JP2004513093A

JP2004513093A - Compositions and methods for stable injections

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Publication number: JP2004513093A
Application number: JP2002535640A
Authority: JP
Inventors: ブルース、ジョセフ、ローザー; アルカディオ、ガルシア、デ、カストロ; ジェームズ、マキ
Original assignee: Cambridge Biostability Ltd
Current assignee: Cambridge Biostability Ltd
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2004-04-30
Also published as: WO2002032402A1; EP1328255A1; PL360052A1; AU2001211986B2; AU1198601A; PT1452171E; NO20031706L; CN1527699A; CN100339066C; KR20030096224A; CA2689856A1; CA2424656C; CA2424656A1; NO20031706D0; MXPA03003236A; ES2337252T3; CA2689856C

Abstract

第一の成分および第二の成分を含んでなる、安定な生物活性化合物を対象者へデリバリーするための組成物であって、第一の成分が、生物活性剤を含有した糖ガラスまたはホスフェートガラスの微粒子からなる。糖ガラスまたはホスフェートガラスは場合によりガラス形成促進剤化合物を含有し、第二の成分が、第一の成分が不溶性でかつ分散される少くとも１種の生物適合性液体ペルフルオロカーボンからなる。液体ペルフルオロカーボンは場合により界面活性剤を含有している。A composition for delivering a stable bioactive compound to a subject, comprising a first component and a second component, wherein the first component is a sugar glass or phosphate glass containing a bioactive agent. Of fine particles. The sugar glass or phosphate glass optionally contains a glass-forming accelerator compound, and the second component comprises at least one biocompatible liquid perfluorocarbon in which the first component is insoluble and dispersed. The liquid perfluorocarbon optionally contains a surfactant.

