JP2004337173A - System for mass production of protein or peptide by microorganism of genus humicola - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、フミコーラ属に属する微生物、とりわけフミコーラ・インソレンス（Humicola insoiens ）において、タンパク質またはペプチドを大量発現または大量分泌させる生産系に関する。 The present invention relates to a production system for expressing or secreting a large amount of a protein or peptide in a microorganism belonging to the genus Humicola, particularly Humicola insoiens.
糸状菌は、タンパク質を菌体外に分泌することが知られている。よって、糸状菌について、タンパク質を効率よく生産させるための高生産細胞や培養方法等が検討され、開発されてきた。 Filamentous fungi are known to secrete proteins outside the cells. Therefore, with regard to filamentous fungi, high production cells and culture methods for efficiently producing proteins have been studied and developed.
その主要なものとしては、ＵＶ照射、変異誘導剤等により、人工突然変異株を作出し、それらの中から目的とするタンパク質を多量に生産する株を選抜するという手法が挙げられる。 The main method is a method of producing an artificial mutant strain by UV irradiation, a mutagenic agent, or the like, and selecting a strain that produces a large amount of a target protein from the artificial mutant strain.
しかしこの手法は、複数のタンパク質の協調作用により活性が発現される様な酵素の発現およびその特性を向上させたい場合には利用が難しくなる。更に、生育に悪影響を及ぼす例えば致死性のタンパク質等を生産する場合には、目的タンパク質を生産する細胞にいかなる変異処理を用いても生産性の向上が図れないことが多く見受けられる。 However, this technique becomes difficult to use when it is desired to improve the expression and properties of an enzyme whose activity is expressed by the cooperative action of a plurality of proteins. Furthermore, in the case of producing, for example, a lethal protein that adversely affects growth, it is often observed that productivity cannot be improved even if any mutation treatment is applied to cells producing the target protein.
一方、最近になって遺伝子組み換えの技術を用いて目的タンパク質を生産させる方法が検討され、一部の糸状菌においては、異種由来のタンパク質、または、同種において微量発現しているタンパク質を大量に生産することが可能となった。例えば、Aspergillus nidulans(G.L.Gray,et al.,Gene,48,41,1986)、Aspergillus oryzae(T.Christensen,et al.,Bio/Technology，6，1419,1988 )、Trichoderma reesei(Taina Karhunen,et al.,Mol.Gen.Genet.241,515-522,1993)、Trichoderma viride（C.Cheng,et al.,Agric.Biol.Chem.，55,1817,1991 ）等において成功しており、その生産量は、培養液１Ｌ当たり１．０〜３．３ｇ程度である。 On the other hand, a method for producing a target protein using gene recombination technology has recently been studied, and some filamentous fungi produce a large amount of a heterologous protein or a protein expressed in a small amount in the same species. It became possible to do. For example, Aspergillus nidulans (GLGray, et al., Gene, 48, 41, 1986), Aspergillus oryzae (T. Christensen, et al., Bio / Technology, 6, 1419, 1988), Trichoderma reesei (Taina Karhunen, et. al., Mol. Gen. Genet. 241, 515-522, 1993) and Trichoderma viride (C. Cheng, et al., Agric. Biol. Chem., 55, 1817, 1991). Is about 1.0 to 3.3 g per liter of culture solution.
好温性糸状菌フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens ）も優れたタンパク質分泌能を有する。また、フミコーラ・インソレンスは、種々の産業上有用なセルラーゼを産生することも知られている（ＷＯ９１／１７２４３号公報（特表平５−５０９２２３号公報））。 The thermophilic filamentous fungus Humicola insolens also has excellent protein secretion ability. It is also known that Humicola insolens produces various industrially useful cellulases (WO 91/17243 (Tokuhyohei 5-509223)).
しかしながら、フミコーラ・インソレンスの全分泌タンパク質における有用成分はわずか数％程度である。これら微量有用成分を大量発現、大量分泌させる方法を確立すれば、最終産物の能力は飛躍的に向上する。また、フミコーラ・インソレンスにおいて異種由来の遺伝子を大量発現する方法を確立すれば、種々の酵素および有用タンパク質を単一の方法で生産でき、より安価な提供が可能となる。さらに、有用タンパク質の生産宿主としてフミコーラ・インソレンスは、好温性糸状菌であることから、至適培養温度が３７℃付近であり、培養の際、他の雑菌の汚染を受けにくいという利点がある。 However, the useful component in the total secreted protein of Humicola insolens is only a few percent. Establishing a method for expressing and secreting a large amount of these useful components in a large amount will dramatically improve the performance of the final product. Further, if a method for expressing large amounts of heterologous genes in Humicola insolens is established, various enzymes and useful proteins can be produced by a single method, and it becomes possible to provide more inexpensive products. Furthermore, since Humicola insolens is a thermophilic filamentous fungus as a production host for useful proteins, the optimal cultivation temperature is around 37 ° C., and there is an advantage that it is less susceptible to contamination by other germs during culturing. .
一方、フミコーラ・インソレンスにおいても、本発明者等の一部によって、特開平８−５６６６３号公報に記載されているように、形質転換系が確立され、遺伝子組み換えの技術の使用が可能となった。 On the other hand, in the case of Humicola Insolens, a transformation system was established by some of the present inventors as described in JP-A-8-56663, and the use of gene recombination technology became possible. .
しかし、フミコーラ・インソレンスに関し、目的タンパク質を高レベルで発現、分泌できるような有効な発現ベクター系の開発が依然として求められていたといえる。 However, it can be said that there was still a need for the development of an effective expression vector system capable of expressing and secreting a target protein at a high level with respect to Humicola insolens.
本発明者らは、今般、フミコーラ属に属する微生物、とりわけフミコーラ・インソレンスにおける目的タンパク質の大量生産方法を確立した。 The present inventors have now established a method for mass-producing a target protein in a microorganism belonging to the genus Humicola, particularly in Humicola insolens.
従って、本発明はフミコーラ属に属する微生物、とりわけフミコーラ・インソレンスにおけるタンパク質の大量生産を可能にする発現系、とりわけ宿主−ベクター系およびそれを利用したタンパク質の製造方法の提供をその目的としている。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an expression system, particularly a host-vector system, which enables large-scale production of proteins in microorganisms belonging to the genus Humicola, particularly Humicola insolens, and a method for producing proteins using the same.
本発明の好ましい態様によれば、目的タンパク質の生産性は親株の１０〜１６倍となり、またその生産量は培養液１リットルあたり約４．５ｇに達する極めて効率のよいタンパク質の生産系が提供される。 According to a preferred embodiment of the present invention, there is provided an extremely efficient protein production system in which the productivity of the target protein is 10 to 16 times that of the parent strain and the production amount is about 4.5 g per liter of the culture solution. You.
微生物の寄託
図１に記載の地図で表されるプラスミドｐＭ３−１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７１（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１４４５９、原寄託日：１９９４年８月３日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３）に寄託されている。
Deposition of microorganisms The E. coli JM109 strain transformed with the plasmid pM3-1 represented by the map shown in FIG. 1 was FERM BP-5971 (Original deposit: FERM P-14459, Original deposit date: August 3, 1994) ) Has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Bioscience and Human Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan).
図２に記載の地図で表されるプラスミドｐＭ１４−１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７２（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１４５８５，原寄託日：１９９４年１０月１８日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 The E. coli JM109 strain transformed with the plasmid pM14-1 represented by the map shown in FIG. 2 was deposited under FERM BP-5972 (original deposit: FERM P-14585, original deposit: October 18, 1994). It is deposited with the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
本発明による発現ベクターｐＭＫＤ０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７４（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３０、現寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 The Escherichia coli JM109 strain transformed with the expression vector pMKD01 according to the present invention was obtained under the accession number of FERM BP-5974 (Original deposit: FERM P-15730, current deposit date: July 12, 1996). Deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Technology.
本発明による発現ベクターｐＥＧＤ０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７３（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７２９、原寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 The Escherichia coli JM109 strain transformed with the expression vector pEGD01 according to the present invention was obtained under the accession number of FERM BP-5973 (Original deposit: FERM P-15729, Original deposit date: July 12, 1996). Deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Technology.
本発明による発現ベクターｐＩＥＤ０２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７５（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３１、原寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 The Escherichia coli JM109 strain transformed with the expression vector pIED02 according to the present invention was obtained under the accession number of FERM BP-5975 (Original deposit: FERM P-155731, Original deposit date: July 12, 1996). Deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Technology.
本発明による発現ベクターｐＮＣＥ４Ｓａｌで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７６（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３２、原寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 The Escherichia coli JM109 strain transformed with the expression vector pNCE4Sal according to the present invention was obtained under the accession number of FERM BP-5976 (Original deposit: FERM P-15732, Original deposit date: July 12, 1996). Deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Technology.
本発明による発現ベクターの宿主となりうるフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３６、原寄託日：１９９６年７月１５日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 Fumicola insolens MN200-1 which can be a host for the expression vector according to the present invention was obtained under the accession number of FERM BP-5977 (Original deposit: FERM P-15736, Original deposit date: July 15, 1996) by the Ministry of International Trade and Industry. Deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
定 義
本明細書において、タンパク質およびペプチドは特に断らない限り、同義に用いることとする。また、本明細書において、改変配列とは、塩基配列またはアミノ酸配列において、一〜数個の塩基またはアミノ酸の挿入、置換または欠失、もしくはその一方または両末端への付加がなされたものを意味する。
Definitions In this specification, proteins and peptides are used synonymously unless otherwise specified . As used herein, the term "modified sequence" refers to a sequence in which one to several bases or amino acids have been inserted, substituted or deleted, or added to one or both terminals in a base sequence or amino acid sequence. I do.
フミコーラ・インソレンスにおける制御配列
本発明におけるフミコーラ属に属する微生物における発現系にあっては、フミコーラ・インソレンス由来の制御配列を用いる。本発明において制御配列とは、プロモーター、シグナル配列、およびターミネーターからなる群から選ばれる少なくとも一つを意味する。
Control sequences in Humicola insolens In the expression system of a microorganism belonging to the genus Humicola in the present invention, a control sequence derived from Humicola insolens is used. In the present invention, the control sequence means at least one selected from the group consisting of a promoter, a signal sequence, and a terminator.
本発明による制御配列とは、好ましくは特開平８−５６６６３号公報に記載のフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ１遺伝子の制御配列、さらに特開平８−１２６４９２号公報に記載のフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ２遺伝子の制御配列である。より具体的には、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５９７２のもと寄託されている菌株中のプラスミドｐＭ３−１およびプラスミドｐＭ１４−１内にある、ＮＣＥ１および２の制御配列である。 The control sequence according to the present invention is preferably a control sequence of the cellulase NCE1 gene derived from Fumicola insolens described in JP-A-8-56663, and furthermore, a cellulase NCE2 derived from Fumicola insolens described in JP-A-8-126492. It is a regulatory sequence of a gene. More specifically, the regulatory sequences of NCE1 and NCE2 in plasmids pM3-1 and pM14-1 in the strains deposited under FERM BP-5971 and FERM BP-5972.
本発明において好ましいプロモーター配列の例としては、図１の地図で表されるプラスミドｐＭ３−１中の、ＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列、例えば図中のＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流のＢｇｌIIサイトまでの配列が挙げられる。 Examples of preferred promoter sequences in the present invention include a sequence existing in a region from the N-terminus of the NCE1 gene to about 1500 bp upstream of the NCE1 gene in the plasmid pM3-1 shown in the map of FIG. 1, for example, NCE1 in the figure. The sequence from the N-terminus of the gene to the upstream BglII site is exemplified.
また、本発明において好ましいプロモーター配列の別の例としては、図２の地図で表されるプラスミドｐＭ１４−１中の、ＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列、例えば図中のＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流のＥｃｏＲＩサイトまでの配列が挙げられる。 Another example of a preferred promoter sequence in the present invention is a sequence present in a region from the N-terminus of the NCE2 gene to about 1500 bp upstream of the NCE2 gene in the plasmid pM14-1 shown in the map of FIG. The sequence from the N-terminus of the NCE2 gene to the upstream EcoRI site in the figure is exemplified.
さらに、本発明によるプロモーター配列には、これら領域の全配列のみならず、高プロモーター活性を保持するその改変配列も含まれる。本発明において、高プロモーター活性とは、後記するＮＣＥ４遺伝子の発現において、高発現を実現する強いプロモーター活性を意味し、より具体的には、培地１リットルあたり２．０ｇ、好ましくは４．０ｇ、より好ましくは４．５ｇのＮＣＥ４の発現を実現するプロモーター活性を意味するものとする。後記する実施例に記載の知見、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５９７２のもと寄託されている菌株、および図１または２の地図が与えられた当業者であれば、そのような改変配列が存在することは容易に予測でき、また容易に製造することが可能であることは明らかである。 Furthermore, the promoter sequence according to the present invention includes not only the entire sequence of these regions but also its modified sequence that retains high promoter activity. In the present invention, the high promoter activity means a strong promoter activity for realizing high expression in the expression of the NCE4 gene described later, and more specifically, 2.0 g, preferably 4.0 g, per liter of medium. More preferably, it means a promoter activity for realizing the expression of 4.5 g of NCE4. Those skilled in the art given the findings described in the Examples below, the strains deposited under FERM BP-5971 and FERM BP-5972, and the map of FIG. It is clear that its presence is easily predictable and can be easily manufactured.
