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JP2003501012A - ボツリヌス菌毒素ｂ及び破傷風菌神経毒素の特異的阻害剤及び治療薬としてのプレビン類 - Google Patents

ボツリヌス菌毒素ｂ及び破傷風菌神経毒素の特異的阻害剤及び治療薬としてのプレビン類

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JP2003501012A
JP2003501012A JP2000618307A JP2000618307A JP2003501012A JP 2003501012 A JP2003501012 A JP 2003501012A JP 2000618307 A JP2000618307 A JP 2000618307A JP 2000618307 A JP2000618307 A JP 2000618307A JP 2003501012 A JP2003501012 A JP 2003501012A
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JP
Japan
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amino acid
polar
proline
glutamine
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Withdrawn
Application number
JP2000618307A
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Inventor
ゴードン，リチャード，ケー
ムーラッド，デボラ，アール
ドクトル，ブペンドラ，ピー
ガルシア，グレゴリー，イー
Original Assignee
デパートメント オブ ジ アーミー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by デパートメント オブ ジ アーミー filed Critical デパートメント オブ ジ アーミー
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Abstract

(57)【要約】 本発明の化合物は、一般に式（１）：B1Z*2B3Z*4X*5Q6F7X8X9X10X11、（２）B1X2X3X4X5Q6F7X8X9X10X11、又は（３）B1X2B3X4Z5Q6F7Z8X9X10X11（３）で記載され、及び、その塩類、エステル類、アミド類、及びアシル化形態である。１つの文字で表された各位置は、１つのアミノ酸残基を示し、その中で、Bは塩基性の、又は極性の／大きいアミノ酸，又はその修飾された形態；Ｘは、小さい又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態；Ｘ*は、小さい又は極性の／大きなアミノ酸、又はその修飾された形態；Ｚは、極性の／大きい、又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態；Ｚ*は、プロリン又は極性の／大きい又は疎水性のアミノ酸、又は、その修飾された形態である。以下に説明するように、アミノ酸残基の間で１つ又はそれ以上のペプチド結合が擬似ペプチド結合で置き換えられてもよい。これらの化合物は、ボツリヌス菌毒素Ｂ及び破傷風菌毒素のプロテアーゼ活性を阻害するために最適化される化合物を創生する分子構築ブロックとして使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 政府関与の承認 本発明は、米国陸軍の被雇用者によりなされた。米国政府はこの発明の権利を
所有する。
【０００２】 技術分野 本発明は、ボツリヌス菌毒素B及び破傷風菌神経毒素の酵素活性を阻害する、
且つ、ボツリヌス菌毒素B及び破傷風菌神経毒素の酵素活性を阻害するように最
適化される化合物を創生するための分子構築ブロックとして使用することができ
る、一種のペプチド及びペプチド様化合物、「プレビン類」に関する。
【０００３】 発明の背景 ボツリヌス菌毒素類(Bttxs)は動物に対する最も強力な毒素に含まれ、例えば
二十日ねずみにおけるLD50は1ng/kgである。Bttxsは７つの異なる血清タイプ（A
−G）の集まりからなる。Bttxsは１００キロダル神経細胞照準重鎖及び５０キロ
ダルの末端蛋白質活性軽鎖からなる２つのサブユニットから構成される。これら
の毒素はZn−メタロプロテアーゼであり、Zn−蛋白質結合モチーフHEXXHを含む
。
【０００４】 しかしながら、酵素阻害剤に変換するアンジオテンシン、カプトプリル、及び
フォスフォラミドンのようなZn−メタロプロテアーゼ阻害剤はBttxsの効果的阻
害剤ではない。亜鉛キレート剤類は体外でBttxプロテアーゼ活性を阻害するが、
体内及び完全な神経及び筋肉細胞及び／又は組織を備えた組織調製においては、
単にBttxプロテアーゼ活性を遅延させるだけである。更に、ある亜鉛キレート剤
はBttxプロテアーゼ活性の遅延に要する濃度において有毒である。ジチオカルバ
メート類は、SODのような他の亜鉛含有蛋白質を阻害するが、Bttx血清タイプB（
BttxB）には効果がない。明らかに、BttxBなど、これら種々のBttx血清タイプの
阻害剤は必要である。
【０００５】 BttxBは、特に、グルタミン７６及びフェニルアラニン７７（QF結合又は分裂
サイト）との間でシナプトブレビン(VAMP2)を裂く。最小長基質を生成する努力
によって示されるように体内ターゲットVAMP2の為の比較的長い基質のための義
務的要求がある。VAMP2の３０個のアミノ酸が要求され、VAMP2の４０個のアミノ
酸が最適分裂のために要求されることが示された。Shone, C. C.他(1993) Eur.
J. Biochem. 217:965−971参照。VAMP2から誘導されるペプチド、V2は分裂位置
から上流の４残基に位置する１０アミノ酸配列であり、Bttx活性を阻害すること
が見出された。Pellizzari R.他(1996) J. Biol. Chem. 271:20353−20358参照
。VAMP2において、C末端アミノ酸の変異は殆ど影響しない。へリックスを乱す置
換であるAlaをProに置換するとBttxB活性は２８％まで阻害される。更に、幾つ
かのマイナスに荷電したアミノ酸の置換は、ほぼ完全な不活性をもたらす。Whit
come, M他(1996) FEBS Let. 386:133−136参照。
【０００６】 VAMP2のコンピュータ支援の二次構造分析は、分裂サイトQFを側面に位置して
いるα螺旋構造の２つの伸びを予測した。Witcome, M. R他(1996) FEBS Let. 38
6:133−136参照。コンピュータ支援の三次構造分析は、この２つの螺旋は逆の回
転で分離した螺旋でへリックス束のスーパー二次構造を形成することに自己関連
可能であることを示す。Lebeda F.J.他(1996) Med. Defense Biosci. Rev. 204
参照。
【０００７】 上記の結果は、毒素が基質分裂するために丁度QF結合より多くを認識する必要
があることを示す。
【０００８】 我々は、先に、特徴的なコンフォーメーションであるOQ結合を有し、BttxBプ
ロテアーゼ活性を阻害する新種の化合物であるブフォリニンについて記載してい
る。
【０００９】 しかしながら、我々は、最近、これらのブフォリニン類に存在するコア構造及
び基礎構造として働くと思われる物質Ｐとして例示されたコア構造、またはBttx
B及びTttxプロテアーゼ活性を阻害する化合物の分子構築ブロックを解明した。
これらのコア配列はBttxB及びTttxプロテアーゼ活性を阻害する化合物の基本構
造で有り得る。これらのコア配列及びその用途が、以下に記載される。
【００１０】 発明の概要 本発明は、内部QF結合と、BttxBプロテアーゼ活性を阻害能を有する「プレビ
ン」と呼ばれるコア構造に向けられている。破傷風菌毒素開裂サイトはBttxBと
同じなので、これらのコア構造は、競合的に破傷風菌プロテアーゼ活性を阻害す
る化合物のコア構造としても働くことができる。
【００１１】 このように、一観点において、本発明は、式（１）、（２）及び（３）： B1Z*2B3Z*4X*5Q6F7X8X9X10X11（１）、 B1X2X3X4X5Q6F7X8X9X10X11（２）、又は B1X2B3X4Z5Q6F7Z8X9X10X11（３） の構造を有する化合物、及び、その塩類、エステル類、アミド類、及びアシル化
物に関する。１つの文字で表された各位置は、１つのアミノ酸残基を示し、その
中で、Bは塩基性の、又は極性の／大きいアミノ酸，又はその修飾された形態；
Ｘは、小さい又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態；Ｘ*は、小さい
又は極性の／大きなアミノ酸、又はその修飾された形態；Ｚは、極性の／大きい
、又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態である；Ｚ*は、プロリン又
は極性の／大きい又は疎水性のアミノ酸、又は、その修飾された形態である。以
下に説明するように、アミノ酸残基の間で１つ又はそれ以上のペプチド結合が擬
似ペプチド結合で置き換えられてもよい。
【００１２】 他の観点において、本発明は、本発明のペプチドを製造するのに有用な遺伝子
でコードされたアミノ酸含有組替え物質に向けられている。同様に、これらのペ
プチドの生産のための発現システムを含むように改良された植物又は動物に向け
られている。本発明は、更に、これらの組替え物質を調製し、操作する方法を包
含する。
【００１３】 加えて、本発明は、活性成分として本発明のコア構造を含む化合物を含有する
医薬組成物に、及び、これらのペプチド類を製造する為の発現システムを含む組
成物に向けられている。本発明は、合成的に本発明のコア構造を含む化合物を製
造する方法、これらの化合物に特異的な抗体、及び保健薬、治療薬、予防薬とし
