【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識レセプタまたは標識リガンドを検出するための生化学解析用ユニットおよびその製造方法、並びに生化学解析用ユニットを利用して標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法により検出する方法、さらには生化学解析用ユニットを利用した生化学解析装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、例えば、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどを用いたガラスアレイやメンブレンアレイの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタをスポッター装置を用いて吸着性領域に滴下した後、これを固定し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、蛍光物質、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された標識されたレセプタまたはリガンドを、ハイブリダイゼーション等によって吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する解析システムが開発されている。
【０００３】
この解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の吸着性領域の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプタのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
標識されたレセプタまたはリガンドを解析する別の方法として、化学発光法を用いた検出方法が知られている。これは、担体表面上の異なる位置にリガンドまたはレセプタを固定し、抗原などで標識されたレセプタまたはリガンド（以下、標識レセプタまたは標識リガンドという）をハイブリダイゼーションなどによって、担体表面上に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて、標識レセプタまたは標識リガンドを標識している抗原などの物質に対する抗体を、酵素のように化学発光を生じさせる標識物質で標識し（以下、酵素標識抗体という）、この酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドの抗原と特異的に結合させ、さらに酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出する方法である。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２８３７２７６号公報
【０００６】
【非特許文献１】
「ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｖｏｌ．２１， ｐ．２５−ｐ．３２（１９９９）
【０００７】
【非特許文献２】
「バイオインダストリー」Ｖｏｌ．１８， ｐ．１３−ｐ．１９（２００１）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上述の化学発光法においても、充分な精度で検出できることはもちろん、検出限界の向上が要求されている。しかし、化学発光法ではバックグラウンドが高いために、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量（ノイズあるいはバックグラウンド）に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量（信号）の比（Ｓ／Ｎ比）が小さく、吸着性領域に結合する標識レセプタまたは標識リガンドが微量となると検出することが困難になるという問題がある。
【０００９】
化学発光法は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質と特異的に結合した酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出して解析を行うが、化学発光基質が酵素と反応する際に、酵素以外の何らかの作用によって発光する場合には、バックグラウンドが高くなる。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、バックグラウンドを低減させることが可能な生化学解析用ユニットおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。また、この生化学解析用ユニットを利用した化学発光法、さらに生化学解析用ユニットを利用した生化学解析装置も提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の生化学解析用ユニットは、複数の孔を有する基板と、前記複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットであって、該生化学解析用ユニットが滅菌されたものであることを特徴とするものである。
【００１２】
本発明の生化学解析用ユニットの製造方法は、複数の孔を有する基板の前記孔内に、それぞれ吸着性材料を充填することによって吸着性領域を形成し、前記孔内に吸着性領域が形成された生化学解析用ユニットを滅菌することを特徴とする方法である。
【００１３】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる化学発光法において、前記生化学解析用ユニットが滅菌されたものであることを特徴とする方法である。
ここで、生化学解析用ユニットの滅菌はリガンドまたはレセプタが結合される前の生化学解析用ユニットに対して行われる。
【００１４】
本発明の生化学解析装置は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットが取付部によって着脱可能に取り付けられ、前記リガンドまたはレセプタと標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドとを特異的に結合させるための反応容器と、該反応容器内に前記標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させる流動手段とからなる生化学解析装置であって、前記生化学解析用ユニットが滅菌されているものであることを特徴とするものである。
【００１５】
ここで、滅菌された生化学解析用ユニットはリガンドまたはレセプタが結合される前の生化学解析用ユニットに対して滅菌が行われたものである。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の生化学解析用ユニットは、複数の孔を有する基板と、複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットが滅菌されたものであるため、これを化学発光法に用いた場合に化学発光基質が酵素以外の何らかの作用によって発光することが抑制され、バックグラウンドを低減させることが可能となる。また、バックグラウンドを低減させることができるため、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量（ノイズあるいはバックグラウンド）に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量（信号）の比（Ｓ／Ｎ比）を大きく検出することが可能となるので、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であっても検出可能となり、検出限界を向上させることができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明の生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。
【００１８】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、放射線または光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、放射線または光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００１９】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００２０】
放射線または光を減衰させるために、プラスチックに金属酸化物粒子やガラス繊維などを充填することが好ましく、金属酸化物粒子としては、二酸化ケイ素、アルミナ、二酸化チタン、酸化鉄、酸化銅などがあげられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００２１】
ここで、放射線または光を減衰させるとは、前記基板２の孔３に充填された多孔質材料表面または内部のリガンドまたはレセプタと結合した標識レセプタまたは標識リガンドから発する放射線または光が、基板の孔から基板壁を透過して、隣接する孔に到達する強度が好ましくは１／５以下、さらに好ましくは１／１０以下になることを意味する。
【００２２】
放射性標識した試料からの電子線などの放射線を効果的に遮蔽するためには、基板２の平均密度は、一般には０．６ｇ／ｃｍ３以上であり、好ましくは１〜２０ｇ／ｃｍ３の範囲にあり、さらには２〜１０ｇ／ｃｍ３の範囲であることが好ましい。電子線の透過距離は密度に反比例するので、放射性物質が、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃなどのような一般的な放射性同位元素（ＲＩ）であれば、基板２の平均密度をこの範囲とすることにより、各孔３内に固定されることになる試料のＲＩからの電子線を基板２の隔壁で遮蔽して、電子線の透過、散乱による放射線画像の分解能の低下を防ぐことができる。
【００２３】
基板２の厚みは、一般には５０〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、１００〜５００μｍの範囲であることがより好ましい。