Description

【０００１】
【発明の背景】
注射用溶液中のワクチンまたは薬物は本来不安定であり、冷却を要する。医薬品業界は薬物を凍結乾燥することにより不安定問題に昔から取り組んできた。乾燥薬物の不正確な再調製で、誤った用量または汚染溶液をもたらすことがあるため、これは高価、不便、かつ本来的に危険である。確固とした、安定で、直ちに注射可能な液体処方物を開発する多くの試みが、過去１００年にわたり行われてきたが、不成功に終わった。本来強くて小さな分子の薬物のみが、有用な貯蔵寿命で、水溶液中に残存しうる。
【０００２】
この問題はワクチン業界で特に重大である。２００５年度までに、３６億回分のワクチンが世界中で投与されねばならないと見積もられている。これは常に冷却を要する標準ワクチンフォーマットを用いたのでは不可能である、と世界保健機関（ＷＨＯ）により言われた（”ＲｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｚｉｎｇＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ”（革命的免疫法）ＪｏｄａｒＬ．，ＡｇｕａｄｏＴ．，ＬｌｏｙｄＪ．ａｎｄＬａｍｂｅｒｔＰ−Ｈ．，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ，Ｆｅｂ１５１９９８）。開発途上中の世界でワクチン工場から地方の町へと延びる冷却機の“コールド・チェーン（低温流通システム）”が現在用いられている。コールド・チェーンのコストは、免疫キャンペーンを行っているワクチン業界および非政府保健機関にとり莫大である。コールド・チェーンの維持コストだけで、毎年２億ＵＳドルを超える、とＷＨＯは見積もっている。加えて、免疫キャンペーンはコールド・チェーンの末端リンク近くに住む者に届くだけかもしれない。
【０００３】
ワクチン接種キャンペーンでは、所定の用量が正確に注射されて、分解の徴候を示さないよう、医療スタッフに要請している。麻疹、黄熱およびＢＣＧのような一部のワクチンを再調製する必要性も、当業界では重大な関心事である。これは正しい投与量を保証するよう正確に行われねばならず、たびたび臨床的惨事を招いてきた汚染源にもなりかねない。加えて、所定期間中に２回以上ワクチンを接種することが多くの場合に必要であり、特定の混合物または“多価”ワクチンが一部成分の化学的不適合のせいで利用できなければ、これは複数回の注射を要することがある。ＷＨＯは、冷却の必要性がなく、再調製を要しない、次世代の安定ワクチンの研究を奨励することにより、これらの問題を重要視している（”Ｐｒｅ−ＦｉｌｌｅｄＭｏｎｏｄｏｓｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎＤｅｖｉｃｅｓ：Ａｓａｆｅｔｙｓｔａｎｄａｒｄｆｏｒｎｅｗｖａｃｃｉｎｅｓ，ｏｒａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｔｈｅｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ？”（前充填単用量分注射器具：新規ワクチンの安全標準または免疫デリバリーの革命）ＬｌｏｙｄＪ．ａｎｄＡｇｕａｄｏＭ．Ｔ．ＷＨＯｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｍａｙ１９９８；”Ｇｅｎｅｒａｌｐｏｌｉｃｙｉｓｓｕｅｓ：ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｓｏｌｉｄｖａｃｃｉｎｅｓ：ａｒｏｌｅｉｎｆｕｔｕｒｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ？”（一般方針問題：注射用固形ワクチン：将来の免疫における役割）ＡｇｕａｄｏＭ．Ｔ．，ＪｏｄａｒＬ．，ＬｌｏｙｄＪ．，ＬａｍｂｅｒｔＰ．Ｈ．ＷＨＯｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏＡ５９７８１）。
【０００４】
この問題の理想的解決策は、完全に安定で直ちに注射可能な処方物であろう。このような安定ワクチンは注射器具自体に個別用量として入れられるか、または大規模免疫キャンペーンのために、多量に輸送されて、無針ジェットインジェクターにより投与される。ガスジェット注入による乾燥固形物の経皮デリバリーが記載されており（ＳａｒｐｈｉｅＤＦ，ＢｕｒｋｏｔｈＴＬ．，Ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｏｖｉｄｉｎｇｄｅｎｓｅｐａｒｔｉｃｌｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｕｓｅｉｎｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｐａｒｔｉｃｌｅｄｅｌｉｖｅｒｙ（経皮粒子デリバリー用の高密度粒子組成物の調製方法）．ＰＣＴ公開ＷＯ９７４８４８５（１９９６））、乾燥ＤＮＡワクチンでの経皮接種が非常に有効なようである（“ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ’ｓＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＤＮＡＶａｃｃｉｎｅＦｉｒｓｔＴｏＳｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙＥｌｉｃｉｔＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＩｍｍｕｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅＩｎＨｕｍａｎｓ”（ヒトで防御免疫応答をうまく誘導する、初めてのＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔのＢ型肝炎ＤＮＡワクチン）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ．ｃｏｍ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅｓ．ｈｔｍ（１９９８））。
【０００５】
これらの粉末インジェクターを稼働するために用いられるヘリウムガスの極超音速衝撃波はパワーが限られており、その分量の微粒子を筋肉内にデリバリーできない。これは、低質量粒子が深く滲入する上で適度な勢いに到達しえないからである。コロイド金粒子に被覆されたＤＮＡワクチンの皮内デリバリーが良好な免疫原性のためには向いているが、不溶性アルミニウムまたはカルシウム塩でアジュバントされた一般ワクチンは許容しえない皮膚刺激を生じる。それらは筋肉内に投与されねばならない。必要なものは、現行の針および注射器技術により達しうる場合に似た、皮内から筋肉深部内までのある範囲のデリバリー深さに達しうる、フレキシブルなシステムである。大規模ワクチン接種キャンペーンでは、これは約３０００ｐｓｉ（約２１０ｋｇ／ｃｍ^２）の圧力を用いて、細い（〜０．１５ｍｍ径）液体流を“リキッド・ネール”（ｌｉｑｕｉｄｎａｉｌ）へ加速しうる液体ジェットインジェクターの開発により解決された。この器具は、表皮に微小な穴をあけることにより、皮膚から深部皮下または筋肉組織中へ無痛でその分量をデリバリーする。液体流へ伝えられる高い勢いのおかげで、深く滲入しうる。現在までのところ、注入される薬物およびワクチンは水ベースであったが、前記の不安定問題のせいで、この技術を活用しうる安定水性製品の範囲は非常に限られている。
【０００６】
広範囲の生物活性分子は糖ガラス中で乾燥させて安定化されることが、現在認められている（ＲｏｓｅｒＢ．”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｈｅｌｉｋｅ”（タンパク質などの保護）ＵＫ特許２，１８７，１９１；ＲｏｓｅｒＢａｎｄＣｏｌａｃｏＣ．”Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｕｂｓｔａｎｃｅｓａｎｄｏｔｈｅｒｏｒｇａｎｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”（生体高分子物質および他の有機化合物の安定化）ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９１；ＲｏｓｅｒＢａｎｄＳｅｎＳ．”Ｎｅｗｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｇｌａｓｓｅｓ”（新規安定化ガラス）ＰＣＴ特許出願９８０５６９９．７，１９９８）。これらの乾燥安定化活性剤は、高温および電離放射線のような敵対的環境により影響をうけない。
【０００７】
糖により分子の著しい安定化を生じるメカニズムはガラス転移である。活性分子を含有した糖溶液が乾燥されると、それは糖の溶解限界に達したときに結晶化するか、または過飽和シロップになる。結晶化に抵抗する糖の能力は、良好な安定剤の重要な性質である。トレハロースはこの点で優れているが（ＧｒｅｅｎＪＬ．＆ＡｎｇｅｌＣＡ．，Ｐｈａｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓａｎｄｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗａｔｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｔｒｅｈａｌｏｓｅａｎｏｍａｌｙ（糖水溶液中における相関係およびガラス化とトレハロース異常）．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９３，２８８０−２８８２（１９８９））、唯一ではない。更に乾燥させるとシロップを次第に固化させ、これが低い残留水分でガラスに変わる。いつのまにか、活性分子が水中の溶液から乾燥糖ガラス中の固溶体へと変化する。化学拡散はガラス中ごくわずかで、そのため化学反応は事実上止む。変性は化学変化であるため、それはガラス中で生じえず、分子は安定化している。この形態のときは、もし他の一つの条件が合うならば、分子は未変化のままでいられる。これは良好な安定剤の第二の重要な性質である、即ち、それは化学的に不活性かつ非反応性である、ということである。多くのガラスが失敗したが、その理由はそれらが貯蔵時に生成物と反応するからである。明らかな問題は還元糖で生じ、これは良好な物理的ガラスを形成しても、それらのアルデヒド基は典型的メイラード反応で生成物のアミノ基を攻撃する。これが、多くの凍結乾燥薬剤が冷蔵保管を要する主な理由である。非反応性の糖は、全く冷却を要しない安定な製品を与える。
【０００８】
糖ガラス中で固定された生体分子は、それら自体および糖の双方が不溶性である非水性工業溶媒中でも安定である（ＣｌｅｌａｎｄＪＬ．ａｎｄＪｏｎｅｓＡＪＳ．”Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｓ”（有機溶媒で処理されたポリペプチドの賦形剤安定化）ＵＳ特許５，５８９，１６７（１９９４））。糖ガラスは非溶媒液中で不透過性バリアとして作用するため、ガラス中で固溶体の生体分子は溶媒の化学反応および環境の双方から防御される。液体自体が安定であれば、懸濁ガラス粒子中の感受性生成物は安定な２相液体処方物を形成する。ＣｌｅｌａｎｄａｎｄＪｏｎｅｓ（１９９４）により記載された種類の工業溶媒は、取扱いに際して有用性が限られている。生体適合性非水性液体に代えると、最も不安定な薬物、ワクチンおよび診断薬でも、安定な液体処方物として処方しうるであろう。
【０００９】
第一世代の安定非水性液体は薬物またはワクチンデリバリー用に考えられた（Ｂ．Ｊ．ＲｏｓｅｒａｎｄＳ．Ｄ．Ｓｅｎ ”Ｓｔａｂｌｅｐａｒｔｉｃｌｅｉｎｌｉｑｕｉｄｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”（液体処方物中の安定粒子））。ＰＣＴ特許出願ＧＢ９８／００８１７は、ゴマ、落花生もしくは大豆油のような注射用油またはオレイン酸エチルのような単純エステルに懸濁された、活性剤を含有する安定化ガラスの粉末の処方物について記載していた。懸濁された糖ガラス粒子は極めて親水性であり、一方油は疎水性である。分離しやすい親水および疎水相の強い傾向のせいで、糖ガラス粒子は一緒に凝集しやすかった。このような“油中水型”懸濁物を安定化するために、連続油相に溶解された油溶性界面活性剤の使用が多くの場合に要求された。
【００１０】
これらの低ＨＬＢ（親水性／親油性バランス）界面活性剤は親水性粒子と油との界面に集中して、連続油相とより適合する両親媒層でそれらを被覆する。各糖ガラス粒子は乾燥油によりその近隣から離されるため、化学的相互作用は粒子間で生じない。したがって、同一の油製剤中に、潜在的に相互作用しうる異なる分子を各々が含有しても、それらを相互作用させることなく、いくつかの異なる粒子群を有することが可能である。複合的な多価ワクチンはこうして製造しうる。
【００１１】
しかしながら、このアプローチは、万能の解決策であることを妨げる、ある欠点を有することがわかった。これらには、さほど高密度でない油状ビヒクル中で約１．５ｇ／ｃｍ^３の典型的密度を有する、懸濁粒子の不可避的沈降がある。その特許ではこの問題を認識しており、ブラウン運動のような熱力学力によりそれらを懸濁させておくために、直径で１μｍ以下に粒径を小さくすることにより、それを解決しようとしている。直径で全粒子を１μｍ以下にする要件は、提案された処方物の欠点である。このように小さな粒子粉末を得ることは、決して容易な作業ではない。改善されたスプレードライヤーデザインであればこれを達成しうるが、小さな粒径はサイクロンタイプコレクターの使用を妨げて、製品回収用フィルターのシステムを要する。
【００１２】
サブミクロンサイズまで粒子を小さくすることも、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（ＣｏｎｓｔａｎｔＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）のような高圧微均質化装置で粒子が油中に懸濁された後であれば、理論的に達成しうる。これは余計なステップをそのプロセスに加え、球形のせいで非常に高い機械強度を有する噴霧乾燥糖ガラス微小球を砕く際に、それがさほど効率的でないことを我々は知った。これは装置に何回も通すことを強いる。それでも、これは多数の大きな粒子を未接触のままにしがちで、そのためそれらを除去するために後で濾過または沈降ステップを要する。しかも、通常の油状のビヒクル中で懸濁物が高粘度であることが、シリンジ中にそれらを引き込むことを難しくさせ、また、それらをゆっくり注入することを要する。それは、液体ジェットインジェクターシステムでみられるような、細いノズル中の速い流動を妨げる。
【００１３】
油に懸濁された粒子は、特に低ＨＬＢ界面活性剤を含有するとき、後で水性環境中へ抽出することを難しくさせることもわかったが、その理由は、意外にも、水性緩衝液で洗浄後にも、それらは強く結合した油の防水コートをそれらの周りに維持するからである。したがって、粒子が油相を出て水相へ入るために、それらは非常に激しい振盪および混合またはより水溶性の洗剤（このときは高ＨＬＢ）の添加を要する。粒径が小さくなるほど、これは大きな問題になる。最終結果は、２つにはっきり分かれた相というよりも、むしろ不明瞭に混じり合ったエマルジョンであることが多い。体内で、この問題は、要求される迅速で予想しうるデリバリーよりも、むしろ活性剤の遅くて予測しえない放出を生じうる。水性環境中へのインビトロ抽出で、溶解した活性剤を含有する水相の上に油が浮かぶようになる。これは診断キットまたは自動アッセイシステムのようなあるインビトロ用途には許容しえない。最後に、臨床で用いうる天然ＦＤＡ承認油のほとんどは光分解、酸化または他の形のダメージをうけやすく、暗所に比較的低温で慎重な貯蔵を要する。加えて、それらは完全には化学的に不活性でないため、それらは懸濁粒子とゆっくり反応しうる。
【００１４】
ＡｌｌｉａｎｃｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙは、注目すべき新規な非水性ペルフルオロカーボン液体中での水溶性物質の粉末の使用を検討した（ＫｉｒｋｌａｎｄＷＤ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓ（活性剤デリバリー用の組成物および方法）．ＵＳ特許５，７７０，１８１（１９９５））。この特許は腸の診断画像化用の経口コントラスト増強剤として、ＰＦＣの機能に主に関する。そこで例示された水溶性粉末は、ＰＦＣの口当りの改善または胃腸管におけるコントラスト効果の向上のために加えられた。しかしながら、具体例は示していないが、これらの液体は薬物デリバリー向けにも用いうることを、Ｋｉｒｋｌａｎｄは認識していた。特に、貯蔵安定性の市販粉末のみがその特許では例示されている。我々は、今や、糖ガラス微小球で安定化された脆性活性剤が、経口および非経口双方のデリバリー用の極めて安定な２相ＰＦＣ液体処方物を生じるように工学処理しうることを発見した。これは、いかなる類の冷却も要しない直ちに注射可能な処方物としての非経口薬物およびワクチンのデリバリーへも、Ｋｉｒｋｌａｎｄ特許の有用性を広く拡大する。ＰＦＣの低い粘度、高い密度および低い表面張力が、これらの安定な懸濁物が液体ジェットインジェクターのような自動器具によりデリバリーされることを意味する、という発見は特に有益である。これは、この技術に２つの重要な追加分野、即ち、大規模免疫キャンペーンおよび自己注射を切り開いている。
【００１５】
ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）は、ある有機化合物の完全フッ素化により製造される、新しい、極めて安定な液体である。それらは油および水の双方または極性もしくは無極性いずれの他の溶媒とも事実上本質的に非混和性であるため（他のＰＦＣを除き）、それらは親水性または親油性のいずれにも分類しえない（ＲｅｖｉｅｗｅｄｉｎＫｒａｆｆｔＭＰ＆ＲｉｅｓｓＪＧ．”Ｈｉｇｈｌｙｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓａｎｄｃｏｌｌｏｉｄａｌｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｆｉｅｌｄ．Ａｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．”（高度フッ素化両親媒性化合物およびコロイド系、および生物医学分野におけるそれらの用途．寄与）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８０，４８９−５１４，１９９８）。更に、それらは油との疎水性相互作用にも、水または親水性物質との親水性相互作用にも関与しない。結果的に、親水性粒子が油中で一緒に強く凝集したときにみられる大きな相分離は、ＰＦＣで生じにくい。それらは安定な懸濁物を形成する上で界面活性剤を必要としないが、フルオロヒドロカーボン（ＦＨＣ）界面活性剤が利用でき（Ｋｒａｆｆｔ＆Ｒｉｅｓｓ，１９９８）、ＰＦＣ液体中でごくわずかな濃度で活性である。これらの非常に低い濃度で、ＦＨＣ界面活性剤は、それらの不在下で凝集する傾向を示すある粒子の完全な単分散系を保証しうる。ＰＦＣ液体自体は化学的に完全に非反応性であり、低分子量タイプでは体内に蓄積せず、揮発性であり、いずれ息で吐き出される。
【００１６】
それらは気体用の優れた溶媒であるため、ＰＦＣは非常に特別な臨床用途で既に大量に用いられてきた。二酸化炭素を溶解酸素と交換しうるそれらの能力は、ヘモグロビンの場合よりも良い。これは１９６８年にＲ．Ｐ．Ｇｅｙｅｒにより“無血ラット”で最初に証明された（ＧｅｙｅｒＲＰ，ＭｏｎｒｏｅＲＧ＆ＴａｙｌｏｒＫ．”Ｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｒａｔｓｔｏｔａｌｌｙｐｅｒｆｕｓｅｄｗｉｔｈｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”（ペルフルオロカーボン‐界面活性剤の製剤で全体的に灌流されたラットの生存）ＯｒｇａｎＰｅｒｆｕｓｉｏｎａｎｄＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｖ．Ｎｏｒｍａｎ，ＪＦｏｌｋｍａｎ，Ｌ．Ｅ．Ｈａｒｄｉｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．ＲｉｄｏｌｆａｎｄＦ．Ｊ．Ｖｅｉｔｈｅｄｓ．Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒｏｆｔｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，８５−９５（１９６８））。ペルフルオロオクチルブロミドは、水中ＰＦＣ型エマルジョンの形態で、商品名Ｏｘｙｇｅｎｔ^ＴＭ（ＡｌｌｉａｎｃｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｒｐ．）で、ある外科手術向け輸血の代用品として、現在ヒトで評価されている。ＰＦＣは、未熟児の呼吸障害症候群の治療にも、液体として肺へ吸入により用いられてきた。
【００１７】
それらの高密度性も、化学的不活性と共に、価値あることがわかった。商品名Ｖｉｔｒｅｏｎ^ＴＭ（ＶｉｔｒｏｐｈａｇｅＩｎｃ．）のペルフルオロフェナントレンが、手術に際して目の被膜の崩壊を防ぎ、剥離網膜の修復を行うために用いられる。ＰＦＣは磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）用の造影剤としても用いられ、この目的から、それらの画像性を改善するか、またはそれらを嗜好上より好ましくするために、親水性粉末がそれらに懸濁しうることが報告された（ＫｉｒｋｌａｎｄＷ．Ｄ．”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓ”ＵＳ特許５，７７０，１８１（１９９８））。この特許は、粒状水溶性薬物デリバリー用の連続相としてのＰＦＣの使用も示唆している。室温で乾燥粉末として安定な非経口薬物の数は限られているため、この特許は大部分の注射可能薬物への適用可能性を有していない。しかしながら、ＲｏｓｅｒａｎｄＧａｒｃｉａｄｅＣａｓｔｒｏ（１９９８）で記載されているような糖ガラスの微小球粉末における薬物安定性と注射可能ＰＦＣとの組合せで、事実上すべての非経口薬物およびワクチンへこの技術を適用しうる。
【００１８】
【発明の要旨】
本発明は、薬物デリバリー製剤として、懸濁状態で不連続ガラス相を含有する連続相としてＰＦＣを含んでなる、２相系を用いている。密度約１．５〜２．５ｇ／ｃｍ^３の最終混合物を得るために異なるＰＦＣを混合しうる、という大きな利点をペルフルオロカーボンベース製剤は発揮する。こうして、粒子が浮かばずまたは容器の底に沈まずに、安定懸濁物の形で留まるように、懸濁流体と一致する密度で粒子を処方しうる。したがって、粒子は沈降を防ぐために油性製剤で必要とされるようなサブミクロンサイズでなくてもよく、サイズは大いに変わりうる。究極の粒径は製剤の目的のみにより決められる。針注射またはジェット注入向けの製剤は、０．１〜１００マイクロメーター、好ましくは１〜１０マイクロメーター範囲の粒子を含有する。これは粒子の製造法をかなり簡略化して、粉砕による極めて小さな粒径の必要性を回避する。粒子は、従来の噴霧乾燥または凍結乾燥、次いで単純な乾式または湿式粉砕により作製してよい。懸濁物中で高固形分が要されるとき、粒子は形状が球形であることが望ましい。不規則形状粒子は一緒に“結合”して易流動性を妨げるかなり大きな傾向を有しているが、球形粒子は固有の“滑らかさ”を有しているため、２０％をかなり超える固形分に達することができる。このような粒子は噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥またはエマルジョン固化により容易に作製される。
【００１９】
懸濁粉末は、適宜に処方されるならば、界面活性剤を必要とせず、水と共に振盪されたとき、ほぼ即座に糖ガラス粒子が溶解する安定な懸濁物を形成する。小さな凝集が問題としてみられるならば、ＫｒａｆｆｔａｎｄＲｉｅｓｓ（１９９８）で記載されているような少量のＦＨＣ界面活性剤が、安定粉末の混合前または後にＰＦＣ液へ有利に加えうる。ＰＦＣのように、これらのＦＨＣは本来極めて不活性で、非反応性である。そのため粒子の溶媒和はなく、懸濁粒子とＰＦＣ相との化学反応はない。糖ガラス粒子およびＰＦＣ液体の双方が環境上安定であるため、光、高温、酸素などによる分解はない。それらは無視しうるほどのインビボまたはインビトロ毒性を有するだけであり、血液交換目的で多量に動物およびヒトの双方へ注入することで、それらは正式機関により大規模に試験され、承認された。高分子量のＰＦＣは肝臓に蓄積することが報告されたが、この出願で用いられる低分子量の例は呼気で体内から結局は排出される。
【００２０】
それらの低い表面張力およびそれらの低い粘度のおかげで、皮下針、自動システムまたは液体ジェットインジェクターでみられる細い孔から、非常に容易にそれらを流動させうる。ＰＦＣは優れた電気絶縁物であり、そのため同様の小さな表面静電荷を有する粒子の単分散懸濁物を得ることが容易である。それらは乾燥した、完全に非吸湿性の液体である。これらの非常に低い水分のおかげで懸濁粉末の乾燥性を維持しうるため、配合活性剤の溶解または分解を防げる。それらの独特な溶解性欠如は親水性または疎水性粒子を懸濁する上でそれらを理想的なものにし、最終懸濁物が容器またはデリバリー装置で用いられる事実上すべての物質と適合しうることを意味する。これは、例えば、プランジャーでゴムシールを膨張させることによりシリンジのひどい目詰まりを生じうる油性製剤と対照的である。ＰＦＣはある範囲の密度、蒸気圧および揮発性で得られる（表Ｉ）。それらの高い密度はほとんどの従来の緩衝液中にそれらを沈ませるため、上に浮かぶ水相に溶解している生成物粒子から容易に分離しうる。したがって、これは診断薬のようなインビトロ用途向けとしてそれらの使用を促す。
【００２１】
【発明の具体的な説明】
表Ｉ　一部ＰＦＣの性質