てのこれらの化合物の用途に向けられている。
【００１４】 本発明は、選択的阻害を用いてBttxB及びTttxを検出するため、及び、与えら
れた毒素の為の阻害剤及び基質を検出するための分析における本発明のコア構造
を含む化合物の使用にも向けられている。
【００１５】 本発明は、更に破傷風菌神経毒素の酵素活性を阻害するための素材、組成物、
キット、及び方法に関する。
【００１６】 本発明は、更にボツリヌス菌毒素B及び破傷風菌中毒等の毒による中毒を防ぎ
又は処置するための素材、組成物、キット、及び方法に関する。このキットは単
一の又は複数の薬量を提供でき、操作に必要な取扱い説明書、溶液、及び組成物
など、他の従来の付属物質を含むことができる。これら組成物及び溶液は試験管
、その他の容器に入れられる。容器は虫や蛇に噛まれたときに使用されるキット
と同様であっても良く、別々の部屋に収められた、本発明のコア構造を含む化合
物とTCEPを供給する注射器を含む。
【００１７】 ある試料が本発明のコア構造を含む化合物を含むかどうか、その化合物の量又
はその化合物のタイプを決定するためのキットは、そのコア構造のための免疫特
異性抗体を含むことができる。
【００１８】 ある試料がボツリヌス菌毒素又はその種のボツリヌス菌毒素を含むかどうかを
決定するキットは、ボツリヌス菌毒素と相互関係を有する少なくとも１つのその
コア構造を含む化合物のための免疫特異性抗体を含むことができる。同様に、あ
る試料が破傷風菌毒素を含むかどうかを決定するキットは、破傷風菌毒素と相互
関係を有する少なくとも１つの本発明のコア構造を含む化合物のための免疫特異
性抗体を含むだろう。
【００１９】 他の実施態様はボツリヌス菌B及び／又は破傷風菌毒素の汚染除去と関連付け
られた１つ以上の公知のペプチド阻害剤を伴うブフォリンIを含む。加えて、そ
のキットは、解毒のために食品又は傷に散布するための、本発明のコア構造を含
む化合物を含む安定なペプチド混合物又は粉末を含んでいてもよい。
【００２０】 更に他の実施態様において、BttxB及びTttxプロテアーゼ活性阻害のために最
適化された化合物を構築する分子構築ブロックとして本発明の化合物を使用する
ことを含む。
【００２１】 発明の詳細な説明 BttxB阻害剤の検索において、我々は、QF分裂サイトを含むがQF開裂サイトを
含むが、QFサイトを取り囲む主配列がVAMP2と同一でないペプチドを研究した。Q
F結合を含む１１個のアミノ酸のペプチドである物質PはBttxBの基質ではない。
実施例１及び２、並びに図１を参照。この結果は、好ましい螺旋−回転−螺旋及
び／又は長い基質仮説を支持する。
【００２２】 ブフォリンI（B−I）はアジアヒキガエルBufo bufo gargarizansの胃から単離
されたペプチドであり、QF結合を持つ。従って、我々は、B−Iが基質であるか、
BttxBプロテアーゼ活性阻害剤であるかを決定する為にエンドぺプチアーゼ分析
を用いた。B−IはBttxBの基質ではないこと、及び、B−Iは薬量依存的に及び競
合的にBttxB活性を阻害することを見出した。図２及び図３参照。阻害の範囲はI
C50 = 1 x 10−6 Mを与えた。図４参照。これは、B−IがVAMP2 55−94と保全ア
ミノ酸のたった１８％相同性であるので、驚くべき結果であった。表１参照。
【００２３】
【表１】
【００２４】 我々は、次いで、先端を切断したB−Iペプチドを我々のエンドペプチダーゼ活
性分析で評価した。我々の評価した先端切断ペプチド類は、B−Iのアミノ酸１−
３６を含むペプチド３６とB−Iのアミノ酸１６−３９を含むペプチド２４である
。B−Iと同様に、これらの先端切断ペプチド類はBttxBの基質ではない。しかし
ながら、これらの先端切断ペプチド類はBttxB活性の阻害剤としてはB−Iと比べ
てより効果が少ない。図２参照。ペプチド３６はB−Iと比べて有効性は約５０％
であった。ペプチド２４はB−Iと比べて有効性は約２５％であった。我々は、B
−Iのアミノ酸１６−３６を含むブフォリンII（B−II）も又評価し、B−Iと比べ
て有効性が２５％であると分かった。
【００２５】 B−Iはヒキガエルのヒストン蛋白質２A（H2A）から誘導され、トリH2Aの配列
とほぼ同一である。表２及びPark, C.B.他(1996) Biochem. Biophys. Res. Comm
. 218:408−413参照。表２Bは、物質PとブフォリンIIとの間で関連のあるアミノ
酸比較を示す。ニワトリ・ヒストン蛋白質粒子のＸ線結晶分析はK１５からY３９
の領域でQFサイトの上流及び下流に螺旋のあることを示す。図５及びArents, G.
他(1991) PNAS 88:10148−52及びWang, S. W.他(1985) Nucleic Acids Res. 13:
1369−138.参照。また、B−IIのNMR解析はQFサイトから上流の領域がα−へリッ
クスを形成できたことを示す。Yi,他(1996) FEBS Lett. 398:87−90参照。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【００２８】 これらの結果は、長いブフォリニン類が類似のへリックス・バンドリングで逆
回転したスーパー二次構造を形成する能力があることを示す。表３参照。従って
、我々は、BttxBプロテアーゼ活性を競合的に阻害する、ブフォリンI（３９個の
アミノ酸）、ブフォリンII（２１個のアミノ酸）、ペプチド３６及びペプチド２
４、及びQF結合を有する他の相似ペプチド類を含むブフォリニン類のような化合
物を構築するために用いられる新種のペプチド、「プレビン類」を定義した。
【００２９】
【表３】
【００３０】 これらのプレビン類又はコア構造は一般的に式： B1Z*2B3Z*4X*5Q6F7X8X9X10X11（１）、 B1X2X3X4X5Q6F7X8X9X10X11（２）、又は B1X2B3X4Z5Q6F7Z8X9X10X11（３） の化合物、及び、その塩類、エステル類、アミド類、及びアシル化形態に関する
。１つの文字で表された各位置は、１つのアミノ酸残基を示し、その中で、Bは
塩基性の、又は極性の／大きいアミノ酸，又はその修飾された形態；Ｘは、小さ
い又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態；Ｘ*は、小さい又は極性の
／大きなアミノ酸、又はその修飾された形態；Ｚは、極性の／大きい、又は疎水
性のアミノ酸、又はその修飾された形態；Ｚ*は、プロリン又は極性の／大きい
又は疎水性のアミノ酸、又は、その修飾された形態である。以下に説明するよう
に、アミノ酸残基の間で１つ又はそれ以上のペプチド結合が擬似ペプチド結合で
置き換えられてもよい。
【００３１】 本発明の化合物は、式（１）、（２）及び（３）で表されるコア構造を含むも
のである。
【００３２】 このペプチドのアミノ末端は遊離形態であっても、式RCO−の基でアシル化さ
れていてもよい。式においてRは１−６Cのハイドロカルビル基を表す。ハイドロ
カルビル基は飽和又は不飽和のものであり、典型的には、例えばメチル、エチル
、i−プロピル、t−ブチル、n−ペンチル、シクロへキシル、シクロヘキセン−
２−イル、ヘキセン−３−イル、へキシン−４−イルなどである。
【００３３】 本発明のペプチドのC−末端は、遊離酸として又は受け容れ可能な塩、例えば
カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、その他の無機イオンの塩、
又はカフェインのような有機イオンの塩として、誘導されないカルボキシル基の
形態であってよい。カルボキシル末端は式ROHで表わされるアルコールのエステ
ル形成で誘導されていても良く、式NH3、又はRNH2又はR2NHのアミンでアミド化
されていても良い。ここで、各Rは独立的に上記の１−６Cのハイドロカルビル基
である。C−末端が式CONH2であるこれらペプチド類のアミド化された形態は好ま
しい。
【００３４】 本発明のペプチド類は、酸添加塩の形態で供給されてもよい。典型的な酸添加
塩は塩化物、臭化物、沃化物、弗化物など、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無
機イオンのものであり、また、アセテート、フォーメート、ベンゾエートなどの
有機陰イオンの塩であっても良い。これらの塩のそれぞれの受け容れ可能性は目
的とする用途に依存し、普通に理解される。
【００３５】 本発明のペプチドにおけるアミノ酸は遺伝子又はそのアナローグによりコード
化され得るペプチド、及び、それらのD−異性体であってもよい。好ましい態様
は、式（１）、（２）又は（３）のコア構造を含む化合物であり、少なくともい
くつかの残基がD−コンフィギュレーションを有することにより、プロテアーゼ
活性に抵抗し、且つBttxBプロテアーゼ活性を阻害する能力を保持する化合物で
ある。
【００３６】 ここで用いられるアミノ酸の命名は従来通りであり、次の通りである：
【００３７】 本発明の化合物は指定されたクラスのアミノ酸残基で部分的に定義されたペプ
チド又はペプチド様化合物である。アミノ酸残基は次の通り、通常、主要なサブ
クラスにサブクラス分けできる： 酸性：この残基は、生理的pHにおいてHイオンを失うことで、マイナスのチャ
ージを有する。この残基は、これを含むペプチドが生理的ｐＨの水性媒体中にあ
るとき、水溶液によって引きつけられ、そのペプチドのコンフォーメーションに
おいて、表面位置を求める。
【００３８】 塩基性：この残基は、生理的pHにおいて、又は、その１つ又は２つのpH単位（
例えばヒスチジン）内で、Hイオンと会合することによりプラスのチャージを有
する。この残基は、これを含むペプチドが生理的ｐＨの水性媒体中にあるとき、
水溶液によって引きつけられ、そのペプチドのコンフォーメーションにおいて、
表面位置を求める。
【００３９】 疎水性：この残基は、生理的ｐＨにおいてチャージされていない。しかし、こ
の残基は、これを含むペプチドが水性媒体中にあるとき、そのペプチドの形態で
、水溶液によって撥ね返され、内側位置を求める。
