほどエポキシを付けた場所の上
に置き、室温に戻すと樹脂が固まって、ZnOウィスカー
がAFMカンチレバー先端に固定された。 ３．試料とする生細胞の調製 本実施例では、RNAの採取源として、BALB/cマウス由来
の繊維芽細胞であるBALB 3T3細胞を用いた。培養環境
は、5％ CO2存在下で、37℃に温度を保つようにした。
培地は、D-MEM/F-12培地（Gibco BRL）に100 U/mLペニ
シリン - 100 mg/mLストレプトマイシン（Gibco BRL ）
を加えたものを作り、それと非働化処理したFBS（fetal
bovine serum、JRH Biosciences）血清の比率が9：1に
なるよう混合した培地を用いた。継代後、約3日後に培
地を交換した。継代は、約1週間毎に行った。継代方法
であるが、コンフルエントになった細胞を0.25％トリプ
シン - 1mM EDTA（Gibco BRL）で処理し、遠心沈殿（70
0 rpm、10分）させた後、全体の1/10を継代した。通常
は角ディッシュ（T-25）を用いて培養するが、本実施例
では35mmペトリディッシュを用いた。 ４．生細胞からのmRNAの採取 原子間力顕微鏡の試料台に、上述のBALB 3T3細胞を置
き、カンチレバーに固定されたZnOウィスカーを細胞の
刺したい部位に移動させた。この作業は、原子間力顕微
鏡に付随する光学顕微鏡で観察しながら行った。ZnOウ
ィスカーの位置調整が完了した後、ピエゾを動かして、
ZnOウィスカーを細胞に刺した。ZnOウィスカーを細胞に
刺した直後の写真を図２に示す。図中の丸印で示された
細胞にZnOウィスカーを刺した。ZnOウィスカーは、この
図ではみえないが、カンチレバー（三角の部分）の先端
に付いている。
た時点で、以下の作業を開始した。実体顕微鏡で観察し
つつ、マニピュレータのマイクロピペットをエポキシに
少しだけ浸けた。これにより、ピペット先端にごく少量
のエポキシが、球状になって付着した。そのピペット先
端を、今度はAFMカンチレバー先端に軽く触れさせた。
これにより、カンチレバー先端にもごく少量のエポキシ
が付いた。次に、もうひとつのマニピュレータピペット
を使い、ZnOウィスカーをひとつだけ拾い上げた。ZnOウ
ィスカーに針先を触れさせると、静電気力によってZnO
ウィスカーがピペット先端に付着した。そして拾い上げ
たZnOウィスカーを、先ほどエポキシを付けた場所の上
に置き、室温に戻すと樹脂が固まって、ZnOウィスカー
がAFMカンチレバー先端に固定された。 ３．試料とする生細胞の調製 本実施例では、RNAの採取源として、BALB/cマウス由来
の繊維芽細胞であるBALB 3T3細胞を用いた。培養環境
は、5％ CO2存在下で、37℃に温度を保つようにした。
培地は、D-MEM/F-12培地（Gibco BRL）に100 U/mLペニ
シリン - 100 mg/mLストレプトマイシン（Gibco BRL ）
を加えたものを作り、それと非働化処理したFBS（fetal
bovine serum、JRH Biosciences）血清の比率が9：1に
なるよう混合した培地を用いた。継代後、約3日後に培
地を交換した。継代は、約1週間毎に行った。継代方法
であるが、コンフルエントになった細胞を0.25％トリプ
シン - 1mM EDTA（Gibco BRL）で処理し、遠心沈殿（70
0 rpm、10分）させた後、全体の1/10を継代した。通常
は角ディッシュ（T-25）を用いて培養するが、本実施例
では35mmペトリディッシュを用いた。 ４．生細胞からのmRNAの採取 原子間力顕微鏡の試料台に、上述のBALB 3T3細胞を置
き、カンチレバーに固定されたZnOウィスカーを細胞の
刺したい部位に移動させた。この作業は、原子間力顕微
鏡に付随する光学顕微鏡で観察しながら行った。ZnOウ
ィスカーの位置調整が完了した後、ピエゾを動かして、
ZnOウィスカーを細胞に刺した。ZnOウィスカーを細胞に
刺した直後の写真を図２に示す。図中の丸印で示された
細胞にZnOウィスカーを刺した。ZnOウィスカーは、この
図ではみえないが、カンチレバー（三角の部分）の先端
に付いている。
【００２６】ZnOウィスカーを細胞に刺した後、すばや
くカンチレバーを原子間力顕微鏡から取り外した。 ５．mRNAの解析 ZnOウィスカーに付着したmRNAを鋳型とし、QIAGENのPCR
用キットを用いて、RT-PCRとnested PCRを行った。プラ
イマーは、β-アクチン遺伝子に特異的な二組のプライ
マーを用いた。これらのプライマーを用いた場合、ZnO
ウィスカーにβ-アクチン遺伝子由来のmRNAが付着して
いれば、約400bpの断片が増幅される（図３）。
くカンチレバーを原子間力顕微鏡から取り外した。 ５．mRNAの解析 ZnOウィスカーに付着したmRNAを鋳型とし、QIAGENのPCR
用キットを用いて、RT-PCRとnested PCRを行った。プラ
イマーは、β-アクチン遺伝子に特異的な二組のプライ
マーを用いた。これらのプライマーを用いた場合、ZnO
ウィスカーにβ-アクチン遺伝子由来のmRNAが付着して
いれば、約400bpの断片が増幅される（図３）。