【００２２】
薬剤または生物活性剤のデリバリー用ビヒクルとしてのＰＦＣの使用は、Ｋｉｒｋｌａｎｄ（１９９５）で既に示唆されていた。この特許では、本来安定な市販の香味または発泡性粉末などについて例示するのみであった。ワクチンまたは薬剤のような安定化された生物活性剤については、それはいかなる例も含んでいなかった。更に、活性剤粒子用の懸濁ビヒクルとしてＰＦＣを用いることにより注射用（非経口）製剤を作る可能性を、そこでは考慮していない。非水性ビヒクルとしてＰＦＣを用いて長い貯蔵寿命を有する、本来脆い生体分子の安定処方物を得るために、好ましくは配合活性剤を安定化しうるガラス形成剤を含有するように粒子が処方される。これは、ＰＣＴＷＯ９１／１８０９１で記載されているようなトレハロース、ラクチトール、パラチニットなどを含めた様々な糖類からでも、あるいは更に好ましくは、ＵＫ特許出願９８２０６８９．９で記載されているような他のより有効な単糖の糖アルコールまたはガラス形成剤からでもよい。
【００２３】
高密度ＰＦＣ相に粒子を浮かべないように、粒子に密度調整剤を配合することが有利である。これは、塩化または硫酸ナトリウムまたはカリウムのような可溶性塩でも、あるいは更に好ましくは、硫酸バリウム、リン酸カルシウム、二酸化チタンまたは水酸化アルミニウムのような不溶性物質でもよい。体内で多量のイオン性塩の放出は著しい局所的な痛みおよび刺激を生じうることから、不溶性の無毒性物質が好ましい。不溶性物質は、一部の場合には、例えばワクチン製剤中でも、アジュバントとして活性製剤の一部でありうる。密度調整剤は糖ガラス粒子中の固溶体中でも、または糖ガラス中に懸濁された不溶性粒状物質中にあってもよい。正しく処方されると、糖ガラス粒子はＰＦＣ液体とほぼ密度が一致し、浮力中性であり、浮遊も沈降もせず、ケーキングのない安定な懸濁物のままである。
【００２４】
ＰＦＣ液体は１０^１３オーム．ｃｍ以上の典型的抵抗率を有する良好な電気絶縁物であるため、懸濁粒子のわずかな表面電荷は懸濁安定性上大きな効果を有しうる。弱い短距離力による凝集を懸濁粒子で防ぐために、乾燥粒子へ弱い残留静電荷を付与しうるリジンまたはアスパラギン酸のような賦形剤を好ましくはそれらへ含有させて製造する。安定コロイドでみられる場合と同様に、粒子の電荷反発を確保することにより、これは凝集を防いでいる。一方、少量のＦＨＣ界面活性剤、例えばペルフルオロデカン酸は、分散された、好ましくは単分散の懸濁物を得るために、有利にはＰＦＣへ溶解させてもよい。
【００２５】
これらの粒子は空気、噴霧、または凍結乾燥を含めたいくつかの手法で製造しうるが、特に小さくなくてもよく、直径０．１〜１００μサイズの不均一混合物でもよい。一部の用途では、ミリメーターサイズの粒子でも適する。
【００２６】
これらの安定な懸濁物の使用は、前記のような非経口使用にも、またはＫｉｒｋｌａｎｄ（１９９５）で例示されているような経口使用にも限定されない。ＰＦＣ液体ビヒクルは無毒性で非反応性であるため、それは肺内、鼻内、眼内、直腸内および膣内デリバリーを含めた粘膜用の理想的なビヒクルである。非常に不安定な薬物またはワクチンの粘膜デリバリー用ですら、安定、無菌で無刺激性の処方物を製造しうる、この特許によりもたらされる能力は、著しい進歩である。しかも、微生物が水の不在下で増殖しえないため、ＰＦＣ液体の非常に乾燥した完全に非吸湿性の性質は、長期貯蔵および断続的使用に際して、これら製剤の無菌性の維持に大いに役立つ。
【００２７】
揮発性のペルフルオロヒドロカーボンおよびクロロフルオロカーボンは、肺深部への薬物デリバリーを行うために考えられた吸入器で、噴射剤として長期間にわたり用いられてきたため、ここで記載された安定ＰＦＣ処方物は肺内デリバリー用の液体ＳＴＡＳＩＳ小滴の微細なミストを生成する上で理想的である。この用途の場合、ＰＦＣ小滴で不連続懸濁相を構成する粒子のサイズは重要であり、１〜５μｍ、好ましくは０．１〜１μｍの直径を超えるべきでない。鼻または目で他の粘膜表面へのデリバリーの場合、粒径はさほど重要でなく、直径１００μｍ以内でもまたは数ｍｍでもよい。
【００２８】
図面の説明
図１
アルカリホスファターゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＬｔｄ．）を、マンニトール３３．３％、乳酸カルシウム３３．３％および分解ゼラチン３３．３％（ＢｙｃｏＣ，ＣｒｏｄａＣｏｌｌｏｉｄｓＬｔｄ．）をベースにしたガラス中で安定化させ、微小球として噴霧乾燥させ、乾燥粉末としてまたはペルフルオロデカリン中の安定な懸濁物として５５℃で貯蔵した。活性は約１００％標準のままであった（２０日で１０３％および３０日で９４％）。ＰＦＣに懸濁されていない乾燥粉末の方が大きな損失であった（残存活性約８０％）。
図２
市販の破傷風トキソイドワクチン（ＥｖａｎｓＭｅｄｅｖａｐｌｃにより快く供与された＃Ｔ０２２）を、２０％トレハロース溶液にリン酸カルシウムを加えて用い、密度一致粉末として処方した。２液ノズルを用いて液体窒素中に噴霧することによりそれを凍結乾燥させ、次いで主乾燥中ずっと−４０℃の初期貯蔵温度でＬａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥機で凍結微小球粉末を凍結乾燥させた。塩水緩衝液でまたは油もしくはＰＦＣ中の無水製剤として再調製された、同用量のＡＳＳＩＳＴ安定化破傷風トキソイドワクチンで注射した後、モルモット１０匹の６群の抗体応答を４、８および１２週目に測定した。
すべての乾燥製剤に対する応答は新鮮ワクチンコントロール（示さず）より低く、噴霧乾燥で免疫原性の有意な損失を示した。トキソイドの抗原性は、捕捉ＥＬＩＳＡで測定されるのであるが、乾燥プロセスにより不変であった。これは、乾燥に際して水酸化アルミニウムアジュバントの保存を完全化させる、更なる作業が必要であることを示唆した。
リン酸カルシウムで密度一致化されたＳＴＡＳＩＳワクチン（群３）に対する応答は、水性緩衝液で再調製されたコントロールワクチン（群１）および油中粉末ワクチン（群２）と本質的に同一であり、一方非水性ビヒクルのみで注射されたコントロール動物（群４＆５）は応答を示さなかった。
【００２９】
【実施例】
好ましい態様の説明
例１：
ＰＦＣ中の噴霧乾燥粒子
ＬａｂｐｌａｎｔモデルＳＤ１スプレードライヤーを用いて、糖および他の賦形剤を用いた水溶液から噴霧乾燥することにより、粒子を製造した。典型的処方は次のとおりであった：
Ａ．水中
マンニトール　　　　　１５％ｗ／ｖ
乳酸カルシウム　　　　１５％ｗ／ｖ
Ｂ．水中
トレハロース　　　　　１５％ｗ／ｖ
リン酸カルシウム　　　１５％ｗ／ｖ
【００３０】
内径０．５ｍｍの液体オリフィスを有する２液ノズルを用いて、粒子を製造した。半最大ノズル気流が最良とわかり、乾燥室を１３５℃の入口温度および７０〜７５℃の出口温度で操作した。粒子をガラスサイクロンで集め、４時間にわたる８０℃までの温度傾斜を用いて真空オーブンで二次乾燥に付した。冷却後、超音波を用いて、それらをＰＦＣに懸濁させた。約７５％のパワーで操作するＭＳＥＭＫ２超音波キャビネットでチタンプローブから超音波エネルギーの３０秒間バースト、または１０秒以内におけるＤｅｃｏｎＦＳ２００Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｓｗｅｅｐ超音波浴への浸漬であれば、十分とわかった。
【００３１】
得られた懸濁物は単分散性であり、顕微鏡でみると、大きさが平均約１０μで約０．５〜３０μ範囲の球形ガラス粒子からなっていた。マンニトール／乳酸カルシウム粒子は数分でＰＦＣ層の上に昇ったが、穏やかな振盪で容易に再懸濁させることができた。トレハロース／リン酸カルシウム粒子はＰＦＣとほぼ密度一致しており、安定な懸濁物を形成した。
【００３２】
糖ガラス粒子の噴霧乾燥粉末をペルフルオロヘキサン、ペルフルオロデカリンおよびペルフルオロフェナントレンに１、１０、２０および４０％ｗ／ｖで懸濁した。それらは、凝集傾向のほとんどない単分散懸濁物を生じることがわかった。ＰＦＣへの０．１％ペルフルオロデカン酸の添加は、表面上のわずかな凝集傾向を阻止した。これらの懸濁物は、吸引または射出で２５ｇ針を容易に通過することがわかった。
【００３３】
例２：
ＰＦＣ中ガラス安定化酵素の懸濁物の安定性
アルカリホスファターゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＬｔｄ．）を前記のようにＬａｂｐｌａｎｔで噴霧乾燥させた。その処方物はマンニトール３３．３％ｗ／ｗ、リン酸カルシウム３３．３％ｗ／ｗおよび分解ゼラチン（ＢｙｃｏＣ，ＣｒｏｄａＣｏｌｌｏｉｄｓＬｔｄ．）３３．３％を含有していた。乾燥酵素を乾燥粉末またはペルフルオロデカリン中の懸濁物として５５℃で貯蔵した。ペルフルオロデカリンに懸濁されたマンニトールベースガラスからなるこれらの微小球で処方された酵素は、５５℃で３０日間以上にわたり酵素活性の１００％近い残留を示す（図１）。
【００３４】
例３：
インビボ効力
臨床破傷風トキソイドワクチン（Ｍｅｄｅｖａｐｌｃにより快く供与された）を含有した類似処方物の前臨床試験を、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔａｎｄａｒｄｓａｎｄＣｏｎｔｒｏｌ（世界保健機関の認可研究所）と共同して行った。この試験の結果は、モルモットを免疫して防御血清抗体応答を呈する能力に関して、安定ＳＴＡＳＩＳ製剤が水性液体ワクチンと完全に同等であることを示した（図２）。こうして、従来の水性液体処方物と同様のインビボバイオアベイラビリティで、ＰＦＣ中の懸濁物が直ちに注射可能な処方物を形成していることを証明した。
【００３５】
例４：
噴霧凍結乾燥粒子
液体小滴を液体窒素中へ噴霧してから、凍結粉末を真空乾燥することによっても、粒子を製造した。これらの粒子は噴霧乾燥粉末より低い密度であり、２０％ｗ／ｖより高い濃度ではＰＦＣ中でペーストを形成した。それより低い濃度では、それらは音波処理後に単分散懸濁物を形成した。
用いられた典型的処方物は次のとおりであった：

