JP2004180638A - ゲンタマイシン生合成遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】ゲンタミシンの生合成遺伝子を含むDNA断片を単離すること、さらにその塩基配列を解析し、各生合成遺伝子を特定することである。
【解決手段】ミクロモノスポラ・エキノスポラ(Micromonospora echinospora)またはミクロモノスポラ・パープレア(Micromonospora purpurea)のゲノムDNAからゲノムDNAライブラリーを作製し、その中からゲンタミシンの生合成に関与する遺伝子を含むDNA断片を見いだした。これらの遺伝子の解読を行い、ゲンタミシンの生合成経路に関する機能の解析を行った。
【選択図】なし。
【解決手段】ミクロモノスポラ・エキノスポラ(Micromonospora echinospora)またはミクロモノスポラ・パープレア(Micromonospora purpurea)のゲノムDNAからゲノムDNAライブラリーを作製し、その中からゲンタミシンの生合成に関与する遺伝子を含むDNA断片を見いだした。これらの遺伝子の解読を行い、ゲンタミシンの生合成経路に関する機能の解析を行った。
【選択図】なし。
Description
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、ゲンタマイシン生合成遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲンタマイシンは、ミクロモノスポラ・エキノスポラ(Micromonospora echinospora)またはミクロモノスポラ・パープレア(Micromonospora purpurea)が生産する20種以上のアミノグリコシド系抗生物質の総称である。一般には、化学療法剤として用いられているゲンタマイシンC1(C21H43N5O7、分子量477.60)、C2(C20H41N5O7、分子量463.58)およびC1a(C19H39N5O7、分子量449.55)の混合物の名称として使用されている。抗菌活性はアミノグリコシド系抗生物質の中で最も優れているものの1つで、抗菌スペクトルはグラム陽性・陰性菌にわたる広域に及び、その作用は殺菌的である。
【０００３】
近年、二次代謝産物の生産生向上や新規活性物質の創出を目的として遺伝子組換えの手法が取り入れられてきており、ポリケチド生合成遺伝子を中心に多くの二次代謝産物生合成に関わる遺伝子が単離されている。アミノグリコシド系抗生物質生合成に関わる遺伝子としては、ストレプトマイシン生合成遺伝子［オオヌキ(Ohnuki, T.)著,「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)」,(米国),1985年,第164巻,p.85-94（非特許文献1）］、アストロマイシン生合成遺伝子［ダイリ(Dairi, T.)ら著,「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Molecular and General Genetics)」,(独国),1992年,第232巻,p.262-270（非特許文献2）］、ブチロシン生合成遺伝子［オオタ(Ota, Y.)ら著,「ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス(Journal of Antibiotics)」,2000年,第53巻,p.1158-1167(非特許文献3)］などが挙げられる。
【０００４】
一方、ゲンタマイシン生合成に関わる遺伝子については、ゲンタマイシン耐性に関わる16S rRNAメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(grm)が単離・解析されている［ケレメン(Kelemen, G. H.)ら著,「ジーン(Gene)」,(和蘭),1991年,第98巻,p.53-60(非特許文献4)］のみであり、その他の生合成遺伝子に関しては全く不明である。生合成遺伝子を単離できれば、組換えDNA技術を利用することによって効率的なゲンタマイシン生産菌の育種が可能となるだけでなく、コンビナトリアルバイオシンセシス技術により有機化学合成では困難であった新規なゲンタマイシン誘導体を生合成させることができる可能性がある。
【０００５】
【非特許文献1】
オオヌキ(Ohnuki, T.)著,「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)」,(米国),1985年,第164巻,p.85-94
【非特許文献2】
ダイリ(Dairi, T.)ら著,「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Molecular and General Genetics),(独国),1992年,第23 2巻,p.262-270
【非特許文献3】
オオタ(Ota, Y.)ら著,「ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス(Journal of Antibiotics)」,2000年,第53巻,p.1158-1167
【非特許文献4】
ケレメン(Kelemen, G. H.)ら著,「ジーン(Gene)」,(和蘭),1991年,第98巻,p.53-60
【非特許文献5】
カイザー(Kieser, T.)ら著,「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス(Practical Streptomyces Genetics)」,「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション(The John Innes Foundation)」,(英国),ノルウィック(Norwick),2000年,p.161-171
【非特許文献6】
池田と大村著,蛋白質核酸酵素,第43巻,p.1265-1277,1998年
【非特許文献7】
カレラス アンド サンティ(Carreras, C. W.and Santi, D. V.) 著,「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Current Opinion in Biotechnology)」,(英国),1998年,第9巻,p.403-411
【非特許文献8】
ハッチンソン(Hutchinson, C. R.)著,「カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー(Current Opinion in Microbiology)」,(英国),1998年,第1巻,p.319-329
【非特許文献9】
カッツ アンド マクダニエル(Katz, L. and McDaniel, R.)著,「メディシナル・リサーチ・レビューズ(Medicinal Research Reviews)」,(米国),1 999年,第19巻,p.543-558
【非特許文献10】
ハッチンソン(Hutchinson, C. R.)著,「バイオ／テクノロジー(Bio／Technology)」,(米国),1994年,第12巻,p.375-380
【非特許文献11】
サンブルーク(Sambrook, J.)ら著,「モレキュラー・クローニング(Molecular cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(a laboratory manual)」,(米国),第2版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),1989年
【非特許文献12】
カイザー(Kieser, T.)ら著,「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス(Practical Streptomyces Genetics)」,ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション(The John Innes Foundation),(英国),ノルウィック(Norwick),2000年,p.169-170
【非特許文献13】
ビッブ(Bibb, M. J.)ら著,「ジーン(Gene)」,(和蘭),1984年,第30巻,p.157-166
【非特許文献14】
アルシュル(Altschul, S. F.)ら著,「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)」,(英国),1990年,第215巻,p.403-410)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ゲンタマイシン生合成遺伝子を含むDNAを単離し、その塩基配列を解析することによって生合成遺伝子を特定することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ゲンタマイシン生合成遺伝子を含むDNA断片を単離することに成功するとともに、その塩基配列を解析することによって各生合成遺伝子を特定することに成功した。すなわち本発明は、以下の通りである。
