【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物が外界から硝酸イオンを吸収する過程、更に吸収した硝酸イオンの植物内での細胞間輸送に関与している硝酸輸送タンパク質と、それをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
硝酸輸送遺伝子には、硝酸イオン濃度が高い（即ち、０．５ｍＭ以上）ときに働く低親和性硝酸輸送輸送遺伝子と、低い（即ち、０．５ｍＭ以下）のときに働く高親和性硝酸輸送遺伝子が存在する（化学と生物， Ｖｏｌ．３８， ｐ１９６−２０３， ２０００）。これまでに遺伝子レベルでの研究が進み、植物由来の低親和性硝酸輸送遺伝子としてシロイヌナズナ由来のＣＨＬ１（ＡｔＮＲＴ１）（Ｃｅｌｌ， ｖｏｌ．７２， ｐ７０５−７１３， １９９３，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ｖｏｌ．８， ｐ２１８３−２１９１， １９９６）、ＮＴＬ１（ＡｔＮＲＴ１：２）（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．１１， ｐ１３８１−１３９２， １９９９）、イネ由来のＯｓＮＲＴ１（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｖｏｌ．１２２， ｐ３７９−３８８， ２０００）、アブラナ由来のＢｎＮＲＴ１：２（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７３， ｐ１２０１７， １９９８）、トマト由来のＬｅＮＲＴ１（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ＶＯｌ．９３， ｐ８１３９−８１４４， １９９６）などの報告がある。なお、ＣＨＬ１については低親和性、高親和性両方の機能を併せ持っているとの報告もある（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．１１， ｐ８６５−８７４， １９９９）。これらの遺伝子のうち、硝酸イオン輸送活性が実験的に確認されているものは、ＣＨＬ１、ＮＴＬ１およびＯｓＮＲＴ１である。この他にも遺伝子レベルで相同性のある遺伝子が多数単離されているが、それらの硝酸イオン輸送活性は測定されておらず、硝酸輸送遺伝子であるという明確な確認はなされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ニコチアナ属由来の硝酸輸送遺伝子を提供することにある。
【０００４】
それにより、ニコチアナ属の硝酸輸送遺伝子が単離され、その機能や発現様式が解明されれば、その遺伝子を操作し、硝酸イオン吸収能を増大、或いは削減した植物を育種することが可能になる。更に、低栄養な土壌でも生育可能な植物の育種、或いは、植物中の硝酸含量を削減して品質の向上した植物の育種が期待される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討の結果、ニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１の根、またはニコチアナ タバカム ｃｖ． ブライトイエロー４号の葉の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法で低親和性硝酸輸送遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定し、その知見に基づいて本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に記載の塩基配列、並びにその相補鎖からなる群より選択される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
１．低親和性硝酸輸送遺伝子
上述の通り、本発明者らは、ニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１、またはニコチアナ タバカム ｃｖ． ブライトイエロー４号の各器官（例えば、葉肉、中骨、茎、根など）の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、低親和性硝酸輸送遺伝子をクローニングし、単離し、その塩基配列を決定した。
【０００８】
本発明に従う低親和性硝酸輸送タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示される塩基配列並びにその相補鎖からなる群より選択される塩基配列により示されるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載のアミノ酸をコードする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
更に本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示される塩基配列並びにその相補鎖からなる群より選択される塩基配列により示されるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
また、本発明に従う低親和性硝酸輸送タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドは、その塩基配列の幾つかの塩基が置換または欠失していてもよく、また、幾つかの塩基が更に付加していてもよく、また化学的な修飾がなされていてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。
【００１１】
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」の語は、合成若しくは天然、またはＤＮＡ若しくはＲＮＡの何れかに関わらず、複数のヌクレオチドを含み、且つ特定の塩基配列により表されるものを示す。
【００１２】
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、それ自体で遺伝子として使用されてもよく、または所望のプロモーター、エンハンサーサイレンサーおよびアテニュエーターなどの発現調節遺伝子、並びに薬物耐性因子、緑色蛍光タンパク質、フィコシアニンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼなどのマーカー遺伝子を付加した形態のオリゴヌクレオチドを遺伝子として使用されてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。また、そのような遺伝子を導入するための対象は、ファージおよびプラスミドなどのベクター、ウイルス、細胞、組織、植物および動物などであればよく、そのような遺伝子を導入された対象も本発明として提供される。また、そのような遺伝子の導入はそれ自身公知の手段により行うことが可能である。
【００１３】
例えば、本発明に従う遺伝子は、所望の対象に導入され、低親和性硝酸輸送遺伝子を発現または発現促進してもよく、または、低親和性硝酸輸送タンパク質を産生させてもよく、低親和性硝酸輸送タンパク質の産生量を増加するために使用してもよい。
【００１４】
或いは、例えば、本発明に従うオリゴヌクレオチドを遺伝子として植物に導入することにより硝酸イオンの吸収能や他細胞への輸送をコントロールできる植物を育種することができる。例えば、低栄養な土壌でも、生育可能な植物の育種、或いは植物中の硝酸含量を削減して品質の向上した植物の育種に使用することが可能である。
【００１５】
また、本発明に従うと、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７並びにその相補鎖からなる群より選択された塩基配列の所望の一部分を含むオリゴヌクレオチド断片も提供される。そのようなオリゴヌクレオチド断片は、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドを検出するためのプローブ、本発明のオリゴヌクレオチドを増幅するためのプライマーなどとして使用することも可能である。
【００１６】
例えば、そのようなオリゴヌクレオチド断片をプローブとして使用する場合には、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７並びにその相補鎖からなる群より選択された塩基配列の連続する約２００塩基から約１０００塩基、好ましくは約５００塩基から約８００塩基であればよい。
【００１７】
そのようなオリゴヌクレオチド断片を増幅反応におけるプライマーとして使用する場合には、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７並びにその相補鎖からなる群より選択された塩基配列から設計すればよい。例えば、２０ｍｅｒ前後、好ましくは２２から２５ｍｅｒ、ＧＣ含量が４０から６０％、Ｔｍ値を６０℃以上として設計することができる。
【００１８】
これに限定するものではないが、好ましいプライマーは、例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４並びにその相補鎖により示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。以下、夫々の配列について説明する。
【００１９】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２は、配列番号１の塩基配列の一部である。
【００２０】
