JP2004508838A - 組合せ蛍光エネルギー移動タグ及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、複数の蛍光分子を含む組合せ蛍光エネルギー移動タグを提供する。該組合せ蛍光エネルギー移動タグは、一以上のエネルギー移動ドナーおよび一以上のエネルギー移動アクセプターを有し、その蛍光分子が固有の蛍光発光信号を生成するために骨格に沿って隔てられる分子骨格を介して結合される。本発明はさらに、複合生物学的分析を含む多成分分析における前記タグの使用を提供する。

Description

【０００１】
本出願は、２００１年７月３１日に出願の仮出願番号６０／３０９，１５６の優先権を主張し、また２０００年９月１１日に出願の米国出願番号０９／６５８，０７７の一部継続出願であり、その両者の内容を本明細書の一部として援用する。
【０００２】
本出願を通して、種々の刊行物を著者名および発行年により括弧中に引用する。これらの参照文献の完全な書誌的引用は、図面の簡単な説明の前に列記する。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術分野の状態をより完全に記述するために本明細書に援用する。
【０００３】
【従来技術】
多くの生物学的な標的を研究する必要性は、それと同時に複合型蛍光タグの開発を促した。しかしながら、スペクトル領域が限られるため、そしてそれ故に利用可能で適切な検出器が限られるため、識別可能な発光スペクトルを有する利用可能な蛍光染料の数は、約１０種に限られている。この制限を克服するために、インサイチューハイブリダイゼーション（Ｍ−ＦＩＳＨ）における多色蛍光のための組合せ蛍光標識アプローチが開発され、現在、細胞遺伝学の分野で広く使われている（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ他，１９９６ 、Ｓｃｈｒｏｃｋ他，１９９６）。このアプローチは、それぞれ固有の発光を有する蛍光染料を２〜７種混合し、その蛍光発光パターンを使って異なる標的を識別するものである。異なる染料を数学的に組み合わせることによって、固有の蛍光発光パターンが得られる。この開発により、染色体分析を進展させることが可能になった。しかしながら、この方法は、「固有の」プローブ標識を開発するために、個々の染料の物理的な混合を定量的に行う必要がある。この要件は、染料の潜在的な相互作用と共に、蛍光発光パターンを複雑にする。従って、その技術の主要な応用はハイブリダイゼーションを含んだ方法に限定される。また、その画像化のためには複数のレーザーおよび検出器が必要とされる。広範囲の生体分子を共有結合的に標識化するために使用できる試薬キットを、このアプローチを用いて構成するのは困難である。このように、バイオメディカル分野または他の分野における多成分分析のために使用可能な、多数の蛍光タグを含むセットが緊急に必要とされている。以前には、蛍光エネルギー移動（ＥＴ）の原理は、ヒトゲノムプロジェクト（Ｊｕ他，１９９５，１９９６）において広く使われているデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定に使用される四つのＥＴタグを首尾よく現像するように、蛍光発光を増強するために用いられた。エネルギー移動に関係するフルオロフォアを含んだタグは、米国特許６，０２８，１９０に開示されている。
【０００４】
【発明の概要】
本発明は、それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する複数のフルオロフォアを含む物質の組成物であって、そのような別々の所定の位置は、一つのフルオロフォアともう一つのフルオロフォアの間での蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、一つのこのようなフルオロフォアおよびもう一つのこのようなフルオロフォアは、その一方のフルオロフォアの最大発光波長が他方のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物を提供する。
【０００５】
本発明はさらに、前記組成物であって、それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する二つのフルオロフォアを含み、前記別々の位置は、前記フルオロフォアの間で蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、前記フルオロフォアの一方の最大発光波長は、他方のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物を提供する。
【０００６】
本発明はさらに、前記組成物であって、それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する三つのフルオロフォアを含み、前記別々の所定の位置は、前記フルオロフォアの間で蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、第１のフルオロフォアの最大発光波長は第２のフルオロフォアの最小励起波長より大きく、第２のフルオロフォアの最大発光波長は第３のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、前記組成物であって、それぞれのフルオロフォアは前記分子骨格と共有結合する組成物を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記蛍光エネルギー移動の効率は２０％より小さい組成物を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記分子骨格は強固である組成物を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記分子骨格は重合体である組成物を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記分子骨格は核酸を含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記分子骨格はペプチドを含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記分子骨格はポリリン酸塩を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、前記組成物であって、少なくとも一つのフルオロフォアは蛍光染料である組成物を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記蛍光染料は６−カルボキシフルオレセインである組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記蛍光染料はＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミンである組成物を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、前記組成物であって、前記蛍光染料はシアニン−５単官能性染料である組成物を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、前記組成物であって、少なくとも一つのフルオロフォアはルミネッセンス分子である組成物を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、前記組成物であって、少なくとも一つのフルオロフォアは量子ドットである組成物を提供する。
【００２０】
本発明はまた、下記の構造を有する物質の組成物を提供する。
【００２１】
【化６】

ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、それぞれのＴはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す。
【００２２】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは４である組成物を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは６である組成物を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは９である組成物を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは１３である組成物を提供する。
【００２６】
本発明はまた、下記の構造を有する物質の組成物を提供する。
【００２７】
【化７】

ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、Ｃｙ５はシアニン−５単官能性染料誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す。
【００２８】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは４である組成物を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは５である組成物を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは７である組成物を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは１０である組成物を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは１３である組成物を提供する。
【００３３】
本発明はまた、下記の構造を有する物質の組成物を提供する。
【００３４】
【化８】

ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、ｎは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、Ｃｙ５はシアニン−５単官能性染料誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す。
【００３５】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは３であり、ｎは７である組成物を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは４であり、ｎは６である組成物を提供する。
【００３７】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは５であり、ｎは５である組成物を提供する。
【００３８】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは６であり、ｎは６である組成物を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは７であり、ｎは７である組成物を提供する。
【００４０】
本発明はまた、下記の構造を有する物質の組成物を提供する。
【００４１】
【化９】

ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す。
【００４２】
本発明はさらに、前記組成物であって、ｍは４である組成物を提供する。
【００４３】
本発明はまた、前記組成物のいずれかで標識化された核酸を提供する。
【００４４】
本発明はさらに、前記組成物の何れかであって、前記核酸はＤＮＡである組成物を提供する。
【００４５】
本発明はさらに、前記組成物の何れかであって、前記核酸はＲＮＡである組成物を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、前記組成物の何れかであって、前記核酸はＤＮＡ／ＲＮＡである組成物を提供する。
【００４７】
本発明はまた、予め選択したヌクレオチド残基が、核酸内の所定の位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記核酸を、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡライゲーションが可能な条件下で下記の成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）と接触させることと；
（ｉ）ＤＮＡリガーゼ、
（ｉｉ）請求項１の組成物を付加され、且つ前記所定の位置の一方の側の直近に隣接するヌクレオチドとハイブリダイズする、第１のオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉｉ）前記所定の位置の他方の側の直近に隣接するヌクレオチドとハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチド、
ここで、前記所定の位置の３´末端に位置するヌクレオチドとハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドの−ＯＨ末端残基は、前記予め選択されたヌクレオチド残基に相補的である；
（ｂ）前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むライゲーション産物の存在を検出し、そのようなライゲーション産物の存在によって、前記所定の位置に前記予め選択されたヌクレオチド残基が存在することが示されることとを含む方法を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、核酸内の種々の所定の位置において、予め選択されたヌクレオチド残基がそのような位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、前記予め選択されたヌクレオチド残基は、別々の所定の位置において異なることができ、それぞれ予め選択されたヌクレオチドがそれぞれの所定の位置に存在しているかどうかを、前記方法に従って決定することを含む方法を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、前記方法であって、複数の任意のヌクレオチド残基の存在を同時に決定する方法を提供する。
【００５０】
本発明はさらに、前記方法であって、前記ＤＮＡリガーゼはＴａｑ　ＤＮＡリガーゼである方法を提供する。
【００５１】
本発明はさらに、前記方法であって、前記第２のヌクレオチドは単離を可能にする部分を付加されており、また前記方法はさらに、前記工程（ａ）から得られる前記部分を含有する分子を単離することと、連結された第１及び第２のオリゴヌクレオチドがその中に存在することを決定することとを含む方法を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、前記方法であって、前記第１のオリゴヌクレオチドに付加した前記組成物は所定の発光スペクトルを有し、この発光スペクトルを観察することによって、前記工程（ｂ）において連結された第１及び第２のオリゴヌクレオチドの存在を決定する方法を提供する。
【００５３】
本発明はまた、予め選択したヌクレオチド残基が、核酸内の所定の位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記核酸を、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメリゼーションが可能な条件下で下記の成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）と接触させることと、
（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｉ）（１）請求項１の組成物を付加され、（２）３´−ＯＨ末端を有し、且つ前記核酸分子の所定の位置に隣接する３´領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及び、
（ｉｉｉ）単離を可能にする部分で標識化され、且つ任意のヌクレオチド残基と相補的であるジデオキシヌクレオチド、
但し、ＤＮＡポリメラーゼおよび予め選択されたヌクレオチド残基の存在下で、前記オリゴヌクレオチドと前記核酸とがハイブリダイゼーションするときに、前記オリゴヌクレオチドおよび前記ジデオキシヌクレオチドは並列し、ＤＮＡポリメラーゼがそれらを共有的に連結することを可能にする；
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドおよび前記ジデオキシヌクレオチドの両方を含むポリメリゼーション産物の存在を検出し、そのようなポリメリゼーション産物の存在により、予め選択されたヌクレオチド残基が所定の位置に存在することが示されることとを含む方法を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、核酸内の種々の所定の位置において、予め選択されたヌクレオチド残基がそのような位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、前記予め選択されたヌクレオチド残基は、別々の所定の位置において異なることができ、該方法は、それぞれ予め選択されたヌクレオチドがそれぞれの所定の位置に存在しているかどうかを、前記方法に従って決定することを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明はさらに、前記方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼはサーモシーケナーゼ（ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）である方法を提供する。
【００５６】
本発明はさらに、前記方法であって、前記ジデオキシヌクレオチドは、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、およびジデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される方法を提供する。
【００５７】
本発明はさらに、前記方法であって、前記オリゴヌクレオチドに付加された組成物は、所定の発光スペクトルを有し、この発光スペクトルを観察することによって、前記（ｂ）におけるポリメリゼーション産物の存在を決定する方法を提供する。
【００５８】
本発明はさらに、前記方法であって、前記所定の発光スペクトルの観察は、波長が２００〜１０００ｎｍの放射線を用いて行われる方法を提供する。
【００５９】
本発明はさらに、前記方法であって、前記放射線の波長は４８８ｎｍである方法を提供する。
【００６０】
本発明はさらに、前記方法であって、前記所定の発光スペクトルの観察は、帯域幅が１〜５０ｎｍの放射線を用いて行われる方法を提供する。
【００６１】
本発明はさらに、前記方法であって、前記放射線の帯域幅は１ｎｍである方法を提供する。
【００６２】
本発明はさらに、前記方法であって、前記単離を可能にする部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、フェニルボロン酸、サリチルヒドロキサム酸、抗体、または抗原を含む方法を提供する。
【００６３】
本発明はさらに、前記方法であって、前記単離を可能にする部分は、リンカー分子を介して前記オリゴヌクレオチドに付加している方法を提供する。
【００６４】
本発明はさらに、前記方法であって、前記単離を可能にする部分は、リンカー分子を介して前記ジデオキシヌクレオチドに付加している方法を提供する。
【００６５】
本発明はさらに、前記方法であって、前記リンカー分子は化学的に切断可能である方法を提供する。
【００６６】
本発明はさらに、前記方法であって、前記リンカー分子は、光学的に切断可能である方法を提供する。
【００６７】
本発明はさらに、前記方法であって、前記リンカー分子は、
【化１０】