また、本発明において好ましいシグナル配列の例としては、セルラーゼＮＣＥ１または２のシグナル配列が挙げられる。より具体的には配列番号１に記載のアミノ酸配列の−２２から−１までの配列をコードする塩基配列、および配列番号２に記載のアミノ酸配列の−２３から−１までの配列をコードする塩基配列が挙げられる。更に本発明には、その改変配列であって、依然としてシグナル配列活性を保持するアミノ酸配列をコードするものも包含される。このような改変配列についても、後記する実施例に記載の知見、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５９７２のもと寄託されている菌株、および図１または２の地図が与えられた当業者であれば、そのような改変配列が存在することは容易に予測でき、また容易に製造することが可能であることは明らかである。 In addition, examples of a preferable signal sequence in the present invention include a signal sequence of cellulase NCE1 or NCE2. More specifically, a base sequence encoding the sequence from -22 to -1 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and a base sequence encoding the sequence from -23 to -1 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 Sequences. The invention further includes modified sequences thereof, which encode an amino acid sequence that still retains signal sequence activity. Regarding such modified sequences, those skilled in the art given the knowledge described in the Examples below, the strains deposited under FERM BP-5971 and FERM BP-5972, and the map shown in FIG. It is clear, for example, that the presence of such modified sequences can easily be predicted and can be easily produced.
なお、これら配列の実際の利用にあたり上記のシグナル配列に加えてさらにＮＣＥ１または２のＮ末端側のいくつかのアミノ酸が付加されてもよいことは当業者に明らかである。すなわち、これらシグナル配列の利用にあたり、目的タンパク質が、ＮＣＥ１または２のＮ末端側のいくつかのアミノ酸からなるペプチドとの融合タンパク質、さらにはＮＣＥ１またはＮＣＥ２との融合タンパク質として得られてもよい。 It is apparent to those skilled in the art that, in actual use of these sequences, some amino acids on the N-terminal side of NCE1 or NCE2 may be added in addition to the signal sequence described above. That is, in using these signal sequences, the target protein may be obtained as a fusion protein with a peptide consisting of several amino acids on the N-terminal side of NCE1 or NCE2, or as a fusion protein with NCE1 or NCE2.
さらに、本発明において好ましいターミネーター配列としては、図１の地図で表されるプラスミドｐＭ３−１中の、ＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流の約１４００ｂｐまでの領域中に存在する配列、例えばＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流のＢｇｌIIサイトまでの配列が挙げられる。また、別の例としては、図２の地図で表されるプラスミドｐＭ１４−１中の、ＮＣＥ２遺伝子のＣ末端から下流の約５００ｂｐまでの領域中に存在する配列、例えば例えばＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流のＢｇｌIIサイトまでの配列が挙げられる。 Further, a preferable terminator sequence in the present invention is a sequence existing in a region from the C-terminus of the NCE1 gene to about 1400 bp downstream from the C-terminal of the NCE1 gene in the plasmid pM3-1 shown in the map of FIG. The sequence from the end to the downstream BglII site is exemplified. Further, as another example, in the plasmid pM14-1 represented in the map of FIG. 2, a sequence existing in a region from the C-terminus of the NCE2 gene to about 500 bp downstream, for example, from the C-terminus of the NCE1 gene The sequence up to the downstream BglII site is exemplified.
さらに、本発明によるターミネーター配列には、これら領域の全配列のみならず、そのターミネーター活性を保持する改変配列も含まれる。 Furthermore, the terminator sequence according to the present invention includes not only the entire sequence of these regions but also a modified sequence that retains the terminator activity.
これら制御配列、とりわけＮＣＥ１またはＮＣＥ２のプロモーター配列は、ＮＣＥ４遺伝子を極めて高効率で発現させる。従って、本発明の好ましい態様によれば、ＮＣＥ４遺伝子の発現に好ましく用いられる制御配列、とりわけＮＣＥ４遺伝子の発現に好ましく用いられるプロモーター配列が提供される。本発明の好ましい態様によれば、セルラーゼＮＣＥ４の生産性は、この酵素の由来である親株における生産性の１０〜１６倍となり、またその生産量は培養液１リットルあたり２．０ｇ、好ましくは４．０ｇ、より好ましくは約４．５ｇに達する。 These regulatory sequences, especially the NCE1 or NCE2 promoter sequence, allow the NCE4 gene to be expressed with very high efficiency. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, there is provided a control sequence preferably used for expression of the NCE4 gene, particularly a promoter sequence preferably used for expression of the NCE4 gene. According to a preferred embodiment of the present invention, the productivity of cellulase NCE4 is 10 to 16 times that of the parent strain from which the enzyme is derived, and the amount of production is 2.0 g per liter of culture, preferably 4 g. 0.0 g, more preferably about 4.5 g.
発現ベクターおよび宿主
本発明によれば、上記制御配列を用いて目的タンパク質を発現するための発現ベクターが提供される。
本発明による発現ベクターは、その第一の態様によれば、上記制御配列と、場合によって遺伝子マーカーとを含んでなるものである。さらに、本発明による発現ベクターは、第一の態様の発現ベクターに、さらにその制御配列に作動可能に連結された目的タンパク質をコードする塩基配列を含んでなるものである。従って、上記した本発明によるプロモーター、シグナル配列、およびターミネーターからなる群から選ばれる少なくとも一つを含んでなる発現ベクターは本発明の範囲に包含されるものである。
Expression Vector and Host According to the present invention, an expression vector for expressing a target protein using the above-mentioned control sequence is provided.
According to a first aspect, the expression vector according to the present invention comprises the above-mentioned control sequence and optionally a gene marker. Furthermore, the expression vector according to the present invention comprises the expression vector of the first embodiment, and further comprises a nucleotide sequence encoding a target protein operably linked to its control sequence. Therefore, an expression vector comprising at least one selected from the group consisting of the above-described promoter, signal sequence, and terminator according to the present invention is included in the scope of the present invention.
前記したように、本発明によるプロモーター配列は極めて有用性の高いものであることから、本発明の好ましい態様によれば、本発明によるプロモーター配列を少なくとも含んでなる発現ベクターが提供される。この発現ベクターにあって、シグナル配列、ターミネーター配列は本発明によるシグナル配列およびターミネーター配列以外のものであってもよいが、上記した上記本発明によるシグナル配列およびターミネーター配列の利用が好ましい。これらベクターの具体例としては、後記する実施例において構築された発現ベクターｐＭＫＤ０１、ｐＥＧＤ０１、およびｐ１ＥＤ０２からＮＥＣ３およびＮＣＥ４遺伝子を除いた形態のベクターが挙げられる。 As described above, since the promoter sequence according to the present invention has extremely high utility, according to a preferred embodiment of the present invention, there is provided an expression vector comprising at least the promoter sequence according to the present invention. In this expression vector, the signal sequence and the terminator sequence may be other than the signal sequence and the terminator sequence according to the present invention, but the above-mentioned signal sequence and terminator sequence according to the present invention are preferably used. Specific examples of these vectors include the expression vectors pMKD01, pEGD01, and p1ED02 constructed in the Examples described later, in which the NEC3 and NCE4 genes are removed.
本発明による発現ベクターは、宿主細胞において複製可能なベクター、例えばプラスミドを基本に構築されるのが好ましい。そのようなベクターとして、大腸菌で複製可能なベクターである、pUC Vector、pTV Vector、pBluescript 、pBR322などが挙げられる。本発明によるベクターの構築に必要な手法は、遺伝子組み替えの分野において慣用されている方法を用いることができる。 The expression vector according to the present invention is preferably constructed on the basis of a vector capable of replicating in a host cell, for example, a plasmid. Examples of such a vector include pUC Vector, pTV Vector, pBluescript, and pBR322, which are vectors that can be replicated in Escherichia coli. As a technique necessary for constructing the vector according to the present invention, a method commonly used in the field of gene recombination can be used.
また遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の手法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。本発明に用いる薬剤耐性遺伝子は、宿主細胞が感受性を示す薬剤に関するものならば限定されないが、例えば、宿主としてフミコーラ・インソレンスを用いる場合、Streptomyces rimofaciens由来のデストマイシン耐性遺伝子、Escherichia coli由来のハイグロマイシンB 耐性遺伝子、Streptococcus hindustanus 由来のブレオマイシン耐性遺伝子、Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子を好ましく用いることができる。 The gene marker may be appropriately selected depending on the method for selecting a transformant. For example, a gene encoding drug resistance and a gene complementing auxotrophy can be used. The drug resistance gene used in the present invention is not limited as long as it relates to a drug to which a host cell exhibits sensitivity.For example, when Humicola insolens is used as a host, a destomycin resistance gene derived from Streptomyces rimofaciens, hygromycin derived from Escherichia coli A B-resistance gene, a bleomycin resistance gene derived from Streptococcus hindustanus, and a bialaphos resistance gene derived from Streptomyces hygroscopicus can be preferably used.
本発明の好ましい態様によれば、公知の方法により、Aspergillus nidulans由来trp C 遺伝子のプロモーターとターミネーター(Mullaney，E.J．et al.，Mol．Gen．Genet． 199:37-45,1985)が得られ、これを用いて、デストマイシン耐性遺伝子（特開昭59-175889 ）を発現可能にしたカセットを利用するのが好ましい。 According to a preferred embodiment of the present invention, the promoter and terminator (Mullaney, EJ. Et al., Mol. Gen. Genet. 199: 37-45, 1985) of the trp C gene derived from Aspergillus nidulans can be obtained by a known method. It is preferable to use a cassette which enables expression of the destomycin resistance gene (JP-A-59-175889).
本発明による発現ベクターは、種々の目的タンパク質またはペプチドの発現生産に利用することができる。本発明において目的タンパク質またはペプチドとは、フミコーラ・インソレンスに存在しないいわゆる外来タンパク質のみならず、フミコーラ・インソレンスにおいて発現してはいるがその量が微量であるタンパク質をも意味するものとする。例えば、本発明による発現ベクターにおける目的タンパク質をコードする遺伝子としては、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ等産業上有用なタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、これらを人為的に改良した遺伝子についても同様に目的タンパク質とすることができる。 The expression vector according to the present invention can be used for expression production of various target proteins or peptides. In the present invention, the target protein or peptide means not only a so-called foreign protein that is not present in Humicola insolens, but also a protein that is expressed in Humicola insolens but its amount is very small. For example, examples of the gene encoding the target protein in the expression vector according to the present invention include genes encoding industrially useful proteins such as cellulase, amylase, lipase, protease, and phytase. In addition, a gene obtained by artificially improving these can be similarly used as a target protein.
本発明による発現ベクターは、宿主としてフミコーラ属に属する微生物と組み合わされて発現系とされる。本発明の好ましい態様によれば、フミコーラ属に属する微生物としてフミコーラ・インソレンスを利用する。 The expression vector according to the present invention is used as an expression system in combination with a microorganism belonging to the genus Humicola as a host. According to a preferred embodiment of the present invention, Humicola insolens is used as a microorganism belonging to the genus Humicola.
ＮＣＥ４遺伝子
本発明の好ましい態様によれば、本発明による発現系は、フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ４またはそれらの改変タンパク質を目的タンバク質として、その生産のために好ましく用いることができる。ここで、フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ４とは、配列番号３に記載のタンパク質を意味する。これは後記する実施例に記載の通り、今般、本発明者等によって単離されたセルラーゼ酵素である。なおここで、改変タンパク質とは、上記タンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸の付加、挿入、削除、欠失、または置換などの改変が生じたタンパク質であって、依然としてセルラーゼＮＣＥ４と同様のセルラーゼ活性、とりわけエンドグルカナーゼ活性を保持するものを意味するものとする。
NCE4 Gene According to a preferred embodiment of the present invention, the expression system according to the present invention can be preferably used for producing cellulase NCE4 derived from Humicola insolens or a modified protein thereof as a target protein. Here, the cellulase NCE4 derived from Humicola insolens means the protein described in SEQ ID NO: 3. This is a cellulase enzyme that has now been isolated by the present inventors, as described in the Examples below. Here, the modified protein is a protein in which amino acid addition, insertion, deletion, deletion, or substitution has been modified in the amino acid sequence of the above protein, and is still the same cellulase activity as cellulase NCE4, especially It shall mean one that retains endoglucanase activity.
