JP2003265172A

JP2003265172A - 発現頻度解析方法

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Publication number: JP2003265172A
Application number: JP2002073221A
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Inventors: Takeo Takahashi; 威夫高橋
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Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2003-09-24
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Abstract

(57)【要約】【課題】効率のよい遺伝子発現頻度解析方法を提供す
る。【解決手段】対象における遺伝子の発現頻度を解析す
る方法であって、（１）前記対象に由来する被検核酸を
得る工程と、（２）標的配列を含み、且つその５’末端
を介して固相化されているターゲット核酸に対して、前
記被検核酸をハイブリダイズさせる工程と、（３）検出
可能な信号を生ずる標識物質を付された少なくとも１種
類の基質ヌクレオチドとポリメラーゼとを用いて、前記
（２）の工程で得られたハイブリダイゼーション産物に
含まれる被検核酸を鋳型とし、ターゲット核酸の３’末
端を伸長する工程と、（４）前記（３）において得られ
た伸長されたターゲット核酸に含まれる標識物質からの
信号を検出することによって、対象における遺伝子の発
現頻度を解析する工程とを具備する対象における遺伝子
の発現頻度を解析する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸に関連した分
析、特に、対象における遺伝子の発現頻度解析に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】所謂ＤＮＡマイクロアレイは、多数の異
なったターゲットＤＮＡをガラスなどの固相基板上に高
密度に固定した装置である。このような基板にターゲッ
ト核酸を固定した装置は、その製造方法から２種類に大
別される。１つは、光リソグラフ方式によりＤＮＡをガ
ラス表面上で合成していくタイプの装置、即ち、一般的
にはＤＮＡチップと称される装置である（Proc Natl Ac
ad Sci USA(1994)91:5022-5026)。もう１つは、予め調
製したＤＮＡをスライドガラス上に機械的に並べ、それ
によってＤＮＡを張り付けていく（即ち、固相化する）
タイプの装置、即ち、一般的にはＤＮＡマイクロアレイ
と称される装置である（Science(1994)270:467-470)。

【０００３】ＤＮＡマイクロアレイの基本的な測定原理
は、固定されたターゲット核酸に対して相補的な標識化
プローブ核酸をハイブリダイズさせ、各々のプローブ核
酸からのシグナルを検出し、得られたシグナルを基に試
料に含まれるプローブ核酸を検出するものである。この
ような原理によって、遺伝子の大量解析が可能になり、
検出感度の向上、装置のマイクロ化によるサンプルの節
約、データの取得の自動化およびデータ処理の簡便化な
どが達成されると期待されている。

【０００４】しかしながら、このようなＤＮＡマイクロ
アレイを使用する遺伝子発現頻度解析には、以下のよう
な問題点がある；１）測定したい試料、例えば、ＲＮＡ
などの抽出後に、蛍光標識化基質核酸と逆転写酵素とを
用いてプローブＤＮＡを標識しなければならず、標識化
の効率が悪く、各操作段階で試料に変性が生じ易い、
２）プローブ核酸となる遺伝子をランダムにラベルしな
ければならないので効率が悪い、３）ハイブリダイゼー
ションまでの前処理が煩雑である、３）ディファレンシ
ャルな遺伝子発現を見るための系であるので、結果は相
対的にしか得られない、４）測定は乾燥状態で行われる
ので蛍光シグナルの検出効率が低い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記の状況に鑑み、本
発明の目的は、効率のよい遺伝子発現頻度解析方法を提
供することである。また本発明の更なる目的は、複数の
プレート間での比較が可能な遺伝子発現頻度解析方法を
提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】鋭意研究の結果、本発明
者らは、上記の課題を解決するための手段を見出した。
即ち、対象における遺伝子の発現頻度を解析する方法で
あって、以下の工程；（１）前記対象に由来する被検核酸を得る工程と、
（２）標的配列に相補的な配列を含み、且つその５’末
端を介して固相化されているターゲット核酸に対して、
前記被検核酸を反応させる工程と、（３）検出可能な信
号を生ずる標識物質を付された標識化基質核酸と、前記
標識化基質核酸の塩基とは異なる種類の塩基を含む少な
くとも１の非標識化基質核酸と、ポリメラーゼとを用い
て、前記（２）の工程で得られたターゲット核酸に対し
てハイブリダイズした標的配列とその標的配列よりも
５’側に更なる配列を含むプローブ核酸の前記更なる配
列の部分を鋳型とし、ターゲット核酸の３’末端を伸長
する工程と、（４）前記（３）において得られた伸長さ
れたターゲット核酸に含まれる標識物質からの信号を検
出することによって、対象における遺伝子の発現頻度を
解析する工程を具備する方法である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の態様に従うと、対象にお
ける遺伝子の発現頻度を解析する方法が提供される。こ
こで使用される「対象」の語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウ
シ、ヤギ、ブタ、ヒツジ及びサルを含む任意の哺乳動物
などの個体、並びに遺伝子を発現し得るその他の生物、
また、個体から採取した細胞および組織等であってもよ
い。

【０００８】ここで使用される「被検核酸」の語は、遺
伝子の発現頻度を解析する場合には、一般的には対象に
おいて発現されるｍＲＮＡを指す。対象から被検核酸を
得る工程はそれ自身公知の手段により行うことが可能で
あり、例えば、被検核酸がｍＲＮＡである場合には、例
えば、市販のキットを使用しても、オリゴｄＴカラムを
使用してもよいが、これに限定されるのもではない。ま
た、標識されたターゲット核酸を得る場合には、何れの
核酸であってもよい。ここにおける「核酸」は、天然に
存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核
酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およ
びＳ-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体
などであってもよく、その塩基配列および修飾の有無な
どは任意に選択すればよい。また、試料中のプローブ核
酸は、対象から抽出された後に、増幅されて本発明の態
様に従う方法に共されてもよい。

