JP2003510257A

JP2003510257A - カッパ−コノトキシンｐｖｉｉａの使用

Info

Publication number: JP2003510257A
Application number: JP2001525222A
Authority: JP
Inventors: アン・エイチ・コーネル−ベル; カレン・イー・ペンバートン; デイビス・エル・テンプル・ジュニア; リチャード・ティ・レイヤー; アール・タイラー・マッケイブ; ロバート・アール・ジョーンズ
Original assignee: コグネティックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1999-09-22
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2003-03-18
Also published as: EP1218407A4; AU7596800A; CA2385047A1; US20040092447A1; US20060040312A1; WO2001021648A1; EP1218407A1; AU778182B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＡＴＰ感受性Ｋ^＋チャネルを活性化するためのカッパ−コノトキシンＰＶＩＩＡ（κ−ＰＶＩＩＡ）、類縁体および誘導体の使用に関する。ＡＴＰ感受性Ｋ^＋チャネルの活性化は、脳および心臓虚血ならびに喘息といったような広範囲の疾患および傷害を治療するのに用いることができるＫ_ＡＴＰチャネルを開くのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（背景技術）本発明は、ＡＴＰ感受性Ｋ^＋チャネルを活性化する（すなわち、開く）ための
カッパ−コノトキシンＰＶＩＩＡ（κ−ＰＶＩＩＡ）、類縁体および誘導体の使
用に関する。ＡＴＰ感受性Ｋ^＋チャネルの活性化は、本明細書においてさらに詳
しく説明するような多くの生理的疾患および傷害を治療するのに有用である。本明細書において本発明の背景技術を明らかにする場合、特に、実施を考慮す
るさらなる詳細を提供する場合に用いる刊行物および他の資料は、全体を参考文
献として本発明に援用され、便宜のために、以下の明細書において、著者および
日付によって引用され、付属の引用文献目録においては、著者のアルファベット
順に列挙される。

【０００２】最初、紫色の円錐形巻貝であるアヤメイモガイ（Conus purpurascens）の毒液
から精製された（Terlauら、１９９６；米国特許第５６７２６８２号）２７アミ
ノ酸ペプチドであるκ−ＰＶＩＩＡは、これまでに、ShakerＨ４カリウムチャネ
ルの強力なアンタゴニストとして同定されている（ＩＣ_５０〜６０ｎＭ）。同じ
研究で、電位依存性カリウムチャネルＫｖ１.１またはＫｖ１.４においては活性
が検出されなかったことが言及されている（Terlauら、１９９６）。Shakerおよ
びＫｖ１.１カリウムチャネルから構築されたキメラでは、毒素感受性領域とし
て、第５および第６膜貫通領域の間に推定の細孔形成領域が確認された（Shonら
、１９９８）。κ−ＰＶＩＩＡが、Shakerチャネル上の外部テトラエチルアンモ
ニウム結合サイトと相互作用することが明らかである。κ−ＰＶＩＩＡおよびチ
ャリブドトキシンの両方が、Shakerチャネルを阻害するが、それらは、異なって
相互作用しなければならない。Ｆ４２５Ｇ Shaker突然変異は、３位（スリー・
オーダー）の大きさでチャリブドトキシン親和性を増加するが、κ−ＰＶＩＩＡ
感受性を完全に無くする（Shonら、１９９８）。κ−ＰＶＩＩＡは、１：１の化
学量論においてイオン細孔を遮断し、その開口および閉鎖チャネルへの結合は、
非常に異なっていると考えられる（Terlauら、１９９９）。長期にわたって全卵
母細胞またはアウトサイドアウトパッチに適用された場合、κ−ＰＶＩＩＡの阻
害は、チャネルを活性化するのに用いられた脱分極パルスに対する応答における
電位依存性開放として現れる（Garciaら、１９９９）。

【０００３】カリウムチャネルは、興奮性細胞における休止膜電位のコントロールにおいて
極めて重要であり、電位依存性チャネル、Ｃａ^２＋活性化チャネルおよびＡＴＰ
感受性Ｋ^＋チャネルという３つのクラスにおおまかに細分することができる。Ａ
ＴＰ感受性カリウムチャネルは、最初、心臓組織に関して記載された（Nomaら、
１９８３）。その後、それらが、膵臓細胞、骨格、血管および神経組織において
も同定された。このＫ^＋チャネルグループは、細胞内ＡＴＰレベルによって調節
され、それ自体、電気的活性に対する一対の細胞代謝である。ＡＴＰレベルの増
大は、Ｋ_ＡＴＰチャネルの閉鎖をもたらす。Ｋ_ＡＴＰチャネルは、化学量論的に
１：１である２つの異なるサブユニットからなる８量体の複合体であると考えら
れる；チャネル細孔を形成すると思われる弱内向き整流Ｋ^＋チャネルKir６.ｘ（
６.１または６.２）およびスルホニルウレア（ＳＵＲ）サブユニット。これまで
に、ＳＵＲの３つの変異体が同定されている：ＳＵＲ１、ＳＵＲ２ＡおよびＳＵ
Ｒ２Ｂ。Kir６.２サブユニットは、心臓、膵臓および神経組織のＫ_ＡＴＰチャネ
ルによくあるが（Kir６.１は、血管平滑筋組織に優先的に発現される）、ＳＵＲ
は、区別的に発現される。Kir６.２／ＳＵＲ１は、ニューロン／膵臓β細胞チャ
ネルを再構築するが、Kir６.２／ＳＵＲ２Ａは、心臓Ｋ_ＡＴＰチャネルを再構築
するのに用いられる。

【０００４】カリウムチャネルは、細胞膜電位の維持を通して、正常な生物的機能において
重要な大きく多様なタンパク質のグループからなる。Ｋ^＋チャネルを開く化合物
に対する電位の治療的適用は、遠くまで及ぶものであり、脳および心臓虚血なら
びに喘息といったような広範囲の疾患および傷害の治療を含む。近年、気管平滑
筋を開放するＫ^＋チャネルオープナーの能力にかなりの興味がもたれており、こ
れらの化合物は、それ自体、気管支喘息を治療するための新規なアプローチを提
供する（Linら、１９９８；Muller−SchweinitzerおよびFozard、１９９７；Mor
ley、１９９４；Barnes、１９９２）。さらに、Ｋ^＋チャネルオープナーの心臓
保護効果は、心臓虚血の実験動物モデルにおいて今や十分に確立されている（Ju
ngら、１９９８；Kouchら、１９９８）。脳虚血によって引き起こされるニュー
ロンの損傷を制限するこれらの化合物の能力については、知見がやや少ない。脳
虚血の治療における最大の進歩は、ナトリウムおよびカルシウムイオンの流入を
減少させる化合物の発達であるとみなされてきている。休止膜電位をもとにもど
すＫ^＋チャネルオープナーは、ニューロン組織の虚血に関連する急性損傷の減少
（Reshefら、１９９８；Windら、１９９７）ならびにグルタミン酸誘発刺激毒性
の減少（Lauritzenら、１９９７）に用いることもできる。しかし、Ｋ_ＡＴＰオ
ープナーの臨床使用は、その心臓血管副作用（すなわち、血圧の低下）のために
、多少制限されている。したがって、脳および心臓虚血ならびに喘息といったような広範囲の疾患およ
び傷害の治療に用いることができるＫ_ＡＴＰチャネルを開く新規作用剤の発達が
望まれる。

【０００５】（発明の概要）本発明は、ＡＴＰ感受性Ｋ^＋チャネルを活性化するためのカッパ−コノトキシ
ンＰＶＩＩＡ（κ−ＰＶＩＩＡ）、類縁体および誘導体の使用に関する。ＡＴＰ
感受性Ｋ^＋チャネルの開口は、本明細書においてさらに詳しく説明するような多
くの生理的疾患を治療するのに有用である。さらに詳しくは、本発明は、心臓虚血、ニューロン虚血、眼虚血および喘息を
治療するのに用いることができるＫ_ＡＴＰチャネルを開くための、κ−ＰＶＩＩ
Ａ、その類縁体、誘導体およびその生理学的に許容しうる塩の使用に関する。本発明の目的において、κ−ＰＶＩＩＡは、以下の一般式をもつペプチドを意
味する：Cys-Xaa_１-Ile-Xaa₂-Asn-Gln-Xaa₃-Cys-Xaa₄-Gln-Xaa₅-Leu-Asp-Asp-Cy
s-Cys-Ser-Xaa_１-Xaa₃-Cys-Asn-Xaa_l-Xaa₄-Asn-Xaa₃-Cys-Val (配列番号: 1)、
式中、Xaa_１およびXaa₃は、独立して、Arg、ホモアルギニン、オルニチン、Lys
、Ｎ−メチル−Lys、Ｎ,Ｎ−ジメチル−Lys、Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチル−Lys、いず
れかの合成塩基性アミノ酸、Hisまたはハロ−His；Xaa₂は、Proまたはヒドロキ
シ−Pro(Hyp)；Xaa₄は、Phe、Tyr、メタ−Tyr、オルソ−Tyr、ノル−Tyr、モノ
−ハロ−Tyr、ジ−ハロ−Tyr、Ｏ−スルホ−Tyr、Ｏ−ホスホ−Tyr、ニトロ−Ty
r、Trp（ＤまたはＬ）、ネオ−Trp、ハロ−Trp（ＤまたはＬ）、またはいずれか
の合成芳香族アミノ酸；およびXaa₅は、Hisまたはハロ−Hisである。Ｃ末端は、
遊離カルボキシル基またはアミド基を含む。ハロが、臭素、塩素またはヨウ素で
あるのが好ましい。Xaa_１がArgであって、Xaa_５がHisであるのが好ましい。Xaa
_１がArg、Xaa₃がLys、Xaa_４がPheおよびXaa_５がHisであるのがより好ましい。Ｃ
末端が遊離カルボキシル基を含むのがさらに好ましい。