で示される構造を有する方法を提供する。
【００６８】
【発明の詳細な記述】
＜定義＞
本発明を理解する一助として次の定義を提供する。
【００６９】
ＣＡＥ　　　　　−　キャピラリーアレイ電気泳動法
ＣＦＥＴ　　　　−　組合せ蛍光エネルギー移動
Ｃｙ５　　　　　−　シアニン５単官能性染料
ｄｄＮＴＰ　　　−　ジデオキシヌクレオチド三リン酸
ＦＡＭ　　　　　−　６−カルボキシフルオレセイン
ｎｍ　　　　　　−　ナノメーター
ＲＢ１　　　　　−　網膜芽細胞腫遺伝子
ＳＮＰ　　　　　−　一塩基多型
ＴＡＭ　　　　　−　Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン
ここで使用するとき、他に断らない限り、次の用語はそれぞれ下記のように定義する。
【００７０】
「化学的に切断可能」は、任意の化学的手法によって切断可能なことを意味する。化学的手法は例えばｐＨ及び温度を含むが、これに限定されない。
【００７１】
「ＤＮＡ／ＲＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの両方を含む核酸分子を意味する。
【００７２】
「発光スペクトル」は、組成物への励起放射の結果として、組成物から放射されるエネルギーの振幅および周波数を意味する。
【００７３】
「フレキシブル」は、分子骨格について述べた場合、骨格に共有的に結合した任意のフルオロフォア対の中心間の距離が５０％以上変化することを意味する。
【００７４】
「蛍光エネルギー移動」は、双極子−双極子相互作用を介して二つのフルオロフォア間に起こるエネルギーの移動を意味する。
【００７５】
「蛍光染料」は、より短い波長のエネルギーによって励起されたとき、波長２００ｎｍ〜１０００ｎｍの蛍光エネルギーを放射することができる有機染料分子を意味する。このとき放射されるエネルギーは、一重項から一重項への移動の結果起こる。蛍光染料の例は、６−カルボキシフルオレセイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びシアニン−５単官能性染料である。
【００７６】
「フルオロフォア」は、蛍光染料、量子ドット、またはルミネッセント分子のような、対応する発光波長より短い波長のエネルギーによって励起されたときに、波長４００ｎｍ〜１０００ｎｍのエネルギーを放射することができる分子を意味する。フルオロフォアの例は、６−カルボキシフルオレセイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、シアニン−５単官能性染料、硫化亜鉛キャップのセレン化カドミウム量子ドット、およびランタニドキレートを含む。
【００７７】
「ハイブリダイズ」は、一つの一本鎖核酸分子ともう一つの一本鎖核酸分子との、配列の相補性に基づくアニ−リングを意味する。核酸同士のハイブリダイゼーションの特性は、その環境の温度およびイオン強度、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。これらの変数がハイブリダイゼーションに及ぼす影響は、当分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９参照）。
【００７８】
「単離を可能にする部分」は、お互いに結合するビオチンとストレプトアビジン、お互いに結合する抗体と抗原、お互いに結合するフェニルボロン酸とサリチルヒドロキサム酸を含むが、これに限定されない。
【００７９】
「ライゲーション可能な条件」は、一つのオリゴヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を介してもう一つのオリゴヌクレオチドに酵素的に結合することができる、温度、イオン強度、イオン組成、分子組成、配向性及び粘性の条件を含むが、これに限定されない。
【００８０】
「ライゲーション」は、核酸が、もう一つの核酸または一塩基のいずれかと酵素的に共有結合することを意味する。
【００８１】
「リンカー分子」は、他の二つの分子を共有的に連結するために用いられる化学物質群を意味する。リンカー分子の例は、
【化１１】

で与えられる構造である。
【００８２】
「ルミネッセント分子」は、対応する発光波長より短い波長のエネルギーによって励起されたときに、波長２００ｎｍ〜１０００ｎｍのエネルギーを放射することができる分子を意味する。ここで発光されるエネルギーは、一重項から一重項への移動の結果起こるものではない。ルミネッセント分子の例は、ユーロピウムポリカルボキシレートキレートおよびテルビウムキレートを含む。
【００８３】
「分子骨格」は、二以上のフルオロフォアが別々の位置で共有結合できる、および／または共有結合している、分子構造を意味する。望ましい分子骨格は、フルオロフォアが結合できるモノマーユニットを含むポリマーである。そのようなポリマー骨格を形成するモノマーユニットは、必ずしも必要ではないが、同一のものであることができる。そのようなモノマーユニットの例は、１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩およびチミジンを含む。
【００８４】
「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのハイブリッドを含む何れかの核酸分子を意味するが、これに限定されない。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，ＴおよびＵに加えてそれらの誘導体であることができる。これらの塩基の誘導体は当分野において周知であり、ＰＣＲシステムの試薬および消耗品がその良い例である。（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔａｌｉｇｕｅ １９９６−１９９７， Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）
「オリゴヌクレオチド」は、二以上のヌクレオチドを含む核酸を意味する。
【００８５】
「光学的切断可能」は、波長２００〜１０００ｎｍの電磁気エネルギーによって切断可能であることを意味する。
【００８６】
「ポリマー」は、二より多いモノマーユニットから構成される分子を示す。
【００８７】
「量子ドット」は、半導体または金属を含む、ナノメーターサイズの物質の組成物を意味する。そのような組成物はルミネッセンス能を有する。量子ドットの例は、硫化亜鉛キャップのカドミウムセレニド量子ドットを含む。
【００８８】
「リジッド」は、分子骨格について述べる場合、骨格に共有結合した何れかのフルオロフォア対の中心間の距離が５０％以上変化しないことを意味する。
【００８９】
【発明の実施例】
本発明は、それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する複数のフルオロフォアを含む物質の組成物であって、そのような別々の所定の位置は、一つのフルオロフォアともう一つのフルオロフォアの間での蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、一つのこのようなフルオロフォアおよびもう一つのこのようなフルオロフォアは、その一方のフルオロフォアの最大発光波長が他方のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物を提供する。
【００９０】
本発明はさらに、前記組成物であって、それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する二つのフルオロフォアを含み、前記別々の位置は、前記フルオロフォアの間で蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、前記フルオロフォアの一方の最大発光波長は、他方のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物を提供する。
【００９１】
本発明はさらに、前記組成物であって、それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する三つのフルオロフォアを含み、前記別々の所定の位置は、前記フルオロフォアの間で蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、第１のフルオロフォアの最大発光波長は第２のフルオロフォアの最小励起波長より大きく、第２のフルオロフォアの最大発光波長は第３のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物を提供する。
【００９２】
一つの実施例において、それぞれのフルオロフォアは前記分子骨格と共有結合する。
【００９３】
一つの実施例において、前記蛍光エネルギー移動の効率は２０％より小さい。
【００９４】
一つの実施例において、前記分子骨格は強固である。
【００９５】
一つの実施例において、前記分子骨格は重合体である。
【００９６】
一つの実施例において、前記分子骨格は核酸を含む。
【００９７】
一つの実施例において、前記分子骨格はペプチドを含む。
【００９８】
一つの実施例において、前記分子骨格はポリリン酸塩を含む。
【００９９】
一つの実施例において、少なくとも一つのフルオロフォアは蛍光染料である。
【０１００】
一つの実施例において、前記蛍光染料は６−カルボキシフルオレセインである。
【０１０１】
一つの実施例において、前記蛍光染料はＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミンである。
【０１０２】
一つの実施例において、前記蛍光染料はシアニン−５単官能性染料である。
【０１０３】
一つの実施例において、少なくとも一つのフルオロフォアはルミネッセンス分子である。
【０１０４】
一つの実施例において、少なくとも一つのフルオロフォアは量子ドットである。
【０１０５】
本発明はまた、下記の構造を有する物質の組成物を提供する。
【０１０６】
【化１２】

ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、それぞれのＴはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す。
【０１０７】
一つの実施例において、ｍは４である。一つの実施例において、ｍは６である。一つの実施例において、ｍは９である。一つの実施例において、ｍは１３である。
【０１０８】
本発明はまた、下記の構造を有する物質の組成物を提供する。
【０１０９】
【化１３】

ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、Ｃｙ５はシアニン−５単官能性染料誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す。
【０１１０】
一つの実施例において、ｍは４である。一つの実施例において、ｍは５である。一つの実施例において、ｍは７である。一つの実施例において、ｍは１０である。一つの実施例において、ｍは１３である。
【０１１１】
本発明はまた、下記の構造を有する物質の組成物を提供する。
【０１１２】
【化１４】

ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、ｎは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、Ｃｙ５はシアニン−５単官能性染料誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す。
【０１１３】
一つの実施例において、ｍは３であり、ｎは７である。一つの実施例において、ｍは４であり、ｎは６である。一つの実施例において、ｍは５であり、ｎは５である。一つの実施例において、ｍは６であり、ｎは６である。一つの実施例において、ｍは７であり、ｎは７である。
【０１１４】
本発明はまた、下記の構造を有する物質の組成物を提供する。
【０１１５】
【化１５】

ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す。
【０１１６】
一つの実施例において、ｍは４である。
【０１１７】
本発明はまた、前記組成物のいずれかで標識化された核酸を提供する。
【０１１８】
一つの実施例において、前記核酸はＤＮＡである。
【０１１９】
一つの実施例において、前記核酸はＲＮＡである。
【０１２０】
一つの実施例において、前記核酸はＤＮＡ／ＲＮＡである。
【０１２１】
本発明はまた、予め選択したヌクレオチド残基が、核酸内の所定の位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記核酸を、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡライゲーションが可能な条件下で下記の成分と接触させることと；
（ｉ）ＤＮＡリガーゼ、
（ｉｉ）請求項１の組成物を付加され、且つ前記所定の位置の一方の側の直近に隣接するヌクレオチドとハイブリダイズする、第１のオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉｉ）前記所定の位置の他方の側の直近に隣接するヌクレオチドとハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチド、
ここで、前記所定の位置の３´末端に位置するヌクレオチドとハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドの−ＯＨ末端残基は、前記予め選択されたヌクレオチド残基に相補的である；
（ｂ）前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むライゲーション産物の存在を検出し、そのようなライゲーション産物の存在によって、前記所定の位置に前記予め選択されたヌクレオチド残基が存在することが示されることとを含む方法を提供する。
【０１２２】
本発明はさらに、核酸内の種々の所定の位置において、予め選択されたヌクレオチド残基がそのような位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、前記予め選択されたヌクレオチド残基は、別々の所定の位置において異なることができ、それぞれ予め選択されたヌクレオチドがそれぞれの所定の位置に存在しているかどうかを、前記方法に従って決定することを含む方法を提供する。
【０１２３】
一つの実施例において、複数の任意のヌクレオチド残基の存在は同時に決定される。
【０１２４】
一つの実施例において、前記ＤＮＡリガーゼはＴａｑ　ＤＮＡリガーゼである。
【０１２５】
本発明はさらに、前記方法であって、前記第２のヌクレオチドは単離を可能にする部分を付加されており、また前記方法はさらに、前記工程（ａ）から得られる前記部分を含有する分子を単離することと、連結された第１及び第２のオリゴヌクレオチドがその中に存在することを決定することとを含む方法を提供する。
【０１２６】
本発明はさらに、前記方法であって、前記第１のオリゴヌクレオチドに付加した前記組成物は所定の発光スペクトルを有し、この発光スペクトルを観察することによって、前記工程（ｂ）において連結された第１及び第２のオリゴヌクレオチドの存在を決定する方法を提供する。
【０１２７】
本発明はまた、予め選択したヌクレオチド残基が、核酸内の所定の位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記核酸を、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメリゼーションが可能な条件下で下記の成分と接触させることと、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）（１）請求項１の組成物を付加され、（２）３´−ＯＨ末端を有し、且つ前記核酸分子の所定の位置に隣接する３´領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及び、（ｉｉｉ）単離を可能にする部分で標識化され、且つ任意のヌクレオチド残基と相補的であるジデオキシヌクレオチド、但し、ＤＮＡポリメラーゼおよび予め選択されたヌクレオチド残基の存在下で、前記オリゴヌクレオチドと前記核酸とがハイブリダイゼーションするときに、前記オリゴヌクレオチドおよび前記ジデオキシヌクレオチドは並列し、ＤＮＡポリメラーゼがそれらを共有的に連結することを可能にする；
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドおよび前記ジデオキシヌクレオチドの両方を含むポリメリゼーション産物の存在を検出し、そのようなポリメリゼーション産物の存在により、予め選択されたヌクレオチド残基が所定の位置に存在することが示されることとを含む方法を提供する。
【０１２８】
本発明はさらに、核酸内の種々の所定の位置において、予め選択されたヌクレオチド残基がそのような位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、前記予め選択されたヌクレオチド残基は、別々の所定の位置において異なることができ、該方法は、それぞれ予め選択されたヌクレオチドがそれぞれの所定の位置に存在しているかどうかを、前記方法に従って決定することを含む方法を提供する。
【０１２９】
一つの実施例において、前記ＤＮＡポリメラーゼはサーモシーケナーゼである。
【０１３０】
本発明はさらに、前記方法であって、前記ジデオキシヌクレオチドは、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、およびジデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される方法を提供する。
【０１３１】
本発明はさらに、前記方法であって、前記オリゴヌクレオチドに付加された組成物は、所定の発光スペクトルを有し、この発光スペクトルを観察することによって、前記（ｂ）におけるポリメリゼーション産物の存在を決定する方法を提供する。
【０１３２】
本発明はさらに、前記方法であって、前記所定の発光スペクトルの観察は、波長が２００〜１０００ｎｍの放射線を用いて行われる方法を提供する。
【０１３３】
一つの実施例において、前記放射線の波長は４８８ｎｍである。
【０１３４】
本発明はさらに、前記方法であって、前記所定の発光スペクトルの観察は、帯域幅が１〜５０ｎｍの放射線を用いて行われる方法を提供する。
【０１３５】
一つの実施例において、前記放射線の帯域幅は１ｎｍである。
【０１３６】
本発明はさらに、前記方法であって、前記単離を可能にする部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、フェニルボロン酸、サリチルヒドロキサム酸、抗体、または抗原を含む方法を提供する。
【０１３７】
本発明はさらに、前記方法であって、前記単離を可能にする部分は、リンカー分子を介して前記オリゴヌクレオチドに付加している方法を提供する。
【０１３８】
本発明はさらに、前記方法であって、前記単離を可能にする部分は、リンカー分子を介して前記ジデオキシヌクレオチドに付加している方法を提供する。
【０１３９】
本発明はさらに、前記方法であって、前記リンカー分子は化学的に切断可能である方法を提供する。
【０１４０】
本発明はさらに、前記方法であって、前記リンカー分子は、光学的に切断可能である方法を提供する。
【０１４１】
本発明はさらに、前記方法であって、前記リンカー分子は、
【化１６】

で示される構造を有する方法を提供する。
【０１４２】
本発明は、次に記載する実験の詳細からより深く理解されるであろう。しかしながら、ここで述べられた特定の方法と結果は、請求項により完全に記述された本発明の単なる実例であることが当業者には容易に理解されるであろう。
【０１４３】
【実験の詳細】
Ｉ．組合せ蛍光エネルギー移動タグの設計
＜背景＞
二つの発色団の間の光学的な相互作用は、それらが８０オングストロームまで離れたときでも持続する。エネルギーの吸収量が高い発色団はドナーと定義され、エネルギーの吸収量が低い発色団はアクセプターと定義される。蛍光エネルギー移動は、発色団の間の双極子−双極子共役によって媒介され、励起されたドナー分子からアクセプターに励起エネルギーが共鳴移動する（Ｆｏｒｓｔｅｒ，１９６５）。Ｆｏｒｓｔｅｒは、エネルギー移動の効率は、二つの発色団の間の距離の６乗に反比例することを証明した。蛍光共鳴エネルギー移動は、生物学的構造の分光学的な物差しとして広く使用されており（Ｓｔｒｙｅｒ，１９７８）、エネルギー移動をカップリングした直列フィコビリンタンパク質接合体は、固有の蛍光標識として広く応用されている（ＧｌａｚｅｒおよびＳｔｒｙｅｒ，１９８３）。エネルギー移動を利用し、且つ二重鎖ＤＮＡに高い親和性を有する一組のポリカチオンへテロ二量体フルオロフォアも開発され、複合蛍光標識処理において、モノマーフルオロフォアに勝る利点を提供している（Ｂｅｎｓｏｎ他，１９９３ ； Ｒｙｅ他，１９９３）。蛍光エネルギー移動原理を利用して、共通のドナーと四つの異なるアクセプターを使用した、四組のＥＴプライマーおよびジデオキシヌクレオチドが作製され、これらはＤＮＡ配列決定において、および、複合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくマッピングおよびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）方法において、単独の染料より著しく優れていた（Ｊｕ他， １９９５， １９９６）。
【０１４４】
本願は、多数の組合せ蛍光エネルギー移動（ＣＦＥＴ）タグを開発するために、エネルギー移動および組合せの概念を用いて蛍光タグの蛍光発光信号をどのように調節するかを開示している。図１ａにタグの模式的な構成を示す。表１にＣＦＥＴタグの構成の代表的な例およびそれらの予測される蛍光信号を示す。ＣＦＥＴタグを構成する例として、３つの個別の蛍光染料、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭまたはＦ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭまたはＴ）、およびシアニン染料（Ｃｙ５またはＣ）を選択する。ＦＡＭ、ＴＡＭ、およびＣｙ５の最大の蛍光発光はそれぞれ、５２５ｎｍ，５８０ｎｍ，および６７０ｎｍである。スペーサーとして使われている化学的部分は、生体分子および他の関心のある標的を都合よく標識することを目標として、種々のＣＦＥＴタグを構成するために選択され、モノマーを使用するのが便利である。他のスペーサー部分は、ヌクレオチド、ペプチド、および１´２´−ジデオキシリボースリン酸塩を含む。表１に示したように、タグ１はＦＡＭのみから成り、その特徴的な蛍光信号を示している（λｍａｘ＝５２５ｎｍ）。特有の蛍光信号を有するフルオロフォアならば、何れもＦＡＭの代わりに使用できる。ＦＡＭをドナーとし、ＴＡＭをアクセプターとして、そのＦＡＭおよびＴＡＭ発色団の間の距離Ｒを変化させることによって、ＣＦＥＴタグ２，３，４，および５を構成することができる。その原理は、ドナーとアクセプターの間の距離の変化は、エネルギー移動効率を変化させ、それ故、ドナー（ＦＡＭ）とアクセプター（ＴＡＭ）の蛍光発光強度の割合を変化させる、ということである。同様に、ＦＡＭをドナーとし、Ｃｙ５をアクセプターとして、ＣＦＥＴタグ６，７および８を作成することが出来る。３つの染料を用いて、即ち、ＦＡＭをドナーとし、ＴＡＭをＦＡＭのアクセプターおよびＣｙ５のドナーとし、Ｃｙ５を最終的なアクセプターとして、ＣＦＥＴタグ９および１０を、距離「Ｒ１」および「Ｒ２」を操作することによって構成することができる。全てのＣＦＥＴタグは一つのレーザー光源で励起することができ、それぞれのタグの発光信号を捕捉できる単純な検出器でもって分析できる。他の実施例において、４種以上の染料を使うことが出来る。あるいは、固有の蛍光信号を有するものならばただ一つの発色団を使うことも出来る。
【０１４５】
【表１】

ドナーおよびアクセプター蛍光分子は、ＣＦＥＴタグの蛍光信号を調節するためのスペーサーとして都合の良い化学的部分を使用して隔てられる。そのようなスペーサー部分の例は、ヌクレオチド、ジデオキシリボースリン酸塩、およびアミノ酸を含む。３以上の異なる染料を含んだＣＦＥＴタグを構成することは、個々の染料分子を、主鎖上の間隔をあけた特定の位置に導入するための合成方法を設計する必要があるため、より難解である。一例に、スペーサーとしてオリゴヌクレオチドを用いて、３つの染料を含んだＣＦＥＴタグを構成することができる。配列
【化１７】