本発明の好ましい態様によれば、これらセルラーゼＮＣＥ４の発現系として好ましいベクターの具体例としては、後記する実施例によって構築された発現ベクターｐＭＫＤ０１、ｐＥＧＤ０１、またはｐＩＥＤ０２が挙げられる。 According to a preferred embodiment of the present invention, specific examples of a vector preferable as an expression system for the cellulase NCE4 include an expression vector pMKD01, pEGD01, or pIED02 constructed according to Examples described later.
本発明による発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、遺伝子組み替えの分野で慣用されている手法を用いることができ、例えば、特開平８−５６６６３号公報に記載の方法に準じて実施することができる。また、エレクトロポレーションによって実施されてもよい。 Transformation of a host cell with the expression vector according to the present invention can be performed by a method commonly used in the field of genetic recombination, and can be performed, for example, according to the method described in JP-A-8-56663. . Moreover, you may implement by electroporation.
目的タンパク質の生産
本発明による目的タンパク質の生産は、上記した本発明による発現ベクターで形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、培養物から目的タンパク質またはペプチドを採取することによって実施される。
Production of the target protein The production of the target protein according to the present invention is carried out by culturing a host cell transformed with the above-described expression vector according to the present invention in an appropriate medium and collecting the target protein or peptide from the culture. You.
本発明の好ましい態様によれば、目的タンパク質の生産性は親株の１０〜１６倍となり、またその生産量は培養液１リットルあたり２．０ｇ、好ましくは４．０ｇ、より好ましくは約４．５ｇに達する極めて効率のよいタンパク質の生産系が提供される。例えば、宿主細胞がフミコーラ・インソレンスである場合、その培養液１リットルあたり２．０ｇ、好ましくは４．０ｇ、より好ましくは４．５ｇ以上の目的タンパク質を生産することができる。この量は、従来知られたタンパク質の発現系と比較して、極めて多量である。このことは、本発明による目的タンパク質の発現系が極めて高い有用性を有していることを示している。 According to a preferred embodiment of the present invention, the productivity of the target protein is 10 to 16 times that of the parent strain, and the production amount is 2.0 g, preferably 4.0 g, more preferably about 4.5 g per liter of the culture solution. , A highly efficient protein production system is provided. For example, when the host cell is Humicola insolens, 2.0 g, preferably 4.0 g, and more preferably 4.5 g or more of the target protein can be produced per liter of the culture. This amount is extremely large as compared with conventionally known protein expression systems. This indicates that the target protein expression system according to the present invention has extremely high utility.
例えば、目的タンパク質がセルラーゼＮＣＥ３またはＮＣＥ４である場合、これら酵素は本来的に高活性であるが、それを更に大量に生産することができる。その結果、セルロース含有繊維の毛羽除去、減量加工、およびデニム染めセルロース含有繊維の脱色加工などに有用なセルラーゼ調製物を効率よく生産することが可能となるとの利点が得られる。 For example, when the target protein is cellulase NCE3 or NCE4, these enzymes are inherently highly active, but can be produced in larger quantities. As a result, there is obtained an advantage that it is possible to efficiently produce a cellulase preparation useful for removing fluff of cellulose-containing fibers, reducing the weight thereof, and decolorizing denim-dyed cellulose-containing fibers.
本発明による目的タンパク質の生産法において、形質転換体の培養は、慣用の成分、例えば炭素原、窒素原、無機塩、増殖因子成分などを含む液体培地で、好気的条件での培養法、振盪培養法、電気撹拌培養法または深部培養法により行うことができる。培地のｐＨは例えば７〜８程度である。培養は宿主細胞がフミコーラ・インソレンスである場合、フミコーラ・インソレンスの培養に慣用される通常の条件、例えば１５℃〜４５℃、好ましくは３５℃〜４０℃、培養時間は２４〜２４０時間程度の条件で行うことができる。 In the method for producing a target protein according to the present invention, the transformant is cultured in a liquid medium containing conventional components such as a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and a growth factor component under aerobic conditions. Shaking culture, electric stirring culture, or submerged culture can be performed. The pH of the medium is, for example, about 7 to 8. When the host cell is Humicola insolens, the culture is carried out under the usual conditions commonly used for culturing Humicola insolens, for example, at 15 ° C to 45 ° C, preferably 35 ° C to 40 ° C, and the culturing time is about 24 to 240 hours. Can be done with
本発明によって得られるタンパク質あるいはペプチドの培養物からの回収にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法等を単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。 In recovering a protein or peptide obtained by the present invention from a culture, a usual separation means utilizing its properties, for example, a solvent extraction method, an ion exchange resin method, an adsorption or distribution column chromatography method, a gel filtration method, a dialysis method , Precipitation method or the like can be used alone or in combination as appropriate.
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例Ａ１：フミコーラ・インソレンスからのテンセル毛羽除去に活性を有する成分の単離精製
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を、（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％硫酸マグネシウム、ｐＨ６．８）中、３７℃で培養した。７日間培養の後、得られた培養液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより菌体を除き、培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
Example A1: Isolation and Purification of a Component Active in Removing Tencel Fuzz from Humicola Insolens Purified Humicola insolens MN200-1 was prepared using (N) medium (5.0% Avicel, 2.0% yeast extract, 0.1% % Polypeptone, 0.03% calcium chloride, 0.03% magnesium sulfate, pH 6.8) at 37 ° C. After culturing for 7 days, the resulting culture was centrifuged at 7,000 rpm for 20 minutes to remove the cells, and the culture supernatant was used as a crude cellulase preparation.
この粗精製セルラーゼ調製液を疎水クロマトグラフィー（Phenyl-SepharoseHigh Performance16/100、ファルマシアバイオテク社製）に供し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１−０Ｍの濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、分画した。このうち、０．１−０Ｍの濃度勾配のときに得られた画分にテンセル毛羽除去活性が強く認められたので、その画分を再び、疎水クロマトグラフィー（Phenyl-Sepharose High Performance16/100 ）に供し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、０．４−０Ｍの濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、活性画分を分取した。 This crude cellulase preparation was subjected to hydrophobic chromatography (Phenyl-Sepharose High Performance 16/100, manufactured by Pharmacia Biotech), and an ammonium sulfate solution subjected to a 1-0 M concentration gradient in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) was used. Eluted and fractionated. Among them, the fraction obtained when the concentration gradient was 0.1-0 M showed strong activity for removing Tencel fuzz, and the fraction was again subjected to hydrophobic chromatography (Phenyl-Sepharose High Performance 16/100). The solution was eluted with an ammonium sulfate solution having a concentration gradient of 0.4-0 M in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and the active fraction was collected.
次に、その画分を逆相クロマトグラフィー（Source15 ISO、ファルマシアバイオテク社製）に供し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１−０Ｍの濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、分画した。このうち、０Ｍの濃度のときに得られた画分にテンセル毛羽除去活性が強く認められたので、その画分を逆相クロマトグラフィー（Source 15 PHE 、ファルマシアバイオテク社製）に供し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１−０Ｍの濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、テンセル毛羽除去活性の強い画分を精製酵素ＮＣＥ４として単離した。このＮＣＥ４はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量４３ｋＤａの単一なバンドを示した。 Next, the fraction was subjected to reverse phase chromatography (Source15 ISO, manufactured by Pharmacia Biotech), and eluted with an ammonium sulfate solution having a 1-0M concentration gradient in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0). Fractionated. Among them, the fraction obtained at a concentration of 0 M showed strong Tencel fuzz removal activity. The fraction was subjected to reverse phase chromatography (Source 15 PHE, manufactured by Pharmacia Biotech) to give 50 mM phosphoric acid. The fraction was eluted with an ammonium sulfate solution having a concentration gradient of 1-0 M in a buffer solution (pH 7.0), and a fraction having strong tencel fuzz removal activity was isolated as a purified enzyme NCE4. This NCE4 showed a single band with a molecular weight of 43 kDa on SDS-PAGE.
実施例Ａ２：セルラーゼＮＣＥ４の部分アミノ酸配列
（１）Ｎ末端アミノ酸残基の同定
実施例１において精製したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定するため、ＦＰＬＣシステム（ファルマシアバイオテク社製）でカラムクロマトグラフィーを行い（カラム：ＲＥＳＯＵＲＣＥ（商品名）ＲＰＣ ３ｍｌ、０．１％のＴＦＡを含む５％〜６０％アセトニトリルグラジェント）、主要なピークを分取した。
Example A2: Partial amino acid sequence of cellulase NCE4 (1) Identification of N-terminal amino acid residue To determine the N-terminal amino acid sequence of the protein purified in Example 1, column chromatography was performed using an FPLC system (Pharmacia Biotech). Performed (column: RESOURCE (trade name)
これを凍結乾燥した後、少量の水に溶解し、８％Gel SDS-PAGE mini（テフコ社製）を用いて電気泳動した。マルチフォーII電気泳動装置（ファルマシアバイオテク社製）を用いて、これをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に、タンパク質を電気的にうつしとり、コマジーブリリアントブルーR-250（ナカライテスク社製）で染色した後、脱色し、水で洗浄し、風乾した。ここから分子量４３KDa のタンパク質がブロットされた部分を切り出し、これをプロテインシーケンサーModel 492（パーキンエルマー社製）に供し、Ｎ末端側アミノ酸配列を１５残基決定した。得られた配列は以下の通りであった。 This was freeze-dried, dissolved in a small amount of water, and electrophoresed using 8% Gel SDS-PAGE mini (manufactured by Tefco). Using a Multi Four II electrophoresis apparatus (Pharmacia Biotech), the protein is electrically transferred to a PVDF membrane (Millipore) and stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 (Nacalai Tesque). After that, it was destained, washed with water and air-dried. From this, a portion where a protein having a molecular weight of 43 KDa was blotted was cut out and subjected to a protein sequencer Model 492 (manufactured by PerkinElmer) to determine the N-terminal amino acid sequence of 15 residues. The sequences obtained were as follows:
N 末端アミノ酸配列：Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-
Pro-Ser(15残基)
N-terminal amino acid sequence: Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp- (Cys)-(Cys) -Lys-
Pro-Ser (15 residues)
（２）ペプチドマッピング
前記（１）のＦＰＬＣによって精製されたタンパク質を凍結乾燥後、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解した。タンパク質に対し約１／２０モル量のトリプシン（プロメガ社製）を添加し、３７℃で、４８時間反応させた。この分解産物をModel 172 μプレパラティブHPLCシステム（パーキンエルマ社製）でカラムクロマトグラフィーを行い（カラム：Ｃ８ ２２０×２．１ｍｍ、０．１％ＴＦＡ、０％アセトニトリル〜−０．０８５％ＴＦＡ、３５％アセトニトリルグラジェント）、３種のペプチドを分取した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列を前述のプロテインシーケンサーにより決定した。その結果は、以下の通りであった。
(2) Peptide mapping The protein purified by FPLC in (1) above was lyophilized and then dissolved in a 100 mM ammonium bicarbonate buffer (pH 8.0). About 1/20 mole of trypsin (Promega) was added to the protein, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 48 hours. This degradation product was subjected to column chromatography using a Model 172 μ preparative HPLC system (manufactured by PerkinElmer) (column: C8 220 × 2.1 mm, 0.1% TFA, 0% acetonitrile to −0.085% TFA, (35% acetonitrile gradient), three kinds of peptides were collected. The amino acid sequence of the obtained peptide fragment was determined by the aforementioned protein sequencer. The results were as follows.
TP-1:Tyr-Gly-Gly-Ile-Ser-Ser(6残基)
TP-2:Phe-Pro-Asp-Ala-Leu-Lys(6残基)
TP-3:Phe-Asp-Trp-Phe-Lys-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Phe-Ser-Phe-Arg
*******(15残基)
TP-1: Tyr-Gly-Gly-Ile-Ser-Ser (6 residues)
TP-2: Phe-Pro-Asp-Ala-Leu-Lys (6 residues)
TP-3: Phe-Asp-Trp-Phe-Lys-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Phe-Ser-Phe-Arg
******* (15 residues)
これらＮ末端アミノ酸配列およびペプチドマッピングによって得られたアミノ酸配列は、ＷＯ９１／１７２４３号公報（特表平５−５０９２２３号公報）に記載されているフミコーラ・インソレンスＤＳＭ１８００から得られた４３ＫＤａエンドグルカナーゼのアミノ酸配列と相同性を示すことから、同タンパク質はセルラーゼの一種であることが強く示唆された。 The amino acid sequence obtained by these N-terminal amino acid sequence and peptide mapping is the amino acid sequence of 43 KDa endoglucanase obtained from Fumicola insolens DSM1800 described in WO91 / 17243 (Japanese Translation of PCT International Publication No. 5-509223). This protein strongly suggests that the protein is a kind of cellulase.
