JP2003518945A

JP2003518945A - インスリン前駆体及びインスリン前駆体類似体の製造方法

Info

Publication number: JP2003518945A
Application number: JP2001550282A
Authority: JP
Inventors: ベルグルムクイェルセン，トマス; ルドビグセン，スベン; クリスチャンカールスホルム，ニルス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1999-12-29
Filing date: 2000-12-04
Publication date: 2003-06-17
Anticipated expiration: 2020-12-04
Also published as: JP4773023B2; ATE397017T1; EP1246845B1; ES2307544T3; CN1414974A; PL355871A1; CN100432104C; KR20030004317A; DE60039074D1; AU1850601A; HUP0203475A3; RU2002120512A; HUP0203475A2; RU2283846C2; BR0016867A; WO2001049742A1; CA2392840A1; EP1246845A1; CA2392840C

Abstract

(57)【要約】少なくとも1つの芳香族アミノ酸残基を含んで成るミニC−ペプチドを有する新規インスリン前駆体及びインスリン前駆体類似体は、高められた折りたたみ安定性を有する。この新規インスリン前駆体及びインスリン前駆体類似体は、高い収率で酵母において発現され得、そして好ましくは15個よりも多くない長さのアミノ酸残基のものである。前記前駆体又は前駆体類似体をコードするポリヌクレオチド配列、及びそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター及び細胞系がまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景：酵母生物は、細胞外機能を有する多くのタンパク質を生成する。そのようなタ
ンパク質は、分泌されたタンパク質として言及される。それらの分泌されたタン
パク質は、小胞体の膜を通して、発現された生成物の効果的方向（トランスロケ
ーション）を確保するプレ−ペプチドを含む前駆体又はフレ−フォームとして細
胞の内部でまず発現される。

【０００２】通常シグナルペプチドと称するプレ−ペプチドは一般的に、トランスロケーシ
ョンの間、所望する生成物から切断される。分泌経路にいったん侵入すると、タ
ンパク質はゴルジ体に輸送される。ゴルジ体から、タンパク質は、区画、例えば
液胞又は細胞膜に誘導する異なった経路に進むか、又はそれは外部培地に分泌さ
れる細胞から経路を定められ得る（Pfefferなど. (1987) Ann. Rev. Biochem. 5
6: 829-852）。

【０００３】インスリンは、膵臓のβ−細胞により分泌されるポリペプチドホルモンであり
、そして２つの鎖間ジスルフィド架橋により連結される２種のポリペプチド鎖A
及びBから成る。前記ホルモンは、配位において、24個のアミノ酸のプレペプチド、及びそれに
続く86個のアミノ酸を含むプロインスリンから成る一本鎖前駆体プロインスリン
（プレプロインスリン）として合成される：プレペプチド−B−ArgArg−C−LysA
rg−A（ここでCは31個のアミノ酸の連結パプチドである）。Arg−Arg及びLys−A
rgは、A及びB鎖から連結ペプチドの切断のための切断部位である。

【０００４】３種の主要方法が、微生物におけるヒトインスリンの生成のために使用されて
来た。２種の方法は、細胞質における大きな融合タンパク質の発見を有するE．
コリ（Frankなど. (1981) in Peptide: Proceedings of 7^th American Peptide
Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford,
IL. pp. 729-739）、又は細胞周辺腔中への分泌を可能にするためへのシグナル
ペプチドの使用（Chanなど. (1981) PNAS 78: 5401-5404）を包含する。

【０００５】３番目の方法は、培地中にインスリン前駆体を分泌するためにサッカロミセス
・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）を利用する（thimなど. (1986) P
NAS 83: 6766-6770）。従来技術は、E．コリ又はサッカロミセス・セレビシアエ
のいずれかにおいて発現される、限定された数のインスリン前駆体を開示する（
アメリカ特許第5,962,267号、WO95/16708号、ヨーロッパ特許第0055945号、ヨー
ロパ特許第0163529号、ヨーロッパ特許第0347845号及びヨーロッパ特許第074118
8号を参照のこと）。

【０００６】円二色性（CD）が、タンパク質安定性、及び分子の相対的安定性を決定するた
めに使用される。240nm以下で観察されるCDは、ペプチドアミド発色団によるも
のであり、そしてタンパク質二次構造を推定するために使用され得る（Johnson
(1988) Ann. Rev. Biophys. Chem. 17: 145-166）。インスリンのスペクトルは
、220及び209nmでの最小、203nm近くで負から正へのクロスオーバー、及び195nm
での最大により特徴づけられる。変性に基づいて、240−218nm範囲における負の
CDは徐々に減少し、このことは、タンパク質の変性を付随する、指図された二次
構造の損失と一致する。結果的に、インスリン前駆体の折りたたみ安定性は、添
加される変性剤、例えば塩酸グアニジン（GuHCl）の機能として二次構造の損失
を測定することによって定量化され得る（例えば、Pace (1975) CRC Crit. Rev.
Biochem. 3:1-43を参照のこと）。

【０００７】発明の要約：本発明は、形質転換された微生物、特に酵母において発現される場合、インス
リン前駆体分子及びインスリン前駆体類似体分子において高められた生成収率及
び/又は高められた安定性を付与する新規連結ペプチド（C−ペプチド）を特徴と
する。次に、そのようなインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体が、１又
は複数の適切な、良く知られている転換段階により、インスリン又はインスリン
類似体に転換され得る。

【０００８】本発明の連結ペプチドは、少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基Phe、Trp又は
Tyrを含み、そして一般的に、フランキング二塩基性切断部位を包含する、35個
のアミノ酸から成る天然のヒトCペプチドよりも短いであろう。従って、新規連
結ペプチドは一般的に、15個よりも多くない長さのアミノ酸残基及び好ましくは
、９個よりも多くないアミノ酸残基のものであろう。典型的には、新規連結ペプ
チドは、７個まで、又は５個までのアミノ酸残基、及び好ましくは４個よりも多
くないアミノ酸残基のものであろう。

【０００９】天然のヒトインスリン分子におけるように、連結ペプチドは、A及びB鎖からの
連結ペプチドのインビトロ切断を可能にするそのC及びN末端で切断部位を含むで
あろう。そのような切断部位は、当業界において知られているいずれかの便利な
切断部位、例えば臭化シアンにより切断できるMet；トリプシン又はトリプシン
様プロテアーゼ、アクロモバクター・リチカス（Acromobactor lyticus）プロテ
アーゼ又はカルボキシペプチダーゼプロテアーゼにより切断できる、単一の塩基
性アミノ酸残基又は１対の塩基性アミノ酸残基（Lys又はArg）であり得る。A−
鎖からの連続ペプチドの切断を可能にする切断部位は好ましくは、単一の塩基性
アミノ酸残基Lys又はArg、好ましくはLysである。

【００１０】他方では、B鎖からの連続ペプチドの切断は、desB30インスリン前駆体又はdes
B30インスリン前駆体類似体を生ぜしめる、B鎖における天然のLys^B29アミノ酸残
基での切断により可能にされ得る。次に所望するB30アミノ酸残基が、良く知ら
れているインビトロ酵素方法により付加され得る。１つの態様においては、連結ペプチドは、２種の隣接する塩基性アミノ酸残基
（Lys, Arg）を含まないであろう。この態様においては、A−鎖からの切断は、A
−鎖のN−末端に位置する単一のLys又はArg、及びB−鎖における位置B29におえ
ける天然のLysで達成され得る。

【００１１】連結ペプチドは、１以上であるが、しかし好ましくは５個よりも多くない芳香
族アミノ酸残基を含んで成る。芳香族アミノ酸残基は、同じであっても又は異な
っていても良い。連結ペプチドは好ましくは、３個よりも多くの芳香族アミノ酸
を包含せず、そして最も好ましくは、単一の芳香族アミノ酸残基を包含するであ
ろう。

【００１２】本発明の１つの態様においては、連結ペプチドにおける芳香族アミノ酸残基の
１つは、A鎖に隣接する切断部のすぐN−末端側に存在する。さらに、芳香族アミ
ノ酸残基の１つは好ましくは、前記B鎖における位置B11、 B12又はB26における
アミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満離れて位置する。１つの態様におい
ては、A鎖に隣接する切断部位のすぐN−末端側の芳香族アミノ酸は、前記B鎖に
おける位置B11、 B12又はB26におけるアミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未
満離れて存在する。

【００１３】インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体は、溶液のおいて折りたたみ安
定性を有することによって特徴づけられる。本発明の前駆体は、連結ペプチドに
芳香族アミノ酸残基を包含しないインスリン又はインスリン類似体に比較して、
高められたCmid安定性を有するであろう。従って、Cmid安定性は、約5.5MのGuHC
lよりも高く、典型的には約6.0のGuHClよりも高く、そしてより典型的には、約6
.5MのGuHClよりも高い。

【００１４】従って、１つの観点においては、本発明は、A及びB鎖から切断できる連結ペプ
チド（C−ペプチド）を含んで成るインスリン前駆体又は又はインスリン前駆体
類似に関し、ここで前記連結ペプチドが少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基、
及び前記A−鎖と前記連結ペプチドとの間のペプチド結合の切断を可能にする切
断部位を含んで成り、そして１つの芳香族アミノ酸残基が前記切断部位のすぐN
−末端側に存在する。

【００１５】もう１つの観点においては、本発明は、A及びB鎖から切断でき、そしてその少
なくとも１つの残基が芳香族アミノ酸残基である９個までの長さのアミノ酸残基
から成る、連結ペプチド（C−ペプチド）を含んで成るインスリン前駆体又はイ
ンスリン前駆体類似体に関する。さらなる観点においては、本発明は、A及びB鎖から切断できる連結ペプチド（
C−ペプチド）を含んで成るインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体に関
し、ここで前記連結ペプチドが前記B鎖における位置B11、 B12又はB26における
アミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満離れて存在する１つの芳香族アミノ
酸残基を含んで成る。

【００１６】さらなる観点においては、本発明は、少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基を
含んで成り、そしてA及びB鎖から切断できる連結ペプチド（C−ペプチド）を含
んで成るインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体に関し、ここで前記イン
スリン前駆体又はインスリン前駆体類似体は、前記連結ペプチドに芳香族アミノ
酸残基を包含しないインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体に比較して、
溶液において高められたCmid安定性を示す。高められた活性は、当業者に知られており、そして下記に記載される種々の方
法により決定される。１つの態様においては、高められた安定性は、インスリン
前駆体分子（Cmid）の1/2最大の変性を達成するために必要とされる塩酸グアニ
ジン（GuHCl）の濃度のCD決定により測定される。