【０００８】
(1) ゲンタマイシンの生合成に関与するポリペプチド少なくとも1種をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
(2) ポリペプチドが、配列番号2〜21、および23〜29から選択されるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含む上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(3) ポリペプチドが、配列番号2〜21、および23〜29から選択されるアミノ酸配列を含む上記(2)に記載のポリヌクレオチド。
(4) 配列番号1の塩基1-598、671-1024、1024-1671、1668-2369、2526-3959、4499-5521、5813-7219、7227-8351、8405-8917、9016-10260、10508-12424、13062-14414、14452-15258、15326-16663、16757-17128、17136-18392、1 8392-20296、20373-21641、21634-22659、22652-23845、23981-25243、25537-26361、26398-27645、27642-28646、28643-30157、30154-31443、31456-32352、32360-33517、および33584-34663から選択されるヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる上記(1)に記載のポリヌクレオチド。(5) 配列番号1の塩基1-598、671-1024、1024-1671、1668-2369、2526-3959、4499-5521、5813-7219、7227-8351、8405-8917、9016-10260、10508-12424、13062-14414、14452-15258、15326-16663、16757-17128、17136-18392、18392-20296、20373-21641、21634-22659、22652-23845、23981-25243、25537-26361、26398-27645、27642-28646、28643-30157、301 54-31443、31456-32352、32360-33517、および33584-34663から選択されるヌクレオチド配列からなる上記(4)に記載のポリヌクレオチド。
(6) 上記(1)〜(5)の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
(7) 上記(6)に記載の組換えベクターを含んでなる宿主。
【０００９】
【発明の実施の形態】
ゲンタマイシン生合成遺伝子
本発明のゲンタマイシン生合成遺伝子がコードするポリペプチドは、配列番号2〜21、および23〜29から選択されるアミノ酸配列及び該アミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列からなる。これらのポリペプチドの機能は後述する表2に記載される通りである。
【００１０】
本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、1つ若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を受けないアミノ酸配列を意味する。改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜数個、更に好ましくは1〜8個、最も好ましくは1〜4個である。
【００１１】
本発明でいう「活性に影響を与えない改変」の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように1若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００１２】
本発明のゲンタマイシン生合成遺伝子は、配列番号1の塩基1-598、671-1024、1024-1671、1668-2369、2526-3959、4499-5521、5813-7219、7227-8351、8405-8917、9016-10260、10508-12424、13062-14414、14452-15258、15326-16663、16757-17128、17136-18392、18392-20296、20373-21641、21634-22659、22652-23845、23981-25243、25537-26361、26398-27645、27642-28646、28643-30157、30154-31443、31456-32352、32360-33517、および33584-34663から選択されるヌクレオチド配列及び該ヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであることができる。本発明において「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、2ラSSC濃度(1ラSSC:15 mMクエン酸3ナトリウム、150 ｍM塩化ナトリウム)、0.5 ％SDS溶液中で、60℃、20分間の洗浄条件を意味する。
【００１３】
ゲンタマイシン生合成遺伝子の取得
本発明のゲンタマイシン生合成遺伝子は、例えば、以下の方法によりミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレアから単離することができる。また、本発明に開示するようにヌクレオチド配列が明らかとなっているため、人工的に化学合成することも可能である。
【００１４】
ミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレアの菌体から、［カイザー(Kieser, T.)ら著,「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス(Practical Streptomyces Genetics)」,「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション(The John Innes Foundation)」,(英国),ノルウィック(Norwick),2000年,p.161-171（非特許文献5）］に記載の慣行法によりゲノムDNAを抽出する。このゲノムDNAを適当な制限酵素にて消化後、適当なベクターと連結することにより、ミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレアのゲノムDNAライブラリーを作製する。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、BACベクター等、多様なものが使用できる。
【００１５】
次に、本明細書において開示したゲンタマイシン生合成遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて適当なプローブを作成し、ゲノムDNAライブラリーからハイブリダイゼーションによって所望のゲンタマイシン生合成遺伝子を含むDNA断片を単離することができる。また、本明細書において開示したゲンタマイシン生合成遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて所望の遺伝子を増幅させるためのプライマーを作成し、ミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレアのゲノムDNAを鋳型としてPCRを実施し、増幅したDNA断片を適当なベクターと連結することにより所望の遺伝子を単離することができる。更に、本発明によるゲンタマイシン生合成遺伝子は、FERM P-19119として寄託されている大腸菌が保持するプラスミドpGM6に含まれていることから、これらをPCRの鋳型DNAとして利用することが可能であるとともに、これらプラスミドから適当な制限酵素にて所望のDNA断片を調製することができる。
【００１６】
微生物の寄託
p GM6で形質転換された大腸菌(Escherichia coli)は、平成14年11月22日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託された。受託番号は、FERM P-19119である。
【００１７】
形質転換体
遺伝子組換えにより二次代謝産物の生産性を向上させる方法として、律速反応となっている生合成反応を触媒するポリペプチドをコードする遺伝子の発現増強、生合成遺伝子の発現を制御する遺伝子の発現増強や遺伝子破壊、不必要な二次代謝系の遮断等が挙げられる。よって、生合成遺伝子が特定されれば、適当なベクターに連結し、生産菌に導入することにより、二次代謝産物の生産性を向上させることができる。
