JP2004290204A - 診断と治療に用いるｈｃｖゲノム配列 - Google Patents

Abstract

【課題】
患者の医療、および血液と血液製剤または対人的な接触によるＨＣＶの伝播の予防には、ＨＣＶに関連する核酸、抗原および抗体を検出するための、信頼できるスクリーニング、診断および予後の手段が必要であり、これらを課題とする。
【解決手段】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中のヌクレオチド配列に対応する８個またはそれ以上のヌクレオチドの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列を有する非天然型の核酸を含み得る組成物を提供する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、以前は血行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＶ）感染症と呼ばれていたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を検出し処置するのに用いる組成物および方法に関する。より具体的には、本発明の実施態様は、ＨＣＶの検出、ＨＣＶ感染症の予防処置用のワクチンの開発、およびＨＣＶに対する受動免疫を伝達する抗体産物の開発のための組成物および方法を特徴とする。

ＨＣＶの原型分離株は、米国特許願第１２２，７１４号（ヨーロッパ特許公開第３１８，２１６号も参照のこと）において特性が記載されている。「ＨＣＶ」という用語には、本願で用いる場合、同じウイルス種の新しい分離株も含まれる。「ＨＣＶ−１」という用語は、米国特許願第１２２，７１４に引用されている。

ＨＣＶは、他の形態のウイルス関連肝臓疾患とは区別できる伝播性の疾患である。他の形態としては、公知の肝炎ウイルス、すなわち、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、およびデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）を原因とする肝臓疾患、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）によって誘発される肝炎が含まれる。ＨＣＶは輸血を受けた個体内で最初に同定された。

ＨＣＶのキャリアー、およびＨＣＶで汚染された血液もしくは血液製剤をスクリーニングおよび同定するために用いられる、鋭敏で特異的な方法が強く要望されている。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は輸血を受けた患者の約１０％に起こり、これらの症例の９０％までがＨＣＶが原因である。この疾患は慢性肝臓障害へ進行することが多い（２５〜５５％）。

患者の医療、および血液と血液製剤または対人的な接触によるＨＣＶの伝播の予防には、ＨＣＶに関連する核酸、抗原および抗体を検出するための、信頼できるスクリーニング、診断および予後の手段が必要である。

本願の情報は、ＨＣＶが複数の遺伝子型を有することを示唆する。すなわち、ＨＣＶウイルスの遺伝情報は、すべてのＨＣＶについて必ずしも全く同一ではなく、異なる遺伝情報を有する複数の群が含まれている。

遺伝情報はＤＮＡとＲＮＡの糸状分子中に記憶される。ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチドの共有結合鎖で構成され、ＲＮＡはリボヌクレオチドの共有結合鎖で構成される。各ヌクレオチドは、４種の塩基：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）のうちの１つによって特徴付けられる。これらの塩基は、官能基の配向のために、特定の塩基対が水素結合とπ−スタッキング相互作用によって互いに引き合って結合するという点で、相補的である。ＤＮＡの一方の鎖の中のアデニンは、対向する相補的な鎖の中のチミンと対を作る。ＤＮＡの一方の鎖の中のグアニンは、対同する相補的な鎖の中のシトシンと対を作る。ＲＮＡ中、チミン塩基はウラシル（Ｕ）で置換され、このウラシルは対向する相補的な鎖の中のアデニンと対を作る。生物の遺伝暗号は塩基対の配列中に保持される。生きている細胞は、核酸の情報を解釈し、転写し、そして翻訳してタンパク質およびペプチドを作る。

ＨＣＶのゲノムはＲＮＡの一本の正鎖で構成される。そのＨＣＶゲノムは、約３０００個のアミノ酸のポリタンパク質をコードする連続したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。ＯＲＦ中において、構造タンパク質はＮ末端領域のほぼ最初の１／４部分にコードされているようであり、ポリタンパク質の大部分は非構造タンパク質に関与している。

ＨＣＶのポリタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端までの間に、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｃ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、ならびに非構造タンパク質（ＮＳ）１、２（ｂ）、３、４（ｂ）、および５を含む。

異なる遺伝子型のＨＣＶには、宿主の免疫系に変化した応答を与えるタンパク質がコードされ得る。異なる遺伝子型のＨＣＶを、このような遺伝子型に対して特異的でない免疫診断法および核酸プローブ法によって検出することは困難であり得る。

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中のヌクレオチド配列に対応する８個またはそれ以上のヌクレオチドの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列を有する非天然型の核酸を含み得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域、およびコア領域からなる領域群から選択され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１配列に対応するヌクレオチド配列が、配列番号２−２２の配列内の配列から選択され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、エンベロープ１領域の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１配列に対応するヌクレオチド配列が、配列番号２４−３２の配列内の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応する少なくとも１つのヌクレオチド配列が、５’ＵＴ領域の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１配列に対応するヌクレオチド配列が、配列番号３４−５１の配列内の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、コア領域の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１配列に対応するヌクレオチド配列が、配列番号５３−６６の配列内の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、Ｃ型肝炎ウイルスの１つまたはそれ以上の遺伝子型に対応するヌクレオチド配列を有し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第１の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第１の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１−６、エンベロープ１領域中の２３−２５、５’ＵＴ領域中の３３−３８、およびコア領域中の５２−５７の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第２の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第２の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号７−１２、エンベロープ１領域中の２６−２８、５’ＵＴ領域中の３９−４５、およびコア領域中の５８−６４の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第３の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第３の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１３−１７、エンベロープ１領域中の３２、５’ＵＴ領域中の４６−４７、およびコア領域中の６５−６６の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第４の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第４の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号２０−２２、エンベロープ１領域中の２９−３１、および５’ＵＴ領域中の４８−４９の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第５の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第５の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１８−１９、および５’ＵＴ領域中の５０−５１の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、Ｃ型肝炎ウイルスに対応するヌクレオチド配列を有する核酸を形成するための核酸の合成反応を開始させ得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ハイブリッド生産物を検出するための標識手段を有し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、溶液からハイブリッド生産物を分離するための支持手段を有し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ウイルスの核酸の転写あるいは翻訳を阻害し得る組成物を提供する。

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸と共にハイブリッド生産物を形成する方法を提供し、以下の工程：
ａ、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノム中の非ＨＣＶ−１配列に対応する８個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する非天然型の核酸を、ハイブリッド形成条件を確立させ得る条件に置く工程であり得、非天然型の核酸が、ハイブリッド形成条件下でＣ型肝炎ウイルスの核酸と共にハイブリッド生産物を形成し得る工程；および
ｂ．ハイブリッド形成条件を確立させて、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸の存在下でハイブリッド生産物を形成する工程、
を包含する方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスのゲノム中の非ＨＣＶ−１配列に対応するヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域、およびコア領域から実質的になる領域群のうち少なくとも１つの領域内の配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域内の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、配列番号２−２２の配列内の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、エンベロープ１領域内の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、配列番号２４−３２の配列内の配列から選択される非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、５’ＵＴ領域内の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、配列番号３４−５１の配列内の配列から選択される非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、コア領域内の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、配列番号５３−６６の配列内の配列から選択される非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、Ｃ型肝炎ウイルスの１つまたはそれ以上の遺伝子型に対応する非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第１の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第１の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１−６、エンベロープ１領域中の２３−２５、５’ＵＴ領域中の３３−３８、およびコア領域中の５２−５７の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第２の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第２の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号７−１２、エンベロープ１領域中の２６−２８、５’ＵＴ領域中の３９−４５、およびコア領域中の５８−６４の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第３の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第３の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１３−１７、エンベロープ１領域中の３２、５’ＵＴ領域中の４６−４７、およびコア領域中の６５−６６の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第４の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第４の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号２０−２２、エンベロープ１領域中の２９−３１、および５’ＵＴ領域中の４８−４９の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第５の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第５の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１８−１９、および５’ＵＴ領域中の５０−５１の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ハイブリッド生産物が、核酸の合成反応を開始させ得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ハイブリッド生産物を検出するための標識手段を有し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、溶液からハイブリッド生産物を分離するための支持手段を有し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ウイルスの核酸の転写あるいは翻訳を阻害し得る方法を提供する。

本発明は、９個またはそれ以上のヌクレオチドの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応する非天然型のポリペプチドを含む組成物を提供し、この９個またはそれ以上のヌクレオチドの配列がＣ型肝炎ウイルスゲノムの配列の中の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、およびコア領域からなる領域群の１つから選択され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域中の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、配列番号２−２２の配列内の配列から選択され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、エンベロープ１領域中の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、配列番号２４−３２の配列内の配列から選択され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、コア領域中の配列に対応し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、配列番号５２−６６の配列内の配列から選択され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、Ｃ型肝炎ウイルスの１つまたはそれ以上の遺伝子型に対応するヌクレオチド配列を有し得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第１の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第１の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１−６、エンベロープ１領域中の２３−２５、およびコア領域中の５２−５７の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第２の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第２の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号７−１２、エンベロープ１領域中の２６−２８、およびコア領域中の５８−６４の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第３の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第３の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１３−１７、エンベロープ１領域中の３２、およびコア領域中の６５−６６の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第４の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第４の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号２０−２２、エンベロープ１領域中の２９−３１、および５’ＵＴ領域中の４８−４９の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第５の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第５の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１８−１９、および５’ＵＴ領域中の５０−５１の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、宿主の中で免疫反応を生じさせ得る組成物を提供する。

