JP2004298112A - Human solid tumor antigen peptide, polynucleotide encoding the same, and use thereof - Google Patents

Abstract

The present invention provides a plurality of novel antigenic peptides effective for diagnosis of solid cancer, antibodies against the antigenic peptides, and a method for diagnosing colorectal cancer using the same.
Kind Code: A1 A solid cancer diagnosis in which a human solid cancer antigen peptide expressing a polynucleotide consisting of 22 kinds of base sequences and a serum of a subject are tested for the presence or absence of an antibody binding to the antigen peptide. Method. A solid cancer diagnostic method for testing whether or not an antibody that binds to the antigen peptide and an antigen peptide that binds to the antibody are present in a biological sample of a subject.
[Selection diagram] None

Description

この出願の発明は、以上のとおりの新規抗原ペプチドと、そのペプチドに対する抗体、それらをコードするポリヌクレオチドを基礎とするものである。
【００１５】
なお、この発明において、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。
【００１６】
また、表１にそれぞれ示した塩基配列およびアミノ酸配列については、１以上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含するものである。
【００１７】
さらに、「血清中抗体」とは、固形癌患者の血清中に存在し、発明（１）の抗原ペプチドと結合する抗体ＩｇＧを意味する。また、発明（４）の「抗体」は、発明（１）の抗原ペプチドを免疫原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を意味する。
【００１８】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の治療方法等に使用可能な薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｅｄ． Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０に、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ， １９９５等に記載されている。
【００１９】
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
発明（１）の抗原ペプチドは、表１に示した２２種の遺伝子またはＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）が発現するタンパク質またはペプチドである。これらの遺伝子産物については様々な機能が知られているが、固形癌における特異的発現は知られていない。またはＥＳＴについてはアミノ酸配列も特定されておらず、当然のこととして、その機能は知られていない。なお、この発明のおいては、ＥＳＴの発現産物は「配列番号３９−４１に示した塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするペプチド」、または「当該ポリヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡが発現するペプチド」と定義する。
【００２１】
なお、後記の実施例に示したように、配列番号１−２０に示した遺伝子は２次元電気泳動法によって、配列番号２１−４１の遺伝子およびＥＳＴはＳＥＲＥＸ法によって特定されたものである。
【００２２】
これら発明（１）の抗原ペプチドは、この発明によって提供される固形癌診断に使用することができる。
【００２３】
これらの抗原ペプチドは、例えば、発明（２）のポリヌクレオチドを保有する組換え発現ベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでペプチドを発現できる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞からペプチドを発現させることができる。
【００２４】
抗原ペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、抗原ペプチドをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７ １８、ｐＴ７／３ １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩなどが例示できる。
【００２５】
抗原ペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有するベクターにポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしている抗原ペプチドを微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２６】
抗原ペプチドを、真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、抗原ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として抗原ペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明の抗原ペプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２７】
抗原ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的ペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２８】
なお、以上の方法によって得られる組換え抗原ペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも第１発明の抗原ペプチドの範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００２９】
発明（２）は、発明（１）の抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片）である。具体的には、各ペプチド（タンパク質）をコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡである。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。またさらに、ゲノムＤＮＡの場合には、その発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、サプレッサー領域）をも含む。
【００３０】
これらのポリヌクレオチドは、それぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、ｃＤＮＡの場合には、公知の方法（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２， １６１−１７０， １９８２； Ｊ． Ｇｅｎｅ ２５， ２６３−２６９， １９８３； Ｇｅｎｅ， １５０， ２４３−２５０， １９９４）を用いてｃＤＮＡを合成し、配列番号１または３の塩基配列に基づいて作製したプローブＤＮＡを用いて、それぞれのｃＤＮＡを単離する方法によって取得することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても各ｃＤＮＡを得ることができる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００３１】
発明（３）は、前記発明（２）のポリヌクレオチド（特にゲノムＤＮＡ）の発現制御領域を構成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、公知のヒトゲノムデータベースを検索するなどの方法によって取得することができる。またこの発明（３）のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えばこの発明の固形癌治療方法に使用することができる。
【００３２】
発明（４）の抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれ発明（１）の抗原ペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、抗原ペプチドやその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。
【００３３】
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年； ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ” Ｊａｍｅｓ Ｗ． Ｇｏｄｉｎｇ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９６）に従い作製することができる。
【００３４】
またこの発明（４）の抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、^１２５Ｉや^３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。
【００３５】
さらにまた、この発明の標識化抗体には、マンガンや鉄等の金属を結合させたものも含まれる。このような金属結合抗体を体内に投与し、ＭＲＩ等によって金属を測定することによって、抗体が結合した抗原ペプチドを産生する癌細胞の存在を検出することができる。
【００３６】
発明（５）のヒト固形癌診断方法は、被験者の血清中に、前記発明（１）の抗原ペプチドのそれぞれと結合する抗体が１種類以上存在か否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定する。すなわち、発明（１）の各抗原ペプチドは、固形癌患者の血清中の抗体（ＩｇＧ）と結合するペプチドであるから、被験者の血清と反応させ、これらの抗原ペプチドと結合する抗体を含む血清を、固形癌患者またはそのハイリスク患者の血清として判定することができる。なおその際に、２種類以上、好ましくは５種類以上、さらに好ましくは１０種類以上、最も好ましくは１５−２２種類の抗原ペプチドについて血清中抗体との結合を判定する。またさらに、すでに知られている他の固形癌マーカーを併用することもできる。
【００３７】
具体的な診断は、例えば抗原ペプチドに被験者血清を接触させ、抗原ペプチドと被験者血清中のＩｇＧ抗体とを液相中において反応させる。さらに血清中のＩｇＧ抗体と特異的に結合する標識化ＩｇＧ抗体を反応させて、標識化ＩｇＧ抗体のシグナルを検出すればよい。標識化ＩｇＧ抗体の標識物質は、前記の標識化抗体において例示したような酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
【００３８】
シグナルの検出は、例えば、ウエスタンブロット分析を採用することができる。あるいは、抗原ペプチド＋血清中抗体＋標識化ＩｇＧ抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識化ＩｇＧ抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。
【００３９】
なお、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１０）の診断キットが提供される。
【００４０】
発明（５）の診断方法はまた、抗原ペプチドの１種類以上をプレートまたはメンブレン上に固定化し、この基板上において被験者血清の抗体との結合を試験する方法（発明（６））として実施することもできる。抗原ペプチドを基板上に固定化することによって、未結合の標識化結合分子を容易に除去することができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１１）の診断キットが提供される。また特に、数十種類の抗原ペプチドを固定化したメンブレンを用いるプロテインアレイ法では、０．０１ｍｌ程度の被験者血清を用いて多種類の抗体の発現を短時間で解析することができる。