（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を有するオリゴヌクレオチドを、ＦＡＭ、ＴＡＭ、およびＣｙ５を共有的に結合する骨格として選択した。ＦＡＭは６−ＦＡＭ−ｄＴホスホラミダイトを使って導入し、ＴＡＭはＴＡＭ−ｄＴ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ）を使って導入する。そして、Ｃ−５の位置にアミノリンカーを有する修飾されたＴ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）がオリゴヌクレオチドに組み込まれ、次いでこれはＣｙ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルに連結される。最終産物はサイズ排除クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動によって精製する。図１に、ＦＡＭ、ＴＡＭ、およびＣｙ５を含むＣＦＥＴタグ　Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃ（数字は、間隔をとるヌクレオチドの数を表す）を構成する代表的な反応を示す。ＦＡＭとＴＡＭ、およびＴＡＭとＣｙ５の間隔を変化させることによって、タグ９および１０に対応する蛍光信号を有する二つのＣＦＥＴタグ、Ｆ−４−Ｔ−６−ＣおよびＦ−７−Ｔ−３−Ｃを、図２に示すように構成した。Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃの紫外／可視吸収スペクトル（図２Ｂ）は、Ｆ−４−Ｔ−６−ＣおよびＦ−７−Ｔ−３−Ｃの蛍光発光スペクトル（図２Ｃおよび２Ｄ）と同様に、４８８ｎｍ（１ｘトリス−ボレート−エチレンジアミンテトラ酢酸（ＴＢＥ）溶液）で励起を示している。ＵＶ／可視スペクトルにおいて、ＦＡＭは４９５ｎｍで、ＴＡＭは５５５ｎｍで、そしてＣｙ５は６４９ｎｍで特徴的な吸収を示す（図２Ｂ）。Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃの蛍光発光スペクトルは、Ｃｙ５が最高で、次がＴＡＭ、そしてＦＡＭが最低の蛍光信号を示す。一方Ｆ−７−Ｔ−３−ＣはＦＡＭが最高で、次がＴＡＭ、そしてＣｙ５が最低の蛍光信号を示す。この二つの蛍光信号は明らかに異なっており、分光法によって容易に識別可能である。ここから、３つの異なる染料を含んだＣＦＥＴアプローチの可能性が明らかに実証される。
【０１４６】
ＣＦＥＴタグの広範なファミリーが合成可能なことは明白である。ＣＦＥＴタグを構成する合成アプローチの二つの例、即ち、（１）ＤＮＡ合成機で構築可能なオリゴヌクレオチドプライマーを、標識するために使用する染料を隔てるためのスペーサーとして１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩モノマーを使用するアプローチ、（２）他の何れの分子標的でも標識化するＣＦＥＴカセットを構築するために、強固なペプチドリンカーを使用するアプローチが示される。
【０１４７】
この第１の例を図３Ａに示す。所望のプライマー配列の５´末端において、１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩（Ｓ）によって形成されたポリマーリンカー（ＳＳＳ…ＳＳＳＳ）は、ＥＴが結合したフルオロフォアが結合できるユニバーサルスペーサーを形成し、これにより、ＥＴカセットを提供する。１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩は、５´−ジメトキシトリチル−１´，２´−ジデオキシリボース−３´−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−フォスフォルアミダイト（ｄＳｐａｃｅｒ　ＣＥ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ，Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ）を用いて導入することができる。ｄＳｐａｃｅｒ　ＣＥフォスフォルアミダイトは従来、ＤＮＡ配列解析プライマーを構成するために使用されてきた（Ｊｕ他、１９９６）。このＣＦＥＴタグの構成においては、ＦＡＭを共通のドナーとして用いる。二つの異なる蛍光染料から成るＣＦＥＴタグにおいて、ＴＡＭもＣｙ５もアクセプターとして使用することができ、ＣＦＥＴタグが３つの異なる蛍光染料から成る場合も、ＴＡＭはＣｙ５のドナーとして使用することができる。各ドナー／アクセプター対の間の間隔の長さは、表１に示したような予測される蛍光信号を達成するために、組織的に変化することができる。ＦＡＭおよびＴＡＭは、フォスフォルアミダイトＦＡＭ−ｄＴおよびＴＡＭ−ｄＴを用いて導入することができ、Ｃｙ５は上述したようにアミノリンカーを保有する修飾されたＴに導入することができる。そのようなスペーサーを使用することは、次のいくつかの面において有利である。（ｉ）スペーサーはＤＮＡテンプレート内の何れの配列ともハイブリダイズせず、それ故誤ったプライミングが避けられる。（ｉｉ）スペーサーのリンクは天然の核酸リン酸塩官能基を維持し、電気泳動の移動度に起こりうる異常を避けることができる。および（ｉｉｉ）スペーサー中のデオキシリボース環の芳香族塩基群を排除することにより、蛍光が消光する可能性を減少できる。
【０１４８】
第２の合成アプローチには、ＣＦＥＴタグを作成するための高度に複雑な選択的合成化学方法が必要である。例として、図３Ｂに、ポリプロリン（Ｐ）ペプチドをスペーサーとして使用したＣＦＥＴデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）の構成の一般的な模式図を示す。それぞれのドナー／アクセプター対の間隔は、表１に示したような予測される蛍光信号を達成するために、組織的に変化させることができる。図４に、Ｆａｍ，Ｔａｍ，およびＣｙ５から成るＣＦＥＴ−ｄＵＴＰの合成の模式図を示す。ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）化学を使ったペプチド合成方法は、所望の分子の骨格を構成するためのペプチド合成において使用される。Ｃ−末端としてのグリシン樹脂で開始し、ＦＡＭ（Ｆａｍ−プロリン）でタグをつけられた修飾プロリンをグリシンに結合し、それからプロリンモノマーを付加し、続いて、後でＴａｍを取り込むために保護された一級アミノリンカー（ＴＦＡ−ＮＨ−プロリン）を有するもう一つの修飾プロリンと反応させる。次に、プロリンスペーサーを再び付加し、続いて、後でＣｙ５を取り込むためのアジド−プロリンと反応させる。樹脂から切断しトリフルオロアセチル基を取り除いた後、図４の化合物１が得られる。化合物１は、ＴＡＭ−ＮＨＳエステルと反応して化合物２を形成し、そして化合物２はＣｙ５−フォスフィン（３）と反応して、３つの染料すべてを取り込んだ化合物４を生成する。Ｃｙ５−フォスフィン（３）は、Ｂｅｒｔｏｚｚｉによって開発された、修正シュタウディンガー反応（ＳａｘｏｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ， ２０００）によって合成することが出来る。化合物４をＮＨＳエステルへ転換し、化合物５を生成する。そして化合物５は、アミノアリル（ＡＡ）−ｄＵＴＰ（シグマ）と結合して最終産物ＣＦＥＴ−ｄＵＴＰを生成する。ＦａｍとＴａｍ、およびＴａｍとＣｙ５の間のプロリンスペーサーの数を変化させることによって、固有の蛍光信号を有するＣＦＥＴ−ｄＵＴＰのライブラリを開発することができる。中間体２，４，５および最終産物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動で精製することができる。図５に、ＡＡ−ｄＵＴＰ、Ｆａｍ−プロリン、および、ＴＡＭおよびＣｙ５のＮＨＳエステルの構造を示す。図６に、トリフルオロアセチック（ＴＦＡ）−ＮＨ−プロリン、Ｆａｍ−プロリン、アジド−プロリン、およびＣｙ５−フォスフィンの簡単な合成図式を示す。図７に、合成された８つのＣＦＥＴタグに固有の蛍光信号を示す。
【０１４９】
ＩＩ．組合せエネルギー移動タグのバイオメディカルへの応用
ＤＮＡの配列を正確に且つ迅速に決定する能力は、生物学および医学に大変革を起こしている。広範なヒトゲノムプロジェクトが統合することにより、高処理量遺伝子解析技術は指数関数的に発展している。生物学、化学、コンピューター科学、および工学を含む科学技術のこの急速な発展により、一つずつの遺伝子を研究することから、ゲノム全体を分析し比較できるアプローチに移行することが可能になる。
【０１５０】
高度に複雑な技術は、大規模なゲノムの解剖を可能にする。例えば、大規模伸長（１００万塩基に至る）のＤＮＡを保持および複製できるクローニングベクターの開発によって、ヒトの、フィジカルマップと呼ばれるものを含む、高度に研究された多くの生物体の殆どの染色体の全長に及ぶクローンライブラリーが作成された。個人個人のヒトゲノムで異なる配列マーカーを認識することは、遺伝子病を有する家族においてそれらを追跡することを可能にした。マーカーがその病気の表現型と同時分離する場合、そのマーカーはその病気の原因である遺伝子の近傍にあることが確実である。自動的に配列解析する方法は、ゲノムの全化学組成をかつてない速さで得ることを可能にした。そして、計算的なアプローチからこれらの配列の解釈がされ始め、染色体に含まれる遺伝子や他の要素の同定を可能にした。遺伝子の発現は、ノーザンブロット解析技術によって一度に少数の遺伝子を解析する段階から、ガラススライド上で、またはシリコンチップ上で、これらの遺伝子の広範なマイクロアレイを作成する段階に移行した（Ｓｃｈｅｎａ 他，１９９５、 Ｃｈｅｅ他， １９９６）。一塩基多型（ＳＮＰｓ）（ＣｈｅｎおよびＫｗｏｋ，１９９７）、ＤＮＡと蛋白質、および蛋白質と蛋白質の相互作用（Ｕｅｔｚ他、２０００）、および、代謝メンバー、信号伝達および他の経路を同定する方法も開発されている。これら全ての進展は、診断、予測、または治療の選択肢を確立する医学的なおよび臨床的な調査を大変革する可能性を有している。
【０１５１】