【００３６】
例５：
粉砕疎水性粒子
疎水性糖誘導体のスクロースオクタアセテートおよびトレハロースオクタアセテートは、融解物から急冷されたとき、あるいはクロロホルムまたはジクロロメタンの溶液から速やかに乾燥されたときに、ガラスを直ちに形成する。それらの使用は薬物デリバリー用の制御放出マトリックスとして記載されている（Ｒｏｓｅｒｅｔａｌ ”Ｓｏｌｉｄｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒｅｌｅａｓｅｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｔｈｅｒｅｉｎａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｏｆｍａｋｉｎｇｓａｍｅ”（配合された分子の制御放出用の固形デリバリーシステムおよびその製造方法）ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０３９７８，１９９４）。
【００３７】
マッフル炉で融解させて、ステンレス鋼プレート上でその融解物を急冷することにより、トレハロースオクタアセテート粉末を得た。得られたガラスディスクを乳棒および乳鉢、次いで高速ホモゲナイザーで砕き、微粉末を得た。これをペルフルオロヘキサン、ペルフルオロデカリンおよびペルフルオロフェナントレンに１および１０％ｗ／ｖで懸濁した。それらはよく分散された懸濁物を生じることがわかった。これらの懸濁物は２３ｇ針を容易に通過することがわかった。
【００３８】
例６：
水性環境での再調製
安定な糖ガラス粒子の性質およびＰＦＣの特性のおかげで、これら懸濁物中の活性剤は体内で急速に放出されるだろうと予想された。含有活性物質の完全な放出を証明するために、下記を含有した粒子を処方した：
トレハロース　　　　　　　　　２０％ｗ／ｖ
乳酸カルシウム　　　　　　　　２０％ｗ／ｖ
リジン　　　　　　　　　　　　　０．５％ｗ／ｖ
ＭｏｒｄａｎｔＢｌｕｅ９色素　　　　　　１％ｗ／ｖ
【００３９】
処方物を前記のように噴霧乾燥させ、ペルフルオロフェナントレンおよびペルフルオロデカリンへ加えて、２０％ｗ／ｖ暗青色不透明懸濁物を調製した。その懸濁物へ等容量の水を加えて、振盪したところ、事実上すべての青色色素が水相中に放出されて、境界が明瞭な界面で、ほぼ無色のＰＦＣ上に浮かぶ澄んだ青色の層を形成することがわかった。
【００４０】
例７：
懸濁物中粒子間で無反応
ＰＦＣ懸濁物中で個別微小球は他のすべての粒子から物理的に離されているため、潜在的に反応性の物質は、それらが相互作用するいかなる危険性もなく、同一懸濁物中に別々な粒子として一緒に存在しうる。糖ガラスが溶解して、分子が一緒になると、反応が生じる。
これを証明するために、（ａ）　１つはアルカリホスファターゼ酵素で、（ｂ）　他はその無色基質、ｐ‐ニトロフェニルリン酸で、２タイプの粒子を含有した懸濁物を調製した。
【００４１】
処方は次のとおりであった：
ａ）ｐＨ７．６の５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液中
トレハロース　　　　　　　　　１０％ｗ／ｖ
硫酸ナトリウム　　　　　　　　１０％ｗ／ｖ
アルカリホスファターゼ　　　　２０Ｕ／ｍｌ
ｂ）各々１ｍＭの塩化Ｚｎ ^＋＋およびＭｇ ^＋＋を含有したｐＨ１０．２の１００ｍＭグリシン緩衝液中
トレハロース　　　　　　　　　１０％ｗ／ｖ
硫酸ナトリウム　　　　　　　　１０％ｗ／ｖ
ｐ‐ニトロフェニルリン酸　　　　０．４４％ｗ／ｖ
【００４２】
１０％ｗ／ｖの粉末“ａ”および１０％ｗ／ｖの粉末“ｂ”を含有したペルフルオロデカリン中粉末の懸濁物は、いかなる発色反応も生ぜず、３７℃で３週間にわたり白色懸濁物のままであることがわかった。
水の添加および振盪後に、粉末は上部の水相に溶解した。酵素反応が数分で生じ、調製したばかりのサンプルおよび３７℃で３週間にわたり保たれたものの双方において、ｐ‐ニトロフェノールの濃黄色を呈した。
【００４３】
例８：
“組織間隙”モデルにおける生成物放出
インビボで注射されたときに、ＰＦＣ懸濁物で生じうる動態を明らかにするために、ポリスチレン製装飾ボトルに０．２％アガロースゲルを入れることにより、透明水和組織間隙モデルを作製した。例５のペルフルオロデカリン懸濁物０．１ｍｌをアガロースゲル中へ２５ｇ針から注入した。これは懸濁物の扁平化した白色球体を生じた。その後５〜１０分間にわたり、白色は球体の底から上方へ消えて、ＰＦＣの透明球体を残留させた。酵素および基質がガラス粒子の溶解により放出されると、それらは一緒に反応して、ｐ‐ニトロフェノールの黄色を生じ、その後１時間かけてアガロース全体に拡散した。
【００４４】
例９：
密度一致：
従来の乾燥法のいずれかで得られる糖ガラス粒子（即ち、トレハロース）は、約１．５ｇ／ｃｍ^３の典型的密度を示す。我々が試験したペルフルオロカーボンは、典型的には１．６８〜２．０３ｇ／ｃｍ^３の密度を有する（表Ｉ）。この理由から、懸濁物中へ処方されたときに、糖ガラス粒子はＰＦＣ層に浮かびやすく、活性剤が均一に分布していない製剤をもたらす。しかしながら、粉末が中性浮力を有し、沈降も浮遊もしない、安定な懸濁物をＰＦＣ中で生じるように、それらは改変してもよい。これは粒子形成前に高密度物質の添加で達成しうる。これらは水溶性でもまたは不溶性でもよい。
【００４５】
非水溶性物質
オルトリン酸三カルシウムは３．１４ｇ／ｃｍ^３の密度を有し、ワクチン用のアジュバントとして承認され、実際上水に不溶性である。約５０％リン酸カルシウムを含有するように調製された粉末は、約２ｇ／ｃｍ^３の増加密度を示して、２０％固形分のときにペルフルオロフェナントレン中で安定な懸濁物を形成する。
【００４６】
ＰＦＣ中２０％固形分で安定な懸濁物を形成する粉末の例には、次のものがある：
１　ペルフルオロデカリン中