【００２７】PCRの条件及びプライマーの配列は下記の
通りである。 ＜1st RT-PCRのプライマー＞ Foward Primer :5'-GTG GGC CGC TCT AGG CAC CAA-3'
（配列番号１） Reverse Primer:5'-CTC TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC-
3'（配列番号２） ＜2nd nested PCRのプライマー＞ Foward Primer :5'-GAC TCC TAT GTG GGT GAC GAG G-3'
（配列番号３） Reverse Primer:5'-GGA TCT TCA TGA GGT AGT CCG TCA-
3'（配列番号４） 上記二段階のPCRを行った後、その増幅産物を電気泳動
した。ゲルの写真を図４に示す。この図に示すように、
中央のレーンには約400bpのバンドが検出された。この
バンドは、β-アクチンmRNA由来のものであると考えら
れる。なお、図中の左端のレーンはマーカー、右端のレ
ーンはコントロールのレーンである。
通りである。 ＜1st RT-PCRのプライマー＞ Foward Primer :5'-GTG GGC CGC TCT AGG CAC CAA-3'
（配列番号１） Reverse Primer:5'-CTC TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC-
3'（配列番号２） ＜2nd nested PCRのプライマー＞ Foward Primer :5'-GAC TCC TAT GTG GGT GAC GAG G-3'
（配列番号３） Reverse Primer:5'-GGA TCT TCA TGA GGT AGT CCG TCA-
3'（配列番号４） 上記二段階のPCRを行った後、その増幅産物を電気泳動
した。ゲルの写真を図４に示す。この図に示すように、
中央のレーンには約400bpのバンドが検出された。この
バンドは、β-アクチンmRNA由来のものであると考えら
れる。なお、図中の左端のレーンはマーカー、右端のレ
ーンはコントロールのレーンである。
【００２８】
【発明の効果】本発明は、生きている状態の細胞から生
体分子を採取する方法を提供する。ある細胞における遺
伝子発現の経時的変化を調べる場合、従来はクローン化
された複数の細胞を用いていたが、本発明の方法によ
り、一個の細胞についての経時的変化を調べることが可
能になる。これにより、クローン細胞を用いる場合より
も、より正確な発現情報を得ることができるようにな
る。また、クローン化できない細胞についても、発現す
る遺伝子の経時的変化を調べることが可能になる。
体分子を採取する方法を提供する。ある細胞における遺
伝子発現の経時的変化を調べる場合、従来はクローン化
された複数の細胞を用いていたが、本発明の方法によ
り、一個の細胞についての経時的変化を調べることが可
能になる。これにより、クローン細胞を用いる場合より
も、より正確な発現情報を得ることができるようにな
る。また、クローン化できない細胞についても、発現す
る遺伝子の経時的変化を調べることが可能になる。
【００２９】更に、本発明の方法では、ウィスカーの刺
す場所を変えることにより、細胞の場所による発現の違
いも調べることができる。
す場所を変えることにより、細胞の場所による発現の違
いも調べることができる。
【００３０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> President of Tokyo Institute of Technology
<120> METHOD FOR PICKING BIOMOLECULES FROM A VIABLE CELL
<130> P01-054
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA
<400> 1
gtgggccgct ctaggcacca a 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA
<400> 2
ctctttgatg tcacgcacga tttc 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA
<400> 3
gactcctatg tgggtgacga gg 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA
<400> 4
ggatcttcat gaggtagtcc gtca 24
【配列番号１】配列番号１は、実施例で行ったRT-PCRの
Foward Primerの塩基配列を示す。
Foward Primerの塩基配列を示す。
【００３１】
【配列番号２】配列番号２は、実施例で行ったRT-PCRの
Reverse Primerの塩基配列を示す。
Reverse Primerの塩基配列を示す。
【００３２】
【配列番号３】配列番号３は、実施例で行ったnested P
CRのFoward Primerの塩基配列を示す。