【００４０】 中性／極性：この残基は生理的ｐＨでチャージされないが、水溶液によって十
分には撥ね返されないので、これを含むペプチドが水性媒体中にあるとき、その
ペプチドの形態で、内側の位置を求めるだろう。
【００４１】 この説明では、特定のアミノ酸を、それらの側鎖にたとえ極性基がなくても、
疎水性を授けるのに充分には大きくないゆえに、「小さい」と特徴づける。「小
さい」アミノ酸は、側鎖に少なくとも１つの極性基がある場合は、炭素数４つ以
下のものであり、無い場合には炭素数３つ以下のものである。
【００４２】 個々の残基分子の統計上の収集において、幾つかの分子はチャージされ、幾つ
かはチャージされず、水性媒体により大きく又は小さく引付けられたり反発され
たりするだろうことは当然理解される。「チャージされ」の定義に適合させるに
は、独自の分子のかなりのパーセンテージ（少なくともほぼ２５%）がその適切
なｐＨでチャージされる。極性又は非極性と分類するために必要な吸引力又は反
発力の程度は任意である。従って、本発明で特に取上げられるアミノ酸はどちら
か一方に分類された。特に名付けられていない大部分のアミノ酸は、既知の挙動
を基礎として分類できる。
【００４３】 アミノ酸残基は、更に、環状、非環状、芳香族、非芳香族、その残基の側鎖の
置換基に関連した自己説明的分類、及び、大きい又は小さいとしてサブクラス分
けできる。この残基は、もしそれがカルボキシル炭素も含めて全炭素数が４個以
下で、極性置換基が存在すると、小さいと考えられ、もし存在しないなら３個以
下が小さいと考えられる。小さい残基は当然常に非芳香族である。
【００４４】 天然に発生する蛋白質アミノ酸の前記表に従うサブ分類は、次の通りである。
【００４５】 遺伝子−コード化された二次アミノ酸プロリンは、ペプチド・チェーンの二次
コンフォーメーションにおける周知の影響、即ち、螺旋構造分裂による特例であ
る。従って、プロリンは位置２６において許されるだけである。その位置では、
プロリンはQF開裂サイトの両側で見出される螺旋構造を分裂させて、螺旋−回転
−螺旋構造をプロモートするのを助けるであろう。
【００４６】 システインは小さなアミノ酸である。一般に、VAMP2基質、B−I、B−II、ペプ
チド２４、ペプチド３６においてステイン又はメチオニンは存在しない。システ
インの側鎖はいくぶん疎水性であるが、非常に反応性が高い。硫黄成分は他のシ
ステインの硫黄と反応する能力がありシスチン或はジサルファイド結合を生成す
る。システインは、二次構造におけるその関与を妨げる様に修飾できる。加えて
、システイン式（１）、（２）又は（３）の化合物中でスペーサ・アンカーとし
て用いてもよい。更に、蛍光マーカーでコア構造をラベルするため反応サイトと
して用いるためにシステインを取込むことは、有利である。
【００４７】 これらのコア構造に含まれてもよい「修飾された」アミノ酸は、遺伝子翻訳の
後、例えばメチル基の付加、他の置換基への共有結合による誘導体形成、酸化又
は還元、或は他の共有結合による修飾により処理された遺伝子−コード化された
アミノ酸である。その結果生じる修飾されたアミノ酸を先の分類に入れるには、
修飾された形態の特徴で決定してよい。例えば、リジンはそのアミノ基がアシル
化で修飾されると、修飾された形態は塩基性としてではなく、極性の／大きいア
ミノ酸として分類される。
【００４８】 通常よく現れるアミノ酸で、遺伝コードでコード化されないものとして、例え
ば、ベータ−アラニン（beta−Ala）又は他のオメガ−アミノ酸が含まれ、例え
ば３−アミノプロピオン酸、２,３−ジアミノアミノプロピオン酸(２,３−diaP)
、４−アミノ酪酸など、アルファアミノイソ酪酸(Aib)、サルコシン(Sar)、オル
ニチン(Orn)、シツルリン(Cit)、t−ブチルアラニン(t−BuA)、t−ブチルグリシ
ン(t−BuG)、N−メチルイソロイシン(N−MeIle)、フェニルグリシン(Phg)、シク
ロヘキシルアラニン(Cha)、ノルロイシン(Nle)、２−ナフチルアラニン(２−Nal
)；１,２,３,４−テトラハイドロイソキノリン−３−カルボン酸(Tic)；３−２
−チエニルアラニン(Thi)；メチオニン・スルフォキシド(MSO)；及びホモアルギ
ニン(Har)がある。これらも、便宜的に特定のカテゴリーに分類される。
【００４９】 上記定義に基いて、 Sar、beta−Ala及びAib は小さい； t−BuA、t−BuG、N−MeIle、Nle、Mvl、Cha、Phg、Nal、Thi及びTicは疎水性
； ２,３−diaP、Orn及びHarは塩基性； Cit、Acetyl Lys及びMSOは中性/極性/大きい。
【００５０】 多種類のオメガアミノ酸は、サイズが小さい（beta−Ala及び３−アミノプロ
ピオン酸）と分類され、或は、大きい及び疎水性（他の全て）と分類される。
【００５１】 他のアミノ酸置換体で、遺伝子コード化されないものは、本発明の範囲内のペ
プチド化合物に含まれて、それらの構造によって、この一般分類の範囲内で分類
される。例えば、D−アミノ酸置換体は、特に経口投薬ルートにとって重要な内
生的プロテアーゼ活性故に潜在する安定性問題を迂回するために望ましい。
【００５２】 本発明の全ての化合物において、１以上のアミド結合（−CO−NH）は他の等価
な結合、例えばCH2NH−、−CH2S−、−CH2CH2、−CH=CH−（シス及びトランス）
、−COCH2−、−CH（OH）CH2−及び−CH2SO−で適宜置き換えられて良い。この
置き換えは、当業界で知られている方法により行うことができる。以下の参考文
献は、互換的結合部位を含むペプチド・アナローグの調製が記載されている：Sp
atola, A. F、Vega Data (March 1983)、Vol. 1、Issue 3、「Peptide Backbone
Modifications」(general review)；Spatola, A. F.の「Chemistry and Bioche
mistry of Amino Acids Peptides and Proteins」 B. Weinstein、eds.、Marcel
Dekker、New York、p.267 (1983) (general review)；Morley, J. S.、Trends
Pharm Sci (1980) pp.463−468 (general review)；Hudson, D.他、Int J Pept
Prot Res (1979) 14:177−185 (−CH2NH−,−CH2CH2−)；Spatola, A. F.他、Li
fe Sci (1986) 38:1243−1249 (−CH2−S)；Hann, M. M.、J Chem Soc Perkin T
rans I (1982) 307−314 (−CH−CH−,cis及びtrans)；Almquist, R.G.他、J Me
d Chem (1980) 23:1392−1398 (−COCH2−)；Jennings−White, C.他、Tetrahed
ron Lett (1982) 23:2533 (−COCH2−)；Szelke, M.,他、European Application
EP45665 (1982) CA:97:39405 (1982) (−CH(OH)CH2−)；Holladay, M.W.他、Te
trahedron Lett (1983) 24:4401−4404 (−C(OH)CH2−)；及びHruby, V.J.、Lif
e Sci (1982) 31:189−199 (−CH2−S−)。
【００５３】 本発明の範囲内の典型的化合物は次の通りである：
【００５４】 式中、「−」はスペーサ分子であり、「Ｘ」はSEQ ID NO 1−12のQFサイトの
上流のアミノ酸配列と相同の適切なアミノ酸配列の全てである。
【００５５】 「活性な」化合物は、本発明のコア配列を含む化合物で、BttxB及び／又はTtt
xプロテアーゼ活性を阻害するものとして定義される。本発明の化合物のコンフ
ォーメーションは、円偏光二色性とFT−IRによって決定できる。CBnaves. J. M.
他(1998) J. Biol. Chem. 273:43214−34221参照。陽子ＮＭＲも又使用できる。
Yi G他(1996) FEBS Lett. 398:87−90参照。Ｘ線結晶学も又使用できる。Sutton
, R. B.他(1998) Nature 395,347−353参照。
【００５６】 「誘導体」は、本発明のコア配列を有し、既知の２１のアミノ酸（通常２０で
あるが、一般的ではない、天然に現れる遺伝子コードされないアミノ酸であるセ
レノシステインを含めて）以外の「非天然」アミノ酸を含むアミノ酸修飾、又は
、他の化学物質、ラベル又は蛋白質と結合する反応中心を与えるために末端にシ
ステイン及びリジンなどの付加を有する化合物として定義される。
【００５７】 式（１）、（２）又は（３）の化合物はBttxB又はTttxのプロテアーゼ活性を
阻害するために最適化される化合物の構築に用いることができる。最適化はQFサ
イトの上流での螺旋構造の形成をプロモートするアミノ酸を置換することにより
なされる。このような例は図７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドである
。
【００５８】 物質PはBttxBの弱い阻害剤である。これはQFサイトの下流にα螺旋構造を含む
。これはQFサイトの上流にα螺旋構造を有していない。コンピュータ・モデリン
グは物質Pと同じであるが、QFサイトの上流と下流にα螺旋を有している化合物
を構築するのに用いられている。このように、物質Pのような化合物は、強い阻
害剤であるブフォリニンよりも、強力な阻害剤を構築するための分子構築ブロッ
クとして利用できる。従って、物質Pは、本発明の化合物のコア構造と考えられ
る。
【００５９】 例えば、物質PはP2A、G3K、P4L、Q5Gの４置換により修飾されて、配列ＲAGLGQ
FFGLMを有する化合物を得ることができる。これらの置換はBttxBプロテアーゼ活
性を阻害するために要求される螺旋構造を生成すると予測される。Garcia他. J.
