JP2004157072A

JP2004157072A - 免疫反応測定に用いられる高感度磁性マーカー

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Publication number: JP2004157072A
Application number: JP2002325026A
Authority: JP
Inventors: Koji Yoshinaga; 耕二吉永; Keiji Marufuku; 敬二円福
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-11-08
Filing date: 2002-11-08
Publication date: 2004-06-03
Also published as: US20070037297A1; US20060035388A1; CA2505507A1; WO2004042397A1

Abstract

【課題】ＳＱＵＩＤ磁気センサーによる免疫反応の測定に用いられるのに好適な高感度の磁性マーカーとその作製に関する新しい技術を提供する。
【解決手段】磁性微粒子とその周りを被覆するポリマーとから構成され、ＳＱＵＩＤ磁気センサーにより免疫反応を測定するのに用いられる磁性マーカーにおいて、磁性微粒子（好ましくはフェライトＦｅ_３Ｏ_４）の粒子径が２０〜４０ｎｍであり、磁性マーカーの外径が４０〜１００ｎｍであり、さらに、ポリマーの表面にカルボキシル基を有するようにする。このＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーは、磁性微粒子の表面に、末端に重合性ビニル基を有し親水性で分子量が５００〜１０００のマクロモノマー（好ましくは、ポリビニルピロリドン）を吸着させた後、カルボキシル基を有し親水性のビニル化合物から成るモノマーと架橋剤とを加えて共重合させることによって作製することができる。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫反応を測定するための技術分野に属し、特に、ＳＱＵＩＤ磁気センサーにより免疫反応を測定するのに用いられるきわめて高感度の磁性マーカーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫反応、すなわち、抗原−抗体反応の測定は、病原菌等の検出、疾病の診断、遺伝子解析、環境関連物質の計測など広範な分野で利用されている。この免疫反応の測定は、被測定物質（抗原）とこれに特異的に結合する検査試薬（抗体）との結合を測定し、被測定物質の定性および／または定量を行なうものである。
【０００３】
免疫反応の測定には、これまで主として光学的な手法が用いられている。すなわち、発光酵素などの光学的マーカーを検査試薬（抗体）に付加し、そのマーカーからの光を測定することにより免疫反応（抗原−抗体反応）の検出を行なっている。しかし、近年、微量な反応を高感度で高速に検出する要求が非常に高まっているが、既存のシステムではこの要求を満たせなくなっている場合も多い。このため、高感度の新しいタイプの免疫反応測定システムの開発が望まれている。
【０００４】
最近、超伝導状態で出現する量子効果（磁束の量子化）を利用するＳＱＵＩＤ（ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇｑｕａｎｔｕｍｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｄｅｖｉｃｅ）は、極めて微弱な磁界の計測を可能にするため、高感度の磁気センサーとして注目されている。ＳＱＵＩＤの最も大きな応用分野は、脳から発生する磁界を計測し脳機能の解明や診断を行なう脳磁界計測の分野であるが、その他の医学、材料評価、物質分析、精密計測、資源探査などの種々の分野への応用も始まっており、免疫反応の測定にＳＱＵＩＤを用いることも提示されている（例えば、円福敬二「ＳＱＵＩＤを用いた抗原−抗体反応計測」応用物理、第７０巻、第１号、４８〜４９頁（２００１）参照）（非特許文献１）。