また、上記配列をProtein Identification Resource（PIR）R44.0，March，1995、またはSWISS-PROT R31.0,March 1995 に登録されている配列と比較したところ、相同性を示す配列はあるものの、同一ではなく、新規なタンパク質であることが明らかとなった。 When the above sequence was compared with sequences registered in Protein Identification Resource (PIR) R44.0, March, 1995, or SWISS-PROT R31.0, March 1995, there was a sequence showing homology, Instead, it was found to be a novel protein.
実施例Ａ３：ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡの単離はHoriuchiらの方法（Hiroyuki Horiuchi et al.，J．Bacteriol.，170:272-278,1988 ）に従った。
Example A3: Preparation of genomic DNA library Isolation of genomic DNA followed the method of Horiuchi et al. (Hiroyuki Horiuchi et al., J. Bacteriol., 170: 272-278, 1988).
まず、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を前述（Ｎ）培地中、３７℃で培養した。２日間培養の後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収した。得られた菌体をフェノール処理、プロテイナーゼＫ、およびリボヌクレアーゼＡ処理、さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿化によりゲノムＤＮＡを得た。 First, Humicola insolens MN200-1 was cultured at 37 ° C. in the aforementioned (N) medium. After culturing for 2 days, the cells were collected by centrifugation (3500 rpm, 10 minutes). The resulting cells were treated with phenol, treated with proteinase K and ribonuclease A, and then subjected to polyethylene glycol (PEG) precipitation to obtain genomic DNA.
つぎに、フミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡをSau3A I により消化し、アガロースゲル電気泳動によって、９〜２３ｋｂｐの範囲で部分的に分解されたことを確認した後、これをエタノール沈殿によって回収した。このＤＮＡ断片をファージベクター、EMBL3 クローニングキット（ストラタジーン社製）のBamH IアームにT4リガーゼ（東洋紡績社製）を用いて連結させた。これをエタノール沈殿後、ＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。 Next, Humicola insolens genomic DNA was digested with Sau3A I, and after it was confirmed by agarose gel electrophoresis that it was partially degraded in the range of 9 to 23 kbp, it was recovered by ethanol precipitation. This DNA fragment was ligated to the BamHI arm of a phage vector, EMBL3 cloning kit (Stratagene) using T4 ligase (Toyobo). After precipitation with ethanol, this was dissolved in a TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) buffer solution.
連結混合物の全量をHohn，B.の方法（ Hohn，B．Methods Enzymol.，68:299-309,1979 ）に記載されている様に凍結したパッケージ成分およびギガパックIIパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、ラムダヘッドにパッケージし、得られたファージを大腸菌ＬＥ３９２株に感染させた。この方法により得られた５×１０4個のファージライブラリーを用いて目的遺伝子のクローニングを行った。 The entire amount of the ligation mixture was frozen as described in the method of Hohn, B. (Hohn, B. Methods Enzymol., 68: 299-309, 1979) and the Gigapack II packaging kit (Stratagene) ) And packaged into lambda head, and the obtained phage was used to infect E. coli strain LE392. Using the 5 × 10 4 phage library obtained by this method, the target gene was cloned.
実施例Ａ４：ＰＣＲ法による長鎖プローブの作製
ＤＮＡプローブとして、フミコーラ・インソレンスの全ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法により増幅されたロングプローブを作製し、これを用いた。
Example A4: Preparation of long-chain probe by PCR method As a DNA probe, a long probe amplified by a PCR method using whole DNA of Humicola insolens as a template was prepared and used.
各プライマーは、Ｎ末端およびペプチドTP-3において＊で示したアミノ酸に対応するＤＮＡを合成した。作製した合成オリゴヌクレオチドの配列は以下に示される通りであった。 Each primer synthesized DNA corresponding to the amino acid indicated by * in the N-terminus and peptide TP-3. The sequence of the prepared synthetic oligonucleotide was as shown below.
NCE4N1:5’-GCXGA(CT)GGXAA(AG)TC(AGCT)AC-3’(17mer)
NCE4N2:5’-GCXGA(CT)GGXAA(AG)AG(CT)AC-3’(17mer)
NCE4C:5’-CXGC(AG)TT(CT)TT(AG)AACCA(AG)TC-3’(19mer)
(X:イノシン)
NCE4N1: 5'-GCXGA (CT) GGXAA (AG) TC (AGCT) AC-3 '(17mer)
NCE4N2: 5'-GCXGA (CT) GGXAA (AG) AG (CT) AC-3 '(17mer)
NCE4C: 5'-CXGC (AG) TT (CT) TT (AG) AACCA (AG) TC-3 '(19mer)
(X: Inosine)
ＰＣＲ反応は以下の条件で行った。まず、フミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇに対し、プライマーとしてNCE4N1、NCE4C 各１μＭ加えたもの、NCE4N2、NCE4C 各１μＭ加えたものの２組のチューブを作製し、これらを、ｄＮＴＰ存在下、９５℃、５分間熱変性を行った。その後、Taq ポリメラーゼ（リコンビナントTaq 、宝酒造社製）を加え、９４℃１分間、４５℃２分間、７２℃３分間の反応条件を２５回繰り返すことにより増幅した。その結果、プライマーとしてNCE4N1、NCE4C を用いた場合のみ、約７５０ｂｐのＤＮＡが増幅された。これを以降のスクリーニングのプローブとして用いた。 The PCR reaction was performed under the following conditions. First, two sets of tubes were prepared by adding 1 μg each of NCE4N1 and NCE4C as primers and 1 μM each of NCE4N2 and NCE4C as primers to 1 μg of Humicola insolens genomic DNA, and heating them at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of dNTP. Denaturation was performed. Thereafter, Taq polymerase (recombinant Taq, manufactured by Takara Shuzo) was added, and amplification was carried out by repeating the reaction conditions of 94 ° C. for 1 minute, 45 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3 minutes 25 times. As a result, a DNA of about 750 bp was amplified only when NCE4N1 and NCE4C were used as primers. This was used as a probe for subsequent screening.
実施例Ａ５：セルラーゼ成分ＮＣＥ４遺伝子のクローニング
（１）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
ＰＣＲ法により増幅させた約７５０ｂｐのＤＮＡ断片１００ｎｇを、あらかじめECL ダイレクトDNA/RNA ラベリング検出システム（アマシャム社製）により、標識化しておいた。
Example A5: Cloning of Cellulase Component NCE4 Gene (1) Screening by Plaque Hybridization 100 ng of a DNA fragment of about 750 bp amplified by the PCR method was labeled in advance with an ECL direct DNA / RNA labeling detection system (Amersham). I left it.
実施例２に記載の方法に準じて作製したファージプラークは、ハイボンドN+ナイロントランスファーメンブラン（アマシャム社製）にうつしとり、０．４Ｎ水酸化ナトリウムで変性した後、5 倍濃度ＳＳＣ（１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させＤＮＡを固定した。キットの方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、先の標識化したプローブを添加し、４時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った。ラベルの洗浄は前述キットの方法に従った。まず、０．４％ＳＤＳ、６Ｍ尿素添加０．５倍濃度ＳＳＣにより４２℃で２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に２倍濃度ＳＳＣにより室温で５分間の洗浄を２回行った。 Phage plaques prepared according to the method described in Example 2 were transferred to a Hybond N + nylon transfer membrane (manufactured by Amersham), denatured with 0.4 N sodium hydroxide, and then 5 times concentrated SSC (15 mM citrate). (Sodium, 150 mM sodium chloride), dried and immobilized DNA. According to the method of the kit, after 1 hour of prehybridization (42 ° C.), the previously labeled probe was added and hybridization was performed for 4 hours (42 ° C.). Washing of the label followed the method of the kit described above. First, washing for 20 minutes at 42 ° C. was repeated twice with 0.5% SSC containing 0.4% SDS and 6M urea, and then twice for 5 minutes at room temperature with 2% SSC.
プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、添付されている検出溶液に１分間浸したあと、ハイパーフィルム―ECL（アマシャム社製）に感光させ、４個の陽性クローンを得た。 The washed nylon membrane was immersed in the attached detection solution for 1 minute, and then exposed to Hyperfilm-ECL (Amersham) to obtain four positive clones.
（２）ファージＤＮＡの調製
E．coli ＬＥ３９２にファージを感染させ、８時間後ファージ粒子を集め、Grossberger の方法（Grossberger,D.,Nucleic Acids．Res．15 6737,1987 ）により、プロテイナーゼＫおよびフェノール処理後、エタノール沈殿により、ファージＤＮＡを分離した。
(2) Preparation of phage DNA
E. E. coli LE392 was infected with phage, and after 8 hours, phage particles were collected, treated with proteinase K and phenol by Grossberger's method (Grossberger, D., Nucleic Acids. Res. 156737, 1987), and precipitated with phage DNA by ethanol precipitation. Was isolated.
（３）目的遺伝子のサブクローニング
４種のファージＤＮＡをSal I で切断し、アガロース電気泳動に供した。
ＤＮＡをSouthernの方法（Southern,E.M.,J.Mol.Biol．98:503-517，1975）により、ナイロンメンブランにうつしとり、前記（１）のプラークハイブリダイゼーションと同一の条件で、約７５０ｂｐのプローブを用いハイブリダイズさせ、５．２ｋｂｐの目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出した。その結果、４種のファージＤＮＡが同一サイズのSal I 断片を有していた。
(3) Subcloning of target gene Four kinds of phage DNAs were cut with SalI and subjected to agarose electrophoresis.
The DNA was transferred to a nylon membrane by the Southern method (Southern, EM, J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975), and a probe of about 750 bp was obtained under the same conditions as in the plaque hybridization described in (1) above. And a DNA fragment containing a 5.2 kbp target gene was detected. As a result, four types of phage DNAs had Sal I fragments of the same size.
この５．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をセファグラスバンドプレップキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて分離し、E．coli ＪＭ１０９を用いプラスミドｐＵＣ１１９のSal I サイトにサブクローニングを行った。得られたプラスミドをｐＮＣＥ４Ｓａｌとした。 This 5.2 kbp DNA fragment was separated using a Sephagrass band prep kit (manufactured by Pharmacia Biotech), and E. coli was isolated. Using E. coli JM109, subcloning was performed at the SalI site of plasmid pUC119. The resulting plasmid was designated as pNCE4Sal.
実施例Ａ６：塩基配列の決定
（１）ゲノムＤＮＡの塩基配列解析
塩基配列決定は以下の様に実施した。
塩基配列解析装置は、A.L.F．DNAシーケンサーII（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。シーケンシングゲルとしては、レディミックスゲル（ファルマシアバイオテク社製）または、ハイドロリンクロングレンジャー（ＦＭＣ社製）として入手可能なアクリルアミド担体を使用した。ゲル作成用各種試薬（N，N，N'，N'- テトラメチルエチレンジアミン、尿素、過硫酸アンモニウム）としては、A.L.F グレードの試薬（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。塩基配列解読反応は、オートリードシーケンシングキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。ゲル作製条件、反応条件と泳動条件の各々は、各説明書の詳細を参照し、設定した。
Example A6: Determination of base sequence (1) Analysis of base sequence of genomic DNA The base sequence was determined as follows.
The base sequence analyzer is ALF. DNA Sequencer II (Pharmacia Biotech) was used. As a sequencing gel, an acrylamide carrier available as a ready-mix gel (Pharmacia Biotech) or Hydrolink Long Ranger (FMC) was used. ALF grade reagents (Pharmacia Biotech) were used as various gel preparation reagents (N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine, urea, ammonium persulfate). For the base sequence decoding reaction, an auto-read sequencing kit (Pharmacia Biotech) was used. Gel preparation conditions, reaction conditions, and electrophoresis conditions were set with reference to the details of each instruction manual.
テンペレートＤＮＡであるｐＮＣＥ４Ｓａｌを、１０μｇの２Ｍ水酸化ナトリウムでアルカリ変性した後、オートリードシーケンシングキット添付のユニバーサルプライマーとアニーリングさせ、伸長反応を行った。反応産物をシーケンサーで解読したところ、５４６ｂｐの塩基配列が判明した。この結果から、MNEG01なるFITC標識シーケンシングプライマーを作製し、ｐＮＣＥ４Ｓａｌに対して反応させ、さらに解読を進めた。得られた結果から、さらに次のプライマーを作製してゆき、解読を進めた結果、ＮＣＥ４の全長が解読された。作製したFITC標識シーケンシングプライマーは以下に示される通りであった。 The template DNA, pNCE4Sal, was alkali-denatured with 10 μg of 2 M sodium hydroxide, and then annealed with the universal primer attached to the auto-read sequencing kit to perform an extension reaction. When the reaction product was decoded with a sequencer, a 546 bp base sequence was found. From these results, a FITC-labeled sequencing primer MNEG01 was prepared, reacted with pNCE4Sal, and further decoded. Based on the obtained results, the following primers were further prepared, and as a result of decoding, the full length of NCE4 was decoded. The prepared FITC-labeled sequencing primer was as shown below.