【０００９】ここで使用される「標的配列」の語は、検
出されるべき塩基配列を示す。ここで使用される「プロ
ーブ核酸」の語は、検出されるべき塩基配列を含む核酸
を示す。また、ここで使用される「ターゲット核酸」の
語は、標的配列を検出するための核酸を示す。例えば、
標的配列に相補的な塩基配列をその一部に含む核酸であ
ればよい。

【００１０】また、本発明の態様に従うターゲット核酸
は、その５’末端を解して固相化されている。ターゲッ
ト核酸の固相化は、従来公知の何れかの基体に対して所
望のターゲット核酸を固定することによって行うことが
可能である。

【００１１】本発明の態様に従って使用され得る基体
は、そこにおいてハイブリダイゼーション反応を行うこ
とが可能な形態であればよい。例えば、一般的に使用さ
れる反応容器、例えば、キャピラリー形状またはウェル
形状のそこにおいて反応を行うための反応部を有した反
応容器であっても、その面において反応を行うような板
状および球状の基体であってもよい。処理の容易さか
ら、キャピラリー形状の反応部を有した反応容器が好ま
しい。

【００１２】ここで使用される「標識物質」の語は、検
出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例え
ば、蛍光物質、放射性物質および化学発光物質などであ
ってよい。また、酵素反応などで発色する基質を用いて
もよい。また、異なる部位に存在する複数の標的核酸を
標的配列として検出する場合や、複数のターゲット核酸
を１つの基体において同時に用いる場合など、所望に応
じて識別可能な複数の標識物質を同時に使用してもよ
い。

【００１３】以下、本発明に従う態様例を用いて本発明
について更に説明する。

【００１４】第１の実施例本発明の態様において使用され得る反応容器の例を図１
に示す（図１）。本例における反応容器１は、そこにお
いて反応を行うための反応部２を具備する。ここで、反
応部２は、１Ｂに示す通りの容器内部の形状がキャピラ
リー形状である（図１）。１Ｂは、１Ａの線１Ｂ−１Ｂ
に沿った断面図である。

【００１５】また、１Ａおよび１Ｂに示すように反応容
器１は、反応部２に試薬などを挿入および／または反応
部２から試薬などを排出するための開口部４ａおよび４
ｂを有している（図１）。また、反応部２の底部には、
検出しようとする標的配列に相補的な配列を含むターゲ
ット核酸３が所望の領域に固相化されている（１Ｂ）。
このような反応容器１の製造は次のように行った。

【００１６】即ち、溝およびその溝の両端に孔を有する
第１の基板と、その表面にターゲット核酸が固相化され
た第２の基板を、第１の基板の溝と第２の基板の表面に
より形成される空間に前記ターゲット核酸が含まれるよ
うに接合することにより製造した。より具体的には次の
通りである。

【００１７】第１の基板は、ガラス板に長さ３〜４ｃ
ｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍの溝を形成し、
この溝の両端にそれぞれ貫通孔を形成した。第２の基板
は、ストレプトアビジンコートスライド（株式会社グラ
イナー・ジャパン）に対して、点着装置を用いて５’末
端をビオチン標識したＲＶターゲット（ggaaacagctatga
ccatg；配列葉号１）を点着し、ビオチン−アビジン反
応を利用して固相化して形成した。このような第１の基
板と第２の基板を接合した。ここで、前記溝により形成
されたキャピラリー内に、前記ＲＶターゲット核酸は具
備されている。このようにして形成した反応容器１を用
いて、次の実験を行った。

【００１８】前記キャピラリー内に、プローブ核酸とし
て前記ＲＶターゲット核酸の配列に相補的なＲＶcomp t
arget(tgcacatggtcatagctgtttcc；配列番号２)を１００
ｎＭ（１×ＳＳＣ溶液中）の濃度で添加し、３７℃で１
時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイ
ゼーション後、１×ＳＳＣ溶液（以下の組成である；
０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．０）で十分に洗浄して、未反応のプロー
ブ核酸をキャピラリー内から取り除いた。次に０．０２
ｍＬの伸長反応溶液[１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
7.5）、７ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋ
ｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（DNA ポリメラーゼＩ，
Large Fragment;TOYOBO）を０．４ユニット／μＬ、１
０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、１０μＭのｄ
ＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を
前記キャピラリー内に添加し３７℃で１〜２時間反応さ
せた。反応後、０．１×ＳＳＣで十分に洗浄して未反応
物を取り除き蛍光を測定した（表１）。

【００１９】表１は、ターゲット核酸の基体への点着量
を１０ｎＭまたは１ｎＭとした場合に、Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇｍｅｎｔを添加ありの場合と添加なしとした場
合について、一番強い蛍光強度を１としたときの相対値
を示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】表１に示すように、伸長反応中にＫｌｅｎ
ｏｗＦｒａｇｍｅｎｔを存在させなかった場合には、
相対値は非常に低かった。従って、ターゲット核酸への
標識核酸の結合が非特異的なものではなく、ポリメラー
ゼによる伸長であることが確認できた。また、ターゲッ
ト核酸の点着量の増加に依存して、相対的蛍光強度も増
加した。従って、本発明の態様に従う方法は、定量性を
有していると示唆された。

【００２２】このような反応により生じる現象を、図２
に模式的に示した。本反応では、２Ａに示すように、標
的配列を含む被検核酸としてプローブ核酸２１を、ター
ゲット核酸としてターゲット核酸２２を使用した。ま
た、非標識核酸にはそこに含まれる塩基をＡとし、それ
に相補的な塩基を含む標識化基質核酸として蛍光標識し
た塩基Ｕ２３を用いた（２Ａ）。本明細書において、各
略語はそれぞれ、「Ａ」はアデニン、「Ｕ」はウラシ
ル、「Ｔ」はチミン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシト
シンである。また、本明細書において例として挙げる塩
基は、記載の便宜上、例として挙げているに過ぎないの
で、それらの塩基に限定するものではない。