【００４１】
この出願の発明（７）の診断方法は、被験者の生体試料中に、前記発明（４）の抗体、またはその標識化抗体と結合する抗原ペプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原ペプチドが存在する被験者を固形癌患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体または標識化抗体は、大腸癌細胞で発現している抗原ペプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原ペプチドを含む生体試料を、固形癌患者またはそのハイリスク患者の試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは２種類以上、好ましくは５種類以上、さらに好ましくは１０種類以上、最も好ましくは１５−２２種類の抗体について試料中の抗原ペプチドとの結合を判定する。また、生体試料としては、血液や血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。
【００４２】
この発明（７）の診断方法における一つの態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、発明（４）の標識化抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体を前記発明（５）と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１２）の診断キットが提供される。
【００４３】
液相系での診断の別の方法は、発明（４）の抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記発明（５）と同様とすることができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１３）の診断キットが提供される。
【００４４】
発明（７）の診断方法における別の態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原ペプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、発明（４）の抗体（一次抗体）を樹脂プレートまたはメンブレン等に固定化し、この固定化抗体に抗原ペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋抗原ペプチド結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）」として広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は前記発明（５）と同様とすることができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１４）の診断キットが提供される。
【００４５】
発明（１０）〜（１４）の診断キットは、前記発明（５）〜（８）の診断方法を行うための試薬キットである。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗原ペプチド、抗体および／または標識化抗体を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。
【００４６】
発明（９）の診断方法は、被験者の生体試料における前記発明（２）のポリヌクレオチドのそれぞれの存在量を試験し、１以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を固形癌患者またはそのハイリスク者と判定する。具体的な判定基準としては、被験者のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれと比較して、１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは１００％以上である場合である。
【００４７】
生体試料としては、便や血液、血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。ポリヌクレオチドの検出、測定は公知のＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ＲＴ−ＰＣＴ法等によって行うことができ、その場合のＰＣＲは発明（１５）のプライマーセットを用いることができる。
【００４８】
これらのプライマーセットは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４０および４１の各塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００４９】
発明（１６）は、発明（３）のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いて固形癌を治療する方法である。発明（３）のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（以下、「プロモーター配列」と記載する）は、固形癌細胞で特異的に発現する遺伝子の発現制御領域であるため、このプロモーター配列に抗癌物質をコードするポリヌクレオチドを連結して治療用遺伝子を作製し、これを遺伝子治療等の方法により体内に投与すれば、治療用遺伝子を癌細胞特異的に発現させることが可能となる。抗癌作用を有する物質あるいは抗癌作用を有する物質の前駆物質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えばｐ５３、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２、−１２、−１７、−１８、ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ｕｒａｃｉｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ等のコードする遺伝子ＤＮＡやそのｃＤＮＡ等を利用することができる。また、このプロモーター配列は、アデノウイルスやヘルペスウイルスを癌細胞特異的に増殖させて癌細胞を融解させる治療法に使用することもできる。すなわち、例えばアデノウイルスのＥ１Ａ領域の前にプロモーター配列を挿入することによって、このアデノウイルスは癌細胞においてのみ特異的に増殖し、癌細胞を融解させる。
【００５０】
発明（１７）は、前記発明（４）の抗体を用いて固形癌を治療する方法である。発明（４）の抗体は、癌細胞で特異的に発現する抗原ペプチドに結合するため、この抗体に公知の抗癌物質や抗癌剤を結合させて患者体内に投与することによって、抗癌物質や抗癌剤を癌細胞特異的に作用させることができる。また、抗体が癌細胞に対する殺傷作用を有するものであれば、抗体の単独投与によっても治療効果を得ることができる。
【００５１】
発明（１８）は、前記発明（１）の抗原ペプチドの発現量を制御することによって固形癌を治療する方法に関するものである。すなわち、発明（１）の抗原ペプチドは癌細胞で特異的に発現しているため、その発現が細胞の癌化の原因となっている可能性が高い。そのため、この抗原ペプチドの発現を抑制すれば、細胞の癌化やその進行に対する治療効果が期待される。具体的には、発明（２）のポリヌクレオチド（特にｍＲＮＡ）に対するアンチセンスＤＮＡ鎖を用いたアンチセンス療法や、２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法によってこの治療法を行うことができる。
【００５２】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００５３】
【実施例】
実施例１：二次元電気泳動による抗原ペプチドの同定
［１］材料と方法
患者（６名）の了解のもと、大腸癌提出直後の癌部および非癌部組織のそれぞれから凍結標本を採取し、―８０℃に保存した。この凍結標本の適量を９．５Ｍ Ｕｒｅａ、２％ ＣＨＡＰＳ、１％ ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビターコンプリート（ロッシュ）溶液中でホモジェナイズした後、超高速遠心器（日立）で１００，０００ｇにて遠心し、上清（タンパク質溶液）を抽出し、吸光度によりタンパク質濃度を同定した。
【００５４】
癌部および非癌部組織から得られたタンパク質それぞれを４００μｇを一次元目はアガロース等電点電気泳動で、二次元目は１２％ Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離されたタンパク質をクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、非癌部組織に比較して癌部組織で発現量が増大しているスポットを検出した。このスポットからゲルを切り出し、ゲル中に含まれているタンパク質をトリプシン（ロッシュ）により消化し、得られたペプチドを回収し、イオントラップ型質量分析器（サーモクエスト社ＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰ ）によりアミノ酸配列を決定した。
［２］結果
６名中、４名以上の大腸癌患者の癌組織において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０のアミノ酸配列を有するタンパク質の特異的発現が確認された。
【００５５】
これらのタンパク質のコード配列は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９であり、それぞれの遺伝子は表１に示したとおりである。
実施例２：ＳＥＲＥＸ法による抗原ペプチドの特定
［１］ｃＤＮＡライブラリーの作製
食道癌、大腸癌、乳癌患者の了解を得て、癌摘出直後の癌部組織の細胞を単離し、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。これらの培養細胞からｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出法によりトータルＲＮＡ（２５０μｇ）を単離し、ｏｌｉｇｏ−ｄＴ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ ｓｕｐｅｒ， ＴＡＫＡＲＡ社）を用いたポリ（Ａ）セレクションを２回行い、ｍＲＮＡを精製した。この得られたｍＲＮＡ（５．７μｇ）を用いて各細胞のｃＤＮＡライブラリーを構築した。一本鎖ｃＤＮＡは、Ｘｈｏ Ｉリンカープライマーと５−ｍｅｔｈｙｌ ｄＣＴＰを用いて合成した。この一本鎖ｃＤＮＡからＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより平滑末端を有する二本鎖ｃＤＮＡを合成し、この二本鎖ｃＤＮＡの両端に制限酵素サイト（Ｅｃｏ ＲＩ／λＺＡＰ ＩＩ）を含むリンカーを付加した。ｃＤＮＡフラグメントをバクテリオファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入し、それぞれの癌細胞について、約１．８×１０^６個のクローンからなるｃＤＮＡライブラリーを作製した。
［２］ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記で作製した各癌細胞のｃＤＮＡライブラリーの各ファージベクターを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させ、ＮＺＹアガロースプレート上でプラークを形成させた。各感染大腸菌に対して、１０ｍＭのＩＰＴＧ処理により発現誘導し、各ｃＤＮＡがコードするペプチドを発現させた。このペプチドをニトロセルロース膜（ＮｉｔｒｏＢｉｎｄ： Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社）に転写し、ＴＢＳ［０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．５）］で膜を洗浄して吸着したバクテリオファージを除去した後、１％のアルブミンを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて非特異反応を抑制した。このフィルターを２０００倍希釈した１６名の食道癌患者血清と室温でそれぞれ２時間反応させた。
【００５６】
血清は、患者から単離した後、−８０℃で保存し、使用直前に１重量％のアルブミンを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．５％のｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）溶液で５００倍に最終的に希釈したものを用いた。この希釈した血清を、大腸菌のライセートと１：５の割合で混合し、４℃で８時間放置後、１５，０００回転にて２０分間遠心し、上清を回収したものを用いた。また、必要に応じて無処理の血清を２０００倍に希釈して用いた。