MNEG-01:5’-GTGATGAGGGCTGGCGACAGGCC-3’(23mer)
MNEG-02:5’-CTGCCACCTCTATTGCCGGCAGC-3’(23mer)
MNEG-03:5’-CCCGACGCCCTCAAGCCCGGCTG-3’(23mer)
MNEG-04:5’-GGCTGGAGCGGCTGCACCACCTG-3’(23mer)
MNEG-01: 5'-GTGATGAGGGCTGGCGACAGGCC-3 '(23mer)
MNEG-02: 5'-CTGCCACCTCTATTGCCGGCAGC-3 '(23mer)
MNEG-03: 5'-CCCGACGCCCTCAAGCCCGGCTG-3 '(23mer)
MNEG-04: 5'-GGCTGGAGCGGCTGCACCACCTG-3 '(23mer)
（２）塩基配列決定
上記（１）の結果をもとに、MNEG-05 〜MNEG-08 なるFITC標識シーケンシングプライマーＤＮＡを合成した。作製したFITC標識シーケンシングプライマーは以下に示される通りであった。
(2) Determination of Nucleotide Sequence Based on the results of (1) above, FITC-labeled sequencing primer DNAs of MNEG-05 to MNEG-08 were synthesized. The prepared FITC-labeled sequencing primer was as shown below.
MNEG-05:5’-GACCTGACGGAAGCTGAAGCTCG-3’(23mer)
MNEG-06:5’-AGCAGTGCAGCCGCTGGGAGTCG-3’(23mer)
MNEG-07:5’-TGGCAGATGAGGACGTGGTGTTG-3’(23mer)
MNEG-08:5’-CGCAGCCGGACTTGGCGTCGAAG-3’(23mer)
MNEG-05: 5'-GACCTGACGGAAGCTGAAGCTCG-3 '(23mer)
MNEG-06: 5'-AGCAGTGCAGCCGCTGGGAGTCG-3 '(23mer)
MNEG-07: 5'-TGGCAGATGAGGACGTGGTGTTG-3 '(23mer)
MNEG-08: 5'-CGCAGCCGGACTTGGCGTCGAAG-3 '(23mer)
これらプライマーとｐＮＣＥ４Ｓａｌとのオートリードシーケンシングキットによる反応を行った。まず、１０μｇのプラスミドをアルカリ変性し、これを各々のプライマーとアニーリングし、Ｔ７ポリメラーゼで反応させた。その結果、SalI断片の内、１２５７ｂｐの塩基配列が決定できた。その配列は配列番号３に示される通りであった。 A reaction between these primers and pNCE4Sal was performed using an auto-read sequencing kit. First, 10 μg of the plasmid was alkali-denatured, annealed with each primer, and reacted with T7 polymerase. As a result, a 1257 bp base sequence of the SalI fragment could be determined. The sequence is as shown in SEQ ID NO: 3.
実施例Ａ７：イントロンの決定
イントロンの決定には、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１からｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これとゲノムの塩基配列を比較し同領域を判定した。
Example A7: Determination of intron For determination of intron, mRNA was prepared from Humicola insolens MN200-1, cDNA was synthesized using reverse transcriptase, and the nucleotide sequence of the genome was compared with this to determine the same region.
（１）全ＲＮＡの調製
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１をセルラーゼ誘導培地、好ましくは前述（N ）培地において２日間培養し、菌体を遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）により回収した。そのうち２ｇの菌体を滅菌水で洗浄し、液体窒素で凍結したままブレンダー（日本精機社製ホモジナイザーAM-3）で粉砕した。これを４Ｍグアニジンチオシアン酸塩を含む変性溶液１０ｍｌ（４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍメルカプトエタノール）に懸濁した。室温で数分間撹拌の後、１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で中和し、１０ｍｌのＴＥ飽和フェノールを加えさらに撹拌した。これに２ｍｌのクロロホルム―イソアミルアルコール（２４：１）を加え、よく撹拌した後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によりフェノールで変性した菌体成分を除去した。上層（水層）を吸い取り、１０ｍｌのイソプロパノールで核酸を沈殿化した。同沈殿を遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）して核酸として回収し、７０％エタノール―水で再遠心分離により沈殿を洗った。
(1) Preparation of total RNA Humicola insolens MN200-1 was cultured in a cellulase induction medium, preferably the above-mentioned (N) medium, for 2 days, and the cells were collected by centrifugation (3500 rpm, 10 minutes). Two g of the cells were washed with sterile water and pulverized with a blender (Nippon Seiki homogenizer AM-3) while being frozen with liquid nitrogen. This was suspended in 10 ml of a denaturing solution containing 4 M guanidine thiocyanate (4 M guanidine thiocyanate, 25 mM trisodium citrate, 0.5% sodium N-lauryl sarcosinate, 0.1 M mercaptoethanol). After stirring at room temperature for several minutes, the mixture was neutralized with 1 ml of 2M sodium acetate (pH 4.5), added with 10 ml of TE-saturated phenol, and further stirred. To this, 2 ml of chloroform-isoamyl alcohol (24: 1) was added, and the mixture was thoroughly stirred, followed by centrifugation (3500 rpm, 10 minutes) to remove cell components denatured with phenol. The upper layer (aqueous layer) was sucked, and the nucleic acid was precipitated with 10 ml of isopropanol. The precipitate was collected as a nucleic acid by centrifugation (3500 rpm, 10 minutes), and the precipitate was washed by re-centrifugation with 70% ethanol-water.
この沈殿を３．５ｍｌのＴＥに溶解の後、溶液に８８０μｌの１０Ｍ塩化リチウム溶液を加え、５℃で２時間冷蔵の後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分）により沈殿を回収した。同沈殿は７０％エタノールで洗い、これを全ＲＮＡ画分とした。収量は２．７ｍｇ、 収率は０．１４％であった。 After dissolving this precipitate in 3.5 ml of TE, 880 μl of a 10 M lithium chloride solution was added to the solution, and the solution was refrigerated at 5 ° C. for 2 hours, and then collected by centrifugation (12000 rpm, 10 minutes). The precipitate was washed with 70% ethanol and used as a total RNA fraction. The yield was 2.7 mg, and the yield was 0.14%.
（２）ポリＡテイル+ＲＮＡ（＝ｍＲＮＡ）の調製
ｍＲＮＡの調製は、ｍＲＮＡピュアリフィケーションキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行った。
(2) Preparation of poly A tail + RNA (= mRNA) The preparation of mRNA was performed using an mRNA purification kit (Pharmacia Biotech).
まず上記（１）で調製した全ＲＮＡのうち、１ｍｇを１ｍｌのエリューションバッファーに溶解し、これに６５℃、１０分間の熱変性処理を加えた。氷中で急冷の後、０．２ｍｌのサンプルバッファーを加えた。この全量のＲＮＡ溶液をオリゴ（dT）セルロースカラムにチャージし、ハイソルトバッファーで３回、ロウソルトバッファーで３回カラムを洗浄の後、６５℃に加温したエリューションバッファーで溶出した。このカラム操作を２回繰り返し、ｍＲＮＡ画分とした。収量は１９．２μｇ、収率は２％であった。 First, 1 mg of the total RNA prepared in the above (1) was dissolved in 1 ml of an elution buffer, and subjected to a heat denaturation treatment at 65 ° C. for 10 minutes. After quenching in ice, 0.2 ml of sample buffer was added. The total amount of the RNA solution was charged into an oligo (dT) cellulose column, and the column was washed three times with a high salt buffer and three times with a low salt buffer, and then eluted with an elution buffer heated to 65 ° C. This column operation was repeated twice to obtain an mRNA fraction. The yield was 19.2 μg, and the yield was 2%.
（３）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡ合成は、タイムセーバーcDNA合成キット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行った。
(3) Synthesis of cDNA cDNA was synthesized using a time saver cDNA synthesis kit (Pharmacia Biotech).
まず、５μｇのｍＲＮＡを２０μｌのサンプルバッファーに溶解した。６５℃、１０分間の熱処理の後、ファーストストランド合成ミックスにジチオスレイトール溶液およびオリゴ（dT）プライマーと共に添加し、３７℃で１時間反応させた。次に、この全量をセカンドストランドミックスに加え、１２℃、３０分間、次いで２２℃、１時間反応させ、これをｃＤＮＡとした。 First, 5 μg of mRNA was dissolved in 20 μl of sample buffer. After a heat treatment at 65 ° C. for 10 minutes, a dithiothreitol solution and an oligo (dT) primer were added to the first strand synthesis mix, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. Next, the whole amount was added to a second strand mix and reacted at 12 ° C. for 30 minutes, then at 22 ° C. for 1 hour to obtain cDNA.
（４）セルラーゼＮＣＥ４ｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅
合成したｃＤＮＡのうち１μｇを鋳型とし、目的のｃＤＮＡのみをＰＣＲ法により増幅した。Ｎ末端およびＣ末端のプライマーとして以下の様な配列のオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。
(4) Amplification of Cellulase NCE4 cDNA by PCR Using 1 μg of the synthesized cDNA as a template, only the target cDNA was amplified by PCR. Oligonucleotide primers having the following sequences were prepared as N-terminal and C-terminal primers.
NCE4-CN:5’-ATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCCGCTCCGCC-3’(30mer)
NCE4-CC:5’-TACAGGCACTGATGGTACCAGTCATTAATC-3’(30mer)
NCE4-CN: 5'-ATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCCGCTCCGCC-3 '(30mer)
NCE4-CC: 5'-TACAGGCACTGATGGTACCAGTCATTAATC-3 '(30mer)
ＰＣＲ反応は、以下の条件で行った。まず、フミコーラ・インソレンスｃＤＮＡ１μｇに対し、プライマーを各１μＭ加え、dNTP存在下、９４℃、１０分間熱変性を行った。その後、Taq ポリメラーゼ（リコンビナントTaq 、宝酒造社製）を加え、９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃３分間の反応条件を３０回繰り返すことにより増幅した。増幅された断片は、アガロースゲル電気泳動の結果、０．９ｋｂｐの大きさであった。これをエタノール沈殿化により濃縮し、pT7 ブル−T ―ベクターキット（ノバジェン社製）によりクローン化した。このプラスミドをｐＣＮＣＥ４とした。 The PCR reaction was performed under the following conditions. First, 1 μg of each primer was added to 1 μg of Humicola insolens cDNA, and heat denaturation was performed at 94 ° C. for 10 minutes in the presence of dNTP. Thereafter, Taq polymerase (recombinant Taq, manufactured by Takara Shuzo) was added, and amplification was carried out by repeating the reaction conditions of 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3 minutes 30 times. The amplified fragment had a size of 0.9 kbp as a result of agarose gel electrophoresis. This was concentrated by ethanol precipitation, and cloned with a pT7 blue-T-vector kit (Novagen). This plasmid was designated as pCNCE4.
（５）ｃＤＮＡの塩基配列解析
シーケンシング反応は前述同様オートリードシーケンシングキットを用いた。
プラスミドｐＣＮＣＥ４を２Ｍ水酸化ナトリウムでアルカリ変性し、エタノールで沈殿化した。この一本鎖プラスミドをテンペレートとし、Ｔ７ポリメラーゼで反応させた。前記合成プライマーMNEG01、MNEG02、MNEG03、MNEG04、MNEG05、MNEG06、MNEG07、およびMNEG08ならびにキット添付のユニバーサルプライマー、リバースプライマーを用いて反応を行い、配列を解読した。
(5) Analysis of base sequence of cDNA For the sequencing reaction, an auto-read sequencing kit was used as described above.
Plasmid pCENCE4 was alkali-denatured with 2M sodium hydroxide and precipitated with ethanol. This single-stranded plasmid was used as a template and reacted with T7 polymerase. A reaction was performed using the synthetic primers MNEG01, MNEG02, MNEG03, MNEG04, MNEG05, MNEG06, MNEG07, and MNEG08, and the universal primer and reverse primer attached to the kit, and the sequence was decoded.
その結果、５６ｂｐの一つのイントロンが存在した。配列番号３の配列において、非翻訳開始配列およびその終了配列、イントロン内部の調整配列は下記の通りである（数字は配列番号３の配列位置番号である）。
Introne ：４５３〜４５８、５０６〜５０８、４９１〜４９７
As a result, there was one 56 bp intron. In the sequence of SEQ ID NO: 3, the non-translation initiation sequence, its termination sequence, and the regulatory sequence within the intron are as follows (the numbers are the sequence position numbers of SEQ ID NO: 3).