【０００５】
ＳＱＵＩＤを利用する免疫反応測定システムにおいては、磁性微粒子を内包するポリマーの表面に抗体が付加されて構成される磁性マーカーを用いて、その抗体が被測定物質の抗原との間で抗原−抗体結合反応を生じたときの磁界マーカーからの微弱な磁界信号をＳＱＵＩＤにより測定する（図１参照）。実際の測定においては、一般に、ＳＱＵＩＤを固定し、サンプルを移動させて磁気信号を検出する方式が採られる。
【０００６】
ＳＱＵＩＤを用いる免疫反応測定システムは、高感度センサーとして、例えば、蛍光抗体測定法に比べて約１０倍の感度が得られることも確認されている（前記非特許文献１）が、システム性能を改善することにより更に高感度で免疫反応を検出することができるものと期待される。ＳＱＵＩＤによる免疫反応検出システムを改善するためのアプローチは、低雑音化（ノイズ低減）のように測定装置の性能向上を図るとともに、磁性マーカーとして最適なものを開発することである。
【０００７】
しかしながら、ＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーの感度を高めるための条件を体系的に検討された従来技術は見当らない。例えば、特表平１１−５０８０３１号公報（特許文献１）には、磁気センサーとしてＳＱＵＩＤを用いることを含むイムノアッセイのための磁性粒子について言及されているが、ＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーの感度を高める技術に関する具体的な開示はなされていない。例えば、磁性粒子の粒子サイズは１〜１０００ｎｍの広い範囲にあるとしており単に考えられる範囲を思いつきのままに定めたにすぎず、磁性粒子の粒径に関する技術的検討は何ら行なわれていない。また、高感度の磁性マーカーを得るためのポリマーの種類やその合成法に関する具体的開示も全く見出されない。
【０００８】
ポリマー内部に磁気微粒子を内包し、その表面に抗体を結合した、如上の磁気標識抗体は、これまで主として抗体の精製・分離に用いられてきた。このような用途では磁性微粒子にいわゆる超常磁性を持たせるため、磁性微粒子としては粒子径が１０〜１５ｎｍ程度であり、ポリマー粒子径（全体の外径）としては直径が５０〜１０００ｎｍのものが市販されている。しかしながら、従来のこのような磁気標識抗体を抗体抗原反応の検出に応用した場合には、磁気微粒子の特性が不充分であるため、高感度検出が阻害されている。
【特許文献１】特表平１１−５０８０３１号公報
【非特許文献１】円福敬二「ＳＱＵＩＤを用いた抗原−抗体反応計測」応用物理、第７０巻、第１号、４８〜４９頁（２００１）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＳＱＵＩＤ磁気センサーによる免疫反応の測定に用いられるのに好適な高感度の磁性マーカーとその作製に関する新しい技術を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、磁性マーカーの芯（コア）を形成する磁性微粒子の粒子径、およびその周りを被覆するポリマーの粒子径（厳密には磁性マーカー全体の外径）が、ＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーの感度に影響することに着意するとともに、それらの因子の最適な磁性マーカーの作製が確保できるポリマー系を設計、合成することにより本発明を導き出したものである。
【００１１】
かくして、本発明に従えば、磁性微粒子とその周りを被覆するポリマーとから構成され、ＳＱＵＩＤ磁気センサーにより免疫反応を測定するのに用いられる磁性マーカーであって、前記磁性微粒子の粒子径が２０〜４０ｎｍであり、前記磁性マーカーの外径が４０〜１００ｎｍであり、さらに、前記ポリマーの表面にカルボキシル基を有することを特徴とするＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーが提供される。本発明の磁性マーカーの好ましい態様に従えば、磁性微粒子は一般にフェライトＦｅ_３Ｏ_４から成る。