本発明は、９個またはそれ以上のヌクレオチドの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応する非天然型のポリペプチドを含む組成物を提供し、この９個またはそれ以上のヌクレオチドの配列がＣ型肝炎ウイルスゲノムの配列の中の配列に対応し得る組成物と選択的に結合し得る抗体を提供する
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの１つまたはそれ以上の遺伝子型を検出する方法を提供し、以下の工程：
ａ．Ｃ型肝炎ウイルスの１つまたはそれ以上の遺伝子型に対応する８個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する非天然型の核酸を、ハイブリッド形成条件を確立させ得る条件下に置く工程、
ｂ．ハイブリッド形成条件を確立させて、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸の存在下でハイブリッド生産物を形成する工程、；および、
ｃ．ハイブリッド生産物の形成に関して、天然に存在しない核酸をモニターする工程であり得、このハイブリッド生産物がＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型の存在を示す工程、
を包含する方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第１の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第１の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１−６、エンベロープ１領域中の２３−２５、５’ＵＴ領域中の３３−３８、およびコア領域中の５２−５７の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第２の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第２の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号７−１２、エンベロープ１領域中の２６−２８、５’ＵＴ領域中の３９−４５、およびコア領域中の５８−６４の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第３の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第３の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１３−１７、エンベロープ１領域中の３２、５’ＵＴ領域中の４６−４７、およびコア領域中の６５−６６の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第４の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第４の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号２０−２２、エンベロープ１領域中の２９−３１、および５’ＵＴ領域中の４８−４９の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第５の遺伝子型の配列に対応する配列を有し、この第５の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１８−１９の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、配列番号６７−１４５の配列に対応する配列を有し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ＨＣＶゲノムのコアおよび領域においてグループＩ遺伝子型を同定するための、配列番号６９、７１、７３、および８１−９９の配列に対応する配列を有し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ＨＣＶゲノムのコアおよびエンベロープ領域においてグループＩＩ遺伝子型を同定するための、配列番号７０、７２、７０、および１００−１１８の配列に対応する配列を有し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴ領域においてグループＩＩＩ遺伝子型を同定するための、配列番号７７の配列に対応する配列を有し得る方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴ領域においてグループＩＶ遺伝子型を同定するための、配列番号７９の配列を有し得る方法を提供する。

本発明の核酸、すなわち異なる遺伝子型を規定するＨＣＶウイルスゲノムに対応する核酸は、核酸ハイブリッド形成アッセイ法のプローブとして、核酸の合成に関する反応に用いるプライマーとして、存在し得る他の成分からＨＣＶウイルス核酸を分離するための結合パートナーとして、および、ウイルス核酸の転写もしくは翻訳を阻害するためのアンチセンス核酸として有用である。

本願で用いる選択された用語の定義を、本発明の理解を容易にするために以下に説明する。「対応する」という用語は核酸の特定の配列に対して相同的もしくは相補的であることを意味する。核酸とペプチド間の場合、「対応する」という用語は、ペプチドのアミノ酸が核酸の配列またはその相補体に由来する順序にあることを指す。

「非天然型の核酸」という用語は、ゲノムの核酸、ｃＤＮＡ、半合成核酸または合成起源の核酸の一部であって、その起源もしくは処理によって、（１）それが天然において結合しているすべての核酸とは結合していないか、（２）それが天然において連結しているのと異なる核酸もしくは他の化学試薬に連結しているか、または（３）天然には存在しないものを指す。

同様に「非天然型のペプチド」という用語は、天然型の大きなペプチドもしくはタンパク質または半合成もしくは合成ペプチドの一部であって、その起源または処理によって、（１）それが天然において結合しているすべてのペプチドとは結合していないか、（２）それが天然において連結しているのと異なるペプチド、官能基もしくは化学試薬に連結しているか、または（３）天然には存在しないものを指す。

「プライマー」という用語は、適正な条件下に置かれた場合により大きな核酸の合成を開始させ得る核酸を指す。プライマーは、コピーされるべき核酸の領域に完全にまたは実質的に相補的である。したがって、ハイブリッド形成を誘導する条件下では、プライマーはより大きな核酸の相補的領域に対してアニーリングする。適切な反応物を添加すると、プライマーはその重合試薬によって伸長されてより大きな核酸のコピーを作る。

「結合対」という用語は、相互の親和性または結合能力を示す分子の対を指す。本願の目的に関して、「リガンド」という用語は結合対の一方の分子を意味し、「抗リガンド」または「受容体」または「標的」という用語は結合対の反対側の分子を指す。例えば核酸については、結合対は２つの相補的な核酸を含む。それらの核酸の一方はリガンドと呼ばれ、他方の鎖は抗リガンド受容体もしくは標的と呼ばれる。リガンドもしくは抗リガンドの呼称は、任意の便宜上の問題である。他の結合対としては、少数の例を挙げるならば、抗原と抗体、医薬と医薬受容体部位、および酵素と酵素基質がある。

「標識」という用語は検出可能な分子の部分を指し、例えば、放射性同位元素、酵素、発光剤、沈澱剤および染料があるが、これらに限定はされない。

「支持体」という用語には、フィルターおよび膜などの慣用的な支持体、および、媒体中に実質的に分散させ、次いで、固定化、濾過、分配などによってその媒体から取り出すかまたは分離し得る回収可能な支持体が含まれる。「支持体手段」という用語は、結合パートナー、または共有結合もしくは非共有結合によって核酸、ペプチドまたは抗体に結合し得る支持体を指す。

多数のＨＣＶの株と分離株が同定されている。ＵＳＡから得た最初の分離株（「ＨＣＶ−１」；Ｑ．−Ｌ． Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４巻、３５９〜３６２頁、１９８９年；Ｑ．−Ｌ． Ｃｈｏｏら、Ｂｒｉｔ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ．，４６巻、４２３−４４１頁、１９９０年；Ｑ．−Ｌ． Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，８８巻、２４５１〜２４５５頁、１９９１年；および上述のヨーロッパ特許公開第３１８，２１６号を参照）の配列と比べると、日本の分離株（「ＨＣＶ Ｊ１」）は、ＮＳ３およびＮＳ４の領域内においてヌクレオチドおよびポリペプチドの両方の配列がかなり異なることが見出された。この結論はその後に、ＮＳ５およびエンベロープの領域（Ｅ１／ＳおよびＥ２／ＮＳ１）まで拡大された（Ｋ．Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．，７１巻、３０２７〜３０３３頁、１９９０年；Ｙ． Ｋｕｂｏ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．，１７巻、１０３６７〜１０３７２頁、１９８９年；およびＫ． Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ，９１巻、２８７〜２９１頁、１９９０年参照）。前者のグループの分離株は、最初に米国で同定されたものであり、本明細書では「遺伝子型Ｉ（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｉ）」と呼ぶ。後者のグループの分離株は、最初に日本で同定されたものであり、本願では「遺伝子型ＩＩ」と呼ぶ。

発明の簡単な説明
本発明は、異なる遺伝子型を規定するＨＣＶウイルスゲノムに対応する核酸およびペプチドを含む組成物を特徴とする。また本発明は、本願に記載の異なる遺伝子型を規定するＨＣＶウイルスゲノムの配列に対応する組成物の使用方法を特徴とする。

Ａ．核酸組成物
本発明の核酸、すなわち異なる遺伝子型を規定するＨＣＶウイルスゲノムに対応する核酸は、核酸ハイブリッド形成アッセイ法のプローブとして、核酸の合成に関する反応に用いるプライマーとして、存在し得る他の成分からＨＣＶウイルス核酸を分離するための結合パートナーとして、および、ウイルス核酸の転写もしくは翻訳を阻害するためのアンチセンス核酸として有用である。

本発明の１つの実施態様は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応する少なくとも８個のヌクレオチドからなる核酸配列を有する非天然型の核酸を含む組成物を特徴とする。このヌクレオチド配列は、好ましくは、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域およびコア領域からなる少なくとも１つの領域中に存在する配列から選択される。

ＮＳ５の領域に対応する配列については、その配列は配列番号２〜２２の配列内の配列から選択されることが好ましい。配列番号１の配列はＨＣＶ−１に対応する。配列番号１〜２２の配列は本願の配列表に規定されている。

エンベロープ１領域に対応する配列については、その配列は配列番号２４〜３２の配列内の配列から選択されるのが好ましい。配列番号２３の配列はＨＣＶ−１に対応する。配列番号２３〜３２の配列は本願の配列表に記載されている。