Introne: 453-458, 506-508, 491-497
実施例Ｂ１：プラスミドｐＭＫＤ０１の作製
（１）プラスミドｐＵＣ１１８ＢＮの作製
ｐＵＣ１１８ ＤＮＡ １μｇをBamH Iによって切断後、フェノール処理によって制限酵素を失活させた。これをエタノール沈殿し、少量のＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。このＤＮＡをDNA ブランチング キット( 宝酒造社製)によって末端を平滑化した。これをさらにDNA ライゲイション キット（宝酒造社製）によって連結し、自己閉環させた。得られた連結混合物をE．coli competent cells ＪＭ１０９（宝酒造社製）に形質転換した。形質転換体について、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．００４％ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）上で生育可能で、かつ白色のコロニーを呈するものを選抜し、これを更に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）において一晩、３７℃で培養した。得られた培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをBamH Iによって切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ｐＵＣ１１８ ＤＮＡのBamH I部位を破壊したプラスミドＤＮＡを選択した。このプラスミドＤＮＡをｐＵＣ１１８ＢＮとした。
Example B1: Preparation of plasmid pMKD01 (1) Preparation of plasmid pUC118BN 1 μg of pUC118 DNA was digested with BamHI, and the restriction enzyme was inactivated by phenol treatment. This was precipitated with ethanol and dissolved in a small amount of TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) buffer. This DNA was blunt-ended with a DNA branching kit (Takara Shuzo). This was further ligated with a DNA ligation kit (Takara Shuzo) and self-cyclized. The resulting ligation mixture was coli competent cells JM109 (Takara Shuzo) was transformed. For transformants, on LB agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar) containing 100 μg / ml ampicillin, 1 mM IPTG, 0.004% X-gal A viable and white colony was selected and further cultured in an LB medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) containing 100 μg / ml ampicillin at 37 ° C. overnight. And cultured. Plasmid DNA was recovered from the resulting culture using the alkali-SDS method. This plasmid DNA was digested with BamHI and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to select a plasmid DNA in which the BamHI site of pUC118 DNA was disrupted. This plasmid DNA was designated as pUC118BN.
（２）プラスミドｐＵＣ１１８ＢＳＮの作製
ｐＵＣ１１８ＢＮ ＤＮＡ １μｇをSph I によって切断し、前述と同様の方法により、ｐＵＣ１１８ＢＮ のSph I 部位を破壊したプラスミドＤＮＡを得た。このプラスミドＤＮＡをｐＵＣ１１８ＢＳＮとした。
(2) Preparation of plasmid pUC118BSN 1 μg of pUC118BN DNA was digested with SphI, and a plasmid DNA in which the SphI site of pUC118BN was disrupted was obtained in the same manner as described above. This plasmid DNA was designated as pUC118BSN.
（３）プラスミドｐＭ２１の作製
（Ａ）セルラーゼＮＣＥ２遺伝子の単離
フミコーラ・インソレンスから、特開平８−１２６４９２号公報に記載の方法によって得られる、セルラーゼＮＣＥ２遺伝子、ならびにそのプロモーターおよびターミネーター領域として上流に１．４Ｋｂ、下流に０．５ＫｂのＤＮＡ配列を有する全長３．４ＫｂｐのPst I 〜Xba I 断片を、先のｐＵＣ１１８ＢＳＮのPst I 〜Xba I 部位に連結した。得られたラスミドＤＮＡをｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸとした。
(3) Preparation of plasmid pM21 (A) Isolation of cellulase NCE2 gene The cellulase NCE2 gene obtained from Humicola insolens by the method described in JP-A-8-126492, and the cellulase NCE2 gene as an upstream and downstream promoter and terminator region. A full-length 3.4 Kbp PstI to XbaI fragment having a DNA sequence of 0.4 Kb and 0.5 Kb downstream was ligated to the PstI to XbaI sites of pUC118BSN. The obtained rasmid DNA was designated as pUC118BSN-PX.
（Ｂ）プラスミドｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸの部位指定変異処理
ＮＣＥ２遺伝子のＮ末端の下流および終止コドンのすぐ下流に、BamH I部位を以下のように部位指定変異により導入した。プラスミドｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸによりE．coli ＪＭ１０９株を形質転換し、さらにヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させた後、アンピシリン、カナマイシンをそれぞれ１５０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌの濃度で含む３０ｍｌの、２×ＹＴ液体培地（１．６％バクトトリプトン、０．８％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）において、３７℃で、１６〜２０時間培養した。培養上清よりＭ１３の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を回収した。このｓｓＤＮＡと２種の合成オリゴヌクレオチドを用い、スカルプタ−インビトロミュータジェネシスシステム（アマシャム社製）を使用して、部位指定変異処理を行った。作製した合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列は以下に示されるとおりであった。
(B) Treatment of site-directed mutagenesis of plasmid pUC118BSN-PX A BamHI site was introduced by site-directed mutation as described below immediately downstream of the N-terminal of the NCE2 gene and immediately downstream of the stop codon. The plasmid pUC118BSN-PX was used to E. coli JM109 strain, and further infected with helper phage M13KO7, 30 ml of 2 × YT liquid medium (1.6% bactotryptone) containing ampicillin and kanamycin at a concentration of 150 μg / ml and 70 μg / ml, respectively. , 0.8% yeast extract, 0.5% NaCl) at 37 ° C for 16 to 20 hours. M13 single-stranded DNA (ssDNA) was recovered from the culture supernatant. Using this ssDNA and two kinds of synthetic oligonucleotides, site-directed mutagenesis was performed using a sculpter-in vitro mutagenesis system (manufactured by Amersham). The sequences of the prepared synthetic oligonucleotide primers were as shown below.
MNC-02 5’-GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3’(36mer)
MNC-03 5’-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3’(36mer)
MNC-02 5'-GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3 '(36mer)
MNC-03 5'-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3 '(36mer)
部位指定変異処理したＤＮＡ混合液を、E．coli ＴＧ１に導入し、得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）にて培養し、プラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをBamH Iによって切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、プラスミドｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸに二箇所BamH I部位の導入されたプラスミドＤＮＡを選択した。このプラスミドＤＮＡをｐＭ２１とした。 The DNA mixture subjected to the site-directed mutagenesis treatment was placed in E. coli. coli TG1, and the resulting transformant was cultured in an LB medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) containing 100 μg / ml ampicillin, and the plasmid DNA was recovered. This plasmid DNA was digested with BamHI and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to select a plasmid DNA in which two BamHI sites were introduced into plasmid pUC118BSN-PX. This plasmid DNA was designated as pM21.
（４）セルラーゼＮＣＥ３遺伝子の単離
公知のHumicola grisea 由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子（de Oliviera Alzevedo,M.et al.,J.General Microbiol.,136:2569-2576,1990 ）の配列をもとに、フミコーラ・インソレンス由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子（ＮＣＥ３）をＰＣＲ法により単離した。
(4) Isolation of Cellulase NCE3 Gene Based on the sequence of a known cellobiohydrolase gene derived from Humicola grisea (de Oliviera Alzevedo, M. et al., J. General Microbiol., 136: 2569-2576, 1990). Next, a cellobiohydrolase gene (NCE3) derived from Humicola insolens was isolated by PCR.
（Ａ）ゲノムＤＮＡの単離
前記実施例Ａ３の方法によりフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１のゲノムＤＮＡを得た。
(A) Isolation of Genomic DNA Genomic DNA of Humicola insolens MN200-1 was obtained by the method of Example A3.
（Ｂ）セルラーゼＮＣＥ３遺伝子のＰＣＲ法による増幅 Humicola grisea 由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子の配列をもとに、フミコーラ・インソレンスのＮＣＥ３遺伝子をＰＣＲ法により単離した。このＮＣＥ３を含むＰＣＲ産物が、プラスミドｐＭ２１のBamH I部位にフレームを合わせて連結できるように、各プライマーにはあらかじめBamH I部位を含む形で設計した。プライマーとして以下のような配列の合成オリゴヌクレオチドを作製した。 (B) Amplification of cellulase NCE3 gene by PCR method The NCE3 gene of Humicola insolens was isolated by PCR based on the sequence of the cellobiohydrolase gene derived from Humicola grisea. Each primer was designed in advance to contain a BamHI site so that the PCR product containing NCE3 could be ligated in frame with the BamHI site of plasmid pM21. Synthetic oligonucleotides having the following sequences were prepared as primers.
MKA-05:5’-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3’(36mer)
MKA-06:5’-TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3’(36mer)
MKA-05: 5'-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3 '(36mer)
MKA-06: 5'-TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3 '(36mer)
ＰＣＲ反応はLA PCR Kit Ver.2（宝酒造社製）に従い、以下の方法で行った。まず、前述の方法によって得られるフミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇに対し、プライマーを各１μＭ、４００μＭ dNTP 、LA Taqポリメラーゼ２．５Ｕを加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃３分間の反応条件を３０回繰り返すことにより増幅した。０．８％アガロースゲル電気泳動の結果、１．６ＫｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。この１．６ＫｂｐのＤＮＡ断片をセファグラスバンドプレップ キット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて回収し、これをpT7 ブルーT-ベクター キット（ノバジェン社製）に連結した。このプラスミドＤＮＡをｐＫ２１とした。 The PCR was performed according to the following method according to LA PCR Kit Ver.2 (Takara Shuzo). First, 1 μg each of primers was added to 1 μg of Humicola insolens genomic DNA obtained by the above-mentioned method, and 1 μM, 400 μM dNTP and 2.5 U of LA Taq polymerase were added, and reaction conditions at 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3 minutes Was amplified 30 times to amplify. As a result of 0.8% agarose gel electrophoresis, amplification of 1.6 Kbp DNA was confirmed. The 1.6 Kbp DNA fragment was recovered using a Sephagrass band prep kit (Pharmacia Biotech) and ligated to a pT7 blue T-vector kit (Novagen). This plasmid DNA was designated as pK21.
（５）プラスミドｐＫＭ０４の作製
プラスミドｐＫ２１ＤＮＡをBamH Iによって消化し、１．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、プラスミドｐＭ２１ＤＮＡをBamH Iによって消化し、さらに７０℃で１０分間処理し、制限酵素を失活させた。これを子牛由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）によって脱リン酸化し、さらに、これを０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、５．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ｐＫ２１由来の１．６ＫｂｐのＤＮＡ断片とｐＭ２１由来の５．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＫＭ０４を得た。
(5) Preparation of plasmid pKM04 Plasmid pK21 DNA was digested with BamHI to recover a 1.6 Kbp DNA fragment. Next, the plasmid pM21 DNA was digested with BamHI and further treated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. This was dephosphorylated with calf-derived alkaline phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) and further separated by 0.8% agarose gel electrophoresis to recover a 5.2 Kbp DNA fragment. The 1.6 Kbp DNA fragment derived from pK21 and the 5.2 Kbp DNA fragment derived from pM21 were ligated to obtain plasmid pKM04.
（６）プラスミドｐＭＫＤ０１の作製
まず、公知の方法により得られるAspergillus nidulans由来trp C 遺伝子のプロモーターおよびターミネーター（Mullaney，E.J． et al.，Mol．Gen．Genet．199:37-45,1985 ）を用いて、特開昭５９−１７５８８９号公報に記載されているデストマイシン耐性遺伝子をフミコーラ・インソレンスで発現可能にした遺伝子を作製した。これを、プラスミドｐＫＭ０４のXba I 部位に導入し、プラスミドｐＭＫＤ０１を作製した。
(6) Preparation of plasmid pMKD01 First, a promoter and a terminator (Mullaney, EJ. Et al., Mol. Gen. Genet. 199: 37-45, 1985) of the trp C gene derived from Aspergillus nidulans obtained by a known method were used. Thus, a gene was prepared in which the destomycin resistance gene described in JP-A-59-175889 was made expressible by Humicola insolens. This was introduced into the XbaI site of plasmid pKM04 to prepare plasmid pMKD01.
実施例Ｂ２：プラスミドｐＭＫＤ０１によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
（１）プラスミドｐＭＫＤ０１の高濃度精製標品の調製
プラスミドｐＭＫＤ０１をフミコーラ・インソレンスに導入するために、まずｐＭＫＤ０１の高濃度精製標品を調製した。ｐＭＫＤ０１をE．coli ＪＭ１０９に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌ ＬＢ培地において一晩、３７℃で培養した。得られた培養液をフレキシプレップ キット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて精製し、１μｇ／μｌのｐＭＫＤ０１プラスミドＤＮＡを得た。
Example B2: Transformation of Humicola insolens with plasmid pMKD01 (1) Preparation of highly concentrated purified sample of plasmid pMKD01 To introduce plasmid pMKD01 into Humicola insolens, first, a highly concentrated purified sample of pMKD01 was prepared. pMKD01 was transformed into E. coli. coli JM109, and cultured at 37 ° C. overnight in 100 ml LB medium containing 100 μg / ml ampicillin. The resulting culture was purified using a Flexiprep kit (Pharmacia Biotech) to obtain 1 μg / μl of pMKD01 plasmid DNA.