【００５７】
血清と、上記の発現ペプチドをブロットしたニトロセルロース膜とを室温で１０〜２０時間反応させて血清中の抗体が反応したペプチドを特定した。すなわち、二次抗体として５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗体（Ｊａｃｈｓｏｎ社）を用いて反応させ、Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｗａｋｏ社）と５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ社）を用いた酵素発色反応により標識シグナルを検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）に溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、２０名の患者の血清中のＩｇＧと反応するファージクローンをスクリーニングして、陽性クローン３４７個を単離した。
［３］新規抗原の特定
得られた陽性クローンから、ＰＣＲ法によりインサートＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物を、Ｂｉｇ Ｄｙｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）とＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）とを用いて配列決定した。既存データベースを用いて検索した結果、既知の癌関連遺伝子の発現産物である抗原ペプチドを除き、さらに複数の患者の血清中抗体と反応する１０種の新規抗原ペプチドを特定した。これら１０種の新規抗原ペプチドのアミノ酸をコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）配列は、それぞれ配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４０および４１の各塩基配列を有している。また、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５および３７の各塩基配列は、それぞれ配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８のアミノ酸配列を有している。
【００５８】
図１−１２は、これら１２種の新規抗原ペプチドと各患者血清中の抗体との結合反応を調べたウエスタンブロット分析の結果である。この図１−１２において、矢印は患者血清中の抗体と特異的に反応したポリペプチドを示す。ＩＰＴＧ処理した大腸菌抽出液において検出され、無処理の大腸菌抽出液には検出されないことから導入したｃＤＮＡ由来のポリペプチドであると確認できる。
【００５９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、大腸癌の診断用マーカーとして有用な新規抗原ペプチド２種と、これらを用いた大腸癌診断方法が提供される。これによって、大腸癌の早期かつ高精度の診断が可能となる。
【００６０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号２１に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号２２）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図２】配列番号２３に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号２４）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図３】配列番号２５に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号２６）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図４】配列番号２７に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号２８）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図５】配列番号２９に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３０）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図６】配列番号３１に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３２）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図７】配列番号３３に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３４）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図８】配列番号３５に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３６）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図９】配列番号３７に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３８）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図１０】配列番号３９に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図１１】配列番号４０に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図１２】配列番号４１に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The invention of this application relates to an antigen peptide for human solid cancer, a polynucleotide encoding the peptide, and a method for diagnosing solid cancer using the same.
[0002]
[Prior art]
Solid such as esophageal cancer, gastric cancer, lung cancer, renal cancer, thyroid cancer, parotid gland cancer, head and neck cancer, bone and soft tissue sarcoma, ureteral cancer, bladder cancer, uterine cancer, liver cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer All cancers are malignant tumors, especially advanced solid cancers that are difficult to treat and often fatal. Therefore, early detection of carcinoma is the most important issue as a measure against solid cancer.
[0003]
Conventionally, solid cancers have been diagnosed using cancer tissue-specific serum markers such as α-fetoprotein, CEA, SCC, CA19-9, and CYFR21-1 and the course of treatment. This method does not require a large-scale facility and has a small burden on the subject, so that it can be widely applied to many subjects without subjective symptoms. However, all of these cancer markers have a positive rate of only about 20 to 30%, and in most cases are particularly negative in early cancer, and are insufficient as a means for early detection of solid cancer. there were.
[0004]
On the other hand, as a method for treating solid cancer, surgical resection of cancer tissue, systemic administration of an anticancer drug, and the like are performed. However, as described above, these treatments have little effect in the case of advanced solid cancer, and even if they are found early, these treatments are extremely burdensome on the patient. There is a problem that.
[0005]
In addition, as a molecular biological diagnosis method using an antigen protein marker, for example, Patent Documents 1 to 3 are known. In addition, a SEREX method (serological identification of antigens by recombinant expression cloning) for screening a protein prepared from mRNA of tumor cells of a cancer-bearing patient in the patient's autologous serum was reported (Non-Patent Document 1; Patent Document 4). It has been reported that cancer antigens recognized by IgG antibodies in tumors, kidney cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, lung cancer and the like were isolated by the SEREX method (Non-Patent Documents 2-7). Patent Literature 5 discloses a malignant melanoma antigen protein identified by the SEREX method, a DNA sequence encoding the same, and a method for diagnosing malignant melanoma using the same.
[0006]
[Patent Document 1]
JP-A-7-51065
[Patent Document 2]
Rev. 00/060073
[Patent Document 3]
JP 2000-511536 A
[Patent Document 4]
U.S. Pat. No. 5698396
[Patent Document 5]
JP 2001-337378 A
[Non-patent document 1]
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11810-11813, 1995.
[Non-patent document 2]
Int. J. Cancer 72: 965-971, 1997.
[Non-Patent Document 3]
Cancer Res. 58: 1034-1041, 1998.
[Non-patent document 4]
Int. J. Cancer 29: 652-658, 1998.
[Non-Patent Document 5]
Int. J. Oncol. 14: 703-708, 1999
[Non-Patent Document 6]
Cancer Res. 56: 4766-4772, 1996.