配列番号９は、配列番号１の塩基の第１位から第２４位までの塩基からなる配列であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと記す）におけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１０は、配列番号１の塩基の第１７７３位から第１７５０位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号９と共に使用され得る。
【００２１】
配列番号１１は、配列番号１の塩基の第１６５３位から第１６７５位までの塩基からなる配列であり、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲと記す）におけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１２は、配列番号１の塩基の第１７６２位から第１７４１位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号９と共に使用され得る。
【００２２】
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６は、配列番号３の塩基配列の一部である。
【００２３】
配列番号１３は、配列番号３の塩基の第１位から第２４位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１４は、配列番号３の塩基の第１７７３位から第１７５０位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号１３と共に使用され得る。
【００２４】
配列番号１５は、配列番号３の塩基の第１６５３位から第１６７５位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１６は、配列番号１の塩基の第１７６２位から第１７４１位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号１５と共に使用され得る。
【００２５】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０は、配列番号５の塩基配列の一部である。
【００２６】
配列番号１７は、配列番号５の塩基の第１位から第２２位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１８は、配列番号５の塩基の第１７８５位から第１７６３位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号１７と共に使用され得る。
【００２７】
配列番号１９は、配列番号５の塩基の第３９４位から第４１６位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号２０は、配列番号５の塩基の第５４４位から第５２３位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号１９と共に使用され得る。
【００２８】
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４は、配列番号７の塩基配列の一部である。
【００２９】
配列番号２１は、配列番号７の塩基の第１位から第２２位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号２２は、配列番号７の塩基の第１７８５位から第１７６３位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号２１と共に使用され得る。
【００３０】
配列番号２３は、配列番号７の塩基の第３９４位から第４１７位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号２４は、配列番号７の塩基の第３９４位から第４１７位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号２３と共に使用され得る。
【００３１】
また、上述のようなオリゴヌクレオチド断片は所望により、更に任意の配列を具備してもよく、また、任意の標識物質などを具備してもよく、その一部に化学的修飾がなされてもよい。
【００３２】
本発明に従い提供される配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示される塩基配列並びにその相補鎖からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド断片は、ニコチアナ属の植物、好ましくは、ニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１、またはニコチアナ タバカム ｃｖ． ブライトイエロー４号から、それ自身公知の手段により単離され、精製されればよく、所望に応じて増幅されてもよい。或いは、それ自身公知の核酸合成手段により、人工的に合成されてもよい。
【００３３】
本発明に従い提供される配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示される塩基配列並びにその相補鎖からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド、およびそれらの一部分であるオリゴヌクレオチド断片は、対象における低親和性硝酸輸送遺伝子の発現を阻害するためのアンチセンスとして使用されてもよい。そのようなアンチセンスも本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
本発明に従うアンチセンスの例は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示す塩基配列の全長のアンチセンスであってもよいが、夫々の配列の連続した約２５％以上の断片のアンチセンスであれば効果は得られる。
【００３５】
本発明に従うアンチセンスの使用方法は、それ自身公知の何れの手段を利用すればよい。
【００３６】
また、そのようなアンチセンスで処理された細胞、組織および植物などの対象も本発明の範囲に含まれる。また、本発明に従うアンチセンスを使用した低親和性硝酸輸送遺伝子の阻害方法も本発明の範囲内である。
【００３７】
２．低親和性硝酸輸送タンパク質
本発明に従うと、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載のアミノ酸配列により示されるタンパク質およびポリペプチドが提供される。これらの配列は、実質的に低親和性硝酸輸送タンパク質を示すアミノ酸配列である。
【００３８】
また、本発明に従うと、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載されるアミノ酸配列により示されるタンパク質は、その幾つかのアミノ酸が置換または欠失していてもよく、また、幾つかのアミノ酸が更に付加していてもよく、また化学的な修飾がなされていてもよい。そのような修飾タンパク質および修飾ポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
また、本発明に従って提供されるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載されるアミノ酸配列により示されるポリペプチドに約６０％以上で相同的なアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
【００４０】
本発明に従う低親和性硝酸輸送タンパク質は、任意の大腸菌や細胞などを利用するそれ自身公知のタンパク質生産方法を利用すればよい。
【００４１】
本発明の遺伝子はまた、定法に従って常用のプラスミドベクターに挿入した後、宿主細胞、例えば、大腸菌などの細胞を含めての原核性細胞、酵母などの単細胞性宿主を含めての下等真核性細胞、カイコなどの高等真核細胞を形質転換して増幅することが可能である。そのことを、その具体的な一例は、上述の実施例５に示す通り、本発明の遺伝子の硝酸イオン輸送活性をカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターに連結したプラスミドを培養細胞ＢＹ２に導入することにより確認することができた。また、アフリカツメガエルの卵母細胞に合成した本発明の遺伝子のｍＲＮＡを直接導入し、硝酸イオン溶液中で電気生理学的に輸送能を測定することも可能である。更に、硝酸輸送能が欠失した酵母などに本発明の遺伝子を導入して、硝酸輸送能が相補されることにより、本発明の遺伝子の活性を確認することも可能である。
【００４２】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例にのみに限定されるものではない。
【００４３】
実施例１．低親和性硝酸輸送遺伝子の単離
（１）ニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１の総ＲＮＡの抽出
標準的な水耕液（５ｍＭのＫＮＯ３、２．５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＣａ（ＮＯ３）、０．０５ｍＭのＦｅ−ＥＤＴＡ、７０μＭのＨ３ＢＯ３、１４μＭのＭｎＣｌ２、０．５μＭのＣｕＳＯ４、１μＭのＺｎＳＯ４、０．２μＭのＮａＭｏＯ４、１０μＭのＮａＣｌ、０．０１μＭのＣｏＣｌ２）で２〜３週間栽培したニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． Ｂｕｒｌｅｙ ２１）の根を総ＲＮＡの調製に供した。０．５ｇの根をＦａｓｔ ＲＮＡ−Ｇｒｅｅｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）のチューブに入れ、これをＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０装置にセットして磨砕した。更に、添付されたプロトコールに従い総ＲＮＡを得た。