（２）フミコーラ・インソレンスの形質転換
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を（Ｓ）培地中３７℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。ここで、（Ｓ）培地の組成は、前述（Ｎ）培地にグルコース（３．０％）を加え、かつアビセルを除いたものである。得られた菌体を０．５Ｍシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（５ｍｇ／ｍｌ Novozyme 234（ＮＬＩ社製）、５ｍｇ／ｍｌ Cellulase Onozuka R-10（ヤクルト社製）、０．５Ｍ シュークロース）１０ｍｌに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。
(2) Transformation of Humicola insolens Humicola insolens MN200-1 was cultured in (S) medium at 37 ° C, and after 24 hours, cells were collected by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. Here, the composition of the (S) medium is such that glucose (3.0%) is added to the (N) medium and Avicel is removed. The obtained cells were washed with 0.5 M sucrose and filtered with a 0.45 μm filter to obtain a protoplast-enzyme solution (5 mg / ml Novozyme 234 (NLI)), 5 mg / ml Cellulase Onozuka R-10 (Yakult) And 0.5M sucrose) in 10 ml. The mixture was shaken at 30 ° C. for 60 to 90 minutes to make the mycelium protoplast. After filtering this suspension, centrifugation was performed at 2500 rpm for 10 minutes to collect protoplasts, which were washed with a SUTC buffer (0.5 M sucrose, 10 mM calcium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)).
以上のように調製したプロトプラストを１ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μｌに対し１０μｇのＤＮＡ（ＴＥ）溶液（１０μｌ）を加え、氷中に５分間静置した。つぎに、４００μｌのＰＥＧ溶液（６０％ ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。 The protoplast prepared as described above was suspended in 1 ml of SUTC buffer solution, and 10 μg of a DNA (TE) solution (10 μl) was added to 100 μl of the suspension, and the mixture was allowed to stand on ice for 5 minutes. Next, 400 μl of a PEG solution (60% PEG 4000, 10 mM calcium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)) was added, and the mixture was allowed to stand in ice for 20 minutes. Then, 10 ml of SUTC buffer was added, and 2500 rpm for 10 minutes. Centrifuged. The collected protoplasts were suspended in 1 ml of SUTC buffer, then centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes, and finally suspended in 100 μl of SUTC buffer.
以上の処理を加えたプロトプラストを、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＧ培地（１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８））上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃で５日間培養した後、形成したコロニーを形質転換体とした。 The protoplasts treated above were placed on a YMG medium (1% glucose, 0.4% yeast extract, 0.2% malt extract, 1% agar (pH 6.8)) containing 200 μg / ml hygromycin B. , And YMG soft agar, and cultured at 37 ° C. for 5 days. The formed colonies were used as transformants.
（３）ｐＭＫＤ０１による形質転換株の培養およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価
前記のようにプラスミドｐＭＫＤ０１をフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１に導入し、ハイグロマイシン耐性を示す株を５０株選抜した。これらを（Ｎ）培地で３７℃で５日間培養した。得られた培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、ｐＭＫＤ０１による形質転換株のうち５クローンにおいて、ＮＣＥ３と推定されるタンパク質バンドが、親株より３〜４倍増加していた。
(3) Culture of transformed strain by pMKD01 and evaluation by SDS-PAGE As described above, plasmid pMKD01 was introduced into Humicola insolens MN200-1, and 50 strains showing hygromycin resistance were selected. These were cultured in the (N) medium at 37 ° C. for 5 days. When the obtained culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE, in 5 clones among the transformants transformed with pMKD01, the protein band presumed to be NCE3 was increased 3 to 4 times as compared with the parent strain.
（４）組み換えＮＣＥ３のＮ末端アミノ酸残基の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、大量発現したタンパク質バンドがＮＣＥ３遺伝子由来であることを確認するために、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。まず、親株とＮＣＥ３高発現株から得られた培養上澄について、前記実施例Ａ２の方法に従いFPLCシステムを用いたカラムクロマトグラフィーを行い、主要なピークを比較した。ＮＣＥ３高発現株において特に増加しているピークを分取し、凍結乾燥した。これを少量の水に溶解し、8 ％Gel SDS-PAGE mini（テフコ社製）を用いて電気泳動した。これを前記実施例Ａ２の方法に従ってPVDF膜に、タンパク質を電気的にうつしとり、コマジーブリリアントブルーR-250 で染色した後、脱色し、水で洗浄した。ここから、分子量６６ＫＤのタンパク質がブロットされた部分を切り出し、ブロットされたタンパク質を、Podell，D．N．らの方法（Podell，D．N．et al.，Biochem．Biophys．Res．Commun．,81:176,1978 ）に従い、修飾Ｎ末端残基を除去した。まず、目的タンパク質を切り出し、少量の０．５％ポリビニルピロリドン（分子量４０，０００、シグマ社製）／１００ｍＭ酢酸溶液中で、３７℃で３０分間保温した後、水でよく洗浄した。次に、Pfu ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（宝酒造社製）により修飾Ｎ末端残基を除去し、水で洗浄、風乾した。これをプロテインシーケンサーModel 492 に供し、Ｎ末端側アミノ酸配列を１５残基決定した。得られた配列は以下に示される通りであった。
(4) Identification of N-terminal Amino Acid Residue of Recombinant NCE3 From the results of SDS-PAGE, the N-terminal amino acid sequence of this protein was determined in order to confirm that the protein band expressed in large amounts was derived from the NCE3 gene. First, the culture supernatants obtained from the parent strain and the NCE3 high expression strain were subjected to column chromatography using an FPLC system according to the method of Example A2, and the main peaks were compared. The peak which increased particularly in the NCE3 high expression strain was collected and freeze-dried. This was dissolved in a small amount of water, and electrophoresed using 8% Gel SDS-PAGE mini (manufactured by Tefco). According to the method of Example A2, the protein was electrically transferred to a PVDF membrane, stained with Coomassie Brilliant Blue R-250, decolorized, and washed with water. From this, a portion where a protein having a molecular weight of 66 KD was blotted was cut out, and the blotted protein was subjected to Podell, DC. N. Modified N-terminal residues were removed according to the method of Pollell, DN et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 81: 176, 1978. First, the target protein was cut out, kept in a small amount of 0.5% polyvinylpyrrolidone (molecular weight: 40,000, manufactured by Sigma) / 100 mM acetic acid solution at 37 ° C. for 30 minutes, and thoroughly washed with water. Next, the modified N-terminal residue was removed with Pfu pyroglutamate aminopeptidase (manufactured by Takara Shuzo), washed with water, and air-dried. This was subjected to a protein sequencer Model 492, and the N-terminal amino acid sequence was determined at 15 residues. The resulting sequence was as shown below.
N末端アミノ酸配列：Asn-Cys-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Glu-Arg-His-Pro-Ser-Leu-Ser-Trp
(15残基)
N-terminal amino acid sequence: Asn-Cys-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Glu-Arg-His-Pro-Ser-Leu-Ser-Trp
(15 residues)
このＮ末端側アミノ酸配列は、プラスミドｐＭＫＤ０１の塩基配列から推定されるセルラーゼＮＣＥ２、ＮＣＥ３融合タンパク質のアミノ酸配列と一致した。 This N-terminal amino acid sequence coincided with the amino acid sequence of the cellulase NCE2, NCE3 fusion protein deduced from the nucleotide sequence of plasmid pMKD01.
（５）ｐＭＫＤ０１による形質転換株のＦＰＬＣよる評価
前述の様にＳＤＳ−ＰＡＧＥでＮＣＥ３の大量発現が確認された５クローンの培養上澄をさらに定量するために、ＦＰＬＣシステムによりカラムクロマトグラフィーを行った。その条件は前記（４）と同一とした。ＮＣＥ３のピークを分取し、これを凍結乾燥し、重量を測定して高発現株と親株の生産性を比較した。その結果は、次の表に示されるとおりであった。
(5) Evaluation by FPLC of the transformed strain using pMKD01 In order to further quantitate the culture supernatant of the five clones for which NCE3 was overexpressed by SDS-PAGE as described above, column chromatography was performed using an FPLC system. . The conditions were the same as in (4) above. The NCE3 peak was collected, freeze-dried, and weighed to compare the productivity of the high expression strain and the parent strain. The results were as shown in the following table.
実施例Ｂ３：プラスミドｐＥＧＤ０１の作製
プラスミドｐＭＫＤ０１をBamH Iによって消化し、さらに７０℃の熱処理によって制限酵素を失活させ、脱リン酸化処理し、８．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
Example B3: Preparation of plasmid pEGD01 Plasmid pMKD01 was digested with BamHI, and the restriction enzyme was inactivated by heat treatment at 70 ° C., followed by dephosphorylation to recover an 8.2 Kbp DNA fragment.
次に、上記実施例Ａ１〜７で得られたフミコーラ・インソレンス由来のＮＣＥ４遺伝子の配列をもとに、ＰＣＲ法によりＮＣＥ４遺伝子を増幅した。このＮＣＥ４を含むＰＣＲ産物は、前述プラスミドｐＭＫＤ０１の８．２ＫｂｐのBamH I断片にフレームを合わせて連結できるように、各プライマーにはあらかじめBamH I部位を含む形で設計した。プライマーとして以下の配列の合成オリゴヌクレオチドを作製した。 Next, the NCE4 gene was amplified by PCR based on the sequence of the NCE4 gene derived from Humicola insolens obtained in Examples A1 to A7. This PCR product containing NCE4 was designed so that each primer contained a BamHI site in advance so that it could be ligated in frame with the 8.2 Kbp BamHI fragment of plasmid pMKD01. A synthetic oligonucleotide having the following sequence was prepared as a primer.
NCE4-N:5’-CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3’(30mer)
NCE4-C:5’-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3’(30mer)
NCE4-N: 5'-CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3 '(30mer)
NCE4-C: 5'-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3 '(30mer)
ＰＣＲ反応は、以下のように行った。フミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇに対し、プライマーを各１μＭ、４００μＭ dNTP 、Pfu DNA ポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５Ｕを加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃３分間の反応条件を２５回繰り返すことにより０．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。この０．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収し、これを前述ｐＭＫＤ０１の８．２Ｋｂｐ BamH I 断片に連結した。このプラスミドＤＮＡをｐＥＧＤ０１とした。 The PCR reaction was performed as follows. To 1 μg of Humicola insolens genomic DNA, 1 μM of each primer, 400 μM dNTP and 2.5 U of Pfu DNA polymerase (manufactured by Stratagene) were added, and the reaction conditions at 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3 minutes were changed to 25. This was repeated twice to amplify a 0.8 Kbp DNA fragment. The 0.8 Kbp DNA fragment was recovered and ligated to the 8.2 Kbp BamHI fragment of pMKD01 described above. This plasmid DNA was designated as pEGD01.
実施例Ｂ４：プラスミドｐＥＧＤ０１の発現
（１）プラスミドｐＥＧＤ０１によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
プラスミドｐＥＧＤ０１によるフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１の形質転換は、実施例Ｂ２の方法に従って行った。まず、ｐＥＧＤ０１の高濃度精製標品を調製し、１μｇ／μｌのｐＥＧＤ０１プラスミドＤＮＡを得た。このｐＥＧＤ０１溶液を１０μｌ使用して、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を形質転換し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株を５０株選抜した。これらを（Ｎ）培地で３７℃で５日間培養した。得られた培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、ｐＥＧＤ０１による形質転換株のうち１０クローンにおいて、ＮＣＥ４と推定されるタンパク質バンドが、親株より１０〜１６倍増加していた。
Example B4: Expression of plasmid pEGD01 (1) Transformation of Humicola insolens with plasmid pEGD01 Transformation of Humicola insolens MN200-1 with plasmid pEGD01 was performed according to the method of Example B2. First, a highly concentrated purified product of pEGD01 was prepared, and 1 μg / μl of pEGD01 plasmid DNA was obtained. Using 10 μl of this pEGD01 solution, Humicola insolens MN200-1 was transformed, and 50 transformants showing hygromycin resistance were selected. These were cultured in the (N) medium at 37 ° C. for 5 days. When the obtained culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE, the protein band presumed to be NCE4 was increased 10 to 16 times in 10 clones among the transformants transformed with pEGD01 as compared with the parent strain.