【００２３】また、プローブ核酸２１は、標的配列を含
み、且つその標的配列の５’側に非標識核酸を含む。こ
の標的配列によって、ターゲット配列とのハイブリダイ
ゼーションが達成される。続く、ターゲット核酸２２の
３’端の伸長は、プローブ核酸の標的配列よりも５’側
の配列を鋳型として達成される。更に、そのプローブ核
酸の標的配列よりも５’側に含まれる被標識核酸の塩基
に対して、標識化基質核酸がハイブリダイズして取り込
まれることによって、標識化が達成される。

【００２４】ここで、非標識核酸は連続した複数の塩基
を含んでいてもよく、または断続的な複数の塩基であっ
てもよい。

【００２５】以下、反応を説明する。

【００２６】まず、２Ｂにおいて、反応容器１の反応部
２５の底面２４に固相化されたターゲット核酸２２に対
して、ハイブリダイゼーション可能な条件下で、プロー
ブ核酸２１を添加する。その結果、２Ｃに示すように、
ターゲット核酸２２とプローブ核酸２１が反応し、ハイ
ブリダイゼーションが生じる。続いて、これについて標
識化基質核酸(Ｕ)２２と非標識化基質核酸(Ａ、Ｔおよ
びＣ；図示せず)とを用いてポリメラーゼの存在下で伸
長反応を行う。その結果、２Ｄに示すように伸長され標
識されたターゲット核酸２６が得られる。

【００２７】従って、前記の取り込まれた基質核酸に具
備される標識物質の蛍光を検出すれば、標的配列を有す
るプローブ核酸の存在が検出される。

【００２８】上記のようなキャピラリー形状の反応容器
を使用すると使用する試料および試薬も微量で済むとい
う利点がある。しかしながら、本発明において使用され
る反応容器は、キャピラリー形状に限られるものではな
い。また、上記の例では１つの反応容器に１本のキャピ
ラリーが具備される装置の例を示したが、これに限定さ
れるものではなく、１つの反応容器に複数のキャピラリ
ー形状などの内部形状を有する反応部を有する反応容器
を用いてもよい。

【００２９】上記の模式図では、便宜上、１つのターゲ
ット核酸について示したがこれに限定するものではな
い。また、ターゲット核酸の配列は上記の配列に限定す
るものではなく、所望に応じて任意に選択し得る。ま
た、複数の異なる配列をそれぞれに有するターゲット核
酸を１つの基体において用いてもよく、同じ種類のター
ゲット核酸を複数使用してもよい。

【００３０】また、本発明に従って使用される反応容器
は、例えば、以下の様に変更することも可能である。即
ち、図１の１Ｃにその断面を示すように、基体の反応部
２の下方にヒーターおよび温度センサーを配置してもよ
い（図１の１Ｃは１Ａの線１Ｂ−１Ｂに沿った断面であ
る）。その場合、例えば、ターゲット核酸３が固相化さ
れるポリイミド薄膜５の下にヒーター６を配置し、ヒー
ター６の下に温度センサー７を配置すればよい。このよ
うな装置はそれ自身公知の何れかの手段により製造する
ことが可能である。また、このような装置に含まれるヒ
ーターおよびセンサーの配置および配置パターンは所望
に応じて変更してもよい。

【００３１】以上のような本発明の態様に従うと、ター
ゲット核酸のラベルを容易に行うことが可能である。本
態様に従うと、所望する特定の配列を有するターゲット
核酸の特定の塩基を選択的に標識することが可能であ
り、これによって、被検試料中に含まれる被検核酸に標
的配列が存在するか否かを判定することが可能である。
それにより、遺伝子の発現頻度を解析することが可能で
ある。

【００３２】第２の実施例第１の実施例に記載した反応容器を用いて、同様に第２
の実施例を実施した。

【００３３】また、第１の実施例において使用した伸長
反応液に変えて、次の伸長反応液［１０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH7.5）、７ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ
のＤＤＴ、ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（DNA ポリ
メラーゼＩ，Large Fragment;TOYOBO）を０．４ユニッ
ト／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、
０μＭのｄＧＴＰまたは１０μＭのｄｄＧＴＰ、および
１０μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含む］を用い、他の条件
は第１の実施例の記載と同様にして反応を行った。

【００３４】この反応の結果、０μＭのｄＧＴＰを用い
た場合には、ＲＶターゲットはその３’端からＣｙ３−
Ｕまで伸長された。即ち、その後のＧ、ＣおよびＡは伸
長されない。また、１０μＭのｄｄＧＴＰを用いた場合
には、ＲＶターゲットはその３’端からＧまで伸長され
た。即ち、その後のＣ、Ａは伸長されない。

【００３５】表２は、ターゲット核酸の基体への点着量
を１０ｎＭと１ｎＭとし、且つＫｌｅｎｏｗＦｒａｇ
ｍｅｎｔを添加ありの場合と添加なしの場合について、
一番強い蛍光強度を１としたときの相対値を示す。

【００３６】

【表２】

【００３７】表２に示すように、伸長反応中にＫｌｅｎ
ｏｗＦｒａｇｍｅｎｔを存在させなかった場合には、
相対値は非常に低かった。従って、ターゲット核酸への
標識核酸の結合が非特異的なものではなく、ポリメラー
ゼによる伸長であることが確認できた。また、ターゲッ
ト核酸の点着量の増加に依存して、相対的蛍光強度も増
加した。従って、本発明の態様に従う方法は、定量性を
有していると示唆された。

【００３８】本発明は、プローブ核酸とハイブリダイゼ
ーションしたターゲット核酸のみを標識化している。ま
た、標的配列にハイブリダイズするべき標識化基質核酸
以外の非標識化基質核酸を、それ以降伸長反応できない
ヌクレオチド(例えば、ddNTPなど)にすること、または
反応系に存在させないことによって、プローブ核酸への
標識量および伸長程度を制御することができる。