Applied Toxicology, in press参照。
【００６０】 他の実施態様において、B−Iにおけるチロシンの除去が阻害を減少するので、
チロシンの位置は重要である。QFサイトのF残基からチロシンを位置決め（〜２
１オングストローム）する目的でスペーサが物質P様分子構築ブロックにおいて
利用できた。。
【００６１】 適切なスペーサとして、ビス−マレイミドエタン（BMIE）８オングストローム
ス・スペーサ・アーム；１,４−ビス−マレイミドブタン（BMB）１０.９オング
ストロームス・スペーサ・アームが含まれる。Chen, L. L.他 J. Biol参照。
【００６２】 下記のように、B−I、VAMP２及びペプチド３６のTyrの位置には明らかな類似
性がある。
【００６３】 C−末端の３つのアミノ酸の削除はB−Iと比べて５０％BttxB阻害を減少させる
。Garcia他(1999) J Applied Toxicol. in press参照。これは、Tyr残基の位置
がこれらの化合物の阻害機能に重要であるだろうことを示す。
【００６４】 従って、QF開裂サイトから最適な距離をTyr又は他の疎水性アミノ酸で置き換
えて修飾することにより、物質P様分子構築ブロックから、BttxB阻害能を高めた
化合物を創生することができる。この距離はペプチド配列又は他の適切なスペー
サ分子によって与えられた。
【００６５】 例えば、QFサイトのQから約６オングストロームの位置にTyrがあるV２配列に
おいて、そのQFサイトの上流に組み込まれたスペーサは阻害を改良できた。Whit
come他(1996) FEBS Let. 386: 133-136 (ELDDRADALQ)参照。
【００６６】 スペーサは、望まれる距離に達するように個々の成分を架橋するために用いる
ことができる。このようなスペーサは望まれる繰返し及び長さの炭素鎖を含む。
炭素鎖スペーサは、それが分裂及び分解に対する抵抗性を与えるので有利である
。スペーサ及びスペーサの使用は当業界で知られている。例、Synthetic Peptid
es Ed. G. A. Gant、W. H. Freeman & Co. New York, NY, 1992参照。
【００６７】 これに代えて、QFサイトから適切な距離で活性基を導入するため、又は構造を
強化するためにアミノ酸残基を用いてもよい。例えば、Cysはジスルフィド・ル
ープのような特別な構造を持つように又は持たないように化合物を操作するのに
用いることができる。しかしながら、TCEPのような他の化合物の使用は、このよ
うに操作された構造に反作用する、即ちジスルフィド・ループが開かれる、かも
しれない。
【００６８】 このように、プレビン又は式（１）、（２）又は（３）のコア構造を、ブフォ
リニン様化合物又はBttxBプロテアーゼ活性を高度に阻害する他の物質を構築す
るために使用できる。
【００６９】 本発明化合物の調製 ここで「プレビン類」と頻繁に指定している本発明の化合物は、本質的に、コ
ア構造又は分子構築ブロックであり、N−又は C−末端で修飾されていてもよく
、BttxB又はTttxのプロテアーゼ活性を阻害する化合物を構築するために最適化
されていてもよい。
【００７０】 標準的方法が、サイズ及びコンフォーメーションがプレビンと同様のコア構造
を合成するのに用いられる。固相合成技術が、現在、最も一般に用いられ、実に
、ペプチド・チェーンを組織的に構築する自動装置を購入することができる。溶
液相合成も用いることができるが、便利さがかなり落ちる。これらの標準の技術
を使用して合成されると、遺伝子とD−エンアンチオマーによってコード化され
ないアミノ酸を合成で使用することができる。
【００７１】 N−及び／又はC−末端を従来の化学の技術で修飾することができる。本発明の
化合物は、アミノ末端で任意にアシル基又はアセチル基を含んでいてもよい。N
−末端遊離アミノ基のアセチル化、更に一般的にはアシル化方法は、一般に当業
界で知られている。
【００７２】 カルボキシ末端で、カルボキシル基は塩の形で存在していてもよい。製薬組成
物の場合、その塩は調剤上受け入れられる塩である。適切な塩は、NH4 +、Ｎａ＋ 、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋、などのような無機イオンで形成されるもの、及び
、カフェイン及び他の高度に置換したアミンような有機陽イオンで形成された塩
を含む。カルボキシ末端は、上記で定義されるように、Rがハイドロカルビル（
１−６C）である式ROHのアルコールを使用してエステル化されてもよい。同様に
、カルボキシ末端は、ここで定義されるように、アミド化されて式−CONH2、−C
ONHR、又は、−CONR2をもっていても良く、各Rは独立的にハイドロカルビル（１
−６C）である。エステル化とアミド化の技術は塩基の存在下に中和して塩を生
成するのと同様に全ての標準の有機化学の技術である。
【００７３】 本発明のコア構造が生理的状況の下で調製される場合、塩基性アミノ酸の側鎖
アミノ基は関連する酸付加塩の形態であるだろう。
【００７４】 ペプチド骨格が完全に遺伝子コードされたアミノ酸から成るか、又は、それの
若干の部分がそのように構成されるなら、そのペプチド又は関連部分は、ＤＮＡ
組換え技術を使用して合成されてもよい。本発明のコア構造をコードするDNAは
、従来の装置で固層DNA合成のような当業界で標準の技術を使用して合成しうる
。これには、フォスフォルアミダイト合成化学（Beaucage, S. L.他(1981) Tetr
ahedorn Lett. 22:1859−1862）を利用するABI 3948核酸合成システム（Perkin
Elmer Applied Biosystems、Foster City、CA）が含まれる。DNAオリゴマーは、
相補的配列にマッチするオーバーラップで合成される。これらの配列のアニール
化は、ダブルストランド合成遺伝子を形成する。このプロセスでの構築において
、必要な遺伝子が構築されるまで、より大きなそして、より大きなダブルストラ
ンド生成物を与えるだろう。また、DNA組換え手段は、本発明のコア構造、この
コア構造を含む化合物又はH2A蛋白質の同様のフラグメントのクローニング、次
にサイトに向けられた突然変異生成又はDNA−カセット置換、又は当業界の他の
手段（Methods Enzymology vol. 152；Eds. S. L. Berge及び A. R. Kimmel、Ac
ademic Press, Inc.、Orlando、FL、1998）による望まれる修飾を行うための修
飾に用いることができるだろう。コドン選択は、宿主の性質に依存して合成中に
組み込むことができる。
【００７５】 組換え生産のために、このコア構造をコードしているDNAは、適切なプロモー
タ及び計画された宿主細胞と適合できる他の制御配列の制御の下に、これらのコ
ーディング配列を配置する表現システム中に含まれる。利用できる宿主細胞のタ
イプは、植物界と動物界のほとんど全ての範囲にわたる。このように、本発明の
コア構造又はこのコア構造を含む化合物は、動物性細胞、昆虫細胞及び植物細胞
におけるのと同様に細菌又はイースト（それらが非毒性又はリフラクチルな形態
で生産され緊張に抵抗して利用できる範囲で）中で生産できる。
【００７６】 本発明のコア構造又はこのコア構造を含む化合物は、このコア構造を含む化合
物のコア構造をコードしているDNAに適切な信号ペプチドをコードしているDNAを
融合することにより宿主細胞からそれらの分泌物になるであろう形態で生産でき
る。又は、細胞内に生産されてもよい。それらは、追加のアミノ酸配列との融合
蛋白質として生産されてもよい。この配列はその後BttxBプロテアーゼ活性阻害
剤としてこれらの化合物を使用するに先だって除去する必要が有るかもしれない
し、無いかもしれない。
【００７７】 このように、本発明のコア構造は、化学合成、組換え生産又はこれらの技術の
組合せを含む様々な様式で製造できる。
【００７８】 自然に発生するプレビン分類のどんなメンバーでも精製され単離された形態で
供給される。「精製され単離された」とは、このペプチドが普通に発生する（天
然に発生するペプチドの場合に）環境からフリーであり、実際に使用できる形態
であることを意味する。このように、「精製され単離された」形態はそのペプチ
ドが実質的に純粋で、即ち、９０%以上純粋で、望ましくは９５%以上純粋で、よ
り望ましくは９９%以上純粋であるか、又は製薬的調製のそれのような完全に異
なる状況にあることを意味する。
【００７９】 本発明は、また、これらのコア構造を有する化合物のためのスクリーニング分
析とこれらのコア構造及びこれらのコア構造を有する化合物を利用している分析
に向けられている。
【００８０】 本発明は、また、BttxBの細胞内阻害剤としてのこれらのコア構造を有する化
合物の用途に向けられている。細胞表面ガングリオシドの受容器様認識と毒素の
重鎖（HC）サブユニットを標的としている神経細胞によるシナプトガミン（syna
ptogamin）のゆえに、Bttxsは特に神経細胞を標的とする。Kozaki, S.他(1998)
Microb. Pathog. 25:91−99参照。一旦、結合すると、この毒素は完全には理解
されていないメカニズムで内面化されるが、明らかに、エンドゾームの酸性化と
、そのHCとそのエンドプロテオリチカリ（endoproteolytically）に活性な軽鎖
（LC）とを結合している二硫化物結合の開裂を要求する。
【００８１】 この分配システムの特異性が、BttxBで毒を入れられるか潜在的に毒を入れら
れるそれらの細胞タイプにこれらのコア構造を有する化合物を分配するのに役立
つであろう。そして、不思議な弾丸アプローチは現実になっているので、１つの
「不思議な弾丸」として使うことができるだろう。例えば、Pastan, I.他(1994)
Ann. Rev. Biochem. 61:331−354及びEngert, A.他(1998) Curr. Top. Microbi
al. Immnunol. 234:13−33（ジフテリア毒素又はRicin A chainに結合した免疫
毒素の紹介）参照。
【００８２】 従って、これらのコア構造又はこれらのコア構造を有する化合物は二硫化物結
合のような結合で、BttxB HCに連結されるかもしれない。あるいは、ブフォリニ
ンは人間のアルブミン又はもう一つの橋のような担体タンパク質で、BttxB HCに
連結して多蛋白質共軛体を成形しているかもしれない。この共軛体は、その後Bt
txBと同様に影響されやすい細胞を標的とするに違いない。細胞中に入ると、こ
の共軛体はBttxBを阻害でき、又は、その結合が開裂してそのコア構造を有する
化合物又は担体−コア構造を遊離し、BttxBを阻害しうる。
【００８３】 抗体 これらのコア構造に対する抗体は、ポリクロナール抗血清の生産の標準的免疫
学技術を使用して製造できる。必要に応じて、モノクロナール抗体生産源のため