【００４４】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の単離
上記（１）で得られた総ＲＮＡを鋳型として使用し、逆転写反応を行った。即ち、総ＲＮＡ１〜２μｇ、１０×ＲＴ緩衝液、終濃度０．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、ｏｌｉｇｏ ｄＴ（１５）プライマー１０ｐｍｏｌｅｓ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １０ユニット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １ユニット（Ｑｉａｇｅｎ）、合計１０μＬにＲＮａｓｅ−フリー ウォーター（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）で調製後、３７℃で６０分間逆転写反応を行い、９３℃で５分間処理して酵素を失活した。次に、反応溶液の一部を鋳型にしてＰＣＲを行った。即ち、反応液５μＬ、１０×緩衝液１０μＬ、終濃度０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーセット、５ユニットのＥｘ−Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）、合計５０μＬに調整後、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００）を用いて９４℃で２分を１サイクル、９４℃で３０秒→５５℃で３０秒→７２℃で１．５分を３０サイクル、７２℃で７分を１サイクルとして反応を行った。プライマーセットの配列は、配列番号１、配列番号２に示したＮ−１（５’−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣ ＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡ ＡＣＡＡ−３’）とＮ−２（５’−ＴＴＡＧＴＧＧＣＡＡ ＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧ ＡＡＴＣ−３’），及び配列番号３および配列番号４に示したＮ−３（５’−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣ ＣＴＧＡＧＡＣＡＣＡ ＧＣ−３’）とＮ−４（５’−ＴＣＡＡＴＧＡＣＡ ＡＡＣＣＧＧＴＣＣＡ ＴＣＡＴ−３’）の２組を用いた。
【００４５】
Ｎ−１とＮ−２、Ｎ−３とＮ−４の２組のプライマーセットを用いて、それぞれ約１．８ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。それぞれの増幅産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ）にクローニングした。大腸菌数十コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し，ＢｉｇＤｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００に供して塩基配列を解析した。その結果、各プライマーセットで２分子種ずつが増幅されることが判明した。その塩基配列を配列番号１、３、５、及び７に示す。なお、それぞれの配列の名称をｎｒｔ１．１Ａ、ｎｒｔ１．１Ｂ、ｎｒｔ１．２Ａ、及びｎｒｔ１．２Ｂとした。
【００４６】
このように、本発明に従う遺伝子が、ニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１の各器官（例えば葉肉、中骨、茎および根など）の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により単離することができた。
【００４７】
実施例２．低親和性硝酸輸送遺伝子の発現解析１
（１）バーレー２１の水耕栽培
播種後１ヶ月の幼苗を２５℃の温室内において、標準水耕液（硝酸イオン濃度９ｍＭ）で２週間栽培した。なお、標準水耕液の組成は実施例１と同様であり、一週間ごとに水耕液は新たなものと取替えた。さらに、エアーポンプで水耕液内に空気を供給した。
【００４８】
（２）総ＲＮＡの抽出
水耕栽培したタバコから葉、中骨（主脈）、茎、根を０．２〜０．３ｇずつサンプリングし、実施例１（１）と同様に、ＦａｓｔＲＮＡ−Ｇｒｅｅｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１）を用いて総ＲＮＡを抽出した。その結果、２５〜１６５μｇの総ＲＮＡが得られ、そのうち１μｇをＲＴ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【００４９】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の定量的発現解析
（２）で得られた総ＲＮＡ（１μｇ）を用いて、逆転写酵素反応を行った。方法は実施例１（２）と同様である。この反応液を滅菌水で５倍に希釈し、そのうち５μＬを鋳型としてＡＢＩＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応にはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。定量する遺伝子のプライマーセットとして、ｎｒｔ１．１およびｎｒｔ１．２を増幅するためのプライマーセット、即ち、配列番号９と配列番号１０、配列番号１３と配列番号１４、配列番号１７と配列番号１８、および配列番号２１と配列番号２２を使用した。また、内部標準としてアクチン遺伝子を増幅する合成プライマーを用いた。
【００５０】
その結果を図１に示した。図１中、Ｌ１は上位葉ラミナ、Ｌ２は下位葉ラミナ、Ｍ１は上位葉中骨、Ｍ２は下位葉中骨、Ｓは茎、Ｒは根を示す。ｎｒｔ１．１は根での発現が特に高かったが、葉、中骨、茎といった他の器官でも一様に発現していた。ｎｒｔ１．２は根、茎で高く、葉や中骨ではほとんど発現していなかった。
【００５１】
（４）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の定性的発現解析
各器官におけるｎｒｔ１．１Ａおよびｎｒｔ１．１Ｂ、並びにｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２Ｂの発現様式を検討した。上記（３）の逆転写産物を鋳型に実施例１（２）と同様な方法でＰＣＲを行った。プライマーセットはｎｒｔ１．１Ａとｎｒｔ１．１Ｂ、及びｎｒｔ１．２Ａとｎｒｔ１．２Ｂに共通の配列部分を用いた。ｎｒｔ１．１のＰＣＲ産物はＳａｌＩで、ｎｒｔ１．２のＰＣＲ産物はＳｓｐＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行ってそれぞれＡ、Ｂを区別した。すなわち、ｎｒｔ１．１ＡのＰＣＲ産物はＳａｌＩで消化されるのに対し、ｎｒｔ１．２Ｂは消化されず、同様にｎｒｔ１．２ＢはＳｓｐＩで消化されるのに対し、ｎｒｔ１．２Ａは消化されないことから、アガロースゲル電気泳動により両者を区別した。結果を図２に示した。図２中、Ｌ１は上位葉ラミナ、Ｌ２は下位葉ラミナ、Ｍ１は上位葉中骨、Ｍ２は下位葉中骨、Ｓは茎、Ｒは根を示す。根、茎および中骨ではｎｒｔ１．１Ｂの発現が顕著に高く、ラミナではｎｒｔ１．１Ｂよりもｎｒｔ１．１Ａの発現の方が高い傾向であった。一方、ｎｒｔ１．２Ａは根、茎、中骨で高く、上位葉ラミナではｎｒｔ１．２Ｂの方が高かった。以上の結果から、ｎｒｔ１．１およびｎｒｔ１．２は器官によりそれぞれ異なった分子種の遺伝子が優先的に発現していることが明らかとなった。
【００５２】
このような実施例により、即ち、ニコチアナ タバカム ｃｖ．バーレー２１について、水耕液で栽培した後、各器官から継時的に総ＲＮＡを抽出し、本発明の遺伝子特異的配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｍＲＮＡの発現量を定量的に調べることで本発明の遺伝子の発現様式を確認できた。
【００５３】
実施例３．低親和性硝酸輸送遺伝子の発現解析２
（１）バーレー２１の水耕栽培
播種後１ヶ月の幼苗を２５℃の温室内において、硝酸イオン濃度の異なる水耕液（０．１、１，５および１０ｍＭ）で２週間栽培した後、実施例２（２）と同様の方法で葉（上位葉、中位葉および下位葉）、茎、根から総ＲＮＡを抽出した。水耕液の硝酸カリウム以外の組成は実施例１（１）と同様である。
【００５４】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の定量的発現解析
実施例２（３）と同様の方法で定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーセットは本発明のｎｒｔ１．１、ｎｒｔ１．２、及び高親和性硝酸輸送遺伝子（Ｎｒｔ２：１）、さらに内部標準としてアクチン遺伝子に特異的な配列を用いた。Ｎｒｔ２：１は、ニコチアナ プランパギニフォリアの高親和性硝酸輸送遺伝子（Ｎｒｔ２：１Ｎｐ， Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｖｏｌ． ３４， ２６５−２７４， １９９７， ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｙ０８２１０）をもとに、定法によりニコチアナ タバカム ｃｖ バーレー２１から単離した。その結果を表１に示す。ｎｒｔ１．１は硝酸イオン濃度の違いに伴い若干発現量に変動が見られるものの、各器官で一様に発現していた。葉でのｎｒｔ１．２発現量は非常に低いレベルであり、さらに硝酸イオン濃度により大きな変化はなかった。茎、根では０．５ｍＭで発現量は低かったのに対し、１ｍＭ以上の硝酸イオン濃度では顕著に発現が高かった。一方、高親和性硝酸輸送遺伝子（Ｎｒｔ２：１）は根でのみ発現が認められ、さらに０．５ｍＭでの発現量が高く、１０ｍＭでは約１／１４しか発現していなかった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