【０００６】 κ−ＰＶＩＩＡ類縁体は、以下の式をもつペプチドを意味する： κ−PVIIA [R18A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Ala-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 2); κ−PVIIA [R22A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Ala-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 3); κ−PVIIA [I3A]: Cys-Arg-Ala-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 4); κ−PVIIA [K19A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Ala-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 5); κ−PVIIA [R2A]: Cys-Ala-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys−Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 6); κ−PVIIA [F9A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Ala-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 7); κ−PVIIA [K25A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Ala-Cys-Val (配列番号: 8); κ−PVIIA [R2K]: Cys-Lys-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 9); κ−PVIIA [K7A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Ala-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-CysCys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 10); κ−PVIIA [F9M]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Met-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 11); κ−PVIIA [F9Y]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Tyr-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 12); κ−PVIIA [R2Q]: Cys-Gln-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 13); κ−PVIIA [H11A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-Ala-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 14); κ−PVIIA [D14A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Ala-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 15); κ−PVIIA [Q6A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Ala-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 16); κ−PVIIA [N21A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Ala-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 17); κ−PVIIA [S17A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ala-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 18); κ−PVIIA [N24A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Ala-Lys-Cys-Val (配列番号: 19); κ−PVIIA [L12A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Ala-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 20); κ−PVIIA [D13A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Ala-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 21); κ−PVIIA [Q10A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Ala-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 22); κ−PVIIA [V27A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Ala (配列番号: 23); κ−PVIIA [O4A]: Cys-Arg-Ile-Ala-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 24);お
よび κ−PVIIA [N5A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Ala-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 25)。Ｃ末端が遊離カルボキシル基を含むのが好ましい。

【０００７】さらに本発明は、Arg残基がLys、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Lys、
Ｎ−メチル−Lys、Ｎ,Ｎ−ジメチル−Lys、Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチル−Lysまたはい
ずれかの合成塩基性アミノ酸で置換されてよく；Lys残基がArg、オルニチン、ホ
モアルギニン、ノル−Lysまたはいずれかの合成塩基性アミノ酸で置換されてよ
く；Tyr残基がいずれかの合成ヒドロキシ含有アミノ酸で置換されてよく；Ser残
基がTyrまたはいずれかの合成ヒドロキシル化アミノ酸で置換されてよく；Thr残
基がSerまたはいずれかの合成ヒドロキシル化アミノ酸で置換されてよく；Pheお
よびTrp残基がいずれかの合成芳香族アミノ酸で置換されてよく；およびAsn、Se
r、ThrまたはHyp残基がグリコシル化（Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンを含む
）されてよい、上記ペプチドの誘導体に関する。Cys残基が、ＤまたはＬ配置で
あってよく、必要に応じて、ホモシステイン（ＤまたはＬ）で置換されてよい。
Tyr残基が３−ヒドロキシルまたは２−ヒドロキシル異性体（それぞれ、メタ−T
yrまたはオルソ−Tyr）ならびに対応するＯ−スルホ−およびＯ−ホスホ誘導体
で置換されてもよい。酸性アミノ酸残基が、GlyおよびAlaのテトラゾリル誘導体
などのいずれかの合成酸性アミノ酸で置換されてもよい。脂肪族アミノ酸が、非
天然の脂肪族分枝鎖または直線側鎖Ｃ_ｎＨ２_ｎ＋２(ｎは８以下)を有する合成誘
導体で置換されてもよい。

【０００８】合成芳香族アミノ酸の例として、ニトロ−Phe、４−置換−Phe[ここで、置換
基は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル、カルボキシル、ヒドロキシメチル、スルホメチル、
ハロ、フェニル、−ＣＨＯ、−ＣＮ、−ＳＯ_３Ｈおよび−ＮＨＡｃである]など
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合成ヒドロキシ含有アミノ
酸の例として、４−ヒドロキシメチル−Phe、４−ヒドロキシフェニル−Gly、２
,６−ジメチル−Tyrおよび５−アミノ−Tyrなどが挙げられるが、これらに限定
されるものではない。合成塩基性アミノ酸の例として、Ｎ−１−(２−ピラゾリ
ニル)−Arg、２−(４−ピペリニル)−Gly、２−(４−ピペリニル)−Ala、２−[
３−(２Ｓ)ピロリニニル]−Glyおよび２−[３−(２Ｓ)ピロリニニル]−Alaなど
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらおよび他の合成塩基
性アミノ酸、合成ヒドロキシ含有アミノ酸または合成芳香族アミノ酸は、マサチ
ューセッツ州ウォーセスターのＲＳＰ・アミノ・アシッド・アナローグズ・イン
コーポレイテッドから市販されている「Building Block Index、Version３.０」
(１９９９カタログ、ヒドロキシ含有アミノ酸および芳香族アミノ酸については
ｐ４〜４７、塩基性アミノ酸についてはｐ６６〜８７；http://www.amino-acids
.comも参照せよ；これらは全体を参考文献として本発明に援用される）に記載さ
れている。慣例の技術を用いて保護基含有残基を脱保護する。合成酸性アミノ酸
の例として、Ornsteinら（１９９３）および米国特許第５３３１００１号（これ
らは全体を参考文献として本発明に援用される。）に記載されているような、カ
ルボキシル、ホスフェート、スルホネートおよび合成テトラゾリル誘導体などの
酸性官能基を有する誘導体が挙げられる。

【０００９】本発明にしたがって、グリカンは、当業界で公知の合成的または酵素的方法に
よって天然または修飾アミノ酸のヒドロキシ、アミノまたはチオール基のいずれ
かに結合することができるＮ−、Ｓ−またはＯ−結合モノ−、ジ−、トリ−、ポ
リ−またはオリゴ糖類のいずれかを意味する。グリカンを構成する単糖類として
、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グ
ロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトサミン
、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−
Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−フコースまたはＤ−アラ
ビノースが挙げられる。これらの糖類を、１つまたはそれ以上のＯ−スルフェー
ト、Ｏ−ホスフェート、Ｏ−アセチルまたはし有る酸などの酸性基またはそれら
の組み合わせなどで構造的に修飾してもよい。グリカンが、Ｄ−ペニシルアミン
２,５およびそのハロゲン化誘導体またはポリプロピレングリコール誘導体など
の類似のポリヒドロキシ基を含んでもよい。グリコシド結合は、ベータおよび１
−４または１−３であり、１−３が好ましい。グリカンとアミノ酸との間の結合
は、アルファまたはベータであり、アルファが好ましく、１−である。

【００１０】コアＯ−グリカンが、Van de Steenら（１９９８）（これは全体を参考文献と
して本発明に援用される）に記載されている。ムチン型Ｏ−結合オリゴ糖類は、
ＧａｌＮＡｃによって、SerまたはThr（または本発明ペプチドの他のヒドロキシ
ル化残基）に結合する。単糖類ビルディングブロックおよびこの最初のＧａｌＮ
Ａｃ残基に結合した結合は、“コアグリカン”を定義し、その８つが同定されて
いる。グリコシド結合のタイプ（方向性および結合性）が、各コアグリカンに対
して定義される。適当なグリカンおよびグリカン類縁体が、１９９９年１０月１
９日出願の米国特許出願０９／４２０７９７および１９９９年１０月１９日出願
のＰＣＴ／ＵＳ９９／２４３８０（国際公開ＷＯ００／２３０９２）（これらは
全体を参考文献として本発明に援用される）にも記載されている。好ましいグリ
カンは、Ｇａｌ(β１→３)ＧａｌＮＡｃ(α１→)である。

【００１１】必要に応じて、上記ペプチドにおいて、Cys残基のペアを、イソテリックラク
タムまたはSer／(GluまたはAsp)、Lys／(GluまたはAsp)もしくはCys／Ala組み合
わせなどのエステル−チオエーテル置換基で、ペアにて置き換えてもよい。公知
の方法によるシーケンシャルカップリング（Barnayら、２０００；Hrubyら、１
９９４；Bitanら、１９９７）によって、天然のCysブリッジがラクタムブリッジ
で置換される。チオエーテル類縁体は、ＲＳＰ・アミノ・アシッド・アナローグ
ズから市販されているハロ−Ala残基を用いて容易に合成することができる。

【００１２】（好ましい具体例の詳細な記載）本発明は、ＡＴＰ感受性Ｋ^＋チャネルを活性化するためのカッパ−コノトキシ
ンＰＶＩＩＡ（κ−ＰＶＩＩＡ）、類縁体および誘導体の使用に関する。ＡＴＰ
感受性Ｋ^＋チャネルの活性化は、本明細書においてさらに詳しく説明するような
多くの生理的疾患および傷害を治療するのに有用である。さらに詳しくは、本発明は、心臓虚血、ニューロン虚血、眼虚血および喘息を
治療するのに用いることができるＫ_ＡＴＰチャネルを開くための、κ−ＰＶＩＩ
Ａ、類縁体および誘導体の使用に関する。別の態様において、本発明は、有効量のκ−ＰＶＩＩＡ、類縁体、誘導体また
は医薬的に許容しうる塩を含む医薬組成物に関する。このような医薬的に許容し
うる塩は、Ｋ_ＡＴＰチャネルのアクチベーターとして働く能力を有する。したが
って、本発明医薬組成物は、上記疾患の治療に有用である。