【００３９】また、ターゲット核酸に取り込まれる標識
物質の量は、プローブ核酸の量、即ち、発現頻度に依存
して変化するため、標識物質の変化を定量的に検出する
ことによって、遺伝子発現頻度を計測することが可能で
ある。このような遺伝子発現頻度解析方法は、微量な試
料で行うことが可能である。即ち、全ての処理を小型の
容器内で、一連の処理として行うことが可能であるの
で、核酸基質(例えば、dNTPなど)の量および必要な試薬
の量を低減することが可能であり、また、多検体につい
て短時間に解析することも可能である。

【００４０】第３の実施例第３の実施例を模式図である図３を用いて説明する。本
例では、それぞれに異なる第１、第２および第３のター
ゲット核酸３ａ、３ｂおよび３ｃを固相化した以外は第
１の実施例と同様に作成した反応容器３０を使用する。
３Ａに示す通り、それぞれのプローブ核酸３１ａ〜３１
ｃに含まれる標的配列は便宜上「Ａ」として示した。

【００４１】第１の実施例において記載した方法に従っ
て、先ず、３Ｂに示すようにプローブ核酸３１ａ〜３１
ｃをターゲット核酸３２ａ〜３２ｃに対してハイブリダ
イズし、次に、３Ｃに示すように伸長反応する。続い
て、３Ｃにおいて、反応部３５を例えば、約９５℃に温
度を上昇させ、伸長したターゲット核酸３６からプロー
ブ核酸３１を解離させ、反応部３５を具備するキャピラ
リー内に０．１×ＳＳＣ溶液などの緩衝液を注入し、排
出することにより内容液をフローする。それにより、解
離したプローブ核酸を除去して、３Ｄに示すように、伸
長され標識されたターゲット核酸３６ａから３６ｃを１
本鎖として得ることが可能である。

【００４２】上記の態様では、２本鎖核酸の解離手段と
して熱処理を行っているが、本発明の態様に従って使用
可能な２本鎖核酸の解離手段は、これに限定するもので
はない。即ち、それ自体公知の一般的に２本鎖核酸を１
本鎖に解離する場合に使用される手段であれば何れの手
段であってよい。例えば、アルカリ溶液、尿素またはホ
ルムアミド等を用いてもよい。

【００４３】また、プローブ核酸がＲＮＡであり、ター
ゲット核酸がＤＮＡである場合、１本鎖への解離は、前
記ＲＮＡを分解するような酵素、例えば、ＲＮＡａｓｅ
Ｈなどを用いて行ってもよい。

【００４４】上記では３種類のターゲット核酸とプロー
ブ核酸の例を示したが、これ以上または以下の種類のタ
ーゲット核酸および／またはプローブ核酸を用いてもよ
く、また、各種類の核酸を１以上で用いてもよい。

【００４５】本発明の態様に従うと、上述した第１の実
施例から第３の実施例に記載した方法の一部分を所望に
応じて組み合わせて実行しても、また、所望に応じて一
部を変更して実施してもよい。

【００４６】本発明の更なる側面に従うと、上述のよう
な本発明の態様により得られた１本鎖標識化ターゲット
核酸も本発明の更なる態様として提供される。

【００４７】例えば、本発明の態様に従って得た伸長さ
れ標識されたターゲット核酸を、１本鎖にした後に、更
なる標識化ターゲット核酸として、後述する第６の実施
例として記載するようなヌクレアーゼプロテクションア
ッセイに利用することも可能である。

【００４８】従来の方法では、ターゲット核酸の中間部
位を標識化する場合には、高度な技術が必要とされてい
る。また、中間部位が標識されたターゲット核酸の作製
を専門業者に依頼した場合には、莫大な時間と費用が必
要とされている。しかしながら、本発明の態様に従う
と、ヌクレオチドの伸長反応を制御できるので、最終的
に得られる更なるターゲット核酸の所望の中間位置を容
易に標識化することが可能である。従って、ヌクレアー
ゼプロテクションアッセイに利用するためのターゲット
核酸も短時間に効率よく作製することが可能である。

【００４９】第４の実施例本発明の更なる側面に従うと、１ターゲット核酸に対し
て、複数回、被検核酸を含む被検試料を繰り返し処理す
ることが可能である。

【００５０】第１の実施例に記載するような反応容器１
を使用し、本発明の態様に従い２回繰り返して処理する
場合の例を各工程における各分子の状態を模式的に示し
た図４を用いて説明する。

【００５１】まず、ターゲット核酸４２を反応部４５の
底面４４に固相化する。次に、反応部４５に対して、第
１のプローブ核酸４１ａと第１の蛍光標識化基質核酸４
３ａ（ここでは例として標識化ｄＵＴＰを記載してい
る）および非標識化基質核酸（図には示してないが、例
えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）をハイブリ
ダイズ可能な条件の下で加えハイブリダイゼーションを
行う（４Ｂ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第１の
標的配列（図４では「Ａ」で示す）の次の塩基まで伸長
反応を行う（４Ｃ）。

【００５２】ここで、所望の箇所、即ち、第１の標的配
列の次の塩基で伸長反応を停止するためには、第１の標
的配列の次の次の塩基に相補的な塩基からなるｄＮＴＰ
を添加しない。

【００５３】続いて、４Ｃに示すように、反応部４５
に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液を満たした状態で９５
℃に温度を上昇させ、伸長されたターゲット核酸４６ａ
からプローブ核酸４１を解離させる。反応部４５を具備
するキャピラリー内に、例えば、０．１×ＳＳＣ溶液な
どを注入し排出することによって内容液をフローして解
離核酸を除去する。その結果、４Ｄに示すように、伸長
され標識されたターゲット核酸４６ａが１本鎖として得
られる（図４）。

【００５４】続いて、４Ｅに示すような第２のプローブ
核酸４２ｂと第２の蛍光標識化基質核酸４３ｂ（ここで
は例として標識化ｄＡＴＰを記載している）および非標
識化基質核酸（図には示してないが、例えば、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）をハイブリダイズ可能な
条件の下で加えハイブリダイゼーションを行う（４
Ｆ）。続いて、ポリメラーゼを添加し、第２の標的配列
（図４では「Ｔ」で示す）の次の塩基まで伸長反応を行
う（４Ｃ）。続いて、得られた第２の伸長され標識され
た第２のターゲット核酸について、第１の蛍光物質およ
び第２の蛍光物質の蛍光強度を測定する（４Ｅ）。

