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JP2005522210A - 単純ヘルペスウイルス感染の診断および処置に対する組成物および方法 - Google Patents

単純ヘルペスウイルス感染の診断および処置に対する組成物および方法 Download PDF

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Abstract

ＨＳＶ感染の診断および処置のための化合物および方法が提供される。その化合物は、ＨＳＶポリペプチドの少なくとも一つの抗原部分およびこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する。このようなポリペプチドまたはＤＮＡ配列を含有する薬学的処方物およびワクチンもまたこのようなポリペプチドに対する抗体と一緒に、提供される。このようなポリペプチドおよび／またはＤＮＡ配列ならびに患者および生物学的サンプルにおけるＨＳＶ感染の検出のための適切な検出試薬を備える診断キットもまた提供される。

Description

（発明の背景）
本発明は、一般に、ＨＳＶ感染の検出および処置に関する。特に、本発明は、ＨＳＶ抗原を含むポリペプチド、ＨＳＶ抗原をコードするＤＮＡおよびＨＳＶ感染の診断および処置のためのこのような組成物の使用に関する。
（関連技術の記述）
ヘルペスウイルスは、１型（ＨＳＶ−１）および２型（ＨＳＶ−２）と名付けられた密接に関連した二つの改変体を含む、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む。ＨＳＶは、年間推定６００，０００件の新しい症例の発生率を有し、そして、１０００万人〜２０００万人の個体が、症候性慢性再発性疾患に直面している、ヒトの生殖器感染症のありふれた原因である。無症候性無症状性感染率は、さらに高くあり得る。例えば、型特異的血清学的アッセイを用いて、アトランタの保健維持機構診療所に通う女性の任意抽出集団の３５％が、ＨＳＶ２型（ＨＳＶ−２）に対する抗体を有していた。抗ウイルス薬物（例えば、アシクロビル）の継続的な投与は、急性ＨＳＶ疾患の重症度を緩和し、再発症の頻度および持続期間を減少するが、このような化学治療処置は、潜伏の確立を中断せず、また潜伏ウイルスの状態を変化させない。結果として、再発疾患傾向は、薬物処理の中止後、急速に回復する。
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の少なくとも一つの株のゲノムは、特徴づけされている。それは、約１５０ｋｂであり、それぞれ５０〜１０００アミノ酸長の範囲のタンパク質をコードする約８５の公知の遺伝子をコードする。しかし、免疫原性部分、特に、ウイルス感染に反応する有効なＴ細胞免疫を惹起し得る免疫原性エピトープは、未知である。
従って、ＨＳＶ感染に対する有効な免疫応答を惹起し得るＨＳＶポリペプチドの免疫原性部分、好ましくは、エピトープを同定することは、医学的に重大でかつ科学的に必要なことである。このような情報は、より安全でかつより効果的で予防的な薬学的組成物（例えば、実質的にＨＳＶ感染を防止するワクチン組成物および感染が既に生じた場合、疾患に効く治療的組成物）につながる。本発明は、これらおよび他の要求を満たす。
（発明の概要）
本発明は、ＨＳＶ感染の診断および治療のための組成物および方法を提供する。一つの局面では、本発明は、ＨＳＶ抗原の免疫原性部分を含むポリペプチドまたはこのような抗原の改変体もしくはこのような抗原の生物学的機能的同等物を提供する。特定の好ましい部分および他の改変体は、免疫原性であり、その結果、その部分または改変体の抗原特異的抗血清に応答する能力は、実質的に減少しない。特定の実施形態において、そのポリペプチドは、以下：（ａ）配列番号１、４、８〜９、１３、１６、１９〜２４、３５〜３８、４８〜４９、５２〜５３、６５〜７３、７６〜８９、９８〜１１７、１１８〜１１９、１４１、１４４〜１５２、１７９〜１８０、１８２〜１８３、１８４〜１９４、２０６〜２１０、２１３〜２１４、２１７〜２２６、２４０、２４２、２４４〜２４７および２５１〜２５２のいずれか一つの配列；（ｂ）前記配列の相補体；および（ｃ）中程度のストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）の配列とハイブリダイズする配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＳＶタンパク質の少なくとも一部分、好ましくは、免疫原性部分を含み、このＨＳＶタンパク質は、配列番号２、３、５、６、７、１０〜１２、１４〜１５、１７〜１８、２０〜２３、２５〜３３、３９〜４７、５０〜５１、５４〜６４、７４〜７５、９０〜９７、１２０〜１２１、１２２〜１４０、１４２〜１４３、１５３〜１７８、１８１、１９５〜２０５、２１１〜２１２、２１５〜２１６、２２７〜２３９、２４１、２４３、２４８〜２５０、２５３〜２５４、２５５〜２６７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列（改変体およびこれらの生物学的機能的同等物を含む）のいくつかまたは全てを含む。
本発明はさらに、上記のポリペプチドまたはその一部（例えば、ＨＳＶタンパク質の少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基をコードする一部分）をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
関連する局面において、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、これらのポリヌクレオチド配列を一つ以上含む組換え発現ベクターおよびこのような発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。
別の局面では、本発明は、例えば、薬学的組成物およびそのワクチンとして使用される生理学的に受容可能なキャリアまたは免疫賦活剤と組み合わせた一つ以上のＨＳＶポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
本発明はさらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）ＨＳＶタンパク質に特異的に結合する抗体（ポリクローナルかモノクローナルのどちらか）、
またはその抗原結合フラグメント；および（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア。
他の局面では、本発明は、本明細書中に開示された一つ以上のＨＳＶポリペプチドもしくはその部分、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子および生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、本明細書中に定義された開示されたポリペプチドおよび免疫賦活剤を一つ以上含む予防目的および治療目的のワクチンならびにこのようなポリペプチドおよび免疫賦活剤をコードするポリヌクレオチド配列を一つ以上含むワクチンを提供する。
なお別の局面では、上記の一つ以上の薬学的組成物またはワクチンを、有効量患者へ投与することを包含する患者において感染防御免疫を誘導する方法を提供する。患者の処置における使用のために同定されたポリペプチドは、いずれもヘルペス感染を処置するために使用される薬学的物質（例えば、Ｚｏｖｉｒａｘ（登録商標）（アシクロビル）、Ｖａｌｔｒｅｘ（登録商標）（バルアシクロビル）およびＦａｍｖｉｒ（登録商標）（ファムシクロビル）が挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせて使用され得る。