【００１２】
本発明は、さらに、以上のようなＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーを作製する方法であって、（ｉ）磁性微粒子の表面に、末端に重合性ビニル基を有し親水性で分子量が５００〜１０００のマクロモノマーを吸着させる工程、および（ｉｉ）その後、カルボキシル基を有し親水性のビニル化合物から成るモノマーと架橋剤とを加えて共重合させる工程を含むことを特徴とする方法を提供する。本発明に従うＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーの作製方法の好ましい態様においては、ポリマーの合成に用いられるマクロモノマーは、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンまたはポリアクリルアミドである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーの感度を支配する問題点をひとつひとつ検討しながらそれらの技術の総まとめとして目的の超高感度磁性マーカーが得られたことに基づくものである。以下、それらの問題点に沿って本発明の実施の形態を詳述する。
【００１４】
（１）磁性微粒子とその粒子径：
本発明者が見出したところによれば、ＳＱＵＩＤ磁気センサーに用いられる磁性マーカーにおいては、ポリマー粒子に内包された磁性微粒子の粒子径（直径）として既述したような市販の磁気微粒子より大きく、２０〜４０ｎｍのものが必要となる。これは、磁性微粒子からの磁気信号は微粒子の体積に比例するため、大きな微粒子により大きな信号が得られるためである。さらに、磁性微粒子の体積が大きくなると磁気特性は大きく変化し、微粒子はいわゆる超常磁性の特性から残留磁気をもつ特性へと変化する。これによって磁性微粒子からの磁気信号は極めて大きくなる。
なお、このような磁気が発生するための最小粒子径は、次のような理論的計算によっても裏づけられる：磁性微粒子の体積をＶ、その磁気異方性エネルギーをＫとすると、超常磁性から残留磁気特性への変化は、ＫＶ／ｋ_ＢＴ〜２０（ｋ_Ｂはボルツマン定数、Ｔ＝３００Ｋ）で生じることになる。磁気微粒子としてＦｅ_３Ｏ_４を用いた場合にはＫ＝１０〜２０（ｋＪ／ｍ^３）と見積もられるので、このときの微粒子の直径はｄ＝２０〜２５ｎｍとなる。従って微粒子の大きさとしてはｄ＞２０ｎｍが望ましいことが理解される。
一方、本発明が対象とする水溶液中で抗原（被測定物質）と結合するように用いられる磁気標識抗体としては、充分な分散性を持つことが重要である。分散性が悪いと抗原−抗体の結合反応が阻害されてしまう。磁性微粒子の大きさがあまり大きくなりすぎると分散性が悪くなるとともに、沈降が顕著になる。この問題を避けるためには磁性微粒子を内包した高分子全体（厳密に言えば、磁性マーカー全体）の比重を１〜３程度に保つ必要がある。従って、磁性微粒子の大きさとしてはｄ＜４０ｎｍ程度にする必要がある。
用いる磁性微粒子としては、基本的には、鉄鉱、Ｆｅ_２Ｏ_３、Ｆｅ_３Ｏ_４など何れも使用できるが、最大の磁力を示すＦｅ_３Ｏ_４であるフェライトが特に好ましい。
【００１５】
（２）磁性マーカーの外径：
さらに、本発明のＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーにおいては、ポリマー粒子の直径（厳密には、磁性マーカー全体の外径）は４０ｎｍ以上であって１００ｎｍ以下のものが必要となる。これは、免疫反応（抗原−抗体の結合反応）検出においてポリマーの大きさが大きすぎると磁気標識抗体と抗原との結合が効率的に行なわれないためである。さらに、磁性微粒子に関連して上述したように、磁性マーカーの粒子径（外径）が全体として大きすぎると分散性が悪くなり沈殿が生じ易くなることからも好ましくない。
【００１６】
（３）採用するポリマー系：