言及された多くのゲノム技術が、新規の分子タグ、特に蛍光染料分子を使用することで利益を得ることは注目に値する。ＤＮＡ配列解析は、この技術の影響を評価するための良い例として貢献する。ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）による化学的切断アプローチの開発、および、Ｓａｎｇｅｒ他（１９７７）によるジデオキシヌクレオチドターミネーターアプローチの開発によって、１９７０年代後半にＤＮＡ配列を得ることが可能になったが、自動化および蛍光標識方法を受け入れたのは殆ど後者であった。過去１５年における急速な進展において、一つの配列解析レーンに４つの染料を使う能力（ＤＮＡ中の４つの塩基のそれぞれについて一つ）（Ｓｍｉｔｈ他，１９８６）、熱安定性酵素を用いたサイクルシークエンシングを使用する能力（Ｔａｂｏｒ他，１９９５）、より高い信号を生成するエネルギー移動染料の開発（Ｊｕ他，１９９５、Ｌｅｅ他，１９９７）、およびより最近では、ポリアクリルアミドスラブゲル上の近接するレーンの代わりに分離キャピラリーチューブで長い配列を解読する能力が、配列解析をますます強固なものにしてきた。小型化および固相アプローチを含めた配列解析技術におけるさらなる改良は、エネルギー移動（ＥＴ）および他の新規の蛍光タグを利用して続けられるであろう（Ｊｕ他，１９９７）。研究者達は、マイクロアレイ上での遺伝子発現の研究のためにＥＴ染料を利用している（Ｈａｃｉａ他，１９９８）。これら全てのアプローチは、各反応に対してドナーおよびアクセプター染料が一対ずつに制限されていると考えられている。ここに記述したＣＦＥＴアプローチは、一つ、二つまたはそれ以上の染料をお互いに様々な分子距離で配列し、多くの新しい別々の信号を生成することで、これらのゲノムアプローチの多くが１０倍高い処理量を得る可能性を提供する。遺伝子変異および染色体の分析は、これらのＣＦＥＴタグをバイオメディカルに応用した二つの例である。ＣＦＥＴタグを、単独の蛍光タグと、および／またはＦＥＴが起こらない複合染料タグと組合せて使用することで、可能な固有の蛍光信号の数（それ故、例えば同時に検出可能なＳＮＰｓの数）は非常に増大する。
【０１５２】
遺伝子の変異は、多くのヒトの病気の発症に重要な役割を果たす。ミスセンス突然変異（一塩基の置換は通常、アミノ酸を変化させるか、または切断された蛋白質を導くストップコドンを導入する）、微小欠失および微小挿入（どちらもリーディングフレームを変化させ、通常は蛋白質の切断を導く）は、その病気の原因となる遺伝子の長さに従って多くの場所で起こりうることが、だんだん明らかに成ってきた。多くの研究者が、多くの癌およびその他の病気の原因となる突然変異および素因となる遺伝子多型を同定しようとしてきた。これらには、慢性的リンパ性白血病および他の血液癌（Ｋａｌａｃｈｉｋｏｖ他，１９９７；Ｑｕ他，１９９８）、長ＱＴ（ｌｏｎｇ ＱＴ）症候群（心電図で見ることができる心臓のイオン障害であり、突発性心臓死の重要な危険要因である）、乳癌（Ｆｉｓｃｈｅｒ他，１９９６）、稀なＩＣＦ（ｒａｒｅ ＩＣＦ）症候群（免疫欠損／動原体性の不安定性／顔面の変態）（Ｘｕ他，１９９９）、およびさらに最近は、喘息および糖尿病のような複合障害のようなものが含まれる。
【０１５３】
上述した小さい変異のタイプ、および、平均１０００ヌクレオチド毎に起こる一塩基多型を例外にすると、ヒトゲノム二倍体を構成する６０億のヌクレオチド対は、個人個人で殆ど同一である。それにも関わらず、大幅な欠損と増幅と再編が起こり、そのような染色体異常はしばしば、重大で命に関わる病気と関連している。最もよく知られた例は恐らく、ダウン症候群の人々の染色体２１の３番目のコピーであるが、他の多くの染色体の転座および微小欠損は、癌および他の病気症候群と関わりがある。もし識別可能な「カラーコード」プローブで染色体に沿ってその位置を標識できたら、そのような大規模な染色体地図の変化を容易に検出できるであろう。実際、染色体のペインティング（多色蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（Ｍ−ＦＩＳＨ））分野は、ちょうどそのような分析に使用されている（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ他，１９９６）。さらに容易に分離可能な、より大きな組のＣＦＥＴタグ信号は、この計画における大きな助けになるだろう。この確立された染色体ペインティング技術は、標識化に先立って異なる染料の適切な混合が必要であり、従って、殆ど全染色体を標識化するためにのみ使用される。
【０１５４】
ＩＩＩ．リガーゼ連鎖反応を用いた複合遺伝子変異検出のためのＣＦＥＴタグ
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、リガーゼおよびオリゴヌクレオチド対を用いた遺伝子変異分析のための方法である（Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇ， １９９５； ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ他，１９８８）。手短に言えば、その方法は、二つの隣接するオリゴヌクレオチドは、隣接する塩基がテンプレート鎖と相補的である場合にのみ結合できるという事実に基づいている。結合サイトの二つの塩基のうち一塩基に違いがあれば、ライゲーションは起こらない。オリゴヌクレオチドの対は、野生型または変異型の塩基を有するテンプレートＤＮＡのライゲーションサイトにまたがって設計されている。通常の方法では、オリゴヌクレオチドはその５´末端のリン酸塩基を放射標識される。変性、プライマーとのアニーリング、およびライゲーションの多段階を含むリガーゼ連鎖反応に続いて、ポリアクリルアミドゲルで生産物を媒体から分離できる。この手順は、ＣＦＥＴタグを使用した試験のために、図８に示す一本鎖ＤＮＡテンプレートを使って変更することができる。プライマー対は変異の可能性のある塩基を囲んで形成される。例えば、そのテンプレートは関連する位置にＴ（野生型、ｗｔ）またはＣ（変異型、ｍｕｔ）を含んでいる。ｗｔプライマーはｗｔテンプレートと全ての位置で相補的である。図８Ａの右側のプライマーはＣＦＥＴタグ１で標識されており、特定の蛍光信号を発する。変異を特定するプライマーは、野生型の類似物より二塩基分長く、変異型テンプレートの全ての位置に相補的である。このプライマーは、もう一つの固有の蛍光信号を表すＣＦＥＴタグ２で標識されている。共通の２０塩基対プライマーが、もう一方のライゲーションサイトに使用される。ライゲーションが起こらないのは、野生型用のオリゴヌクレオチドが変異型のテンプレート配列と共に使用されているか、または変異型用のオリゴヌクレオチドが野生型のテンプレート配列と共に使用されているためで、アクリルアミドゲル上で唯一の蛍光バンドが、タグを付けられたプライマーのサイズに出現する。反対に、ライゲーション結合点のミスマッチがない場合、二つの蛍光バンドが、一つはプライマーのサイズに、一つは接合したプライマーが形成するサイズに出現する。リガーゼ連鎖反応に続いて、左および右のプライマーは、それらが完全にテンプレートに相補的である場合にのみ連結される。従って、図８に示すように、ｗｔテンプレートからは４０塩基産物のみが、またｍｕｔテンプレートからは４２塩基産物のみが生成する。ＣＦＥＴタグに固有の蛍光発光信号によって、いくつかの変異位置を同時に、それぞれ異なるＣＦＥＴタグで標識された産物を示すことが可能である。連結された産物は一つのゲルレーンで分離し分析することができる。これを達成するため、潜在的に変異位置を含むオリゴヌクレオチドの複合セットを、それぞれ特定のＣＦＥＴタグとともに５´末端標識に使うことができる。例えば、８つの異なるＣＦＥＴタグを用いて４つの異なる変異サイトを試験することができる。
【０１５５】
表２に示すように、８つの固有のＣＦＥＴタグ（表１の１，２，３，４，５，６，９および１０）で標識された８つのプライマーを、１´，２´−ジデオキシ糖リン酸塩（Ｓ）をスペーサーとして使用して、図３Ａの一般的な標識化図式のように構成することができる。このＣＦＥＴタグセットの構成では、ＦＡＭを共通のドナーとして、ＴＡＭおよび／またはＣｙ５をアクセプターとして使用する。それぞれのドナー／アクセプター対の間隔の長さ、（Ｓ）_ｍおよび（ｓ）_ｎは、表１に描写したような予測した蛍光信号を達成するために、組織的に変化させることができる。ＦＡＭおよびＴＡＭはＦＡＭ−ｄＴおよびＴＡＭ−ｄＴフォスフォルアミダイトを使って導入することができ、Ｃｙ５は上述したアミノリンカーを保有する修飾されたＴに導入することができる。
【０１５６】
このシステムは例えば、網膜芽細胞腫感受性（ＲＢ１）遺伝子（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ他，１９９４、Ｌｏｈｍａｎｎ，１９９９）のエキソン２０の周知の一塩基変異を模した一本鎖ＤＮＡを合成することによって試験することができる。分析に使用できる合成テンプレート（ｗｔおよびｍｕｔ）の二組の配列を表３に示す。変異の可能性がある位置の配列は、太字で「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」および「Ｔ」を示す。表２のプライマーセット１および２は、テンプレートＡの野生型と変異塩基の位置の両方の試験にそれぞれ使用され、一方プライマーセット３および４はテンプレートＢの野生型および変異塩基の位置の試験にそれぞれ使用される。ポリアクリルアミドゲルで検出可能なサンプル数を最大にするために、それぞれの「変異」位置を囲むプライマーは図９に示す固有の長さで設計することができる。例えば、変異位置１を囲む、ＣＦＥＴ標識された二つのオリゴヌクレオチド（一つは野生型遺伝子用で、一つは変異型遺伝子用）は、それぞれ２０および２２塩基長であり、標識されていない共通プライマーは２０塩基長である。その結果のライゲーション産物は、何れも４０または４２塩基長である。同様に、変異位置２のための、２４および２６塩基長の標識されたオリゴヌクレオチドが構成され、異なる２０塩基長の共通プライマーが構成され、４４または４６塩基のいずれかのライゲーション産物が導かれる。さらなるプライマーはもちろん、それぞれ別々の変異に対して一つの塩基のかわりに二つの塩基を追加してサイズを増大することにより、あるいは、ライゲーション産物が８０から９８塩基対、１２０から１３８塩基対またはその他の塩基対になるような、標識化された第２のプライマーセットを作ることにより、生成することができる。４００ｂｐまでの長さのＤＮＡ断片の一つの塩基対の分離能はポリアクリルアミドゲル電気泳動で容易に達成されるので、ライゲーション産物はそのような標準の蛍光ゲルシステムで容易に分離することができる。さらにその上、その産物をそれらの蛍光信号に基づいて明瞭に分けることができる利点は、サイズによる利点と同様に、この分析をきわめて有力にする。この複合試験システムの排除ゲル電気泳動の結果を図９の右側に示す。ここで、テンプレートコレクション１はｗｔ配列のみを含み、反対に、テンプレートプール２は位置２に変異型の一つのテンプレートを、そして位置４にヘテロ接合体遺伝子型を含むと考えられる。
【０１５７】
【表２】