【００１８】
一方、遺伝子組換えにより新規活性物質を創出するには、ポリケチド合成酵素のドメイン改変［池田と大村著,蛋白質核酸酵素,第43巻,p.1265-1277,1998年(非特許文献6)］、［カレラス アンド サンティ(Carreras, C. W.and Santi,D.V.)著,「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Cu rrent Opinion in Biotechnology)」,(英国),1998年,第9巻,p.403-411(非特許文献7)］、［ハッチンソン(Hutchinson, C. R.)著,「カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー(Current Opinion in Microbiology)」,(英国),1998年,第1巻,p.319-329(非特許文献8)］、［カッツ アンド マクダニエル(Katz, L. and McDaniel, R.)著,「メディシナル・リサーチ・レビューズ(Medicinal Research Reviews)」,(米国),1999年,第19巻,p.543-558(非特許文献9)］、生合成遺伝子の破壊、他の生物からの修飾酵素遺伝子の導入［ハッチンソン(Hutchinson, C. R.)著,「バイオ／テクノロジー(Bio／Technology)」,(米国),1994年,第12巻,p.375-380(非特許文献10)］等が行われている。よって、生合成遺伝子が特定されれば、適当なベクターに連結し、二次代謝産物の生産菌に導入することにより新規活性物質を創出することが可能となる。
【００１９】
従って、本発明によるゲンタマイシン生合成遺伝子を適当なベクターに連結してミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレア等の宿主に導入し、その発現を増強または抑制すること、または一部の生合成遺伝子を相同組換えを利用して遺伝子破壊を行いその機能を欠損させることにより、ゲンタマイシンの生産性を向上させることができる。また、本発明によるゲンタマイシン生合成遺伝子を適当なベクターに連結し、ゲンタマイシン以外の二次代謝産物を生産する宿主に導入して発現させること、あるいは生合成遺伝子の一部を遺伝子破壊してゲンタマイシン非生産株となった菌株を適当な物質を添加した培地で培養することによって新規活性物質を生産させることができる。
【００２０】
相同組換えを利用した遺伝子破壊は慣用の方法に従って実施することができ、遺伝子破壊に用いられるベクターの作成やベクターの宿主への導入は当業者に自明であろう。
【００２１】
遺伝子導入用の組換えベクターは、本発明により提供されるポリヌクレオチドを、例えば、［サンブルーク(Sambrook, J.)ら著,「モレキュラー・クローニング(Molecular cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(a laboratory manual)」,(米国),第2版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),1989年(非特許文献11)］に記載の遺伝子組換え技術の慣行法に従って目的に応じて適当な形態に修飾し、ベクターに連結することによって作製することができる。本発明において使用されるベクターは、使用する宿主細胞を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクター等から適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、pBR、pUC系のプラスミド、枯草菌の場合はpUB系のプラスミド、酵母の場合はYEp、YRp、YCp、YIp系のプラスミドベクターが挙げられる。
【００２２】
また、使用されるプラスミドの内少なくとも1つは、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。その好ましい具体例としては、使用する宿主が細菌の場合は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などであり、酵母の場合はトリプトファン生合成遺伝子(TRP1)、ウラシル生合成遺伝子(URA3)、ロイシン生合成遺伝子(LEU2)などであり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子などであり、植物の場合にはカナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
更に、本発明において利用される発現ベクターとしてのDNA分子は、各遺伝子の発現に必要なDNA配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号を有しているのが好ましい。プロモーターとしては、大腸菌においてはラクトースオペロン、トリプトファンオペロンなどのプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、ガラクトース資化性遺伝子、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などのプロモーター、カビではα−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、abp1遺伝子などのプロモーター、植物ではCaMV 35S RNAプロモーター、 CaMV 19S RNAプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーターが好ましく用いることができるものとして挙げられる。
【００２４】
生合成遺伝子を導入する宿主は、用いるベクターの種類に応じて、放線菌、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞等の中から適宜選択されて良い。
【００２５】
組換えベクターの宿主への導入方法としては、接合伝達、ファージによる形質導入、更にカルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、PEG法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法といった形質転換の方法の中から、供試する宿主細胞に応じて用いれば良い。
【００２６】
本発明において複数の遺伝子を宿主細胞に導入する場合には、各遺伝子は同一または別々のDNA分子に含まれていても良い。更に、宿主細胞が細菌である場合には、各遺伝子をポリシストロン性mRNAとして発現させるように設計し、1つのDNA分子とすることも可能である。
【００２７】
得られた組換え体を慣行の方法により、培養し、新たに獲得した性質を調べることができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸(リン酸水素2カリウム等)、硫酸(硫酸マグネシウム等)及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン(チアミン塩酸塩等)等の各種ビタミン、グルタミン酸(グルタミン酸ナトリウム等)、アスパラギン(DL-アスパラギン等)等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。更に、菌の発育を助け、ゲンタマイシン又ゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の生産を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。
【００２８】
培地のpHは、例えばpH 5.5〜pH 8程度である。培養法としては、好気的条件での固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法又は深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。培養に適当な温度は、15℃〜40℃であるが、多くの場合22℃〜30℃付近で生育する。ゲンタマイシン又はゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の生産は、培地及び培養条件、又は使用した宿主により異なるが、何れの培養法においても通常2日〜10日間でその蓄積が最高に達する。培養中のゲンタマイシン又はゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の量が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
【００２９】
培養物からゲンタマイシン又はゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物を採取するためには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、又は適宜組み合わせて抽出精製することができる。