[Non-Patent Document 7]
Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, as a method for early diagnosis of solid cancer, the effectiveness of molecular biological diagnostic methods using cancer tissue-specific antigen protein markers has been pointed out, and several new antigen protein markers have been pointed out. Proposed. However, in order to further improve the diagnostic accuracy, it is essential to prepare more protein markers with high antigenicity and use them in combination.
[0008]
In addition, since these antigenic protein markers are predominantly expressed in solid cancer tissues, their application to therapeutic methods targeting only cancer tissues is also expected.
[0009]
The invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and has an object to provide a novel antigenic peptide which is effective for diagnosis and treatment of solid cancer.
[0010]
Another object of the invention of this application is to provide a genetic material encoding the antigen peptide and an antibody against the antigen peptide.
[0011]
It is another object of the invention of this application to provide a method for diagnosing solid cancer and a method for treating solid cancer using the above-described peptide, polynucleotide, antibody, and the like.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
This application provides the following inventions (1) to (18) to solve the above problems.
(1) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 40 and 41 A human solid cancer antigen peptide expressed by a polynucleotide having a base sequence.
(2) A polynucleotide encoding the antigenic peptide of the invention (1).
(3) An oligonucleotide or a polynucleotide constituting the expression control region of the polynucleotide of the invention (2).
(4) An antibody that binds to the antigenic peptide of claim 1.
(5) It is tested whether or not an antibody that binds to each of the antigenic peptides of the invention (1) is present in the serum of the subject, and the subject in which one or more antibodies are present in the serum is a solid cancer patient or A method for diagnosing human solid cancer cancer, comprising determining that the patient has a high risk of solid cancer.
(6) The diagnostic method according to the invention (5), wherein the binding between the antibody of the subject's serum and the antigen peptide is tested on a plate or a membrane on which one or more antigen peptides are immobilized.
(7) A test is performed to determine whether or not a biological sample of a subject contains an antigen peptide that binds to each of the antibodies of the invention (4). Alternatively, a method for diagnosing human solid cancer, characterized by determining that the patient is at high risk for solid cancer.
(8) The diagnostic method according to the invention (7), wherein the binding between the antibody and the antigen peptide is tested on a plate or a membrane on which one or more kinds of antibodies are immobilized.
(9) The abundance of each of the polynucleotides of the invention (2) in a biological sample of a subject is tested, and a subject in which the abundance of one or more polynucleotides is higher than that of a healthy subject is determined as a solid cancer patient or a solid subject. A method for diagnosing human solid cancer, characterized by determining that the patient is at high risk of cancer.
(10) At least the following elements:
(A) one or more antigen peptides of the invention (1); and
(B) Labeled antibody that specifically binds to serum antibody
A diagnostic kit for solid cancer, comprising:
(11) At least the following elements:
(A) a plate or a membrane on which at least one kind of the antigenic peptide of the invention (1) is immobilized; and
(B) Labeled antibody that specifically binds to serum antibody
A diagnostic kit for solid cancer, comprising:
(12) A solid cancer diagnostic kit comprising at least one kind of the antibody of the invention (4) and / or its labeled antibody.
(13) At least the following elements:
(A) one or more antibodies of the invention (4); and
(B) a labeled antibody obtained by labeling the antibody of (a) above;
A diagnostic kit for solid cancer, comprising:
(14) At least the following elements:
(A) a plate or a membrane on which one or more of the antibodies of the invention (4) are immobilized; and
(B) a labeled antibody obtained by labeling the antibody of (a) above;
A diagnostic kit for solid cancer, comprising:
(15) A primer set for PCR-amplifying the polynucleotide of the invention (2).
(16) A method for treating solid cancer, comprising using the oligonucleotide or polynucleotide of the invention (3).
(17) A method for treating solid cancer, comprising using the antibody of the invention (4).
(18) A method for treating solid cancer, comprising suppressing the expression level of the antigenic peptide of the invention (1).
[0013]
That is, the inventors of the present application obtain the consent of the patient from the normal part and the cancerous part of a surgical specimen of a colorectal cancer patient, extract proteins, and perform two-dimensional electrophoresis (for example, Electrophoresis 22: 3019-3025). 2001), 10 antigen peptides (upper 10 in Table 1) which were specifically expressed in solid cancer cells and whose function as a tumor marker was not conventionally known were found. Further, the serum collected with the consent of the esophageal cancer patient was analyzed by the SEREX method, and 12 types of specific antibodies (lower 12 types in Table 1) present only in the serum of the esophageal cancer patient were found.
[0014]
[Table 1]

The invention of this application is based on the novel antigenic peptide described above, an antibody against the peptide, and a polynucleotide encoding them.
[0015]
In the present invention, “protein” and “peptide” mean a molecule composed of a plurality of amino acid residues linked to each other by an amide bond (peptide bond). A “polynucleotide” is a molecule in which 100 or more nucleoside phosphates (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP) in which a purine or pyrimidine is β-N-glycosidically linked to a sugar are linked. And "oligonucleotide" refers to a molecule in which 2-99 are linked.
[0016]
In addition, regarding the base sequence and the amino acid sequence shown in Table 1, addition or deletion of one or more bases, substitution with other bases, or addition or deletion of one or more amino acid residues based on these base mutations. And substitutions to other amino acids.
[0017]
Furthermore, “serum antibody” means an antibody IgG that is present in the serum of a solid cancer patient and binds to the antigenic peptide of the invention (1). The “antibody” of the invention (4) means a polyclonal antibody or a monoclonal antibody prepared using the antigen peptide of the invention (1) as an immunogen.
[0018]
Other terms and concepts in the present invention are defined in detail in the description and examples of the embodiments of the present invention. Various techniques used for carrying out the present invention can be easily and reliably implemented by those skilled in the art based on known documents and the like, except for the technique whose source is clearly indicated. For example, the preparation of a drug that can be used in the treatment method of the present invention is described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990, genetic engineering and molecular biology techniques are described in Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York; M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.W. Y, 1995.
[0019]
Hereinafter, embodiments of each invention will be described in detail.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The antigenic peptide of the invention (1) is a protein or peptide expressed by 22 kinds of genes or EST (Expressed Sequence Tag) shown in Table 1. Various functions are known for these gene products, but specific expression in solid tumors is not known. Alternatively, the amino acid sequence of EST is not specified, and its function is, of course, not known. In the present invention, the expression product of the EST is “a peptide encoded by a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39-41” or “a peptide expressed by a genomic DNA to which the polynucleotide hybridizes”. Is defined.
[0021]
As described in Examples below, the genes shown in SEQ ID NOS: 1 to 20 were identified by two-dimensional electrophoresis, and the genes of SEQ ID NOS: 21 to 41 and EST were identified by the SEREX method.
[0022]
The antigen peptide of the invention (1) can be used for the diagnosis of solid cancer provided by the invention.