【００１３】 κ−ＰＶＩＩＡは、米国特許第５６７２６８２号に記載されているように、Co
nus purpurascensから単離することができるが、あるいは米国特許第５６７２６
８２号に記載されているように、一般的合成法によって化学的に合成することも
できる。別法として、κ−ＰＶＩＩＡをコードするＤＮＡ（Shonら、１９９８）
を用いる慣例の組換えＤＮＡ技術（Sambrookら、１９８９）によって、天然のペ
プチドを合成することができる。自動合成機を用いてペプチドを合成することも
できる。Advanced ChemTech ３５７ Automatic Peptide Synthesizerを用い、Ｃ
末端から開始してアミノ酸をＭＢＨＡ Rink樹脂（代表的には樹脂１００ｍｇ）
へ連続的にカップリングさせる。カップリングは、Ｎ−メチルピロリジノン（Ｎ
ＭＰ）中、１,３−ジイソプロピルカルボジイミドを用いて行うか、または２−(
１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム
・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジエチルイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＥＡ）によって行う。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％
ピペリジン溶液で処理することによってＦＭＯＣ保護基を除去する。ＤＭＦ（２
回）、次いで、メタノールおよびＮＭＰで樹脂を連続的に洗浄する。

【００１４】前述のτ−コノトキシンペプチドのムテイン、類縁体または活性フラグメント
もまた本明細書に企図される。Hammerlandら（１９９２）などを参照。コノトキ
シンペプチドの誘導体ムテイン、類縁体または活性フラグメントは、米国特許第
５５４５７２３号（特に、カラム２の５０行からカラム３の８行を参照）；第５
５３４６１５号（特に、カラム１９の４５行からカラム２２の３３行を参照）；
および第５３６４７６９号（特に、カラム４の５５行からカラム７の２６行を参
照）に概要が記載されているような慣例のアミノ酸置換などの公知の技術にした
がって合成することができる。有効成分として本発明化合物またはその医薬的に許容しうる塩を含有する医薬
組成物は、慣例の医薬製造技術にしたがって製造することができる。「Remingto
n's Pharmaceutical Sciences、１８版」（１９９０、マーク・パブリッシング
・カンパニー、イーストン、ペンシルバニア）などを参照。代表的には、Ｋ_ＡＴ _Ｐチャネル活性化量の有効成分を医薬的に許容しうる担体に混合する。担体は、
静脈内、経口または非経口などの投与に望まれる処方形態に応じて広範囲の剤形
を採用することができる。組生物はさらに、抗酸化剤、安定化剤、保存剤などを
含むことができる。デリバリー方法の例として、米国特許第５８４４０７７号参
照；これは全体を参考文献として本発明に援用される。

【００１５】 “医薬組生物”は、医薬的投与にとって安定な物理的に別々の密着した部分を
意味する。“単位投与剤形における医薬組生物”は、それぞれ有効化合物の一日
用量または複数回投与用用量（４回まで）もしくはサブ複数回投与用用量（４０
分の１まで）ならびに担体を含むか、および／または容器に封入された、医薬的
投与にとって安定な物理的に別々の密着した部分を意味する。組生物が一日用量
または一日用量の２分の１、３分の１もしくは４分の１などのいずれの量を含む
かは、医薬組生物が、それぞれ一日１回、または２回、３回もしくは４回で投与
されるべきであるかどうかに応じて決まる。

【００１６】本明細書で用いる“塩”は、無機または有機酸および／または塩基と形成され
た酸性および／または塩基性の塩を意味する（塩基性塩が好ましい）。特に、薬
剤として本発明化合物を用いる場合、医薬的に許容しうる塩が好ましいが、これ
れらの化合物の加工において、あるいは非薬剤型の使用が企図される場合、他の
塩も有用である。これらの化合物の塩は、当業界で公知の技術によって製造する
ことができる。このような医薬的に許容しうる塩の例として、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩または
リン酸塩および酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、安
息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン
酸塩、イソチオン酸塩、テオフィリン酢酸塩、サリチル酸塩などの無機および有
機付加塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。低級アルキル第４
アンモニウム塩なども同様に適している。

【００１７】本明細書で用いる“医薬的に許容しうる”担体は、非毒性の不活性固体、半固
体液体フィラー、希釈剤、カプセル封入物質、いずれかのタイプの製剤補助剤ま
たは生理的食塩水などの単に滅菌した水性媒体を意味する。医薬的に許容しうる
担体として機能できる物質のいくらかの例は、ラクトース、グルコースおよびス
クロースなどの糖、コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンなどのデンプン、セル
ロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび
酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカントゴム；麦芽、ゼラチン、タ
ルク；カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ
油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油；プロピレング
リコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポ
リエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エ
チルなどのエステル、寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど
の緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性生理的食塩水、リンゲル
液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬処方において用いられ
る他の非毒性の適合性物質である。

【００１８】また、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤
、乳化剤および滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香
味剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤は、処方者の判断により該組成物中に
存在できる。医薬的に許容しうる抗酸化剤の例には、これらに限定されるもので
はないが、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重
亜硫酸水素ナトリウム、硫酸ナトリウム等などの水溶性抗酸化剤；アスコルビル
パルミテーロ、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）またはブチル化ヒドロ
キシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロ
ール等などの油可溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等などの金属キレート化剤が含まれる
。

【００１９】経口投与に関しては、化合物をカプセル剤、丸薬、錠剤、トローチ剤、メルト
剤、散剤、懸濁剤または乳剤などの固体または液体の調製物に製剤し得る。経口
投与形態で組成物を調製することにおいては、いずれかの通常の医薬媒体を用い
ることができ、これは例えば、（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤など
の）経口液体調製物の場合においては、水、グリコール、油剤、アルコール、香
味剤、保存料、着色剤、懸濁化剤等；あるいは（例えば、散剤、カプセル剤およ
び錠剤などの）経口固体調製物の場合においては、デンプン、糖、希釈剤、顆粒
化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等などの担体である。投与におけるそれらの簡便
性のために、錠剤およびカプセル剤は最も有利な単位投与剤形を表し、その場合
、固体医薬担体を用いることが多い。所望ならば、錠剤は標準的な技術によって
糖衣または腸溶衣をかけ得る。活性剤をカプセル化して、それが血液脳関門を通
過することを許容すると同時に胃腸管を安定に通過させ得る。例えば、ＷＯ９６
／１１６９８を参照。

【００２０】非経口投与に関しては、化合物を医薬担体に溶解して、液剤または懸濁剤とし
て投与できる。適当な担体の例示は水、生理的食塩水、デキストロース溶液、フ
ラクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成起源の油剤である
。また、担体には、他の成分、例えば、保存剤、懸濁化剤、可溶化剤、緩衝剤等
も含まれ得る。また、化合物を髄腔内投与する場合、それらを脳脊髄液に溶解で
きる。

【００２１】様々な投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は、選択された特定
の薬物、治療されるべき疾患状態の重篤度および治療上の効力のために必要とさ
れる用量にもちろん依存するであろう。本発明の方法は、一般的に言えば、医学
的に許容できるいずれの様式の投与を用いても実施でき、臨床的に許容できない
副作用を生じることなく、活性化合物の有効レベルを生じるいずれの様式も意味
する。かかる投与様式には、経口、直腸、舌下、局所、鼻、経皮または非経口の
経路が含まれる。「非経口」なる用語は、皮下、静脈内、硬膜外、潅注、筋肉内
、放出ポンプまたは注入が含まれる。

【００２２】例えば、本発明による活性剤の投与は、いずれの適当なデリバリー手段を用い
ても達成でき、（ａ）ポンプ（例えば、LauerおよびHatton（１９９３）、Zimmら（１９８４）
ならびにEttingerら（１９７８）参照）；（ｂ）マイクロカプセル化（例えば、米国特許第４,３５２,８８３号；第４,３
５３,８８８号および米国特許第５,０８４,３５０号参照）；（ｃ）持続性放出ポリマーインプラント（例えば、米国特許第４,８８３,６６６
号参照）；（ｄ）マイクロカプセル化（例えば、米国特許第５,２８４,７６１号、第５,１
５８,８８１号、第４,９７６,８５９号および第４,９６８,７３３号ならびに公
開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９５／０５４５２参照）；（ｅ）ＣＮＳに対する裸のまたは非カプセル化の細胞移植（例えば、米国特許第
５,０８２,６７０号および第５,６１８,５３１号参照）；（ｆ）皮下、静脈内、動脈内、筋肉内もしくは他の適当な部位への注射；または（ｇ）カプセル剤、液剤、錠剤、丸剤または持続性放出製剤における経口投与；が含まれる。

【００２３】本発明の１つの具体例において、活性剤は、ＣＮＳ、好ましくは、脳室、脳実
質、髄腔または他の適当なＣＮＳ位置、最も好ましくは髄腔内に直接的にデリバ
リーされる。別法として、ターゲティング治療を用いて、抗体または細胞特異的リガンドな
どのターゲティング・システムの使用によって、さらにとりわけ、ある種のタイ
プの細胞に活性剤をデリバリーできる。ターゲティングは、種々の理由、例えば
、薬剤が許容できない毒性がある場合、余りにも高用量を必要とする場合、また
は標的細胞に入ることができない場合に望ましい。また、ペプチドである活性剤は、活性剤をコードするＤＮＡ配列を患者の体内
、とりわけ脊髄領域に移植するために設計された細胞に導入する細胞ベースのデ
リバリーシステムにて投与できる。適当なデリバリーシステムは、米国特許第５
,５５０,０５０号およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９４／２
５５０３、ＷＯ９５／０１２０３、ＷＯ９５／０５４５２、ＷＯ９６／０２
２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、ＷＯ９６／４０９
５９およびＷＯ９７／１２６３５に記載されている。適当なＤＮＡ配列は、開示
された配列および公知の遺伝暗号に基づいて、各活性剤について合成により調製
できる。