【００１７】さらなる観点においては、本発明は、下記式： B（1−27）−X₂−X₃−X₁−Y−A（1−21）［式中、X₁は、その１つのアミノ酸残基がYのすぐN−末端側の芳香族アミノ酸
残基である１〜15個のアミノ酸残基のペプチド配列であり； X₂は、前記B鎖の位置28でのPro, Asp, Lys又はIleの１つであり； X₃は、前記B鎖の位置29でのPro, Lys, Ala, Arg又はPro−Thrの１つであり；
そして Yは、Lys又はArgである］により表されるインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体に関する。

【００１８】１つの態様においては、X₁におけるアミノ酸残基の合計数は、1−10, 1−9, 1
−8, 1−7, 1−6, 1−5又は1−4個の長さのアミノ酸残基であろう。もう１つの
特定の態様においては、X₁は1−3個のアミノ酸残基、及び好ましくは1−2個のア
ミノ酸残基である。X₁におけるアミノ酸残基は、いずれかのコードできるアミノ
酸残基であり得、そして同じであっても又は異なっていても良いが、但し、その
残基の１つは、YのすぐN−末端側の芳香族アミノ酸残基である。

【００１９】さらなる観点においては、本発明は下記式： B（1−27）−X₂−X₃−X₁−Y−A（1−21）［式中、X₁は、その１つの残基が、前記B鎖における位置B11、 B12又はB26に
おけるアミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満離れて存在する芳香族アミノ
酸残基である、１〜15個のアミノ酸残基のペプチド配列であり； X₂は、前記B鎖の位置28でのPro, Asp, Lys又はIleの１つであり； X₃は、前記B鎖の位置29でのPro, Lys, Ala, Arg又はPro−Thrの１つであり；
そして Yは、Lys又はArgである］により表されるインスリン前駆体又はインスリン前駆体。類似体に関する。１つの態様においては、X₁におけるアミノ酸残基の数は、1−9, 1−5又は1−4
である。もう１つの態様においては、アミノ酸残基の数は、1−3又は1−2である
。

【００２０】もう１つの観点においては、本発明は、下記式： B（1−27）−X₂−X₃−X₁−Y−A（1−21）［式中、X₁は、少なくとも１つのアミノ酸残基が芳香族アミノ酸残基である１
〜８個のアミノ酸残基のペプチド配列であり； X₂は、前記B鎖の位置28でのPro, Asp, Lys又はIleの１つであり； X₃は、前記B鎖の位置29でのPro, Lys, Ala, Arg又はPro−Thrの１つであり；
そして Yは、Lys又はArgである］により表されるインスリン前駆体又はインスリン前駆体。類似体に関する。

【００２１】１つの態様においては、X₁におけるアミノ酸残基の合計数は、1〜7, 1〜6, 1
〜5,又は1〜4個の長さのアミノ酸残基であろう。もう１つの特定の態様において
は、X₁は1〜3個のアミノ酸残基、及び好ましくは1〜2個のアミノ酸残基である。
X₁におけるアミノ酸残基は、いずれかのコードできるアミノ酸残基であり得、そ
して同じであっても又は異なっていても良いが、但し、X₁におけるその少なくと
１つの残基の１つのアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸残基である。

【００２２】上記式において、X₁は、同じであっても又は異なっていても良い５個までの芳
香族アミノ酸残基を含んで成る。特定の態様においては、X₁は、同じであっても
又は異なっていても良い３個までの芳香族アミン残基を含んで成り、そして好ま
しくは、わずか１つの芳香族アミノ酸残基を含むであろう。芳香族アミノ酸残基
は、Trp, Phe又はTyr、好ましくはPhe又はTrpである。

【００２３】１つの態様においては、X₂はAspであり、そしてX₃はLysである。この態様は、
B鎖の位置B28にAspを含むインスリン前駆体類似体（この後、“Asp^B28IP”と称
する）を包含する。もう１つの態様においては、X₂はLysであり、そしてX₃はPro
である。さらなる態様においては、配列X₁−Yは、（ａ）Met−Trp−Lys,（ｂ）A
la−Trp−Lys、（C）Val−Trp−Lys、（ｄ）Ile−Trp−Lys、（ｅ）Leu−Trp−L
ys、（ｆ）Glu−Glu−Phe−Lys（配列番号15）、（ｇ）Glu−Phe−Lys、（ｈ）G
lu−Trp−Lys、（i）Ser−Trp−Lys、（ｊ）Thr−Trp−Lys、（ｋ）Arg−Trp−L
ys、（ｌ）Glu−Met−Trp−Lys（配列番号１）、（ｍ）Gln−Met−Trp−Lys（配
列番号２）及び（ｎ）Asp−Trp−Lysから成る群から選択される。

【００２４】もう１つの態様においては、X₂はProであり、X₃はLysであり、そしてX₁はその
１つがTrp又はPheである1〜2個のアミノ酸残基である。もう1つの態様のおいては、X₂はLysであり、X₃はPro−Thrであり、そしてX₁は
その１つがTrp, Tyr又はPheである15個までのアミノ酸残基から成る。この態様
においては、X₁はC−末端での切断部位、例えば一塩基性又はニ塩基性（Lys, Ar
g）切断部位を含むであろう。

【００２５】本発明はまた、本発明のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体をコー
ドするポリヌクレオイド配列に関する。さらなる観点においては、本発明は、そ
のようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、及びそのようなポリヌクレオチ
ド又はベクターを含む宿主細胞に関する。もう１つの観点においては、本発明は、インスリン前駆体又はインスリン前駆
体類似体の製造方法に関し、ここで前記方法は、（i）本発明のインスリン前駆
体又はインスリン前駆体類似体をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る
宿主細胞を、前記前駆体又は前駆体類似体の発現のための適切な条件下で培養し
；そして（ii）発現された前駆体又は前駆体類似体を単離することを含んで成る
。

【００２６】さらにもう1つの観点においては、本発明は、インスリン又はインスリン類似
体の製造方法に関し、ここで前記方法は、（i）本発明のインスリン前駆体又は
インスリン前駆体類似体をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る宿主細
胞を、前記前駆体又は前駆体類似体の発現のための適切な条件下で培養し；（ii
）前記培養培地から前記前駆体又は前駆体類似体を単離し；そして（iii）前記
前駆体又は前駆体類似体を、インビボでの化学又は酵母転換によりインスリン又
はインスリン類似体に転換することを含んで成る。本発明の１つの観点においては、宿主細胞は酵母細胞であり、そしてさらなる
観点においは、酵母細胞は、サッカロミセス属から選択される。さらなる観点に
おいては、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシアエ種から選択される。

【００２７】特定の記載：略語及び命名法： “連結ペプチド”又は“C−ペプチド”とは、一本鎖プレプロインスリン−様
分子のB−C−Aポリペプチド配列の連結成分“C”を意味する。特に、天然のイン
スリン鎖においては、C−ペプチドは、B鎖の位置30及びA鎖の位置１を連結する
。“ミニC−ペプチド”又は“連結ペプチド”、例えば本明細書に記載されるそ
れらのものは、A1にB29又はB30を連結し、そして天然のC−ペプチドのものとは
配列及び長さにおいて異なる。

【００２８】 “IP”とは、desB30鎖が連結ペプチドを通してインスリンのA鎖に連結されて
いる一本鎖インスリン前駆体を意味する。一本鎖インスリン前駆体は、ヒトイン
スリンにおけるように、正しく位置決定されたジスルフィド架橋（３個）を含む
であろう。

【００２９】 “desB30”又は“B（1−29）”とは、B30アミノ酸残基を欠いている天然のイ
ンスリンB鎖を意味し、“A（1−21）”とは、天然のインスリンA鎖を意味し、“
B（1−27）”とはB28, B29及びB30アミノ酸残基を欠いている天然のB鎖を意味し
；“Asp^B28IP”とは、B−鎖の位置28でアスパラギン酸を有し、そしてC−ペプチ
ド（B29はA1に連結される）を有さない一本鎖インスリン前駆体を意味する。ミ
ニC−ペプチド及びそのアミノ酸配列は、IPに続いて括弧により３文字アミノ酸
コードで示され；従って、“Asp^B28IP(MetTrpLys)”とは、B−鎖の位置28でのア
スパラギン酸、及びA１にB29を連結する配列Met−Trp−Lysを有するミニC−ペプ
チドを有する一本鎖インスリン前駆体を意味する。

【００３０】 “インスリン前駆体”とは、１又は複数の置換化学及び/又は酵素工程により
、ヒトインスリンに転換され得る一本鎖ポリペプチドを意味する。 “インスリン前駆体類似体”とは、ヒトインスリン分子に比較して、A及び/又
はBアミノ酸鎖の１又は複数の突然変異、置換、欠失及び付加を有するインスリ
ン前駆体分子を意味する。インスリン類似体は好ましくは、１又は複数の存在す
るアミノ酸残基、好ましくはそれらの１，２又は３個がもう１つのコードできる
アミノ酸残基により置換されているようなものである。１つの態様においては、
本発明は、天然のヒトインスリン分子に比較して、変更されたB鎖の位置28を有
する類似体分子を含んで成る。この態様においては、位置28は、天然のPro残基
からAsp, Lys又はIleの１つに修飾される。

【００３１】好ましい態様においては、位置B28での天然のPro残基が、Asp残基に修飾され
る。もう１つの態様においては、位置B29でのLysがProに修飾され；また、位置A
21でのAsnがAla, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr又
はVal、特にGly, Ala, Ser又はThr及び好ましくはGlyに修飾され得る。さらに、
位置B3でのAsnはLysに修飾され得る。インスリン前駆体類似体のさらなる例は、
des(B30) ヒトインスリン、インスリン類似体（Phe⁸¹が欠失されている）；イン
スリン類似体（A−鎖及び/又はB−鎖がN−末端延長を有する）、及びインスリン
類似体（A−鎖及び/又はB−鎖がC−末端延長を有する）である。従って、１又は
２個のArgが位置B１に付加され得る。

【００３２】用語“〜のすぐN−末端側”とは、アミノ酸残基又はペプチド配列が、ペプチ
ド結合により、もう１つのアミノ酸残基又はアミノ酸配列のN−末端に、そのC−
末端で直接的に連結されている情況を意味する。本明細書においては、用語“インスリンの機能的類似体”及び同様のものは、
生来のヒトインスリンタンパク質に類似する生物学的作用を有するポリペプチド
を意味する。

【００３３】２種のアミノ酸残基間のA５Åよりも短い距離とは、第１のアミノ酸における
いずれかの原子と第２アミノ酸におけるいずれかの原子との間の５Å以下の最短
の原子間距離を意味する。原子距離は、NMR（Withrich, K., 1986, NMR of Prot
eins and Nucleic Acids, Wilesy, New York）又はX−線結晶学（Drenth, H., 1
994, Principles of Protein X-ray crystallography, Springer Verlay Berlin
）のいずれかにより決定される分子の立体構造から測定される。１つのアミノ酸
からもう１つのアミン酸までの距離は、第１のアミン酸におけるいずれかの原子
と、特にことわらない限り、第２のアミノ酸におけるいずれかの原子との間の最
短の原子間距離として測定される。