【００２４】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２ 未満であり、好ましくは１ｍｍ２ 未満であり、０．３ｍｍ２ 未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２ 未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２ 以上であることが好ましい。
【００２５】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２ 以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２ 以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２ 以上、さらには１０００個／ｃｍ２ 以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２ 以下、さらには１００００個／ｃｍ２ 以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００２６】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２７】
図２は、本発明の生化学解析用ユニットを作製する一実施の形態を示す概略図である。図２に示す生化学解析用ユニットは、多孔性膜２１と基板２とを重ね合わせてプレスし、基板２の孔３に多孔性膜２１を圧入する方法により作製されるものである。図２（ａ）に示すように、孔３が形成された基板２と多孔性膜２１を重ねて、プレスロール２２とバックアップロール２３の間に送り込みプレスすることにより、図２（ｂ）に示すように基板２の孔３に多孔性膜１を圧入する。この場合、プレスロール２２とバックアップロール２３を加熱する方法などにより、多孔性膜２１を軟化させてもよい。
【００２８】
本発明の生化学解析用ユニットは、基板の孔に多孔質材料を含有している溶液（以下、ドープという）を注入することによっても作製することができる。図３は、本発明の生化学解析用ユニットを作製する別の実施の形態を示す概略図である。連続的、もしくは間欠的に搬送されている基板２の上方に、ドープ３１を基板２の孔３に注入するディスペンサ３０が配置されており、このディスペンサ３０は各孔３へ間欠的にドープ３１を注入する。ドープ３１が注入された後、基板に温度と湿度が制御された風を一定風速で供給し、徐々に溶剤を揮発させることによって多孔を形成することができる。なお、多孔性膜は、ドープを支持体上に流延または塗布後、多孔性膜のポリマーの貧溶媒、もしくは良溶媒と貧溶媒の混合液に浸漬した後、水洗乾燥するか、またはドープを支持体上に流延または塗布後、徐々に乾燥することにより別途作製してもよい。
【００２９】
吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体であってもよい。
【００３０】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００３１】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００３２】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００３３】
生化学解析用ユニットの滅菌には、ガスまたは電気によって直接加熱するか、加熱した空気を循環させて乾燥高温状態を保つ方式によって、乾燥空気中で加熱することによって菌を殺菌する乾熱滅菌法、適当な温度と圧力の飽和水蒸気中で加熱することによって菌を殺菌する高圧蒸気法や加熱水蒸気を直接流通させることによって菌を殺菌する流通蒸気法等の湿熱滅菌法、放射線同位元素を含む線源からのガンマ線あるいは加速器による電子線などの放射線の照射により菌を殺菌する放射線滅菌法、紫外線を照射することで菌を殺菌する紫外線滅菌法などを好ましく用いることができる。
【００３４】
図４は菌の生存曲線とＤ値の関係を示すグラフである。Ｄ値は菌数を１／１０にするのに必要な滅菌時間である。ある菌数をある滅菌方法で滅菌すると、滅菌時間が経過するに従って菌は指数関数的に減少する。図４は、最初に存在した１０６ 個の菌数が、６時間処理後には１００ 個すなわち１個になり、これをさらに６時間継続させた時に菌数は１０−６個になることを示している。菌数１０−６個は１０６ 個の生化学解析用ユニットを滅菌処理すると、そのうち１個に菌が生存しているという確率的な意味を示すものである。
【００３５】
弱い菌ではＤ値が小さいため、滅菌時間が少なくても充分な滅菌ができるが、強い菌ではＤ値が大きくなるため、滅菌時間を長くする必要がある。生存する菌種は生化学解析用ユニットの製造環境下によって異なるため、滅菌条件は適宜決定することが好ましいが、例えば、乾熱滅菌法では１００℃以上かつメンブレンの融点以下の温度で１０分以上加熱、湿熱滅菌法では１１０℃以上１３０℃未満で５分以上加熱、放射線滅菌法では吸収線量が０．５ｋＧｙ以上となるように放射、紫外線滅菌法では波長２５０〜２６０ｎｍの紫外線を１ｍＪ／ｃｍ以上で照射することが好ましい。
【００３６】
滅菌の確認は、計器類によるチェック、化学的インジケータ、生化学的インジケータなどによって行うことができる。化学的インジケータは、一般には紙に塗りつけた化学薬品またはガラス管に密封された物質が、滅菌に必要な物理的条件の変化に対応して変質、変性、変色することを応用したものであって、一般に市販されているものを用いることができる。化学的インジケータは、その変色等が明瞭であって滅菌処理の前後で判別が容易であり、希望する滅菌条件になったときに初めて完全に変色等し、使用するまでの保管中に変色したり性能が変化しない等の条件を満たしているものが好ましい。生物学的インジケータは菌を接種した濾紙を包装したものであり、特定の滅菌処理で効果的に滅菌されたか否かを培養によって確認するものである。生物学的インジケータは滅菌装置に積み込んだ生化学解析用ユニットのうち、滅菌が最も難しいと予想される箇所において、指定された条件により滅菌処理を行い、確認することが好ましい。
【００３７】
以上のようにして生化学解析用ユニットを滅菌することができるが、上記のように作製後の生化学解析用ユニットを滅菌するのではなく、生化学解析用ユニットを構成する材料を全て滅菌し、滅菌が保たれた状態で生化学解析用ユニットを製造する方法によって作製してもよい。
【００３８】
次に、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を順を追って説明する。
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する滅菌された生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。
【００３９】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、滅菌された生化学解析用ユニットの多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００４０】
次に、ハイブリダイゼーションバッグ内に生化学解析用ユニットを入れ、ここに標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドを対流あるいは拡散によって移動させて、リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。レセプタまたはリガンドを標識する標識物質としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。
【００４１】
生化学解析用ユニットの多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった標識レセプタまたは標識リガンドを除去するために、ハイブリダイゼーションバッグに洗浄液を対流あるいは拡散によって移動させて、吸着性領域を洗浄する。これによって多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合していない標識レセプタまたは標識リガンドを、剥離させ、除去することができる。
【００４２】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、剥離させ、除去することが可能になる。
【００４３】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファで吸着性領域をブロッキングすることが好ましい。ブロッキングによって、酵素標識抗体が標識レセプタまたは標識リガンドの抗原とではなく、吸着性領域に直接結合することを防止することができる。
【００４４】
洗浄後、洗浄液を廃棄し、酵素標識抗体を含む反応溶液をハイブリダイゼーションバッグに入れて、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。酵素標識抗体は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質に対する抗体（標識レセプタまたは標識リガンドが抗体である場合には抗原）を酵素で標識したものである。酵素標識抗体の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【００４５】
続いて、生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグから取り出して、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。酵素標識抗体に反応させる化学発光基質は、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
【００４６】
化学発光基質と酵素との接触によって各吸着性領域から可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４７】
【実施例】
（実施例１）
大きさが９０ｍｍ×９０ｍｍ、厚み１００μｍのＳＵＳ３０４シート（基板材料シート）に、孔径０．３ｍｍの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ０．４ｍｍ、孔間隔０．１ｍｍで、計４００個形成した。
【００４８】
次に、基板材料シートの片面に接着剤を塗工し、続いて基板材料シートに形成した孔内部に入り込んだ接着剤を吸引除去した後、乾燥した。続いて、基板材料シートの接着剤を塗工した面に、ポアサイズ０．４５μｍ、厚み１７０μｍのナイロン６，６メンブレンを重ね、１５０℃に加熱しながら、圧力が１ｃｍ２ 当たり３００ｋｇとなるようにプレスして、基板材料シートの孔内部にナイロン６，６メンブレンを圧入することで、ステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを作製した。次いで、この生化学解析用ユニットを波長２５３．７ｎｍの紫外線を１ｍＪ／ｃｍ以上照射し紫外線滅菌を行った。