【００２４】活性剤は、好ましくは、治療上有効量にて投与される。活性化合物の「治療上
有効量」または単に「有効量」とは、いずれの医学的治療にも適用できる適当な
利益／リスク比にて、痛みを軽減するか、または鎮痛を導入するのに十分な量を
意味する。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療す
べき症状の性質および程度に依存するであろう。治療の処方箋、例えば、投与量
、時期等に関する決定は、一般の医師または専門医の責任の範囲内にあり、典型
的には治療すべき障害、個々の患者の症状、デリバリー部位、投与方法、および
医師に知られている他の因子を考慮する。技術およびプロトコールの例は、Remi
ngton's Pharmaceutical Sciencesに見出すことができる。

【００２５】用量は、局所的または全身的に所望の薬剤レベルを達成するように適当に調節
する。代表的には、本発明の活性剤は、有効成分が約０.００１ｍｇ／ｋｇ〜約
２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０.０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、さ
らに好ましくは約０.０５ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇの用量範囲にて効果を
表す。適当な用量を一日当たり、複数回のサブ用量にて投与することもできる。
代表的には、用量またはサブ用量は、単位投与剤形当たり約０.１ｍｇ〜約５０
０ｍｇの有効成分を含む。より好ましい用量は、単位投与剤形当たり約０.５ｍ
ｇ〜約１００ｍｇの有効成分を含む。一般に用量は、低レベルで開始し、所望の
効果が達成されるまで増加する。有効成分の固定用量を提供するように各単位を適合させた用量単位として組生
物を製剤するのが有利である。本発明の投与剤形の例としては、錠剤、被覆錠剤
、カプセル剤、アンプルおよび座薬などが挙げられる。有効成分が、有効量、すなわち、一回または複数回単位用量において採用され
た適当な有効用量が用量剤形に一致するような量を構成することのみが必要であ
る。ヒトまたは動物のための使用においては、正確な各回の用量ならびに一日用
量は、医師または獣医の指示の下、標準的医学原則にしたがって決定される。

【００２６】一般に医薬組生物は、全組生物の重量に対し、約０.０００１〜９９重量％、
好ましくは約０.００１〜５０重量％、より好ましくは約０.０１〜１０重量％の
有効成分を含む。活性剤に加えて、医薬組生物および医薬は、他の医薬的活性化
合物を含むこともできる。他の医薬的活性化合物の例として、鎮痛剤、サイトカ
インおよび臨床薬の主要な領域のすべてにおける治療剤が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。他の医薬的活性化合物とともに用いる場合、本発明
のコノトキシンペプチドは、薬物カクテルの形態でデリバリーしてもよい。カク
テルは、他の薬物または作用剤を含む本発明の有用な化合物のいずれか１つの混
合物である。この具体例において、通例の投与ビヒクル（丸剤、錠剤、インプラ
ント、ポンプ、注射液など）には、本組生物および補足的薬効増強剤の両方が含
まれる。カクテルの個々の薬物は、治療有効量にてそれぞれ投与される。治療有
効量は、前述のパラメーターによって決定される；しかし、いずれの事例におい
ても、該有効量は、所望の効果に到達するのに有効な時間の間、薬物を必要とす
る身体の領域において薬物のレベルを安定させる量である。

【００２７】Ｋ_ＡＴＰチャネルのアクチベーターは、喘息、心臓虚血および脳虚血などの治
療にとって治療的重要性をもつ。喘息：喘息は、米国だけでも約１２００万人の人々が罹患する重篤かつよくあ
る身体状態である。この疾患は、児童において特に重篤であり、非常に多くの数
の喘息患者が１８歳以下であると見積もられている（ナショナル・ヘルス・サー
ベイ、ナショナル・センター・オブ・ヘスル・スタティクス、１９８９）。該疾
患は、慢性炎症および気管の過剰反応を特徴とし、その結果として、喘ぎと呼吸
困難の周期的な発作が起こる。発作は、トリガー物質に接触した結果として気管
平滑筋が炎症を起こし、腫れるときに生じる。重症のケースでは、平滑筋収縮の
結果として気管が、閉塞または遮蔽される。さらに問題を悪化させるのは、気管
を閉塞するように作用する大量の粘液の放出である。慢性喘息は、最も一般的に
はコルチコステロイドの吸入による予防的治療が行われるが、急性発作の治療に
は、気管支拡張薬、通常β２アゴニストの吸入が行われる。しかし、コルチコス
テロイドの吸入による慢性治療は、免疫系の障害、高血圧、骨粗鬆症、副腎機能
不全および菌への感染性の増大というリスクを伴う（Rakel、１９９７）。さら
に、β２アゴニストの使用は、幾つかのケースにおいて、震顫、頻脈および動悸
ならびに筋肉痙攣などの逆反応を引き起こすことが報告されている（Rakel、１
９９７）。したがって、副作用のより少ない抗喘息薬の開発が強く望まれている
。

【００２８】Ｋ^＋チャネルオープナーは、気管の活動亢進誘発性遮蔽を低減化する気管平滑
筋の有効な弛緩薬であることがわかっている。低温保存ヒト気管支（Muller−Sc
hweinitzerおよびFozard、１９９７）および単離モルモット気管組織標本（Lin
ら、１９９８；Andoら、１９９７；Nielson−Kudsk、１９９６；Nagaiら、１９
９１）において。Ｋ_ＡＴＰチャネルオープナーは、筋肉が自発的に収縮されるも
のであれ、一連の痙攣原物質によって誘発されるものであれ、弛緩を引き起こし
た。これらの状態において、Ｋ^＋チャネルオープナーは、Ｋ^＋イオン流出および
その結果として生じる膜過分極を引き起こすように作用していると考えられる。
結果として、電位感受性Ｃａ^２＋チャネルが閉じ、細胞内カルシウムレベルが低
下し、筋肉弛緩を引き起こす。新規なより特異性の高いＫ_ＡＴＰオープナーの開
発により、喘息の予防および徴候治療の両方への新規なアプローチを提供するこ
とができる。Ｋ_ＡＴＰチャネルは、標的組織以外にも多くのタイプの組織に存在し、したが
って、その活性化の結果として望ましくない副作用が生じうる。特に、Ｋ_ＡＴＰチャネルは、血管平滑筋に見出されるので、Ｋ_ＡＴＰオープナーの有益な抗喘息
特性以外に、血圧低下が伴う可能性がある。吸入薬の形式で該化合物を気管平滑
筋へ直接デリバリーすると、化合物の濃度が低下し、それによって、逆反応を最
小化できる可能性がある。

【００２９】心臓虚血：心臓組織におけるカリウムチャネルの多くのサブタイプが、まだ完
全には特徴づけられていないが、Ｋ_ＡＴＰチャネルのオープナーは、心臓保護薬
として大いに有望である。狭心症の患者においてＫ^＋チャネルオープナーによっ
て提供される有益な血管拡張効果は、今や十分に確立されている（Chenら、１９
９７；Goldschmidtら、１９９６；Yamabeら、１９９５；Koikeら、１９９５）。
さらに、Ｋ_ＡＴＰチャネルは、短時間の虚血期間後の心筋の急性予備調整に関与
して、リスク（Pellら、１９９８）および再潅流梗塞の大きさ（Kouichiら、１
９９８）を減少させるように働いているとも思われる。Ｋ_ＡＴＰチャネルの細胞保護特性の直接の証拠は、Jovanovicら（１９９８ａ
）によって明らかにされた。こららの実験においては、Kir6.2/SUR2A(心臓Ｋ_Ａ
_ＴＰ）チャネルをコードするＤＮＡが、ＣＯＳ−７サル細胞にトランスフェクト
され、カルシウムローディングの程度がモニターされた。トランスフェクトされ
なかった細胞は、低酸素症／再酸素添加後に見られる細胞内カルシウムの増加に
対して脆弱であることがわかった。しかし、Ｋ_ＡＴＰチャネルで細胞をトランス
フェクションすることによって、低酸素症／再酸素添加の潜在的に有害な影響に
対する耐性が付与された。したがって、心臓Ｋ_ＡＴＰチャネルは、再灌流傷害に
対する心筋の保護において重要な役割を演じるものと思われる。

【００３０】脳虚血：脳虚血の治療は、過去３０年間にわたってかなりの進歩を遂げている
が、脳虚血（脳卒中）は、依然として米国における死亡原因の第３位である。５
０００００人以上の新たな脳卒中／虚血の症例が毎年報告されている。初期死亡
率は高い（３８％）が、米国において３００万人近くの脳卒中からの生存者がお
り、米国における毎年のこれらの患者のリハビリテーションのコストは、１７０
億ドル近いものである（Rakel、１９９７）。虚血後の最初の細胞への影響は非常にすばやく（およそ数分）起こるが、実際
の細胞の破壊は、梗塞の数時間または数日後まで起こらない。最初の影響には、
生物エネルギー不全およびＮａ^＋チャネルの不活性化による脱分極が含まれる。
電位依存性カルシウムチャネルが活性化され、細胞内カルシウムが大量に上昇す
る。さらに問題を悪化させるのは、イオン刺激性グルタミン酸塩受容体を介して
それ自体Ｎａ^＋およびＣａ^２＋の両方の流入を増加するグルタミン酸塩の大きな
一過性の放出である。グルタミン酸塩も、代謝刺激性受容体に結合し、その結果
として、リン酸イノシトール経路が活性化される。このことが、細胞内に貯蔵さ
れているカルシウムのさらなる放出という細胞内イベントのカスケードを誘発す
る。この細胞内カルシウムの初期オーバーロードが、結局、数時間または数日後
に見られる遅延細胞毒性を導くことが今や十分に受け入れられている。