【００３４】本発明は、酵母宿主細胞において生成収率を有意に高める、インスリンB鎖の
位置29及びインスリンA鎖の位置１を連結する新規ミニC−ペプチドを特徴とする
。用語“有意に高められた生成”、“高められた発酵収率”及び同様のものは、
ミニCペプチドに芳香族アミノ酸残基を有さないインスリン前駆体又はインスリ
ン前駆体類似体の収量に比較して、培養物上清液に存在するインスリン前駆体分
子又はインスリン前駆体類似体分子の分泌される量の上昇を意味する。“高めら
れた”発酵収率は、対照よりも絶対的に高く；好ましくは、その上昇率は、対照
（Asp^B28IP）レベルよりも50％又はそれ以上高く；さらにより好ましくは、その
上昇率は、対照レベルよりも100％又はそれ以上高い。

【００３５】用語“安定性の上昇”とは、例えばミニC−ペプチドに芳香族アミン酸残基を
有さないインスリン前駆体類似体（例えば、Asp^B28IP）について得られる高めら
れた値に比較して、溶液におけるCmidのその高められた値を意味する。用語“Cm
id”とは、上昇する濃度の変性剤の関数としてのインスリン分子の遠−UV円二色
性を測定するアッセイにおいてタンパク質集団の半分を変性するために必要なGu
HClの濃度を意味する。

【００３６】 “POT”とは、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces Pombe）ト
リオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、そして“TPl１”はS.セレビシアエ
トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。 “リーダー”とは、プレ−ペプチド（シグナルペプチド）及びプロ−ペプチド
から成るアミノ酸配列を意味する。

【００３７】用語“シグナルペプチド”とは、タンパク質の前駆体形上にN−末端配列とし
て存在するプレ−ペプチドを意味する。シグナルペプチドの機能は、小胞体中へ
の異種タンパク質のトランスロケーションの促進を可能にすることである。シグ
ナルペプチドは通常、この工程の間、切断される。シグナルペプチドは、タンパ
ク質を生成する酵母生物に対して異種であっても又はは同種であっても良い。

【００３８】本発明のDNA構造体と共に使用され得る多くのシグナルペプチドは、酵母アス
パラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）シグナルペプチド又はいずれかの機能的類似
体（Egel−Mitaniなど。（1990）YEAST 6:127-137及びアメリカ特許第5,726,038
号）、及びMFα１遺伝子のα−因子シグナル（Thomer (1981) in The Molecular
of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathemなど., eds., pp. 143-180
, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 及びアメリカ特許第4,870,000号）を包
含する。

【００３９】用語“プロ−ペプチド”とは、小胞体から、ゴルジ体及びさらに、培養培地中
への分泌（すなわち、細胞壁を通して、又は少なくとも細胞を通して酵母細胞の
細胞周腔中へのポリペプチドの輸送）のための分泌小胞への発現されたポリペプ
チドの方向づけを可能にすることである。プロ−ペプチドは、酵母α−因子プロ
−ペプチドであり得る（アメリカ特許第4,546,082号及び第4,870,008号を参照の
こと）。他方では、プロ−ペプチドは、天然において見出されないプロ−ペプチ
ドと言われる合成プロ−ペプチドであり得る。適切な合成プロ−ペプチドは、ア
メリカ特許第5,395,922号、第5,795,746号及び第5,162,498号、及びWO98/32867
号に開示されるものである。プロ−ペプチドは好ましくは、C−末端でエンドペ
プチダーゼプロセッシング部位、例えばLys−Arg配列又はいずれかのその機能的
類似体を含むであろう。

【００４０】本発明のポリヌクレオチド配列は、確立された標準方法、例えば“Beaucageな
ど. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869により記載されるホスホアミジ
ット方法、又はMattesなど. (1984) EMBO Journal 3: 801-805により記載される
方法により、合成的に調製され得る。ホスホアミジット方法によれば、オリゴヌ
クレオチドが、例えば自動DNA合成機により合成され、精製され、二本鎖化され
、そして合成DNA構造体に連結される。DNA構造体を調製する現在の好ましい手段
は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってである。

【００４１】本発明のポリヌクレオチド配列はまた、混合されたゲノム、cDNA及び合成起原
のものであり得る。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノム又はcDNA配列
は、A及びB鎖をコードするゲノム又はcDNA配列に連結され、この後、DNA配列は
、良く知られている方法に従って相同組換えのための所望するアミノ酸配列をコ
ードする合成オリゴヌクレオチドを挿入し、又は好ましくは、適切なオリゴヌク
レオチドを用いてPCRにより所望する配列を生成することによって、１つの部位
で修飾され得る。

【００４２】本発明は、選択された微生物又は宿主細胞において複製することができ、そし
て本発明のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体をコードするポリヌク
レオチド配列を担持するベクターを包含する。組換えベクターは、自律的に複製
するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色体外実在物と
して存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ−染色体又は人
工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確保するためのいずれかの手段を
含むことができる。

【００４３】他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ
、そしてそれが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターである。さらに、
単一のベクター又はプラスミド、又は宿主細胞のゲノム中に導入される全DNAを
共に含む複数のベクター、又はトランスポゾンが使用され得る。ベクターは線状
又は閉環されたプラスミドであり得、そして好ましくは、宿主細胞ゲノム中への
ベクターの安定した組み込み、又はゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自
律的複数を可能にする要素を含むであろう。

【００４４】好ましい態様においては、組換え発現ベクターは、酵母において複製すること
ができる。酵母においてベクターの複製を可能にする配列の例は、酵母プラスミ
ド２μm複製遺伝子REP1−3及び複製の起点である。

【００４５】本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にす
る１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、遺伝子であり、その生成
物は殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養性〜栄養要求性、
及び同様のものを提供する。細菌選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス（
Bacillus subtillis）、又はバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniform
is）からのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン
、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。

【００４６】糸状菌宿主細胞への使用のための選択マーカーは、amdS（アセトアミダーゼ）
、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、pyrG（オロチジン−5
’−リン酸デカルボキシラーゼ）及びtrpC（アントラニル酸シンターゼ）を包含
する。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3
, TRP1及びURA3である。酵母のための好ましい選択マーカーは、シゾサッカロミ
セス・ポンベTPI遺伝子（Russell（1985）Gene 40: 125-130）である。

【００４７】ベクターにおいては、ポリヌクレオチド配列は、適切なプロモーター配列に操
作可能的に連結される。プロモーターは、変異、切断されたハイブリッドプロモ
ーターを包含する選択の宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列で
あり得、そして宿主細胞に対して相同又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチド
をコードする遺伝子から得られる。

【００４８】細菌宿主細胞において転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.
コリlacオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptamyces coelicolor
）アガラーゼ遺伝子（dagA）、バチルス・サブチリスレバンスクラーゼ遺伝子
（sacB）、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バチルス
・アテアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）マルトゲン性アミ
ラーゼ遺伝子（amyM）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloli
quefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、及びバチルス・リケニホルミスペ
ニシラーゼ遺伝子（penP）から得られるプロモーターである。

【００４９】糸状菌宿主細胞における転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、
アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコル
・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギ
ラス・ニガー（Aspergillus niger）中性のα−アミラーゼ及びアスペルギラス
・ニガー酸性安定性α−アミラーゼのための遺伝子から得られるプロモーターで
ある。酵母宿主においては、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシ
アエMa1, TP1, ADH又はPGKプロモーターである。

【００５０】本発明のポリヌクレオチド構造体はまた、適切なターミネーターに操作可能的
に連結されるであろう。酵母においては、適切なターミネーターは、TPIターミ
ネーター（Alberなど. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434）である。

【００５１】それぞれ、本発明のポリヌクレオチド配列、プロモーター及びターミネーター
を連結し、そして酵母複製のために必要な情報を含む適切な酵母ベクター中にそ
れらを挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている。ベクター
は、本発明のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体をコードする全DNA
を含むDNA構造体をまず調製し、そして続いて、適切な発現ベクター中にこのフ
ラグメントを挿入することによって、又は個々の要素（例えば、シグナル、プロ
−ペプチド、ミニC−ペプチド、A及びB鎖）についての遺伝子情報を含むDNAフラ
グメントを連続的に挿入し、続いて連結することにより構成され得る。

【００５２】本発明はまた、本発明のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体をコー
ドするポリヌクレオチド配列を含んで成る組換え宿主細胞に関する。そのような
ポリヌクレオチド配列を含んで成るベクターは、宿主細胞中に導入され、その結
果、前記ベクターは、前記のように、染色体挿入体として、又は自己複製する染
色体外ベクターとして維持される。用語“宿主細胞”とは、複数の間に生じる突
然変異誘発のために、親細胞に同一でない、親細胞のいずれかの子孫を包含する
。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源にかなりの程
度、依存するであろう。

【００５３】宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は非単細胞微生物、例えば真
核酸細胞であり得る。有用な単細胞は、細菌細胞、例えばグラム陽性細菌、例え
ばバチルス細胞、ストレプトミセス細胞、又はグラム陰性細菌、例えばE.コリ及
びシュードモナルsp. を包含するが、但しそれらだけには限定されない。真核細
胞は、哺乳類、昆虫、植物又は菌類細胞であり得る。好ましい態様においては、
宿主細胞は酵母細胞である。本発明の方法に使用される酵母生物は、培養に基づ
いて、多量の本発明のインスリン前駆体及びインスリン前駆体類似体を生成する
いずれか適切な酵母生物であり得る。

【００５４】適切な酵母生物の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyce
s cerevisiae）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、シ
ゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロミセス・
ラバラム（Saccharomyces uvarum）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromy
ces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula pdymorpha）、ピチア・
パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）
、ピチア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowi
a lipolytica）、カンジダsp. (Candida sp.)、カンジダ・ウチリス（Candida u
tilis）、カンジダ・カカオイ（Candida cacaoi）、ゲオトリチウムsp. (Geotri
chum sp.) 及びゲオトリチウム・フェルメンタンス（Geotrichum fermentans）
から選択された菌株である。

【００５５】酵母細胞の形質転換は、例えばそれ自体知られている態様で、プロトプラスト
形成、続いての形質転換によりもたらされ得る。細胞を培養するために使用され
る培地は、酵母生物を増殖するために適切ないずれかの従来の培地であり得る。
分泌される本発明のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体（その有意な
割合、正しくプロセッシングされた形で培地に存在するであろう）は、遠心分離
、濾過、又はイオン交換マトリックス逆相吸収マトリックスによるインスリン前
駆体又はインスリン前駆体類似体の捕獲による培地からの酵母細胞の分離、塩、
例えば硫酸アンモニウムによる上清液又は濾液中のタンパク質成分の沈殿、続い
て、種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親
和製クロマトグラフィー又は同様のものによる精製を包含する従来の方法により
培地から回収され得る。