２　ペルフルオロフェナントレン中

【００４７】
用いられてきた他の密度増加非水溶性物質には、硫酸バリウムおよび二酸化チタンがある。いかなる無毒性で不溶性の物質も、適切な密度であれば用いうる。
【００４８】
水溶性物質
密度２．７ｇ／ｃｍ^３の硫酸ナトリウムのような可溶性塩も密度増加剤として用いてよい。下記の粉末は、ペルフルオロデカリン中で安定な懸濁物を形成した：

他の無毒性高密度水溶性物質も用いてよい。おそらく高濃度のイオン性塩の急激な溶解のせいで、これらの処方物はモルモットで皮下注射後に不快感を生じることがわかった。
【００４９】
例１０：
懸濁物中活性剤で密度一致の効果
あるワクチンは、アジュバントとして働く不溶性ゲルまたは粒子へ吸着させて処方される。水酸化アルミニウムおよびリン酸カルシウムがこの目的のために広く用いられている。これらの不溶性アジュバントは、それ自体、懸濁される粒子の密度を増加させるために用いうる。この場合に、高密度物質は完全には不活性でなく、実際上溶液から活性高分子を吸着する。この吸着が活性剤を変性させないことを証明することが必要である。これを試験するために、アルカリホスファターゼを活性剤／ワクチンモデルとして用いた。
【００５０】
下記の溶液を調製した：
ｐＨ７．６の５ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液中
アジュバントグレードリン酸カルシウム　　１０％ｗ／ｖ　（ＳｕｐｅｒｐｈｏｓＫｅｍｉａ／ｓ）
トレハロース　　　　　　　　　　　　　　１０％ｗ／ｖ
ＺｎＣｌ_２　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭ
ＭｇＣｌ_２　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭ
アルカリホスファターゼ　　　　　　　　　２０Ｕ／ｍｌ
【００５１】
溶液を３７℃で１０分間にわたりよく混合して、リン酸カルシウムによりアルカリホスファターゼを吸着させた。リン酸カルシウムを遠心し、上澄をサンプリングし、基質としてｐ‐ニトロフェニルリン酸を用い４０５ｎｍの波長でその酵素反応速度を測定することにより、１分間当たりのこの吸収変化を測定した。溶液を噴霧乾燥して、微粉末を製造した。酵素の脱着を、粉末の再水和後に、上記のような上澄で測定した。その粉末は、ペルフルオロフェナントレン中に２０％ｗ／ｖで懸濁させると、安定な懸濁物を形成することがわかった。
【００５２】