【００４９】
上記生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグに入れ、０．２μｍの組織培養フィルターユニット（ナルジェヌンクインターナショナル社製）にて濾過したブロッキングバッファをバッグ内に供給して１時間振盪させ、ブロッキング反応を行った。アルカリホスファターゼ標識ＤＩＧ抗体をあらかじめ、孔径０．２２μｍのウルトラフリー（ミリポア社製）にて濾過し、濃度が１／１００００となるように、孔径０．２μｍの組織培養フィルターユニット（ナルジェヌンクインターナショナル社製）にて濾過したブロッキングバッファで希釈し、これをバッグ内に供給して１時間振盪させ抗原抗体反応を行った。
【００５０】
続いて、ケミルミ洗浄液（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載のもの）を供給し、１５分間振盪して洗浄し、これを３回繰り返した。洗浄後ディテクションバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載のもの）で５分間浸漬の後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ ｔｏ ｕｓｅ）を含む溶液と１時間接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００：富士写真フィルム社製）によって光電的に検出した。
【００５１】
（比較例１）
滅菌を行わない生化学解析用ユニットを用いた以外は、実施例１と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【００５２】
実施例１と比較例１のバックグラウンドの発光量の比を表１に示す。
【表１】
【００５３】
（実施例２）
実施例１で作製した生化学解析用ユニットを、オートクレーブで３０分１１５℃の条件で滅菌処理を行った。
【００５４】
ＴＥバッファに溶解した分子量マーカーｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩ（２５０ｎｌ／μｇ：ロッシュ社製）を５分煮沸後、１分間氷冷しｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを１本鎖とした。これを上記で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域にスポットし、その後紫外線を照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２ ）して、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。
【００５５】
次にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液（ロッシュ社製）１０ｐｇを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファ（６×ＳＳＣ，０．０１ＭＥＤＴＡ，５×ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．５％ＳＤＳ，１００μｇＳｈｅａｒｄ，ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）５ｍｌに添加した。
【００５６】
上記生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグに入れ、バッグ内に６５℃のプレハイブリダイゼーションバッファ（上記ハイブリダイゼーションバッファと同じもの）５ｍｌを供給し１時間振盪させた。次に、ＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液が添加されたハイブリダイゼーションバッファを６５℃の条件下１８時間振盪させてハイブリダイゼーションを行った。続いて、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて洗浄バッファ１（２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間振盪させて洗浄し、洗浄バッファ２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間振盪させて洗浄した（バッファ温度はいずれも６５℃）。
【００５７】
洗浄液を廃棄し、０．２２μｍのウルトラフリー（ミリポア社製）にて濾過したブロッキングバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載のもの）をバッグ内に供給して１時間振盪させ、ブロッキング反応を行った。アルカリホスファターゼ標識ＤＩＧ抗体をあらかじめ、孔径０．２２μｍのウルトラフリー（ミリポア社製）にて濾過し、濃度が１／１００００となるように、同じく孔径０．２２μｍのウルトラフリーにて濾過したブロッキングバッファで希釈し、これをバッグ内に供給して１時間振盪させ抗原抗体反応を行った。
【００５８】
続いて、ケミルミ洗浄液（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載のもの）を供給し、１５分間振盪して洗浄し、これを３回繰り返した。洗浄後ディテクションバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載のもの）で５分間浸漬の後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ ｔｏ ｕｓｅ）を含む溶液と１時間接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００：富士写真フィルム社製）によって光電的に検出した。
【００５９】
（比較例２）
滅菌処理していない生化学解析用ユニットを使用した以外は、実施例２と同様にして化学発光を行い、発光量を検出した。
【００６０】
【表２】
【００６１】
実施例１および比較例１は、生化学解析用ユニットにＤＮＡをスポットすることなく、化学発光法によりバックグラウンドのみを検出したものである。表１から明らかなように、紫外線照射により滅菌した実施例１の生化学解析用ユニットは、滅菌しなかった比較例１の生化学解析用ユニットに比べて、バックグラウンドの発光を半分近くまで抑えることができた。滅菌した生化学解析用ユニット上では化学発光基質に作用して化学発光を生じさせる菌が存在していないため、バックグラウンドの発光量が低減されたものと考えられる。
【００６２】
実施例２および比較例２は、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩが固定された生化学解析用ユニットで、ＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡを検出したものである。表２から明らかなように、湿熱滅菌法で滅菌した実施例２の生化学解析用ユニットは、滅菌しなかった比較例２の生化学解析用ユニットに比べてバックグラウンドの発光量は低減しており、逆に、シグナルの発光量は高く検出された。滅菌した生化学解析用ユニットでバックグラウンドの発光量が低減されたのは上記と同様の理由によるものと考えられる。一方で、滅菌した生化学解析用ユニットでシグナルの発光量が高くなったのは、予期しえない効果であったが、これによって標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。
【００６３】
なお、上記実施の形態及び実施例では、生化学解析用ユニットと反応溶液をハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドあるいは酵素標識抗体を対流あるいは拡散によって移動させて特異的に結合させる、いわゆる振盪方式によって行う場合を例にとって説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能な反応容器に生化学解析用ユニットを取り付けて行ってもよい。
【００６４】
また、本発明の生化学解析用ユニットは、酵素標識抗体の酵素が化学発光基質と接触することによって化学発光基質が分解あるいは反応する等して発光する化学発光法のみではなく、標識物質に色素基質（酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドなど）あるいは蛍光基質（酵素がアルカリホスファターゼの場合４−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には３（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドなど）を接触させて、色素基質や蛍光基質が分解あるいは反応する等して発色あるいは蛍光を放出し、これを検出する生化学解析にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析用ユニットを作製する一実施の形態を示す概略図
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを作製する別の実施の形態を示す概略図
【図４】菌の生存曲線とＤ値の関係を示すグラフ
【符号の説明】
１ 生化学解析用ユニット
２ 基板
３ 孔
４ 吸着性領域[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a biochemical analysis unit for detecting a labeled receptor or a labeled ligand and a method for producing the same, a method for detecting a labeled receptor or a labeled ligand by a chemiluminescence method using the biochemical analysis unit, and The present invention relates to a biochemical analysis apparatus using a biochemical analysis unit.