【００３０】
ゲンタマイシン又はゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物を更に精製するには、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤、セファデックスLH-20(ファルマシア社製)、又はトヨパールHW-40(東ソー社製)等を用いるクロマトグラフィーを行うと良い。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。
【００３２】
実施例 1: ゲノム DNA ライブラリーの作成
50 ml分の液体培地(2％可溶性デンプン、1 ％ポリペプトン、0.3 ％肉エキス、0.05 ％KH2PO4、pH 7.0)を250 ml容の三角フラスコに作製した。この培地に、ミクロモノスポラ・エキノスポラを植菌し、28℃、24時間培養した。培養終了後、遠心により菌体を集め、これらの菌体より［カイザー(Kieser, T.)ら著,「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス(Practical Streptomyces Genetics)」,ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション(The John Innes Foundation),(英国),ノルウィック(Norwick),2000年,p.169-170(非特許文献12)］に記載の方法で染色体DNAを調製した。
【００３３】
単離したゲノムDNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行いDNA末端を脱リン酸化した。このDNA断片を、予め制限酵素XbaIで消化しアルカリフォスファターゼ処理によって脱リン酸化した後、更に制限酵素BamHIで消化したコスミドベクター SuperCosI(ストラタジーン社製)に連結し、組換えコスミドベクターを作製した。この組換えコスミドベクターについて、ストラタジーン社製のGigapack IIIパッケージングエキストラクトを用いてインビトロパッケージし、大腸菌XLI-Blue MRAに感染させることによりゲノムDNAライブラリーを作製した。
【００３４】
実施例 2: ゲノム DNA ライブラリーのスクリーニング
実施例1で作製したゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、ゲンタマイシン耐性遺伝子(grm)を使用することとし、以下に示すようにPCRによって調製した。
【００３５】
実施例1に示したゲノムDNAを鋳型とし、配列表の配列番号31及び32に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。PCRは、DNAポリメラーゼとしてKOD Dash(東洋紡績製)を使用し、PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700を用いて行った。反応液は、ゲノムDNAを1μl(1μg相当量)、酵素に添付の10倍濃度反応用緩衝液を5μl、2 mM dNTP溶液を5μl、100 pmol／μlの濃度に調整した上記プライマーを各1μlずつ、ジメチルスルホキシド(特級、和光純薬製)を5μl、KOD Dashを1μl、滅菌水を31μl加えて50μlとした。反応は、94℃、5分間の前処理後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間のインキュベーションを25サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約0.8 kbpのDNA断片が特異的に増幅されている事が確認された。そこで、残りの反応液をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿を滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約0.8 kbpのバンドを定法に従って切り出してDNA断片を回収した。
【００３６】
上記DNA断片をプローブにし、ECLダイレクトDNA／RNAラベリング・検出システム(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、取得された陽性クローンよりプラスミドを調製しpGM6と命名した。
【００３７】
実施例 3: プラスミド pGM6 の塩基配列の解析
プラスミドpGM6についてはショットガン法を用い、マルチキャピラリーDNAシーケンサRISA384(島津製作所製)を使用してシーケンシングを実施した。得られた結果から、解析が不充分な領域については、解析済みの塩基配列を元に新たなプライマーを設計してシーケンシングを行った。その結果、プラスミドpGM6の挿入断片の部分塩基配列として、配列番号1に示す塩基配列が得られた。
【００３８】
塩基配列中のオープンリーディングフレーム(ORF)の予測はFramePlot-2.3［ビッブ(Bibb, M. J.)ら著,「ジーン(Gene)」,(和蘭),1984年,第30巻,p.157-166 (非特許文献13)］により行い、各ORFの機能はBLAST［アルシュル(Altschul, S. F.)ら著,「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)」,(英国),1990年,第215巻,p.403-410 (非特許文献14)］により公共のデータベースを検索し推定した。各O RFに位置を図1及び表1に示した。
【００３９】
【表１】
【００４０】
また、各ORFの推定される機能を表2に示した。
【００４１】
【表2】
【００４２】
【００４３】
機能から特定されたゲンタマイシンの生合成に関わるORFの有する機能について以下に説明する。ORF6、ORF10、ORF12、ORF14、ORF16、ORF19、ORF21、ORF24、ORF25及びORF26は、1位、3位、2’位、6’位及び3”位(第1図)の5ヶ所のアミノ基形成に関わる遺伝子である。このうちORF6、ORF19、ORF24及びORF25は、各糖の水酸基(−OH)をケト基(＝O)に変換する酸化還元酵素をコードする遺伝子であり、またORF10、ORF12、ORF14、ORF16、ORF21及びORF26はケト基にアミノ基を転移するアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ORF20はグルコース6リン酸から2−デオキシ−シロ−イノソースの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であり、2−デオキシストレプタミン生合成に関わる遺伝子である。ORF18及び23は2ヵ所のグリコシド結合形成に関わるグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ORF11は、6’位のメチル化に関わるメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ORF13は、3’及び4’位のジデオキシ化に関わる酵素をコードする遺伝子である。ORF7、ORF22及びORF27は、ゲンタマイシンに対する自己耐性に関わる遺伝子であり、ORF7はゲンタマイシンを菌体外に排出するトランスポーターをコードし、更にORF22及びORF27はゲンタマイシンの標的部位であるrRNAを修飾するメチルトランスフェラーゼをコードする。ORF4は、ゲンタマイシン生合成遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする遺伝子である。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のゲンタマイシン生合成遺伝子は、遺伝子組換え技術を利用するゲンタマイシンの生産性向上及び新規活性物質の創製に有用である。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、ゲンタマイシン類の構造を示す。
【図2】図2は、決定した塩基配列、決定されたORF、プラスミドpGM6の位置関係を示す。
【発明の属する分野】
本発明は、ゲンタマイシン生合成遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲンタマイシンは、ミクロモノスポラ・エキノスポラ(Micromonospora echinospora)またはミクロモノスポラ・パープレア(Micromonospora purpurea)が生産する20種以上のアミノグリコシド系抗生物質の総称である。一般には、化学療法剤として用いられているゲンタマイシンC1(C21H43N5O7、分子量477.60)、C2(C20H41N5O7、分子量463.58)およびC1a(C19H39N5O7、分子量449.55)の混合物の名称として使用されている。抗菌活性はアミノグリコシド系抗生物質の中で最も優れているものの1つで、抗菌スペクトルはグラム陽性・陰性菌にわたる広域に及び、その作用は殺菌的である。