【表３】

ＩＶ．全染色体分析のためのＣＦＥＴタグ標識プローブ
ランダムプライムドラベリング方法（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により、染色体に特異的なＤＮＡ分子または任意の染色体の長さにあわせて処理されたコスミドに、ＣＦＥＴ−ｄＵＴＰを組み入れるためのプローブを生成することができる。新鮮な細胞に広がった分裂中期または脱パラフィン化された（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄ）物質は標準的な方法論により準備されることができ、タグを付されたプローブは染色体にハイブリダイズすることができる。二つの別々の蛍光分子から成る嵩高いＥＴ染料は、長いリンカーを有する染料と同様に、ＤＮＡポリメラーゼの良い基質となることが示されているデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）およびジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰｓ）に結合している（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ他，１９９７、Ｚｈｕ他，１９９４）。従って、ＣＦＥＴ−ｄＵＴＰは、ポリメラーゼ反応によって伸長中の鎖に取り込まれることができるはずである。実際のランダムプライミング反応では、デオキシチミン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびＣＦＥＴ−ｄＵＴＰの一定の割合は調節可能であるので、適当な方法によって検出されるのに十分な、ＣＦＥＴ−ｄＵＴＰの小部分だけが伸長中の鎖に取り込まれる。
【０１５８】
数量的なおよび構造的な染色体の再配列は、ヒトの死亡率および罹患率の主な原因である。全染色体の異数性により、初期胚の死亡率の少なくとも５０％が説明され、ダウン症候群のような重症な先天性の奇形パターンも誘導する。欠損および重複による部分的な異数性もまた、多くの型の癌と関係しているほかに、奇形症候群を誘導する。
【０１５９】
伝統的な細胞遺伝学の分析は、標準的な結合分析に固有する分離能と解析における問題のために妨害される。ここ１０年間に、静止期の核に加えて、染色体標本の蛍光標識ＤＮＡプローブの使用は、細胞学的診断の解析能と正確さを大きく改善した。バンド形成によって光学顕微鏡で見るには小さすぎる微小欠失および増幅は、今では染色体および領域に特異的な蛍光化標識プローブを用いて可視化することができる。このシステムは、異なる蛍光で標識されたプローブを組合せることで複合化することが可能である。異なる標識をされたプローブの５つまでのセットは、出生前のサンプルの異数性を決定するために静止期の核を診断する目的で使用されている（Ｍｕｎｎｅ他，１９９８）。コンピュータイメージソフトウェアを用いて目立たせるために、Ｍ−ＦＩＳＨおよびスペクトル核型分析はヒト染色体の全２３対を「ペイント」する５つの染料の組合せアプローチを使用する（Ｓｃｈｒｏｃｋ他，１９９６、Ｓｐｅｉｃｈｅｒ他，１９９６）。しかしながら、これらの確立された技術は、調製された割合で染料の混合を慎重に行わなければならない。品質管理はしばしば問題であり、そして商業的に利用するプローブは非常に高価である。
【０１６０】
ＣＦＥＴタグは、現在利用されている染料のセットに対して実質的に有利な点を持つことを期待されている。より多数のＣＦＥＴタグのセットを形成し、組合せアプローチの必要性を減少することは可能である。それぞれのプローブは一つのタグのみで標識されればよく、プローブセットは多色ＦＩＳＨ試薬を生成するために等量で混合されることができるので、品質管理もより容易になりやすい。
【０１６１】
ＣＦＥＴタグは例えば、静止期の核の異数性の検出、および超顕微鏡的な染色体欠損および増幅の検出の両方のために使用されることができた。異数性の検出のため、例えば、８つの異なるＣＦＥＴタグで標識されたプローブを用意することができ、それぞれ、最も一般的には胚芽欠損または誕生欠陥のいずれかの異数性を含む染色体（染色体１３，１５，１６，１８，２１，２２、ＸおよびＹ）のうちの一つに特異的である。
【０１６２】
取得または欠損した遺伝物質の、包括的な全染色体分析の手順を模式的に図１０に示す。この例では、固有の蛍光信号を発光するＣＦＥＴ−ｄＵＴＰでそれぞれ標識された８つのプローブが、染色体の８つの離れた位置にそってハイブリダイズする。通常の染色体Ａは、各プローブの８つの固有の蛍光信号を定義された順で表示する。染色体Ｂの蛍光信号「２」の欠損は、プローブ２の相補的配列の欠損で表示される。他方の染色体Ｃでは、信号「３」が二つ存在することから、プローブ３の相補的配列が重複していることが示される。
【０１６３】
コスミドおよび染色体に沿って２〜３Ｍｂおきにあるビスアクリロイルシスタミン（ＢＡＣ）マーカーの標準的なセットは、国立癌研究所が支援するプロジェクト、癌染色体異常プロジェクト（ＣＣＡＰ：ｗｅｂｐａｇｅ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ ｎｃｉｃｇａｐ／）を含めた幾つかの研究室で開発されている。特定の染色体領域に特異的な、異なるＣＦＥＴ標識が順に並んだプローブのセットを用意することができる。ＦＩＳＨを使って、欠損であるか、またはそうと思われる範囲を決定することができる。
【０１６４】
Ｖ．他の多成分分析におけるＣＦＥＴタグの使用
本願において開示する固有の蛍光信号を有するＣＦＥＴタグは、これらの開示に加えて、多成分分析を含めた他の応用にも有用である。さらなる応用は、結合分析および免疫分析を含む複合分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙ）、微生物病原体の検出、生体分子の複雑な反応のモニタリング、薬または化合物のスクリーニング、エピトープマッピング、アレルギーのスクリーニング、および有機化合物との使用、および物質科学における使用、を含む複数の分析を含むが、これに限定されない。例えば、複雑な反応あるいは相互作用を同時に測定でき、このとき、それぞれ異なる蛍光信号を有する複数のＣＦＥＴタグは、例えば、抗体、抗原、リガンド、または基質を含む異なる反応物を標識するのに使用される。その例は、抗体と抗原の、およびレセプターとリガンドの結合を含む。さらなる例において、異なる反応物は微粒子と結合できる。
【０１６５】
ＶＩ．複数の一塩基多型を同定するライゲーション分析に使用されるＣＦＥＴタグ
生物学的分析の応用例として、腫瘍サプレッサー網膜芽細胞腫（ＲＢ１）遺伝子のエキソン２０上の遺伝子変異を検出するため、固相精製と組み合せたオリゴヌクレオチドライゲーション分析（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，１９８８）にＣＦＥＴタグを適用した。図１１にこの応用の模式図を示す。二つの２０塩基対のオリゴヌクレオチドは、一方はその５´末端をＣＦＥＴタグで標識され、他方はその３´末端をビオチンで、その５´末端を一リン酸塩（Ｐ）基で標識されており、ＣＦＥＴで標識されたオリゴヌクレオチドの３´末端がビオチンで標識されたオリゴヌクレオチドの５´末端の隣に位置するような標的ＤＮＡテンプレートとハイブリダイズする。Ｔａｑ　ＤＮＡリガーゼは、二つの並列したオリゴヌクレオチドを、リン酸エステル結合を形成して頭−尾様式で結合し、二つのオリゴヌクレオチドのライゲーション接合点におけるヌクレオチドがテンプレートと正確な塩基対を形成するようにする（Ｂａｒａｎｙ，１９９１）。Ｔａｑ　ＤＮＡリガーゼを使った実験条件下において、ＣＦＥＴで標識されたプローブの３´末端（図１１のヌクレオチドＡおよびＣ）と標的テンプレートのＳＮＰサイト（図１１のヌクレオチドＴおよびＧ）がミスマッチである場合、ライゲーション反応は起こらない。ライゲーションの後、ＣＦＥＴで標識されたライゲーション産物（４０塩基対）は、ストレプトアビジンで被膜されたマグネチックビーズに固定化され、一方他の化合物は洗い流される。その後、そのライゲーション産物は、ホルムアミドでビオチンとストレプトアビジンの相互作用を変性させることによってマグネチックビーズから切断し、３色蛍光ＣＡＥシステムで分析する。ＣＦＥＴで標識されたライゲーション産物は、図１２に示すように、特徴的な移動度のため、および電気泳動図における固有の蛍光信号のために明瞭に検出される。このＳＮＰサイトにおける異種接合体の場合、異なる蛍光信号と電気泳動の移動度を有する二つのＣＦＥＴタグは、それぞれの対立遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを標識するために使われる。電気泳動図における固有の蛍光信号はそれ故、それぞれの対応するＳＮＰｓであると確認される。この固相方法は、結合していないＣＦＥＴ標識オリゴヌクレオチドを完全に排除する。結合していない２０塩基対のビオチン標識オリゴヌクレオチドはマグネチックビーズに捕捉されるが、ＣＦＥＴタグがないために蛍光信号を発生しない。本願のＣＦＥＴタグライブラリーは、標的ＤＮＡテンプレート上の複数のＳＮＰｓを同時に検出する。
【０１６６】
腫瘍サプレッサーＲＢ１遺伝子のエキソン２０（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，１９９４）を、ＣＦＥＴタグの有用性を試験するモデルシステムとして選択した。ＲＢ１遺伝子の２００塩基対の領域内に幾つかのＳＮＰｓが発見されており、それは遺伝的変異分析システムの評価に適当である。複数のＳＮＰｓ（６種のヌクレオチド）が位置するＲＢ１遺伝子のエキソン２０を擬態した合成テンプレート上で、６つの異なるＣＦＥＴタグを使った６つのライゲーション反応を別々に実行した。ライゲーションおよび固相精製の後、ライゲーション産物はシングルチューブに連結し、３色ＣＡＥで分析し、ＣＦＥＴ標識ライゲーション産物の固有の蛍光信号によって、６つのヌクレオチドの差異を同時に検出する（図１２参照）。固有の蛍光信号は、ＣＦＥＴ標識ライゲーション産物の移動度が異なる結果、電気泳動図において空間的に分離した。このモデル実験では、ＣＦＥＴ−１（ＦＡＭ）およびＣＦＥＴ−６（Ｆ−１０−Ｃｙ５）の両方がホモ接合型ＳＮＰｓ（Ｔ／Ｔ）と検出された。ＣＥＦＴ−３（Ｆ−９−Ｔ）およびＣＦＥＴ−４（Ｆ−１３−Ｔ）は、野生型（Ｃ）および変異型（Ｔ）の両方を検出することによって、ＲＢ１遺伝子変異型Ｒ６６１Ｗ（コドン６６１の変異のためにアミノ酸がアルギニンからトリプトファンに変化する）の擬態を明瞭に識別する。ＣＦＥＴ−７（Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃｙ５）およびＣＦＥＴ−８（Ｆ−７−Ｔ−７−Ｃｙ５）は、もう一つの変異Ｑ６８５Ｐ（コドン６８５の変異のため、アミノ酸がグルタミンからプロリンに変化する）をヘテロ接合型遺伝子型（Ａ／Ｃ）であると識別する。ＣＦＥＴ技術をさらに確証するために、患者のゲノムＤＮＡのＲＢ１遺伝子のエキソン２０から増幅したＰＣＲ産物を使って、３つのＳＮＰｓを確認するための、３つのＣＦＥＴ標識オリゴヌクレオチドプローブ（ＣＦＥＴ−１，３および７）と、それらに対応するビオチン標識オリゴヌクレオチドを使った。ライゲーション反応は、シングルチューブで行い、反応産物は３色ＣＡＦシステムにロードした。ＤＮＡ配列解析によって検証された３つの個別のホモ接合型ＳＮＰｓ（Ｔ，ＣおよびＡ）は、ＣＦＥＴタグ（図１２Ｂ）：Ｔ（ＦＡＭ、ＣＦＥＴ−１）、Ｃ（Ｆ−９−Ｔ、ＣＦＥＴ−３）、およびＡ（Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃｙ５、ＣＦＥＴ−７）からの３つの異なる蛍光信号によって明瞭に識別された。従って、ここに述べたアプローチは、固有のＣＦＥＴ蛍光信号と電気泳動図中の移動度のために、ヘテロ接合型およびホモ接合型の両方を検出可能である。
【０１６７】
ビオチン以外に、他の単離を可能にする部分を単離する際の制御可能なレベルを上昇するために、フェニルボロン酸のようなものを使ってもよい。切断可能なリンカー分子を介した部分の結合は、この制御可能性をさらにいっそう増強する。
【０１６８】
ＶＩＩ．複数の一塩基多型を識別するための一塩基プライマー伸長に使われるＣＦＥＴタグ
それぞれの染料標識プライマーの一塩基伸長は、０．５〜１ｐｍｏｌのプライマーと１ｐｍｏｌのテンプレートを混合して行われ、続いて２μｌのサーモシーケナーゼ１０ｘリアクションバッファー（２６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ６５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，ｐＨ９．５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、５μのｌ水、１ｐｍｏｌのビオチン化ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ビオチン−１１−ｄｄＮＴＰ、ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ ）および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中のサーモシーケナーゼ１ユニット、ｐＨ８．５、５０％グリセロール、０．１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ^ＴＭ−２０（ｖ／ｖ）、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ^ＴＭ　Ｐ−４０（ｖ／ｖ）、１ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１００ｍＭ　ＫＣｌおよび０．０５３ユニット／μｌ　サーモプラスマアシドフィルム無機性ピロホスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加する。この反応混合物は５４℃で３０秒インキュベートして一塩基伸長する。
【０１６９】
図１３に、ＣＦＥＴタグおよびビオチン標識ジデオキシヌクレオチドを使った複合ＳＮＰｓ検出の模式図を示す。この例で、プライマーの３´末端とテンプレートがマッチした場合（プライマー１ではＸとＹ、プライマー２ではＸ´とＹ´）、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、プライマーの伸長はｄｄＣＴＰ−ビオチン（プライマー１のための）およびｄｄＧＴＰ−ビオチン（プライマー２のための）によって開始される。この伸長産物は、ストレプトアビジンで被膜されたマグネチックビーズを用いて単離する。変性し、洗浄しビーズから放出させて、伸長産物を電気泳動システムにロードし、そしてその結果の電気泳動図の蛍光信号をそれぞれの固有のＳＮＰｓに識別する。従って、ＣＦＥＴ標識オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼおよびビオチン標識ジデオキシヌクレオチドは、高フィデリティーＳＮＰ検出システムを形成し、これにおいてオリゴヌクレオチドの３´末端塩基は、特異的なビオチン標識オリゴヌクレオチドを取り込むことによって伸長する。使用したＣＦＥＴタグは、Ｆ、Ｆ−９−ＴおよびＦ−１３−Ｔであった。それらの固有の蛍光信号を図１４および１５に示す。
【０１７０】
ＶＩＩＩ．高処理量分析
ＣＦＥＴタグを使用することによって提供される複合分析の処理量は、図１６に示す高処理量チャンバーで分析することによって上昇できる。
【０１７１】
ＩＸ．非−ＦＥＴタグとの組合せ
何れのセットでも使用可能な、異なる固有の蛍光信号の数を増やすため、ＣＦＥＴタグは、ＦＥＴが起こらない場合に一つのクロモフォア／フルオロフォアタグおよび複数のクロモフォア／フルオロフォアタグと組合せて使用することができる。そのような組合せを使った異なる蛍光信号の可能な数は大きく、複合分析に非常に役立つと考えられる。そのようなフルオロフォアは量子ドット、蛍光染料のルミネッセント分子でありうる。例えば、それぞれのタグは、例証のための分析に使った異なるＳＮＰの検出に使うことができる。
【０１７２】
【参照文献】