【００５５】この態様においては、第２の標的配列の次
の塩基まで伸長反応を行った例を示したが、それ以上伸
長しても、第２の標的配列まで伸長することも可能であ
る。

【００５６】また、上記の例では、ターゲット核酸の伸
長において、第１の標的配列と第２の標的配列の間に１
の塩基が配置される例を示したが、これに限定するもの
ではなく、当該間に塩基が配置されなくとも、また２以
上の塩基が配置されてもよい。

【００５７】４Ｅに示すように、得られた第２の伸長さ
れ標識されたターゲット核酸４６ｂに含まれる第１の蛍
光物質（図４では星印でしめす）と第２の蛍光物質（図
４ではＸ印で示す）は、識別可能であることが望まし
く、互いに異なる波長の蛍光を生じる物質であることが
望ましい。また、検出される蛍光強度の違いによって、
判定する場合や、使用する検出手段の選択によっては、
必ずしも互いに異なる波長である必要はない。

【００５８】また更に、得られた第２の伸長され標識さ
れたターゲット核酸４６ｂを更に１本鎖に変性し、上述
した方法の更なる繰り返しを行ってもよい。

【００５９】以下に、具体的な１例を挙げて更に説明す
る。

【００６０】まず、第１の実施例に記載の反応容器１を
用いて、ハイブリダイゼーション可能な条件下で第１の
ターゲット核酸と第１のプローブ核酸とのハイブリダイ
ゼーションを行う。続いて伸長反応溶液を[１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.5)、７ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．
１ｍＭのＤＤＴ、ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ(DNA
ポリメラーゼＩ，Large Fragment;TOYOBO)を０．４ユニ
ット／μＬ、１０μＭのｄＡＴＰ、１０μＭのｄＣＴ
Ｐ、０μＭのｄＧＴＰ、および１０μＭのＣｙ３−ｄＵ
ＴＰを含む］を用いることを除いて第１の実施例に記載
の方法と同様に伸長反応を行う。

【００６１】このハイブリダイゼーションと伸長反応に
よって、第１のプローブ核酸の存在が第１のターゲット
核酸の伸長および標識化に反映される。即ち、第１のタ
ーゲットにハイブリダイズした第１のプローブ核酸を鋳
型として、第１のターゲット核酸が伸長され、Ｃｙ３−
Ｕが取り込まれ、Ｇの手前まで伸長される。その結果、
第１のプローブ核酸にハイブリダイズされた、第１の伸
長され標識されたターゲット核酸が得られる。

【００６２】次に、温度を約９５℃に上昇させることに
より、第１の伸長され標識されたターゲット核酸から第
１のプローブ核酸を解離する。更に、反応部に含まれる
溶液をフローすることにより、遊離した第１のプローブ
核酸を除去する。

【００６３】続いて、第２のプローブ核酸をハイブリダ
イゼーション可能な条件下においてハイブリダイズさ
せ、伸長反応溶液を[１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.
5)、７ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭのＤＤＴ、Ｋｌｅ
ｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ(DNAポリメラーゼＩ，Large
Fragment;TOYOBO)を０．４ユニット／μＬ、１０μＭの
Ｃｙ５−ｄＡＴＰ、０μＭのｄＣＴＰ、１０μＭのｄＧ
ＴＰ、および１０μＭのｄＴＴＰを含む］を用いること
を除いて第１の実施例に記載の方法と同様に伸長反応を
行う。

【００６４】上記の反応により、第２のプローブ核酸の
存在が反映され、第２のプローブ核酸と第１の伸長され
標識されたターゲット核酸とのハイブリダイゼーション
が生じ、続いて、更なる伸長および標識化が生じ、第２
の伸長され標識されたターゲット核酸が得られる。即
ち、第２の伸長され標識されたターゲット核酸は、Ｃｙ
５−Ａで標識化され、Ｃの手前まで伸長されている。

【００６５】Ｃｙ３とＣｙ５の蛍光強度をそれぞれにま
たは相対的に測定することにより第１のプローブ核酸と
第２のプローブ核酸の発現頻度または相対的発現頻度を
測定することが可能である。

【００６６】上述の本発明の態様に従うと、比較したい
２つ以上のプローブ核酸を同じターゲット核酸に対して
連続してハイブリダイゼーションし、ハイブリダイゼー
ションとプローブ核酸の配列に依存して、そのターゲッ
ト核酸を伸長し、識別可能な信号を生じる複数の標識物
質を用いて、そのターゲット核酸に対して標識化を行う
ことが可能である。その後、ターゲット核酸に取り込ま
れた各標識物質を検出することにより、非相対的に、複
数の対象について発現頻度解析を行うことが可能であ
る。

【００６７】このような発明の態様に従うと、複数のハ
イブリダイゼーションおよび標識化に関する全ての処理
が、小型の容器内で、一括して、即ち、一連の操作によ
って行うことが可能である。従って、少ない試料で、所
望する遺伝子発現頻度解析を短時間に、簡便に行うこと
が可能である。また、ターゲット核酸の伸長の程度を制
御でき、また、所望のターゲット核酸を伸長していく途
中の所望の部位に容易に標識を行うことが可能である。

【００６８】第５の実施例本発明の態様に従い使用され得るターゲット核酸とプロ
ーブ核酸がハイブリダイズした時の状態の例を図５の５
Ａから５Ｄまでに模式的に示す。

【００６９】上述した通り、ターゲット核酸５１は、基
板表面５２にその５’末端を介して固相化されている。

【００７０】５Ａに示すように、プローブ核酸５３Ａの
全長は、ターゲット核酸５１Ａの全長よりも長いことが
好ましい。それにより、プローブ核酸５３Ａとターゲッ
ト核酸５１Ａがハイブリダイズした際に、その長さの違
いから生じるプローブ核酸５３Ａの１本鎖の部分を鋳型
として、ターゲット核酸５１Ａの３’末端は伸長され
る。また、このとき被標識核酸はプローブ核酸５３Ａの
１本鎖の部分に存在する。