このような実施例により、即ち、ニコチアナ タバカム ｃｖ．バーレー２１を硝酸イオン濃度の異なる水耕液で栽培した後、各器官から継時的に総ＲＮＡを抽出し、本発明の遺伝子特異的配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｍＲＮＡの発現量を定量的に調べることにより、本発明の遺伝子の発現様式を確認できた。
【００５７】
実施例４．低親和性硝酸輸送遺伝子の発現解析３
（１）バーレー２１の水耕栽培
播種後１ヶ月の幼苗を２５℃の温室内において、実施例１（１）に示した水耕液で１０日間栽培した後、硝酸イオン濃度の異なる水耕液（０ｍＭおよび５ｍＭ）で１週間栽培し、さらに５ｍＭ、０ｍＭおよび０．２ｍＭの硝酸イオンを含む水耕液に移して経時的に根を採取してそれぞれから総ＲＮＡを抽出した。
【００５８】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の定量的発現解析
実施例２（３）と同様の方法で本発明のｎｒｔ１．１とｎｒｔ１．２について定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。内部標準としてはＡＴＰシンターゼ遺伝子を用いた。
【００５９】
その結果を図３に示す。図３中、黒丸は５ｍＭ硝酸濃度で継続して栽培した場合、白丸は５ｍＭ硝酸濃度から無窒素状態に移した場合、白三角は無窒素状態から０．２ｍＭ硝酸濃度に移した場合、黒三角は無窒素状態から５ｍＭ硝酸濃度に移した場合を示した。図の横軸はタバコを新たな水耕液に移した時からの経過時間を表している。ｎｒｔ１．１は０時間目では発現量に明確な差はなかったが、硝酸イオン濃度を０ｍＭから５ｍＭに替えると１時間で顕著に発現が高まり、その後減少して一定のレベルを維持した。０ｍＭから０．２ｍＭに替えた時は若干発現量が高まるものの、５ｍＭに替えた時と比べて劇的な変化はなかった。５ｍＭで栽培を継続したとき、あるいは５ｍＭから無窒素状態にしたときは発現量に大きな変化はなかった。一方、ｎｒｔ１．２は０時間では無窒素状態で発現量が顕著に低く、硝酸イオンを投与した場合、１〜２時間で発現が誘導されたが、０．２ｍＭと５ｍＭとの間での差異は認められなかった。また、５ｍＭから無窒素状態に替えた場合、１時間で発現量は顕著に減少し、その後低いレベルで推移した。
【００６０】
以上のことから、ｎｒｔ１．１は硝酸イオンの有無に関わらず発現していることから構成的発現をしており、また、高濃度の硝酸イオンで特に発現が誘導されることから低親和性の機能を有するものと考えられた。ｎｒｔ１．２は無窒素状態ではほとんど発現しておらず、硝酸イオンの投与により増大することから硝酸イオン誘導性であることが示唆された。
【００６１】
このような実施例により、即ち、ニコチアナ タバカム ｃｖ．バーレー２１を様々な条件で栽培した後、各器官から継時的に総ＲＮＡを抽出し、本発明の遺伝子特異的配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｍＲＮＡの発現量を定量的に調べることにより、本発明の遺伝子の発現様式を確認できた。
【００６２】
実施例５．低親和性硝酸輸送遺伝子の発現量と硝酸イオン含量との関係
（１）形質転換培養細胞の作出
過剰発現用のコンストラクト（ｐ３５Ｓ−ｎｒｔ１．１Ｂ）は、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）のＧＵＳ遺伝子を除去した部分に、ＰＣＲ増幅したｎｒｔ１．１Ｂの構造遺伝子の両端をブラント化、リン酸化した後に挿入して構築した。これによりｎｒｔ１．１Ｂはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターの下流に結合された。ｐ３５Ｓ−ｎｒｔ１．１Ｂはエレクトロポーレーション法によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株に導入し、これをタバコＢＹ２培養細胞に感染させることにより遺伝子を導入した。コントロールとしてベクターｐＢＩ１２１も同様に培養細胞に導入した。カナマイシン２００ｐｐｍを含む培地で形質転換体を選抜し多数の遺伝子導入株を得た。導入した遺伝子が発現している培養細胞系統を選抜するために，得られた全てのカルスから総ＲＮＡを抽出し、実施例２（３）と同様に定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、内在性ｎｒｔ１．１Ｂの発現量に比べ、全ｎｒｔ１．１の発現量が増大した培養細胞系統が得られ（図４）、これらのうち６系統（Ｓ１−５、Ｓ１−８、Ｓ１−１８、Ｓ３−５、Ｓ３−７およびＳ３−１０）を懸濁培養化した。図４中、白丸は野生株（ｗｔ）を、白三角はｐＢＩ１２１で形質転換した培養細胞である。
【００６３】
（２）タバコ培養細胞の維持と細胞内硝酸イオン含量の測定
形質転換タバコＢＹ２培養細胞は懸濁培養化し、５０ｍｌの改変ＭＳ培地（０．２ｇ／ｍｌ リン酸二水素カリウム，１μｇ／ｍｌ ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ，０．２μｇ／ｍｌ ２，４−Ｄ，３％ ｓｕｃｒｏｓｅ，５０μｇ／ｍｌ カナマイシン，ｐＨ５．８）で２５℃、１２０ｒｐｍで回転培養し、７日ごとに１ｍｌの飽和培養細胞液を継代した。硝酸含量測定に用いる培養細胞は、カナマイシンを含まない上記培地に継代培養を２〜３回繰り返したものを新たな液体培地に継代し、５〜７日経過したものを用いた。培養細胞を集め、硝酸イオンを含まない緩衝液（５ｍＭ ＭＥＳ，３ｍＭ ＣａＣｌ２，１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４，３％ ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ６．０）で３〜４回洗浄し、最後に０．４５μｍの遠心濾過チューブ（ＵＦＣ４０ＨＶ２５，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いてさらに遠心洗浄した。集めた培養細胞から総ＲＮＡを抽出し、さらに１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で培養細胞を磨砕して細胞内の硝酸含量測定用試料とした。総ＲＮＡからは定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い遺伝子の発現量を、磨砕抽出液はサリチル酸−硫酸法にて硝酸含量を測定した（図５）。図５中、白丸は野生株（ｗｔ）を、白三角はｐＢＩ１２１で形質転換した培養細胞である。その結果、全ｎｒｔ１．１発現量と細胞内硝酸含量の間には高い正の相関が認められた。また、発現量の高かったＳ１−１８、Ｓ３−１０の２系統について同様の反復実験を行った（図６）。試験は３反復行った。以上の結果から、本発明のｎｒｔ１．１Ｂは硝酸輸送活性を有しているものと判断された。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、その機能や発現様式が明かとなったニコチアナ属由来の硝酸輸送遺伝子が提供された。
【００６５】
本発明を用い、目的とする対象の遺伝子を操作することによって、硝酸イオン吸収能を増大すること、または削減した植物を育種することが可能になる。また、低栄養な土壌でも生育可能な植物の育種を得ることが可能になる。更に、植物中の硝酸含量をコントロールして品質の向上した植物の育種が可能になる。
【００６６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】水耕栽培したニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１の各器官でのｎｒｔ１．１，およびｎｒｔ１．２ ｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した結果を示すグラフ。
【図２】水耕栽培したニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１の各器官でのｎｒｔ１．１Ａ、ｎｒｔ１．１Ｂ、ｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２ＢのｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲで比較した結果を示す電気泳動写真。
【図３】硝酸濃度の異なった栽培条件におけるニコチアナ タバカム ｃｖ． バーレー２１の根でのｎｒｔ１．１，ｎｒｔ１．２ ｍＲＮＡ発現量の変化を示したグラフ。
【図４】ｐ３５Ｓ−ｎｒｔ１．１Ｂを導入したタバコＢＹ２培養細胞の全ｎｒｔ１．１発現量と内在性ｎｒｔ１．１Ｂ発現量の関係を示したグラフ。
【図５】一次選抜した形質転換ＢＹ２培養細胞の全ｎｒｔ１．１発現量と細胞内硝酸含量の関係を示したグラフ。
【図６】外来遺伝子の高発現株Ｓ１−１８，Ｓ３−１０の全ｎｒｔ１．１発現量と細胞内硝酸含量を測定した結果を示すグラフ。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a nitrate transport protein involved in the process by which a plant absorbs nitrate ions from the outside world, and furthermore, the transport of absorbed nitrate ions between cells in a plant, and a gene encoding the same.