５’ＵＴ領域に対応する配列については、その配列は配列番号３４〜５１の配列内の配列から選択されるのが好ましい。配列番号３３の配列はＨＣＶ−１に対応する。配列番号３３〜５１の配列は本願の配列表に記載されている。

コア領域に対応する配列については、その配列は配列番号５３〜６６の配列内の配列から選択されるのが好ましい。配列番号５２の配列ＨＣＶ−１に対応する。配列番号５２〜６６の配列は本願の配列表に記載されている。

本発明の組成物は、ＨＣＶの異なる遺伝子型に対応する核酸とハイブリット生産物を形成する。

ＨＣＶは少なくとも５種の遺伝子型を有する。これらの遺伝子型を、本願ではＧＩ−ＧＶと呼ぶ。第１の遺伝子型であるＧＩは、配列番号１〜６、２３〜２５、３３〜３８および５２〜５７の配列で例示される。第２の遺伝子型であるＧＩＩは、配列番号７〜１２、２６〜２８、３９〜４５および５８から６４の配列で例示される。第３の遺伝子型であるＧＩＩＩは、配列番号１３〜１７、３２、４６〜４７および６５〜６６の配列で例示される。第４の遺伝子型であるＧＩＶは、配列番号２０〜２２および２９〜３１および４８〜４９の配列で例示される。第５の遺伝子型であるＧＶは、配列番号１８、１９、５０および５１の配列で例示される。

本発明の１つの実施態様は、ＨＣＶの遺伝子型を例示する１つ以上の配列に対応する配列を有する核酸を含む組成物を特徴とする。

Ｂ．ハイブリッド生産の製造方法
また本発明の実施態様は、ＨＣＶ核酸に対応する配列を有する核酸とのハイブリッド生産物の製造方法も特徴とする。１つの方法は、ＨＣＶ核酸に対応する非ＨＣＶ−１配列を有する非天然型の核酸を、ハイブリッド形成が起こり得る条件下に置く工程を含む。その非天然型の核酸は、ハイブリッド形成条件下で、ＨＣＶ核酸とハイブリッド生産物を形成し得る。この方法は、さらに、ＨＣＶゲノムの１つの領域に対応する核酸の存在下で、ハイブリッド形成条件を確立させてハイブリッド生産物を形成する工程を含む。

ハイブリッド生産物の形成は、ＨＣＶの１つ以上の遺伝子型の存在を検出するために有用である。非天然型の核酸は、好ましくは、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域およびコア領域を含む１つ以上の領域内のＨＣＶの核酸とハイブリッド生産物を形成する。ハイブリッド生産物を検出するには、非天然型の核酸に標識を結合させることが有用である。ハイブリッド生産物の形成は、ハイブリッド生産物を形成しなかった標識された非天然型の核酸から、ハイブリッド形成生産物を分離することによって検出される。

ハイブリッド生産物の形成は、存在する可能性がある他の成分から、ＨＣＶ核酸の１つ以上の遺伝子型を分離する手段として有用である。このような用途の場合、形成したハイブリッド生産物を他の成分から分離するために、非天然型の核酸を支持体と結合させることが有用である。

核酸の“サンドイッチアッセイ”では、標識を結合させた１つの核酸、および支持体と結合させた第２の核酸を利用する。本発明の１つの実施態様は、２種の核酸からなるサンドイッチアッセイを特徴とする。この２種の核酸は両者ともＨＣＶ核酸に対応する配列を有する。しかし、少なくとも一方の非天然型核酸は、非ＨＣＶ−１ ＨＣＶ核酸に対応する配列を有する。少なくとも一方の核酸は標識と結合し得る。他方の核酸は支持体と結合し得る。支持体に結合された非天然型の核酸は、ＨＣＶ核酸と、非ＨＣＶ−１配列を有する非天然型の核酸とを含有するハイブリッド生産物を分離するのために使用される。

本発明の１つの実施態様は、ＨＣＶの１つ以上の遺伝子型の検出方法を特徴とする。この方法は、ハイブリッド形成が起こり得る条件下に非天然型核酸を置く工程を含む。その非天然型の核酸は、ＨＣＶの１つ以上の遺伝子型由来の核酸とハイブリッド生産物を形成し得る。第１の遺伝子型であるＧＩは、配列番号１〜６、２３〜２５、３３〜３８および５２〜５７の配列で例示される。第２の遺伝子型であるＧＩＩは、配列番号７〜１２、２６〜２８、３９〜４５および５８〜６４の配列で例示される。第３の遺伝子型であるＧＩＩＩは、配列番号１３〜１７、３２、４６〜４７および６５〜６６の配列にで例示される。第４の遺伝子型であるＧＩＶは、配列番号２０〜２２および２９〜３１の配列で例示される。第５の遺伝子型であるＧＶは、配列番号１８、１９、５０および５１の配列で例示される。

ＨＣＶ核酸と、ＨＣＶゲノム内の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列を有する非天然型の核酸とのハイブリッド生産物は、核酸を合成する反応を開始するのに有用である。

ＨＣＶ核酸と、ＨＣＶの特定の遺伝子型に対応する配列を有する非天然型の核酸とのハイブリッド生産物は、そのような遺伝子型の核酸を合成する反応を開始するのに有用である。１つの実施態様において、合成された核酸は、ＨＣＶの１つ以上の遺伝子型の存在を示す。

また核酸の合成によって、ウイルスタンパク質を合成する発現ベクター中への、その核酸のクローン化が容易になる。

本発明の実施態様は、ウイルス核酸の転写もしくは翻訳を阻害するためのアンチセンス剤として有用である。ＨＣＶゲノム配列の特定の遺伝子型に対応する配列を有する非天然型の核酸と、ＨＣＶ核酸とがハイブリッド生産物を形成すると、そのような遺伝子型の翻訳または転写を阻止する。５種の遺伝子型をすべて含有させて治療剤を作り得る。

Ｃ．ペプチドおよび抗体の組成物
本発明の別の実施態様は、非ＨＣＶ−１配列を有する核酸に対応する、３個以上のアミノ酸からなる非天然型のペプチドを含む組成物を特徴とする。その非ＨＣＶ−１配列は、好ましくは、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域およびコア領域からなる１つ以上の領域内の配列と対応する。

ＮＳ５領域の非ＨＣＶ−１配列を有する核酸に対応するペプチドについては、その配列は配列番号２〜２２の配列内にあることが好ましい。配列番号１の配列はＨＣＶ−１に対応する。配列番号１〜２２の配列は配列表に記載されている。

エンベロープ１領域の非ＨＣＶ−１配列を有する核酸に対応するペプチドについては、その配列は配列番号２４〜３２の配列内にあることが好ましい。配列番号２３の配列はＨＣＶ−１に対応する。配列番号２３〜３２の配列は配列表に記載されている。

コア領域に関する非ＨＣＶ−１配列を有する核酸に対応するペプチドについては、その配列は配列番号５３〜６６の配列内にあることが好ましい。配列番号５２の配列はＨＣＶ−１に対応する。配列番号５２〜６６の配列は配列表に記載されている。

本発明の別の実施態様は、ＨＣＶの１つの遺伝子型の核酸配列に対応するペプチド組成物を特徴とする。第１の遺伝子型であるＧＩは、配列番号１〜６、２３〜２５、３３〜３８および５２〜５７の配列で例示される。第２の遺伝子型であるＧＩＩは、配列番号７〜１２、２６〜２８、３９〜４５および５８〜６４の配列で例示される。第３の遺伝子型であるＧＩＩＩは、配列番号１３〜１７、３２、４６〜４７および６５〜６６の配列で例示される。第４の遺伝子型であるＧＩＶは、配列番号２０〜２２、２９〜３１、４８および４９の配列で例示される。第５の遺伝子型であるＧＶは、配列番号１８、１９、５０および５１の配列で例示される。

本発明の非天然型のペプチドはワクチンの成分として有用である。本発明の配列の情報によって、ＨＣＶの異なる遺伝子型のすべてまたはいくつかに対するワクチンを設計することができる。ワクチンを特定の遺伝子型に指向させると、遭遇する可能性がある因子に対して最大の防護を行うように、予防治療を適合させることができる。ワクチンを１種以上の遺伝子型に指向させると、そのワクチンを一層包括的なものにすることができる。

また本発明のペプチド組成物は、ＨＣＶタンパク質に対して特異的な抗体を開発するためにも有用である。本発明の１つの実施態様は、組成物として、ＨＣＶゲノムの非ＨＣＶ−１配列に対応するペプチドに対する抗体を特徴とする。この非ＨＣＶ−１配列は、好ましくは、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域およびコア領域からなる領域内の配列から選択される。未翻訳５’ＵＴ領域に関連するペプチドはない。

ＮＳ５領域のペプチドに対する抗体については、そのペプチドは配列番号２〜２２の配列内の配列に対応することが好ましい。エンベロープ１領域に対応するペプチドに対する抗体については、そのペプチドは配列番号２４〜３２の配列内の配列に対応することが好ましい。コア領域に対応するペプチドに対する抗体については、そのペプチドは配列番号５３〜６６の配列内の配列に対応することが好ましい。