[0002]
[Prior art]
In recent years, for example, hormones, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, abzymes, other proteins, nucleic acids, cDNA, at different positions on the carrier surface of glass arrays or membrane arrays using glass slides or membrane filters A ligand or receptor that can specifically bind to a substance derived from a living body such as DNA or RNA and has a known base sequence, base length, composition, characteristics, etc. is dropped onto the adsorptive region using a spotter device. Then, this was fixed, and then collected from the living body by extraction, isolation, etc. of hormones, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, abzymes, other proteins, nucleic acids, DNA, mRNA, etc. After chemical treatment, the substance is labeled with a fluorescent labeling substance such as a fluorescent substance or fluorescent dye. The labeled receptor or ligand was specifically bound to the ligand or receptor immobilized on the adsorptive region by hybridization or the like, and then irradiated with excitation light, and emitted from a labeling substance such as a fluorescent substance or a dye. Analytical systems have been developed that photoelectrically detect fluorescence and analyze biological materials.
[0003]
According to this analysis system, spots of many ligands or receptors are formed at high density at different positions of the adsorptive region on the surface of a carrier such as a membrane filter, and the receptor or ligand labeled with a fluorescent labeling substance is hybridized. By making it soy etc., there exists an advantage that it becomes possible to analyze the substance derived from a biological body in a short time.
[0004]
As another method for analyzing a labeled receptor or ligand, a detection method using a chemiluminescence method is known. This is because ligands or receptors are immobilized at different positions on the surface of the carrier, and receptors or ligands labeled with an antigen or the like (hereinafter referred to as labeled receptors or labeled ligands) are immobilized on the surface of the carrier by hybridization or the like. Alternatively, it specifically binds to a receptor, and then an antibody against a substance such as an antigen labeled with a labeled receptor or a labeled ligand is labeled with a labeling substance that produces chemiluminescence such as an enzyme (hereinafter referred to as an enzyme-labeled antibody). The enzyme-labeled antibody is specifically bound to the antigen of the labeled receptor or the labeled ligand, and the chemiluminescent substrate that specifically binds to the enzyme of the enzyme-labeled antibody is contacted to contact the chemiluminescent substrate with the enzyme. Is a method for photoelectrically detecting chemiluminescence in the visible light wavelength region caused by the above.
[0005]
[Patent Document 1]
Japanese Patent No. 2837276
[0006]
[Non-Patent Document 1]
"Nature genetics" Vol. 21, p. 25-p. 32 (1999)
[0007]
[Non-Patent Document 2]
“Bioindustry” Vol. 18, p. 13-p. 19 (2001)
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Even in the above-described chemiluminescence method, it is possible to detect with sufficient accuracy, and it is required to improve the detection limit. However, since chemiluminescence has a high background, luminescence corresponding to the amount of labeled receptor or labeled ligand bound to the amount of luminescence (noise or background) of the adsorptive region to which the labeled receptor or labeled ligand is not bound. There is a problem that it becomes difficult to detect when the amount (signal) ratio (S / N ratio) is small, and the amount of labeled receptor or labeled ligand bound to the adsorptive region is very small.
[0009]
The chemiluminescence method is a method in which a chemiluminescent substrate that specifically binds to an enzyme of an enzyme-labeled antibody that specifically binds to a labeling substance of a labeled receptor or a labeled ligand is contacted, and visible light generated by contact between the chemiluminescent substrate and the enzyme. The analysis is performed by photoelectrically detecting chemiluminescence in the wavelength region. However, when the chemiluminescent substrate reacts with the enzyme and emits light by some action other than the enzyme, the background becomes high.
[0010]
This invention is made | formed in view of the said situation, and aims at providing the unit for biochemical analysis which can reduce a background, and its manufacturing method. It is another object of the present invention to provide a chemiluminescence method using the biochemical analysis unit and a biochemical analysis apparatus using the biochemical analysis unit.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The biochemical analysis unit of the present invention is a biochemical analysis unit comprising a substrate having a plurality of holes and an adsorbent material that is filled in the plurality of holes to form an adsorptive region. The chemical analysis unit is sterilized.
[0012]
In the method for producing a biochemical analysis unit of the present invention, an adsorptive region is formed by filling an adsorbent material in each of the holes of a substrate having a plurality of holes, and the adsorbent region is formed in the holes. The biochemical analysis unit thus prepared is sterilized.
[0013]
The chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention is a method in which the ligand or receptor of the biochemical analysis unit having a porous adsorptive region bound with a ligand or receptor is labeled with a labeling substance. A receptor or a labeled ligand is specifically bound, an enzyme-labeled antibody is specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand, and a chemiluminescent substrate is contacted with the enzyme-labeled antibody specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand. In the chemiluminescence method, the biochemical analysis unit is sterilized.
Here, the sterilization of the biochemical analysis unit is performed on the biochemical analysis unit before the ligand or the receptor is bound.
[0014]
In the biochemical analysis apparatus of the present invention, a biochemical analysis unit having a porous adsorptive region to which a ligand or a receptor is bound is detachably attached by an attachment portion, and is labeled with the ligand or receptor and a labeling substance. A reaction container for specifically binding a labeled receptor or a labeled ligand; and a flow means for forcibly flowing a reaction solution containing the labeled receptor or the labeled ligand in the reaction container so as to cross the adsorptive region. A biochemical analysis device comprising: the biochemical analysis unit is sterilized.