【００５６】本発明のインスリン前駆体及びインスリン前駆体類似体は、アメリカ特許第5,
395,922号及びヨーロッパ特許第765,395A号（両特許は引用により本明細書に組
み込まれる）に記載されるように、N−末端アミノ酸延長により発現され得る。
この延長は、発酵の間、本発明のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体
に安定して連結し、酵母プロテアーゼ、例えばDPAPのタンパク質加水分解活性に
対して前記インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体のN−末端を保護する
ことが見出された。

【００５７】インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体上でのN−末端延長の存在はま
た、タンパク質の化学的プロセッシングの間、N−末端アミノ基の保護として作
用することができ、すなわちそれは、BOC（ｔ−ブチル−オキシカルボニル）又
は類似する保護基のための置換基として作用することができる。N−末端延長は
、塩基性アミノ酸（例えば、Lys）に対して特異的であるタンパク質加水分解酵
素により、回収されたインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体から除去さ
れ、その結果、末端延長がLys残基で切断される。そのようなタンパク質加水分
解酵素の例は、トリプシン又はアクロモバクター・リチカス（Achromobacter ly
ticus）プロテアーゼである。

【００５８】培養培地への分泌及び回収の後、本発明のインスリン前駆体又はインスリン前
駆体類似体は、インスリン又は所望するインスリン類似体を付与する可能性ある
N−末端延長配列及びミニC−ペプチドを除去するために種々のインビボ方法にゆ
だねられるであろう。そのような方法は、アメリカ特許第4,343,898号又は第4,9
16,212号明細書、又はResearch Disclosure, September 1994/487 (それらの開
示は、引用により本明細書に組み込まれる) に記載されるように、L−トレオニ
ンエステルの存在下でのトリプシン又はアクロモバクター・リチカスプロテアー
ゼによる酵素転換、続いて、塩基又は酸加水分解によるインスリン又はインスリ
ン類似体のトレオニンエステルのインスリン又はインスリン類似体への転換を包
含する。

【００５９】下記に記載されるように、合成C−ペプチドを有するインスリン前駆体又はイ
ンスリン前駆体類似体は、少なくとも1つの芳香族アミノ酸を用いて構成された
（例１）。本発明のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体をコードする
ポリヌクレオチド配列を含むサッカロミセス・セレビシアエ発現プラスミドが、
PCRにより構成され、そしてS．セレビシアエ宿主細胞を形質転換するために使用
された。発現される生成物、例えばインスリン類似体の量は、適切な対照レベル
の％、例えばミニC−ペプチドを欠いている発現されるAsp^B28IP（表１）及び芳
香族アミノ酸残基を有さないミニC−ペプチドを有するAsp^B28IP（AlaAlalys）(
表２)の量として測定された。本発明の新規C−ペプチドは、７倍レベルまで高め
られた収率を付与した。

【００６０】本発明は、本発明の範囲を制限しない次の例により、さらに詳細に記載される
。添加図面は、本発明の明細書及び記載の不可欠の部分として見なされる。引用
されるすべての文献は、引用により本明細書に組み込まれる。

【００６１】実施例一般的な方法：すべての発現プラスミドは、S．セレビシアエにおけるプラスミド選択及び安
定化のためにシズサッカロミセス・ポンペトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子
（POT）を含むことによって特徴づけられる。ヨーロッパ特許第171,142号に記載
されるそれらのタイプに類似するC−POTタイプのものである。プラスミドはまた
、S．セレビシアエトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネー
ターを含む。

【００６２】それらの配列は、リーダー及びインスリン前駆体生成物の融合タンパク質をコ
ードするEcoRI−XbaIフラグメントの配列を除くすべての配列であるので、プラ
スミドpKFN1003 (WO90/100075号に記載される)におけるその対応する配列に類似
する。異なった融合タンパク質を発現するために、pKFN1003のEcoRI−XbaIフラ
グメントを、興味あるリーダー−インスリン前駆体−融合体をコードするEcoRI
−XbaIフラグメントにより単純に置換する。そのようなEcoRI−XbaIフラグメン
トを、標準方法に従って、合成及びオリゴヌクレオチド及びPCRを用いて合成す
ることができる。

【００６３】酵母形質転換体を、宿主株S．セレビシアエ株MT663の形質転換により調製した
（MATa/MATα Pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir⁺）。酵母株M
T663を、WO92/11378号の出願に関連して、Deutsche Sammlung von Mikroorganis
men und Zellkulturen寄託し、そして寄託番号DSM6278号を得た。

【００６４】 MT663を600nmで0.6のO.D.まで、YPGaL (1％Bacto酵母抽出物、２％Bactoペプ
トン、２％ガラクトース、１％ラクテート) 上で増殖した。培養物100mlを、遠
心分離により収穫し、水10mlにより洗浄し、再び遠心分離し、そして1.2Mのソル
ビトール、25mMのNa₂EDTA（pH＝8.0）及び6.7mg/mlのジチオトレイトールを含む
溶液10mlに再懸濁した。その懸濁液を、30℃で15分間インキュベートし、遠心分
離し、そして細胞を、1.2Mのソルビトール、10mMのNa₂EDTA、0.1Mのクエン酸ナ
トリウム、pH＝5.8及び2mgのNovozym（商標）234を含む溶液10mlに再懸濁した。

【００６５】その懸濁液を30℃で30分間インキュベートし、細胞を遠心分離により集め、1.
2Mのソルビトール10ml及びCAS（1.2Mのソルビトール、10mMのCaCl₂、10mMのトリ
スHCl（トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）pH＝7.5）10mlによ
り洗浄し、そしてCAS2mlに再懸濁した。形質転換のために、CAS−懸濁された細
胞1mlを、約0.1mgのプラスミドDNAと共に混合し、そして室温で15分間、放置し
た。（20％ポリエチレングリコール4000、10mMのCaCl₂、10mMのトリスHCl、pH＝
7.5）の溶液1mlを添加し、そしてその混合物を室温でさらに30分間、放置した。
その混合物を遠心分離し、そしてペレットを、SOS（1.2Mのソルビトール、33％
（v/v）のYPD、6.7mMのCaCl₂）0.1mlに再懸濁し、そして30℃で２時間インキュ
ベートした。

【００６６】次に、その懸濁液を遠心分離し、そしてペレットを、1.2Mのソルビトール0.5m
lに再懸濁した。次に、52℃でのトッピング寒天（1.2Mのソルビトール及び2.5％
ソルビトールを含む、Shermanなど. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold
Spring Harbor LaboratoryのSC培地）6mlを添加し、そしてその懸濁液を、同じ
寒天−固化された、ソルビトール含有培地を含むプレートの上部に注いだ。発現プラスミドにより形質転換されたS. セレビシアエ株MT663を、30℃で72時
間、YPDにおいて増殖した。培養物上清液におけるインスリン前駆体収量の定量
化を、外部標準としてヒトインスリンを用いて逆相HPLC分析により行った（Snel
& Damgaard (1988) Proinsulin heterogenity in pigs. Horm. Metabol. Res.
20:476-488）。

【００６７】例１．芳香族アミノ酸を有する合成C−ペプチドの構成プレペプチド（シグナルペプチド）及びプロペプチドから成るリーダー配列に
より結合されるAsp^B28IPから成る融合タンパク質をコードする合成遺伝子を、標
準の条件（Sambrookなど. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press）下で、及びE.H.F.ポリメラーゼ（Boehringer Mannheim GmbH, S
andhoefer Strasse 115, Mannheim, Germany）を用いて、PCRにより構成した。
得られるDNAフラグメントを単離し、そしてエンドヌクレアーゼにより消化し、
そしてGene Cleanキット（Bio101 Inc., La Jolla, CA, USA）を用いて精製した
。

【００６８】標準方法をDNA連結のために使用し、そしてE.コリ細胞の形質転換を、CaCl₂方
法（Sambrookなど. (1989) など. (1989) 前記）により行った。プラスミドを、
QIAGENカラム（QIAGEN, Hilden, GermanY）を用いて、形質転換されたE.コリ細
胞から精製した。ヌクレオチド配列を、鋳型として精製された二本鎖プラスミド
DNAを用いて、ALF Pharmacia Biotech DNA配列決定システムにより決定した。PC
Rのためのオリゴヌクレオチドプライマーを、DNA技法（Arhus，Denmark）から得
た。

【００６９】 S．セレビシアエにおけるAsp^B28IPの分泌発現を、Thimなど. (1989) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 83: 6770-6770に記載のようにして、S．セレビシアエ株MT6
63及び２μmの基本酵母発現ベクターCPOT（図１を参照のこと）を用いて行った
。酵母発現ベクターは、S.セレビシアエにおけるプラスミド選択及び安定化のた
めのシゾサッカロミセス・ポンベトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子を含む。
さらに、S．セレビシアエトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（TP11）プロモ
ーター及びターミネーターを、リーダー−Asp^B28IP融合タンパク質をコードする
組換え遺伝子の転写開始及び終結のために使用する。Asp^B28IPの分泌を、種々の
既知の酵母リーダー配列が使用され得るけれども、α−因子リーダーにより促進
した。

【００７０】図１に示されるように、LA19リーダーEEAEAEAEPK（配列番号３）−IP融合タン
パク質を発現するpAK721 S. セレビシアエ発現プラスミドを、S．セレビシアエ
−E．コリシャトルPOTプラスミド（アメリカ特許第5,871,957号）に基づいて
構成した。図１においては、L−IPは、リーダーIP融合タンパク質をコードする
融合タンパク質のカセットを示し；TPI−プロモーターはS．セレビシアエTP11プ
ロモーターであり、TPI−ターミネーターはS．セレビシアエTP11ターミネーター
であり；TPI−POMBEはS．セレビシアエにおける選択のために使用されるS．ポン
ベPOT遺伝子を示し；起点は２μmのプラスミドに由来する複製のS．セレビシア
エ起点を示し；AMP−RはE．コリにおける選択を促進する。アンピシリンに対し
ての耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を示し、そして起点−PBR322は複製
のE．コリ起点を示す。

【００７１】リーダー配列、及び異なったミニC−ペプチドを有するAsp^B28IPの多くの融合
タンパク質をコードするDNAを、下記のようにして、プライマーとして適切なオ
リゴヌクレオチドを用いてPCRにより生成した。標準の方法を用いて、リーダー
−Asp^B28IP融合タンパク質をコードするDNAフラグメントを、CPOT発現ベクター
中に次の配位でサブクローン化した：リーダー−Lys−Arg−スペーサー−Asp^B28 IP（ここで、Lys−Argは有効な二酸基性エンドプロテアーゼプロセッシング部位
であり、そしてスペーサーはN−末端延長である）。