【００３１】近年、非常に短い低酸素性チャレンジにさらされたドーパミン作用性ニューロ
ンが、Ｋ_ＡＴＰチャネルの開口を介して最初に過分極することが報告されている
（Guatteoら）。この刺激効果は、代謝要求の増加および結果として生じる細胞
内ＡＴＰレベルの低下の直接の結果であることが示唆された。さらに、Jovanovi
cら（１９９８ｂ）は、近年、Kir6.2/SUR1(ニューロンＫ_ＡＴＰ）チャネルをコ
ードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞が、低酸素症／再酸素添加によっ
て引き起こされる傷害に対する耐性の増加を示すことを報告した。したがって、
Ｋ_ＡＴＰチャネルの開口は、ニューロン組織における短期間の酸素低下中に、き
わめて重大な細胞保護の役割を果たすことができる。このように、このカルシウ
ム流入を予防的に防止するように働くだけでなく、損傷組織において正常な休止
膜電位を再確立するのを促進する化合物の開発において、大きな治療的可能性が
ある。κ−ＰＶＩＩＡによる治療は、Ｋ_ＡＴＰチャネルを開くように作用して、
膜過分極を誘発し、間接的に電位依存性Ｃａ^２＋チャネルの閉鎖を引き起こし、
その結果として、多量のカルシウム流入の有害な影響を予防あるいは減少する。本発明は、インビトロでの気管培養物において最大過分極を引き起こすのに必
要な濃度より非常に高い濃度のκ−ＰＶＩＩＡの静脈内（ＩＶ）注射が、麻酔ラ
ットにおいて血圧あるいは心拍に影響を及ぼさないことを見出した。我々の予備データは、筋細胞の初代培養において、κ−ＰＶＩＩＡが、非常に
強力にグリベンクラミド感受性電流を誘発することを示す。さらに、κ−ＰＶＩ
ＩＡの存在下での初代筋細胞培養のインキュベートは、低酸素症誘発脱分極に対
する保護を付与する。

【００３２】（実施例）以下の実施例を参照して本発明を記載するが、この実施例は例示のために提供
されるものであり、いかなる意味でも本発明を制限することを意図しない。当該
分野において周知の標準技術および以下に記載した技術を利用した。実施例１実験方法１．細胞培養プロトコルラット新生仔の皮質細胞、心室筋細胞、気管平滑筋細胞および海馬細胞の初代
培養系を調製した。皮質半球から髄膜を取り除き、海馬をとりだし、２０Ｕ／ml
パパインを使用してばらばらに分離した。細胞を３７℃で４５分間、混合し続け
ることにより解離させた。培地（10ml、DMEM/F12±10％ウシ胎仔血清±B27ニュ
ーロン用補充物；Life Technologies）中で、BSA fractionＶ（1.5mg／ml）およ
びトリプシンインヒビター（1.5mg／ml）を用いて消化を停止させた。細胞を穏
やかに粉砕して、周辺の結合組織から細胞を分離した。流体操作ロボット（flui
d-handling robot）（Quadra 96, Tomtech）を使用して、細胞をPrimariaで処理
した96ウェルプレート（Becton-Dickinson）に配置した。各ウェルに約25,000細
胞をロードした。プレートを加湿５％CO_２インキュベーター（37℃）に配置し、
蛍光スクリーニングの前に少なくとも５日間保持した。心室を２mm角切片にさい
の目状にし、20Ｕ/mlパパインおよびトリプシン/EDTA 1X（Life technologies）
の存在下で消化した。同じ消化酵素を使用して気管表面上の平滑筋細胞を培養し
た。培養方法は上記の方法に従った。

【００３３】２．蛍光アッセイ蛍光アッセイ用に、137mM NaCl、５mM KCl、10mM HEPES、25mMグルコース、３
mM CaCl_２および１mM MgCl_２を含有する生理食塩水を使用した。ジ-8-ANEPP：電圧感受性色素電圧感受性色素、ジ-8-ANEPPを使用して、膜電位に対する化合物の影響を試験
した。ジ-8-ANEPP（２μＭ）をDMSOに溶解し（最終浴（bath）濃度、0.3％）、
１０％プルロニック酸（pluronic acid）の存在下で細胞にロードした。実験を
開始する前に、プレートを40分間インキュベートし、次いで生理食塩水溶液を用
いて４回洗浄した。ジ-8-ANEPPは、プルロニック酸の存在下で膜を横切り、細胞
毒性の色素のプールを生じる。ジ-8-ANEPPは原形質膜へと侵入し、それによる電
位の変化により分子の再配置が生じる。過分極の間に、色素の細胞質蓄積から原
形質膜の外部リーフレット（leaflet）へと色素がインターキレート(interchela
te)する。過分極は蛍光レベルにける正のシフトとして表され、脱分極は負のシ
フトとして表される。ANEP色素は、膜電位100mVの変化あたり蛍光強度10％の、
かなり均一な変化を示し、従って、蛍光の変化は膜電位の変化と関係づけること
ができる。

【００３４】 PBFI:Ｋ^＋感受性色素 PBFI色素の脂溶性AMエステルを使用して、細胞内カリウムレベルに対するκ-P
VIIAの影響を試験した。色素を20％プルロニック酸と共に細胞質に負荷すると、
エステラーゼにより色素がエステルから切断され、色素は効率よく細胞内に捕捉
された。細胞内カリウム（Ｋ^＋i）の上昇は蛍光の上昇として反映され、細胞内
カリウム（Ｋ^＋i）の減少は蛍光の低下として反映される。スクリーニングの前
に、予め細胞を５μＭ PBFI中で３〜４時間インキュベートした。ジ-8-ANEPP色
素を用いる場合、実験の開始前にプレートを４回、生理食塩水を用いてリンスし
た。

【００３５】フルオ-3-カルシウム感受性色素細胞内カルシウムの変化を試験するために、脂溶性エステルであるフルオ-3色
素（DMSO中２μＭ、DMSOの最終浴濃度は0.3％）を、20％プルロニック酸の存在
下で細胞に負荷する。実験の開始前にプレートを35分間インキュベートし、生理
食塩水溶液を用いて４回洗浄する。細胞内カルシウム濃度の上昇および減少は、
それぞれ、蛍光パーセントにおける正および負の変化として反映される。

【００３６】エチジウムホモダイマー−１：細胞生存性色素細胞毒性薬剤により生じた細胞性傷害の程度を、色素エチジウムホモダイマー
−１（分子プローブ）を用いて測定した。この色素は、無傷の原形質膜とは架橋
しないが、傷害を受けた細胞には容易に入り込むことができる。核酸との結合の
際に、色素は蛍光の増強を受ける。それゆえ、細胞性傷害の程度は蛍光の量と関
係づけることができる。興奮毒性アッセイに関する調製においては、細胞を３回
リンスし、予めκ-PVIIAまたは等量の生理食塩水で調製しておいた。細胞を15分
間インキュベートし、グルタメート（５〜500μＭ）をプレートの適切なレーン
に添加した。細胞をさらに30分間インキュベートし、徹底的に、４回洗浄した。
エチジウム色素（４μＭ）を全てのウェルに負荷し、すぐに読み取りを行った。
ついで、１時間間隔で読み取りを行った。

【００３７】３．蛍光プロトコル蛍光測定は、96ウェルプレートの１ウェルあたりおよそ25,000細胞からの細胞
性応答の平均である。皮質由来の細胞の培養物は、少なくとも垂体ニューロン、
双極性ニューロン、介在ニューロンおよび星状細胞を含む。膜電位の変化（ジ-8
-ANEPP）、細胞性傷害（エチジウムホモダイマー−１）、細胞内Ｋ^＋（PBFI）お
よびCa^２＋（フルオ-3）を、κ-PVIIA単独、または特定のレセプター／イオンチ
ャネルアゴニストまたはアンタゴニストの存在下で、κ-PVIIAを用いて誘発した
反応の指標として使用した。濃度-反応をκ-PVIIAを用いて回収し、有効範囲を
決定した。ウェル間の変動（well-to-well variability）を最小にするため、予
備処理における蛍光の程度を処理後の蛍光の程度と比較することにより、各ウェ
ルを自身のコントロールとして機能させた。この正規化プロセスにより、プレー
ト間および培養物間での、相対的な反応の比較が可能となる。各ウェルにおける
混合型細胞集団を蛍光計を用いて測定し、個々の細胞のシグナル反応を平均化し
た。８個のウェルからの平均値および平均の標準誤差を含む統計値により、処理
間における有意差の比較が可能となった。結果は、蛍光における変化の割合（％
）として示した。プレートの初期読み取りは生理食塩水で行った。ジ-8-ANEPP、
フルオ-3またはPBFI色素を用いる測定は、化合物の存在下で15秒、２分、５分、
10分、20分および30分の時間間隔で行った。エチジウムホモダイマー−１を用い
る読み取りは１時間間隔で行った。

【００３８】４．気管平滑筋調製モルモットを頸部脱臼により屠殺し、気管を切除して結合組織を取り除いた。
気管を４または５個の切片に切断し、気管筋肉の反対側の軟骨環（ring of cart
ilage）まで切断することにより開いた。各セグメントを、NaCl 118.2mM、KCl 4
.7mM、MgSO_４ 1.2mM、KH_２PO_４ 1.2mM、グルコース 11.7mM、CaCl_２ 1.9mMおよ
びNaHCO_３ 25.0mMを含有する器官浴に載せた。浴を37℃に維持し、95％Ｏ_２およ
び５％CO_２のガスを供給した。実験開始前に、調製物を１ｇの張力で維持し、
60分間平衡化させた。グラスポリグラフ（grass polygraph）に連結した力変位
変換器（force-displacement transducer）を使用して等尺的に収縮を測定した
。60秒間の平衡化時間に続いて、気管を準最大収縮のヒスタミンに曝した。痙攣
原物質に対する収縮反応が一定になるまでこの工程を反復した。ヒスタミン非存
在下および存在下で、増加濃度のκ-PVIIAの弛緩効果を決定した。