[0023]
These antigenic peptides can be expressed in vitro by, for example, preparing RNA by in vitro transcription from a recombinant expression vector having the polynucleotide of the invention (2) and performing in vitro translation using the RNA as a template. When a recombinant expression vector is introduced into a prokaryotic cell such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, or a eukaryotic cell such as yeast, insect cell, or mammalian cell to produce a transformed cell, the peptide is expressed from the transformed cell. be able to.
[0024]
When expressing the antigen peptide by in vitro translation, the polynucleotide is inserted into a vector having an RNA polymerase promoter to prepare a recombinant expression vector, and this vector is lysed in rabbit reticulocyte lysate containing RNA polymerase corresponding to the promoter. When added to an in vitro translation system such as a product or a wheat germ extract, an antigenic peptide can be produced in vitro. Examples of the RNA polymerase promoter include T7, T3, SP6 and the like. Examples of vectors containing these RNA polymerase promoters include pKA1, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, and pBluescript II.
[0025]
When expressing an antigen peptide in a microorganism such as Escherichia coli, an expression vector is prepared by recombining a polynucleotide into a vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, a terminator, etc., which can be replicated in the microorganism. After transforming a host cell with this expression vector, and culturing the resulting transformant, the antigen peptide encoded by the polynucleotide can be expressed from a microorganism. At this time, it can be expressed as a fusion protein with another protein. Examples of the expression vector for Escherichia coli include a pUC system, pBluescript II, a pET expression system, and a pGEX expression system.
[0026]
When the antigen peptide is expressed in eukaryotic cells, a polynucleotide is inserted into an expression vector for eukaryotic cells having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site and the like to prepare a recombinant vector. When introduced into a nuclear cell, the antigenic peptide can be expressed in the transformed eukaryotic cell. Examples of expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, and the like. When pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as expression vectors, fusion proteins to which various tags such as His tag, FLAG tag, myc tag, HA tag and GFP are added. As an antigen peptide. As eukaryotic cells, mammalian cultured cells such as monkey kidney cells COS7 and Chinese hamster ovary cells CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, Xenopus egg cells and the like are generally used, and the antigen peptide of the present invention can be expressed. Any eukaryotic cell can be used. In order to introduce the expression vector into eukaryotic cells, known methods such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, and a DEAE dextran method can be used.
[0027]
In order to isolate and purify the target peptide from the culture after expressing the antigen peptide in prokaryotic cells or eukaryotic cells, known separation operations can be combined. For example, treatment with a denaturant or a surfactant such as urea, ultrasonic treatment, enzymatic digestion, salting out or solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography and the like.
[0028]
The recombinant antigen peptide obtained by the above method includes a fusion protein with any other protein. For example, a fusion protein with glutatin-S-transferase (GST) and green fluorescent protein (GFP) can be exemplified. Furthermore, a peptide expressed in a transformed cell may undergo various modifications in the cell after being translated. Therefore, the modified peptide is also included in the scope of the antigen peptide of the first invention. Examples of such post-translational modifications include N-terminal methionine elimination, N-terminal acetylation, sugar chain addition, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, phosphorylation and the like.
[0029]
Invention (2) is a polynucleotide (DNA fragment, RNA fragment) encoding the antigenic peptide of invention (1). Specifically, it is a genomic DNA encoding each peptide (protein), an mRNA transcribed from the genomic DNA, and a cDNA synthesized from the mRNA. It may be double-stranded or single-stranded. Furthermore, the sense strand and antisense strand of these genomic DNAs, mRNAs and cDNAs are also included. Further, in the case of genomic DNA, the expression control region (promoter, enhancer, suppressor region) is also included.
[0030]
These polynucleotides can be easily obtained by known methods. For example, in the case of cDNA, a known method (Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982; J. Gene 25, 263-269, 1983; Gene, 150, 243-250, 1994) is used. Can be obtained by using a probe DNA prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 to isolate each cDNA. Each cDNA can also be obtained by the RT-PCR method using mRNA isolated from human cells as a template using the primer set provided by the present invention. The obtained cDNA is subjected to, for example, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, NASBN (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transscription-mediated amplification) method, and SDA (Differential Exchange method). Can be amplified.
[0031]
Invention (3) is an oligonucleotide or polynucleotide constituting an expression control region of the polynucleotide (particularly genomic DNA) of the invention (2). Such an oligonucleotide or polynucleotide can be obtained, for example, by a method such as searching a known human genome database. The oligonucleotide or polynucleotide of the present invention (3) can be used, for example, in the method for treating solid cancer of the present invention.
[0032]
The antibody of the invention (4) is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and the whole molecule capable of binding to the epitope of the antigenic peptide of the invention (1), Fab, F (ab ') ₂ , Fv fragments and the like. For example, in the case of a polyclonal antibody, such an antibody can be obtained from serum after immunizing an animal using an antigen peptide or a partial fragment thereof as an immunogen. Alternatively, it can be prepared by introducing the above expression vector for eukaryotic cells into an animal muscle or skin by injection or gene gun, and then collecting serum. As animals, mice, rats, rabbits, goats, chickens and the like are used.
[0033]
In addition, a monoclonal antibody can be prepared by a known monoclonal antibody preparation method (“monoclonal antibody”, written by Kamei Chomune and Hiroshi Terada, Hirokawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody”, James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996). In accordance with the following.
[0034]
The antibody of the present invention (4) also includes an antibody labeled with a labeling substance. As the labeling substance, an enzyme, a radioisotope or a fluorescent dye can be used. The enzyme is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of the substrate, and is used for ordinary EIA. Enzymes, for example, peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphoryl dehydrogenase, malate dehydrogenase and the like can also be used. In addition, enzyme inhibitors, coenzymes, and the like can also be used. The binding between the enzyme and the antibody can be performed by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the substrate, a known substance can be used depending on the type of the enzyme to be used. For example, when peroxidase is used as an enzyme, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzicin can be used. When alkaline phosphatase is used as an enzyme, paranitrophenol or the like can be used. As radioisotopes, ¹²⁵ I and ³ H and the like used in normal RIA can be used. As the fluorescent dye, those used in ordinary fluorescent antibody methods such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.
[0035]
Furthermore, the labeled antibodies of the present invention also include those to which metals such as manganese and iron are bound. By administering such a metal-binding antibody into the body and measuring the metal by MRI or the like, the presence of cancer cells that produce the antigen peptide to which the antibody has bound can be detected.