【００７２】 S．セレビシアエKex2エンドプロテアーゼにより融合タンパク質のプロセッシ
ングを最適化するために、スペーサーペプチド（N−末端延長）、例えばEEAEAEA
PK（配列番号４）をコードするDNAを、リーダーをコードするDNAとAsp^B28IPとの
間に挿入した（Kjeldsenなど. (1996) Gene 170, 107-112）。しかしながら、ス
ペーサーペプチドの存在は強制的ではない。成熟Asp^B28IPを、Lys^B29及びGly^A1
を連結するミニC−ペプチドを有する、一本鎖のN−末端延長されたインスリン前
駆体として分泌した。Asp^B28IPの精製、及びN−末端延長及びミニC−ペプチドの
タンパク質加水分解除去の後、アミノ酸Thr^B30を、酵素介在性ペプチド転移反応
によりLys^B29に付加し、Asp^B28ヒトインスリンを生成した（Markussenなど. (19
87) in “Peptides 1986” (Theodoropoulos, D., Ed.), pp. 189-194, Walter
de Gruyter & Co., Berlin）。

【００７３】合成ミニC−ペプチドの成長を、ミニC−ペプチドにおけるアミノ酸をコードす
る１又は複数のコドンのランダム化により行った。すべての合成ミニC−ペプチ
ドは、合成ミニC−ペプチドの酵素的除去を可能にするC−末端で酵素的プロセッ
シング部位（Lys）を特徴とする（引用により本明細書に組み込まれるアメリカ
特許第4,916,212号）。ランダム化は、合成ミニC−ペプチドの１又は複数の位置
でコドン変動を導入された、ドーピングされたオリゴヌクレオチドを用いて行わ
れた。典型的には、PCRのために使用される２種のプライマー（オリゴヌクレオ
チド）の１つがドーピングされた。

【００７４】一般式：Xaa−Trp−Lys（XVVK）を有する生成された合成ミニC−ペプチドに使
用されるランダム化された合成ミニC−ペプチドを有するリーダーAsp^B28IPのPCR
生成のために使用されるオリゴヌクレオチド対の例は、次の通りである：プライマーA： 5’−TAAATCTATAACTACAAAAAACACATA−3’（配列番号13）、及びプライマーB： 3’-CCAAAGAAGATGTGACTGTTCNNMACCTTCCCATAGCAACTTGTTACAACATGAAGATAGACAAGA
AACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATCAGATCTTTGA-TTC-5’（配列番号14）、ここでN
はA, C, G又はTであり、そしてMはC又はAである。

【００７５】ポリメラーゼ連鎖反応。PCRを典型的には、次の成分下で行った：５μlのプラ
イマーA（20pモル）、５μlのプライマーB（20pモル）、10μlの10×PCR緩衝液
、８μlのdNTPミックス、0.75μlのE.H.F.酵素、鋳型としての１μlのpAK1150プ
ラスミド（約0.2μgのDNA）、及び70.25μlの蒸留水。典型的には、10〜15サイクルを行い、１つのサイクルは典型的には、94℃で45
秒；55℃で１分；72℃で1.5分であった。PCR混合物を、続いて、２％アガロース
ゲル上に負荷し、そして電気泳動を標準の技法を用いて行った。得られるDNAフ
ラグメントを、アガロースゲルから切断し、そしてGene Cleanキットにより単離
した。

【００７６】図２は、PCRのための鋳型として使用されるpAK1150 DNAの配列及びコードされ
る融合タンパク質の推定されるアミノ酸（α−因子−リーダー（EEAEAEAPK）（
配列番号４）−Asp^B28IP又はpAK1150 (配列番号５及び６)を示す。pAK1150プラ
スミドは、図１に示されるpAK721に類似する。α−因子−リーダーのC−末端を
、推定されるアミノ酸配列を、SerLeuAspからSerMetAlaに変えるNcoI制限エンド
ヌクレアーゼを導入するために、修飾した。さらに、コードされたASP^B28IPは、
ミニC−ペプチドを特徴としないが、しかしLys^B29はGly^A1に直接的に連結される
。

【００７７】精製されたPCR DNAフラグメントを水及び制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶
解し、そして標準技法に従って、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Bgl
II及びXbaI）により消化した。Bal II-XbaI DNAフラグメントを、アガロース電
気泳動にゆだね、そしてGene Glean キットを用いて精製した。発現プラスミドpAK1150，又はCPOT型の類似するプラスミド（図１を参照のこ
と）を、制限エンドヌクレアーゼBgl II及びXbaIにより消化し、そして10765個
のヌクレオチド塩基対のベクターフラグメントを、Gene Cleanキットを用いて単
離した。

【００７８】２種の消化され、そして単離されたDNAフラグメント（ベクターフラグメント
及びPCRフラグメント）を、T4 DNAリガーゼ及び標準条件を用いて一緒に連結し
た。連結混合物を続いて、コンピテントE．コリ株（R^-, M⁺）中に形質転換し、
続いてアンピシリン耐性により選択した。得られるE．コリからのプラスミドを
、QIAGENカラムを用いて単離した。

【００７９】プラスミドを、続いて適切なS．セレビシアエ宿主株、例えばMT663（MATa/MAT
α Pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir⁺）の形質転換のために
使用した。個々の形質転換されたS．セレビシアエクローンを、液体培養にお
いて増殖し、そして培養上清液に分泌されるAsp^B28IPの量を、RP-HPLCにより決
定した。次に、高められた量のAsp^B28IPを分泌するS．セレビシアエクローンか
らの発現プラスミドの合成ミニｃ−ペプチドをコードするDNA配列を決定した。
続いて、同定された合成ミニC−ペプチド配列を、もう１つのラウンドのランダ
ム化された最適化工程にゆだねることができる。

【００８０】記載されるランダム化された最適化工程に起因する合成ミニC−ペプチド（Glu
TrpLys）を特徴とするリーダー−Asp^B28IP（GluTrpLys）融合タンパク質をコー
ドするDNA配列に基づく例が、図３（配列番号７及び８）に示される。第１表及び第２表は、上記方法により生成されるインスリン前駆体類似体、及
び対照の％として表される生成収率を示す。発酵を、5mlのYPDにおいて30℃で72
時間行った。インスリン前駆体の収率が、培養上清液のRP−HPLCにより決定され
、そしてB29残基がペプチド結合によりA1残基に連結されているリーダー−Asp^B2 ⁸ IP融合タンパク質、又はB29残基がミニC−ペプチドによりA1残基に連結されて
いるリーダー−Asp^B28IP融合タンパク質のいずれかを発現する対照株の収率に対
して表される。

【００８１】表において、“α^★”は、LysArgまでのC−末端が“SLD（SerLeuAsp）”から
“SMA（SerMetAla）”に修飾され、そして“ex4”がアミノ酸配列EEAEAEAPK（配
列番号４）を有するN−末端延長であるα−因子リーダーを示す。YAP3はYAP3シ
グナル配列である。TA39は合成プレ配列QPIDDTESNTTSVNLMADDTESRFATNTTLAGGLDV
VNLISMAKR（配列番号16）である。配列EEGEPK（配列番号17）は、インスリン類
似体のB−鎖側のN−末端延長である。TA57は、合成プロ配列QPIDDTESQTTSVNLMAD
DTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR（配列番号18）である。

【００８２】

【表１】

【００８３】

【表２】

【００８４】例２．NMR分光計による水溶液におけるAsp^B28IP（MetTrpLys）の構造決定 NMR分光計。NMRのためのサンプルを、10/90のD₂O/H₂Oに凍結乾燥されたタンパ
ク質粉末を、10mMのリン酸緩衝液に溶解し、そして小体積の１MのDCl又はNaODの
添加により所望のようなpHを調節することによって調製した。すべての計器読み
取りは、同位体効果のために修正しない。NMRのためのAsp^B28IP（MetTrpLys）の
サンプルを、pH8.0で、25μM〜1mMの範囲の濃度で調製した。

【００８５】 1mMのサンプル、すなわちDQF−COSY（Piantinなど. (1982) J. AM. Chem. Soc
. 104: 6800-6801, Ranceなど. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 117:
479-485）、TOCSY（Braunschweilerなど. (1983) J. Magn. Reson. 53: 521-528
, Baxなど. (1985) J. Magn. Reaon. 65: 355-360）及びNOESY（Jeenerなど. (1
979) J. Chem. Phys. 71: 4546-4553）の二次元¹H−¹H NMRスペクトルを、Vari
anユーザーライブラリーからの標準のパルス配列を用いて、自己−シールド三軸
グラジエントコイルを有する¹H/¹³C/¹⁵N三重共鳴プローブを備えたVarian Unity
Inova NMR 分光計上で、600MHzで記録した。

【００８６】操作温度は、27℃に設定された。個々の相感受性二次元NMRスペクトルに関し
ては、512t₁インクレメントTPPI−States方法（Marionなど. (1989) J. Magn. (
1989) J. Magn. Reson. 85: 893-399）に従って、2048又は4096実データ点によ
り獲得した。両寸法での6983Hzのスペクトル幅を、グラジエント−調整された励
起パルス配列による1.5秒間の走査と、選択的励起との間の飽和を用いることに
よって減衰されて水共鳴上に正確に配置されたキャリヤーと共に使用した（WATE
RGATE, Piottoなど. (1992) J. Biomol. NMR2: 661-665）。DQFCOSYスペクトル
を、マジック−角度グラジエントを適用するグラジエント増強されたバージョン
を用いて記録した（Mattielloなど. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 3253-3281
）。TOCSYスペクトルに関しては、30〜80m秒間の混合時間が使用され、そしてNO
ESYに関しては、50〜200m秒間の混合時間が使用された。

【００８７】二次元NMRスペクトルの処理は、ソフトウェアパッケージXwinnmr（Bruker Ana
lytische Messtechnik GmbH, D-76275 Ettlingen, Germany からのNMR処理ソフ
トウェアバージョン2.5）を用いて、行われた。個々の次元は、個々の次元にお
いて１度、実施される、移動された正弦−ベルアポディゼーション及びゼロ−充
填により処理された。基線修正は、必要なら、Xwinnmr標準方法を用いて適用さ
れた。

【００８８】スペクトル割り当て、交差ピーク統合、配列特異的割り当て、立体特異的割り
当て、及びすべての他の簿記は、プログラムPRONTO（PRNTO Software Developme
nt and Distribution, Copenhagen Denmark）(Kjaerなど. (1991) NATO ASI Ser
ies (Hoch, J. C., Redfield C., & Poulsen, F.M., Eds.) Plenum，New York)
を用いて行われた。化学シフトは、ppmで測定され、そして水共鳴は4.75ppmに設
定される。

【００８９】構造計算。続く構造計算のための距離抑制は、それぞれ、5.5, 3.3及び2.7Å
の上限距離抑制に対応する、弱い、中位又は強いとして分類される統合されたNO
ESY交差ピークから得られた。メチル基に関する距離抑制に関しては、追加の0.5
Åが、その上限には付加された（Wagnerなど., (1985) J. Mol. Biol. 196: 611
-639）。