【００３９】５．パッチクランプ記録ポリオルニチン／ポリ−Ｄ−リジンでコーティングしたカバーガラス上で皮質
ニューロンから、およびコーティングしていないカバーガラス上で筋細胞から、
全細胞のパッチクランプ記録を作製した（培養５〜28日目）。薄壁(thin-wall)
ホウ化ケイ酸ガラスからパッチピペットを引きこんだ。これは４Ｍ〜６Ｍの抵抗
を有していた。電流をEPC 9増幅器（HEKA）で記録し、マッキントッシュパワー
ＰＣで動かせたソフトウェア（Pulse，HEKA）によりコントロールした。全細胞
電流を10kHzで低域フィルターにかけ、94kHzのサンプリング速度で記録するため
にVR-10bデジタルデータレコーダーでデジタル処理した。細胞内ピペットは以下
を含む：107mM KCl、33mM KOH、10mM EGTA、１mM MgCl_２、１mM CaCl_２および10
mM HEPES。NaOHを用いて溶液をpHを7.2にし、実験直前に0.1〜0.5mMNa_２ATPおよ
び0.1mM NaADPを添加した。細胞外溶液は以下を含む：60mM KCl、80mM NaCl、１
mM MgCl_２、0.1mM CaCl_２および10mM HEPES。NaOHを用いて細胞外溶液をpHを7.4
にした。高濃度のカリウムにより、カリウムに関して計算値-20mVの逆転電位を
生じる。結果として、保持電位が-20mVよりもネガティブならばＫチャネルの開
口によりＫイオンの内部への流入および全細胞電流の下方への偏向が生じる。Ｋ _ＡＴＰチャネルが弱い内向きの整流特性を有し、より強い内向きの電流が予想さ
れるので、これらの溶液を選択した。進行中の実験は、低カリウムレベルの溶液
中でのκ-PVIIAの影響を示す。

【００４０】６．電気生理学的溶液異なるＫ^＋イオン濃度およびNa^＋イオン濃度を有する２つの細胞外溶液を使用
した。溶液１は５mM KClを含み、-84mVのカリウム平衡電位（Ｅ_ｋ）を有し、溶
液２は60mM KClを含み、-20mVの対応するＥ_ｋを有していた。細胞外溶液１は以
下を含む：５mM KCl、135mM NaCl、１mM MgCl_２、0.1mM CaCl_２および10mM HEPE
S。外部溶液のpHをNaOHを用いてpH7.4に中和した。細胞外溶液２は以下を含む：
60mM KCl、80mM NaCl、１mM MgCl_２、0.1mM CaCl_２および10mM HEPES。外部溶液
のpHをNaOHを用いてpH7.4に中和した。細胞内ピペットは以下を含む：107mM KCl
、33mM KOH、10mM EGTA、１mM MgCl_２、１mM CaCl_２および10mM HEPES。NaOHお
よび0.1〜0.5mM Na_２ATPを用いて溶液をpHを7.2にし、実験直前に0.1mM NaADPを
添加した。

【００４１】７．電気生理学的結果の解釈低濃度の外部Ｋ^＋イオンの存在下（溶液１）および-84mVよりも脱分極してい
る保持電位では、Ｋ^＋チャネルの開口はＫ^＋イオンの外向きの流れを生じる。高
濃度の外部Ｋ^＋イオンの存在下（溶液２）では、Ｋ^＋イオンの外向きの動きを観
察するには、膜電位が-20mVよりもネガティブでなければならない。２つの異な
る細胞外溶液中のκ-PVIIAにより引き起こされる、電流の実際の逆転電位が計算
値と同一であるならば、κ-PVIIA誘発電流はＫイオンの流れの結果である可能性
が高い。細胞をＥ_ｋ計算値で保持し、-100mV〜+80mVの500ms電圧傾斜（ランプ）
で、漸増濃度のκ-PVIIAの存在下および非存在下の両方で行うことにより電流の
逆転電位を算出した。４つのコントロール傾斜の平均値を、κ-PVIIAの存在下で
引き起こされた４つの傾斜の平均から減じた。得られたトレースは化合物の存在
に誘発された実際の電流であった。これは多項関数と適合しており、計算された
逆転電位である。

【００４２】８．微速度共焦点Ca^２＋イメージング皮質細胞培養物を、イメージング実験の40分前に蛍光Ca^２＋指示薬であるフル
オ3-AM（Molecular Probes，Eugene OR；最終濃度２mM＋0.1％プルロニック酸）
と共にロードした。細胞を含むカバーガラスを層流灌流チャンバ（Cornell-Bell
設計；Warner Instruments，Hamden，CT）中に載置し、生理食塩水（137mM NaCl
、５mM KCl、３mM CaCl_２、１mM MgCl_２、10mM HEPESおよび20mMソルビトール、
pH7.3）中で少なくとも５分間リンスして過剰なフルオ-3AMを取り除いた。微速
度画像を、Zeiss Axiovertl35倒立顕微鏡（Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY）
を備えたNikon PCM200（Melville、NY）共焦点走査型レーザー顕微鏡で回収し、
1.8秒毎に、フレームの平均化を行うことなく、光メモリディスクレコーダーに
ダウンロードした（Panasonic TQ3031F，Secaucus NJ)（さらには、Kimら、1994
に記載の方法を参照のこと）。場における各星状細胞の細胞質を基準化５×５ピ
クセル面積でイメージング分析を行い、データ分析の偏りを予防した。強度測定
（蛍光における％変化）のタイムコースプロットを、H. Sontheimer (Birmingha
m, AL）により記載されたプログラムを使用して得、Origin（MicroCal Northamp
ton，MA）を使用してプロットした。ルーチン分析は、少なくとも５回の試行で
場１つあたり200個の細胞までのタイムコースプロットからなり、従ってしばし
ば、実験１回あたり数千もの細胞からデータ分析を得ることとなる。

【００４３】実施例２κ-PVIIAへの曝露により用量依存性の細胞内Ｋ^＋の減少が生じる元々は、κ-PVIIAはムラサキマキガイ（purple cone snail）(Conus purpuras
cens)から単離され、ショジョウバエH4 shaker Ｋ^＋チャネル（Shonら、1998)を
ブロックすることが見出されていた。同じ研究では、哺乳動物shaker様電位依存
性Ｋ^＋チャネルであるＫｖ1.1およびＫｖ1.3を発現する卵母細胞においてペプチ
ドの影響は見出されなかった。皮質の初代培養系に存在する他の電位依存型Ｋ^＋チャネルをペプチドがブロックする可能性を本研究において試験した。96ウェル
蛍光アッセイを使用して、電位依存型カリウムチャネル（Ｋｖ）が活性化される
脱分極条件下でカリウムレベルの変化を探索した。細胞に、予めカリウム指示薬
色素PBFIをロードした。脱分極環境中で化合物がＫｖチャネルをブロックするよ
うに作用する場合、結果的に細胞内Ｋ^＋が上昇する。しかしながら、100nMまで
の濃度では、処理していない静止調製物では10〜100μＭアコニチンで脱分極さ
せた調製物と同様に細胞内Ｋ^＋濃度が減少することが示唆された（図１）。κ-P
VIIAで引き起こされたPBFI色素中の蛍光の変化は小さいが、それらが有意であり
、再現性があることは、強調すべき重要な点である。

【００４４】実施例３κ-PVIIAへの曝露により用量依存性過分極が生じる電位感受性色素ジ-8-ANEPPの存在下で蛍光実験を繰り返し、細胞内Ｋ^＋レベル
の減少(drop)が調製物の顕著な過分極を伴うことを観察した（蛍光のポジティブ
側へのシフトにより表される、図２Ａ〜２Ｂ）。本アッセイにおいてκ-PVIIAは
非常に強力であり、皮質培養物で８×10^−１６Ｍ、心室培養物で９×10^−１６Ｍ
、気管平滑筋細胞の初代培養系で９×10^−１８ＭのEC_５０を示す。

【００４５】実施例４κ-PVIIA誘発型過分極はＫ_ＡＴＰアンタゴニストへの曝露によりブロックされる κ-PVIIA誘発型過分極における異なるＫ^＋チャネルサブタイプの関与を決定す
るために、５個の非常によく報告されているＫ^＋チャネルアンタゴニスト（４−
アミノピリジン（4-AP）、イベリオトキシン（IBTX）、アパミン（apamin）、ト
ルブタミドおよびグリベンクラミド）の効果を試験した。皮質調製物では、4-AP
、IBTXおよびアパミンの適用は、100nMのκ-PVIIAで観察される過分極に対して
検出可能な影響を伴わなかった。しかしながら、Ｋ_ＡＴＰチャネルのアンタゴニ
ストであるトルブタミド（１〜10μＭ）およびグリベンクラミド（10ｎＭ）の両
方は、κ-PVIIA誘発型過分極の有意な減少を生じた（図３Ｂ）。また、グリベン
クラミドは筋細胞培養物においてκ−PVIIA誘発型過分極に有意な減少を生じた
（図３Ａ）。