[0002]
[Prior art]
The nitrate transport gene includes a low-affinity nitrate transport gene that works when the nitrate ion concentration is high (ie, 0.5 mM or more) and a high-affinity nitrate transport gene that works when the nitrate ion concentration is low (ie, 0.5 mM or less). (Chemistry and Biology, Vol. 38, p196-203, 2000). So far, research at the gene level has progressed, and as a plant-derived low affinity nitrate transport gene, Arabidopsis-derived CHL1 (AtNRT1) (Cell, vol. 72, p705-713, 1993, The Plant Cell, vol. 8, p2183). -2191, 1996), NTL1 (AtNRT1: 2) (The Plant Cell vol. 11, p1381392, 1999), OsNRT1 derived from rice (Plant Physiol. Vol. 122, p379-388, 2000), BnNRT1 derived from oilseed rape : 2 (J. Biol. Chem. Vol. 273, p12017, 1998), LeNRT1 derived from tomato (Proc. Natl. Acad. Sci. USA VOL. 93, p8139-8144). 1996). It has been reported that CHL1 has both low-affinity and high-affinity functions (The Plant Cell vol. 11, p865-874, 1999). Among these genes, those whose nitrate ion transport activity has been experimentally confirmed are CHL1, NTL1 and OsNRT1. In addition, a number of other genes having homology at the gene level have been isolated, but their nitrate transport activity has not been measured, and no clear confirmation that they are nitrate transport genes has been made.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a nitrate transport gene derived from Nicotiana.
[0004]
As a result, if the nitrate transport gene of Nicotiana is isolated and its function and expression mode are elucidated, it will be possible to breed plants that manipulate the gene and increase or decrease its ability to absorb nitrate ions. . Furthermore, breeding of plants that can grow even in low-nutrition soil, or breeding of plants with improved quality by reducing the nitrate content in the plants is expected.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent studies, the present inventors have found that Nicotiana Tabacam cv. Burley 21 Root, or Nicotiana Tabacum cv. The low-affinity nitrate transport gene was cloned from the total RNA of Bright Yellow 4 leaves by RT-PCR, the nucleotide sequence was determined, and the present invention was achieved based on the knowledge.
[0006]
That is, the present invention provides an oligonucleotide represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7, and a complementary strand thereof.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
1. Low affinity nitrate transport gene
As described above, the present inventors have proposed Nicotiana Tabacam cv. Burley 21, or Nicotiana Tabacum cv. A low-affinity nitrate transport gene was cloned and isolated by RT-PCR from total RNA of each organ of Bright Yellow No. 4 (for example, mesophyll, middle bone, stem, root, etc.), and its nucleotide sequence was determined.
[0008]
The gene encoding the low-affinity nitrate transport protein according to the present invention is represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7, and their complementary chains. And an oligonucleotide comprising a base sequence encoding the amino acid set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 8.
[0009]
Further, the present invention provides an oligonucleotide represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7, and a complementary strand thereof.
[0010]
Further, the oligonucleotide encoding the low-affinity nitrate transport protein according to the present invention may have some bases substituted or deleted in its base sequence, or some bases may be further added. Well, and may be chemically modified. Such oligonucleotides are also included in the scope of the present invention.
[0011]
As used herein, the term "oligonucleotide" refers to one that contains a plurality of nucleotides and is represented by a specific base sequence, whether synthetic or natural, or DNA or RNA.
[0012]
Oligonucleotides according to the present invention may be used as genes per se or as expression controlling genes such as desired promoters, enhancer silencers and attenuators, and drug resistance factors, green fluorescent protein, phycocyanin and horseradish peroxidase, etc. Oligonucleotides in a form to which the above marker gene has been added may be used as the gene. Such oligonucleotides are also included in the scope of the present invention. The target for introducing such a gene may be a vector such as a phage or a plasmid, a virus, a cell, a tissue, a plant, an animal, or the like, and the target into which such a gene has been introduced is also provided as the present invention. Is done. Further, such a gene can be introduced by a means known per se.
[0013]
For example, a gene according to the present invention may be introduced into a desired subject to express or enhance the expression of a low affinity nitrate transport gene, or to produce a low affinity nitrate transport protein, It may be used to increase the production of transport proteins.
[0014]
Alternatively, for example, by introducing an oligonucleotide according to the present invention as a gene into a plant, a plant capable of controlling the ability to absorb nitrate ions and transport it to other cells can be bred. For example, the present invention can be used for breeding viable plants or for breeding plants with improved quality by reducing the nitric acid content in the plants, even in poorly nutrient soil.
[0015]
According to the present invention, there is also provided an oligonucleotide fragment containing a desired part of a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7, and a complementary strand thereof. Such an oligonucleotide fragment can be used, for example, as a probe for detecting the oligonucleotide of the present invention, a primer for amplifying the oligonucleotide of the present invention, or the like.
[0016]
For example, when such an oligonucleotide fragment is used as a probe, about 200 contiguous base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7, and the complementary strand thereof are used. It may be from about 1000 bases to about 1000 bases, preferably about 500 bases to about 800 bases.
[0017]
When such an oligonucleotide fragment is used as a primer in an amplification reaction, it may be designed from a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7, and a complementary strand thereof. Good. For example, it can be designed to be around 20 mer, preferably 22 to 25 mer, GC content is 40 to 60%, and Tm value is 60 ° C. or more.
[0018]
Although not limited thereto, preferred primers include, for example, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 and an oligonucleotide comprising a base sequence represented by a complementary strand thereof. Hereinafter, each arrangement will be described.
[0019]
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 are a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
[0020]
SEQ ID NO: 9 is a sequence consisting of the 1st to 24th bases of the base of SEQ ID NO: 1, and can be used as a sense primer in a polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR), for example. SEQ ID NO: 10 is the complementary strand of a sequence consisting of the nucleotides from position 1773 to position 1750 of the nucleotide of SEQ ID NO: 1, and can be used, for example, as an antisense primer for PCR together with, for example, SEQ ID NO: 9.
[0021]
SEQ ID NO: 11 is a sequence consisting of nucleotides from positions 1653 to 1675 of the nucleotides of SEQ ID NO: 1, and can be used as a sense primer in a reverse transcription polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as RT-PCR), for example. . SEQ ID NO: 12 is a complementary strand of a sequence consisting of nucleotides from position 1762 to position 1741 of the nucleotide of SEQ ID NO: 1, and can be used, for example, as an antisense primer for RT-PCR, for example, together with SEQ ID NO: 9 .
[0022]
SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 are part of the base sequence of SEQ ID NO: 3.
[0023]
SEQ ID NO: 13 is a sequence consisting of the 1st to 24th bases of the base of SEQ ID NO: 3, and can be used as a sense primer in PCR, for example. SEQ ID NO: 14 is a complementary strand of a sequence consisting of the nucleotides from position 1773 to position 1750 of the nucleotides of SEQ ID NO: 3, and can be used, for example, as an antisense primer for PCR together with, for example, SEQ ID NO: 13.
[0024]
SEQ ID NO: 15 is a sequence consisting of the nucleotides at positions 1653 to 1675 of the nucleotides of SEQ ID NO: 3, and can be used as a sense primer in RT-PCR, for example. SEQ ID NO: 16 is a complementary strand of a sequence consisting of the nucleotides at positions 1762 to 1741 of the nucleotides of SEQ ID NO: 1, and can be used, for example, as an antisense primer for RT-PCR, for example, together with SEQ ID NO: 15 .