なおさらなる局面では、患者のＨＳＶ感染の影響を処置し、実質的に予防し、さもなければ回復する方法、患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の入手を包含する方法、インキュベートされたＴ細胞を提供するために、本発明のポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含むＰＢＭＣのインキュベートを包含する方法およびインキュベートされたＴ細胞の患者への投与を包含する方法を提供する。本発明はさらに、インキュベートされた抗原提示細胞を提供するための本発明のポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を有する抗原提示細胞のインキュベートおよびインキュベートされた抗原提示細胞の患者への投与を包含するＨＳＶ感染の処置のための方法を提供する。増殖させた細胞は、患者への投与の前にクローニングされ得るが、その必要はない。特定の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞および線維芽細胞からなる群から選択される。本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドとともにインキュベートされたＴ細胞または抗原提示細胞を含有するＨＳＶ感染の処置のための組成物もまた、提供される。関連した局面では、（ａ）上記のようにポリペプチドを発現する抗原提示細胞および（ｂ）免疫賦活剤を含有するワクチンが提供される。
本発明はさらに、他の局面では、ＨＳＶタンパク質に特異的に応答するＴ細胞と生物学的サンプルとの接触を包含する、生物学的サンプルからＨＳＶ感染細胞を除去する方法を提供し、ここで、接触工程は、タンパク質を発現する細胞のサンプルからの除去を可能にするために十分な条件下および時間実施される。
関連した局面では、上記のように処理した生物学的サンプルの患者への投与を包含する、患者においてＨＳＶ感染の進行を阻害する方法が提供される。本発明のさらなる局面では、患者においてＨＳＶ感染を検出するための方法および診断キットが提供される。一つの実施形態では、その方法は、（ａ）生物学的サンプルを本明細書に開示したポリペプチドまたは融合タンパク質の少なくとも一つと接触させる工程；および（ｂ）ポリペプチドまたは融合タンパク質に結合する結合物質の存在をサンプル中で検出し、それによって、生物学的サンプル中でＨＳＶ感染を検出する工程を包含する。適切な生物学的サンプルとしては、全血、痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿が挙げられる。一つの実施形態では、診断キットは、本明細書中に開示された一つ以上のポリペプチドまたは融合タンパク質を、検出試薬と組み合わせて含む。なお別の実施形態では、診断キットは、本発明のポリペプチドと結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを含む。
本発明はまた、（ａ）患者から生物学的サンプルを入手する工程；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応で、少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプライマー（少なくとも一つは、本明細書中に開示されたポリヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー）とサンプルを接触させる工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅するポリヌクレオチド配列をサンプル中で検出する工程を包含する、ＨＳＶ感染検出のための方法を提供する。一つの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中で開示されたペプチドのポリヌクレオチド配列またはそれにハイブリダイズする配列の約１０個の連続するヌクレオチドを含む。
さらなる局面では、本発明は、（ａ）患者から生物学的サンプルを入手する工程；（ｂ）本明細書中に開示されたポリヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとサンプルを接触させる工程および（ｃ）オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列をサンプル中で検出する工程を包含する、患者においてＨＳＶ感染を検出するための方法を提供する。一つの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書中に開示されたポリヌクレオチド配列の少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドまたはそれにハイブリダイズする配列を含む。
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照することによって、明らかになる。本明細書中に開示された全ての参考文献は、それぞれが、個々に援用されるように、本明細書中でその全てが参考として援用される。
（いくつかの配列識別名の簡単な説明）
配列番号１は、ＨＳＶ２Ｉ＿ＵＬ３９ｆｒａｇＨ１２Ａ１２と名付けられた単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示し、
配列番号２は、配列番号１のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｈ１２Ａ１２ｏｒｆ１．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号３は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ３９タンパク質のアミノ酸配列を示し；
配列番号４は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ８ＡｆｒａｇＤ６．Ｂ＿Ｂ１１＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示し；
配列番号５は、配列番号４のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｄ６Ｂｏｒｆ１．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号６は、配列番号４のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｄ６Ｂｏｒｆ２．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号７は、全長ＨＳＶ−２ ＵＳ８Ａタンパク質のアミノ酸配列を示し；
配列番号８は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ４ｆｒａｇＦ１０Ｂ３＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示し；
配列番号９は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ３ｆｒａｇＦ１０Ｂ３＿Ｔ７Ｐ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示し；
配列番号１０は、配列番号８のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｆ１０Ｂ３ｏｒｆ２．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号１１は、配列番号９のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（８Ｆ１０Ｂ３ｏｒｆ１．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号１２は、全長ＨＳＶ−２ ＵＳ３タンパク質のアミノ酸配列を示し；