【００４６】実施例５κ-PVIIAは、トルブタミドおよびグリベンクラミド感受性電流を誘発するＫ_ＡＴＰアンタゴニストに対する反応の感受性を、全細胞パッチクランプ技術
を使用して確認した。これらの実験では、細胞外カリウム濃度を60ｍＭまで上昇
させ、カリウムに関しての逆転電位（Ｅｋ）が-20ｍＶであるように溶液を計算
した。従って、膜電位が-20ｍＶよりもネガティブである場合のＫ^＋チャネルの
開口はＫ^＋イオンの流入を生じる。皮質および心筋細胞の初代培養物の両方にお
いて、100ｎＭ κ-VIIAの過灌流は、-20ｍＶ近くで逆転する陽イオンの内向きの
流入を誘発し、これはＫ^＋イオンの関与を示す。-80ｍＶの保持電位では、心筋
調製物（87.7±5.9 ｐＡ、ｎ＝８）における場合のκ-PVIIAにより引き起こされ
る電流は、皮質調製物（26.2±6.2 ｐＡ、ｎ＝４）と比較して有意に大きかった
。電流を細胞容量に関して校正した場合でさえ、心筋により生じる反応は皮質調
製物において見出される場合よりも大きかった（それぞれ、4.6±0.4ｐＡ／pfお
よび2.4±0.7ｐＡ／pf）。両方の場合において、電流は、Ｋ_ＡＴＰアンタゴニストであるトルブタミド（
100μＭ）またはグリベンクラミド（10ｎＭ）のいずれかに対して感受性であっ
た（図４ＡおよびＢ）。κ-PVIIA誘発型電流の逆転電位は、-100〜+60ｍｖの電
圧傾斜、および結果を四次多項式へあてはめることにより決定した（図４Ｃ）。
これらの高カリウム溶液に関しては、実験的に決定したＥｋ（-23ｍＶ）はＥｋ
の計算値（-20ｍＶ）に近似しており、このことはＫ^＋チャネルの関与を示す。

【００４７】実施例６κ-PVIIAは、遅延発症型（slowly development）の細胞内カルシウム減少を生じさせる細胞内カルシウムレベルに対するκ−PVIIAの影響は、96ウェル蛍光アッセイ
プレートを使用し、Ｃａ^２＋支持薬色素フルオ-3とともに細胞をロードすること
により測定した。皮質ニューロンの初代培養系では、κ-PVIIAは細胞内カルシウ
ムの顕著な減少を生じた。１ｎＭ κ-PVIIAを用いる場合、15秒目では効果はほ
とんど顕著でなかった（-2.15±0.95％、２回の試行）が、全時間にわたると、
カルシウム濃度の減少はより大きくなった（30分、-8.8±3.9％）。

【００４８】実施例７κ-PVIIAは低酸素症誘導性脱分極から保護するＮ_２誘導性低酸素症の脱分極の影響は、電位感受性色素ジ-8-ANEPPを使用して
、96ウェル蛍光アッセイプレート中で心室筋細胞においてモニターされてきた。
Ｎ_２で定常的にバブリングすることにより溶液から酸素を取り除き、コントロー
ルである未処理生理食塩水での結果と比較した。これらの条件において、低酸素
症は調製物の顕著な脱分極を生じ（これは蛍光における減少として反映される）
、10ｎＭ κ-PVIIAを用いた調製物は低酸素症誘導性の膜電位における任意の変
化を予防した（図５）。

【００４９】実施例８κ-PVIIAはグルタメート誘導性興奮毒性から保護するグルタメート誘導性興奮毒性に対するκ-PVIIAの保護効果を、96ウェル蛍光ア
ッセイおよびエチジウムホモダイマー−１死細胞染色を使用して試験した。96-
ウェルプレートの５個のレーンを予め100ｐＭ κ-PVIIAに曝露し、別の５個のレ
ーンを生理食塩水に曝した。次いで、グルタメートを30分間適用し、この時点で
プレート全体を徹底的に洗浄してκ-PVIIAおよびグルタメートの全てを取り除い
た。エチジウム色素をロードし、初期読み取りを行い、遅延型細胞毒性の量を6
時間の間、モニターした。蛍光の上昇は細胞破壊の上昇を示す。図６からも見出
され得るように、κ-PVIIA中での皮質細胞のプレインキュベーションにより、10
0μＭグルタメートの遅延型（６時間）細胞毒性効果に対する非常に有効な保護
が生じた。この保護は、100μＭトルブタミド（Ｋ_ＡＴＰアンタゴニスト）によ
りブロックされた。

【００５０】実施例９κ-PVIIAの細胞毒性皮質初代培養系を200ｎＭ κ-PVIIAと20分間インキュベートすることにより検
出可能なプロテアーゼ活性は誘導されなかった（３回の試行）。比較すると、En
zchekプロテアーゼ感受性色素により検出した場合、５％Tritonとの20分間のイ
ンキュベーションにより、約14％の蛍光の上昇が生じた。

【００５１】実施例10気管支拡張薬としてのκ-PVIIAの評価ヒスタミンにより収縮した単離モルモット気管切片を、κ-PVIIAが弛緩させる
能力を、等尺引っ張り記録を使用して試験した。ヒスタミンにより収縮した単離
モルモット気管切片を、κ-PVIIAが弛緩し得ることが見出された。また、κ-PVI
IAに対する反応を、Ｋ_ＡＴＰチャネルアンタゴニストであるトルブタミドまたは
グリベンクラミドの存在下で試験する。これらのアンタゴニストがκ-PVIIAの効
果を減少させることが見出され、反応におけるＫ_ＡＴＰチャネルの関与が確認さ
れる。

【００５２】実施例11低酸素症のインビトロモデルにおけるκ-PVIIAの保護能力の評価 96ウェル蛍光アッセイ、電気生理学および共焦点顕微鏡の組合わせを使用して
、初代培養系における一過性の酸素枯渇の急激な影響からの、κ-PVIIAの保護能
力を評価する。マルチチャンバ生理食塩水リザーバは、デリバリー（送達）プレ
ートの半分以下をＮ_２でバブリングされた生理食塩水で満たし得るように構築さ
れた。個々のチャンバにより、異なる濃度のκ-PVIIAの存在下および非存在下に
おける酸素濃度の減少の効果がモニターできる。心室筋細胞の初代培養系におけ
る、電位差色素ジ-8-ANEPPを使用する初期スクリーニングは、低酸素症誘発性脱
分極に対するκ-PVIIAの強力な保護効果を示す。同様の効果は皮質および気管に
おいて見出される。カルシウム感受性色素フルオ-3を使用して、低酸素曝露（ch
allenge）により誘発される細胞内カルシウムレベルの変化を観察すると、３つ
の組織調製物全てにおいて、κ-PVIIAが低酸素症に対する保護を提供し得ること
が見出される。同様の結果は、低酸素症電気生理学により誘発される膜電位の変
化をモニターするための全細胞パッチクランプ技術のカレントクランプモード(c
urrent-clamp mode)を使用して観察される。この技術は非常に感度が高く、ただ
１つの気管、ニューロンまたは筋細胞に対するκ-PVIIAの影響の検査が可能であ
る。

【００５３】実施例12興奮毒性のインビトロモデルにおける、κ-PVIIAの上昇した保護能力高濃度のグルタメートに対する曝露の後に生じる遅延型細胞死の程度をモニタ
ーする予備的な蛍光実験を、皮質の初代培養系で行った。結果は、グルタメート
誘導性興奮毒性の程度をκ-PVIIAの存在が、用量依存の様式で有効に減少させる
ことを示す。全細胞パッチクランプ技術のカレントクランプモードを使用して、
蛍光の結果の膜電位の実際の変化に対する相関関係を試験する。κ-PVIIAの存在
は初期のグルタメート誘導性脱分極を阻害し、それによりグルタメート誘導性カ
ルシウム流入に対する保護を付与することが見出される。本発明の方法および組成物は種々の態様の形式で組込まれ得、このうちのほん
の２，３個のみが本明細書中に開示されていることが認識される。他の態様が存
在すること、そしてこれらは本発明の精神から逸脱していないことは当業者に明
らかである。それゆえ、記載の実施態様は単なる例示であり、限定を構成するも
のではない。

【００５４】（参考文献） Ando, T. ら、(1997). Clin. Exp. Allergy. 27: 706-713. Barnay, G. ら、(2000). J. Med. Chem. Barnes, P. J. (1992). Eur. Respir. J. 5: 1126-1136. Bitan, G. ら、(1997). J. Peptide Res. 49: 421-426. Chen, J. W. ら、(1997) Am. J. Cardiol. 80: 32-38. Ettinger, L. J. ら、(1978). Cancer 41: 1270-1273. Garcia, E. ら、(1999). J. Gen. Physiol. 114: 141-157. Goldschmidt, M. ら、(1996). J. Clin. Pharmacol. 36: 559-572. Guatteo, E. ら、(1998). J. Neurophysiol. 79: 1239-1245. Hubry, V. ら、(1994). Reactive Polymers 22: 231-241. Jovanovic, A. ら、(1998a). Circulation 98: 1548-1555. Jovanovic, A. ら、(1998b). Lab. Invest. 78: 1101-1107. Jung, Y. S. ら、(1998). Japan J. Pharmacol. 76 (1): 65-73. Kim ら、(1994). Koike, A. ら、(1995). Am J. Cardiol. 76: 449-452. Kouchi, I. ら、(1998). Am. J. Physiol. 274 (4/2); H1106-H1112. Lauritzen I. ら、(1997). J. Neurochem. 69 (4); 1570-1579. Lin, C. ら、(1998). Pharmacology 57 (6); 314-322. Luer, M. S. および Hatton, J. (1993). Annals Pharmcotherapy 27: 912-921. Morley, J. (1994). Trends Pharmacol. Sci. 15 (12); 463-468. Muller-Shweinitzer, E. および Fozard, J. R. (1997). Br. J. Pharmacol. 12
0 (7): 1241-1248. Nagai, H. ら、(1991). Japan J. Pharmacol. 56 (1): 13-21. Neilson-Kudsk, J. E. (1996). Dan. Med. Bull. 43 (5): 429-447. Noma, A. (1983). Nature 304: 147-148. Ornstein, ら、(1993). Biorganic Medicinal Chemistry Letters 3: 43-48. Pell, T. J. ら、(1998). Am. J. Physiol. 275 (5 pt 2): H542-547. Rakel, R. E. (1997). Conn's current therapy. Reshef A. ら、(1998). Neurosci. Lett. 250 (2): 111-114. Sambrook, J. ら、(1989). Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed
., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Shon, K.-J. ら、(1998). J. Biol. Chem. 273: 33-38. Terlau, H. ら、(1996). Nature 381: 148-151. Terlau, H. ら、(1999). J. Gen. Physiol. 114: 125-140. Van de Steen, P. ら、(1998). Critical Rev. in Biochem. and Mol. Biol. 33
: 151-208. Wind, T. ら、(1997). Brain Res. 751 (2): 295-299. Yamabe H. ら、(1995). Cardiovasc. Drugs Ther. 9 (6): 755-761. 米国特許No. 5,331,001. 米国特許No. 5,534,615. 米国特許No. 5,364,769. 米国特許No. 5,545,723. 米国特許No. 5,550,050. 米国特許No. 5,844,077. 米国特許No. 5,672,682. 国際公開公報 WO 92/19195. 国際公開公報 WO 94/25503. 国際公開公報 WO 95/01203. 国際公開公報 WO 95/05452. 国際公開公報 WO 96/02286. 国際公開公報 WO 96/02646. 国際公開公報 WO 96/11698. 国際公開公報 WO 96/40871. 国際公開公報 WO 96/40959. 国際公開公報 WO 97/12635. 国際公開公報 WO 00/23092.