【００７１】また、プローブ核酸５３のターゲット核酸
５１へのハイブリダイゼーションの位置は、５Ａおよび
５Ｃに示すように、ターゲット核酸５１の全長に相補的
な配列をプローブ核酸５３が含み、その上で、更に余分
な配列がプローブ核酸の５’側に含まれるようにしても
よい。

【００７２】或いは、５Ｂおよび５Ｄに示すように、タ
ーゲット核酸５１の一部に相補的な配列をプローブ核酸
５３の３’側が含み、更に余分な配列をプローブ核酸の
５’側に含むように設計してもよい。

【００７３】また、５Ａおよび５Ｂに示すように、被標
識核酸として１ヌクレオチドが１箇所に設定されてもよ
く、５Ｃおよび５Ｄに示すように、被標識核酸として１
ヌクレオチドが２箇所以上で設定されてもよい。

【００７４】第６の実施例ヌクレアーゼプロテクションアッセイへの利用核酸分解酵素（nuclease）であるＳ１ヌクレアーゼは、
１本鎖特異的エンドヌクレアーゼであり、DNAおよびRNA
ともに酸可溶性の５’−Ｐのヌクレオチドに分解し最終
的には、全体の９０％以上を５’−Ｐのヌクレオチドに
分解する。また２本鎖中の１本鎖部分にも作用し、これ
を分解する酵素である。また、この酵素はＤＮＡ−ＤＮ
ＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の１本鎖部分の
除去などによく用いられる。また、エキソヌクレアーゼ
Ｉも、１本鎖特異的エクソヌクレアーゼであり、１本鎖
ＤＮＡの３’端から順番に加水分解して５’−Ｐのヌク
レオチドにする。これらの酵素は、ＰＣＲ後のプライマ
ーの除去などに用いられている（図６）。

【００７５】ヌクレアーゼプロテクションアッセイ(Nuc
laase Protection Assay)は、固相したターゲット核酸
をあらかじめラベルをしておき、ハイブリダイゼーショ
ン後に１本鎖特異的ヌクレアーゼを反応させる解析方法
である。例えば、プローブ核酸とハイブリダイゼーショ
ンした２本鎖ＤＮＡは、このヌクレアーゼからプロテク
ションされるので標識が保護されるのに対し、未反応の
ターゲット核酸（例えば、１本鎖ＤＮＡなど）は分解さ
れるので標識が遊離してしまう。従って、そのプロテク
ションされたターゲット核酸の標識量を、ターゲット核
酸に含まれる標識物質からの信号を検出することによっ
て測定し、それによって遺伝子の発現頻度を測定する方
法である（図７）。

【００７６】このようなヌクレアーゼプロテクションア
ッセイを本願発明の一部として利用することも可能であ
る。例えば、第３の実施例に記載する方法により得た１
本鎖標識化ターゲット核酸を用いてヌクレアーゼプロテ
クションアッセイにより核酸を解析してもよい。また、
第１、第２および第４の実施例に記載する方法により得
た２本鎖標識化ターゲットを第３の実施例に記載するよ
うな手段により１本鎖して得られた１本鎖標識化ターゲ
ット核酸を用いてもよい。また、そのようにして得られ
た１本鎖標識化ターゲット核酸は、本発明の態様に従っ
て得られたままで、即ち、基体に固相化されたままでヌ
クレアーゼプロテクションアッセイに利用してもよく、
或いは基体から遊離させ回収して利用してもよい。更
に、回収した後に生成した後に使用してもよい。

【００７７】本発明の更なる態様を、図８の模式図を用
いて説明する。まず、第３の実施の態様に記載した方法
と同様に、蛍光強度の検出以前の段階まで、即ち、図８
の８Ａから８Ｄまでを行う。これにより、ヌクレアーゼ
プロテクションアッセイのための１本鎖標識化ターゲッ
ト核酸が得られる(８Ｄ)。

【００７８】次に、核酸配列の解析を行うべき試料を添
加し、ハイブリダイゼーション可能な条件下で反応す
る。８Ｅに示すように、試料中に検出すべき標的核酸が
存在する場合それらはハイブリダイズする。即ち、前記
標的核酸を含む被検核酸８７ａおよび８７ｂと標識化タ
ーゲット核酸８６ａおよび８６ｂがそれぞれハイブリダ
イズする。その後、８Ｆに示すように、１本鎖特異的エ
ンドヌクレアーゼを添加し、適切な条件下で反応する。
その結果、ハイブリダイゼーションの生じなかった標識
化ターゲット核酸８６Ｃは分解される（８Ｅ）。続い
て、反応部８５内の容器をフローさせ、分解された核酸
を除去し（８Ｇ）、蛍光強度を検出する（８Ｈ）。

【００７９】本態様により使用されるヌクレオチドプロ
テクションアッセイの詳細な条件は、実施者によって、
適宜決定されればよい。

【００８０】ここに示した態様では、ターゲット核酸の
伸長および標識化から、ヌクレアーゼプロテクションア
ッセイまでを連続して行う例を示したが、これに限るも
のではなく、上述したターゲット核酸の伸長および標識
化により得られた更なる伸長され標識されたターゲット
核酸を、ヌクレアーゼプロテクションアッセイのための
１本鎖標識化ターゲット核酸として予め作成し、所望に
応じてヌクレアーゼプロテクションアッセイに使用して
もよい。

【００８１】キャピラリー形状の反応容器を用いる場合
の利点の１は、各種溶液を置換するだけで分注および洗
浄方法から測定までの処理を自動化できる可能性が大き
いことである。また、キャピラリー形状の反応容器の場
合、そこに含まれる溶液を容易に置換することが可能で
あることも更なる利点である。