以上のような特性を有するＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーは、本発明者によって設計されたポリマー系を用いることによって最適に作製することができる。すなわち、本発明に従えば、磁性微粒子の表面に、末端に重合性ビニル基を有し親水性で分子量が５００〜１０００のマイクロモノマーを吸着させた後、カルボキシル基を有し親水性のビニル化合物から成るモノマーと架橋剤とを加えて共重合させることによって、磁性微粒子に対して効果的にポリマーコーティング（被覆）が行なわれ、磁性微粒子の粒子径が２０〜４０ｎｍで磁性マーカーの外径が４０〜１００ｎｍであり、ポリマーの表面にカルボキシル基を有するＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーを得ることができる。
用いるマイクロモノマーとして特に好適な例は、ポリビニルピロリドンであるが、その他に、ポリオキシエチレンまたはポリアクリルアミドなどを用いることもできる。このようなマクロモノマーの磁性微粒子への吸着は、一般に、フェライトＦｅ_３Ｏ_４に代表される磁性微粒子をメタノール中に分散させ、その分散溶液にマクロモノマーを添加し、室温下に数時間攪拌することによって行われる。
【００１７】
次に、マクロモノマーが吸着された磁性微粒子を、低極性溶媒（例えばテトラヒドロフラン）中に分散させて、架橋剤とモノマーの共重合（ラジカル重合）によって磁性微粒子の表面にポリマーコーティングを行なう。架橋剤としては、一般に、トリビニル化合物を用いる。また、モノマーとしては、カルボキシル基を有するとともに、分子全体として親水性のビニル化合物が好ましい。カルボキシル基の他には親水性基を有さず長いアルキル鎖を含むなどの構造から成る疎水性のモノマーを用いると、得られる磁性マーカーの分散安定性が悪くなる。
【００１８】
このように、本発明で採用するポリマー系は、磁性微粒子のポリマーコーティングとして従来存しない新しい技術思想に基づくものである。ポリビニルピロリドンを用いる磁性体としては、ビニルピロリドン−酢酸ビニルの共重合樹脂に磁性体粉末を練り込む方法は報告されている（特開２０００−２８６１６）が、本発明の方法は、如上の説明から明らかなように、これとは全く異なるものである。
【００１９】
本発明に従えば、フェライトＦｅ_３Ｏ_４のような磁性微粒子を均一に一定厚みの合成ポリマーで抱合し、しかもこの磁性微粒子−合成ポリマー複合体表面に所定量のカルボキシル基を付けることができる。すなわち、磁性マーカー粒子１個あたりポリマー表面にカルボキシル基を５００〜５０００残基、望ましくは、２０００〜３０００残基を有するようにすることができる。
【００２０】
また、本発明の方法に従えば、先ずフェライト超微粒子の表面にマクロモノマーを吸着させ、その後、カルボキシル基をもつモノマーを加え、架橋剤によってラジカル共重合させるという各工程の条件を適宜変えることにより、磁性マーカーの粒子サイズを４０〜１００ｎｍの範囲で自由にコントロールすることができる。さらに、本発明の方法は粒子間凝集を誘起することなく、個々の磁性微粒子表面にカルボキシル基をもつポリマーで被覆させることができる。
【００２１】
（４）磁性マーカーの特性
以上のようにして得られる本発明のＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁気マーカーは、分散安定性に優れ、一般に、水溶液中において１ヶ月以上安定に分散させることができる。
本発明のＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁気マーカーは、その表面に多数のカルボキシル基を有しているので、そのカルボキシル基を介して抗体を結合させることができる。そして、本発明の磁性マーカーは、抗体を高効率で結合させることができ、１例として、ウサギの抗体であるＩｇＧを８０％以上の収率で結合させることができた。
抗体が結合された本発明の磁性マーカーは、既述したように免疫反応（抗原−抗体反応）の測定に供されるが、その感度はきわめて高く、１例として、１ｐｇ（ピコグラム）以下の抗原（タンパク質）の測定もできる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明の特徴をさらに具体的に示すため実施例を記すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１：ポリマーコーティングフェライト微粒子の調製