【０００３】
近年、二次代謝産物の生産生向上や新規活性物質の創出を目的として遺伝子組換えの手法が取り入れられてきており、ポリケチド生合成遺伝子を中心に多くの二次代謝産物生合成に関わる遺伝子が単離されている。アミノグリコシド系抗生物質生合成に関わる遺伝子としては、ストレプトマイシン生合成遺伝子［オオヌキ(Ohnuki, T.)著,「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)」,(米国),1985年,第164巻,p.85-94（非特許文献1）］、アストロマイシン生合成遺伝子［ダイリ(Dairi, T.)ら著,「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Molecular and General Genetics)」,(独国),1992年,第232巻,p.262-270（非特許文献2）］、ブチロシン生合成遺伝子［オオタ(Ota, Y.)ら著,「ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス(Journal of Antibiotics)」,2000年,第53巻,p.1158-1167(非特許文献3)］などが挙げられる。
【０００４】
一方、ゲンタマイシン生合成に関わる遺伝子については、ゲンタマイシン耐性に関わる16S rRNAメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(grm)が単離・解析されている［ケレメン(Kelemen, G. H.)ら著,「ジーン(Gene)」,(和蘭),1991年,第98巻,p.53-60(非特許文献4)］のみであり、その他の生合成遺伝子に関しては全く不明である。生合成遺伝子を単離できれば、組換えDNA技術を利用することによって効率的なゲンタマイシン生産菌の育種が可能となるだけでなく、コンビナトリアルバイオシンセシス技術により有機化学合成では困難であった新規なゲンタマイシン誘導体を生合成させることができる可能性がある。
【０００５】
【非特許文献1】
オオヌキ(Ohnuki, T.)著,「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)」,(米国),1985年,第164巻,p.85-94
【非特許文献2】
ダイリ(Dairi, T.)ら著,「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Molecular and General Genetics),(独国),1992年,第23 2巻,p.262-270
【非特許文献3】
オオタ(Ota, Y.)ら著,「ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス(Journal of Antibiotics)」,2000年,第53巻,p.1158-1167
【非特許文献4】
ケレメン(Kelemen, G. H.)ら著,「ジーン(Gene)」,(和蘭),1991年,第98巻,p.53-60
【非特許文献5】
カイザー(Kieser, T.)ら著,「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス(Practical Streptomyces Genetics)」,「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション(The John Innes Foundation)」,(英国),ノルウィック(Norwick),2000年,p.161-171
【非特許文献6】
池田と大村著,蛋白質核酸酵素,第43巻,p.1265-1277,1998年
【非特許文献7】
カレラス アンド サンティ(Carreras, C. W.and Santi, D. V.) 著,「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Current Opinion in Biotechnology)」,(英国),1998年,第9巻,p.403-411
【非特許文献8】
ハッチンソン(Hutchinson, C. R.)著,「カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー(Current Opinion in Microbiology)」,(英国),1998年,第1巻,p.319-329
【非特許文献9】
カッツ アンド マクダニエル(Katz, L. and McDaniel, R.)著,「メディシナル・リサーチ・レビューズ(Medicinal Research Reviews)」,(米国),1 999年,第19巻,p.543-558
【非特許文献10】
ハッチンソン(Hutchinson, C. R.)著,「バイオ／テクノロジー(Bio／Technology)」,(米国),1994年,第12巻,p.375-380
【非特許文献11】
サンブルーク(Sambrook, J.)ら著,「モレキュラー・クローニング(Molecular cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(a laboratory manual)」,(米国),第2版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),1989年
【非特許文献12】
カイザー(Kieser, T.)ら著,「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス(Practical Streptomyces Genetics)」,ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション(The John Innes Foundation),(英国),ノルウィック(Norwick),2000年,p.169-170
【非特許文献13】
ビッブ(Bibb, M. J.)ら著,「ジーン(Gene)」,(和蘭),1984年,第30巻,p.157-166
【非特許文献14】
アルシュル(Altschul, S. F.)ら著,「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)」,(英国),1990年,第215巻,p.403-410)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ゲンタマイシン生合成遺伝子を含むDNAを単離し、その塩基配列を解析することによって生合成遺伝子を特定することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ゲンタマイシン生合成遺伝子を含むDNA断片を単離することに成功するとともに、その塩基配列を解析することによって各生合成遺伝子を特定することに成功した。すなわち本発明は、以下の通りである。
【０００８】
(1) ゲンタマイシンの生合成に関与するポリペプチド少なくとも1種をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
(2) ポリペプチドが、配列番号2〜21、および23〜29から選択されるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含む上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(3) ポリペプチドが、配列番号2〜21、および23〜29から選択されるアミノ酸配列を含む上記(2)に記載のポリヌクレオチド。
(4) 配列番号1の塩基1-598、671-1024、1024-1671、1668-2369、2526-3959、4499-5521、5813-7219、7227-8351、8405-8917、9016-10260、10508-12424、13062-14414、14452-15258、15326-16663、16757-17128、17136-18392、1 8392-20296、20373-21641、21634-22659、22652-23845、23981-25243、25537-26361、26398-27645、27642-28646、28643-30157、30154-31443、31456-32352、32360-33517、および33584-34663から選択されるヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる上記(1)に記載のポリヌクレオチド。(5) 配列番号1の塩基1-598、671-1024、1024-1671、1668-2369、2526-3959、4499-5521、5813-7219、7227-8351、8405-8917、9016-10260、10508-12424、13062-14414、14452-15258、15326-16663、16757-17128、17136-18392、18392-20296、20373-21641、21634-22659、22652-23845、23981-25243、25537-26361、26398-27645、27642-28646、28643-30157、301 54-31443、31456-32352、32360-33517、および33584-34663から選択されるヌクレオチド配列からなる上記(4)に記載のポリヌクレオチド。