CRのFoward Primerの塩基配列を示す。
【００３３】
【配列番号４】配列番号４は、実施例で行ったnested P
CRのReverse Primerの塩基配列を示す。
CRのReverse Primerの塩基配列を示す。
【図１】ZnOウィスカーの形状を示す顕微鏡写真（図１
Ａ）、オリゴdTで修飾したZnOウィスカーと蛍光性ポリA
のアニーリングの様子を示す蛍光顕微鏡写真（図１Ｂ）
Ａ）、オリゴdTで修飾したZnOウィスカーと蛍光性ポリA
のアニーリングの様子を示す蛍光顕微鏡写真（図１Ｂ）
【図２】ZnOウィスカーを細胞に刺した直後の写真
【図３】実施例で使用したPCRプライマーと鋳型となるm
RNAの位置を示す図
RNAの位置を示す図
【図４】細胞から回収したmRNAを鋳型としたPCRによる
増幅断片を示す写真
増幅断片を示す写真
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 金 賢徹
東京都目黒区大岡山２丁目12番１号 東京
工業大学内
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 CA09 CA12 DA02
GA11 HA14
4B063 QA01 QA13 QQ53 QR32 QR55
QR62 QS12 QS25 QS34
Claims (7)
- 【請求項１】 少なくとも以下の（１）及び（２）の工
程を含むことを特徴とする生体分子の採取方法。 （１）採取しようとする生体分子と結合し得る針を、微
細な位置制御が可能な装置を用いて、生細胞に刺し込む
工程 （２）前記針を、前記装置を用いて、生細胞から引き抜
く工程 - 【請求項２】 微細な位置制御が可能な装置が、原子間
力顕微鏡であることを特徴とする請求項１記載の生体分
子の採取方法。 - 【請求項３】 針が、生体分子と特異的に結合し得る物
質で修飾されたウィスカーであることを特徴とする請求
項１又は２記載の生体分子の採取方法。 - 【請求項４】 ウィスカーが、ZnOウィスカーであるこ
とを特徴とする請求項３記載の生体分子の採取方法。 - 【請求項５】 生体分子が、mRNAである請求項１乃至４
のいずれか一項に記載の生体分子の採取方法。 - 【請求項６】 少なくとも以下の（１）及び（２）の工
程を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺伝
子の同定方法。 （１）請求項５記載の方法によって生細胞からmRNAを採
取する工程 （２）前記mRNAと、発現が予想される遺伝子に特異的な
配列を含むオリゴヌクレオチドとを共存させ、前者を鋳
型とし、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応
が起きるかどうかを調べる工程 - 【請求項７】 少なくとも以下の（１）〜（３）の工程
を含むことを特徴とする生細胞内で発現している遺伝子
の同定方法。 （１）請求項５記載の方法によって生細胞からmRNAを採
取する工程 （２）前記mRNAからcDNAを合成する工程 （３）前記cDNAを、発現が予想される複数の遺伝子断片
が固定されているDNAチップに近づけ、前記cDNAと固定
されている遺伝子断片間に生じる力を測定する工程
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001284298A JP3837480B2 (ja) | 2001-09-19 | 2001-09-19 | 生細胞からの生体分子の採取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001284298A JP3837480B2 (ja) | 2001-09-19 | 2001-09-19 | 生細胞からの生体分子の採取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003088383A true JP2003088383A (ja) | 2003-03-25 |
| JP3837480B2 JP3837480B2 (ja) | 2006-10-25 |
Family
ID=19107647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001284298A Expired - Lifetime JP3837480B2 (ja) | 2001-09-19 | 2001-09-19 | 生細胞からの生体分子の採取方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3837480B2 (ja) |
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-
2001
- 2001-09-19 JP JP2001284298A patent/JP3837480B2/ja not_active Expired - Lifetime
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