[0036]
The method for diagnosing human solid cancer of the invention (5) tests whether or not one or more antibodies binding to each of the antigenic peptides of the invention (1) are present in the serum of the subject, and the antibody is contained in the serum. An existing subject is determined to be a solid cancer patient or a solid cancer high-risk individual. That is, since each antigen peptide of the invention (1) is a peptide that binds to an antibody (IgG) in the serum of a solid cancer patient, it is reacted with the serum of a subject, and a serum containing an antibody that binds to these antigen peptides is obtained. , Serum of a solid cancer patient or a high-risk patient thereof. At that time, the binding to the serum antibody is determined for two or more, preferably five or more, more preferably ten or more, and most preferably 15 to 22 antigen peptides. Still further, other known solid cancer markers can also be used in combination.
[0037]
For specific diagnosis, for example, the serum of the subject is brought into contact with the antigen peptide, and the antigen peptide is reacted with the IgG antibody in the serum of the subject in a liquid phase. Further, a signal of the labeled IgG antibody may be detected by reacting a labeled IgG antibody that specifically binds to the IgG antibody in the serum. As the labeling substance of the labeled IgG antibody, an enzyme, a radioisotope or a fluorescent dye as exemplified in the above-mentioned labeled antibody can be used. When an enzyme is used, a substrate that decomposes by the action of the enzyme and develops a color is added, and the enzyme activity is determined by optically measuring the amount of degradation of the substrate. Is used to calculate the amount of antibody. When a radioactive isotope is used, the radiation dose emitted by the radioisotope is measured by a scintillation counter or the like. When a fluorescent dye is used, the amount of fluorescence may be measured by a measuring device combined with a fluorescent microscope.
[0038]
For detection of the signal, for example, Western blot analysis can be employed. Alternatively, the conjugate of the antigen peptide + serum antibody + labeled IgG antibody is separated by known separation means (chromatography, salting out, alcohol precipitation, enzyme method, solid phase method, etc.), and the labeled IgG antibody May be detected.
[0039]
In addition, a diagnostic kit of the invention (10) is provided as one that enables such a diagnostic method to be performed simply and widely.
[0040]
The diagnostic method of the invention (5) may be carried out as a method (invention (6)) of immobilizing one or more antigen peptides on a plate or a membrane and testing the binding of the subject's serum to the antibody on the substrate. You can also. By immobilizing the antigen peptide on the substrate, unbound labeled binding molecules can be easily removed. Further, a diagnostic kit of the invention (11) is provided as one that enables such a diagnostic method to be carried out simply and widely. In particular, in the protein array method using a membrane on which several tens of antigen peptides are immobilized, the expression of various types of antibodies can be analyzed in a short time using about 0.01 ml of the serum of the subject.
[0041]
The diagnostic method of the invention (7) of the present application tests whether or not the antibody of the invention (4) or an antigen peptide that binds to the labeled antibody thereof is present in a biological sample of a subject, The subject in which the antigen peptide is present is determined as a solid cancer patient or a high-risk subject. That is, since the antibody or labeled antibody used here is an antibody that specifically binds to an antigen peptide expressed in colorectal cancer cells, a biological sample containing the antigen peptide that binds to this antibody is used for solid cancer patients. Alternatively, it can be determined as a sample of the high-risk patient. At this time, the binding of the antibody to the antigen peptide in the sample is preferably determined for two or more, preferably five or more, more preferably ten or more, and most preferably 15 to 22 antibodies. In addition, blood and blood cells (such as mononuclear cells) can be used as the biological sample.
[0042]
One aspect of the diagnostic method of the present invention (7) is a method of binding an antibody and an antigen peptide in a liquid phase system. For example, the labeled antibody of the invention (4) is brought into contact with a biological sample to bind the labeled antibody to the antigen peptide, the conjugate is separated by the same method as in the invention (5), and the labeled signal is converted to the same signal. Detect by method. The diagnostic kit of the invention (12) is provided as a method that enables such a diagnostic method to be carried out simply and widely.
[0043]
Another method for diagnosis in a liquid phase system is to contact the antibody (primary antibody) of the invention (4) with a biological sample to bind the primary antibody and the antigen peptide, and to attach the labeled antibody (secondary antibody) ) Is detected, and the labeled signal in the conjugate is detected. Alternatively, in order to further enhance the signal, an unlabeled secondary antibody may first be bound to the antibody + antigen peptide conjugate, and a labeling substance may be bound to this secondary antibody. Such binding of the labeling substance to the secondary antibody can be performed, for example, by biotinylating the secondary antibody and avidinizing the labeling substance. Alternatively, an antibody (tertiary antibody) recognizing a partial region (for example, Fc region) of the secondary antibody may be labeled, and the tertiary antibody may be bound to the secondary antibody. As the primary antibody and the secondary antibody, both monoclonal antibodies can be used, or one of the primary antibody and the secondary antibody can be a polyclonal antibody. Separation of the conjugate from the liquid phase and detection of the signal can be performed in the same manner as in the invention (5). In addition, a diagnostic kit of the invention (13) is provided as one that enables such a diagnostic method to be performed simply and widely.
[0044]
Another aspect of the diagnostic method of the invention (7) is a method of testing the binding between an antibody and an antigen peptide in a solid phase system. This method using a solid phase system is a preferred method for detecting a trace amount of an antigen peptide and simplifying the operation. That is, this solid-phase method involves immobilizing the antibody (primary antibody) of the invention (4) on a resin plate or a membrane, binding the antigen peptide to the immobilized antibody, washing away the unbound peptide, and This is a method in which a labeled antibody (secondary antibody) is bound to the antibody + antigen peptide conjugate remaining above and the signal of this secondary antibody is detected. This method is a so-called “sandwich method”, and when an enzyme is used as a marker, the method is widely used as “ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)”. As the primary antibody and the secondary antibody, both monoclonal antibodies can be used, or one of the primary antibody and the secondary antibody can be a polyclonal antibody. Detection of the signal can be performed in the same manner as in the invention (5). In addition, a diagnostic kit of the invention (14) is provided as one that enables simple and wide-ranging implementation of such a diagnostic method.
[0045]
The diagnostic kits of the inventions (10) to (14) are reagent kits for performing the diagnostic methods of the inventions (5) to (8). Various such kits are commercially available depending on the type of the test component. The diagnostic kit of the present invention also uses the antigenic peptide, antibody and / or labeled antibody provided by the present invention. Except for this, it can be constituted by each element used in a publicly known kit.
[0046]
The diagnostic method of the invention (9) tests the abundance of each of the polynucleotides of the invention (2) in a biological sample of the subject, and examines the subject in which the abundance of one or more polynucleotides is larger than those of healthy subjects. Is determined to be a solid cancer patient or a high-risk person thereof. As a specific criterion, when the amount of the polynucleotide of the subject is 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 100% or more compared to that of a healthy person It is.