(6) 上記(1)〜(5)の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
(7) 上記(6)に記載の組換えベクターを含んでなる宿主。
【０００９】
【発明の実施の形態】
ゲンタマイシン生合成遺伝子
本発明のゲンタマイシン生合成遺伝子がコードするポリペプチドは、配列番号2〜21、および23〜29から選択されるアミノ酸配列及び該アミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列からなる。これらのポリペプチドの機能は後述する表2に記載される通りである。
【００１０】
本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、1つ若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を受けないアミノ酸配列を意味する。改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜数個、更に好ましくは1〜8個、最も好ましくは1〜4個である。
【００１１】
本発明でいう「活性に影響を与えない改変」の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように1若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００１２】
本発明のゲンタマイシン生合成遺伝子は、配列番号1の塩基1-598、671-1024、1024-1671、1668-2369、2526-3959、4499-5521、5813-7219、7227-8351、8405-8917、9016-10260、10508-12424、13062-14414、14452-15258、15326-16663、16757-17128、17136-18392、18392-20296、20373-21641、21634-22659、22652-23845、23981-25243、25537-26361、26398-27645、27642-28646、28643-30157、30154-31443、31456-32352、32360-33517、および33584-34663から選択されるヌクレオチド配列及び該ヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであることができる。本発明において「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、2ラSSC濃度(1ラSSC:15 mMクエン酸3ナトリウム、150 ｍM塩化ナトリウム)、0.5 ％SDS溶液中で、60℃、20分間の洗浄条件を意味する。
【００１３】
ゲンタマイシン生合成遺伝子の取得
本発明のゲンタマイシン生合成遺伝子は、例えば、以下の方法によりミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレアから単離することができる。また、本発明に開示するようにヌクレオチド配列が明らかとなっているため、人工的に化学合成することも可能である。
【００１４】
ミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレアの菌体から、［カイザー(Kieser, T.)ら著,「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス(Practical Streptomyces Genetics)」,「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション(The John Innes Foundation)」,(英国),ノルウィック(Norwick),2000年,p.161-171（非特許文献5）］に記載の慣行法によりゲノムDNAを抽出する。このゲノムDNAを適当な制限酵素にて消化後、適当なベクターと連結することにより、ミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレアのゲノムDNAライブラリーを作製する。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、BACベクター等、多様なものが使用できる。
【００１５】
次に、本明細書において開示したゲンタマイシン生合成遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて適当なプローブを作成し、ゲノムDNAライブラリーからハイブリダイゼーションによって所望のゲンタマイシン生合成遺伝子を含むDNA断片を単離することができる。また、本明細書において開示したゲンタマイシン生合成遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて所望の遺伝子を増幅させるためのプライマーを作成し、ミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレアのゲノムDNAを鋳型としてPCRを実施し、増幅したDNA断片を適当なベクターと連結することにより所望の遺伝子を単離することができる。更に、本発明によるゲンタマイシン生合成遺伝子は、FERM P-19119として寄託されている大腸菌が保持するプラスミドpGM6に含まれていることから、これらをPCRの鋳型DNAとして利用することが可能であるとともに、これらプラスミドから適当な制限酵素にて所望のDNA断片を調製することができる。
【００１６】
微生物の寄託
p GM6で形質転換された大腸菌(Escherichia coli)は、平成14年11月22日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託された。受託番号は、FERM P-19119である。
【００１７】
形質転換体
遺伝子組換えにより二次代謝産物の生産性を向上させる方法として、律速反応となっている生合成反応を触媒するポリペプチドをコードする遺伝子の発現増強、生合成遺伝子の発現を制御する遺伝子の発現増強や遺伝子破壊、不必要な二次代謝系の遮断等が挙げられる。よって、生合成遺伝子が特定されれば、適当なベクターに連結し、生産菌に導入することにより、二次代謝産物の生産性を向上させることができる。
【００１８】
一方、遺伝子組換えにより新規活性物質を創出するには、ポリケチド合成酵素のドメイン改変［池田と大村著,蛋白質核酸酵素,第43巻,p.1265-1277,1998年(非特許文献6)］、［カレラス アンド サンティ(Carreras, C. W.and Santi,D.V.)著,「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Cu rrent Opinion in Biotechnology)」,(英国),1998年,第9巻,p.403-411(非特許文献7)］、［ハッチンソン(Hutchinson, C. R.)著,「カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー(Current Opinion in Microbiology)」,(英国),1998年,第1巻,p.319-329(非特許文献8)］、［カッツ アンド マクダニエル(Katz, L. and McDaniel, R.)著,「メディシナル・リサーチ・レビューズ(Medicinal Research Reviews)」,(米国),1999年,第19巻,p.543-558(非特許文献9)］、生合成遺伝子の破壊、他の生物からの修飾酵素遺伝子の導入［ハッチンソン(Hutchinson, C. R.)著,「バイオ／テクノロジー(Bio／Technology)」,(米国),1994年,第12巻,p.375-380(非特許文献10)］等が行われている。よって、生合成遺伝子が特定されれば、適当なベクターに連結し、二次代謝産物の生産菌に導入することにより新規活性物質を創出することが可能となる。
【００１９】