に免疫された宿主の抗体産生細胞を不滅にして生産し得る。関心の有るどんな物
質に対しても抗体を生産する技術は、よく知られている。特にここでは物質が短
いペプチドだけであるが、その物質の免疫原性をこのハプテンをキャリアに連結
させることによって、強化することが必要であるかもしれない。この目的のため
の適切なキャリアは、施されるべき哺乳類中で、それ自身でそのハプテン−キャ
リア共軛体に免疫応答を生産しない物質を含む。使用される共通のキャリアは、
鍵穴カサガイ・ヘモシアニン（KLH）、ジフテリア・トキソイド、血清アルブミ
ン、及びロータウイルス（VP6）のウィルスのコートタンパク質を含む。キャリ
アに対するハプテンの結合は、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの脱水剤の
存在下にそのペプチドとキャリアを接触させ、又はPierce Chemical社、シカゴ
、ILを通して入手可能な結合剤を使用するような標準的技術により行われる。
【００８４】 免疫原性形態のこれらのコア構造又はこれらのコア構造を有する化合物は、次
に適切な哺乳類宿主に注射され、血清中の抗体の滴定濃度が監視される。
【００８５】 滴定濃度が十分に高いとき、ポリクロナール抗血清は収穫されてよい。あるい
は、脾臓細胞又は周辺血液リンパ球のような宿主の抗体産生細胞が収穫され、不
滅化されてもよい。不滅にされた細胞は、それから個々のコロニーとしてクロー
ンにされ、望まれるモノクロナール抗体の生産のために選別される。選択された
ハイブリドーマ又は他細胞によって分泌されるモノクロナール抗体をコードして
いる遺伝子は、例えば、多数のエピトープ特異性を提供するか、単鎖形態をコー
ド化するために必要に応じて回収し、操作してもよく、CHO細胞などの他の宿主
細胞中での発現のために加工されてもよい。
【００８６】 このように、ここで使われる「抗体」は、Fab、Fab'及びF(ab')２断片などの
免疫グロブリンの免疫学的に反応性のある全ての断片を含み、同様に、Fv領域の
ような修飾された免疫反応性形態を含む。これらは関連する遺伝子（例えば、適
当なハイブリドーマから単離可能な）の操作によって生産される。
【００８７】 本発明の抗体は、もちろん、本発明のコア構造の量又は存在を決定するための
免疫測定で役立つ。そのような分析は、本発明のコア構造を含有する組成物の品
質制御生産において不可欠である。加えて、この抗体はこのコア構造の組換え生
産の有効性を評価するのに用いることができる。同様に、プレビンコード化遺伝
子の存在のための発現ライブラリをスクリーニングするためにも用いることがで
きる。それらは、また、これらのコア構造及びこれらのコア構造を有する化合物
を精製し及び／又は単離するための親和性リガンドとして用いることができる。
それらは、また、RIA及びELISAのような技術においてよく知られた方法によって
血清又はプラズマ中のコア構造検出及び測定するために用いることができる。従
って、充分な薬量を保証するために、循環するプレビン又は本発明のコア構造を
有する化合物のレベルを監視することができる。
【００８８】 プレビン類含有組成物と使用方法 これらのコア構造はBttxB及び破傷風菌神経毒のプロテアーゼ活性の阻害に効
果の有る化合物の構築に有用である。従って、本発明のコア構造を含む化合物は
、BttxB及びTttx中毒のために防止、予防と療法に用いることができる。そのよ
うな状況のために、このコア構造を含む化合物を単独で投与してもよく、コア構
造を含む化合物類と遊離のプレビン類の様々な集まりとして投与してもよい。更
に、追加のプロテアーゼ阻害剤又はトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィ
ン（TCEP）のような補助の化学物質との混合物として投与してもよい。
【００８９】 TCEPは、無臭の、スルフヒドリルを含まない還元剤であり、動物に比較的毒性
が無い(P−CH2CH2COOH)3HCl；Molecular Probes, Inc. Eugene OR)。TCEPはHC及
びLCとの間の二硫化物結合を還元でき、BttxB又はTttxサブユニットの解離を許
すことができる。この解離により、BttxBプロテアーゼ活性を阻害する化合物は
は活性QFサイトの利用性を増加する。その上、毒素の解離は、神経細胞浸透を妨
害する。ジチオスレイトール（DTT）のような他の還元剤を使用してもよい。し
かしながら、それらの特徴的な臭気と毒性のために異議があるかもしれない。従
って、TCEPは好ましい。
【００９０】 本発明のコア構造は、また、分析を監視する際の標準物質、及びその後のこれ
らのコア構造を含む化合物の生産の効果を評価するための分析において標準物質
として役立つ。これは、BttxBに対するエンドペプチターゼ活性分析を利用する
ことによって行うことができた。このエンドペプチターゼ分析において、可能性
のあるペプチドが、細胞内ターゲット、VAMP２のアミノ酸５５−９４を含んでい
る合成ペプチド基質の開裂能力によって、BttxBの阻害剤として機能するか、基
質として機能するかを評価できる。開裂生成物は、C18逆相HPLCカラムによって
分離でき、２０５nmでの吸光度により検出できる。
【００９１】 動物対象でBttxB及びTttxによって引き起こされる初期中毒又は更なる中毒を
防ぐために、これらのコア構造又はこれらのコア構造を含む化合物は医薬又は獣
医薬組成物として処方することができる。処置される対象、投与モード、及び要
求される治療のタイプ、例えば防止、予防、治療などにより、これらのコア構造
又はこれらのコア構造を含む化合物は、これらのパラメータに調和するように処
方される。そのような技術の概要は、レミントンのPharmaceutical Sciences（
最新版）、Mack Publishing社、イーストン、PAに見出される。
【００９２】 一般に、治療又は予防における使用のために、プレビン類又はこれらのコア構
造を含む化合物は単独で、或は、VAMP2のようなプロテアーゼ活性を阻害する他
の化合物と組合せて使用してよい。全てのD−アミノ酸を含んでいるエナンチオ
メトリック（enantiomeric）形態の使用は、トリプシン及びキモトリプシンのよ
うなプロテアーゼに対する抵抗などの利点を授けるかもしれない。
【００９３】 プレビン類又はこれらのコア構造を含む化合物は、単独で又は幾つかのプレビ
ン類又は化合物類の混合物として、或は、他の薬学的に活性な成分との組合せで
、並びに、単一投与又は多重投与で投与され得る。処方は全身の投与に適切な方
法で調製されてよい。全身処方は、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射
などの注射用に設計されたものを含み、経皮投与、経粘膜投与又は経口投与用に
調製されてもよい。処方は一般に希釈剤を含み、場合によっては、助剤、緩衝剤
、防腐剤なども含む。ブフォリニン類は、従来の技術を用いて脂質性被膜粒子組
成物に含めて、又は微細乳液としても投与できる。
【００９４】 経口投与される場合、本発明の化合物は適切な消化器官コーティングを用いて
、胃で分解されないように保護されるべきである。これはD−コンフィギュレー
ションのアミノ酸を用い、プロテアーゼに対する抵抗を与えることである程度避
けることができる。しかしながら、このペプチドは、なお酸による加水分解に影
響されやすいので、ある程度の消化器官のコーティングは、まだ必要かもしれな
い。
【００９５】 本発明における有用な化合物及びそれらの関連化合物の投与及び処方の方法は
、状態の迫真性、状態の厳しさ、処置されるべき特定の対象、開業医の判断に依
存する。処方は投与形態に依存する。本発明の化合物が小分子であるので、それ
らは適切な製薬賦形剤と混合され、タブレット、カプセル、シロップなどにされ
て、経口投与により便利に投与される。経口投与のための適切な処方は、緩衝剤
、風味剤などの微量成分を含んでいてもよい。典型的には、処方における活性成
分の量は、全処方の5％−95％の範囲にあるが、そのキャリアに依存して幅広い
変化が許容される。適切なキャリアは、サッカロース、ペクチン、ステアリン酸
マグネシウム塩、ラクトース、落花生油、オリーブ油、水などを含む。
【００９６】 本発明における有用な化合物は、また、座薬又は他の経粘膜媒体により投与さ
れてもよい。典型的には、このような処方は、調剤上受け入れられる洗浄剤のよ
うな粘膜を通してこの化合物の通過を容易にする賦形剤を含む。
【００９７】 これらの化合物は、乾癬のような局所の状況のために、又は皮膚に浸透するよ
うに計画された処方で、局所投与されてもよい。これらは、ローション、クリー
ム、軟膏等を含み、既知の方法で処方することができる。
【００９８】 これらの化合物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は腹膜内注射を含
む注射によって投与されてもよい。そのような用途の典型的処方は、ハンク溶液
又はリンゲル溶液のようなの等張媒体中の液体処方である。
【００９９】 適切な他の処方は、鼻のスプレー、脂質性被膜粒子処方、緩慢放出処方などを
含む。
【０１００】 それに代わる如何なる適切な処方が用いられてよい。業界公知の処方の解説は
、レミントンのPharmaceutical Sciences（最新版）、Mack Publishing社、イー
ストン、PAに見出される。このマニュアルの参照は、当業界で日常的である。
【０１０１】 本発明のプレビン類又はコア構造を含む化合物を分配する好ましい手段は、TC
EPの使用を含むだろう。TCEPは、ホロトキシンを開裂してこれらのコア構造が利
用できるサイトを生成するからである。TCEPは更にその毒素を個々の構成要素に
解離して、その神経細胞浸透を妨げる。
【０１０２】 更に、これらのコア構造は、BttxB毒素に冒された細胞に的をしぼってプレビ
ン類又はこれらのコア構造を含む化合物を送り込むために、BttxB重鎖を含むが
軽鎖を除外してある様々な化合物に連結することができた。
【０１０３】 本発明の化合物の薬量は、数多くの要因に依存し、患者毎に変わるだろう。
【０１０４】 以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって制限するものではない
。
【０１０５】 実施例１ エンドペプチターゼ活性分析 この毒素は、活性化混合物中で25℃で３０分間培養することにより、使用直前
に活性化された。活性化混合物は１消化当たり7.5μl中に毒素2.4μg（16pmol）
、30mMのNaHEPESバッファ、ｐＨ7.3、及び5mMのDTT又はTCEPを含む。１消化当た
り１nmolの基質ペプチド（VAMP2 55−94）、４%のDMSO、４％のトリトンX−100
及び８０mMのNaHEPESバッファ（ｐＨ7.3）を含む基質ペプチド混合物が調製され