特定の遺伝子型を反映するペプチドに対する抗体は、ＨＣＶのそのような遺伝子型の検出、および治療剤のために有用である。

本発明の１つの実施態様は、特定の遺伝子型の配列を有する核酸に対応するペプチドに対する抗体を特徴とする。第１の遺伝子型であるＧＩは、配列番号１〜６、２３〜２５、３３〜３８および５２〜５７の配列で例示される。第２の遺伝子型であるＧＩＩは、配列番号７〜１２、２６〜２８、３９〜４５および５８〜６４の配列で例示される。第３の遺伝子型であるＧＩＩＩは、配列番号１３〜１７、３２、４６〜４７および６５〜６６の配列で例示される。第４の遺伝子型であるＧＩＶは、配列番号２０〜２２、２９〜３１、４８および４９の配列で例示される。第５め遺伝子型であるＧＶは、配列番号１８、１９、５０および５１の配列で例示される。

本発明の組成物が、核酸のハイブリッド形成または免疫化学的反応を行うためのキットの形態で、使用説明書とともに包装され得ることを、当業者は容易に理解する。

本発明を、ＨＣＶの遺伝子型を示す配列を図示した以下の図面を用いてさらに説明する。これらの配列は１〜１４５の数字で呼ばれ、これらの数字および配列は配列表に記載の数字および配列と一致する。配列１４６および１４７は、アッセイの考察を容易にする。その数字および配列は、配列表に記載されている数字および配列と一致する。

（発明の詳細な説明）
本発明を、診断と治療の用途に関する、ＨＣＶゲノムおよび関連ペプチドおよび結合パートナーに対応する配列を有する核酸として詳細に説明する。

本発明を実施するために、特にことわりがない限り、当該技術分野の技術の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的な手法が用いられる。このような手法は文献に充分説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ１， １９８２年； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）特に１５４巻および１５５巻（ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編）を参照のこと。

ｃＤＮＡライブラリーを、ＨＣＶに感染させたチンパンジーの血漿中に存在する核酸配列から誘導する。これらのライブラリーの１つである「ｃ」ライブラリー（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４０３９４）の構築は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４４３６に記載されている。本発明に関連するライブラリーの配列は、配列番号１、２３、３３および５２の配列として記載されている。

本発明の特徴にしたがって単離もしくは合成される核酸は、本発明を限定しない例として、プローブ、プライマーおよびアンチセンス遺伝子として、およびそのような配列に対応するペプチドを合成する発現系を開発するために有用である。

記載した核酸配列は、ウイルスゲノムの４つの領域についてＨＣＶの遺伝子型を規定する。図１はＨＣＶの構造を示す。特に重要な４つの領域はＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域およびコア領域である。

配列番号１〜２２の配列として本願に記載されている配列は、ＮＳ５領域において、少なくとも５つの遺伝子型を示唆する。配列番号１〜２２の配列は、図２および配列表に示される。配列番号１〜２２の各配列は、ＮＳ５領域由来の３４０個のヌクレオチドを有する核酸から誘導される。

５つの遺伝子型は、配列番号１〜２２の配列によって規定される配列をグループ分けすることによって規定される。便宜上、本願では、異なる遺伝子型にローマ数字およびアルファベット文字「Ｇ」を与える。

第１の遺伝子型（ＧＩ）は、配列番号１〜６の配列内の配列で例示される。第２の遺伝子型（ＧＩＩ）は、配列番号７〜１２の配列内の配列で例示される。第３の遺伝子型（ＧＩＩＩ）は、配列番号１３〜１７の配列内の配列で例示される。第４の遺伝子型（ＧＩＶ）は、配列番号２０〜２２の配列内の配列で例示される。第５の遺伝子型（ＧＶ）は配列番号１８と１９の配列内の配列で例示される。

配列番号２３〜３２の配列として本願に記載されている配列は、ＨＣＶのエンベロープ１領域において、少なくとも４つの遺伝子型を示唆する。配列番号２３〜３２の配列は、図３および配列表に示される。配列番号２３〜３２の各配列は、エンベロープ１領域由来の１００個のヌクレオチドを有する核酸から誘導される。

第１のエンベロープ１遺伝子型グループ（ＧＩ）は、配列番号２３〜２５の配列内の配列で例示される。第２のエンベロープ１遺伝子型（ＧＩＩ）領域は、配列番号２６〜２８の配列内の配列で例示される。第３のエンベロープ１遺伝子型（ＧＩＩＩ）は、配列番号３２の配列内の配列で例示される。第４のエンベロープ１遺伝子型（ＧＩＶ）は配列番号２９〜３１の配列内の配列で例示される。

配列番号３３〜５１の配列として本願に記載されている配列は、ＨＣＶの５’ＵＴ領域において、少なくとも３つの遺伝子型を示唆する。配列番号３３〜５１の配列は、図４および配列表に示される。配列番号３３〜５１の各配列は、５’ＵＴ領域由来の２５２個のヌクレオチドを有する核酸から誘導されるが、配列５０と５１はそのヌクレオチドが約１８０個でありいくぶん短い。

第１の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＩ）は、配列番号３３〜３８の配列内の配列で例示される。第２の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＩＩ）は配列番号３９〜４５の配列内の配列で例示される。第３の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＩＩＩ）は、配列番号４６〜４７の配列内の配列で例示される。第４の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＩＶ）は、配列番号４８および４９の配列内の配列で例示される。第５の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＶ）は、配列番号５０および５１の配列内の配列で例示される。

配列番号４８〜６２の配列は、ＨＣＶのコア領域内において、少なくとも３つの遺伝子型を示唆する。配列番号５２〜６６の配列は、図５および配列表に示される。

第１のコア領域遺伝子型（ＧＩ）は、配列番号５２〜５７の配列内の配列で例示される。第２のコア領域遺伝子型（ＧＩＩ）は、配列番号５８〜６４の配列内の配列で例示される。第３のコア領域遺伝子型（ＧＩＩＩ）は、配列番号６５および６６の配列内の配列で例示される。配列番号５２〜６５の配列は５４９個のヌクレオチドで構成される。配列番号６６の配列は５１０個のヌクレオチドで構成される。

各領域について記載した種々の遺伝子型は一致する。すなわち、ＮＳ５領域について第１の遺伝子型の特徴を有するＨＣＶは、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域およびコア領域の第１の遺伝子型の特徴と実質的に一致する。

配列番号１〜６６の配列中に記載された配列にしたがって単離もしくは合成される核酸は、プローブ、プライマー、捕獲リガンドおよびアンチセンス剤として有用である。プローブ、プライマー、捕獲リガンドおよびアンチセンス剤としての核酸は、特異性および安定なハイブリッド生産物を形成する能力のため、通常約８個以上のヌクレオチドを含有する。

プローブ類
ＨＣＶゲノムの１つの領域の特定の遺伝子型を規定する配列にしたがって単離もしくは合成される核酸は、プローブとして使用してそのような遺伝子型を検出し得るし、または他の核酸のプローブと組合わせて用いて実質的にＨＣＶのすべての遺伝子型を検出し得る。

本願に記載される配列の情報によって、ＨＣＶ内の各種の遺伝子型およびハイブリッド形成条件中に遭遇する可能性がある外来の核酸配列に対して所望の包含性と排他性を与える８個以上のヌクレオチドの配列が同定される。

当業者は、プローブとして用いる核酸配列には、ハイブリッド生産物の検出を容易にするために標識を与え得ることを容易に理解する。

捕獲リガンド
捕獲リガンドとして用いるため、プローブについて先に述べた方式で選択された核酸は容易に支持体に結合させ得る。核酸を支持体に結合させる方法は公知である。配列番号１〜６６の配列内の配列に対応する配列を有する核酸は、１つの遺伝子型のウイルス核酸を異なる遺伝子型のＨＣＶの核酸から分離するのに有用である。配列番号１〜６６の配列内の配列にしたがって単離もしくは合成される核酸は、組合わせて用いれば、ＨＣＶのすべての遺伝子型の実質的にすべての核酸を捕獲するのに有用である。

プライマー
本願に記載された配列にしたがって単離または合成される核酸は、ＨＣＶ配列の増幅のためのプライマーとして有用である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に関して、配列番号１〜６６の配列の１つ以上の配列に対応する８個以上のヌクレオチドの核酸配列は、適切な酸素および試薬と組み合せて、ウイルス核酸のコピーを作るのに有用である。１つ以上の遺伝子型に対応する異なる配列を有する複数のプライマーは、かような遺伝子型についてウイルス核酸のコピーを作るのに使用し得る。

そのコピーはＨＣＶウイルスを検出する診断検定法に使用し得る。またそのコピーは、クローニングベクターおよび発現ベクターに組込んで、ＰＣＲで合成した核酸に対応するポリペプチドを製造することができる。以下にさらに詳細に述べる。