従って、本発明によるゲンタマイシン生合成遺伝子を適当なベクターに連結してミクロモノスポラ・エキノスポラまたはミクロモノスポラ・パープレア等の宿主に導入し、その発現を増強または抑制すること、または一部の生合成遺伝子を相同組換えを利用して遺伝子破壊を行いその機能を欠損させることにより、ゲンタマイシンの生産性を向上させることができる。また、本発明によるゲンタマイシン生合成遺伝子を適当なベクターに連結し、ゲンタマイシン以外の二次代謝産物を生産する宿主に導入して発現させること、あるいは生合成遺伝子の一部を遺伝子破壊してゲンタマイシン非生産株となった菌株を適当な物質を添加した培地で培養することによって新規活性物質を生産させることができる。
【００２０】
相同組換えを利用した遺伝子破壊は慣用の方法に従って実施することができ、遺伝子破壊に用いられるベクターの作成やベクターの宿主への導入は当業者に自明であろう。
【００２１】
遺伝子導入用の組換えベクターは、本発明により提供されるポリヌクレオチドを、例えば、［サンブルーク(Sambrook, J.)ら著,「モレキュラー・クローニング(Molecular cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(a laboratory manual)」,(米国),第2版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),1989年(非特許文献11)］に記載の遺伝子組換え技術の慣行法に従って目的に応じて適当な形態に修飾し、ベクターに連結することによって作製することができる。本発明において使用されるベクターは、使用する宿主細胞を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクター等から適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、pBR、pUC系のプラスミド、枯草菌の場合はpUB系のプラスミド、酵母の場合はYEp、YRp、YCp、YIp系のプラスミドベクターが挙げられる。
【００２２】
また、使用されるプラスミドの内少なくとも1つは、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。その好ましい具体例としては、使用する宿主が細菌の場合は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などであり、酵母の場合はトリプトファン生合成遺伝子(TRP1)、ウラシル生合成遺伝子(URA3)、ロイシン生合成遺伝子(LEU2)などであり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子などであり、植物の場合にはカナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
更に、本発明において利用される発現ベクターとしてのDNA分子は、各遺伝子の発現に必要なDNA配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号を有しているのが好ましい。プロモーターとしては、大腸菌においてはラクトースオペロン、トリプトファンオペロンなどのプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、ガラクトース資化性遺伝子、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などのプロモーター、カビではα−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、abp1遺伝子などのプロモーター、植物ではCaMV 35S RNAプロモーター、 CaMV 19S RNAプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーターが好ましく用いることができるものとして挙げられる。
【００２４】
生合成遺伝子を導入する宿主は、用いるベクターの種類に応じて、放線菌、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞等の中から適宜選択されて良い。
【００２５】
組換えベクターの宿主への導入方法としては、接合伝達、ファージによる形質導入、更にカルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、PEG法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法といった形質転換の方法の中から、供試する宿主細胞に応じて用いれば良い。
【００２６】
本発明において複数の遺伝子を宿主細胞に導入する場合には、各遺伝子は同一または別々のDNA分子に含まれていても良い。更に、宿主細胞が細菌である場合には、各遺伝子をポリシストロン性mRNAとして発現させるように設計し、1つのDNA分子とすることも可能である。
【００２７】
得られた組換え体を慣行の方法により、培養し、新たに獲得した性質を調べることができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸(リン酸水素2カリウム等)、硫酸(硫酸マグネシウム等)及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン(チアミン塩酸塩等)等の各種ビタミン、グルタミン酸(グルタミン酸ナトリウム等)、アスパラギン(DL-アスパラギン等)等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。更に、菌の発育を助け、ゲンタマイシン又ゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の生産を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。
【００２８】
培地のpHは、例えばpH 5.5〜pH 8程度である。培養法としては、好気的条件での固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法又は深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。培養に適当な温度は、15℃〜40℃であるが、多くの場合22℃〜30℃付近で生育する。ゲンタマイシン又はゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の生産は、培地及び培養条件、又は使用した宿主により異なるが、何れの培養法においても通常2日〜10日間でその蓄積が最高に達する。培養中のゲンタマイシン又はゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の量が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
【００２９】
培養物からゲンタマイシン又はゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物を採取するためには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、又は適宜組み合わせて抽出精製することができる。
【００３０】
ゲンタマイシン又はゲンタマイシン以外のアミノグリコシド系化合物を更に精製するには、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤、セファデックスLH-20(ファルマシア社製)、又はトヨパールHW-40(東ソー社製)等を用いるクロマトグラフィーを行うと良い。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。
【００３２】
実施例 1: ゲノム DNA ライブラリーの作成
50 ml分の液体培地(2％可溶性デンプン、1 ％ポリペプトン、0.3 ％肉エキス、0.05 ％KH2PO4、pH 7.0)を250 ml容の三角フラスコに作製した。この培地に、ミクロモノスポラ・エキノスポラを植菌し、28℃、24時間培養した。培養終了後、遠心により菌体を集め、これらの菌体より［カイザー(Kieser, T.)ら著,「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス(Practical Streptomyces Genetics)」,ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション(The John Innes Foundation),(英国),ノルウィック(Norwick),2000年,p.169-170(非特許文献12)］に記載の方法で染色体DNAを調製した。
【００３３】