【００５３】
実験では次のことを証明している：
粒子の密度は、リン酸カルシウムアジュバントの含有により、ＰＦＣビヒクルの場合と一致させうる。
酵素活性の有意な脱着または損失は処方プロセス中に生じていない。
【００５４】
例１１：
例１のようなマンニトールベースガラスのＳＴＡＳＩＳ製剤をペルフルオロデカリン中に懸濁させ、オキシメタゾリン鼻鬱血除去剤（Ｓｕｄａｆｅｄ，ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）をデリバリーするために臨床で常用されている、外科的に清潔で、ポンプ式の、ポリプロピレンアトマイザー中へ入れた。ヒトボランティアの各鼻孔中へその懸濁物を２回スプレーして、彼らに感じた不快感の程度について質問した。ボランティアは全く不快感を訴えなかった。投与の副作用は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
アルカリホスファターゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＬｔｄ．）を、マンニトール３３．３％、乳酸カルシウム３３．３％および分解ゼラチン３３．３％（ＢｙｃｏＣ，ＣｒｏｄａＣｏｌｌｏｉｄｓＬｔｄ．）をベースにしたガラス中で安定化させ、微小球として噴霧乾燥させ、乾燥粉末としてまたはペルフルオロデカリン中の安定な懸濁物として５５℃で貯蔵した。活性は約１００％標準のままであった（２０日で１０３％および３０日で９４％）。ＰＦＣに懸濁されていない乾燥粉末の方が大きな損失であった（残存活性約８０％）。
【図２】
市販の破傷風トキソイドワクチン（ＥｖａｎｓＭｅｄｅｖａｐｌｃにより快く供与された＃Ｔ０２２）を、２０％トレハロース溶液にリン酸カルシウムを加えて用い、密度一致粉末として処方した。２液ノズルを用いて液体窒素中に噴霧することによりそれを凍結乾燥させ、次いで主乾燥中ずっと−４０℃の初期貯蔵温度でＬａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥機で凍結微小球粉末を凍結乾燥させた。塩水緩衝液でまたは油もしくはＰＦＣ中の無水製剤として再調製された、同用量のＡＳＳＩＳＴ安定化破傷風トキソイドワクチンで注射した後、モルモット１０匹の６群の抗体応答を４、８および１２週目に測定した。
すべての乾燥製剤に対する応答は新鮮ワクチンコントロール（示さず）より低く、噴霧乾燥で免疫原性の有意な損失を示した。トキソイドの抗原性は、捕捉ＥＬＩＳＡで測定されるのであるが、乾燥プロセスにより不変であった。これは、乾燥に際して水酸化アルミニウムアジュバントの保存を完全化させる、更なる作業が必要であることを示唆した。
リン酸カルシウムで密度一致化されたＳＴＡＳＩＳワクチン（群３）に対する応答は、水性緩衝液で再調製されたコントロールワクチン（群１）および油中粉末ワクチン（群２）と本質的に同一であり、一方非水性ビヒクルのみで注射されたコントロール動物（群４＆５）は応答を示さなかった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Vaccines or drugs in injectable solutions are inherently unstable and require cooling. The pharmaceutical industry has long addressed the instability problem by freeze-drying drugs. This is expensive, inconvenient, and inherently dangerous because incorrect reconstitution of the dry drug can result in the wrong dose or contaminating solution. Many attempts to develop robust, stable, ready-to-inject liquid formulations have been unsuccessful over the last 100 years. Only drugs that are naturally strong and small molecules can remain in aqueous solution with a useful shelf life.
[0002]
This problem is particularly acute in the vaccine industry. It is estimated that by 2005, 3.6 billion doses of vaccine will have to be administered worldwide. This was not possible using a standard vaccine format that required constant cooling (WHO) ("Revolutionizing Immunizations" (Revolutionary Immunization) Joda L., Aguado T., Lloyd). J. and Lambert PH, Genetic Engineering News, Feb 15 1998). In the developing world, a "cold chain" of chillers running from vaccine factories to rural towns is currently in use. The cost of cold chains is enormous for the vaccine industry and non-governmental health organizations that are running immunization campaigns. WHO estimates that the cost of maintaining a cold chain alone will exceed $ 200 million annually. In addition, the immunization campaign may only reach those living near the end links of the cold chain.
[0003]
Vaccination campaigns require medical staff to ensure that a given dose is injected correctly and does not show any signs of degradation. The need to reconstitute some vaccines such as measles, yellow fever and BCG is also a significant concern in the art. This must be done accurately to ensure the correct dosage and can be a source of contamination that has often led to clinical catastrophe. In addition, it is often necessary to vaccinate more than once during a given time period, and this may not be possible if a particular mixture or "multivalent" vaccine is not available due to some component chemical incompatibility. May require multiple injections. The WHO emphasizes these issues by encouraging the study of next-generation stable vaccines that do not require cooling and do not require reconstitution ("Pre-Filled Monodose Injection Devices: A safety standard"). for new vaccines, or a revolution in the delivery of immunizations? "(Pre-filled single dose injection device: a safety standard for new vaccines or a revolution in immune delivery) Lloyd J. and Aguado M.T. General policy issues: injectable solid vaccines: a role in future immunization? "(General policy issue: solid vaccine for injection: role in future immunity) Aguado MT, Jodar L., Lloyd J., Lambert PH WHO publication No A59781).
[0004]
The ideal solution for this problem would be a completely stable and ready-to-inject formulation. Such stable vaccines are placed into the injection device itself as individual doses, or are shipped in large quantities and administered by needle-free jet injectors for large-scale immunization campaigns. Transdermal delivery of dry solids by gas jet injection is described (Sarphie DF, Burkoth TL., Method for providing dense particles composites for use in transdermal delivery of high-density particles of transdermal delivery particles. Methods) PCT publication WO97448485 (1996)), transdermal inoculation with a dry DNA vaccine appears to be very effective ("PowderJect's Hepatitis B DNA Vaccine First To Successful Emulsions Protection in Human Protection Essential Human Invasiveness Human Protection Essentials"). The first P that successfully induces an immune response wderJect of hepatitis B DNA vaccine) http://www.powderject.com/pressreleases.htm (1998)).
[0005]
The hypersonic shock wave of helium gas used to operate these powder injectors has limited power and cannot deliver that amount of fine particles into muscle. This is because the low-mass particles cannot reach moderate momentum as they penetrate deeply. While intradermal delivery of DNA vaccines coated with colloidal gold particles is suitable for good immunogenicity, common vaccines adjuvanted with insoluble aluminum or calcium salts produce unacceptable skin irritation. They must be administered intramuscularly. What is needed is a flexible system that can reach a range of delivery depths from intradermal to deep into the muscle, similar to those that can be achieved with current needle and syringe technology. For large-scale vaccination campaigns, this is about 3000 psi (about 210 kg / cm²This was solved by the development of a liquid jet injector capable of accelerating a small (〜0.15 mm diameter) liquid stream into a “liquid nail” using the pressure of (1). This device painlessly delivers its volume from the skin into the deep subcutaneous or muscle tissue by making a small hole in the epidermis. It can penetrate deeply due to the high momentum transmitted to the liquid stream. To date, infused drugs and vaccines have been water-based, but because of the instability problem described above, the range of stable aqueous products that can take advantage of this technology is very limited.
[0006]
It is now recognized that a wide range of biologically active molecules can be stabilized by drying in sugar glass (Roser B. "Protection of proteins and the like"), UK Patent 2,187,191. Roser B and Colaco C. "Stabilization of biological macromolecular substrates and other organic compounds" (stabilization of biopolymers and other organic compounds) PCT published WO 91 / 180Sen. New stabilized glass) PCT Patent Application No. 9805699.7, 1998). These dry stabilizing activators are not affected by hostile environments such as high temperatures and ionizing radiation.
[0007]
The mechanism by which sugars cause significant stabilization of the molecule is the glass transition. When the sugar solution containing the active molecule is dried, it crystallizes when it reaches the solubility limit of the sugar or becomes a supersaturated syrup. The ability of a sugar to resist crystallization is an important property of a good stabilizer. Trehalose is excellent in this regard (Green JL. & Angel CA., Phase relations and vitrification in saccharide water solutions and the trehalose anomaly in the aqueous sugar solution and in the presence of trehalose anomaly in sugar aqueous solution). .93, 2880-2882 (1989)). Upon further drying, the syrup gradually solidifies, which turns into glass with low residual moisture. At some point, the active molecules change from a solution in water to a solid solution in dry sugar glass. Chemical diffusion is negligible in the glass, so the chemical reaction virtually stops. Since denaturation is a chemical change, it cannot occur in glass and the molecule is stabilized. In this form, the molecule remains unchanged if another condition is met. This is the second important property of a good stabilizer, that is, it is chemically inert and non-reactive. Many glasses have failed because they react with the product during storage. An obvious problem arises with reducing sugars, which form good physical glasses, but their aldehyde groups attack the amino groups of the product in a typical Maillard reaction. This is the main reason that many freeze-dried drugs require refrigerated storage. Non-reactive sugars give a stable product requiring no cooling at all.
[0008]
Biomolecules immobilized in sugar glass are also stable in non-aqueous industrial solvents in which both themselves and the sugar are insoluble (Cleland JL. And Jones AJS. “Excipient stabilization of polypropylenes with organic solvents”). Excipient stabilization of polypeptides treated with US Pat. No. 5,589,167 (1994)). Because sugar glass acts as an impermeable barrier in non-solvent liquids, solid solution biomolecules in the glass are protected from both solvent chemical reactions and the environment. If the liquid itself is stable, the susceptible product in the suspended glass particles will form a stable two-phase liquid formulation. Industrial solvents of the type described by Cleland and Jones (1994) have limited utility in handling. As an alternative to biocompatible non-aqueous liquids, even the most unstable drugs, vaccines and diagnostics could be formulated as stable liquid formulations.
[0009]
First generation stable non-aqueous liquids were considered for drug or vaccine delivery (BJ Roser and SD Sen "Stable particles in liquid formulations" (stable particles in liquid formulations)). PCT patent application GB98 / 00817 describes the formulation of a stabilized glass powder containing an active agent suspended in an injection oil such as sesame, peanut or soybean oil or a simple ester such as ethyl oleate. Was. Suspended sugar glass particles are very hydrophilic, while oils are hydrophobic. Due to the strong tendency of the hydrophilic and hydrophobic phases to separate easily, the sugar glass particles tended to aggregate together. In order to stabilize such "water-in-oil" suspensions, the use of oil-soluble surfactants dissolved in the continuous oil phase has often been required.
[0010]
These low HLB (hydrophilic / lipophilic balance) surfactants concentrate at the interface between the hydrophilic particles and the oil and coat them with an amphiphilic layer that is more compatible with the continuous oil phase. Since each sugar glass particle is separated from its neighbors by dry oil, no chemical interaction occurs between the particles. Thus, it is possible to have several different groups of particles without each interacting, even though each may contain different molecules that can potentially interact in the same oil formulation. Complex multivalent vaccines can thus be produced.
[0011]
However, this approach has been found to have certain drawbacks that prevent it from being a universal solution. These include about 1.5 g / cm in a less dense oily vehicle.³There is inevitable sedimentation of suspended particles with a typical density of The patent recognizes this problem and attempts to solve it by reducing the particle size to less than 1 μm in diameter in order to keep them suspended by thermodynamic forces such as Brownian motion. The requirement that all particles be 1 μm or less in diameter is a disadvantage of the proposed formulation. Obtaining such small particle powders is not an easy task. This can be achieved with an improved spray dryer design, but small particle sizes hinder the use of cyclone-type collectors and require a system of product recovery filters.
[0012]
Reducing particles to sub-micron size can also be achieved theoretically if the particles are suspended in oil with a high-pressure microhomogenizer such as a Microfluidizer (Constant Systems Inc.). This adds an extra step to the process and we have found that it is not very efficient in breaking up spray-dried sugar glass microspheres that have very high mechanical strength due to the sphere. This forces multiple passes through the device. Nevertheless, this tends to leave many large particles untouched, thus requiring a later filtration or sedimentation step to remove them. Moreover, the high viscosity of the suspensions in normal oily vehicles makes it difficult to draw them into syringes and requires them to be injected slowly. It prevents fast flow through narrow nozzles, as found in liquid jet injector systems.
[0013]
It has also been found that particles suspended in oils make it difficult to extract them later into an aqueous environment, especially when they contain low HLB surfactants, because, unexpectedly, aqueous buffers Even after washing, they maintain a tightly bound oil waterproof coat around them. Therefore, they require very vigorous shaking and mixing or addition of a more water-soluble detergent (here high HLB) for the particles to leave the oil phase and enter the aqueous phase. This becomes a major problem as the particle size decreases. The end result is often an opaquely mixed emulsion, rather than two distinct phases. Within the body, this problem can result in a slow and unpredictable release of the active agent, rather than the required quick and predictable delivery. In vitro extraction into an aqueous environment causes the oil to float above the aqueous phase containing the dissolved active. This is unacceptable for certain in vitro applications such as diagnostic kits or automated assay systems. Finally, most of the clinically available natural FDA approved oils are susceptible to photolysis, oxidation or other forms of damage and require careful storage in the dark at relatively low temperatures. In addition, since they are not completely chemically inert, they can react slowly with suspended particles.
[0014]
The Alliance Pharmaceutical Company has investigated the use of powders of water-soluble substances in remarkable new non-aqueous perfluorocarbon liquids (Kirkland WD, Composition and method for delivering active agents and activator composition delivery agents). US Patent 5,770,181 (1995)). This patent relates primarily to the function of PFC as an oral contrast enhancer for diagnostic imaging of the intestine. The exemplified water-soluble powders were added to improve the mouthfeel of the PFC or to enhance the contrast effect in the gastrointestinal tract. However, although no specific examples are given, Kirkland recognized that these liquids could also be used for drug delivery. In particular, only storage-stable commercial powders are exemplified in that patent. We have now discovered that brittle actives stabilized with sugar glass microspheres can be engineered to yield highly stable two-phase PFC liquid formulations for both oral and parenteral delivery. This broadly extends the utility of Kirkland's patent to the delivery of parenteral drugs and vaccines as ready-to-injectable formulations without the need for any kind of cooling. The finding that the low viscosity, high density and low surface tension of PFCs means that these stable suspensions are delivered by automated equipment such as liquid jet injectors is particularly beneficial. This opens up two important additional areas to this technology: large-scale immunization campaigns and self-injection.
[0015]
Perfluorocarbons (PFCs) are new, extremely stable liquids produced by the perfluorination of certain organic compounds. Because they are essentially immiscible with both oil and water or other solvents, either polar or non-polar (except for other PFCs), they are classified as either hydrophilic or lipophilic. (Reviewed in Kraft MP & Riess JG. "Highly fluorinated amphiphiles and colloidal systems, and their applications in the field of fluorinated biochemicals and biochemicals in the field of fluorinated biochemicals and biochemicals in the field of fluoridation" Applications and Contributions) Biochimie, 80, 489-514, 1998). Furthermore, they do not participate in hydrophobic interactions with oils or in hydrophilic interactions with water or hydrophilic substances. As a result, the large phase separation seen when the hydrophilic particles aggregate together strongly in the oil is less likely to occur with PFC. They do not require surfactants to form stable suspensions, but fluorohydrocarbon (FHC) surfactants are available (Krafft & Riess, 1998) and at very low concentrations in PFC liquids. Active. At these very low concentrations, FHC surfactants can ensure a complete monodisperse of certain particles that tend to agglomerate in their absence. The PFC liquid itself is completely non-reactive chemically, does not accumulate in the body in low molecular weight types, is volatile, and is eventually exhaled with breath.
[0016]
Because they are good solvents for gases, PFCs have already been used in large quantities in very special clinical applications. Their ability to exchange carbon dioxide for dissolved oxygen is better than for hemoglobin. This was in 1968 P. First demonstrated by Geyer in "bloodless rats" (Geyer RP, Monroe RG & Taylor K. "Survival of rats totally perforated with perfluorocarbon-detergent preparations with perfluorocarbon-detergent preparations. Survival of rats) Organ Perfusion and Preservation, JV Norman, J Folkman, LE Hardison, LE Ridolf and FJ Veith eds. Appleton-Centry-New York, New York-85 1968)). Perfluorooctyl bromide is in the form of a PFC-in-water emulsion, trade name Oxygent^TM(Alliance Pharmaceutical Corp.) is currently being evaluated in humans as a replacement for certain surgical blood transfusions. PFC has also been used as a liquid by inhalation into the lungs for the treatment of respiratory distress syndrome in premature babies.
[0017]
Their high density, along with chemical inertness, has also proven valuable. Product name Vitreon^TM(Vitrophage Inc.) perfluorophenanthrene is used to prevent eye capsule collapse during surgery and to repair detached retinas. PFCs are also used as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI), for which purpose hydrophilic powders are suspended in them to improve their imageability or make them more palatable. (Kirkland WD, "Composition and method for delivering active agents", US Pat. No. 5,770,181 (1998)). This patent also suggests the use of PFC as a continuous phase for delivery of particulate water-soluble drugs. Due to the limited number of parenteral drugs that are stable as dry powders at room temperature, this patent has no applicability to most injectable drugs. However, the combination of drug stability in sugar glass microsphere powders with injectable PFCs as described in Roser and Garcia de Castro (1998) applies this technology to virtually all parenteral drugs and vaccines. Can.
[0018]
[Summary of the invention]
The present invention uses a two-phase system comprising PFC as a continuous phase containing a discontinuous glass phase in suspension as a drug delivery formulation. Density about 1.5-2.5g / cm³The perfluorocarbon based formulation offers the great advantage that different PFCs can be mixed to obtain a final mixture of Thus, the particles may be formulated at a density consistent with the suspending fluid such that the particles remain in a stable suspension without floating or sinking to the bottom of the container. Thus, the particles need not be of submicron size as required in oily formulations to prevent sedimentation, and can vary greatly in size. The ultimate particle size is determined solely by the purpose of the formulation. Formulations for needle or jet injection contain particles in the range of 0.1 to 100 micrometers, preferably 1 to 10 micrometers. This greatly simplifies the process of producing the particles and avoids the need for very small particle sizes due to grinding. The particles may be made by conventional spray-drying or freeze-drying, followed by simple dry or wet milling. When high solids are required in the suspension, the particles are preferably spherical in shape. Irregularly shaped particles have a fairly large tendency to "bind" together to impede free flowing, whereas spherical particles have an inherent "smoothness" and thus have a solids content well over 20%. Can be reached. Such particles are easily made by spray drying, spray freeze drying or emulsion solidification.
[0019]
The suspension powder, if formulated properly, does not require a surfactant and forms a stable suspension in which the sugar glass particles dissolve almost immediately when shaken with water. If small agglomeration appears to be a problem, small amounts of FHC surfactants as described in Kraftt and Riess (1998) can be advantageously added to the PFC solution before or after mixing the stable powder. Like PFCs, these FHCs are inherently very inert and non-reactive. Therefore, there is no solvation of the particles and there is no chemical reaction between the suspended particles and the PFC phase. Since both the sugar glass particles and the PFC liquid are environmentally stable, they are not decomposed by light, high temperature, oxygen or the like. They have only negligible in vivo or in vitro toxicity, and have been extensively tested and approved by formal agencies on large scale infusions into both animals and humans for blood exchange purposes. Although high molecular weight PFCs have been reported to accumulate in the liver, the low molecular weight example used in this application is exhaled and eventually excreted from the body.
[0020]
Thanks to their low surface tension and their low viscosity, they can flow very easily from the small holes found in hypodermic needles, automatic systems or liquid jet injectors. PFC is an excellent electrical insulator, so it is easy to obtain a monodispersed suspension of particles with similar small surface electrostatic charges. They are dry, completely non-hygroscopic liquids. Thanks to these very low water contents, the dryness of the suspended powder can be maintained, thus preventing dissolution or decomposition of the formulated active agent. Their unique lack of solubility makes them ideal for suspending hydrophilic or hydrophobic particles, and the final suspension is compatible with virtually any substance used in containers or delivery devices Means This is in contrast to oily formulations, for example, which can cause severe clogging of the syringe by inflating the rubber seal with a plunger. PFCs are obtained in a range of densities, vapor pressures and volatility (Table I). Their high density allows them to sink in most conventional buffers, so that they can be easily separated from the product particles dissolved in the overlying aqueous phase. Thus, this facilitates their use for in vitro applications such as diagnostics.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Table I Properties of some PFCs