[0047]
The biological sample may be stool, blood, or blood cells (eg, mononuclear cells). The detection and measurement of the polynucleotide can be performed by a known PCR method, RT-PCR method, quantitative RT-PCT method, or the like, and in that case, the PCR can use the primer set of the invention (15).
[0048]
These primer sets have SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 40 and It can be designed based on each base sequence of No. 41 and prepared through each step of synthesis and purification. The following points can be pointed out, for example, as points to consider when designing primers. The size (number of bases) of the primer is 15 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases in consideration of satisfying specific annealing with the template DNA. However, when performing LA (long accurate) PCR, at least 30 bases are effective. Avoid a complementary sequence between a pair of primers consisting of a sense strand (5 'end) and an antisense strand (3' end) so that they do not anneal to each other. In order to prevent the formation of a hairpin structure, self-complementary sequences are also avoided. Furthermore, in order to ensure stable binding to the template DNA, the GC content is set to about 50% so that GC-rich or AT-rich is not unevenly distributed in the primer. Since the annealing temperature depends on the melting temperature (Tm), primers having a Tm value of 55 to 65 ° C. and close to each other are selected to obtain a highly specific PCR product. It is also necessary to pay attention to the adjustment of the final concentration of the use of the primer in the PCR to be about 0.1 to about 1 μM. Also, commercially available software for designing primers, for example, Oligo ™ [National Bioscience Inc. (USA), GENETYX [Software Development Co., Ltd. (Japan)], and the like.
[0049]
Invention (16) is a method for treating solid cancer using the oligonucleotide or polynucleotide of invention (3). Since the oligonucleotide or polynucleotide of the invention (3) (hereinafter referred to as “promoter sequence”) is an expression control region of a gene specifically expressed in solid cancer cells, the promoter sequence encodes an anticancer substance. If a therapeutic gene is prepared by linking the polynucleotides to be administered and administered into the body by a method such as gene therapy, the therapeutic gene can be specifically expressed in cancer cells. Examples of the polynucleotide encoding a substance having an anticancer effect or a precursor of a substance having an anticancer effect include, for example, p53, herpes simplex virus thymidine kinase, Interleukin-2, -12, -17, -18, cytosine deaminase, uracil. For example, a gene DNA encoding cDNA such as phosphoribosyltransferase and its cDNA can be used. This promoter sequence can also be used in a therapeutic method in which an adenovirus or herpes virus is proliferated in a cancer cell-specific manner to thaw the cancer cells. That is, for example, by inserting a promoter sequence in front of the E1A region of the adenovirus, the adenovirus proliferates specifically only in cancer cells and causes the cancer cells to thaw.
[0050]
Invention (17) is a method for treating solid cancer using the antibody of invention (4). Since the antibody of the invention (4) binds to an antigenic peptide that is specifically expressed in cancer cells, a known anticancer substance or anticancer agent is bound to this antibody and administered to a patient, whereby the anticancer substance or anticancer agent is administered. Can act specifically on cancer cells. In addition, as long as the antibody has a killing effect on cancer cells, a therapeutic effect can be obtained even by administering the antibody alone.
[0051]
Invention (18) relates to a method for treating solid cancer by controlling the expression level of the antigenic peptide of invention (1). That is, since the antigenic peptide of the invention (1) is specifically expressed in cancer cells, the expression is highly likely to cause canceration of the cells. Therefore, suppressing the expression of this antigenic peptide is expected to have a therapeutic effect on canceration and progression of cells. Specifically, it is possible to carry out this treatment by an antisense therapy using an antisense DNA strand against the polynucleotide (particularly mRNA) of the invention (2) or an RNA interference (RNAi) method using double-stranded RNA. it can.
[0052]
Hereinafter, the invention of this application will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the invention of this application is not limited to the following examples.
[0053]
【Example】
Example 1: Identification of antigenic peptide by two-dimensional electrophoresis
[1] Materials and methods
With the consent of the patients (6 patients), frozen specimens were collected from each of the cancerous and non-cancerous tissues immediately after submission of colorectal cancer, and stored at -80 ° C. An appropriate amount of this frozen sample was homogenized in a 9.5 M Urea, 2% CHAPS, 1% DTT, protease inhibitor complete (Roche) solution, and then centrifuged at 100,000 g in an ultrahigh-speed centrifuge (Hitachi). (Protein solution) was extracted, and the protein concentration was identified by absorbance.
[0054]
400 μg of each of the proteins obtained from the cancerous and non-cancerous tissues was separated on the first dimension by agarose isoelectric focusing, and on the second dimension by 12% Tris / Glycine SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The separated protein was stained with Coomassie Brilliant Blue R250 to detect a spot where the expression level was increased in the cancerous tissue compared to the non-cancerous tissue. A gel is cut out from this spot, the protein contained in the gel is digested with trypsin (Roche), the obtained peptide is collected, and the amino acid sequence is analyzed by an ion trap mass spectrometer (LCQ DECA XP, ThermoQuest). Were determined.
[2] Result
Specific expression of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 was confirmed in cancer tissues of 4 or more colorectal cancer patients among 6 patients. Was.
[0055]
The coding sequences of these proteins are SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19, and the respective genes are as shown in Table 1.
Example 2: Identification of antigenic peptide by SEREX method
[1] Preparation of cDNA library
With the consent of patients with esophageal cancer, colorectal cancer and breast cancer, cells of the cancerous tissue immediately after removal of the cancer were isolated and cultured in a DMEM medium containing 10% fetal bovine serum supplemented with kanamycin (100 μg / ml). Total RNA (250 μg) was isolated from these cultured cells by guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, and poly (A) selection using oligo-dT (Oligotex-dT30 super, TAKARA) was performed twice, and mRNA was isolated. Was purified. Using the obtained mRNA (5.7 μg), a cDNA library of each cell was constructed. Single-stranded cDNA was synthesized using Xho I linker primer and 5-methyl dCTP. A double-stranded cDNA having blunt ends was synthesized from the single-stranded cDNA by T4 DNA polymerase, and a linker containing a restriction enzyme site (Eco RI / λZAP II) was added to both ends of the double-stranded cDNA. The cDNA fragment was inserted into bacteriophage (Stratagene), and for each cancer cell, about 1.8 × 10 ⁶ A cDNA library consisting of the clones was prepared.
[2] Screening of cDNA library
Escherichia coli XL1-Blue was infected with each phage vector of the cDNA library of each cancer cell prepared above, and plaques were formed on an NZY agarose plate. Expression of each infected E. coli was induced by treatment with 10 mM IPTG, and the peptide encoded by each cDNA was expressed. This peptide is transferred to a nitrocellulose membrane (NitroBind: Osmonics), and the membrane is washed and adsorbed with TBS [TBS containing 0.5% Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl; pH 7.5)]. After removing the bacteriophage, non-specific reactions were suppressed with TBS-Tween containing 1% albumin. This filter was reacted with 16 esophageal cancer patient sera diluted 2000 times at room temperature for 2 hours.