【００８２】上述したような本発明の態様によって得ら
れた標識化ターゲット核酸を用いれば、ヌクレアーゼプ
ロテクションアッセイは次のような利点を得ることが可
能である。即ち、ターゲット核酸を予め蛍光ラベルして
おけるのでハイブリダイゼーション前のターゲット核酸
の固相量を予め知ることが可能である。即ち、ターゲッ
ト核酸の固相の量や点着スポットの状態を反応前に知る
ことが可能である。従って、ターゲット核酸の固相の精
度管理が可能である。また、試料としてｍＲＮＡを用い
る場合には、従来の方法とは異なり、これを直接にハイ
ブリダイゼーション反応させることが可能であるので、
逆転写酵素でｃＤＮＡを作製したり標識化するなどの作
業により生じる効率のロスを避ることが出来る。

【００８３】

【発明の効果】本発明の態様に従うと、効率のよい遺伝
子発現頻度解析方法が提供される。また、複数のプレー
ト間での比較が可能な遺伝子発現頻度解析方法が提供さ
れる。

【００８４】本発明の態様に従うと、反応容器内で、検
出するべき標的配列を含むプローブ核酸とハイブリダイ
ゼーションしたターゲット核酸についてのみ選択的に標
識化することが可能である。従って、効率のよい遺伝子
発現頻度解析が可能であると共に、ターゲット核酸の標
識化を効率的に行うことも可能である。

【００８５】本発明の態様に従うと、遺伝子の発現頻度
の解析を、煩雑な操作を必要とせずに行うことが可能で
ある。

【００８６】本発明の態様に従うと、標識化から発現頻
度解析までの全ての処理を１つの容器内で一括して行う
ことが可能である。

【００８７】本発明に従う遺伝子の発現頻度の解析は、
従来の解析方法のような競合反応ではないので、他検体
との反応容器間(例えば、キャピラリー間や、プレート
間など)の比較が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の１態様に従って使用される反応容器の
例を示す図。

【図２】本発明の１態様に従う方法の例を模式的に示す
図。

【図３】本発明の１態様に従う方法の例を模式的に示す
図。

【図４】本発明の１態様に従う方法の例を模式的に示す
図。

【図５】本発明の１態様に従い使用されるターゲット核
酸およびプローブ核酸の例を模式的に示す図。

【図６】Ｓ１ヌクレアーゼによる核酸分解の例を模式的
に示す図。

【図７】ヌクレアーゼプロテクションアッセイの原理を
模式的に示す図。

【図８】本発明の１態様に従う方法の１例を模式的に示
す図。

【符号の説明】

１．反応容器２．反応部３．ターゲット核酸
４．開口部５．ポリイミド薄膜６．ヒーター
７．温度センサー２１．プローブ核酸２２．ターゲット核酸２３．標識化基質核酸２
４．反応部の底面２５．反応部２６伸長され標識されたターゲット核
酸３１．プローブ核酸３２．ターゲット核酸
３３．標識化基質核酸３４．反応部の底面３５．反応部３６．伸長され標識されたターゲット
核酸４１．プローブ核酸４２．ターゲット核酸
４３．標識化基質核酸４４．反応部の底面
４５．反応部４６．伸長され標識されたターゲット
核酸５１．ターゲット核酸５２．反応部の底面
５３．プローブ核酸５４．第１の標識化基質核
酸５５．第２の標識化基質核酸