た。最終反応混合物は25μlの基質ペプチド混合物、4.5μlの新鮮な10mMのDTT、
13μlのH2O又は試験ペプチド、及び7.5μlの活性化混合物を加えることで調製さ
れた。反応は37℃で培養することによって開始された。この反応は、1volのトリ
フルオロ酢酸（TFA）を0.25%まで添加することで停止された。試料は、遠心分離
によって澄明にされた。
【０１０６】 この分析法では、16pmolのBttxBは、37℃、４５分未満で１nmolの基質を完全
に消化した。
【０１０７】 実施例２ 消化生成物の逆相HPLC分析 消化されたペプチド生成物は、Beckmanシステム・ゴールドVer8.1のソフトウ
ェアによって制御されたBeckman126ポンプとモデル168Diode Array検出器に取付
けられたウォーターズのBondapak分析用Cl8カラム（3.9mmのx30cm）でRP−HPLC
によって分別された。溶媒系は、バッファA（BA；H2O−0.1% TFA）とバッファB
（BB；CH3CN−0.1 % TFA）からなる。展開プログラムは、０から１分後まで９７
%のBA、１分後から３０分後まで３３%のBB、次に５分間９７%のBBで洗浄し、続
いて１０分間９７％のＢＡで均衡化するというものであった。流速は、1.5ml mi
n−1であった洗浄及び均衡相の間以外では ml min−1であった。ウォーターズIn
telligent Sample Processor（WISP Model 712）で７５μリットルが注入された
。流出液は、２０５nmと２８０nmの２つの波長で監視された。
【０１０８】 最初に、消化生成物は、フェニルチオハイドレーション誘導のアミノ酸検出用
のHPLC（ABIモデル120A）とインラインで取付けられたＡＢＩ477Ａ蛋白質シーケ
ンサで自動化エドマン分解を用いるペプチド配列決定により同定される。消化の
範囲は、未消化のコントロール（毒素が加えられていない）と全消化（消化は２
乃至３時間で完全に行われる）とのピーク領域の比較によって決定された。阻害
又は消化の範囲は、標準物質及び／又は定量された標準物質又は阻害剤を加える
ことなく完了するまで消化された消化物と比較して作られた生成物とのピーク領
域の比較によりクロマトグラムの検査で決定される。
【０１０９】 実施例３ 二次構造予測 二次構造はnnpredict及びGibrat（GOR2）プログラムを用いて予測された。McC
leland, D. G、Rumelhart D. E、In Explorations in Parallel Distributed Pr
ocessing. vol. 3:318−362. 1988. MIT Press、Cambridge MA；Kneller D. G.
他(1990) J. Mol. Biol. 214:171−182；Garnier, J. 他(1978) J. Mol. Biol 1
98；425−443；Garnier J. 他(1987) J. Mol. Biol. 120:97−120；Garnier, J.
他(1996) Methods Enzymol. 266: 540−553. 螺旋輪突起は、Antheprotプログラ
ムVer 4を使用してなされた。Deleage, G.、Instit de Biologie et Chimi des
Proteins、Lyon、France参照。
【０１１０】 Gibratプログラムは、B−1がVAMP2のそれと同様のα−螺旋−回転−α−螺旋
コンフィグレーションが形成できたと予測する。表３参照。ブフォリンＩがそれ
からVAMP2と同様の二次構造を形成できるという結果は、B−Ｉも又VAMP2と同様
の螺旋バンドリングで逆回転のスーパー二次構造を成形できることを示唆する。
Lebeda他（1996）参照。この予側を支持して、我々は、ブフォリンIが先端切断
されるにつれてBttxB活性の阻害及びその螺旋内容が減少することは、基質削除
でBttxB活性が減少することを反映しいることを見出した。表１と図４における
ブフォリン−IIについてのデータを参照。
【０１１１】 実施例４ ブフォリニン類、プレビン類及びコア構造を含む化合物の調製 Park, C. B他（Park, C.B.他(1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 218:408
−413参照）により記載された方法を使用した腸洗浄によって、これらのブフォ
リニン及びこのコア構造を含む化合物類は両生類の胃から得ることができる。
【０１１２】 L.A. Carpino, J、Am. Chem. Soc. 79,4427 (1957)、C.D. Chang他、Int. J.
Pept. Protein Res. 11,246 (1978)、E. Atherton,他、J. Chem Soc. Chem. Com
mun., 537 (1978)及びR.B. Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85,2149 (1963)及
びBarlos, K.他(1989)、Tetrahedron Lett. 30:3947に記載されるように、ブフ
ォリニン類及びこのコア構造を含む化合物類は固相ペプチド合成（SSPS）によっ
て合成できる。
【０１１３】 これらのブフォリニン、プレビン及びコア構造を含む化合物は、当業界で一般
に知られているDNA組換え手段で生産できる。即ち、混成システムにおいて発現
に適するプロモータ、即ち、細菌、真菌、昆虫又は哺乳類の細胞培養が用いられ
てよい。DNA配列は、特定の宿主とtRNA含有量のために最適化できる。例えば、
ブフォリニン、又は本発明のコア配列を含む他の化合物は、このコア配列を単離
するために酵素的に消化される。単離されると、組換え手段を用いて、BttxB又
はTttxのプロテアーゼ活性を効果的に阻害する化合物を創る目的で、この配列を
修飾し又はこの配列に追加のアミノ酸又は他の成分を付加したりすることができ
る。
【０１１４】 実施例５ ブフォリニンによるプロテアーゼ活性の阻害 実施例１及び２で述べられたように、エンドペプチターゼ分析と逆相HPLCは、
開裂生成物とプロテアーゼ阻害範囲を検出するのに用いることができる。簡潔に
言えば、Garica、他により記載された毒素を含む活性化混合物の添加の直前に、
潜在的阻害剤が基質ペプチド混合物に加えられてよい。37℃で４５分間培養後、
反応は停止されなければならず、消化生成物はRP HPLCを用いて分析できる。も
し蛍光ラベル化基質が使われるなら、生成物の形成はインライン蛍光探知器で決
定されるだろう。
【０１１５】 阻害又は消化の範囲は、実施例２で記載したようにして決定されるだろう。即
ち、残存する未消化の基質及び／又は形成された生成物が、定量された標準物質
と、又は阻害剤を加えることなく完了まで消化された消化物と比較される。
【０１１６】 それに代わる手段として、濃度測定法を含むものがある。その基質及び生成物
が、電気泳動で分離され、蛋白質特異性の染料、即ち、Coomassieブリリアント
・ブルーで染色され、測定される。基質又は生成物に特異的抗体を利用すること
によって、阻害又は消化の範囲を決定する免疫測定を行ってもよい。
【０１１７】 それに代わる手段は、生体内保護又は組織特異機能分析をも含む。例えば、実
験動物に付加剤と共に或は付加剤なしで阻害剤を投薬し、それから毒素に挑戦す
る。例えば、TCEPのような還元剤と共にブフォリニンを生体内注射する。その後
、徴候の発症又はLD50の変化が、評価される。組織保護分析は、完全な神経−筋
肉調製物を使用し、神経細胞刺激への筋肉痙攣反応が評価される。毒素は、ブフ
ォリニン及び付加剤と共に前培養されて、それから組織調製物に加えられる。
【０１１８】 実施例６ BttxBプロテアーゼ活性に影響を与えるブフォリニン類、プレビン類及び本発
明のコア配列を含む他の化合物の設計 標準的方法と技術を用いて、本発明のペプチドは、Pro26を基質に更に似てい
る活性サイトをつくるためにグルタミンに、又はProにより強いられる回転の抑
制なしに回転に有利に働く他のアミノ酸で代えることを含む変異又は置換によっ
て修飾されてもよい。そのような置換は、毒素の解離を起こす更に効果的な螺旋
バンドリングに帰結すると予測される。螺旋領域の他のアミノ酸置換又は変異が
なされることにより両親媒性になり、螺旋バンドリングを改善するか、或は、毒
素との相互作用を改良する。このような変化は、L又は他の螺旋嗜好アミノ酸で
のR11の置換を含む。図６Ａ及び図６Ｂを参照。同様に、R11L、K15L及びS18L、
又は他アミノ酸類の多重置換が行われることは、螺旋形成及びバンドリングに好
ましい。
【０１１９】 それに代わって、B−Iの予測される上流螺旋が欠落するB−IIを、BttxBプロテ
アーゼ活性の阻害能力を強化して、向上させるために修飾できる。例えば、置換
S3A及びS4A（SEQ ID NO：5）を持つペプチドは、QFサイトの上流に予測された螺
旋を持っている。もう一つの例は、置換S2LとS4L（SEQ ID NO：6)を持つペプチ
ドである。同様に、このペプチドは、QFサイトの上流に予測された螺旋を持つ。
【０１２０】 実施例７ ブフォリニン類、プレビン類及び本発明のコア配列を含む他の化合物での前処 理 ブフォリニン類、プレビン類及び本発明のコア配列を含む他の化合物は、Bttx
B又はTttxで汚染されるかもしれない食物と液体を前処理するのに用いることが
できる。例えは、ブフォリニン、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合
物の有効量が、BttxBプロテアーゼ活性を阻害するためにBttxBを含む水の中に混
合される。例えば、1ugのBttxBを含む水100mlが、タブレット、粉末又は液状の1
00ugのブフォリニン、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合物と0.1mmo
lの還元剤、即ちTCEPで処理される。
【０１２１】 これらの種々の形態は、ブフォリニン、プレビン又はこのコア配列を含む他の
化合物、TCEPのような還元剤及び他の充填剤及び安定剤からなる。液状形態は、
タブレット又は粉末から作られ、それが使用前に予め溶解される。ブフォリニン
、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合物の溶液は、表面にBttxBを有
する固形食物の表面に塗布されてもよい。あるいは、その溶液の有効量は、食物
の表面で見つからないBttxBの量へその溶液の活性成分が接近できるように微粒
子に粉砕された固形食物を処理するのに用いることができる。
【０１２２】 汚染されているか疑惑のある食品以外のものの表面は、ブフォリニン、プレビ
ン又は本発明のコア構造を含む他の化合物の溶液で洗ってもよい。浸したり、表
面を拭いたりして使用されるスプレー、泡、おしぼり又はスポンジとして、本発