［配列表］

【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
リンカーに結合した複数の発色団集合の模式図。一般に、１からｎの発色団が、図のようにスペーサーによって隔てられた発色団に結合し、集合することが出来る。発色団は、蛍光染料、量子ドット、またはテルビウムキレートのようなルミネッセント分子であることができるが、これに限定されない。ヌクレオチド、ペプチド、１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩で形成されたポリマーリンカー、または他の化学部分のようなものを用いた様々なスペーサーを使用することができる。ここで示した集合標識は、複合生物学的分析のために、核酸、蛋白質または細胞、その他として設計されたリンカーに結合する。
【図１Ｂ】
Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃの合成。Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃの数字は、染料ＦとＴ、およびＴとＣの間の骨格中にある、間隔をあけるためのヌクレオチドの数を表す。ＦはＦａｍ、ＴはＴａｍ、Ｃはシアニン５単官能性染料である。
【図２】
タグＦ−４−Ｔ−６−ＣおよびＦ−７−Ｔ−３−Ｃの分光学的データ。
（Ａ）３つの染料Ｆ，ＴおよびＣの間の間隔を変化することで構成した、異なる蛍光信号を有する二つのタグ。
（Ｂ）染料Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃの紫外／可視（ＵＶ／ｖｉｓ）吸収スペクトル。
（Ｃ）染料Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃの蛍光発光スペクトル。
（Ｄ）染料Ｆ−７−Ｔ−３−Ｃの蛍光発光スペクトル。
ＦはＦａｍ、ＴはＴａｍ、ＣはＣｙ５である。
【図３】
ＣＦＥＴプライマーおよびＣＦＥＴ−ｄＵＴＰｓを構成する標識化アプローチの模式図。染料間のスペーサーは、（Ａ）では１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩（Ｓ）であり、（Ｂ）ではプロリン（Ｐ）である。「ｍ」および「ｎ」は、スペーサー中の分子の数である。ｄＵＴＰはデオキシウリジン三リン酸である。
【図４】
ＣＦＥＴ−ｄＴＵＰの合成。ＣＦＥＴタグは、３つの異なる蛍光染料、Ｆａｍ，ＴａｍおよびＣｙ５を含む。
【図５】
アミノアリル（ＡＡ）−ｄＵＴＰ、Ｆａｍ−プロリン、および、ＴＡＭおよびＣｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルの構造。
【図６】
Ｆａｍ−プロリン、アジド−プロリンおよびＣｙ５−フォスフィンを調製する合成の模式図。ＴＭＳＣＩはトリメチルシリルクロニドである。
【図７】
３色ＣＡＥシステムで発生した、８つのＣＦＥＴタグに固有の蛍光信号。ＦＡＭチャネル（５２０±２０ｎｍ、点線）、ＴＡＭチャネル（５８５±２０ｎｍ、細線）、Ｃｙ５チャネル（６７０±２０ｎｍ、太線）。３つのチャネル［点線：細線：太線］のそれぞれのＣＦＥＴタグの蛍光信号の計数率は括弧中に表示する。電気泳動図の蛍光信号は、４８８ｎｍの励起によって、および８つのＣＦＥＴ標識オリゴヌクレオチドを３色ＣＡＥシステムへ電気動態学的に注入することによって得られた。
【図８】
一塩基変異の可能性を含む位置の遺伝子型を決定するための、リガーゼ連鎖反応を用いた図式。
（Ａ）プライマー対は変異の可能性がある塩基を囲んで形成される。野生型プライマーは一つのＣＦＥＴタグ（タグ１）で標識され、変異特異性プライマーはもう一つのＣＦＥＴタグ（タグ２）で標識される。
（Ｂ）続いてゲル電気泳動を行い、結合したプライマー対と取り込まれなかったプライマーを分離する。テンプレートが野生型か変異型かによって、ゲル上に異なるバンドが出現する。
【図９】
８つの固有のＣＦＥＴタグおよびリガーゼ連鎖反応を用いた、Ｒｂ１遺伝子の４つの変異潜在サイトのスクリーニングから予測される結果の模式図。ライゲーション産物のみがゲル上に示される。
【図１０】
大幅な欠損および増幅を検出する染色体研究の模式図。
【図１１】
ハイブリダイズしたＣＦＥＴ標識およびビオチン標識オリゴヌクレオチドのライゲーションを介した、複合ＳＮＰ検出方法の模式図。Ｔａｑ　ＤＮＡリガーゼは、二つのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの間のニックを、そのライゲーション接合点のヌクレオチドがテンプレートと正しい塩基対である場合に封鎖する（ＡとＴ；ＣとＧ）。ＣＦＥＴ標識化、ビオチン標識化したライゲーション産物はその後、ストレプトアビジンで被膜したビーズを用いて単離する。洗浄後、マグネチックビーズから放出させ、そのライゲーション産物を３色ＣＡＥシステムに電気動態学的に注入する。固有のＳＮＰを同定するそれぞれのＣＦＥＴ標識ライゲーション産物は、ＣＡＥ電気泳動図において、その個々に異なる移動度と蛍光信号のために明確に検出される。
【図１２】
ＲＢ１のエキソン２０をＳＮＰｓ同定するためのＣＦＥＴ標識ライゲーション産物の電気泳動図。（Ａ）合成ＤＮＡテンプレートから検出した６つのヌクレオチドの差異。ＦＡＭ（Ｔ）およびＦ−１０−Ｃｙ５（Ｔ）のピークは、同じテンプレートの二つの異なる位置から検出された。Ｆ−９−Ｔ（Ｃ）およびＦ−１３−Ｔ（Ｔ）のピークは、ＤＮＡテンプレートの同じ部位から変異を示したが、Ｆ−４−Ｔ−６−Ｃｙ５（Ａ）およびＦ−７−Ｔ−７−Ｃｙ５（Ｃ）のピークはもう一つのＤＮＡテンプレートの同じ位置から変異を検出した。（Ｂ）ＲＢ１のＰＣＲ産物から検出した３つのホモ接合遺伝子型（Ｔ，ＣおよびＡ）。
【図１３】
染料標識化プライマーおよびビオチン標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ−ビオチン）を用いた複合ＳＮＰ検出のための一塩基プライマー伸長の模式図。多型サイトを含んだＤＮＡテンプレートは、多型サイトに隣接する位置のテンプレートにハイブリダイズする染料標識化プライマー、ｄｄＮＴＰ−ビオチンおよびサーモシーケナーゼと共にインキュベートする。反応および精製の最後に、プライマー伸長産物の蛍光信号を分析する。
【図１４】
染料で標識化した伸長産物に固有する３つの蛍光信号。ＦＡＭチャネル（明線）およびＴＡＭチャネル（暗線）。電気泳動図の蛍光信号は、４８８ｎｍの励起および染料標識化プライマーの一塩基伸長によって得られる。二つの検出チャネルのそれぞれの蛍光信号を表示する計数率は括弧中に表示する。
【図１５】
ＲＢ１のエキソン２０の擬態における複合ＳＮＰｓを同定するための、ＣＦＥＴ標識プライマー伸長産物の電気泳動図。ＦＡＭチャネル（明線）およびＴＡＭチャネル（暗線）。
（Ａ）野生型テンプレートから、２つの別々のホモ接合型遺伝子型を検出。ＦＡＭ（Ｔ）およびＦ−９−Ｔ（Ｃ）のピークは、テンプレート上の二つの異なる位置から得られた。
（Ｂ）変異型テンプレートを使用した他は（Ａ）と同様である。（Ｃ）３つのヌクレオチドの変異を同時に検出。ＦＡＭ（Ｔ）のピークは、ホモ接合遺伝子型が見つかったテンプレートの位置から得られた。Ｆ−９−Ｔ（Ｃ）およびＦ−１３−Ｔ（Ｔ）のピークは、ＤＮＡテンプレートの同じ位置から変異Ｒ６６１Ｗ（ヘテロ接合体）を示した。
【図１６】
高処理量チャネルに基づいた、部位による精製システム。サンプル溶液は、二つのプレートの間を、ガラスキャピラリーおよびチップの被膜されたチャネルを通して前後に押し出される。そのチャネルは、サンプルのタグ部分に結合するのに適した化学物質で被膜されている。例えば、ビオチン標識オリゴヌクレオチドの場合はストレプトアビジンで被膜される。その部分は、切断可能なリンカー、例えば光学的に切断可能なリンカーによって結合され、全チップは、サンプルが固定化された後に切断されるよう、照射されることができる。