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】対象における遺伝子の発現頻度を解析す
る方法であって、以下の工程を具備する方法；（１）前記対象に由来する被検核酸を得る工程と、
（２）標的配列に相補的な配列を含み、且つその５’末
端を介して固相化されているターゲット核酸に対して、
前記被検核酸を反応させる工程と、（３）検出可能な信
号を生ずる標識物質を付された標識化基質核酸と、前記
標識化基質核酸の塩基とは異なる種類の塩基を含む少な
くとも１の非標識化基質核酸と、ポリメラーゼとを用い
て、前記（２）の工程で得られたターゲット核酸に対し
てハイブリダイズした標的配列とその標的配列よりも
５’側に更なる配列を含むプローブ核酸の前記更なる配
列の部分を鋳型とし、ターゲット核酸の３’末端を伸長
する工程と、（４）前記（３）において得られた伸長さ
れたターゲット核酸に含まれる標識物質からの信号を検
出することによって、対象における遺伝子の発現頻度を
解析する工程。
【請求項２】前記被検核酸がｍＲＮＡ断片であり、前
記ターゲット核酸がポリヌクレオチドであり、前記標識
物質が蛍光物質であり、且つ前記基質核酸がジデオキシ
ヌクレオチド三リン酸であることを特徴とする請求項１
に記載の対象における遺伝子の発現頻度を解析する方
法。
【請求項３】請求項２に記載の対象における遺伝子の
発現頻度を解析する方法であって、前記（３）の伸長す
る工程が、次の群より選択されることによってその伸長
が停止されることを特徴とする方法；（ａ）前記非標識基質核酸のうち、前記ターゲット核酸
の伸長を停止したい部位に対応するプローブ核酸の塩基
に相補的な塩基を含む非標識化基質核酸を、ジデオキシ
ヌクレオチドとすることにより、前記伸長を停止するこ
と、（ｂ）前記非標識基質核酸のうち、前記ターゲット
核酸の伸長を停止したい部位に対応するプローブ核酸の
塩基に相補的な塩基を含む非標識化基質核酸を、前記
（３）の伸長する工程において存在させないことによ
り、前記伸長を停止すること。
【請求項４】対象における遺伝子の発現頻度を解析す
る方法であって、以下の工程を具備する方法；（１）前記対象に由来する第１の被検核酸および第２の
被検核酸を得る工程と、（２）第１の標的配列に相補的
な配列を含み且つその５’末端を介して固相化されてい
るターゲット核酸に対して、第１の被検核酸を反応させ
る工程と、（３）検出可能な第１の信号を生ずる標識物
質を付された標識化基質核酸と、前記標識化基質核酸の
塩基とは異なる種類の塩基を含む少なくとも１の非標識
化基質核酸と、ポリメラーゼとを用いて、前記（２）の
工程で得られたターゲット核酸に対してハイブリダイズ
した標的配列とその標的配列よりも５’側に更なる配列
を含む第１のプローブ核酸の前記更なる配列の部分を鋳
型とし、ターゲット核酸の３’末端を伸長し、第２の標
的配列を含むターゲット核酸を得る工程と、（４）前記
（３）で得られた第２の標的配列を含むターゲット核酸
にハイブリダイズしている第１のプローブ核酸を解離さ
せる工程と、（５）（４）で得られた第２の標的配列を
含むターゲット核酸に、第２の被検核酸を反応させる工
程と、（６）検出可能な第２の信号を生ずる標識物質を
付された標識化基質核酸と、前記標識化基質核酸の塩基
とは異なる種類の塩基を含む少なくとも１の非標識化基
質核酸と、ポリメラーゼとを用いて、前記（５）の工程
で得られた第２の標的配列を含むターゲット核酸にハイ
ブリダイズした標的配列とその標的配列よりも５’側に
更なる配列を含む第２のプローブ核酸を鋳型とし、第２
の標的配列を含むターゲット核酸の３’末端を伸長する
工程と、（７）前記（６）において得られた伸長された
ターゲット核酸に含まれる標識物質からの第１および／
または第２の信号を検出することによって、対象におけ
る遺伝子の発現頻度を解析する工程。
【請求項５】前記被検核酸がｍＲＮＡ断片であり、前
記ターゲット核酸がポリヌクレオチドであり、前記標識
物質が蛍光物質であり、且つ前記基質核酸がジデオキシ
ヌクレオチド三リン酸であることを特徴とする請求項４
に記載の対象における遺伝子の発現頻度を解析する方
法。
【請求項６】請求項５に記載の対象における遺伝子の
発現頻度を解析する方法であって、前記（３）の伸長す
る工程が、次の群より選択されることによってその伸長
が停止されることを特徴とする方法；（ａ）前記非標識基質核酸のうち、前記ターゲット核酸
の伸長を停止したい部位に対応するプローブ核酸の塩基
に相補的な塩基を含む非標識化基質核酸を、ジデオキシ
ヌクレオチド三リン酸とすることにより、前記伸長を停
止すること、（ｂ）前記非標識基質核酸のうち、前記タ
ーゲット核酸の伸長を停止したい部位に対応するプロー
ブ核酸の塩基に相補的な塩基を含む非標識化基質核酸
を、前記（３）の伸長する工程において存在させないこ
とにより、前記伸長を停止すること。
【請求項７】前記標的配列が１０から１５塩基のポリ
ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１から６の
何れか１項に記載の細胞における遺伝子の発現頻度を検
出する方法方法。
【請求項８】前記ターゲット核酸がそこにおいて核酸
について反応を行うことが可能な反応容器の内壁に固相
化されていることを特徴とする請求項１から７の何れか
１項に記載の対象における遺伝子の発現頻度を解析する
方法。
【請求項９】前記反応容器の容器内部の形状がキャピ
ラリー形状であることを特徴とする請求項８記載の対象
における遺伝子の発現頻度を解析する方法。
【請求項１０】以下の工程により得られる標識された
ターゲット核酸；（１）前記対象に由来する被検核酸を得る工程と、
（２）標的配列に相補的な配列を含み、且つその５’末
端を介して固相化されているターゲット核酸に対して、
前記被検核酸を反応させる工程と、（３）検出可能な信
号を生ずる標識物質を付された標識化基質核酸と、前記
標識化基質核酸の塩基とは異なる種類の塩基を含む少な
くとも１の非標識化基質核酸と、ポリメラーゼとを用い
て、前記（２）の工程で得られたターゲット核酸に対し
てハイブリダイズした標的配列とその標的配列よりも
５’側に更なる配列を含むプローブ核酸の前記更なる配
列の部分を鋳型とし、ターゲット核酸の３’末端を伸長
する工程と、（４）前記（３）で得られた２本鎖からプ
ローブ核酸を解離させることによって標識されたターゲ
ット核酸を得る工程。
【請求項１１】以下の工程により得られる標識された
ターゲット核酸；（１）前記対象に由来する第１の被検
核酸および第２の被検核酸を得る工程と、（２）第１の
標的配列に相補的な配列を含み且つその５’末端を介し
て固相化されているターゲット核酸に対して、第１の被
検核酸を反応させる工程と、（３）検出可能な第１の信
号を生ずる標識物質を付された標識化基質核酸と、前記
標識化基質核酸の塩基とは異なる種類の塩基を含む少な
くとも１の非標識化基質核酸と、ポリメラーゼとを用い
て、前記（２）の工程で得られたターゲット核酸に対し
てハイブリダイズした標的配列とその標的配列よりも
５’側に更なる配列を含む第１のプローブ核酸の前記更
なる配列の部分を鋳型とし、ターゲット核酸の３’末端
を伸長し、第２の標的配列を含むターゲット核酸を得る
工程と、（４）前記（３）で得られた第２の標的配列を
含むターゲット核酸にハイブリダイズしている第１のプ
ローブ核酸を解離させる工程と、（５）（４）で得られ
た第２の標的配列を含むターゲット核酸に、第２の被検
核酸を反応させる工程と、（６）検出可能な第２の信号
を生ずる標識物質を付された標識化基質核酸と、前記標
識化基質核酸の塩基とは異なる種類の塩基を含む少なく
とも１の非標識化基質核酸と、ポリメラーゼとを用い
て、前記（５）の工程で得られた第２の標的配列を含む
ターゲット核酸にハイブリダイズした標的配列とその標
的配列よりも５’側に更なる配列を含む第２のプローブ
核酸を鋳型とし、第２の標的配列を含むターゲット核酸
の３’末端を伸長する工程と、（７）前記（６）で得ら
れた２本鎖から第２のプローブ核酸を解離させることに
よって標識されたターゲット核酸を得る工程。