図２に概示する反応スキームに従って、表面にカルボキシル基を有するポリマーコーティングフェライト微粒子（ＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカー）を調製した。
＜フェライト微粒子へのポリビニルピロリドンの吸着＞
メタノール１０ｍｌにマクロモノマーとしてポリビニルピロリドン（分子量５２０）の０．００４〜０．０４ｇ範囲内の一定量を溶解させた後、フェライトＦｅ_３Ｏ_４（戸田工業製、粒子径２５ｎｍ）微粒子０．０５ｇを加えて、超音波を照射した。静かに４時間かきまぜたのち、ポリピロリドンを吸着した粒子を遠心分離器を用いて分離し、減圧乾燥させた。吸着量は、１００〜８００℃までの昇温時における重量減少から算出した。図３に吸着等温線を示す。ポリビニルピロリドンがフェライト微粒子１ｇあたり１．０×１０⁻ ^３ｍｏｌに達して、一定になるとことがわかった。
【００２３】
＜ラジカル共重合によるフェライト微粒子のポリマーコーティング＞
親水性マクロモノマーが吸着されたフェライト微粒子を以下に詳述するようにテトラヒドロフランに分散させてＡＩＢＮ（重合開始剤）の存在下、架橋剤（トリビニル化合物）とモノマーの共重合によって微粒子表面のポリマーコーティングを行なった。
【００２４】
＜コーティング１：トリ（（アクロイルオキシ）エチレン）アミン塩酸塩（ａ）とＮ−アクロイルアミノペンタン酸（ｂ）の共重合によるフェライト微粒子のポリマーコーティング＞
テトラヒドロフラン５ｍｌにＮ−アクロイルペンタン酸０．１２ｇ（フェライト微粒子に吸着したポリビニルピロリドンのビニル基量の１００倍量）および０〜１００倍量の架橋剤トリ（アクロイルオキシ）アミン塩酸塩を溶解させた。この溶液にフェライト微粒子１ｇあたり０．２ｇのポリビニルピロリドンを吸着した粒子０．０１８ｇ、さらに２，２’−アゾビス（イソブチルニトリル）０．０１ｇを加えた後、６５℃に１０時間かきまぜた。複合粒子は遠心分離によって溶液から分離した。この操作を５回繰り返して、未反応モノマーおよび架橋剤を分離した。表１に、この方法で得られたフェライト微粒子表面のポリマー量を示した。この表１から、架橋剤の増加とともにポリマー結合量が増大するが、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定した粒子径は２９〜３０ｎｍ程度であり、粒子間凝集は起こっていないことがわかる。（なお、ＤＬＳ法による粒子径は、一般に、後述するような顕微鏡観察による実際の値よりは低くなる。）しかしながら、この方法で調製した複合粒子は、水中での分散継続時間が比較的短く、最大２日間であった。これは、モノマー（ｂ）のメチレン鎖が長いため疎水性が高くなり水溶液中で低極性相互作用により粒子間凝集が起こり易くなるためと考えられる。
【００２５】
【表１】

【００２６】
＜コーティング２：トリ（（アクロイルオキシ）エチレン）アミン塩酸塩（ａ）とＮ−アクロイルグリシン（ｃ）の共重合によるフェライト微粒子のポリマーコーティング＞
このコーティングは、上記コーティング１と同様の操作で行なった。その結果を表２に示す。このコーティングにおいても、架橋剤の増大とともに結合ポリマー量が増大し、最大８７０ｍｇ／ｇに達した。得られた複合粒子のうち、特に、６５０〜７００ｍｇ／ｇの結合ポリマー量をもつ粒子が４週間以上水溶液中で安定に分散し続けた。また、表面カルボキシル基量も架橋剤とともに増大し、最大６０μｍｏｌ／ｇとなった。なお、粒子径はＤＬＳ法によるものである。
【００２７】
【表２】

【００２８】
＜コーティング３：トリ（（アクロイルオキシ）エチレン）アミン塩酸塩（ａ）とＮ−アクロイルグルタミン酸（ｄ）の共重合によるフェライト微粒子のポリマーコーティング＞