アンチセンス
本願明細書に記載した配列に従って単離もしくは合成した核酸は、ＨＣＶの発現を阻害するアンチセンス遺伝子として有用である。

ＨＣＶの遺伝子型に対応する核酸は、ＨＣＶに感染している細胞内に導入するためリポソームのような適切な担体に負荷され得る。８個又はそれ以上のヌクレオチドを有する核酸はウイルス核酸またはウイルスメッセンジャーＲＮＡに結合することができる。好ましくはアンチセンス核酸は、３０個又はそれ以上のヌクレオチドからなり、ウイルス核酸またはウイルスメッセンジャーＲＮＡのハイブリッド生成物に必要な安定性を提供するものが好ましい。アンチセンス核酸を負荷する方法は当該技術分野で公知であるが、例えばＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓらに１９８０年１２月２３日付で付与された米国特許第４，２４１，０４６号がある。

ペプチドの合成
本願に記載の配列に従って単離もしくは合成される核酸はペプチド製造に有用である。配列番号１〜３２および５２〜６６の配列で例示される配列は、適切なベクター内にクローン化され得、または核酸の単離に使用し得る。単離された核酸は、適切なＤＮＡリンカーに結合され、適切なベクター中にクローン化される。そのベクターは、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような適切な宿主生物を形質転換するのに用いられ得、その配列によってコードされるペプチドが単離され得る。

分子クローニング法は、テキストＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２年に記載されている。

その単離されたペプチドは、ＨＣＶの特定の遺伝子型に対するワクチン、および抗体を製造するのに用いる抗原物質として有用である。

ワクチンと抗体
本発明のペプチド物質は、抗体およびワクチンを製造するのに有用である。

ｃＤＮＡ配列またはそれから誘導されるヌクレオチド配列（配列のセグメントもしくは修飾物を含む）を入手できれば、いずれかのストランドにコードされているペプチドの抗原として活性な領域をコードする発現ベクターを構築し得る。抗原として活性な領域は、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域およびコード領域から誘導され得る。

所望のペプチドをコードするフラグメントは、通常の制限酵素による消化法を用いるかまたは合成法によって、ｃＤＮＡクローンから誘導され得、次に、例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはスーバーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、のような融合配列の一部分を含有しているベクターに連結され得る。好ましくはＳＯＤに連結され得る。ＳＯＤの融合配列を含有しているポリペプチドを製造するのに有用な方法とベクターは、１９８６年１０月１日付で公開されたヨーロッパ特許公開第０１９６０５６号に記載されている。

いずれかのセンスストランドにある、オープン・リーディングフレームを含有するＨＣＶ ｃＤＮＡの所望の部分は、成熟タンパク質もしくは融合タンパク質のような組換えペプチドとして得られ得る。あるいはｃＤＮＡにコードされているペプチドは化学合成して得られ得る。

所望のペプチドを含有するＤＮＡは、融合型もしくは成熟型であることを問わず、および分泌を可能にするシグナル配列を含有もしくは含有していないことを問わず、あらゆる好適な宿主に適した発現ベクターに連結し得る。現在、真核および原核の宿主系の両方が、組換えペプチドを製造するのに用いられている。ペプチドは、細胞を溶解し、または培地から単離され、次いでその意図する用途に必要な純度まで精製され得る。精製は当該技術分野で公知の方法、例えば分別抽出法、塩分画法、イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、遠心分離法などによって行い得る。例えば、タンパク質の各種精製法ついては、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｓｙを参照。このようなペプチドは診断剤として使用し得、あるいは中和抗体を生成するペプチドはワクチンとして処方し得る。また、これらのペプチドに対して生成する抗体は、診断剤として使用可能であり、または受動免疫治療法もしくはＨＣＶの単離と固定に用い得る。

ペプチドの抗原領域は一般に比較的小さく、長さは典型的には８〜１０個あるいはそれ以下のアミノ酸である。５個の小数のアミノ酸からなるフラグメントが抗原領域の特徴である。これらのセグメントはＨＣＶゲノムのＮＳ５領域、エンベロープ１領域およびコア領域に対応する。５’ＵＴ領域は翻訳されないことが知られている。したがって、このような領域のｃＤＮＡを使用して、この領域に対応するＨＣＶペプチドの短いセグメントをコードするＤＮＡは、融合タンパク質としてあるいは単離されたペプチドとして組換え法によって発現され得る。さらに、短いアミノ酸配列は、化学合成法によって容易に得られ得る。合成されたペプチドが、正しいエピトープを提供するように正しく形成されているが、小さすぎて免疫原性がない場合、そのペプチドは適切なキャリアーに連結され得る。

このような連結を行う多数の方法が当該技術分野では公知であり、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドーメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（米国，イリノイ州，ロックフォード，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙから入手した）を用いジスルフィド結合を生成させる方法がある（ペプチドにスルフヒドリル基がない場合はジスルフィド結合はシステイン残基を付加することによって得られる）。これらの試薬は、それ自体の間で、および一方のタンパク質のペプチドシステイン残基と、他方のタンパク質のリシンのε―アミノを介するアミド結合もしくは他の遊離アミノ基との間でジスルフィド結合を生成する。このようなジスルフィド／アミド形成試薬は種々のものが公知である。（例えばＩｍｍｕｎ Ｒｅｖ，６２巻１８５頁、１９８２年参照）。他の二官能カップリング剤はジスルフィド結合ではなくてチオエーテル結合を形成する。このようなチオエーテル形成試薬の多くは、市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルがある。カルボキシル基は、それをスクシンイミドもしくは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と結合することによって活性化し得る。抗原をカップリングする別の方法としては、ヨーロッパ特許出願公開２５９，１４９号に記載されているロタウイルス／結合ペプチドシステムが利用され得る。この開示事項は本願に文献として援用する。上記のリストは網羅的なものではなく、上記化合物の修飾物も使用し得ることは明かである。

それ自体が宿主に対して有害な抗体の産生を誘発しないキャリアーはいずれも使用し得る。適切なキャリアーは、一般に大きく、ゆっくり代謝される巨大分子であり、例えばタンパク質類；ラテックスで官能性を与えられたセファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどのような多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリシンなどのようなアミノ酸ポリマー；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子がある。特に有用なタンパク質の基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オバルブミン、破傷風菌毒素、および当業者によく知られているタンパク質である。

ＮＳ５、エンベロープ１およびコアの領域由来の少なくとも１つのウイルスエピトープをコードにするＨＣＶアミノ酸配列を含有するペプチドは有用な免疫試薬である。５’ＵＴ領域は翻訳されないことが知られている。例えば、末端を切取られた配列を有するペプチドは免疫検定法の試薬として使用できる。またこれらのペプチドは、抗血清製造用組成物あるいはワクチンの候補となり得るサブユニット抗原である。この末端を切取られた配列は未変性のウイルスタンパク質を各種の公知の方法で処理することによって製造し得るが、ＨＣＶ配列を有する合成もしくは組換えによるペプチドを作る方が一般に好ましい。これらの末端を切取られたＨＣＶ配列を有するペプチドは、全体がＨＣＶ配列（連続もしくは非連続である１つまたはそれ以上のエピトープ）、またはＨＣＶ配列と異種タンパク質との融合タンパク質を含有し得る。有用な異種タンパク質は組換え宿主から分泌され、ＨＣＶエピトープの免疫反応性を強化し、またはポリペプチドが、免疫検定法の支持体もしくはワクチンの担体と容易にカップリングする配列である。（例えばヨーロッパ特許公開第１１６、２０１号、米国特許第４、７２２、８４０号、ヨーロッパ特許公開第２５９、１４９号、米国特許第４、６２９、７８３号）。

末端を切取られたＨＣＶ配列を含有するペプチドの大きさは広範囲に変え得、その最小の大きさは１つのＨＣＶエピトープを与えるのに充分な大きさの配列であるが、最大の大きさは重要ではない。便宜上、最大の大きさは、たとえあるとしても、通常、所望のＨＣＶエピトープを提供し、異種配列の機能を与えるのに必要な大きさより実質的に大きいことはない。典型的には、末端を切取られたＨＣＶのアミノ酸配列は長さが約５〜約１００個のアミノ酸の範囲内にある。しかし、さらに典型的にはＨＣＶ配列長さが最大約５０個のアミノ酸であり、好ましくは最大３０個のアミノ酸である。少なくとも約１０、１２または１５個のアミノ酸、最大約２０個もしくは２５個までのアミノ酸を有するＨＣＶ配列を選択することが通常望ましい。

エピトープを含有するＨＣＶアミノ酸配列は多数の方法で同定することができる。例えばＮＳ５、エンベロープおよびコアの各領域に対応する全タンパク質配列は、このような領域の全タンパク質配列にわたる一連の短いペプチドを作ることによってスクリーニングし得る。例えば、ほぼ１００個のアミノ酸のペプチドから出発することによって、所望の反応性を示すエピトープの存在について各ペプチドを試験し、次に１００個のアミノ酸からなる同定されたペプチドを次第に小さくした、かつ重複しているフラグメントを試験し、目的とするエピトープをマップすることは日常的に行われる。免疫検定法でこのようなペプチドをスクリーニングすることは、当業者に容易である。タンパク質配列のコンピュータ分析を実施して潜在的なエピトープを同定し、その同定された領域を含有するペプチドを調製してスクリーニングに用いることも公知である。