[0025]
SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 are a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
[0026]
SEQ ID NO: 17 is a sequence consisting of the first to 22nd nucleotides of SEQ ID NO: 5, and can be used, for example, as a sense primer in PCR. SEQ ID NO: 18 is a complementary strand of a sequence consisting of the nucleotides at positions 1785 to 1763 of SEQ ID NO: 5, and can be used, for example, as an antisense primer for PCR together with, for example, SEQ ID NO: 17.
[0027]
SEQ ID NO: 19 is a sequence consisting of the nucleotides from position 394 to position 416 of the nucleotides of SEQ ID NO: 5, and can be used as a sense primer in RT-PCR, for example. SEQ ID NO: 20 is a complementary strand of a sequence consisting of the nucleotides from positions 544 to 523 of SEQ ID NO: 5, and can be used, for example, as an antisense primer for RT-PCR, for example, together with SEQ ID NO: 19 .
[0028]
SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 are a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
[0029]
SEQ ID NO: 21 is a sequence consisting of the first to 22nd nucleotides of SEQ ID NO: 7, and can be used as a sense primer in PCR, for example. SEQ ID NO: 22 is a complementary strand of a sequence consisting of the nucleotides from position 1785 to position 1763 of the nucleotide of SEQ ID NO: 7, and can be used, for example, as an antisense primer for PCR, for example, together with SEQ ID NO: 21.
[0030]
SEQ ID NO: 23 is a sequence consisting of the nucleotides from position 394 to position 417 of the nucleotide of SEQ ID NO: 7, and can be used as a sense primer in RT-PCR, for example. SEQ ID NO: 24 is a complementary strand of a sequence consisting of the nucleotides from positions 394 to 417 of the nucleotides of SEQ ID NO: 7, and can be used, for example, as an antisense primer for RT-PCR, for example, together with SEQ ID NO: 23 .
[0031]
In addition, the above-described oligonucleotide fragment may further have an arbitrary sequence, if desired, or may have an arbitrary labeling substance, and a part thereof may be chemically modified. .
[0032]
Oligonucleotides and oligonucleotide fragments selected from the group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7 and the complementary strands thereof provided in accordance with the present invention are plants of the genus Nicotiana, Preferably, Nicotiana Tabacam cv. Burley 21, or Nicotiana Tabacum cv. It may be isolated and purified from Bright Yellow No. 4 by a method known per se, and may be amplified as desired. Alternatively, it may be artificially synthesized by a nucleic acid synthesis means known per se.
[0033]
Oligonucleotides selected from the group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 and their complementary strands provided in accordance with the present invention, and oligonucleotide fragments that are a part thereof, May be used as an antisense to inhibit expression of a low affinity nitrate transport gene in a subject. Such antisense is also included in the scope of the present invention.
[0034]
An example of the antisense according to the present invention may be the full-length antisense of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7, but about 25% or more of the continuous The effect can be obtained if the fragment is antisense.
[0035]
The method of using antisense according to the present invention may use any means known per se.
[0036]
Subjects such as cells, tissues and plants treated with such antisense are also included in the scope of the present invention. Also, a method for inhibiting a low affinity nitrate transport gene using an antisense according to the present invention is within the scope of the present invention.
[0037]
2. Low affinity nitrate transport protein
According to the present invention, there are provided proteins and polypeptides represented by the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8. These sequences are substantially amino acid sequences indicative of a low affinity nitrate transport protein.
[0038]
According to the present invention, the protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 8 may have some amino acids substituted or deleted, In addition, some amino acids may be further added, or may be chemically modified. Such modified proteins and modified polypeptides are also included in the scope of the present invention.
[0039]
Further, the polypeptide provided according to the present invention has an amino acid sequence that is at least about 60% homologous to the polypeptide represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. It may be a polypeptide having
[0040]
The low-affinity nitrate transport protein according to the present invention may be a protein production method known per se using any Escherichia coli or cells.
[0041]
The gene of the present invention may also be inserted into a conventional plasmid vector according to a conventional method, and then inserted into host cells, for example, prokaryotic cells including cells such as Escherichia coli, and lower eukaryotic cells including unicellular hosts such as yeast. Cells and higher eukaryotic cells such as silkworms can be transformed and amplified. As a specific example, as shown in Example 5 described above, a plasmid in which the nitrate ion transport activity of the gene of the present invention is linked to the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) is introduced into cultured cells BY2. This was confirmed by Alternatively, the mRNA of the gene of the present invention synthesized in Xenopus oocytes can be directly introduced, and the transport ability can be measured electrophysiologically in a nitrate ion solution. Furthermore, the activity of the gene of the present invention can be confirmed by introducing the gene of the present invention into yeast or the like lacking the nitrate transport ability and complementing the nitrate transport ability.
[0042]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
[0043]
Embodiment 1 FIG. Isolation of low-affinity nitrate transport gene
(1) Nicotiana Tabacam cv. Extraction of total RNA from Burley 21
Standard hydroponic solution (5 mM KNO 3 2.5 mM potassium phosphate buffer (pH 5.5), 2 mM MgSO 4 , 2 mM Ca (NO 3 ), 0.05 mM Fe-EDTA, 70 μM H 3 BO 3 , 14 μM MnCl 2 0.5 μM CuSO 4 1 μM ZnSO 4 , 0.2 μM NaMoO 4 , 10 μM NaCl, 0.01 μM CoCl 2 ) Grown for 2-3 weeks in Nicotiana tabacum cv. The roots of Burley 21 (Nicotiana tabacum cv. Burley 21) were subjected to the preparation of total RNA. 0.5 g of the root was placed in a tube of Fast RNA-Green Kit (BIO101), which was set on a FastPrep FP120 apparatus and ground. Further, total RNA was obtained according to the attached protocol.
[0044]
(2) Isolation of low affinity nitrate transport gene by RT-PCR
Using the total RNA obtained in the above (1) as a template, a reverse transcription reaction was performed. That is, 1 to 2 μg of total RNA, 10 × RT buffer, dNTPs having a final concentration of 0.5 mM, 10 dmoles of oligo dT (15) primer, 10 units of RNase inhibitor (Applied Biosystems), Omniscript Reverse Transcriptase 1 unit of 10 units of Omniscript Reverse Transcriptase After preparing with RNase-free water, a reverse transcription reaction was performed at 37 ° C. for 60 minutes, followed by treatment at 93 ° C. for 5 minutes to inactivate the enzyme. Next, PCR was performed using a part of the reaction solution as a template. That is, after adjusting the reaction solution to 5 μL, 10 × buffer solution 10 μL, final concentration 0.2 mM dNTP, 10 pmoles primer set, and 5 units of Ex-Taq DNA polymerase (TaKaRa), a total of 50 μL, and then a thermal cycler (GeneAmp PCR) Using System 9700), the reaction was performed at 94 ° C. for 2 minutes as one cycle, 94 ° C. for 30 seconds → 55 ° C. for 30 seconds → 72 ° C. for 1.5 minutes, and 72 ° C. for 7 minutes as one cycle. Was. The sequences of the primer set were N-1 (5'-ATGGCACTTC CTGAAACACA ACAA-3 ') and N-2 (5'-TTAGTGGCAA GCTGGTTCTG AATC-3') shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3 And two sets of N-3 (5'-ATGGCACTTC CTGAGACACA GC-3 ') and N-4 (5'-TCAATGACA AACCGGTCCA TCAT-3') shown in SEQ ID NO: 4.