【００９０】構造計算を、距離幾何学を組合すハイブリッド方法を用いて行ない（Crippen
など. (1988) Distance Geometry and Molecular Conformation, Research Stuc
ies Press, Taunton, Somerset, England; Kuszewskiなど.（1992） J. Biomol
NMR2: 33-56）、そしてX−PLORマニュアル（dg_sub_embed. Inp, dgsa. Inp, re
fine. inp）により与えられる例に従って、X−PLOR 3.0 (Brunger (1992) X-PLO
R Version 3.1: A System for X-ray Crystallography and NMR, Yale Universi
ty Press, New Haven) を用いて、Nilgesなど. (1988) FEBS Lett. 229: 317-32
4の考えに基づいてアニーリングをシミュレートした。残基数は、標準のインス
リン残基番号付けに由来し、B−鎖における残基はB1からB29まで番号付けされ、
C−ペプチドにおける残基（例えばMerTrpLys）はC1からC3まで番号付けされ、そ
してA−鎖における残基はA1からA21まで番号付けされる。

【００９１】 NMRスペクトルのスペクトル割り当ては、ほとんどの共鳴に関して、Wuthrich
（1986 NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley, New York）により記載さ
れる標準の配列割り当て方法に従った。標準の割り当て方法は、特定のアミノ酸
残基の目的とするプロトンが水におけるプロトンと急速に交換する場合、失敗で
ある。pH8.0で、これはいくつかのアミノ酸残基に関して生じるが、しかしなが
ら、初期変異体インスリンNMRスペクトル割り当てとの比較、及びNOEを通しての
隣接する（空間における）アミノ酸残基の同定は、ほとんどすべてのスペクトル
割り当てを可能にする。

【００９２】 NOESYスペクトルの分析は、いくつかのアミノ酸残基が、他のインスリン分子
についてこれまで決定された残基、すなわちヒトインスリンHis^B16変異体に類似
する周囲残基に対してNOE網状構造を有し（Ludvigsenなど. (1994) Biochemistr
y 33: 7998-8006）、そしてそれらの類似する条件が残基B1−B10、B13−B14、B1
7−B24及びA4−A21について見出される。さらに、上記に列挙される残基につい
ての二面角制御が、これまで使用されたそれらから採用された（Ludvigsenなど. (1994) 前記）。

【００９３】いくつかのアミノ酸、特にB27−B29、C1−C3、A1−A3は、通常十分に定義され
ている二次構造要素よりも低く規則化されているペプチド鎖と一致する交差ピー
クパターンを有する。従って、追加のNOEは、メチル基が包含される場合、5.5Å
又は6.0Åの上限によりも、いずれの追加の分類も伴なわないで、距離抑制中に
転換された。20の収斂された構造の全体（図５）が計算され、そして相当するパ
ラメーターが収斂構造について表３に列挙される。距離制御に同一の個々のNOE
は、たとえそれがNOESYスペクトルにおいて数度、生じたとしても、わずか１度
、計算される。ラーマチャンドラプロット性質割り当ては、局部幾何学品質を評
価するための標準の品質パラメーターである。一般的に、記載される品質パラメ
ーターは、X−線に基づくタンパク質構造の2.5Å分解能に比較できる（Laskowsk
iなど. (1996) J. Biolmol. NMR 8: 477-486）。

【００９４】

【表３】

【００９５】計算された構造の説明：全体の平均に最も類似する代表的な構造が、図６に示されている。Asp^B28IP（
MetTrpLys）は、前記B1−B10、B14−B23、A4−A21を含んで成る領域について生
来のインスリン構造に構造的に類似する。その差異は、位置B26−B29、C1−C3、
A1−A3における連結ペプチド付近の領域に関して最も明白である、そして前記B1
1−B13に関しては、前記よりも明白でない。C−ペプチド近くのAsp^B28IP（MetTr
pLys）の構造は、生来の構造とは厳格に異なっている（Ludvigsen（1994）前記
）。

【００９６】 Asp^B28IP（MetTrpLys）におけるメチオニン及びトリプトファン側鎖は、特定
のTyr^B28及びPhe^B26の側鎖を方側に動かし、そしてLeu^B11、Val^B12、Ile^A2及びT
yr^A18の側鎖により包含される他の有用な近くの疎水性パッチを損なわないまま
に放置することによって、従来のインスリンコアー構造を開環する。Phe^B25、Ty
r^B26、及び残基B25〜B29により包含されるペプチドを動かすことによって創造さ
れるポケットは、C−ペプチドからの側鎖Met^C1及びTrp^C2のパッキングを収容す
るために明らかに十分に適合される。それらの２個の側鎖〜構造的に接近する残
基のいくつかのNOEは、いずれかのインスリン構造にこれまで観察されていない
側鎖のこの非常に新規の配位を証明する。

【００９７】 Met^C1が、NOE〜Met^C1のすべてを有する残基Leu^B15、Phe^B24、Tyr^B28、Trp^C1、
Ile^A2及びTry^A19により構成されるポケットに配置される。Trp^C2はさらにより広
範囲のNOE網状構造を有するが、しかしインドールアミドプロトンの早い交換の
ために、Trp^C2の芳香族環に属するわずか４個の共鳴が割り当てられ得る。これ
にもかかわらず、Trp^C2からLeu^B11、Val^B12、Leu^B15、Tyr^B28、Met^C1及びIle^A2
により拡張されるその隣接部分までの21個の残基間NOEは、Asp^B28IP（MetTrpLys
）のNOESY範囲に観察された。

【００９８】前記ポケットにおけるトリプトファン側鎖の存在はまた、Asp^B28IP（MetTrpLy
s）の範囲に観察される化学シフトに対して広範囲の影響を有する。NMRのために
使用される条件下で、Asp^B28IP（MetTrpLys）の範囲は、自己会合によりいくら
かの程度、影響されるが（図７）、しかしモノマーとダイマーとの間の交換は、
それらの２種の状態間の平均として単に観察されるNMRの時間の尺度に基づく。2
5μM〜0.2mMの濃度で、自己会合の程度は、NMRにより見出されるようには変化し
ない。

【００９９】図４は、10％/90％D₂O/H₂O及び10mMのリン酸緩衝液の溶液（pH８）において60
0MHzで得られる、27℃でのAsp^B28IP（MetTrpLys）の化学シフトを示す。化学シ
フトは残留水シグナルを4.76ppmに設定することによって参照される。N/Aは割り
当てなしを意味する。Asp^B28IP（MetTrpLys）は、（1−29＝B1−B29；30−32＝C
1−C3及び33−53＝A1−A21）を割り当て、そして表５は、PDB型でのAsp^B28IP（M
etTrpLys）の原子座標を提供する。

【０１００】

【表４】

【０１０１】

【表５】

【０１０２】

【表６】

【０１０３】

【表７】

【０１０４】

【表８】

【０１０５】

【表９】

【０１０６】

【表１０】

【０１０７】

【表１１】

【０１０８】

【表１２】

【０１０９】

【表１３】

【０１１０】

【表１４】

【０１１１】

【表１５】

【０１１２】

【表１６】

【０１１３】

【表１７】

【０１１４】

【表１８】

【０１１５】

【表１９】

【０１１６】

【表２０】

【０１１７】

【表２１】

【０１１８】

【表２２】

【０１１９】

【表２３】

【０１２０】

【表２４】

【０１２１】

【表２５】

【０１２２】

【表２６】

【０１２３】

【表２７】

【０１２４】

【表２８】

【０１２５】

【表２９】

【０１２６】

【表３０】

【０１２７】

【表３１】

【０１２８】

【表３２】

【０１２９】

【表３３】

【０１３０】

【表３４】

【０１３１】例３．Asp^B28IP類似体の相対的折りたたみ安定性インスリン前駆体についての折りたたみの評価のために、変性サンプルを、異
なった割合でのインスリン前駆体及びGuHCl原液と10mMのトリス/ClO₄ ^-（pH8.0）
とを組合すことによって調製した。タンパク質原液は典型的には、10mMのトリス
/ClO₄ ^-(pH8.0) において8.25Mであった。CDスペクトルは、（＋）−10−樟脳ス
ルホン酸により検量されたJasco J-715分光計により記録された。すべてのスペ
クトルは、20℃で記録された。

【０１３２】変性サンプルを、250〜218nmで走査した。典型的なセル通過幅及びタンパク質
濃度は、それぞれ0.5cm及び３μMであった。すべてのスペクトルは、適切な溶媒
ブランクの控除の前、平滑にされた。円二色性は、ペプチド結合のモル濃度に基
づいてΔεとして表される。表示するために、個々の曲線は、実験において観察
される合計の変化により、個々の点での観察される変化を割り算することによっ
て、０−１の尺度に標準化される。

【０１３３】データ分析。GuHCl変性曲線を、折りたたみ/変性の転移が、Santoro & Bolen
(1988) Biochemistry 27: 8063-8068及びKaarsholmなど. (1993) Biochemistry
32: 10773-10778により記載されるようにして、２種の状態であることを仮定す
ることによって分析し、ここで引用により本明細書に組み込まれる前記２種の文
献は、GuHCl変性により安定性を計算する方法を教授する。この分析は、多くの
パラメーター、例えば、変性曲線の中点でのGuHClを生成する。Cmidは、タンパ
ク質集団の半分を変性するのに必要な変性剤の濃度に影響を及ぼす。従って、折
りたたみ安定性の上昇は、Cmidの高められた値により明白である。

【０１３４】平衡安定数は、K＝（Δε_N−Δε）/（Δε−Δε_U）(ここで、ΔεはCDの観
察される値であり、そしてΔε_N及びΔε_Uはそれぞれ、所定のGuHCl濃度での生
来及び変性された形についてのCD値を表す) を用いて、個々の変性濃度で得られ
る（Pace, 1975）。転移領域におけるGuHCl濃度でのΔε_N及びΔε_Uについての
値は、転移領域中への前−及び後−転移基線の線状外挿、すなわちΔE_N＝Δε⁰ _N ＋m_N［GuHCl］及びΔε_U＝Δε⁰ _U＋m_U［GuHCl］（ここで、Δε⁰ _N及びΔε⁰ _Uは
交点であり、そしてm_N及びm_Uは、それぞれ、前−及び後−転移基線の傾斜である
）により得られる。

【０１３５】転移領域における所定の変性濃度での変性の自由エネルギーは、ΔG＝-RTInK
により与えられる。変性剤濃度へのΔGの線状依存性を仮定すれば、ΔG＝ΔG_H2O -m［GuHCl］［ここで、ΔG_H2Oは変性剤の不在下でのΔGの値であり、そしてmは
変性剤濃度へのΔGの依存性の測定である］。従って、転移領域におけるKから誘
導されるΔG値は、ΔG_H2Oを得るために、0Mの変性剤に引き続いて外挿され得る
。完全な変性曲線に関してのΔεと［GuHCl］との間の関係は、下記等式１（San
toro & Bolen, 1988）に示される：