また、ＨＣＶのエピトープの免疫原性は、例えばＢ型肝炎表面抗原に関連する粒子形成性タンパク質と融合もしくは会合した形で、哺乳類もしくは酵母の系で調製することによっても強化し得る。例えば米国特許第４、７２２、８４０号参照。ＨＣＶエピトープが粒子形成性タンパク質をコードする配列に直接結合された構築物はＨＣＶエピトープに対して免疫原性な融合体を産生する。さらに、製造されたすべてのベクターは、ＨＢＶに特異的なエピトープを含有し、例えばプレ−Ｓ−ペプチドのように種々の異なる免疫原性をもっている。したがって、ＨＣＶ含有する粒子形成性タンパク質で構成された粒子はＨＣＶとＨＢＶとに対して免疫原性である。

肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は、エス・セレビシェ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で形成され、集合して粒子になること（Ｐ． Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらの１９８２年の報告）、および、例えば哺乳類細胞中で形成され、集合して粒子になること（Ｐ． Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらの１９８４年の報告）が報告されている。このような粒子が生成するとそのモノマーサブユニットの免疫原性が増大されることが報告されている。またその構造体は、プレサーフェイス（プレ−Ｓ）領域の５５個のアミノ酸を含有する、ＨＢＳＡｇの免疫優性エピトープを有している（Ｎａｕｒａｔｈらの１９８４年の報告）。酵母中で発現可能なプリ−Ｓ−ＨＢＳＡｇ粒子の構築物は１９８６年３月１９日付で公開されたヨーロッパ特許公開第１７４、４４４号に開示され、また酵母で発現される異種ウイルス配列を含有するハイブリッドが、１９６６年３月２６日付で公開されたヨーロッパ特許第１７５、２６１号に開示されている。またこれらの構築物は、ＳＶ４０−ジヒドロ葉酸レダクターゼベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞内で発現させ得る。（Ｍｉｃｈｅｌｌｅらの１９８４年の文献）。

その上、粒子形成性タンパク質をコードする配列の一部分は、ＨＣＶエピトープをコードするコドンと置換し得る。この置換で、哺乳動物の酵母の中でユニットの集合を仲介して免疫原性粒子を形成するのに必要とされない領域を削除して、付加的なＨＢＶ抗原部位がＨＣＶエピトープと競合しないようにし得る。

ワクチン類
ワクチンは、ＨＣＶ由来の１つ又はそれ以上の免疫原性ペプチドから調製し得る。ＨＣＶとフラビウイルス間にみられる相同性から、ワクチンとして最も有効であると思われるペプチドと、これらのペプチドがコードされるゲノムの領域とに関する情報が得られる。

ＨＣＶに対する多価ワクチンは、ＮＳ５、エンベロープ１、およびコアの領域から誘導された１つ又はそれ以上のタンパク質由来の１つ又はそれ以上のエピトープで構成され得る。特に、ＮＳ５、エンベロープ１およびコアの領域由来の１つ又はそれ以上のＨＣＶタンパク質もしくはサブユニット抗原を有するワクチンが考えられる。５’ＵＴ領域は翻訳されないことが知られている。

免疫原性ペプチドを活性成分として含有するワクチンの製造法は当業者には公知である。典型的には、このようなワクチンは注射用薬剤の液状の溶液もしくは懸濁液として製造され得る。また注射する前に液体の溶液もしくは懸濁液にするのに適した固体の形態のものも製造し得る。またその製剤は乳化させ得、または、そのタンパク質はリポソーム内に封入し得る。活性な免疫原性成分は、医薬として許容されかつ活性成分と相溶性のある賦形剤と混合され得る。適切な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどおよびそれらの組合せがある。さらに、所望により、本発明のワクチンは、少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤および／またはワクチンの有効性を増大するアジュバントを含有し得る。有効なアジュバントの例としては、限定はないが以下のものがある。すなわち水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６７３）、ｎｏｒ−ＭＤＰという）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ，ＭＴＰ−ＰＥという）、およびＲＩＢＩである。なおＲＩＢＩは、細菌から抽出された３成分、すなわちモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に含有している。アジュバントの有効性は、抗体の量を測定することによって決定し得、該抗体は種々のアジュバントを含有するワクチン中に存在するＨＣＶ抗原配列を有する免疫原性ペプチドを投与した結果、該ペプチドに対して生産され得る。

本発明のワクチンは、通常非経口で、例えば、皮下もしくは筋肉内に注射することによって投与され得る。他の投与法に適した別の製剤としては坐剤、および、ある場合には経口用製剤がある。坐剤の場合、伝統的な結合剤と担体、例えばポリアルキレングリコール類もしくはトリグリセリドを含有し得る。このような坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から製造され得る。経口製剤は、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤を含有し得る。

下記の実施例は例示を目的とし提供するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

（Ｉ．血清からのＨＣＶ ＲＮＡの検出）
ＲＮＡの血清からの抽出は、キット（ＲＮＡｚｏｌ（登録商標）Ｂキット，Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ）の製造者の指示に従って、グアニジニウム塩、フェノールおよびクロロホルムを使用して行った。抽出したＲＮＡをイソプロパノールで沈澱させ、次いでエタノールで洗浄した。合計２５μｌの血清をＲＮＡ単離のために処理し、精製したＲＮＡを、ピロ炭酸ジエチルで処理した水５μｌ中に再懸濁し、次のｃＤＮＡ合成を行った。

（ＩＩ． ｃＤＮＡの合成とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅）
表１に、この実施例に用いたすべてのＰＣＲプライマーとプローブの配列と位置（ＨＣＶ１について）を示す。ヌクレオチドに対するアルファベット文字による名称は米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２５と同じである。即ちアルファベット文字Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルという通常の意味で用いられる。文字ＭはＡまたはＣを意味し；ＲはＡまたはＧを意味し；ＷはＡまたはＴ／Ｕを意味し；ＳはＣまたはＧを意味し；ＹはＣまたはＴ／Ｕを意味し；ＫはＧまたはＴ／Ｕを意味し；ＶはＡまたはＣまたはＧを意味し、Ｔ／Ｕを意味しない；ＨはＡまたはＣまたはＴ／Ｕを意味し、Ｇを意味しない；ＤはＡまたはＧまたはＴ／Ｕを意味し、Ｃを意味しない；ＢはＣまたはＧまたはＴ／Ｕを意味し、Ａを意味しない；Ｎは（ＡもしくはＣもしくはＧもしくはＴ／Ｕ）または（未知のものなど）を意味する。表１は下記のとおりである。

ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲによる増幅については、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ［ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ］によって開発されたプロトコルを用いた。ランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ）およびＨＣＶに対して特異的な相補的配列を有するプライマーの両者を、逆転写（ＲＴ）反応を開始するために使用した。反応成分の添加と混合を除いて、すべての工程は熱サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）内で実施した。第１ストランドｃＤＮＡの合成反応は９９℃５分間処理して不活性化し、ついで５０℃で５分間冷却してから次の増幅を行うための反応成分を添加した。９７℃で１分間、５０℃で２分間および７２℃で３分間のサイクルを最初５回行い、つぎに、９４℃で１分間、５５℃で２分間および７２℃で３分間のサイクルを３０回行い、次いで最後の７２℃で７分間の延伸を行った。

遺伝子型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行うのに、配列６７と６８とをＰＣＲ反応のプライマーとして用いた。これらのプライマーは、コアとエンベロープの領域に対応するセグメントを増幅する。増幅後、反応生成物をアガロースゲルで分離し、ついでナイロン膜に転写した。その固定化された反応生成物を、遺伝子型Ｉ（コアもしくはエンベロープ１）、または、遺伝子型ＩＩ（コアもしくはエンベロープ１）に対応する３２Ｐ標識核酸とハイブリッドさせた。遺伝子型Ｉに対応する核酸は、６９番（コア）、７１番（エンベロープ）および７３番（エンベロープ）の配列を含有していた。遺伝子型ＩＩに対応する核酸は７０番（コア）、７２番（エンベロープ）および７４番（エンベロープ）の配列を含有していた。

遺伝子型Ｉのプローブは、遺伝子型Ｉの配列を有する分離株由来の増幅した生成物とだけハイブリッドした。同様に、遺伝子型ＩＩのプローブは、遺伝子型ＩＩの配列を有する分離株由来の増幅した生成物とだけハイブリッドを形成した。

他の実験では、ＰＣＲ生成物は配列７９と８０を用いて製造した。配列７３番を遺伝子型Ｉを検出するのに用い、配列７４番を遺伝子型ＩＩを検出するのに用い、配列７７番（５’ＵＴ）を遺伝子型ＩＩＩを検出するのに用い、および配列７８番（５’ＵＴ）を遺伝子型ＩＶを検出するのに用いたことを除いて、前述したのと同様にして生成物を分析した。各配列は、遺伝子型に特異的な方法でハイブリッドを形成した。