Claims (60)

1. それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する複数のフルオロフォアを含む物質の組成物であって、そのような別々の所定の位置は、一つのフルオロフォアともう一つのフルオロフォアの間での蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、一つのこのようなフルオロフォアおよびもう一つのこのようなフルオロフォアは、その一方のフルオロフォアの最大発光波長が他方のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物。
2. 請求項１に記載の組成物であって、それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する二つのフルオロフォアを含み、前記別々の位置は、前記フルオロフォアの間で蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、前記フルオロフォアの一方の最大発光波長は、他方のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物。
3. 請求項１に記載の組成物であって、それぞれが別々の所定の位置で分子骨格に結合する三つのフルオロフォアを含み、前記別々の所定の位置は、前記フルオロフォアの間で蛍光エネルギー移動が可能であるように選択され、第１のフルオロフォアの最大発光波長は第２のフルオロフォアの最小励起波長より大きく、第２のフルオロフォアの最大発光波長は第３のフルオロフォアの最小励起波長より大きいことを特徴とする組成物。
4. 請求項１に記載の組成物であって、それぞれのフルオロフォアは前記分子骨格と共有結合する組成物。
5. 請求項１に記載の組成物であって、前記蛍光エネルギー移動の効率は２０％より小さい組成物。
6. 請求項１に記載の組成物であって、前記分子骨格は強固である組成物。
7. 請求項１に記載の組成物であって、前記分子骨格は重合体である組成物。
8. 請求項１に記載の組成物であって、前記分子骨格は核酸を含む組成物。
9. 請求項１に記載の組成物であって、前記分子骨格はペプチドを含む組成物。
10. 請求項１に記載の組成物であって、前記分子骨格はポリリン酸塩を含む組成物。
11. 請求項１に記載の組成物であって、少なくとも一つのフルオロフォアは蛍光染料である組成物。
12. 請求項１１に記載の組成物であって、前記蛍光染料は６−カルボキシフルオレセインである組成物。
13. 請求項１１に記載の組成物であって、前記蛍光染料はＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミンである組成物。
14. 請求項１１に記載の組成物であって、前記蛍光染料はシアニン−５単官能性染料である組成物。
15. 請求項１１に記載の組成物であって、少なくとも一つのフルオロフォアはルミネッセンス分子である組成物。
16. 請求項１１に記載の組成物であって、少なくとも一つのフルオロフォアは量子ドットである組成物。
17. 下記構造を有する物質の組成物：
    

    

    ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、それぞれのＴはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す組成物。
18. 請求項１７に記載の組成物であって、ｍは４である組成物。
19. 請求項１７に記載の組成物であって、ｍは６である組成物。
20. 請求項１７に記載の組成物であって、ｍは９である組成物。
21. 請求項１７に記載の組成物であって、ｍは１３である組成物。
22. 下記の構造を含む物質の組成物：
    

    

    ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、Ｃｙ５はシアニン−５単官能性染料誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す組成物。
23. 請求項２２に記載の組成物であって、ｍは４である組成物。
24. 請求項２２に記載の組成物であって、ｍは５である組成物。
25. 請求項２２に記載の組成物であって、ｍは７である組成物。
26. 請求項２２に記載の組成物であって、ｍは１０である組成物。
27. 請求項２２に記載の組成物であって、ｍは１３である組成物。
28. 下記の構造を含む物質の組成物：
    

    

    ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、ｎは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン誘導体を表し、Ｃｙ５はシアニン−５単官能性染料誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す組成物。
29. 請求項２８に記載の組成物であって、ｍは３であり、ｎは７である組成物。
30. 請求項２８に記載の組成物であって、ｍは４であり、ｎは６である組成物。
31. 請求項２８に記載の組成物であって、ｍは５であり、ｎは５である組成物。
32. 請求項２８に記載の組成物であって、ｍは６であり、ｎは６である組成物。
33. 請求項２８に記載の組成物であって、ｍは７であり、ｎは７である組成物。
34. 下記の構造を含む物質の組成物：
    

    

    ここで、Ｓは１´，２´−ジデオキシリボースリン酸塩部を表し、ｍは１より大きく１００より小さい整数であり、Ｔはチミジン誘導体を表し、ＴＡＭはＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−６−カルボキシローダミン誘導体を表し、各実線は共有結合を表し、Ｒは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかを表し、Ｑは−ＯＨ末端またはリン酸末端のいずれかのうちＲと異なるものを表す組成物。
35. 請求項３４に記載の組成物であって、ｍは４である組成物。
36. 請求項１，１７，２２，２８および３４のいずれかに記載された組成物で標識化された核酸。
37. 請求項３６に記載の核酸であって、前記核酸はＤＮＡである核酸。
38. 請求項３６に記載の核酸であって、前記核酸はＲＮＡである核酸。
39. 請求項３６に記載の核酸であって、前記核酸はＤＮＡ／ＲＮＡである核酸。
40. 予め選択したヌクレオチド残基が、核酸内の所定の位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、
    （ａ）前記核酸を、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡライゲーションが可能な条件下で下記の成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）と接触させることと；
    （ｉ）ＤＮＡリガーゼ、
    （ｉｉ）請求項１の組成物を付加され、且つ前記所定の位置の一方の側の直近に隣接するヌクレオチドとハイブリダイズする、第１のオリゴヌクレオチド、及び
    （ｉｉｉ）前記所定の位置の他方の側の直近に隣接するヌクレオチドとハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチド、
    ここで、前記所定の位置の３´末端に位置するヌクレオチドとハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドの−ＯＨ末端残基は、前記予め選択されたヌクレオチド残基に相補的である；
    （ｂ）前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むライゲーション産物の存在を検出し、そのようなライゲーション産物の存在によって、前記所定の位置に前記予め選択されたヌクレオチド残基が存在することが示されることとを含む方法。
41. 核酸内の種々の所定の位置において、予め選択されたヌクレオチド残基がそのような位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、前記予め選択されたヌクレオチド残基は、別々の所定の位置において異なることができ、それぞれ予め選択されたヌクレオチドがそれぞれの所定の位置に存在しているかどうかを、請求項４０に記載された方法に従って決定することを含む方法。
42. 請求項４１に記載の方法であって、複数の任意のヌクレオチド残基の存在を同時に決定する方法。
43. 請求項４０に記載の方法であって、前記ＤＮＡリガーゼはＴａｑ　ＤＮＡリガーゼである方法。
44. 請求項４０に記載の方法であって、前記第２のヌクレオチドは単離を可能にする部分を付加されており、また前記方法はさらに、前記工程（ａ）から得られる前記部分を含有する分子を単離することと、連結された第１及び第２のオリゴヌクレオチドがその中に存在することを決定することとを含む方法。
45. 請求項４０に記載の方法であって、前記第１のオリゴヌクレオチドに付加した前記組成物は所定の発光スペクトルを有し、この発光スペクトルを観察することによって、前記工程（ｂ）において連結された第１及び第２のオリゴヌクレオチドの存在を決定する方法。
46. 予め選択したヌクレオチド残基が、核酸内の所定の位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、
    （ａ）前記核酸を、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメリゼーションが可能な条件下で下記の成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）と接触させることと、
    （ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、
    （ｉｉ）（１）請求項１の組成物を付加され、（２）３´−ＯＨ末端を有し、且つ前記核酸分子の所定の位置に隣接する３´領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及び、
    （ｉｉｉ）単離を可能にする部分で標識化され、且つ任意のヌクレオチド残基と相補的であるジデオキシヌクレオチド、
    但し、ＤＮＡポリメラーゼおよび予め選択されたヌクレオチド残基の存在下で、前記オリゴヌクレオチドと前記核酸とがハイブリダイゼーションするときに、前記オリゴヌクレオチドおよび前記ジデオキシヌクレオチドは並列し、ＤＮＡポリメラーゼがそれらを共有的に連結することを可能にする；
    （ｂ）前記オリゴヌクレオチドおよび前記ジデオキシヌクレオチドの両方を含むポリメリゼーション産物の存在を検出し、そのようなポリメリゼーション産物の存在により、予め選択されたヌクレオチド残基が所定の位置に存在することが示されることとを含む方法。
47. 核酸内の種々の所定の位置において、予め選択されたヌクレオチド残基がそのような位置に存在しているかどうかを決定する方法であって、前記予め選択されたヌクレオチド残基は、別々の所定の位置において異なることができ、該方法は、それぞれ予め選択されたヌクレオチドがそれぞれの所定の位置に存在しているかどうかを、請求項４６に記載された方法に従って決定することを含む方法。
48. 請求項４６に記載の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼはサーモシーケナーゼである方法。
49. 請求項４６に記載の方法であって、前記ジデオキシヌクレオチドは、ジデオキシアデノシン三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸、ジデオキシグアノシン三リン酸、ジデオキシチミジン三リン酸、およびジデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される方法。
50. 請求項４６に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドに付加された組成物は、所定の発光スペクトルを有し、この発光スペクトルを観察することによって、前記（ｂ）におけるポリメリゼーション産物の存在を決定する方法。
51. 請求項４５または５０に記載の方法であって、前記所定の発光スペクトルの観察は、波長が２００〜１０００ｎｍの放射線を用いて行われる方法。
52. 請求項５１に記載の方法であって、前記放射線の波長は４８８ｎｍである方法。
53. 請求項４５または５０に記載の方法であって、前記所定の発光スペクトルの観察は、帯域幅が１〜５０ｎｍの放射線を用いて行われる方法。
54. 請求項５３に記載の方法であって、前記放射線の帯域幅は１ｎｍである方法。
55. 請求項４４または４６に記載の方法であって、前記単離を可能にする部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、フェニルボロン酸、サリチルヒドロキサム酸、抗体、または抗原を含む方法。
56. 請求項５５に記載の方法であって、前記単離を可能にする部分は、リンカー分子を介して前記オリゴヌクレオチドに付加している方法。
57. 請求項４６に記載の方法であって、前記単離を可能にする部分は、リンカー分子を介して前記ジデオキシヌクレオチドに結合している方法。
58. 請求項５６または５７に記載の方法であって、前記リンカー分子は化学的に切断可能である方法。
59. 請求項５６または５７に記載の方法であって、前記リンカー分子は、光学的に切断可能である方法。
60. 請求項５９に記載の方法であって、前記リンカー分子は、
    

    

    で示される構造を有する方法。

Images