【０１３６】

【数１】

【０１３７】応答としてのΔε及び独立変数としての［GuHCl］を伴なって、等式（１）は
、PC SAS (SAS Inc. Cary, North Carolina) のNLIN方法を用いて非直線最小二
乗分析を受ける。次に、６種のパラメーター、Δε⁰ _N, Δε⁰ _U, m_N, m_U, m及び
ΔG_H2Oは変性曲線を説明する。さらに、変性曲線の中点でのGuHCl濃度、すなわ
ちCmidは、ΔG_H2O /mにより与えられる。

【０１３８】 C−ペプチドMetTrpLys（Asp^B28IP（MetTrpLys））を有するAsp^B28IP誘導体分
子の相対的折りたたみ安定性の評価を、Asp^B28IPに関して評価した。その結果は
、Asp^B28IP（MetTrpLys）分子、Cmidにおける変化により明らかなように、Asp^B2 ⁸ IP（図５）よりもより安定していた。Asp^B28IPについてのCmidはおよそ約5.5M
のGuHClであるが、Asp^B28IP（MetTrpLys）のそれは、少なくとも約6.5MのGuHCl
まで高められる（約18％の上昇率）。

【０１３９】例４．インスリン前駆体類似体Asp^B28IP（EWK）を、YAP3−TA39−EEGEPK（配列番号1
7）−Asp^B28IP（EEK）融合タンパク質、又はYAP3−TA57−EEGEPK（配列番号17）
−Asp^B28IP（EWK）融合タンパク質を発現する発現プラスミドにより形質転換さ
れた酵母株MT663を培養することによって生成した。

【０１４０】リーダー配列YAP3−TA39及びYAP3−TA57をコードするcDNA, 及びAsp^B28IP（EW
K）及びN−末端延長をコードするcDNAを、標準の技法（Sambrook J, Fritsch EF
及びManiatis T, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press,
1989）を用いて、C−POT型の発現ベクター中にクローン化した。DNA及び推定さ
れるアミノ酸配列は、図８及び９に示される。第６表は、収率を示す。発酵は、5mlのYPDにおいて30℃で72時間、行われた。
IP収率は、培養物上清液のRP−HPLCにより決定され、そして対照株のIP収率に比
較して表される。

【０１４１】第６表においては、“α^★”は、LysArgまでのC−末端が“SLD（SerLeuAsp）
”から“SMA（SerMetAla）”に修飾されているα−因子リーダーを示し、そして
“ex4”は、アミノ酸配列EEAEAEAPK（配列番号４）を有するN−末端延長である
。YAP3は、YAP3シグナル配列である。TA39は、合成プロ−配列QPIDDTESNTTSVNLM
ADDTESRFATNTTLAGGLDVVNLISMAKR（配列番号16）である。配列EEGEPK（配列番号1
7）は、インスリン類似体のB−鎖のN−末端側延長である。TA57は、合成プロ−
配列QPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR（配列番号18）である。

【０１４２】

【表３５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、LA19リーダー−EEAEAEAEPK（配列番号３）−IP（AlaAlaLys）融合タ
ンパク質を発現するpAK721 S. セレビシアエ発現プラスミドを表す。

【図２】図２は、PCR鋳型として使用されるpAK1150のコードされた融合タンパク質（α
−因子−リーダー−EEAEAEAPK（配列番号４）−Asp^B28IP部分）のDNA配列及び推
定されるアミノ酸配列（配列番号５及び６）である。

【図３】図３は、ランダム化された最適化により生成される合成ミニC−ペプチドGluTr
pLysを有するα−因子リーダー−Asp^B28IP（GluTrpLys）融合タンパク質をコー
ドするDNA配列（配列番号７及び８）である。ミニC−ペプチド（EWK）は、下線
により示される。

【図４】図４は、Asp^B28IPに比較してのインスリン類似体Asp^B28IP（MetTrpLys）の折
りたたみ安定性を示す。

【図５】図５は、20の収斂構造の全体の主鎖系としてのAsp^B28IP（MetTrpLys）の分解
構造を示す。

【図６】図６は、Asp^B28IP（MetTrpLys）のリボン表示を示す。その図は、MOLSCRIPT（
Kraulis (1991) J. Appl. Crystallog, 24: 946-950）を用いて生成される。ア
ミノ酸注釈は次の通りである：B1−B29（B鎖）は番号１−29であり、残基C1−C3
（連結ペプチド）は番号30−32であり、そして残基A1−A21（A鎖）は番号33−53
である。

【図７】図７は、10％/90％のD₂O/H₂O及び10mMのリン酸緩衝液（pH8.0）において1.0mM
の濃度で27℃で記録されるAsp^B28IP（MetTrpLys）についてのIDプロトンNMRスペ
クトルである。

【図８】図８は、合成ミニC−ペプチドGluTrpLysを有するYAP3−TA39-EEGEPK（配列番
号17）−Asp^B28IP融合タンパク質を発現する発現カセットのDNA及び推定される
アミノ酸配列（配列番号９及び10）である。