（ＩＩＩ．ＨＣＶ ＲＮＡについてのサンドイッチハイブリッド形成検定法を用いるＨＣＶ ＧＩ−ＧＩＶの検出）
増幅された溶液相の核酸サンドイッチハイブリッド形成検定法の方式をこの実施例で説明する。この検定法の方式では、捕獲と検出を達成するために数種の核酸プローブを使用する。捕獲プローブ核酸は固体担体に結合した相補的プローブ及びＨＣＶ核酸と会合し得、核酸は捕獲を行うことができる。検出プローブ核酸は、ＨＣＶ核酸に結合する第１セグメント（Ａ）と、第２の増幅核酸とハイブリッドする第２セグメント（Ｂ）とをもっている。

増幅核酸は、第１セグメント（Ｂ＊）を有し、そのセグメントはプローブ核酸のセグメント（Ｂ）とハイブリッドし、かつ１５のセグメント（Ｃ）の反復を有している。増幅核酸のセグメントＣは、３種の標識核酸とハイブリッドし得る。

グループＩのＨＣＶ単離株のエンベロープ１遺伝子のヌクレオチド配列に対応する核酸配列は８１〜９９番の配列内に記載されている。表２には、その核酸配列が対応するＨＣＶゲノムの領域と、その配列の好ましい用途を記載している。

グループＩＩのＨＣＶ単離株のエンベロープ１遺伝子のヌクレオチド配列に対応する核酸配列は１００〜１１８番の配列中に記載されている。表３には、核酸が対応するＨＣＶゲノムの領域と、その配列の好ましい用途が記載されている。

Ｃ遺伝子と５’ＵＴ領域中のヌクレオチド配列に対応する核酸配列は配列１１９〜１４５に記載されている。表４に、その配列と好ましい用途を示す。

検出及び捕獲プローブのＨＣＶ特異的セグメントおよび、このアッセイで使用されるそれぞれの名称は次のとおりである。

捕獲配列は１１９〜１２２番および１４１〜１４４番の配列である。

検出配列は１１９〜１４０番の配列である。

各検出配列は、ＨＣＶ配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、５’伸長部（Ｂ）を有し、その伸長部（Ｂ）は第２増幅核酸のセグメントに相補的である。その伸長部（Ｂ）の配列は、配列番号１４６として配列表に記載されているが以下に再度示す。

ＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴ
各捕獲配列は、ＨＣＶ配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、固体相に結合されたＤＮＡに相補的な配列を含有している。固定支持体に結合されたＤＮＡに相補的な配列は、捕獲配列の下流に保持されている。支持体に結合されたＤＮＡに相補的な配列は１４７番の配列として記載されているが、以下に再度示す。

ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧ
マイクロタイタープレートを以下のように調製した。Ｗｈｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ １ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ ｓｔｒｉｐｓ（ポリスチレン製微量滴定プレート、９６ウェル／プレート）はＤｙｎａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．から購入した。

各ウェルに１Ｎ ＨＣｌ ２００μｌを添加し、室温で１５〜２０分間インキュベートした。次ぎにプレートを１ｘＰＢＳで４回洗浄し、つぎにウェルを吸引して液体を除いた。ウェルに１Ｎ ＮａＯＨ ２００μｌを添加し、室温で１５〜２０分間インキュベートした。プレートを再び１ｘＰＢＳで４回洗い、吸引して液体を除いた。

ポリ（ｐｈｅ−ｌｙｓ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社から購入した。このポリペプチドは、ｐｈｅ：ｌｙｓのモル比が１：１であり、平均分子量が４７，９００ｇｍ／モルである。またこのペプチドは平均長が３０９個のアミノ酸の長さであり、１５５個のアミン／モルを含有している。このポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液を２Ｍ ＮａＣｌ／１ｘＰＢＳと混合して最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ６．０）にした。この溶液２００μｌづつを各ウェルに添加した。このプレートをプラスチックで包んで乾燥を防止し、３０℃で一夜インキュベートした。そのプレートを１ｘＰＢＳで４回洗浄し、ウェルを吸引して液体を除いた。

以下の方法を用いて、核酸１４７番の配列に相補的な配列をプレートに結合させた（以後固定化核酸と呼称する）。１３３番の配列に相補的な配列を有する固定化核酸の合成は、ヨーロッパ特許第８８３０９６９７６号に記載されている。ジスクシンイミジルスベレート２０ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３００μｌに溶解した。固定化核酸の２６ ＯＤ₂₆₀単位を連結用緩衝液１００μｌ（５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．８）に添加した。つぎにその連結混合物をＤＳＳ−ＤＭＦ溶液に添加しマグネティックスタラーで３０分間撹絆した。ＮＡＰ−２５のカラムを１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．５で平衡化した。連結混合物のＤＳＳ−ＤＭＦ溶液を、４℃にて、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５ ２ｍｌに添加した。得られた混合物を撹絆して混合し、上記の平衡化したＮＡＰ−２５カラムにロードした。ＤＳＳで活性化された固定化核酸ＤＮＡを、３．５ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５で上記カラムから溶離した。溶離された、ＤＳＳ活性化固定化核酸ＤＮＡの５．６ ＯＤ₂₆₀単位の量を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．８ １５００ｍｌに添加した。この溶液５０μｌずつを各ウェルに添加し、そのプレートを一夜インキュベートした。次にプレートを１ｘＰＢＳで４回洗浄し、ウェルを吸引して液体を除いた。

プレートの最終のストリッピングを次のようにして行った。０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを含有する０．２Ｎ ＮａＯＨ２００μｌずつを各ウェルに添加した。そのプレートをプラスチックで包み６５℃で６０分間インキュベートした。次いでプレートを１ｘＰＢＳで４回洗浄し、ウェルを吸引し液体を除去した。ストリッピングしたプレートを乾燥剤のビーズとともに２〜８℃で貯蔵した。

検定すべき血清試料は、ＰＣＲとそれに続く配列分析法を用いて分析して遺伝子型を測定した。

試料は、血清試料５０μｌとＰ−Ｋ緩衝液１５０μｌを各ウェルに添加することによって調製した。Ｐ−Ｋ緩衝液は、５３ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０中２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ；０．６Ｍ ＮａＣｌ；０．０６Ｍ クエン酸ナトリウム；８ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；１．３％ ＳＤＳ；１６μｇ／ｍｌの超音波処理サケ精子ＤＮＡ；７％ホルムアミド；５０ｆｍｏｌｅ捕獲プローブ；１６０ｆｍｏｌｅ検出プローブで構成されている。プレートを振とうし、ウェルの内容物を混合し、カバーして１６時間６２℃でインキュベートした。

さらに１０分間室温で保持した後、各ウェルの内容物を吸引してすべての流体を除き、ウェルを、洗浄緩衝液（０．１％ＳＤＳ；０．０１５Ｍ ＮａＣｌ； ０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム）で２回洗浄した。つぎに増幅核酸を各ウェル（０．０４８Ｍ ＮａＣｌ； ０．０４８Ｍクエン酸ナトリウム；０．１％ＳＤＳ；０．５％「ブロッキング剤」（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、カタログ番号１０９０ １７６）の０．７ｆｍｏｌｅ／μｌ溶液５０μｌ）に添加したプレートにふたをし、ウェルの内容物を撹拌混合して、プレートを３０分間５２℃でインキュベートした。

さらに１０分間室温に保持した後、ウェルを上記と同様にして洗浄した。

アルカリホスターゼ標識をした核酸（これはヨーロッパ特許８８３０９６９７６号に開示されている）、を各ウェルに添加した（２．６６ｆｍｏｌｅ／μｌをウェル当り５０μｌ）。５２℃で１５分間、つぎに室温で１０分間インキュベートした後、ウェルを前に述べたと同様に２回洗浄し、次に、０．０１５ＭＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄した。

酵素でトリガーされた（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）ジオキセタン（Ｓｃｈａａｐら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２８巻、１１５９〜１１６２頁、１９８７年およびヨーロッパ特許公開第０２５４０５１号）をＬｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃから入手して利用した。Ｌｕｍｉｐｈｏｓ ５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ）５０μｌずつを各ウェルに添加した。ウェルを軽くたたいて試薬を底部に落下させ、かつゆるやかに旋回させて試薬を底部に均一に分布させた。ウェルにふたをし、３７℃で２０〜４０分間インキュベートした。

プレートを、次に、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ １０００ルミノメー夕（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で読み取った。出力は反応中に発生した光の全合計として示された。

この検定法は、遺伝子型のいかんにかかわらず、各血清試料を確実に検出した。

（ＩＶ．異なる遺伝子型で規定された配列にコードされたポリペプチドの発現）
１〜６６番の配列内の配列でコードされるＨＣＶポリペプチドは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を用いて融合ポリペプチドとして発現される。これらの配列を保持するｃＤＮＡを、発現ベクターｐＳＯＤｃｆ１（Ｓｔｅｉｍｅｒらの１９８６年の文献）中にサブクローン化する。