[0022]
The use of PFC as a vehicle for the delivery of drugs or bioactive agents was already suggested in Kirkland (1995). This patent merely exemplifies a commercially available flavor or effervescent powder which is inherently stable. For stabilized bioactive agents such as vaccines or drugs, it did not include any examples. Furthermore, the possibility of making injectable (parenteral) formulations by using PFC as a suspending vehicle for the active agent particles is not considered therein. To obtain a stable formulation of an inherently brittle biomolecule with long shelf life using PFC as a non-aqueous vehicle, the particles are preferably formulated to contain a glass former that can stabilize the formulated active. This may be from a variety of sugars, including trehalose, lactitol, palatinit, etc., as described in PCT WO 91/18091, or more preferably, from other sugars, such as those described in UK patent application 98206899.9. It may be from an effective monosaccharide sugar alcohol or a glass former.
[0023]
It is advantageous to incorporate a density modifier into the particles so that the particles do not float in the high-density PFC phase. This can be a soluble salt, such as sodium or potassium chloride or sulfate, or more preferably, an insoluble material such as barium sulfate, calcium phosphate, titanium dioxide or aluminum hydroxide. Insoluble non-toxic substances are preferred since the release of large amounts of ionic salts in the body can cause significant local pain and irritation. The insoluble substance may in some cases be part of the active formulation as an adjuvant, for example in a vaccine formulation. The density modifier may be in a solid solution in the sugar glass particles or in an insoluble particulate material suspended in the sugar glass. When properly formulated, the sugar glass particles are approximately density-matched to the PFC liquid, are buoyant-neutral, do not float or settle, and remain a stable suspension without caking.
[0024]
PFC liquid is 10^ThirteenOhm. A small surface charge of the suspended particles can have a significant effect on suspension stability, as it is a good electrical insulator with a typical resistivity of at least cm. In order to prevent agglomeration due to weak short-range forces in the suspended particles, they are preferably made to contain excipients such as lysine or aspartic acid which can impart a weak residual electrostatic charge to the dried particles. This prevents aggregation, as is the case with stable colloids, by ensuring charge repulsion of the particles. On the other hand, small amounts of FHC surfactants, such as perfluorodecanoic acid, may advantageously be dissolved in the PFC to obtain a dispersed, preferably monodispersed, suspension.
[0025]
These particles may be produced by several techniques, including air, spray, or lyophilization, but need not be particularly small, and may be a heterogeneous mixture with a size of 0.1-100 μm in diameter. For some applications, millimeter-sized particles are also suitable.
[0026]
The use of these stable suspensions is not limited to parenteral use as described above, or to oral use as exemplified in Kirkland (1995). Because the PFC liquid vehicle is non-toxic and non-reactive, it is an ideal vehicle for mucous membranes, including pulmonary, nasal, ocular, rectal and vaginal delivery. The ability afforded by this patent to produce stable, sterile, non-irritating formulations, even for mucosal delivery of highly unstable drugs or vaccines, is a significant advance. Moreover, the very dry and completely non-hygroscopic nature of PFC liquids greatly aids in maintaining the sterility of these formulations during long-term storage and intermittent use, as microorganisms cannot grow in the absence of water.
[0027]
Because volatile perfluorohydrocarbons and chlorofluorocarbons have long been used as propellants in inhalers, which have been considered for delivering drugs to the deep lung, the stable PFC formulations described here have Ideal for generating fine mist of liquid STASIS droplets for internal delivery. For this application, the size of the particles that make up the discontinuous suspension phase with the PFC droplets is important and should not exceed a diameter of 1-5 μm, preferably 0.1-1 μm. For delivery to other mucosal surfaces by nose or eye, the particle size is not critical and may be within 100 μm in diameter or several mm.
[0028]
Description of the drawings
FIG.
Alkaline phosphatase (Sigma Aldrich Ltd.) was stabilized in a glass based on 33.3% mannitol, 33.3% calcium lactate and 33.3% degraded gelatin (Byco C, Croda Colloids Ltd.) and micronized. Spray dried as spheres and stored at 55 ° C. as a dry powder or as a stable suspension in perfluorodecalin. Activity remained at approximately 100% standard (103% at 20 days and 94% at 30 days). The dry powder not suspended in the PFC had a greater loss (about 80% residual activity).
FIG.
A commercially available tetanus toxoid vaccine (# T022, kindly provided by Evans Medeva plc) was formulated as a density matched powder using a 20% trehalose solution plus calcium phosphate. It was lyophilized by spraying into liquid nitrogen using a two-part nozzle, and then the frozen microsphere powder was lyophilized on a Labconco lyophilizer at an initial storage temperature of -40 ° C throughout the main drying. After injection with the same dose of ASSIST-stabilized tetanus toxoid vaccine, reconstituted in saline buffer or as an anhydrous formulation in oil or PFC, the antibody response of 6 groups of 10 guinea pigs at 4, 8, and 12 weeks It was measured.
The response to all dried formulations was lower than the fresh vaccine control (not shown) and showed a significant loss of immunogenicity upon spray drying. The antigenicity of the toxoid, measured by a capture ELISA, was unchanged by the drying process. This indicated that further work was required to complete the storage of the aluminum hydroxide adjuvant upon drying.
The response to the STASIS vaccine densified with calcium phosphate (Group 3) is essentially identical to the control vaccine (Group 1) and the powder-in-oil vaccine (Group 2) reconstituted in aqueous buffer, while Control animals (Groups 4 & 5) injected with aqueous vehicle only showed no response.
[0029]
【Example】
Description of the preferred embodiment
Example 1:
Spray-dried particles in PFC
Particles were prepared by spray drying from an aqueous solution with sugar and other excipients using a Labplant model SD1 spray dryer. A typical formulation was as follows:
A. Underwater
Mannitol @ 15% w / v
Calcium lactate @ 15% w / v
B. Underwater
Trehalose @ 15% w / v
Calcium phosphate 15% w / v
[0030]
Particles were produced using a two-liquid nozzle with a liquid orifice having an inner diameter of 0.5 mm. The half-maximum nozzle airflow was found to be best and the drying chamber was operated at 135 ° C inlet temperature and 70-75 ° C outlet temperature. The particles were collected in a glass cyclone and subjected to secondary drying in a vacuum oven using a temperature ramp to 80 ° C over 4 hours. After cooling, they were suspended in PFC using ultrasound. A 30 second burst of ultrasonic energy from a titanium probe in a MSE MK2 ultrasonic cabinet operating at about 75% power, or immersion in a Decon FS200 Frequency sweep ultrasonic bath within 10 seconds, has proven satisfactory.
[0031]
The resulting suspension was monodisperse and, when viewed microscopically, consisted of spherical glass particles with an average size of about 10μ and a range of about 0.5-30μ. The mannitol / calcium lactate particles rose over the PFC layer in a few minutes, but could be easily resuspended with gentle shaking. The trehalose / calcium phosphate particles were nearly density-matched to the PFC and formed a stable suspension.
[0032]
The spray-dried powder of sugar glass particles was suspended in perfluorohexane, perfluorodecalin and perfluorophenanthrene at 1, 10, 20 and 40% w / v. They were found to produce monodisperse suspensions with little tendency to agglomerate. Addition of 0.1% perfluorodecanoic acid to the PFC prevented a slight tendency to aggregate on the surface. These suspensions were found to easily pass through a 25 g needle by suction or injection.
[0033]
Example 2:
Stability of suspensions of glass-stabilized enzymes in PFC
Alkaline phosphatase (Sigma Aldrich Ltd.) was spray dried on a Labplant as described above. The formulation contained mannitol 33.3% w / w, calcium phosphate 33.3% w / w and degraded gelatin (Byco C, Croda Colloids Ltd.) 33.3%. The dried enzyme was stored at 55 ° C. as a dry powder or suspension in perfluorodecalin. Enzymes formulated with these microspheres, consisting of mannitol-based glass suspended in perfluorodecalin, show nearly 100% residual enzyme activity over 55 days at 55 ° C. (FIG. 1).
[0034]
Example 3:
In vivo efficacy
Preclinical studies of a similar formulation containing a clinical tetanus toxoid vaccine (kindly provided by Medeva plc) were conducted in collaboration with the National Institute of Biological standards and Control (a licensed laboratory of the World Health Organization). The results of this study showed that the stable STASIS formulation was completely equivalent to the aqueous liquid vaccine in its ability to immunize guinea pigs to develop a protective serum antibody response (FIG. 2). Thus, with in vivo bioavailability similar to conventional aqueous liquid formulations, it was demonstrated that the suspension in PFC was immediately forming an injectable formulation.
[0035]
Example 4:
Spray freeze-dried particles
Particles were also produced by spraying liquid droplets into liquid nitrogen and then vacuum drying the frozen powder. These particles were of lower density than the spray-dried powder and formed a paste in PFC at concentrations higher than 20% w / v. At lower concentrations, they formed a monodispersed suspension after sonication.
The typical formulation used was as follows:

[0036]
Example 5:
Crushed hydrophobic particles
The hydrophobic sugar derivatives sucrose octaacetate and trehalose octaacetate immediately form a glass when quenched from the melt or quickly dried from a solution of chloroform or dichloromethane. Their use has been described as controlled release matrices for drug delivery (Roser et al "Solid delivery systems for controlled release of moleculars incorporated in the form of controlled delivery matrices of the molecules of the controlled drug delivery system". And its manufacturing method) PCT Publication WO96 / 03978, 1994).
[0037]
Trehalose octaacetate powder was obtained by melting in a muffle furnace and quenching the melt on a stainless steel plate. The obtained glass disk was crushed with a pestle and a mortar and then with a high-speed homogenizer to obtain a fine powder. This was suspended at 1 and 10% w / v in perfluorohexane, perfluorodecalin and perfluorophenanthrene. They have been found to produce well dispersed suspensions. These suspensions were found to pass easily through a 23 g needle.
[0038]
Example 6:
Reconstitution in aqueous environment
Due to the properties of stable sugar glass particles and the properties of PFC, it was expected that the active agents in these suspensions would be released rapidly in the body. To demonstrate complete release of the active substance contained, particles containing the following were formulated:
Trehalose @ 20% w / v
Calcium lactate @ 20% w / v
Lysine @ 0.5% w / v
Mordant Blue 9 dyes 1% w / v
[0039]
The formulation was spray dried as described above and added to perfluorophenanthrene and perfluorodecalin to prepare a 20% w / v dark blue opaque suspension. When an equal volume of water is added to the suspension and shaken, virtually all of the blue dye is released into the aqueous phase, with a clear blue interface floating on a nearly colorless PFC at a well-defined interface. It was found to form a layer.
[0040]
Example 7:
No reaction between particles in suspension
Because the individual microspheres are physically separated from all other particles in the PFC suspension, potentially reactive substances will be in the same suspension without any risk of their interaction. May be present together as separate particles. When the sugar glass dissolves and the molecules come together, a reaction occurs.
To prove this, suspensions containing two types of particles were prepared, one with alkaline phosphatase enzyme (a) and the other with its colorless substrate, p-nitrophenyl phosphate.
[0041]
The prescription was as follows:
a)in 5 mM Tris / HCl buffer, pH 7.6
Trehalose @ 10% w / v
Sodium sulfate 10% w / v
Alkaline phosphatase @ 20 U / ml
b)1 mM Zn chloride each ⁺⁺ And Mg ⁺⁺ In 100 mM glycine buffer at pH 10.2
Trehalose @ 10% w / v
Sodium sulfate 10% w / v
p-Nitrophenylphosphoric acid 0.44% w / v
[0042]
A suspension of the powder in perfluorodecalin containing 10% w / v powder "a" and 10% w / v powder "b" did not produce any color reaction and was a white suspension at 37 ° C for 3 weeks. It turned out to be something.
After addition of water and shaking, the powder dissolved in the upper aqueous phase. The enzymatic reaction occurred in a few minutes and exhibited the dark yellow color of p-nitrophenol in both freshly prepared samples and those kept at 37 ° C. for 3 weeks.
[0043]
Example 8:
Product release in the "tissue gap" model
To clarify the possible kinetics of the PFC suspension when injected in vivo, a clear hydrated tissue gap model was created by placing a 0.2% agarose gel in a polystyrene decorative bottle. 0.1 ml of the perfluorodecalin suspension of Example 5 was injected into an agarose gel through a 25 g needle. This resulted in flattened white spheres of the suspension. Over the next 5-10 minutes, the white color disappeared upward from the bottom of the sphere, leaving a clear sphere of PFC. As the enzyme and substrate were released by dissolution of the glass particles, they reacted together to produce the yellow color of p-nitrophenol, which then diffused throughout the agarose over an hour.
[0044]
Example 9:
Density match:
Sugar glass particles (ie, trehalose) obtained by any of the conventional drying methods are about 1.5 g / cm³Shows the typical density of The perfluorocarbons we tested are typically between 1.68 and 2.03 g / cm³(Table I). For this reason, when formulated in suspension, the sugar glass particles tend to float in the PFC layer, resulting in a formulation in which the active agent is not evenly distributed. However, they may be modified so that the powders have a neutral buoyancy and do not settle or float, resulting in a stable suspension in the PFC. This can be achieved by the addition of a high density material prior to particle formation. These may be water-soluble or insoluble.
[0045]
Water-insoluble substance
3.14 g / cm of tricalcium orthophosphate³It is approved as an adjuvant for vaccines and is practically insoluble in water. A powder prepared to contain about 50% calcium phosphate will have about 2 g / cm³To form a stable suspension in perfluorophenanthrene at 20% solids.
[0046]
Examples of powders that form stable suspensions at 20% solids in PFC include:
1 In perfluorodecalin

2 In perfluorophenanthrene

[0047]
Other density increasing water insoluble materials that have been used include barium sulfate and titanium dioxide. Any non-toxic, insoluble material can be used, provided that it is of the appropriate density.
[0048]
Water-soluble substance
Density 2.7g / cm³Soluble salts, such as sodium sulfate, may also be used as a density increasing agent. The following powder formed a stable suspension in perfluorodecalin:

Other non-toxic high-density water-soluble substances may also be used. These formulations were found to cause discomfort after subcutaneous injection in guinea pigs, presumably due to the rapid dissolution of high concentrations of ionic salts.
[0049]
Example 10:
Density matching effect with actives in suspension
Some vaccines are formulated adsorbed on an insoluble gel or particle that acts as an adjuvant. Aluminum hydroxide and calcium phosphate are widely used for this purpose. These insoluble adjuvants can themselves be used to increase the density of the suspended particles. In this case, the high density material is not completely inert and effectively adsorbs the active polymer from solution. It is necessary to prove that this adsorption does not denature the activator. To test this, alkaline phosphatase was used as an activator / vaccine model.
[0050]
The following solutions were prepared:
in 5 mM Tris HCl buffer, pH 7.6
Adjuvant grade calcium phosphate {10% w / v} (Superphos Kemia / s)
Trehalose @ 10% w / v
ZnCl₂1 mM
MgCl₂1 mM
Alkaline phosphatase 20U / Ml
[0051]
The solution was mixed well at 37 ° C. for 10 minutes, and the alkaline phosphatase was adsorbed by calcium phosphate. This change in absorption per minute was determined by centrifuging the calcium phosphate, sampling the supernatant, and measuring its enzymatic reaction rate at a wavelength of 405 nm using p-nitrophenyl phosphate as a substrate. The solution was spray dried to produce a fine powder. Enzyme desorption was measured in the supernatant as described above after rehydration of the powder. The powder was found to form a stable suspension when suspended at 20% w / v in perfluorophenanthrene.
[0052]

[0053]
Experiments have proven that:
The density of the particles can be matched with that of a PFC vehicle by the inclusion of a calcium phosphate adjuvant.
No significant desorption or loss of enzyme activity occurred during the formulation process.
[0054]
Example 11:
A STASIS formulation of a mannitol-based glass as in Example 1 is suspended in perfluorodecalin and is a surgically clean, commonly used clinically to deliver an oxymetazoline nasal decongestant (Sudafed, Warner Lambert). , Pumped into a polypropylene atomizer. The suspension was sprayed twice into each nostril of human volunteers and asked about the degree of discomfort they felt. The volunteers did not complain at all. No side effects of administration were observed.
[Brief description of the drawings]
FIG.
Alkaline phosphatase (Sigma Aldrich Ltd.) was stabilized in a glass based on 33.3% mannitol, 33.3% calcium lactate and 33.3% degraded gelatin (Byco C, Croda Colloids Ltd.) and micronized. Spray dried as spheres and stored at 55 ° C. as a dry powder or as a stable suspension in perfluorodecalin. Activity remained at approximately 100% standard (103% at 20 days and 94% at 30 days). The dry powder not suspended in the PFC had a greater loss (about 80% residual activity).
FIG. 2
A commercially available tetanus toxoid vaccine (# T022, kindly provided by Evans Medeva plc) was formulated as a density matched powder using a 20% trehalose solution plus calcium phosphate. It was lyophilized by spraying into liquid nitrogen using a two-part nozzle, and then the frozen microsphere powder was lyophilized on a Labconco lyophilizer at an initial storage temperature of -40 ° C throughout the main drying. After injection with the same dose of ASSIST-stabilized tetanus toxoid vaccine, reconstituted in saline buffer or as an anhydrous formulation in oil or PFC, the antibody response of 6 groups of 10 guinea pigs at 4, 8, and 12 weeks It was measured.
The response to all dried formulations was lower than the fresh vaccine control (not shown) and showed a significant loss of immunogenicity upon spray drying. The antigenicity of the toxoid, measured by a capture ELISA, was unchanged by the drying process. This indicated that further work was required to complete the storage of the aluminum hydroxide adjuvant upon drying.
The response to the STASIS vaccine densified with calcium phosphate (Group 3) is essentially identical to the control vaccine (Group 1) and the powder-in-oil vaccine (Group 2) reconstituted in aqueous buffer, while Control animals (Groups 4 & 5) injected with aqueous vehicle only showed no response.

Claims

A composition for delivering a stable bioactive compound to a subject, comprising a first component and a second component,
The first component contains the above-mentioned bioactive agent, and is composed of fine particles of sugar glass, metal carboxylate glass or phosphate glass, and the sugar glass, metal carboxylate glass or phosphate glass optionally promotes glass formation. Agent compound,
The second component comprises at least one biocompatible liquid perfluorocarbon in which the first component is insoluble and dispersed, the liquid perfluorocarbon optionally containing a surfactant. And the above composition.

The sugar glass comprises a sugar selected from the group consisting of trehalose, sucrose, raffinose, stachyose, glucopyranosyl sorbitol, glucopyranosyl mannitol, palatinit, lactitol, monosaccharide alcohol, or sucrose octaacetate or trehalose octaacetate 2. The composition of claim 1, wherein the composition is formed from a sugar molecule modified by the addition of a hydrophobic side chain selected from the group.

The composition according to claim 1, wherein the phosphate glass or carboxylate glass is formed from a mixture of divalent metal phosphate or metal carboxylate.

The composition according to claim 1, wherein the optional glass formation promoter is selected from the group consisting of peptides, proteins, dextran, polyvinylpyrrolidone, borate, calcium lactate, sodium polyphosphate and silicic acid or acetate.

The composition of claim 1, wherein the sugar glass microparticles have a diameter of about 0.1 to about 100 micrometers.

7. The composition of claim 6, wherein the diameter ranges from 1 to 10 micrometers.

Composition according to claim 1, wherein the microparticles have a water content of less than 4%, preferably less than 2%, ideally less than 1%.

The composition of claim 1, wherein the first component is monodispersed in the second component.

The composition of claim 1, wherein the concentration of the first component in the second component is from about 1 to about 40% by weight.

The composition according to claim 10, wherein the concentration range is 10 to 15%.

The composition of claim 1, wherein the concentration of the surfactant in the second component is from about 0.01 to about 10%.

13. The composition of claim 12, wherein the concentration is about 1%.

The composition of claim 1, further comprising microparticles of the first component, wherein the inorganic salt is added in an amount effective to provide the microparticles with a density consistent with that of the liquid phase of the second component. .

The composition according to claim 1, further comprising an excipient that imparts a weak residual electrostatic charge to the fine particles such that the fine particles repel each other.

16. The composition according to claim 15, wherein the excipient is an amino acid.

The composition of claim 1, wherein the perfluorocarbon is selected from the group consisting of perfluorohexane, perfluorodecalin, and perfluorophenanthrene.

The composition according to claim 1, wherein the bioactive compound is a vaccine, drug, enzyme or diagnostic reagent.

(A) preparing fine particles of the first component according to claim 1;
(B) suspending the microparticles in the second component perfluorocarbon of claim 1; and (c) administering the mixture to the subject. A method for delivering a substance.