[0045]
Using two primer sets, N-1 and N-2 and N-3 and N-4, a PCR product of about 1.8 kb was amplified. Each amplification product was purified by agarose gel electrophoresis and cloned into pUC19 (TaKaRa). Plasmid DNA was extracted from dozens of E. coli colonies, labeled with BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitv2.0 (Applied Biosystems), and then subjected to ABI PRISM 3700 to analyze the base sequence. As a result, it was found that two molecular species were amplified by each primer set. The nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7. The names of the respective sequences were nrt1.1A, nrt1.1B, nrt1.2A, and nrt1.2B.
[0046]
Thus, the gene according to the present invention is Nicotiana tabacum cv. It could be isolated from the total RNA of each organ of Burley 21, such as mesophyll, bone, stem and root, by RT-PCR.
[0047]
Embodiment 2. FIG. Expression analysis of low affinity nitrate transport gene 1
(1) Hydroponics of Burley 21
One month after seeding, the seedlings were cultivated in a standard hydroponic solution (nitrate concentration 9 mM) for 2 weeks in a greenhouse at 25 ° C. The composition of the standard hydroponic solution was the same as in Example 1, and the hydroponic solution was replaced with a new one every week. Further, air was supplied into the hydroponic solution with an air pump.
[0048]
(2) Extraction of total RNA
0.2 to 0.3 g of each leaf, middle bone (main vein), stem, and root were sampled from the hydroponic tobacco, and the FastRNA-Green Kit (BIO 101) was used as in Example 1 (1). Total RNA was extracted. As a result, 25 to 165 μg of total RNA was obtained, of which 1 μg was used as a template for RT-PCR.
[0049]
(3) Quantitative expression analysis of low-affinity nitrate transport gene by RT-PCR
Using the total RNA (1 μg) obtained in (2), a reverse transcriptase reaction was performed. The method is the same as in Example 1 (2). This reaction solution was diluted 5-fold with sterile water, and quantitative PCR was performed using ABIPRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) with 5 μL as a template. The SYBR Green PCR Core Reagents Kit (Applied Biosystems) was used for the PCR reaction, and the method followed the attached protocol. As a primer set of the gene to be quantified, a primer set for amplifying nrt1.1 and nrt1.2, that is, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 were used. In addition, a synthetic primer for amplifying the actin gene was used as an internal standard.
[0050]
The result is shown in FIG. In FIG. 1, L1 indicates upper leaf lamina, L2 indicates lower leaf lamina, M1 indicates upper leaf middle bone, M2 indicates lower leaf middle bone, S indicates stem, and R indicates root. nrt1.1 was particularly highly expressed in roots, but was uniformly expressed in other organs such as leaves, bones and stems. nrt1.2 was high in roots and stems, and hardly expressed in leaves and bones.
[0051]
(4) Qualitative expression analysis of low affinity nitrate transport gene by RT-PCR
The expression patterns of nrt1.1A and nrt1.1B, and nrt1.2A and nrt1.2B in each organ were examined. PCR was performed in the same manner as in Example 1 (2) using the reverse transcript of the above (3) as a template. As a primer set, a sequence portion common to nrt1.1A and nrt1.1B and nrt1.2A and nrt1.2B was used. The PCR product of nrt1.1 was digested with SalI and the PCR product of nrt1.2 was digested with SspI, and A and B were distinguished by agarose gel electrophoresis. That is, since the PCR product of nrt1.1A is digested with SalI, nrt1.2B is not digested. Similarly, nrt1.2B is digested with SspI, whereas nrt1.2A is not digested. The two were distinguished by agarose gel electrophoresis. The results are shown in FIG. In FIG. 2, L1 indicates upper leaf lamina, L2 indicates lower leaf lamina, M1 indicates upper leaf middle bone, M2 indicates lower leaf middle bone, S indicates stem, and R indicates root. The expression of nrt1.1B was remarkably high in roots, stems and bones, and the expression of nrt1.1A tended to be higher in lamina than in nrt1.1B. On the other hand, nrt1.2A was higher in roots, stems and midbones, and in upper leaf lamina, nrt1.2B was higher. From the above results, it was revealed that nrt1.1 and nrt1.2 preferentially express genes of different molecular species depending on the organ.
[0052]
According to such an embodiment, namely Nicotiana Tabacam cv. About Burley 21, after cultivation in a hydroponic solution, total RNA was successively extracted from each organ, and RT-PCR was performed using the gene-specific sequence of the present invention as a primer to quantitatively determine the expression level of mRNA. The examination confirmed the expression mode of the gene of the present invention.
[0053]
Embodiment 3 FIG. Expression analysis of low affinity nitrate transport gene 2
(1) Hydroponics of Burley 21
One month after seeding, the seedlings were cultivated in a greenhouse at 25 ° C. for 2 weeks in hydroponic solutions (0.1, 1, 5 and 10 mM) having different nitrate ion concentrations, and then subjected to the same method as in Example 2 (2). Total RNA was extracted from the leaves (upper, middle and lower leaves), stem and root. The composition of the hydroponic solution other than potassium nitrate is the same as in Example 1 (1).
[0054]
(2) Quantitative expression analysis of low-affinity nitrate transport gene by RT-PCR
Quantitative RT-PCR was performed in the same manner as in Example 2 (3). The primer set used nrt1.1, nrt1.2, and the high-affinity nitrate transport gene (Nrt2: 1) of the present invention, and a sequence specific to the actin gene as an internal standard. Nrt2: 1 is a standard method based on the high-affinity nitrate transport gene of Nicotiana planpaginifolia (Nrt2: 1Np, Plant. Mol. Bio. Vol. 34, 265-274, 1997, GeneBank Accession No. Y08210). Was isolated from Nicotiana Tabacum cv Burleigh 21. Table 1 shows the results. nrt1.1 was uniformly expressed in each organ, although the expression level varied slightly with the difference in nitrate ion concentration. The expression level of nrt1.2 in the leaves was at a very low level, and there was no significant change with the nitrate ion concentration. In the stem and root, the expression level was low at 0.5 mM, whereas the expression level was remarkably high at a nitrate ion concentration of 1 mM or more. On the other hand, the high-affinity nitrate transport gene (Nrt2: 1) was expressed only in the root, and the expression level was high at 0.5 mM, and only about 1/14 was expressed at 10 mM.
[0055]
[Table 1]
[0056]
According to such an embodiment, namely Nicotiana Tabacam cv. After culturing Burley 21 in hydroponic solution having a different nitrate ion concentration, total RNA was successively extracted from each organ, RT-PCR was performed using the gene-specific sequence of the present invention as a primer, and the mRNA expression level was determined. Was quantitatively examined, whereby the expression mode of the gene of the present invention could be confirmed.
[0057]
Embodiment 4. FIG. Expression analysis of low affinity nitrate transport gene 3
(1) Hydroponics of Burley 21
One month after seeding, the seedlings were cultivated for 10 days in the hydroponic solution shown in Example 1 (1) in a greenhouse at 25 ° C., and then cultivated for 1 week in hydroponic solutions (0 mM and 5 mM) having different nitrate ion concentrations. Then, the cells were transferred to a hydroponic solution containing 5 mM, 0 mM, and 0.2 mM nitrate ions, and the roots were collected with time to extract total RNA from each.