（２）組み換えＮＣＥ４のＮ末端アミノ酸残基の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、大量発現したタンパク質バンドがＮＣＥ４遺伝子由来であることを確認するために、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。まず、親株、ＮＣＥ４高発現株から得られた培養上澄をＦＰＬＣシステムでカラムクロマトグラフィーを行い、主要なピークを比較した。条件は上記実施例Ｂ２と同一とした。ＮＣＥ４高発現株において特に増加しているピークを分取し、凍結乾燥した。これを少量の水に溶解した。実施例Ｂ２の方法に従って修飾Ｎ末端残基を除去した後、前述のプロテインシーケンサーによって、Ｎ末端側アミノ酸配列を決定した。その結果、２種類のＮ末端側アミノ酸配列がおよそ７：３の割合で得られた。得られた配列は以下に示される通りであった。次に、修飾Ｎ末端を除去せずに前述のプロテインシーケンサーによって、Ｎ末端側アミノ酸配列を決定した。その結果、以下に示されるアミノ酸配列１のみが得られた。
(2) Identification of N-terminal Amino Acid Residues of Recombinant NCE4 From the results of SDS-PAGE, the N-terminal amino acid sequence of this protein was determined in order to confirm that the protein band expressed in large amounts was derived from the NCE4 gene. First, the culture supernatant obtained from the parent strain and the NCE4 high expression strain was subjected to column chromatography using an FPLC system, and the main peaks were compared. The conditions were the same as in Example B2. The peak which increased particularly in the NCE4 high expression strain was collected and freeze-dried. This was dissolved in a small amount of water. After removing the modified N-terminal residue according to the method of Example B2, the N-terminal amino acid sequence was determined by the aforementioned protein sequencer. As a result, two types of N-terminal amino acid sequences were obtained at a ratio of about 7: 3. The resulting sequence was as shown below. Next, the N-terminal amino acid sequence was determined using the aforementioned protein sequencer without removing the modified N-terminal. As a result, only the amino acid sequence 1 shown below was obtained.
N末端アミノ酸配列1：Val-Val-Glu-Glu-Arg-Gln-Asn-Cys-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp(20残基)
N末端アミノ酸配列2：Asn-(Cys)-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser-(Cys)(20残基)
N-terminal amino acid sequence 1: Val-Val-Glu-Glu-Arg-Gln-Asn-Cys-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp (20 residues)
N-terminal amino acid sequence 2: Asn- (Cys) -Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp- (Cys)-(Cys) -Lys-Pro-Ser- (Cys) (20 residues)
これらのＮ末端側アミノ酸配列は、プラスミドｐＥＧＤ０１の塩基配列から推定されるセルラーゼＮＣＥ２およびＮＣＥ４融合タンパク質のアミノ酸配列と一致した。Ｎ末端側アミノ酸配列が２種類得られたことで、本融合タンパク質のシグナル配列が切断される際、複数の位置でプロセスされることが明らかとなった。 These N-terminal amino acid sequences matched the amino acid sequences of the cellulase NCE2 and NCE4 fusion proteins deduced from the nucleotide sequence of plasmid pEGD01. The fact that two N-terminal amino acid sequences were obtained revealed that when the signal sequence of the present fusion protein was cleaved, it was processed at a plurality of positions.
（３）ｐＥＧＤ０１による形質転換株のＦＰＬＣよる評価
前述の様にＳＤＳ−ＰＡＧＥでＮＣＥ４の大量発現が確認された５クローンの培養上澄をさらに定量するために、ＦＰＬＣシステムでカラムクロマトグラフィーを行い、ＮＣＥ４のピークを分取した。これを凍結乾燥し、重量を測定し、高発現株と親株の生産性を比較した。その結果は、次の表に示される通りであった。
(3) Evaluation by FPLC of the transformed strain using pEGD01 In order to further quantify the culture supernatant of the five clones in which NCE4 was overexpressed by SDS-PAGE as described above, column chromatography was performed using an FPLC system. The peak of NCE4 was collected. This was freeze-dried, weighed, and the productivity of the high expression strain and that of the parent strain were compared. The results were as shown in the following table.
実施例Ｂ５：プラスミドｐＩＥＤ０２の作製
（１）プラスミドｐＩＤ０１の作製
プラスミドｐＥＧＤ０１をHind IIIおよびBamH Iによって消化し、７．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
次に、特開平８−５６６３号公報に記載の方法で得られるフミコーラ・インソレンス由来のＮＣＥ１遺伝子の配列をもとに、ＰＣＲ法によりＮＣＥ１遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列をコードする部分のＤＮＡを増幅した。このＮＣＥ１プロモーターおよびシグナル配列を含むＰＣＲ産物は、前述プラスミドｐＥＧＤ０１の７．２ＫｂｐのHind III〜BamH I断片に連結できるように、各プライマーにはあらかじめHind III、BamH I部位を含む形で設計した。プライマーとして以下の配列の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
Example B5: Preparation of plasmid pIED02 (1) Preparation of plasmid pID01 Plasmid pEGD01 was digested with HindIII and BamHI to recover a 7.2 Kbp DNA fragment.
Next, based on the sequence of the Humicola insolens-derived NCE1 gene obtained by the method described in JP-A-8-5663, the DNA of the portion encoding the promoter and signal sequence of the NCE1 gene was amplified by PCR. . The PCR product containing the NCE1 promoter and signal sequence was designed so that each primer contained Hind III and Bam HI sites in advance so that it could be ligated to the 7.2 Kbp Hind III to Bam HI fragment of the plasmid pEGD01. A synthetic oligonucleotide having the following sequence was prepared as a primer.
PNCE1-N:5’-GTCATGAAGCTTCATTAAGGTACGTATGCAAC-3' (32mer)
PNCE1-C:5’-GGTGATGGATCCGGCCTGCTGGGCAGCGACGC-3' (32mer)
PNCE1-N: 5'-GTCATGAAGCTTCATTAAGGTACGTATGCAAC-3 '(32mer)
PNCE1-C: 5'-GGTGATGGATCCGGCCTGCTGGGCAGCGACGC-3 '(32mer)
ＰＣＲ反応は、実施例３と同様に行った。フミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇ対し、プライマー各１μＭ、４００μＭ dNTP 、Pfu DNA ポリメラーゼ２．５Ｕを加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃４分間の反応条件を２３回繰り返すことにより１．５ＫｂのＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ産物をHind IIIおよびBamH Iによって消化し、１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これを前述ｐＥＧＤ０１の７．２ＫｂｐのHind III〜BamH I断片に連結した。このプラスミドＤＮＡをｐＩＤ０１とした。 The PCR reaction was performed in the same manner as in Example 3. To 1 μg of Humicola insolens genomic DNA, 1 μM each of primers, 400 μM dNTP and 2.5 U of Pfu DNA polymerase were added, and the reaction conditions of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 4 minutes were repeated 23 times for 1.5 Kb. The DNA fragment was amplified. This PCR product was digested with HindIII and BamHI to recover a 1.5 Kbp DNA fragment. This was ligated to the 7.2 Kbp HindIII to BamHI fragment of pEGD01 described above. This plasmid DNA was designated as pID01.
（２）プラスミドｐＩＥＤ０２の作製
プラスミドｐＩＤ０１をBamH Iによって消化し、７０℃の熱処理で制限酵素を失活させ、さらに脱リン酸化処理した後、８．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、プラスミドｐＥＧＤ０１をBamH Iによって消化した後、ＮＣＥ４遺伝子を含む０．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。２つの断片を連結し、プラスミドｐＩＥＤ０２を得た。
(2) Preparation of plasmid pIED02 Plasmid pID01 was digested with BamHI, the restriction enzyme was inactivated by heat treatment at 70 ° C., and further dephosphorylation treatment was performed, and then a 8.6 Kbp DNA fragment was recovered. Next, after the plasmid pEGD01 was digested with BamHI, a 0.8 Kbp DNA fragment containing the NCE4 gene was recovered. The two fragments were ligated to obtain plasmid pIED02.
実施例Ｂ６：プラスミドｐＩＥＤ０２の発現
（１）プラスミドｐＩＥＤ０２によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
プラスミドｐＩＥＤ０２によるフミコーラ・インソレンスのＭＮ２００−１形質転換は、実施例Ｂ２の方法に従って行った。まず、ｐＩＥＤ０２の高濃度精製標品を調製し、１μｇ／μｌのｐＩＥＤ０２プラスミドＤＮＡを得た。このｐＩＥＤ０２溶液を１０μｌ使用して、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を形質転換し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株を５０株選抜した。これらを（Ｎ）培地で３７℃で５日間培養した。得られた培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、ｐＩＥＤ０２による形質転換株のうち５クローンにおいて、ＮＣＥ４と推定されるタンパク質バンドが、親株より５〜１０倍増加していた。
Example B6: Expression of plasmid pIED02 (1) Transformation of Humicola insolens with plasmid pIED02 MN200-1 transformation of Humicola insolens with plasmid pIED02 was performed according to the method of Example B2. First, a highly concentrated purified product of pIED02 was prepared, and 1 μg / μl of pIED02 plasmid DNA was obtained. Using 10 μl of this pIED02 solution, Humicola insolens MN200-1 was transformed, and 50 transformants showing hygromycin resistance were selected. These were cultured in the (N) medium at 37 ° C. for 5 days. When the obtained culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE, the protein band presumed to be NCE4 was increased by 5 to 10 times from the parent strain in 5 clones among the transformants using pIED02.
（２）組み換えＮＣＥ４のＮ末端アミノ酸残基の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、大量発現したタンパク質バンドがＮＣＥ４遺伝子由来であることを確認するために、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。まず、実施例Ｂ２と同様の方法によって、親株およびＮＣＥ４高発現株から得られた培養上澄についてＦＰＬＣシステムを用いたカラムクロマトグラフィーを行い、ＮＣＥ４のピークを分取し、凍結乾燥した。これを少量の水に溶解した。実施例Ｂ２の方法に従って修飾Ｎ末端残基を除去した後、前述のプロテインシーケンサーによって、Ｎ末端側アミノ酸配列を１５残基決定した。得られた配列は以下に示される通りであった。
(2) Identification of N-terminal Amino Acid Residues of Recombinant NCE4 From the results of SDS-PAGE, the N-terminal amino acid sequence of this protein was determined in order to confirm that the protein band expressed in large amounts was derived from the NCE4 gene. First, by the same method as in Example B2, the culture supernatant obtained from the parent strain and the NCE4 high expression strain was subjected to column chromatography using an FPLC system, and the NCE4 peak was collected and freeze-dried. This was dissolved in a small amount of water. After removing the modified N-terminal residue according to the method of Example B2, 15 residues of the N-terminal amino acid sequence were determined by the aforementioned protein sequencer. The resulting sequence was as shown below.
N末端アミノ酸配列:Gln-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)
(15残基)
N-terminal amino acid sequence: Gln-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp- (Cys)
(15 residues)
このＮ末端側アミノ酸配列は、プラスミドｐＩＥＤ０２の塩基配列から推定されるセルラーゼＮＣＥ１、ＮＣＥ４融合タンパク質のアミノ酸配列と一致した。 This N-terminal amino acid sequence coincided with the amino acid sequence of the cellulase NCE1 and NCE4 fusion protein deduced from the nucleotide sequence of plasmid pIED02.
（３）ｐＥＧＤ０２による形質転換株のＦＰＬＣよる評価
前述の様にＳＤＳ−ＰＡＧＥでＮＣＥ４の大量発現が確認された５クローンの培養上澄をさらに定量するために、ＦＰＬＣシステムでカラムクロマトグラフィーを行い、ＮＣＥ４のピークを分取した。これを凍結乾燥し、重量を測定し、高発現株と親株の生産性を比較した。その結果は、次の表に示されるとおりであった。
(3) Evaluation by FPLC of the transformed strain using pEGD02 In order to further quantify the culture supernatant of the five clones for which NCE4 was confirmed to be overexpressed by SDS-PAGE as described above, column chromatography was performed using an FPLC system. The peak of NCE4 was collected. This was freeze-dried, weighed, and the productivity of the high expression strain and that of the parent strain were compared. The results were as shown in the following table.
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|---|---|---|---|---|
| EP2861739A4 (en) * | 2012-06-08 | 2016-08-03 | Univ Concordia | NOVEL SCYTALIDIUM THERMOPHILUM CELL WALL DECONSTRUCTING ENZYMES, MYRIOCOCCUM THERMOPHILUM AND AUREOBASIDIUM PULLULANS, AND USES THEREOF |
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2004
- 2004-07-08 JP JP2004202083A patent/JP2004337173A/en active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2861739A4 (en) * | 2012-06-08 | 2016-08-03 | Univ Concordia | NOVEL SCYTALIDIUM THERMOPHILUM CELL WALL DECONSTRUCTING ENZYMES, MYRIOCOCCUM THERMOPHILUM AND AUREOBASIDIUM PULLULANS, AND USES THEREOF |
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