[0056]
Serum was isolated from the patient and stored at -80 ° C, and immediately before use was finalized 500-fold with a TBS-Tween containing 1% by weight albumin (TBS-Tween containing 0.5% polyoxyethylenesorbitan monolaurate) solution. The dilution was used. The diluted serum was mixed with E. coli lysate at a ratio of 1: 5, left at 4 ° C. for 8 hours, and then centrifuged at 15,000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was used. Untreated serum was diluted 2000-fold as needed.
[0057]
The serum was reacted with the nitrocellulose membrane on which the above-mentioned expressed peptide was blotted at room temperature for 10 to 20 hours to identify the peptide to which the antibody in the serum reacted. That is, alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG-F (ab ′) diluted 5000-fold as a secondary antibody ₂ The reaction was carried out using a goat antibody (Jachson), and a labeling signal was detected by an enzyme color reaction using Nitroblue tetrazolium (Wako) and 5-Bromo-4-Chloro-3-indolylphosphate (Wako), and the color reaction was positive. A colony corresponding to the site was picked from the agarose plate, and SM buffer (100 mM NaCl, 10 mM MgSO 4) ₄ , 50 mM Tris-HCl; pH 7.5). The secondary and tertiary screening is repeated in the same manner as described above until the color reaction positive colonies are unified, and phage clones that react with IgG in the serum of 20 patients are screened, and 347 positive clones are isolated. Released.
[3] Identification of new antigen
From the obtained positive clone, insert DNA was amplified by PCR and the obtained PCR product was sequenced using Big Dye DNA Sequencing Kit (ABI) and ABI Prism (Perkin Elmer). As a result of a search using an existing database, 10 novel antigen peptides that react with the antibodies in the sera of a plurality of patients were identified, except for the antigen peptides that are expression products of known cancer-related genes. Polynucleotide (cDNA) sequences encoding the amino acids of these 10 novel antigenic peptides are the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 40 and 41, respectively. have. The nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 and 37 are the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 and 38, respectively. have.
[0058]
FIG. 1-12 shows the results of Western blot analysis for examining the binding reaction between these 12 novel antigenic peptides and antibodies in the serum of each patient. In FIG. 1-12, arrows indicate polypeptides that specifically reacted with the antibody in the patient's serum. The polypeptide was detected in the E. coli extract treated with IPTG, but was not detected in the untreated E. coli extract, indicating that the polypeptide was derived from the introduced cDNA.
[0059]
【The invention's effect】
As described in detail above, the invention of this application provides two novel antigenic peptides useful as diagnostic markers for colorectal cancer and a method for diagnosing colorectal cancer using them. This enables early and highly accurate diagnosis of colorectal cancer.
[0060]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity of an antigen peptide (SEQ ID NO: 22) expressed by a polynucleotide whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 21 with an antibody in patient serum.
FIG. 2 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity between the antigen peptide (SEQ ID NO: 24) expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23 and the antibody in the patient's serum.
FIG. 3 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity between the antigen peptide (SEQ ID NO: 26) expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and the antibody in the patient's serum.
FIG. 4 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity between the antigen peptide (SEQ ID NO: 28) expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and the antibody in the patient's serum.
FIG. 5 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity between the antigen peptide (SEQ ID NO: 30) expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 and the antibody in the patient's serum.
FIG. 6 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity between the antigen peptide (SEQ ID NO: 32) expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 and the antibody in the patient's serum.
FIG. 7 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity between the antigen peptide (SEQ ID NO: 34) expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 33 and the antibody in the patient's serum.
FIG. 8 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity of the antigen peptide (SEQ ID NO: 36) expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 with the antibody in the serum of patients.
FIG. 9 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity between the antigen peptide (SEQ ID NO: 38) expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 37 and the antibody in the patient's serum.
FIG. 10 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity of the antigen peptide expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39 with the antibody in the patient's serum.
FIG. 11 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity of the antigen peptide expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 40 with the antibody in the patient's serum.
FIG. 12 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity of the antigen peptide expressed by the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 with the antibody in the patient's serum.

Claims (18)

SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 40 and 41 A human solid cancer antigen peptide expressed by a polynucleotide having the same. A polynucleotide encoding the antigenic peptide of claim 1. An oligonucleotide or polynucleotide constituting the expression control region of the polynucleotide of claim 2. An antibody that binds to the antigenic peptide of claim 1. A test is performed to determine whether or not an antibody that binds to each of the antigenic peptides of claim 1 is present in the serum of the test subject. And a method for diagnosing human solid cancer. The diagnostic method according to claim 5, wherein the binding between the antibody of the subject's serum and the antigen peptide is tested on a plate or a membrane on which one or more antigen peptides are immobilized. A test is performed to determine whether or not a biological sample of a subject contains an antigenic peptide that binds to each of the antibodies of claim 4. A method for diagnosing human solid cancer, characterized in that the method is a person. The diagnostic method according to claim 7, wherein the binding between the antibody and the antigen peptide is tested on a plate or a membrane on which one or more antibodies are immobilized. The abundance of each of the polynucleotides of claim 2 in a biological sample of a subject is tested, and a subject whose abundance of one or more polynucleotides is higher than those of a healthy subject is a solid cancer patient or a solid cancer high-risk subject. A method for diagnosing human solid cancer, characterized by determining. At least the following elements:
A solid cancer diagnostic kit comprising (a) at least one kind of the antigen peptide of claim 1; and (b) a labeled antibody that specifically binds to an antibody in serum. At least the following elements:
A solid cancer diagnostic kit comprising: (a) a plate or a membrane on which at least one kind of the antigenic peptide of claim 1 is immobilized; and (b) a labeled antibody that specifically binds to an antibody in serum. A solid cancer diagnostic kit comprising at least one kind of the antibody of claim 4 and / or its labeled antibody. At least the following elements:
(A) at least one kind of the antibody of claim 4; and (b) a solid cancer diagnostic kit comprising a labeled antibody obtained by labeling the antibody of (a). At least the following elements:
A solid cancer diagnostic kit comprising: (a) a plate or a membrane on which at least one kind of the antibody of claim 4 is immobilized; and (b) a labeled antibody obtained by labeling the antibody of (a). A primer set for PCR-amplifying the polynucleotide of claim 2. A method for treating solid cancer, comprising using the oligonucleotide or polynucleotide according to claim 3. A method for treating solid cancer, comprising using the antibody according to claim 4. A method for treating solid cancer, comprising suppressing the expression level of the antigenic peptide according to claim 1.

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