このコーティングは、コーティング１と同様の操作で行なった。その結果を表３に示す。表中の粒子径はＤＬＳ法によるものである。このコーティングにおいても粒子間凝集は生じず、また架橋剤とともに結合ポリマー量は増大し、最大９４７ｍｇ／ｇとなった。図４に表３中エントリー４で得られた複合粒子の粒子径分布（ＤＬＳ法）を示した。凝集による大径の粒子は存在しないことが理解される。また、表面カルボキシル基量も架橋剤濃度とともに増大し、最大９７ｍｍｏｌ／ｇに達した。この量は、粒子表面にカルボキシル基が単位平方ナノメーターあたり０．７個存在することに相当する。さらに、このコーティングで得られた複合粒子はすべて水溶液中で４週間以上も安定に分散し続けた。
【００２９】
【表３】

【００３０】
図５および図６に、未修飾フェライト微粒子とコーティング３で得られたポリマーコーティングフェライト微粒子の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。未修飾粒子のＳＥＭ写真では、試料作成時の乾燥操作中に粒子間の凝集が観測されたが、ポリマーコーティングフェライト微粒子は良好に分散しており、その外径（直径）は約８０ｎｍであることが確認された。
【００３１】
なお、表２および表３に示すポリマー表面のカルボキシル基の定量は次のように実施した：脱水、蒸留したクロロホルム５ｍｌに複合粒子（ポリマーコーティングフェライト微粒子）１０ｍｇおよびＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド１５ｍｇを加えた後、氷冷下で２時間かき混ぜた。その分散溶液へｐ−ニトロフェノールイミド１５ｍｇを加えて、室温で１２時間かき混ぜた。未反応ｐ−ニトロフェノールを遠心分離による洗浄によって複合粒子から分離した後、その粒子を減圧下に乾燥した。次に、そのｐ−ニトロフェノレート基を結合した粒子を精秤した後、４％アンモニア水４ｍｌ中に分散させて、１２時間静かにかき混ぜた。ｐ−ニトロフェノールを遊離した溶液を複合粒子から遠心分離操作によって分離したのち、洗浄液とあわせて溶液の全容量を１０．０ｍｌに調整した。この水溶液中に含まれるｐ−ニトロフェノール量は波長４００ｎｍ（モル吸光係数ε＝１８０００）の吸光度から決定した。
【００３２】
実施例２：抗体の結合
実施例１のコーティング３の方法で調製したポリマーコーティングフェライト微粒子（磁性マーカー）０．０１７ｇをｐＨ７．０リン酸緩衝溶液５ｍｌ中へ分散させて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．０１ｇを加えた。この溶液を４℃で１時間かき混ぜたあと、ウサギ抗体ＩｇＧ０．１６ｍｇ（微粒子１ｇあたり９．３ｍｇ／ｇ）を加え、続いて室温で６時間かき混ぜた。抗体を結合した粒子は、リン酸緩衝溶液から遠心分離によって分離した。結合した抗体量は、７．０ｍ／ｇであった。抗体の結合量は、この反応において仕込んだ抗体量から非結合抗体量を差し引いた量とした。これらの量は、波長２８０ｎｍにおける吸光度から決定した。
図７にウサギＩｇＧのポリマー被覆フェライト微粒子への結合結果を示す。粒子１グラムあたり１０ｍｇ程度の添加では、添加量の８０％程度が結合し、本発明の方法で得られる複合粒子（磁性マーカー）が抗体に対して高い固定化効率を示すことが明らかとなった。
【００３３】
実施例３：磁性体重量とＳＱＵＩＤ出力関係
実施例１のコーティング３の方法で調製され、直径が２５ｎｍのＦｅ_３Ｏ_４微粒子をポリマーコーティングしその表面にカルボキシル基を結合させた外径８０ｎｍの磁性マーカーからの磁気信号をＳＱＵＩＤ磁気センサーで計測した。磁気マーカーの重さを変化させた時のＳＱＵＩＤ出力の測定結果を図８に示す。図の横軸は磁性マーカー中のフェライト微粒子の重さ（ｐｇ）であり、縦軸はＳＱＵＩＤ出力（ｍΦ_０）を示す。同図に示すようにマーカーの重さとＳＱＵＩＤ出力の間には非常によい相関が得られた。ＳＱＵＩＤセンサーは０．１ｍΦ_０以下のレベルまで測定できるので、図から本磁性マーカーでは１ｐｇ以下のフェライト微粒子が測定できることがわかる。
【００３４】
実施例４：抗体を結合した磁性マーカーとＳＱＵＩＤ出力関係