明の化合物は適用される。その量は、典型的には適用される溶液ml当たり200ug
である。しかし、要求される濃度は汚染の範囲に依存し、適切な活性成分の濃度
は必要に応じて調整されてよい。
【０１２３】 実施例８ 予防処置での使用 ブフォリニン、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合物のは、BttxB
又はTttx中毒に対する予防薬として使用できた。対象は、BttxB又はTttxと接触
しそうな状況に入る前にブフォリニン、プレビン又は本発明のコア配列を含む他
の化合物で処置することができた。投薬モードと量は、接触で予想される毒素の
量と接触が起こるかもしれない時間に依存している。瞬間接触のための好ましい
投与は体内投与である。より遅くてより長びく曝露のための好ましい投与形態は
、摂取である。しかし、パッチのような他の遅い分配の放出形態が、用いられて
もよい。
【０１２４】 実施例９ エアゾール汚染の防止 ブフォリニン、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合物は、エアゾー
ル形態のBttxBを不活性化するために、使い捨ての、湿ったフィルタの、呼吸マ
スクに組み込ませてもよい。この毒素は湿ったフィルタで捕獲され、ブフォリニ
ンで不活性化されるだろう。
【０１２５】 そのようなフィルタのデザインは、バクテリアより小さい、例えばHEPAなどの
ように１ミクロンの毒素粒子から保護する。これらのフィルタは、予め湿らせ、
ブフォリニンとTCEPなどの補助化学薬品を含浸させて提供できた。これに代えて
、これらのフィルタは、予め含浸させた乾燥フィルタを濡らすことによって、又
はフィルタをブフォリニンの溶液に浸すことによって製造する事もできた。空気
の処理能力を持つ閉鎖領域でも、適切な大きさに設定されたフィルタでこの形式
で保護することができる。
【０１２６】 実施例１０ 傷治療 毒素が体内に吸収される機会を持つ前に、開いた傷口にブフォリニン、プレビ
ン又は本発明のコア配列を含む他の化合物を局所的に適用して、BttxB又はTttx
中毒を阻止することができた。ブフォリニンと、還元剤及び他の安定剤又は充填
剤を含む補助剤を含む粉末混合物が直接傷に適用されてよい。この試みは、傷が
ブフォリニン、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合物を溶かすほどに
濡れていることを頼りにしている。これに代えて、ブフォリニン含む軟膏、液体
、スプレー、泡又はおしぼりを傷の表面にあてがってもよい。おしぼりは、実施
例１０のフィルタと同様の方法で供給され又は作ることができた。
【０１２７】 実施例１１ 曝露後 BttxB又はTttx中毒に既に冒されている対象をブフォリニン、プレビン又は本
発明のコア配列を含む他の化合物で治療することができた。これらの処置は、感
受性細胞に未だ入りこんでいず、アクセスできる毒素を掃除することである。感
受性細胞の中毒は、細胞機能抑制に至るが、細胞自身に致命的でない。充分な時
間があれば、細胞は回復することができて、再び機能的になることができる。こ
の回復過程は、数ヶ月続くかもしれない。したがって、ブフォリニン、プレビン
又は本発明のコア配列を含む他の化合物での治療は、対象の回復を手伝い、互換
的生命維持手段の必要を減らす。この治療は、ブフォリニン−BttxB HC又は他の
、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合物の類似共軛体の使用からなる
。Bttx−HC部は、感受性細胞にこの共軛体を特異的に方向付け、この毒素と同様
の方法で取込が発生すると思われる。細胞内で、ブフォリニンは毒素に接近して
、プロテアーゼ活性を阻害し、それによって、毒素が内部で発生するタンパク質
分解によって細胞から除去されるまで、細胞を更なる毒素損害から保護する。
【０１２８】 実施例１２ ボツリヌス菌毒素サブクラスの識別 ブフォリニン、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合物を、BttxB又
はTttxの識別のために使用できる。未知のBttx又はTttxが基質及びもし存在する
ならBttxB及びTttxを特異的に阻害する１つのブフォリニン、プレビン又は本発
明のコア配列を含む他の化合物と培養される。未開裂の基質の検出又は消化生成
物の減少は、毒素の識別を許す。
【０１２９】 これは、阻害が特異的である故に、確認分析として有用である。例えば、VAMP
2のようなC−末端蛍光ラベル化基質が、微量滴定プレートに取り付けられる。Ha
llis. B.他、（1996）J. Clin. Microbiol. 34:1934−1938参照。次に、未知の
試料が、ウエル(well)に加えられて、培養される。反応が停止され、ウエルはす
すがれる。蛍光の減少は、毒素に基質が感受性であることを示す。ブフォリニン
、プレビン又は本発明のコア配列を含む他の化合物が消化混合物に含まれるなら
、BttxB又はTttx毒素は特異的に阻害され、蛍光レベルは阻害剤なしでBttxBを含
んでいる反応生成物より高いだろう。
【０１３０】 実施例１３ ボツリヌス菌Ｂ毒素のプロテアーゼ活性を阻害するために最適化されたコア構 造を有する化合物の構築 式（１）、（２）又は（３）のコア構造は、図７に示されるような配列に装飾
又は置換を行うことにより最適化できる。これらのコア構造は、次にボツリヌス
菌Ｂ毒素のプロテアーゼ活性を高度に阻害する化合物構築するために使用できる
。
【０１３１】 例えば、標準方法及び技術を用いて、本発明のコア構造は、変異され、或は、
回転フォーメーションに味方する置換及びアミノ酸付加を行うことにより修飾さ
れる。他のアミノ酸付加、変異化、又は置換は、そのへリックスがヘリックス・
バンドリングを改良し、又はその毒素との相互関係を改良して、更に両親媒性に
なるように行われる。
【０１３２】 出典明示による記載 本発明の開示を理解し完全にするために必要な範囲まで、ここに記載した全て
の出版物、特許及び特許出願は、個々に取り込まれた同じ 範囲で明白に取り入れられる。
【０１３３】 本発明は図面を参照して更に理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ及びＢは、物質PがBttxBの基質ではないが、阻害剤であることを示す。
【図２】 図２は、物質ＰのBttxB阻害度を示す。
【図３】 図３は、ブフォリンIによるBttxBエンドプロテアーゼ活性の阻害を示す２軸逆
数表示グラフである。
【図４】 図４は、各種ブフォリニンによるBttxBエンドプロテアーゼ活性の阻害を説明
している。
【図５】 図５は、ブルックへブン蛋白質データベース#1HIOにより生成されたトリ染色
体蛋白質ヒストンオクタマーH2A残基Lysl5−Try39のＸ線結晶構造を説明してい
る。
【図６】 図６Ａは、ブフォリンIと変異体B−I Rl1L及び変異体B−I RllL，K15L，S18L
のアミノ酸配列の比較である。 図６Ｂは、ブフォリンIのへリックス１及びへリックス２の螺旋輪突起を示す
。 図６Ｃは、変異体B−I R11L及びB−I Rl1L，K15L，S18Lのへリックス１の螺旋
輪突起を示す。
【図７】 図７は、式（１）、（２）又は（３）の典型的化合物を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 14/81 11/00 16/38 14/81 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/38 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 5/10 33/569 Ｆ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ムーラッド，デボラ，アール アメリカ合衆国，メリーランド州，ロック ビル (72)発明者 ドクトル，ブペンドラ，ピー アメリカ合衆国，メリーランド州 20854， ポトマック，10613 グレート アーバー ドライブ (72)発明者 ガルシア，グレゴリー，イー アメリカ合衆国，メリーランド州，ジャー マンタウン Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 BA19 BA50 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG21 AG27 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA99Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA02 BA08 BA11 BA17 BA18 BA23 BA41 CA43 DC32 NA14 ZB351 ZC202 ZC371 ZC412 4H045 AA11 CA53 DA56 EA22 EA29 FA74

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 精製され単離された形態での式： B1Z*2B3Z*4X*5Q6F7X8X9X10X11（１）、 B1X2X3X4X5Q6F7X8X9X10X11（２）、又は B1X2B3X4Z5Q6F7Z8X9X10X11（３） 式中、 Bは塩基性の、又は極性の／大きいアミノ酸，又はその修飾された形態； Ｘは、小さい又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態； Ｘ*は、小さい又は極性の／大きなアミノ酸、又はその修飾された形態； Ｚは、極性の／大きい、又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態であ
    る； Ｚ*は、プロリン又は極性の／大きい又は疎水性のアミノ酸、又は、その修飾
    された形態である、 の化合物、及び、その塩類、エステル類、アミド類、及びアシル化物。
  2. 【請求項２】 少なくとも１つのアミノ酸残基がD−コンフィギュレーションである請求項１
    記載の化合物。
  3. 【請求項３】 ２つのアミノ酸残基の間の少なくとも１つの結合が擬似ペプチド結合又はスペ
    ーサ分子である請求項１記載の化合物。
  4. 【請求項４】 Bは、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン又はリジン； Ｘは、アラニン、セリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又は
    グリシン； Ｘ*は、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタ
    ミン； Ｚは、アスパラギン、グルタミン、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシ
    ン、メチオニン、フェニルアラニン又はトリプトファン； Ｚ*は、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、チ
    ロシン又はプロリンである請求項１の化合物。
  5. 【請求項５】 Ｂ1はアルギニン、又は Ｚ*２はプロリン、又は Ｂ３はリジン、又は Ｚ*４はプロリン、又は Ｘ*５はグルタミン、又は Ｘ8はフェニルアラニン、又は Ｘ9はグリシン、又は Ｘ１0はロイシン、又は Ｘ１1はメチオニンである請求項１の式（１）の化合物。
  6. 【請求項６】 Ｂ1はアルギニン、 Ｚ*２はプロリン、 Ｂ３はリジン、 Ｚ*４はプロリン、 Ｘ*５はグルタミン、 Ｘ8はフェニルアラニン、 Ｘ9はグリシン、 Ｘ１0はロイシン、及び Ｘ１1はメチオニンである請求項１の式（１）の化合物。
  7. 【請求項７】 式中、「−」はスペーサ分子であり、「Ｘ」は配列番号１−１２のQFサイトの
    上流のアミノ酸配列と相同の適切なアミノ酸配列の全てである、 からなる群から選ばれた請求項１の化合物。
  8. 【請求項８】 ボツリヌス菌毒素B又は破傷風菌毒素のプロテアーゼ活性を阻害することがで
    きる、請求項１の式（１）、（２）及び（３）のコア構造を含むペプチドの産生
    のための組換え発現システムであって、発現システムが、発現をもたらす制御配
    列に操作可能に連結される前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列から成る
    ことを特徴とする組換え発現システム。
  9. 【請求項９】 前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列がプレカーサー・ペプチドをコー
    ドする請求項８の組換え発現システム。
  10. 【請求項１０】 請求項８の発現システムを含むように修飾された組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 ボツリヌス菌毒素B又は破傷風菌毒素のプロテアーゼ活性を阻害することがで
    きるペプチドを生産する方法であって、請求項１０の修飾された宿主細胞を、前
    記ペプチドが生産される条件下に培養することから成る方法。
  12. 【請求項１２】 式： B1Z*2B3Z*4X*5Q6F7X8X9X10X11（１）、 B1X2X3X4X5Q6F7X8X9X10X11（２）、又は B1X2B3X4Z5Q6F7Z8X9X10X11（３） 式中、 Bは塩基性の、又は極性の／大きいアミノ酸，又はその修飾された形態； Ｘは、小さい又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態； Ｘ*は、小さい又は極性の／大きなアミノ酸、又はその修飾された形態； Ｚは、極性の／大きい、又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態であ
    る； Ｚ*は、プロリン又は極性の／大きい又は疎水性のアミノ酸、又は、その修飾
    された形態である、 のコア構造及び、その塩類、エステル類、アミド類、及びアシル化形態を含むボ
    ツリヌス菌又は破傷風菌中毒を処置するためのの製薬組成物。
  13. 【請求項１３】 Bは、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン又はリジン； Ｘは、アラニン、セリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又は
    グリシン； Ｘ*は、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタ
    ミン； Ｚは、アスパラギン、グルタミン、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシ
    ン、メチオニン、フェニルアラニン又はトリプトファン； Ｚ*は、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、チ
    ロシン又はプロリンである請求項１２の製薬組成物。
  14. 【請求項１４】 Ｂ1はアルギニン、又は Ｚ*２はプロリン、又は Ｂ３はリジン、又は Ｚ*４はプロリン、又は Ｘ*５はグルタミン、又は Ｘ8はフェニルアラニン、又は Ｘ9はグリシン、又は Ｘ１0はロイシン、又は Ｘ１1はメチオニンである前記式（１）の化合物を含むことを特徴とする請求
    項１２の製薬組成物。
  15. 【請求項１５】 Ｂ1はアルギニン、 Ｚ*２はプロリン、 Ｂ３はリジン、 Ｚ*４はプロリン、 Ｘ*５はグルタミン、 Ｘ8はフェニルアラニン、 Ｘ9はグリシン、 Ｘ１0はロイシン、及び Ｘ１1はメチオニンである前記式（１）の化合物を含むことを特徴とする請求
    項１２の製薬組成物。
  16. 【請求項１６】 前記化合物は、 式中、「−」はスペーサ分子であり、「Ｘ」は配列番号１−１２のQFサイトの
    上流のアミノ酸配列と相同の適切なアミノ酸配列の全てである、及びそのアミド
    化形態 からなる群から選ばれる請求項１２の製薬組成物。
  17. 【請求項１７】 請求項１の化合物に特異的免疫反応性の抗体。
  18. 【請求項１８】 請求項１７の抗体を利用する分析。
  19. 【請求項１９】 不明化合物のボツリヌス菌毒素Ｂ又は破傷風菌毒素プロテアーゼ活性の阻害能
    力を測定することにより、前記不明化合物がプレビンであるかどうかを決定する
    方法。
  20. 【請求項２０】 式： B1Z*2B3Z*4X*5Q6F7X8X9X10X11（１）、 B1X2X3X4X5Q6F7X8X9X10X11（２）、又は B1X2B3X4Z5Q6F7Z8X9X10X11（３） 式中、 Bは塩基性の、又は極性の／大きいアミノ酸，又はその修飾された形態； Ｘは、小さい又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態； Ｘ*は、小さい又は極性の／大きなアミノ酸、又はその修飾された形態； Ｚは、極性の／大きい、又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態であ
    る； Ｚ*は、プロリン又は極性の／大きい又は疎水性のアミノ酸、又は、その修飾
    された形態である、 の化合物、及び、その塩類、エステル類、アミド類、及びアシル化物を、ボツリ
    ヌス菌Ｂ又は破傷風菌毒素のプロテアーゼ活性阻害能力を有する化合物を構築す
    るために使用する方法。
  21. 【請求項２１】 Bは、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン又はリジン； Ｘは、アラニン、セリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又は
    グリシン； Ｘ*は、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタ
    ミン； Ｚは、アスパラギン、グルタミン、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシ
    ン、メチオニン、フェニルアラニン又はトリプトファン； Ｚ*は、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、チ
    ロシン又はプロリンである請求項２０の方法。
  22. 【請求項２２】 Ｂ1はアルギニン、又は Ｚ*２はプロリン、又は Ｂ３はリジン、又は Ｚ*４はプロリン、又は Ｘ*５はグルタミン、又は Ｘ8はフェニルアラニン、又は Ｘ9はグリシン、又は Ｘ１0はロイシン、又は Ｘ１1はメチオニンである前記式（１）の化合物を利用する請求項２０の方法
    。
  23. 【請求項２３】 Ｂ1はアルギニン、 Ｚ*２はプロリン、 Ｂ３はリジン、 Ｚ*４はプロリン、 Ｘ*５はグルタミン、 Ｘ8はフェニルアラニン、 Ｘ9はグリシン、 Ｘ１0はロイシン、及び Ｘ１1はメチオニンである前記式（１）の化合物を利用する請求項２０の方法
    。
  24. 【請求項２４】 前記化合物は、 式中、「−」はスペーサ分子であり、「Ｘ」は配列番号１−１２のQFサイトの
    上流のアミノ酸配列と相同の適切なアミノ酸配列の全てである、 からなる群から選ばれる請求項２０の方法。
  25. 【請求項２５】 少なくとも１つのプレビン組成物を含むボツリヌス菌毒素B又は破傷風菌毒素
    中毒を治療又は防止するためのキット。
  26. 【請求項２６】 前記組成物は、式： B1Z*2B3Z*4X*5Q6F7X8X9X10X11（１）、 B1X2X3X4X5Q6F7X8X9X10X11（２）、又は B1X2B3X4Z5Q6F7Z8X9X10X11（３） 式中、 Bは塩基性の、又は極性の／大きいアミノ酸，又はその修飾された形態； Ｘは、小さい又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態； Ｘ*は、小さい又は極性の／大きなアミノ酸、又はその修飾された形態； Ｚは、極性の／大きい、又は疎水性のアミノ酸、又はその修飾された形態であ
    る； Ｚ*は、プロリン又は極性の／大きい又は疎水性のアミノ酸、又は、その修飾
    された形態である、 のコア配列を含む化合物、及び、その塩類、エステル類、アミド類、及びアシル
    化物を含有することを特徴とする請求項２５のキット。 請求項２６ 少なくとも１つのプレビンに免疫特異性な抗体を含むことからなる、試料がプ
    レビンを含むかどうか、そのプレビンの量、又はそのプレビンのタイプを決定す
    るためのキット。
  27. 【請求項２７】 試料がボツリヌス菌毒素を含むかどうか、又はそのボツリヌス菌毒のタイプを
    決定するためのキットであって、前記ボツリヌス菌毒素と相互関係を有する少な
    くとも１つのプレビンに免疫特異性な抗体を含み、前記相互作用は観察可能な結
    果を産出することを特徴とするキット。
  28. 【請求項２８】 試料が破傷風菌毒素を含むかどうかを決定するためのキットであって、前記破
    傷風菌毒素と相互関係を有する少なくとも１つのプレビンに免疫特異性な抗体を
    含み、前記相互作用は観察可能な結果を産出することを特徴とするキット。
JP2000618307A 1999-05-17 2000-05-15 ボツリヌス菌毒素ｂ及び破傷風菌神経毒素の特異的阻害剤及び治療薬としてのプレビン類 Withdrawn JP2003501012A (ja)

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