[0015]
Here, the sterilized biochemical analysis unit is one in which sterilization is performed on the biochemical analysis unit before the ligand or receptor is bound.
[0016]
【The invention's effect】
The biochemical analysis unit of the present invention is a sterilized biochemical analysis unit comprising a substrate having a plurality of holes and an adsorptive material filled in the plurality of holes to form an adsorptive region. Therefore, when this is used in the chemiluminescence method, the chemiluminescence substrate is prevented from emitting light by some action other than the enzyme, and the background can be reduced. In addition, since the background can be reduced, the amount of luminescence corresponding to the amount of binding of the labeled receptor or labeled ligand to the amount of luminescence (noise or background) of the adsorptive region to which the labeled receptor or labeled ligand is not bound. Since it is possible to detect a large (signal) ratio (S / N ratio), even a trace amount of labeled receptor or labeled ligand can be detected, and the detection limit can be improved.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic perspective view of the biochemical analysis unit of the present invention. The biochemical analysis unit 1 shown in FIG. 1 includes a substrate 2 provided with a plurality of holes 3 and an adsorptive region 4 filled in the holes 3 and having a porous material bonded to the substrate 2.
[0018]
The material of the substrate 2 is preferably a material that does not transmit or attenuate radiation or light in order to prevent light scattering inside the biochemical analysis unit, and is preferably a metal or ceramic. In addition, when a plastic that can be easily processed to form holes is used as the substrate, it is preferable to disperse the particles in the plastic in order to further attenuate radiation or light.
[0019]
Preferred examples of the metal include copper, silver, gold, zinc, lead, aluminum, titanium, tin, chromium, iron, nickel, cobalt, tantalum, and alloys such as stainless steel and brass. Preferred examples of the ceramic include alumina, zirconia, magnesia, and quartz. Plastics include polyolefins such as polyethylene and polypropylene, acrylic resins such as polystyrene and polymethyl methacrylate, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinylidene fluoride, polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, polycarbonate, polyethylene naphthalate, Polyesters such as polyethylene terephthalate, aliphatic polyamides such as nylon-6 and nylon-6,6, silicon resins such as polyimide, polysulfone, polyphenylene sulfide, polydiphenylsiloxane, phenolic resins such as novolac, epoxy resins, polyurethane, cellulose acetate And celluloses such as nitrocellulose, copolymers such as butadiene-styrene copolymers, and plastics. Such as those obtained by blending is preferably raised.
[0020]
In order to attenuate radiation or light, it is preferable to fill a plastic with metal oxide particles or glass fibers, and examples of the metal oxide particles include silicon dioxide, alumina, titanium dioxide, iron oxide, and copper oxide. However, it is not necessarily limited to these.
[0021]
Here, attenuation of radiation or light means that the radiation or light emitted from the labeled receptor or labeled ligand bonded to the surface of the porous material filled in the holes 3 of the substrate 2 or the internal ligands or receptors is the holes of the substrate. Means that the strength to penetrate through the substrate wall and reach the adjacent hole is preferably 1/5 or less, more preferably 1/10 or less.
[0022]
In order to effectively shield radiation such as an electron beam from a radiolabeled sample, the average density of the substrate 2 is generally 0.6 g / cm. 3 Or more, preferably 1 to 20 g / cm 3 In the range of 2 to 10 g / cm. 3 It is preferable that it is the range of these. Since the transmission distance of the electron beam is inversely proportional to the density, 32 P, 33 P, 35 S, 14 In the case of a general radioisotope (RI) such as C, the electron beam from the RI of the sample to be fixed in each hole 3 can be obtained by setting the average density of the substrate 2 within this range. By shielding with the partition of the board | substrate 2, the fall of the resolution of the radiographic image by transmission and scattering of an electron beam can be prevented.
[0023]
In general, the thickness of the substrate 2 is preferably in the range of 50 to 1000 μm, and more preferably in the range of 100 to 500 μm.
[0024]
The area (size) of the opening of the hole 3 opened in the substrate 2 is generally 5 mm in order to increase the density of the hole 3. 2 Less than, preferably 1 mm 2 Less than 0.3mm 2 Less than, more preferably 0.01 mm 2 It is preferable that it is less than. And more preferably 0.001 mm 2 The above is preferable.
[0025]
The pitch of the holes 3 (distance from the center of two adjacent holes to the center) is preferably in the range of 0.05 to 3 mm, and the interval between the holes 3 (from the end to the end of the two adjacent holes) The shortest distance) is preferably in the range of 0.01 to 1.5 mm. The number (density) of holes 3 is generally 10 / cm. 2 Or more, preferably 100 / cm 2 Or more, more preferably 500 / cm 2 Or more, 1000 / cm 2 The above is preferable. And preferably 100,000 pieces / cm 2 Below, further 10,000 / cm 2 The following is preferable. Note that the holes 3 do not necessarily have to be provided at regular intervals as shown in FIG. 1, and a plurality of holes may be provided for each block divided into several blocks (units).
[0026]
Examples of the method for forming the plurality of holes 3 in the substrate 2 include punching by punching with pins, electric discharge machining for applying a high voltage to the electrodes in a pulsed manner to volatilize the substrate, etching, and laser irradiation. When the substrate material is a metal material or a plastic material, a corona discharge or plasma discharge is applied to the surface of the substrate and an adhesive is applied, and then a porous material for forming the adsorptive region is pressed. The unit for biochemical analysis is produced by pasting together. In addition, when pressing a porous material for forming an adsorptive region on a substrate, the material for forming the substrate and the adsorptive region is divided in advance and then intermittently pressed. Alternatively, the material for forming the substrate and the adsorptive region may be continuously conveyed between the two rolls in the form of a long band.