[0058]
(2) Quantitative expression analysis of low-affinity nitrate transport gene by RT-PCR
Quantitative RT-PCR was performed on nrt1.1 and nrt1.2 of the present invention in the same manner as in Example 2 (3). The ATP synthase gene was used as an internal standard.
[0059]
The result is shown in FIG. In FIG. 3, solid circles indicate that the cultivation was continued at a concentration of 5 mM nitric acid, white circles indicate that the nitrogen-free state was transferred from the 5 mM nitric acid concentration, white triangles indicate that the nitric acid was moved from the nitrogen-free state to 0.2 mM nitric acid, Indicates the case where the nitrogen-free state was changed to a concentration of 5 mM nitric acid. The horizontal axis of the figure represents the elapsed time since the tobacco was transferred to the new hydroponic solution. Although nrt1.1 had no clear difference in the expression level at the 0th hour, the expression increased remarkably in 1 hour when the nitrate ion concentration was changed from 0 mM to 5 mM, and thereafter decreased and maintained at a constant level. Although the expression level slightly increased when the concentration was changed from 0 mM to 0.2 mM, there was no dramatic change as compared with the case where the concentration was changed to 5 mM. When cultivation was continued at 5 mM, or when the culture was changed from 5 mM to a nitrogen-free state, there was no significant change in the expression level. On the other hand, nrt1.2 showed a remarkably low expression level in a nitrogen-free state at 0 hours, and expression was induced in 1-2 hours when nitrate ions were administered, but the difference between 0.2 mM and 5 mM was observed. Was not found. In addition, when the concentration was changed from 5 mM to a nitrogen-free state, the expression level was remarkably reduced in 1 hour, and thereafter changed to a low level.
[0060]
From the above, nrt1.1 is constitutively expressed since it is expressed irrespective of the presence or absence of nitrate ions. In addition, since the expression is particularly induced by high concentrations of nitrate ions, nrt1.1 has low affinity. It was considered to have a function. nrt1.2 is hardly expressed in a nitrogen-free state, and is increased by administration of nitrate ions, suggesting that it is nitrate ion-inducible.
[0061]
According to such an embodiment, namely Nicotiana Tabacam cv. After cultivating Burley 21 under various conditions, total RNA is extracted from each organ successively, and RT-PCR is performed using the gene-specific sequence of the present invention as a primer to quantitatively examine the expression level of mRNA. This confirmed the expression mode of the gene of the present invention.
[0062]
Embodiment 5 FIG. Relationship between expression level of low affinity nitrate transport gene and nitrate ion content
(1) Production of transformed cultured cells
The construct for overexpression (p35S-nrt1.1B) was inserted into the portion of the pBI121 (Clonetech) from which the GUS gene had been removed, after blunting and phosphorylating both ends of the PCR-amplified nrt1.1B structural gene. It was constructed. This bound nrt1.1B downstream of the cauliflower mosaic virus 35S (CaMV35S) promoter. p35S-nrt1.1B was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain by electroporation, and this was transfected into tobacco BY2 cultured cells to introduce a gene. As a control, the vector pBI121 was similarly introduced into the cultured cells. Transformants were selected on a medium containing 200 ppm of kanamycin to obtain a number of transgenic strains. In order to select a cultured cell line expressing the introduced gene, total RNA was extracted from all the obtained calli, and quantitative RT-PCR was performed in the same manner as in Example 2 (3). As a result, a cultured cell line in which the expression level of all nrt1.1 was increased as compared with the expression level of endogenous nrt1.1B was obtained (FIG. 4), and among these, 6 lines (S1-5, S1-8, S1) -18, S3-5, S3-7 and S3-10) were cultured in suspension. In FIG. 4, open circles indicate cultured cells transformed with a wild strain (wt), and open triangles indicate cultured cells transformed with pBI121.
[0063]
(2) Maintenance of cultured tobacco cells and measurement of intracellular nitrate content
The transformed tobacco BY2 cultured cells were cultured in suspension, and 50 ml of a modified MS medium (0.2 g / ml potassium dihydrogen phosphate, 1 μg / ml thamine-HCl, 0.2 μg / ml 2,4-D, 3% sucrose) , 50 μg / ml kanamycin, pH 5.8) at 25 ° C. and 120 rpm, and 1 ml of a saturated culture cell solution was passaged every 7 days. Cultured cells used for the nitrate content measurement were obtained by repeating subculture twice or three times on the above-mentioned medium without kanamycin and subcultured to a new liquid medium, and used for 5 to 7 days. The cultured cells were collected, and a buffer (5 mM MES, 3 mM CaCl 2) containing no nitrate ion was used. 2 , 1.5 mM MgSO 4 , 3% sucrose, pH 6.0) three to four times, and finally further centrifugally washed using a 0.45 μm centrifugal filtration tube (UFC40HV25, MILLIPORE). Total RNA was extracted from the collected cultured cells, and the cultured cells were further ground with a 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) to obtain a sample for measuring the nitrate content in the cells. From the total RNA, quantitative RT-PCR was performed to measure the gene expression level, and the crushed extract was measured for the nitrate content by the salicylic acid-sulfuric acid method (FIG. 5). In FIG. 5, open circles indicate cultured cells transformed with the wild strain (wt), and open triangles with pBI121. As a result, a high positive correlation was observed between the total nrt1.1 expression level and the intracellular nitrate content. In addition, the same repetitive experiment was performed on two lines S1-18 and S3-10 which had high expression levels (FIG. 6). The test was performed in triplicate. From the above results, it was determined that nrt1.1B of the present invention had nitrate transport activity.
[0064]
【The invention's effect】
According to the present invention, a nitrate transport gene derived from the genus Nicotiana whose function and expression mode have been clarified has been provided.
[0065]
By manipulating the gene of the target using the present invention, it becomes possible to breed a plant whose nitrate ion absorption capacity has been increased or whose nitrate ion absorption capacity has been reduced. In addition, it is possible to obtain breeding of plants that can grow even in low-nutrition soil. Furthermore, it is possible to breed plants with improved quality by controlling the nitric acid content in the plants.
[0066]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1: Hydroponic cultivation of Nicotiana tabacum cv. The graph which shows the result of having measured nrt1.1 and nrt1.2 mRNA expression level in each organ of Burley 21 by quantitative RT-PCR.
Figure 2: Hydroponic cultivated Nicotiana tabacum cv. 9 is an electrophoretic photograph showing the results of comparing the expression levels of nrt1.1A, nrt1.1B, nrt1.2A, and nrt1.2B mRNA in each organ of Burley 21 by RT-PCR.
FIG. 3. Nicotiana tabacum cv. The graph which showed the change of the nrt1.1, nrt1.2 mRNA expression level in the root of Burley 21.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the total nrt1.1 expression level and the endogenous nrt1.1B expression level in cultured tobacco BY2 cells into which p35S-nrt1.1B has been introduced.
FIG. 5 is a graph showing the relationship between the total nrt1.1 expression level and the intracellular nitrate content of primary selected transformed BY2 cultured cells.
FIG. 6 is a graph showing the results of measuring the total nrt1.1 expression level and intracellular nitrate content of the foreign gene highly expressing strains S1-18 and S3-10.