実施例２のように抗体を結合させた磁性マーカーとＳＱＵＩＤ磁気センサーを用いて抗原（タンパク質）の検出を行なった。前記ウサギＩｇＧに特異的なタンパク質と該抗体の結合量を磁性マーカーからの磁気信号を用いて測定した。図９にタンパク質の量とＳＱＵＩＤ出力の測定結果を示す。図の横軸はタンパク質の重さ（ｐｇ）であり、縦軸はＳＱＵＩＤ出力（ｍΦ_０）を示す。同図に示すようにタンパク質の重さとＳＱＵＩＤ出力の間には非常によい相関が得られた。ＳＱＵＩＤセンサーは０．１ｍΦ_０以下のレベルまで測定できるので、図から本磁性マーカーでは０．２ｐｇ程度のタンパク質が測定できることがわかる。
【００３５】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明の磁性マーカーは、高温超伝導ＳＱＵＩＤとの組み合わせにより、超高感度に免疫反応（抗原抗体反応）を測定できるために、長足に進歩している最近の医療関連でも有用であり、従来は不可能であった生体内物質の測定も可能とすることによって新事実の発見に繋がる等、多くの分野で寄与するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の磁性マーカーを用いてＳＱＵＩＤ磁気センサーにより免疫反応を測定する原理を模式的に示す。
【図２】本発明に従い磁性微粒子をポリマーコーティングする反応スキームと用いる反応物の構造式を例示する。
【図３】本発明に従い磁性微粒子にマクロモノマーを吸着させる場合の吸着等温線（２５℃）を例示する。
【図４】本発明に従い磁性微粒子をポリマーコーティングして得られる複合粒子（磁性マーカー）の粒子径分布を例示する。
【図５】本発明に従いポリマーコーティングする前の未修飾フェライト微粒子を示す電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図６】本発明に従いポリマーコーティングによって得られた複合粒子（磁性マーカー）の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真の１例である。
【図７】本発明の磁性粒子に抗体を結合させた場合の結果の１例を示すグラフである。
【図８】本発明に従う磁性マーカー中の磁性微粒子の重量とＳＱＵＩＤ出力の関係を示す１例である。
【図９】本発明に従う抗体結合磁性マーカーを用いてタンパク質の検出を行なった場合のタンパク質の量とＳＱＵＩＤ出力の関係を示す１例である。

Claims

磁性微粒子とその周りを被覆するポリマーとから構成され、ＳＱＵＩＤ磁気センサーにより免疫反応を測定するのに用いられる磁性マーカーであって、前記磁性微粒子の粒子径が２０〜４０ｎｍであり、前記磁性マーカーの外径が４０〜１００ｎｍであり、さらに、前記ポリマーの表面にカルボキシル基を有することを特徴とするＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカー。
前記磁性微粒子がフェライトＦｅ_３Ｏ_４から成ることを特徴とする請求項１に記載の磁性マーカー。
前記磁性マーカーの粒子１個あたりポリマー表面に５００〜５，０００残基のカルボキシル基を有することを特徴とする請求項１または２に記載の磁性マーカー。
前記磁性マーカーの粒子１個あたりポリマー表面に２０００〜３０００残基のカルボキシル基を有することを特徴とする請求項３に記載の磁性マーカー。
請求項１〜４のいずれかのＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーを作製する方法であって、（ｉ）磁性微粒子の表面に、末端に重合性ビニル基を有し親水性で分子量が５００〜１０００のマクロモノマーを吸着させる工程、および（ｉｉ）その後、カルボキシル基を有し親水性のビニル化合物から成るモノマーと架橋剤とを加えて共重合させる工程を含むことを特徴とする方法。
前記マクロモノマーが、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンまたはポリアクリルアミドであることを特徴とする請求項５に記載の磁性マーカー作製方法。