[0027]
FIG. 2 is a schematic view showing an embodiment for producing a biochemical analysis unit of the present invention. The biochemical analysis unit shown in FIG. 2 is manufactured by a method in which the porous film 21 and the substrate 2 are overlapped and pressed, and the porous film 21 is press-fitted into the holes 3 of the substrate 2. As shown in FIG. 2 (a), the substrate 2 in which the holes 3 are formed and the porous film 21 are overlapped and fed between the press roll 22 and the backup roll 23 and pressed, thereby being shown in FIG. 2 (b). Thus, the porous film 1 is press-fitted into the holes 3 of the substrate 2. In this case, the porous film 21 may be softened by a method of heating the press roll 22 and the backup roll 23.
[0028]
The biochemical analysis unit of the present invention can also be produced by injecting a solution (hereinafter referred to as a dope) containing a porous material into the pores of the substrate. FIG. 3 is a schematic view showing another embodiment for producing the biochemical analysis unit of the present invention. A dispenser 30 for injecting the dope 31 into the hole 3 of the substrate 2 is arranged above the substrate 2 being conveyed continuously or intermittently. The dispenser 30 intermittently introduces the dope 31 into each hole 3. inject. After the dope 31 has been implanted, a substrate having a controlled temperature and humidity is supplied to the substrate at a constant air speed, and the solvent is gradually evaporated to form a porous structure. The porous membrane is cast or coated on a support, immersed in a poor solvent of the polymer of the porous membrane, or a mixture of a good solvent and a poor solvent, washed with water, dried, or doped with a dope. After casting or coating on a support, it may be prepared separately by gradually drying.
[0029]
As the porous material forming the adsorptive region, a porous material or a fiber material is preferably used. Further, the adsorptive region can be formed by using a porous material and a fiber material together. In the present invention, the porous material used to form the adsorptive region may be either an organic material or an inorganic material, or an organic / inorganic composite.
[0030]
The organic porous material used for forming the adsorptive region is not particularly limited, but a carbon porous material such as activated carbon or a porous material capable of forming a membrane filter is preferably used. As a porous material capable of forming a membrane filter, a polymer that is soluble in a solvent is preferably used. Examples of the polymer that can be dissolved in the solvent include cellulose derivatives (for example, nitrocellulose, regenerated cellulose, cellulose acetate, cellulose acetate, cellulose butyrate acetate, etc.), aliphatic polyamides (for example, nylon 6, nylon 6,6, nylon 4, 10), polyolefins (eg, polyethylene, polypropylene, etc.), chlorine-containing polymers (eg, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, etc.), fluororesins (eg, polyvinylidene fluoride, polytetrafluoride, etc.), polycarbonate , Polysulfone, alginic acid and derivatives thereof (for example, alginic acid, calcium alginate, alginic acid / polylysine polyion complex, etc.), collagen, etc., and copolymers and composites (mixtures) of these polymers It can be used.
[0031]
In addition, the fiber material for forming the adsorptive region is not particularly limited, but preferred examples include the cellulose derivatives and aliphatic polyamides described above.
[0032]
The inorganic porous material used to form the adsorptive region is not particularly limited, but is preferably a metal (for example, platinum, gold, iron, silver, nickel, aluminum, etc.), a metal or the like Examples thereof include oxides (for example, alumina, silica, titania, zeolite, etc.), metal salts (for example, hydroxyapatite, calcium sulfate, etc.), and composites thereof.
[0033]
For sterilization of biochemical analysis unit, dry heat sterilization method in which bacteria are sterilized by heating in dry air by heating directly with gas or electricity or by circulating heated air to maintain a dry high temperature state Wet heat sterilization methods such as the high-pressure steam method for sterilizing bacteria by heating in saturated steam at an appropriate temperature and pressure, and the circulating steam method for sterilizing bacteria by directly circulating heated steam, and lines containing radiation isotopes A radiation sterilization method for sterilizing bacteria by irradiation with radiation such as gamma rays from a source or an electron beam from an accelerator, an ultraviolet sterilization method for sterilizing bacteria by irradiation with ultraviolet rays, or the like can be preferably used.
[0034]
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the survival curve of bacteria and the D value. The D value is the sterilization time required to reduce the number of bacteria to 1/10. When a certain number of bacteria is sterilized by a certain sterilization method, the bacteria decrease exponentially as the sterilization time elapses. FIG. 4 shows the first existing 10 6 The number of bacteria is 10 after 6 hours of treatment. 0 When this is continued for another 6 hours, the number of bacteria is 10 -6 It shows that it becomes a piece. Number of bacteria 10 -6 10 6 When the biochemical analysis unit is sterilized, one of them has a probable meaning that the bacterium is alive.
[0035]
Since weak D has a small D value, sufficient sterilization can be achieved even if the sterilization time is short. However, since strong D has a large D value, it is necessary to lengthen the sterilization time. Since the surviving bacterial species varies depending on the production environment of the biochemical analysis unit, it is preferable to determine the sterilization conditions as appropriate. For example, in the dry heat sterilization method, 10 minutes or more at a temperature of 100 ° C. or more and the melting point of the membrane or less. Heating or heat-humidity sterilization is 110 ° C or more and less than 130 ° C for 5 minutes or more. Radiation sterilization is radiation so that the absorbed dose is 0.5 kGy or more. It is preferable to irradiate with.
[0036]
The confirmation of sterilization can be performed by checking with instruments, chemical indicators, biochemical indicators, and the like. Chemical indicators are generally applied to chemicals applied to paper or substances sealed in glass tubes that change, denature and discolor in response to changes in physical conditions required for sterilization. A commercially available product can be used. The chemical indicator is clearly discolored and easily distinguishable before and after sterilization, and it will not change color completely until the desired sterilization conditions are reached. Those satisfying the condition that the performance does not change are preferred. The biological indicator is a package of filter paper inoculated with bacteria, and it is confirmed by culturing whether it has been effectively sterilized by a specific sterilization treatment. The biological indicator is preferably confirmed by performing sterilization treatment under designated conditions at a position where sterilization is expected to be most difficult among the biochemical analysis units loaded in the sterilizer.
[0037]
The biochemical analysis unit can be sterilized as described above. However, instead of sterilizing the biochemical analysis unit after production as described above, all the materials constituting the biochemical analysis unit are sterilized. Alternatively, the biochemical analysis unit may be produced by a method in which sterilization is maintained.
[0038]
Next, the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention will be described step by step.