単離したゲノムDNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行いDNA末端を脱リン酸化した。このDNA断片を、予め制限酵素XbaIで消化しアルカリフォスファターゼ処理によって脱リン酸化した後、更に制限酵素BamHIで消化したコスミドベクター SuperCosI(ストラタジーン社製)に連結し、組換えコスミドベクターを作製した。この組換えコスミドベクターについて、ストラタジーン社製のGigapack IIIパッケージングエキストラクトを用いてインビトロパッケージし、大腸菌XLI-Blue MRAに感染させることによりゲノムDNAライブラリーを作製した。
【００３４】
実施例 2: ゲノム DNA ライブラリーのスクリーニング
実施例1で作製したゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、ゲンタマイシン耐性遺伝子(grm)を使用することとし、以下に示すようにPCRによって調製した。
【００３５】
実施例1に示したゲノムDNAを鋳型とし、配列表の配列番号31及び32に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。PCRは、DNAポリメラーゼとしてKOD Dash(東洋紡績製)を使用し、PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700を用いて行った。反応液は、ゲノムDNAを1μl(1μg相当量)、酵素に添付の10倍濃度反応用緩衝液を5μl、2 mM dNTP溶液を5μl、100 pmol／μlの濃度に調整した上記プライマーを各1μlずつ、ジメチルスルホキシド(特級、和光純薬製)を5μl、KOD Dashを1μl、滅菌水を31μl加えて50μlとした。反応は、94℃、5分間の前処理後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間のインキュベーションを25サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約0.8 kbpのDNA断片が特異的に増幅されている事が確認された。そこで、残りの反応液をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿を滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約0.8 kbpのバンドを定法に従って切り出してDNA断片を回収した。
【００３６】
上記DNA断片をプローブにし、ECLダイレクトDNA／RNAラベリング・検出システム(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、取得された陽性クローンよりプラスミドを調製しpGM6と命名した。
【００３７】
実施例 3: プラスミド pGM6 の塩基配列の解析
プラスミドpGM6についてはショットガン法を用い、マルチキャピラリーDNAシーケンサRISA384(島津製作所製)を使用してシーケンシングを実施した。得られた結果から、解析が不充分な領域については、解析済みの塩基配列を元に新たなプライマーを設計してシーケンシングを行った。その結果、プラスミドpGM6の挿入断片の部分塩基配列として、配列番号1に示す塩基配列が得られた。
【００３８】
塩基配列中のオープンリーディングフレーム(ORF)の予測はFramePlot-2.3［ビッブ(Bibb, M. J.)ら著,「ジーン(Gene)」,(和蘭),1984年,第30巻,p.157-166 (非特許文献13)］により行い、各ORFの機能はBLAST［アルシュル(Altschul, S. F.)ら著,「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)」,(英国),1990年,第215巻,p.403-410 (非特許文献14)］により公共のデータベースを検索し推定した。各O RFに位置を図1及び表1に示した。
【００３９】
【表１】
また、各ORFの推定される機能を表2に示した。
【００４１】
【表2】
機能から特定されたゲンタマイシンの生合成に関わるORFの有する機能について以下に説明する。ORF6、ORF10、ORF12、ORF14、ORF16、ORF19、ORF21、ORF24、ORF25及びORF26は、1位、3位、2’位、6’位及び3”位(第1図)の5ヶ所のアミノ基形成に関わる遺伝子である。このうちORF6、ORF19、ORF24及びORF25は、各糖の水酸基(−OH)をケト基(＝O)に変換する酸化還元酵素をコードする遺伝子であり、またORF10、ORF12、ORF14、ORF16、ORF21及びORF26はケト基にアミノ基を転移するアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ORF20はグルコース6リン酸から2−デオキシ−シロ−イノソースの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であり、2−デオキシストレプタミン生合成に関わる遺伝子である。ORF18及び23は2ヵ所のグリコシド結合形成に関わるグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ORF11は、6’位のメチル化に関わるメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ORF13は、3’及び4’位のジデオキシ化に関わる酵素をコードする遺伝子である。ORF7、ORF22及びORF27は、ゲンタマイシンに対する自己耐性に関わる遺伝子であり、ORF7はゲンタマイシンを菌体外に排出するトランスポーターをコードし、更にORF22及びORF27はゲンタマイシンの標的部位であるrRNAを修飾するメチルトランスフェラーゼをコードする。ORF4は、ゲンタマイシン生合成遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする遺伝子である。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のゲンタマイシン生合成遺伝子は、遺伝子組換え技術を利用するゲンタマイシンの生産性向上及び新規活性物質の創製に有用である。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、ゲンタマイシン類の構造を示す。
【図2】図2は、決定した塩基配列、決定されたORF、プラスミドpGM6の位置関係を示す。
Claims (7)
- ゲンタマイシンの生合成に関与する少なくとも1種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
- ポリペプチドが、配列番号1〜21、および23〜29から選択されるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- ポリペプチドが、配列番号1〜21、および23〜29から選択されるアミノ酸配列を含む請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号18の塩基1-598、671-1024、1024-1671、1668-2369、2526-3959、4499-5521、5813-7219、7227-8351、8405-8917、9016-10260、10508-12424、13062-14414、14452-15258、15326-16663、16757-17128、17136-18392、18392-20296、20373-21641、21634-22659、22652-23845、23981-25243、25537-26361、26 398-27645、27642-28646、28643-30157、30154-31443、31456-32352、32360-33517、および33584-34663から選択されるヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1の塩基1-598、671-1024、1024-1671、1668-2369、2526-3959、4499-5521、5813-7219、7227-8351、8405-8917、9016-10260、10508-12424、13062-14414、14452-15258、15326-16663、16757-17128、17136-18392、18392-20296、20373-21641、21634-22659、22652-23845、23981-25243、25537-26361、26398-27645、27642-28646、28643-30157、30154-31443、31456-32352、32360-33517、および33584-34663から選択されるヌクレオチド配列からなる請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
- 請求項6に記載の組換えベクターを含んでなる宿主。
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2002
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