まずｐＳＯＤｃｆ１から単離されたＤＮＡをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理し、ついで、これら制限酵素によって生成された線状ＤＮＡに下記：

のリンカーを連結した。

クローン化した後、挿入断片を含有するプラスミドを単離した。

挿入断片を含有するプラスミドをＥｃｏＲＩで切断する。このＥｃｏＲＩで線状にしたプラスミドＤＮＡに、ＨＣＶｃＤＮＡを連結する。得られたＤＮＡ混合物を用いてイー・コリ菌株Ｄ１２１０を形質転換する（Ｓａｄｌｅｒらの１９８０年の文献）。ポリペプチド類はゲル状で単離する。

（Ｖ． ポリペプチド類の抗原性）
セクションＩＶで製造されたポリペプチドの抗原性を以下の方法で評価する。８ １２アレー（オーストラリア、ビクトリア州、Ｃｏｓｅｌｃｏ Ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ）中のブロック上に配列したポリエチレン製のピンはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の２０％Ｖ／Ｖ％のピペリジン溶液に３０分間室温で置くことによって調製する。そのピンを取り出しＤＭＦ中で５分間洗浄し、ついでメタノール中で４回洗浄する（２分間／洗浄）。そのピンを少なくとも１０分間空気乾燥し、ＤＭＦ中で（５分間）最終回の洗浄を行う。１−ヒロドキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、３６７ｍｇ）をＤＭＦ（８０μＬ）に溶解し、セクションＩＶで製造したＦｍｏｃで保護したポリペプチドの結合に使用する。

保護されたアミノ酸を、ＨＯＢｔとともに、マイクロ夕イタープレートのウェル内に入れ、前記ピンブロックをプレートの上においてピンをウェル内で浸漬させる。集合体をプラスチック袋内に密封し、２５℃で１８時間反応させて第１アミノ酸をピンに結合させる。次いでブロックを取り出し、ピンをＤＭＦ（２分間）、ＭｅＯＨ（４回、２分間ずつ）および再びＤＭＦ（２分間）で洗って、結合したアミノ酸を洗浄して脱保護する。この手順を、個々の付加するアミノ酸を結合させる際に繰り返し、８量体を製造した。

大部分のエピトープはＮ末端には見られないため正の電荷をもっていないので、遊離のＮ末端はアセチル化して遊離のアミドを保護する。アセチル化反応は、マイクロタイタープレートのウェルをＤＭＦ／無水酢酸／トリエチルアミン（５：２：１ Ｖ／Ｖ／Ｖ）で満たし、ピンをウェル中で９０分間２０℃にて反応させることによって達成される。次いでピンをＤＭＦ（２分間）、ＭｅＯＨ（４回、２分間）で洗浄し、少なくとも１０分間空気乾燥する。

側鎖の保護基は、ポリプロピレンの袋内で４時間室温で、ピンをトリフルオロ酢酸／フェノール／ジチオエタン（９５：２．５：１．５， Ｖ／Ｖ／Ｖ）で処理して除かれる。ついでピンは、ジクロロメタン（２回、２分間）、５％ジーイソプロピルエチルアミン／ジクロロメタン（２回、５分間）およびジクロロメタン（５分間）中で洗い、次いで、少なくとも１０分間空気乾燥を行う。その後、ピンを水（２分間）およびＭｅＯＨ（１８時間）中で洗浄し、減圧乾燥し、シリカゲルの入ったプラスチック製袋内に密封して貯蔵する。

（ＶＩ． Ｂ．１５．６ペプチドの検定）
８量体を有するピンを、破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）緩衝液（１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％２− メルカプトエタノール、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４）中、６０℃で３０分間超音波で処理する。つぎにピンを数回、水（６０℃）中に浸漬し、続いて沸騰ＭｅＯＨ（２分間）中に浸漬し、次いで空気乾燥させる。

つぎにピンをプレコートするが、それはピンを、２００μＬのブロッキング緩衝液（１％オバルブミン、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、および０．０５％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）が入っているマイクロタイターウェル中で、撹拌しながら、２５℃にて１時間行う。次ぎにピンを、ＨＣＶに感染していると診断されたヒトの患者から得た抗血清１７５ｍｌが入って入る微量滴定用ウェルに中に浸漬し、一夜４℃でインキュベートする。血清中のポリクローナル抗体とポリペプチド間の複合体が生成して、ペプチドがインビボで免疫応答を起こしはじめる。このようなペプチドは、ワクチン開発の候補である。

上記のように本発明を説明し例証してきた。本願明細書に添付した請求の範囲から逸脱することなく、かつ本発明の教示事項と適用範囲から逸脱することなく多くの変更と改変を行うことができることは当業者にとっては明かなことである。

本願は、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型に関連する核酸、ペプチドおよび抗体の組成物、ならびに、そのような組成物を診断および治療のために使用する方法を特徴とする。

（配列表） 配列表は配列番号１〜１４７の配列を示す。

図１は、ＨＣＶの遺伝子の構造を示す。 図２ａは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。 図２ｂは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。 図２ｃは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。 図２ｄは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。 図２ｅは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。 図３は、ＨＣＶウイルスゲノムのエンベロープ１領域に由来する配列番号２３〜３２の核酸配列を示す。 図４ａは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。 図４ｂは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。 図４ｃは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。 図４ｄは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。 図４ｅは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。 図５ａは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。 図５ｂは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。 図５ｃは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。 図５ｄは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。 図５ｅは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。 図５ｆは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。 図５ｇは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。 図５ｈは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。 図５ｉは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。

Claims (12)

1. ８〜２５２の連続したヌクレオチド配列からなる非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列を含む非天然型の核酸であって、該核酸は、Ｃ型肝炎ウイルスの５’ＵＴ領域に由来するヌクレオチド配列に完全に相同性であるかまたは完全に相補的であり、および配列番号３４〜４９うちの配列から選択され、該配列は、ＨＣＶ−Ｊ１またはＨＣＶ−Ｊ４ではない、非天然型の核酸。
2. ８〜１８０の連続したヌクレオチド配列からなる非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列を含む非天然型の核酸であって、該核酸は、Ｃ型肝炎ウイルスの５’ＵＴ領域に由来するヌクレオチド配列に完全に相同性であるかまたは完全に相補的であり、および配列番号５０および５１のうちの配列から選択され、該配列は、ＨＣＶ−Ｊ１またはＨＣＶ−Ｊ４ではない、非天然型の核酸。
3. 請求項１に記載の核酸であって、第１のＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型の５’ＵＴ領域うちのヌクレオチド配列に対応し、ここで、前記ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列は、配列番号３４〜３８にのうちの配列から選択される、核酸。
4. 第２のＣ型肝炎ウイルス遺伝子型の５’ＵＴ領域中にある、請求項１に記載の核酸であって、前記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、配列番号３９〜４５のうちの配列から選択される、核酸。
5. 第２のＣ型肝炎ウイルス遺伝子型の５’ＵＴ領域中にある、請求項１に記載の核酸であって、前記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、配列番号４６および４７のうちの配列から選択される、核酸。
6. 第４のＣ型肝炎ウイルス遺伝子型の５’ＵＴ領域中にある、請求項１に記載の核酸であって、前記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、配列番号４８および４９のうちの配列から選択される、核酸。
7. 請求項１〜６のいずかに記載の核酸であって、Ｃ型肝炎ウイルスに対応するヌクレオチド配列を有する核酸を形成する核酸合成のための反応を開始することができる、核酸。
8. ハイブリッド生産物を検出するための標識手段を有する、請求項1〜６のいずれか１項に記載の核酸。
9. ハイブリッド生産物を分離するための支持手段を有する、請求項1〜６のいずれか１項に記載の核酸。
10. ウイルス核酸の転写および翻訳を阻害し得る、請求項1〜６のいずれか１項に記載の核酸。
11. Ｃ型肝炎ウイルス核酸とのハイブリッド生産物を形成する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）請求項１〜９に記載の非天然核酸を、ハイブリッド形成条件が確立され得る条件下におく工程であって、該非天然型の核酸が、ハイブリッド形成条件下で該Ｃ型肝炎ウイルスの核酸と共にハイブリッド生産物を形成し得る工程、および
    （ｂ）ハイブリッド形成条件を確立させて、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸の存在下でハイブリッド生産物を形成する工程
    を包含する、方法。
12. Ｃ型肝炎ウイルスの１以上の遺伝子型を検出する方法であって、以下の工程：
    （ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の非天然型の核酸を、ハイブリッド形成条件を確立させ得る条件下に置く工程、
    （ｂ）ハイブリッド形成条件を確立させて、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸の存在下でハイブリッド生産物を形成する工程、
    （ｃ）ハイブリッド生産物の形成に関して、該非天然型の核酸をモニターする工程であって、該ハイブリッド生産物がＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型の存在を示す工程、
    を包含する、方法。

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