In the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention, first, a ligand or a receptor is bound to the adsorptive region of a sterilized biochemical analysis unit having a porous adsorptive region.
[0039]
The ligand or receptor bound to the porous adsorptive region includes hormones, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, abzymes, other proteins, nucleic acids, cDNA, DNA, RNA, etc., characteristics, composition, structure Alternatively, the base sequence and base length are known. The ligand or the receptor can be fixed to the adsorptive region by dropping it onto the adsorptive region and then irradiating it with ultraviolet rays. Note that this step is omitted when a biochemical analysis unit in which a ligand or a receptor is already bound to the porous adsorptive region of the sterilized biochemical analysis unit is used.
[0040]
Next, place the biochemical analysis unit in the hybridization bag, add the reaction solution containing the labeled receptor or labeled ligand, and apply vibration to the hybridization bag to move the labeled receptor or labeled ligand by convection or diffusion. Then, the labeled receptor or labeled ligand is specifically bound to the ligand or receptor. The labeled receptor or labeled ligand is a hormone or tumor marker, enzyme, antibody, antigen, abzyme, other protein, nucleic acid, DNA, mRNA, etc. that specifically binds to the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region. It is collected from a living body by extraction, isolation, etc., or is subjected to chemical treatment after being collected and labeled with a labeling substance. Preferred examples of the labeling substance for labeling the receptor or the ligand include antigens such as digoxigenin, biotin, avidin, and fluorescein, and antibodies against these antigens.
[0041]
The washing solution is transferred to the hybridization bag by convection or diffusion to remove the labeled receptor or ligand that did not specifically bind to the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region of the biochemical analysis unit. To wash the adsorptive region. As a result, the labeled receptor or labeled ligand not specifically bound to the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region can be peeled off and removed.
[0042]
This washing step is also preferably performed when an enzyme-labeled antibody described later is specifically bound to a labeled receptor or a labeled ligand, and then the enzyme-labeled antibody that has not been specifically bound is removed. As a result, the enzyme-labeled antibody not specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand can be peeled off and removed.
[0043]
It is preferable to block the adsorptive region with a blocking buffer for the enzyme-labeled antibody before binding the enzyme-labeled antibody to the labeled receptor or ligand specifically bound to the ligand or receptor bound to the adsorptive region. Blocking can prevent the enzyme-labeled antibody from binding directly to the adsorptive region rather than to the labeled receptor or labeled ligand antigen.
[0044]
After washing, the washing solution is discarded, and the reaction solution containing the enzyme-labeled antibody is placed in a hybridization bag and specifically bound to the labeled receptor or labeled ligand. The enzyme-labeled antibody is obtained by labeling an antibody against a labeling substance of a labeled receptor or a labeled ligand (or an antigen when the labeled receptor or labeled ligand is an antibody) with an enzyme. As the enzyme of the enzyme-labeled antibody, enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, and luciferase can be preferably used.
[0045]
Subsequently, the biochemical analysis unit is taken out from the hybridization bag, and the chemiluminescent substrate is brought into contact with the enzyme-labeled antibody specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand. The chemiluminescent substrate to be reacted with the enzyme-labeled antibody is not particularly limited when the enzyme is alkaline phosphatase, peroxidase, or luciferase, but dioxetane, luminol, or luciferin can be used, respectively.
[0046]
Since chemiluminescence in the visible wavelength region is generated from each adsorptive region by contact between the chemiluminescent substrate and the enzyme, if this is detected photoelectrically and image data for biochemical analysis is generated, the labeled receptor or labeled ligand can be used. It can be detected and measured.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0047]
【Example】
(Example 1)
A SUS304 sheet (substrate material sheet) having a size of 90 mm × 90 mm and a thickness of 100 μm is formed with a fine hole having a circular diameter of 0.3 mm and a hole pitch of 0.4 mm and a hole interval of 0.1 mm for a total of 400. Individually formed.
[0048]
Next, an adhesive was applied to one side of the substrate material sheet, and then the adhesive that had entered the holes formed in the substrate material sheet was removed by suction and then dried. Subsequently, a nylon 6,6 membrane with a pore size of 0.45 μm and a thickness of 170 μm is layered on the surface of the substrate material sheet coated with the adhesive, and the pressure is 1 cm while heating to 150 ° C. 2 A unit for biochemical analysis consisting of a stainless steel barrier and a polymer-filled region with a large number of holes was produced by pressing the nylon 6 and 6 membranes into the holes of the substrate material sheet. Next, this biochemical analysis unit was irradiated with ultraviolet rays having a wavelength of 253.7 nm for 1 mJ / cm or more, and sterilized by ultraviolet rays.
[0049]
The above biochemical analysis unit is placed in a hybridization bag, and a blocking buffer filtered through a 0.2 μm tissue culture filter unit (manufactured by Nargenunk International Co., Ltd.) is supplied into the bag and shaken for 1 hour to effect a blocking reaction. went. Alkaline phosphatase-labeled DIG antibody is filtered in advance with 0.22 μm pore-free Ultra Free (Millipore), and a tissue culture filter unit (Narugenunk International Co., Ltd.) with a pore size of 0.2 μm so that the concentration becomes 1/10000. The product was diluted with a blocking buffer filtered in the above product, and supplied to the bag and shaken for 1 hour to carry out an antigen-antibody reaction.
[0050]
Subsequently, a chemirmi washing solution (DIG manufactured by Roche, as described in Wash and Block buffer Set) was supplied, washed by shaking for 15 minutes, and this was repeated three times. After washing, after immersion for 5 minutes in detection buffer (Roche DIG, described in Wash and Block buffer Set), a solution containing a chemiluminescent substrate CDP-star (CDP-star, read to use) and 1 The chemiluminescence emitted from the absorptive region of the biochemical analysis unit was contacted for a period of time and photoelectrically detected by a cooled CCD camera (LAS1000: manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.).
[0051]
(Comparative Example 1)
Except for using the biochemical analysis unit without sterilization, chemiluminescence was performed in the same manner as in Example 1 to detect the amount of luminescence.
[0052]
Table 1 shows the ratio of the amount of light emitted from the background in Example 1 and Comparative Example 1.