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】心室筋細胞の初代培養においてκ−ＰＶＩＩＡ濃度を増加した後
の細胞内Ｋ^＋の蛍光定量法の測定を示す（ＰＢＦＩ染色剤で測定）。示したデー
タは、１回の試行からのものであり、蛍光±Ｓ.Ｅ.Ｍ.における平均変化として
表す（^＊ｐ＜０.０５、対になっていないｔ検定）。

【図２Ａ−２Ｂ】心室筋細胞（図２Ａ）および皮質（図２Ｂ）の初代培養
においてκ−ＰＶＩＩＡ濃度を増加した後の膜電位の蛍光定量法の測定を示す（
Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰｓ染色剤で測定）。実験の少なくとも６日前に、細胞を９
６ウエルプレートにロードした。結果は、平均±ＳＥＭとして表し、２〜５回の
試行からの平均データを表す。

【図３Ａ−３Ｂ】筋細胞の初代培養における１００ｎＭのグリベンクラミ
ド（Glib）（図３Ａ）または皮質の初代培養における５０μＭのトルブタミド（
Tolb）（図３Ｂ）によるκ−ＰＶＩＩＡ（１００ｎＭ）応答の阻害を示す棒グラ
フである。データは、平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.として表す。

【図４Ａ−４Ｃ】皮質細胞（図４Ａ）および筋細胞（図４Ｂ）においてκ
−ＰＶＩＩＡによって誘発された電流を示す全細胞レコーディングである。図４
Ｃは、κ−ＰＶＩＩＡ誘発電流のＩ−Ｖ関係を示す。

【図５】低酸素症誘発脱分極に対する１０ｎＭのκ−ＰＶＩＩＡの保護効
果を示す棒グラフである。

【図６】グルタミン酸塩ウォッシュアウト後６時間で測定したグルタミン
酸塩誘発（１００μＭ）刺激毒性におけるκ−ＰＶＩＩＡ濃度の増加の効果を示
す（３〜６回試行）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/435 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者デイビス・エル・テンプル・ジュニアアメリカ合衆国06492コネチカット州ウォリングフォード、ダーラム・ロード1010番 (72)発明者リチャード・ティ・レイヤーアメリカ合衆国84093ユタ州サンディ、サンバースト・コート9024番 (72)発明者アール・タイラー・マッケイブアメリカ合衆国84108ユタ州ソルト・レイク・シティ、フリーズ・クリーク・サークル715番 (72)発明者ロバート・アール・ジョーンズアメリカ合衆国84101ユタ州ソルト・レイク・シティ、ウエスト・ブロードウェイ・ナンバー2103・サウス44番Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA09 BA19 BA23 CA59 NA14 ZA33 ZA36 ZA59 ZC02 4H045 AA10 AA30 BA18 BA72 CA50 DA83 EA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｋ_ＡＴＰチャネルの活性化による興奮性膜の極端な脱分極に
関連する疾患の治療方法であって、（ａ）以下の一般式：Cys-Xaa_１-Ile-Xaa₂-Asn-Gln-Xaa₃-Cys-Xaa₄-Gln-Xaa₅-
Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Xaa_１-Xaa₃-Cys-Asn-Xaa_l-Xaa₄-Asn-Xaa₃-Cys-Val (
配列番号: 1)［式中、Xaa_１およびXaa₃は、独立して、Arg、ホモアルギニン、オ
ルニチン、Lys、Ｎ−メチル−Lys、Ｎ,Ｎ−ジメチル−Lys、Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチ
ル−Lys、いずれかの合成塩基性アミノ酸、Hisまたはハロ−His；Xaa₂は、Proま
たはヒドロキシ−Pro(Hyp)；Xaa₄は、Phe、Tyr、メタ−Tyr、オルソ−Tyr、ノル
−Tyr、モノ−ハロ−Tyr、ジ−ハロ−Tyr、Ｏ−スルホ−Tyr、Ｏ−ホスホ−Tyr
、ニトロ−Tyr、Trp（ＤまたはＬ）、ネオ−Trp、ハロ−Trp（ＤまたはＬ）、ま
たはいずれかの合成芳香族アミノ酸；およびXaa₅は、Hisまたはハロ−Hisである
］で示される化合物；（ｂ） κ−PVIIA [R18A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-
Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Ala-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番
号: 2); κ−PVIIA [R22A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Ala-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 3); κ−PVIIA [I3A]: Cys-Arg-Ala-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 4); κ−PVIIA [K19A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Ala-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 5); κ−PVIIA [R2A]: Cys-Ala-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys−Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 6); κ−PVIIA [F9A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Ala-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 7); κ−PVIIA [K25A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Ala-Cys-Val (配列番号: 8); κ−PVIIA [R2K]: Cys-Lys-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 9); κ−PVIIA [K7A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Ala-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-CysCys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 10); κ−PVIIA [F9M]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Met-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 11); κ−PVIIA [F9Y]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Tyr-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 12); κ−PVIIA [R2Q]: Cys-Gln-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 13); κ−PVIIA [H11A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-Ala-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 14); κ−PVIIA [D14A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Ala-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 15); κ−PVIIA [Q6A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Ala-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 16); κ−PVIIA [N21A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Ala-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 17); κ−PVIIA [S17A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ala-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 18); κ−PVIIA [N24A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Ala-Lys-Cys-Val (配列番号: 19); κ−PVIIA [L12A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Ala-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 20); κ−PVIIA [D13A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Ala-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 21); κ−PVIIA [Q10A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Ala-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 22); κ−PVIIA [V27A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-
Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Ala (配列番号: 23); κ−PVIIA [O4A]: Cys-Arg-Ile-Ala-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 24);お
よび κ−PVIIA [N5A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Ala-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-A
sp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号: 25)；
からなるグループから選ばれる化合物（ａ）の類縁体；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の誘導体；および（ｄ）その生理学的に許容しうる塩；からなるグループから選ばれる有効量の活性剤を治療を必要とする患者に投与す
ることからなる方法。
【請求項２】 Xaa₂がヒドロキシ−Proである請求項１記載の方法。
【請求項３】 Xaa_１がArg、Xaa_３がLys、Xaa_４がPheおよびXaa_５がHisであ
る請求項１記載の方法。
【請求項４】 Xaa₂がヒドロキシ−Proである請求項３記載の方法。
【請求項５】疾患が心臓虚血である請求項１記載の方法。
【請求項６】疾患が脳虚血である請求項１記載の方法。
【請求項７】疾患が喘息である請求項１記載の方法。
【請求項８】疾患が眼虚血である請求項１記載の方法。
【請求項９】誘導体が（ａ）または（ｂ）のペプチド［ここで、Arg残基
はLys、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Lys、Ｎ−メチル−Lys、Ｎ,Ｎ−ジ
メチル−Lys、Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチル−Lysまたはいずれかの合成塩基性アミノ酸
で置換されてよく；Lys残基はArg、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Lysま
たはいずれかの合成塩基性アミノ酸で置換されてよく；Tyr残基はいずれかの合
成ヒドロキシ含有アミノ酸で置換されてよく；Ser残基はTyrまたはいずれかの合
成ヒドロキシル化アミノ酸で置換されてよく；Thr残基はSerまたはいずれかの合
成ヒドロキシル化アミノ酸で置換されてよく；PheおよびTrp残基はいずれかの合
成芳香族アミノ酸で置換されてよく；およびAsn、Ser、ThrまたはHyp残基はグリ
コシル化（Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンを含む）されてよく；Cys残基は、
ＤまたはＬ配置であってよく、必要に応じて、ホモシステイン（ＤまたはＬ）で
置換されてよく；Tyr残基は３−ヒドロキシルまたは２−ヒドロキシル異性体（
それぞれ、メタ−Tyrまたはオルソ−Tyr）ならびに対応するＯ−スルホ−および
Ｏ−ホスホ誘導体で置換されてよく；酸性アミノ酸残基は、GlyおよびAlaのテト
ラゾリル誘導体などのいずれかの合成酸性アミノ酸で置換されてよく；脂肪族ア
ミノ酸は、非天然の脂肪族分枝鎖または直線側鎖Ｃ_ｎＨ２_ｎ＋２(ｎは８以下)を
有する合成誘導体で置換されてよく；およびCys残基のペアは、イソテリックラ
クタムまたはSer／(GluまたはAsp)、Lys／(GluまたはAsp)もしくはCys／Ala組み
合わせなどのエステル−チオエーテル置換基で、ペアにて置き換えてもよい］で
ある請求項１記載の方法。