【図９】図９は、合成ミニC−ペプチドGluTrpLysを有するYAP3−TA57-EEGEPK（配列番
号17）−Asp^B28IP融合タンパク質を発現する発現カセットのDNA及び推定される
アミノ酸配列（配列番号11及び12）である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年３月８日（２００２．３．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者カールスホルム，ニルスクリスチャンデンマーク国，デーコー−2720 バンレーゼ，クラウスホルムバイ 38 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 CA01 DA12 GA11 HA20 4B064 AG16 CA06 CA19 CC24 DA07 4B065 AA72X AB01 AC15 BA02 CA24 CA44 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA37 EA23 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 A及びB鎖から切断できる連結ペプチド（C−ペプチド）を含
んで成り、前記連結ペプチドが少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基、及び前記
A−鎖と前記連結ペプチドとの間のペプチド結合の切断を可能にする切断部位を
含んで成り、そして１つの芳香族アミノ酸残基が前記切断部位のすぐN−末端側
に存在するインスリン前駆体又は又はインスリン前駆体類似体。
【請求項２】前記連結ペプチドが、15個までの長さのアミノ酸残基のもの
である請求項１記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３】前記連結ペプチドが、９個までの長さのアミノ酸残基のもの
である請求項１記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４】前記連結ペプチドが、5個までのアミノ酸残基、好ましくは
３個までのアミノ酸残基のものである請求項１記載のインスリン前駆体又はイン
スリン前駆体類似体。
【請求項５】前記A−鎖と前記連結ペプチドとの間のペプチド結合の切断
を可能にする切断部位が、Lys又はArgである請求項１記載のインスリン前駆体又
はインスリン前駆体類似体。
【請求項６】前記連結ペプチドが、５個までの芳香族アミノ酸残基を含ん
で成る請求項１記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７】前記連結ペプチドが、３個までの芳香族アミノ酸残基、好ま
しくはわずか１つの芳香族アミノ酸残基を含んで成る請求項１記載のインスリン
前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項８】前記芳香族アミノ酸残基の１つが、前記B鎖における位置B11
、 B12又はB26におけるアミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満離れて存在
する請求項７記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項９】前記切断部位のすぐN−末端側の芳香族アミノ酸残基が、前
記B鎖における位置B11、 B12又はB26におけるアミノ酸残基の少なくとも１つか
ら５Å未満離れて存在する請求項１記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆
体類似体。
【請求項１０】前記インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体が、前
記連結ペプチドに芳香族アミノ酸残基を含まないインスリン前駆体又はインスリ
ン前駆体類似体に比較して、溶液において高められたCmid安定性を示す請求項１
記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１１】 Cmidが約5.5M以上のGuHClである請求項10記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１２】 Cmidが約6.0M以上のCuHClである請求項10記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１３】 Cmidが少なくとも約6.5MのGuHClである請求項10記載のイ
ンスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１４】 A及びB鎖から切断でき、そして９個までの長さのアミノ酸
残基からなり、少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基を含んで成る連結ペプチド
（C−ペプチド）を含んで成るインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１５】前記連結ペプチドが、５個までのアミノ酸残基のものであ
る請求項14記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１６】前記連結ペプチドが、３個までの長さのアミノ酸残基のも
のである請求項14記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１７】前記連結ペプチドが、５個までの芳香族アミノ酸残基を含
んで成る請求項14記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１８】前記連結ペプチドが、３個までの芳香族アミノ酸残基、好
ましくは１つの芳香族アミノ酸残基を含んで成る請求項14記載のインスリン前駆
体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項１９】前記連結ペプチドが、前記A鎖のすぐN−末端側のLys又はA
rgを有する請求項14記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項２０】１つの芳香族アミノ酸残基が、前記Lys又はArgのすぐN−
末端側に存在する請求項19記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体
。
【請求項２１】前記連結ペプチドにおける芳香族アミノ酸残基の１つが、
前記B鎖における位置B11、 B12又はB26における残基の少なくとも１つから５Å
未満離れて存在する請求項14記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似
体。
【請求項２２】前記Lys又はArgのすぐN−末端に位置する芳香族アミノ酸
が、前記B鎖における位置B11、 B12又はB26における残基の少なくとも１つから
５Å未満離れて存在する請求項20記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体
類似体。
【請求項２３】前記インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体が、前
記連結ペプチドに芳香族アミノ酸残基を含まないインスリン前駆体又はインスリ
ン前駆体類似体に比較して、溶液において高められたCmid安定性を示す請求項14
記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項２４】 Cmidが約5.5M以上のGuHClである請求項23記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項２５】 Cmidが約6.0M以上のCuHClである請求項23記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項２６】 Cmidが少なくとも約6.5MのGuHClである請求項23記載のイ
ンスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項２７】 A及びB鎖から切断できる連結ペプチド（C−ペプチド）を
含んで成り、ここで前記連結ペプチドが前記B鎖における位置B11、 B12又はB26
におけるアミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満離れて存在する１つの芳香
族アミノ酸残基を含んで成るインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項２８】前記連結ペプチドが、15個までの長さのアミノ酸残基のも
のである請求項27記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項２９】前記連結ペプチドが、９個までの長さのアミノ酸残基のも
のである請求項27記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３０】前記連結ペプチドが、５個までのアミノ酸残基のものであ
る請求項27記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３１】前記連結ペプチドが、３個までの長さのアミノ酸残基のも
のである請求項27記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３２】前記連結ペプチドが、５個までの芳香族アミノ酸残基を含
んで成る請求項27記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３３】前記連結ペプチドが、３個までの芳香族アミノ酸残基、好
ましくはわずか１つの芳香族アミノ酸残基を含んで成る請求項27記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３４】前記連結ペプチドが、前記A鎖のすぐN−末端側のLys又はA
rgを有する請求項27記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３５】１つの芳香族アミノ酸残基が、前記Lys又はArgのすぐN−
末端側に存在する請求項34記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体
。
【請求項３６】前記Lys又はArgのすぐN−末端に位置する芳香族アミノ酸
が、前記B鎖における位置B11、 B12又はB26における残基の少なくとも１つから
５Å未満離れて存在する請求項35記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体
類似体。
【請求項３７】前記インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体が、前
記連結ペプチドに芳香族アミノ酸残基を含まないインスリン前駆体又はインスリ
ン前駆体類似体に比較して、溶液において高められたCmid安定性を示す請求項27
記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３８】 Cmidが約5.5M以上のGuHClである請求項37記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項３９】 Cmidが約6.0M以上のCuHClである請求項37記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４０】 Cmidが少なくとも約6.5MのGuHClである請求項37記載のイ
ンスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４１】下記式： B（1−27）−X₂−X₃−X₁−Y−A（1−21）［式中、X₁は、少なくとも１つのアミノ酸残基が芳香族アミノ酸残基である１
〜８個のアミノ酸残基のペプチド配列であり； X₂は、前記B鎖の位置28でのPro, Asp, Lys又はIleの１つであり； X₃は、前記B鎖の位置29でのPro, Lys, Ala, Arg又はPro−Thrの１つであり；
そして Yは、Lys又はArgである］により表されるインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４２】 X₁が１〜６個のアミノ酸残基である請求項41記載のインス
リン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４３】 X₁が１〜４個のアミノ酸残基である請求項41記載のインス
リン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４４】 X₁が１〜３個のアミノ酸残基である請求項41記載のインス
リン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４５】 X₁が１〜２個のアミノ酸残基である請求項41記載のインス
リン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４６】 X₁が５個までの芳香族アミノ酸残基を含んで成る請求項41
記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４７】 X₁が３個までの芳香族アミノ酸残基、好ましくはわずか１
つの芳香族アミノ酸残基を含んで成る請求項41記載のインスリン前駆体又はイン
スリン前駆体類似体。
【請求項４８】前記芳香族アミノ酸残基が、Trp及びTyrからなる群から選
択される請求項41記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項４９】１つの芳香族アミノ酸残基が、前記B鎖における位置B11、 B12又はB26におけるアミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満離れて存在す
る請求項41記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５０】１つの芳香族アミノ酸残基が、YのすぐN−末端側に存在す
る請求項41記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５１】 YのすぐN−末端側の芳香族アミノ酸残基が、前記B鎖にお
ける位置B11、 B12又はB26におけるアミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満
離れて存在する請求項50記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５２】 X₁−Yが、（ａ）Met−Trp−Lys,（ｂ）Ala−Trp−Lys、（
C）Val−Trp−Lys、（ｄ）Ile−Trp−Lys、（ｅ）Leu−Trp−Lys、（ｆ）Glu−G
lu−Phe−Lys（配列番号15）、（ｇ）Glu−Phe−Lys、（ｈ）Glu−Trp−Lys、（
i）Ser−Trp−Lys、（ｊ）Thr−Trp−Lys、（ｋ）Arg−Trp−Lys、（ｌ）Glu−M
et−Trp−Lys（配列番号１）、（ｍ）Gln−Met−Trp−Lys（配列番号２）及び（
ｎ）Asp−Trp−Lysから成る群から選択される請求項41記載のインスリン前駆体
又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５３】 X₂がAspであり、X₃がLysであり、そしてX₁がその１つがTr
p又はPheである、１〜３個のアミノ酸残基である請求項41記載のインスリン前駆
体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５４】前記インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体が、X₁ に芳香族アミノ酸残基を包含しないインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似
体に比較して、溶液において高められたCmid安定性を示す請求項41記載のインス
リン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５５】 Cmidが約5.5M以上のGuHClである請求項54記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５６】 Cmidが約6.0M以上のGuHClである請求項54記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５７】 Cmidが少なくとも約6.5MのGuHClである請求項54記載のイ
ンスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項５８】下記式： B（1−27）−X₂−X₃−X₁−Y−A（1−21）［式中、X₁は、その１つのアミノ酸残基がYのすぐN−末端側の芳香族アミノ酸
残基である１〜15個のアミノ酸残基のペプチド配列であり； X₂は、前記B鎖の位置28でのPro, Asp, Lys又はIleの１つであり； X₃は、前記B鎖の位置29でのPro, Lys, Ala, Arg又はPro−Thrの１つであり；
そして Yは、Lys又はArgである］により表されるインスリン前駆体又はインスリン前駆体。類似体。
【請求項５９】 X₁が１〜９個、好ましくは１〜５のアミノ酸残基である請
求項58記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６０】 X₁が１〜３個、好ましくは１〜２のアミノ酸残基である請
求項58記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６１】 X₁が、その1つがTrp又はPheである１〜２のアミノ酸残基
である請求項58記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６２】 X₁−Yが、（ａ）Met−Trp−Lys,（ｂ）Ala−Trp−Lys、（
C）Val−Trp−Lys、（ｄ）Ile−Trp−Lys、（ｅ）Leu−Trp−Lys、（ｆ）Glu−G
lu−Phe−Lys（配列番号15）、（ｇ）Glu−Phe−Lys、（ｈ）Glu−Trp−Lys、（
i）Ser−Trp−Lys、（ｊ）Thr−Trp−Lys、（ｋ）Arg−Trp−Lys、（ｌ）Glu−M
et−Trp−Lys（配列番号１）、（ｍ）Gln−Met−Trp−Lys（配列番号２）及び（
ｎ）Asp−Trp−Lysから成る群から選択される請求項58記載のインスリン前駆体
又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６３】 X₂がAspであり、X₃がLysであり、そしてX₁がその１つがTr
p又はPheである、１〜３個のアミノ酸残基である請求項58記載のインスリン前駆
体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６４】前記インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体が、X₁ に芳香族アミノ酸残基を含まないインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体
に比較して、溶液において高められたCmid安定性を示す請求項58記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６５】 Cmidが約5.5M以上のGuHClである請求項64記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６６】 Cmidが約6.0M以上のGuHClである請求項64記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６７】 Cmidが少なくとも約6.5MのGuHClである請求項64記載のイ
ンスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項６８】下記式： B（1−27）−X₂−X₃−X₁−Y−A（1−21）［式中、X₁は、その１つの残基が、前記B鎖における位置B11、 B12又はB26に
おけるアミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満離れて存在する芳香族アミノ
酸残基である、１〜15個のアミノ酸残基のペプチド配列であり； X₂は、前記B鎖の位置28でのPro, Asp, Lys又はIleの１つであり； X₃は、前記B鎖の位置29でのPro, Lys, Ala, Arg又はPro−Thrの１つであり；
そして Yは、Lys又はArgである］により表されるインスリン前駆体又はインスリン前駆体。類似体。
【請求項６９】 X₁が１〜９個、好ましくは１〜５のアミノ酸残基である請
求項68記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７０】 X₁が１〜４個、好ましくは１〜３のアミノ酸残基である請
求項68記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７１】 X₁が１〜２個のアミノ酸残基である請求項68記載のインス
リン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７２】 X₁が５個までの芳香族アミノ酸残基を含んで成る請求項68
記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７３】 X₁が３個までの芳香族アミノ酸残基、好ましくはわずか１
つの芳香族アミノ酸残基を含んで成る請求項68記載のインスリン前駆体又はイン
スリン前駆体類似体。
【請求項７４】前記芳香族アミノ酸残基が、Trp及びTyrからなる群から選
択される請求項68記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７５】１つの芳香族アミノ酸残基が、YのすぐN−末端側に存在す
る請求項75記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７６】 YのすぐN−末端側の芳香族アミノ酸残基が、前記B鎖にお
ける位置B11、 B12又はB26におけるアミノ酸残基の少なくとも１つから５Å未満
離れて存在する請求項68記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７７】 X₁−Yが、（ａ）Met−Trp−Lys,（ｂ）Ala−Trp−Lys、（
C）Val−Trp−Lys、（ｄ）Ile−Trp−Lys、（ｅ）Leu−Trp−Lys、（ｆ）Glu−G
lu−Phe−Lys（配列番号15）、（ｇ）Glu−Phe−Lys、（ｈ）Glu−Trp−Lys、（
i）Ser−Trp−Lys、（ｊ）Thr−Trp−Lys、（ｋ）Arg−Trp−Lys、（ｌ）Glu−M
et−Trp−Lys（配列番号１）、（ｍ）Gln−Met−Trp−Lys（配列番号２）及び（
ｎ）Asp−Trp−Lysから成る群から選択される請求項68記載のインスリン前駆体
又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７８】 X₂がAspであり、X₃がLysであり、そしてX₁がその１つがTr
p又はPheである、１〜３個のアミノ酸残基である請求項68記載のインスリン前駆
体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項７９】前記インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体が、X₁ に芳香族アミノ酸残基を含まないインスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体
に比較して、溶液において高められたCmid安定性を示す請求項68記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項８０】 Cmidが約5.5M以上のGuHClである請求項79記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項８１】 Cmidが約6.0M以上のGuHClである請求項79記載のインスリ
ン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項８２】 Cmidが少なくとも約6.5MのGuHClである請求項79記載のイ
ンスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体。
【請求項８３】請求項１記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類
似体をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項８４】請求項14記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類
似体をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項８５】請求項27記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類
似体をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項８６】請求項41記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類
似体をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項８７】請求項58記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類
似体をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項８８】請求項68記載のインスリン前駆体又はインスリン前駆体類
似体をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項８９】請求項83〜88のいずれか１項記載のポリヌクレオチド配列
を含んで成る発現ベクター。
【請求項９０】請求項89記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項９１】インスリン前駆体又はインスリン前駆体類似体の製造方法
であって、（i）請求項１〜82のいずれか１項記載のインスリン前駆体又はインスリン前
駆体類似体をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る宿主細胞を、前記前
駆体又は前駆体類似体の発現のための適切な条件下で培養し；そして（ii）発現された前駆体又は前駆体類似体を単離する；ことを含んで成る方法。
【請求項９２】前記宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項91記載の方法。
【請求項９３】インスリン又はインスリン類似体の製造方法であって、（i）請求項１〜82のいずれか１項記載のインスリン前駆体又はインスリン前
駆体類似体をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る宿主細胞を、前記前
駆体又は前駆体類似体の発現のための適切な条件下で培養し；（ii）前記培養培地から前記前駆体又は前駆体類似体を単離し；そして（iii）前記前駆体又は前駆体類似体を、インビボでの化学又は酵母転換によ
りインスリン又はインスリン類似体に転換する；ことを含んで成る方法。
【請求項９４】前記宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項93記載の方法。