[Table 1]
[0053]
(Example 2)
The biochemical analysis unit prepared in Example 1 was sterilized by autoclaving for 30 minutes at 115 ° C.
[0054]
The molecular weight markers pBR328 / BgII and HinfI (250 nl / μg: manufactured by Roche) dissolved in TE buffer were boiled for 5 minutes and then ice-cooled for 1 minute to make pBR328 / BgII and HinfI single-stranded. This is spotted on the adsorptive region of the biochemical analysis unit prepared above, and then irradiated with ultraviolet rays (254 nm, 33 mJ / cm 2 Then, single-stranded pBR328 / BgII and HinfI were immobilized on the adsorptive region.
[0055]
Next, 10 pg of pBR328-DNA solution (manufactured by Roche) labeled with digoxigenin (DIG) was thermally denatured, and hybridization buffer (6 × SSC, 0.01 MEDTA, 5 × denhardt's solution, 0.5% SDS, (100 μg Sheared, denatured salmon sperm DNA) was added to 5 ml.
[0056]
The biochemical analysis unit was placed in a hybridization bag, and 5 ml of a prehybridization buffer at 65 ° C. (the same as the hybridization buffer) was supplied into the bag and shaken for 1 hour. Next, hybridization was performed by shaking the hybridization buffer to which the DIG-labeled pBR328-DNA solution was added for 18 hours under the condition of 65 ° C. Subsequently, the hybridization bag was vibrated and washed with washing buffer 1 (2 × SSC, 0.1% SDS) for 5 minutes to wash, and washing buffer 2 (0.1 × SSC, 0.1% SDS). And washed for 5 minutes with shaking (both buffer temperatures are 65 ° C.).
[0057]
Discard the washing solution, and supply a blocking buffer (described by Roche DIG, described in Wash and Block buffer Set) filtered through 0.22 μm Ultra Free (Millipore) into the bag and shake for 1 hour. A blocking reaction was performed. Alkaline phosphatase-labeled DIG antibody was filtered with Ultra Free (Millipore) with a pore size of 0.22 μm in advance, and with a blocking buffer filtered with Ultra Free with a pore size of 0.22 μm so that the concentration would be 1/10000. It was diluted and supplied into a bag and shaken for 1 hour to carry out an antigen-antibody reaction.
[0058]
Subsequently, a chemirmi washing solution (DIG manufactured by Roche, as described in Wash and Block buffer Set) was supplied, washed by shaking for 15 minutes, and this was repeated three times. After washing, after immersion for 5 minutes in detection buffer (Roche DIG, described in Wash and Block buffer Set), a solution containing a chemiluminescent substrate CDP-star (CDP-star, read to use) and 1 The chemiluminescence emitted from the absorptive region of the biochemical analysis unit was contacted for a period of time and photoelectrically detected by a cooled CCD camera (LAS1000: manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.).
[0059]
(Comparative Example 2)
Except for using the biochemical analysis unit that was not sterilized, chemiluminescence was performed in the same manner as in Example 2 to detect the amount of luminescence.
[0060]
[Table 2]
[0061]
In Example 1 and Comparative Example 1, only the background was detected by the chemiluminescence method without spotting DNA on the biochemical analysis unit. As is clear from Table 1, the biochemical analysis unit of Example 1 sterilized by ultraviolet irradiation suppresses background light emission to almost half that of the biochemical analysis unit of Comparative Example 1 that was not sterilized. I was able to. On the sterilized biochemical analysis unit, since there are no bacteria that act on the chemiluminescent substrate to cause chemiluminescence, it is considered that the amount of luminescence in the background has been reduced.
[0062]
In Example 2 and Comparative Example 2, DIG-labeled pBR328-DNA was detected by a unit for biochemical analysis in which single-stranded pBR328 / BgII and HinfI were immobilized in the adsorptive region. As is apparent from Table 2, the background luminescence amount of the biochemical analysis unit of Example 2 sterilized by the wet heat sterilization method is lower than that of the biochemical analysis unit of Comparative Example 2 that was not sterilized. On the contrary, the amount of signal emission was detected to be high. The reason why the amount of light emission in the background was reduced in the sterilized biochemical analysis unit is considered to be due to the same reason as described above. On the other hand, it was an unexpected effect that the amount of signal emission increased in the sterilized biochemical analysis unit. However, even if the amount of labeled receptor or labeled ligand was very small, the S / N ratio was low. Large detection can be performed.
[0063]
In the above embodiments and examples, the biochemical analysis unit and the reaction solution are placed in the hybridization bag, and the hybridization bag is vibrated to move the labeled receptor, the labeled ligand, or the enzyme-labeled antibody by convection or diffusion. However, the present invention is not limited to this, and the reaction solution can be forced to flow across the adsorptive region. A biochemical analysis unit may be attached to a possible reaction vessel.
[0064]
The biochemical analysis unit of the present invention is not limited to the chemiluminescence method in which the enzyme of the enzyme-labeled antibody contacts the chemiluminescent substrate and the chemiluminescent substrate decomposes or reacts to emit light. Substrate (paranitrophenol phosphate if the enzyme is alkaline phosphatase, 4-aminoantipyrine and trinder reagent combination if the enzyme is peroxidase, diaminobenzidine, tetramethylbenzidine, if the enzyme is beta galactosidase Para-nitrophenyl β-D-galactoside, etc.) or fluorescent substrate (4-methylumbellylphenyl phosphate when the enzyme is alkaline phosphatase, 3 (4-hydroxyphenyl) -propionic acid when the enzyme is peroxidase, and the enzyme is beta In the case of galactosidase, 4-methyl Contacting the umbelliferose phenyl beta-D-galactoside, etc.), and the like chromogenic substrate or fluorogenic substrate to decompose or react to release a chromogenic or fluorescent, can also be used in biochemical analysis to detect this.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic perspective view of a biochemical analysis unit used in the chemiluminescence method of the present invention.
FIG. 2 is a schematic view showing an embodiment for producing a biochemical analysis unit of the present invention.
FIG. 3 is a schematic view showing another embodiment for producing the biochemical analysis unit of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the survival curve of bacteria and the D value.
[Explanation of symbols]
1 Biochemical analysis unit
2 Substrate
3 holes
4 Adsorbent area