配列番号１３は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示し；
配列番号１４は、配列番号１３のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｆ１１Ｆ５ｏｒｆ１．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号１５は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ４６タンパク質のアミノ酸配列を示し；
配列番号１６は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ２７ｆｒａｇＨ２Ｃ７＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示し；
配列番号１７は、配列番号１６のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｈ２Ｃ７ｏｒｆ１．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号１８は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ２７タンパク質のアミノ酸配列を示し；
配列番号１９は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１８ｆｒａｇＦ１０Ａ１＿ｒｃ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示し；
配列番号２０は、配列番号１９のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｆ１０Ａ１ｏｒｆ３．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号２１は、配列番号１９のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｆ１０Ａ１ｏｒｆ２．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号２２は、配列番号１９のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｆ１０Ａ１ｏｒｆ１．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号２３は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ１８タンパク質のアミノ酸配列を示し；
配列番号２４は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１５ｆｒａｇＦ１０Ａ１２＿ｒｃ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示し；
配列番号２５は、配列番号２４のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（Ｆ１０Ａ１２ｏｒｆ１．ｐｒｏと名付けられた）を示し；
配列番号２６は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ１５タンパク質のアミノ酸配列を示し；
配列番号２７は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号２８は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号２９は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号３０は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号３１は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号３２は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ１８遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号３３は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ１８遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号３４は、ＲＬ２＿Ｅ９Ａ４＿５＿ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのヌクレオチド配列を示し；
配列番号３５は、全長ＨＳＶ−２ ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を示し；
配列番号３６は、ＵＬ２３＿２２＿Ｃ１２Ａ１２＿ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのヌクレオチド配列を示し；
配列番号３７は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ２３タンパク質のヌクレオチド配列を示し；
配列番号３８は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ２２タンパク質のヌクレオチド配列を示し；
配列番号３９は、配列番号３７のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（ＨＳＶ２＿ＵＬ２３と名付けられた）を示し；
配列番号４０は、配列番号３６のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（ＨＳＶ２＿ＵＬ２３と名付けられた）を示し；
配列番号４１は、配列番号３６のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（ＨＳＶ２＿ＵＬ２２と名付けられた）を示し；
配列番号４２は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ２３遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号４３は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ２３遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号４４は、ＨＳＶＩＩ ＵＬ２３遺伝子の免疫原性部分に由来する１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号４５は、配列番号３８のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（ＨＳＶ２＿ＵＬ２２と名付けられた）を示し；
配列番号４６は、配列番号３４のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（ＲＬ２＿Ｅ９Ａ４＿５＿ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｓｅｑと名付けられた）を示し；
配列番号４７は、配列番号３５のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（ＨＳＶ２＿ＲＬ２と名付けられた）を示し；
配列番号４８は、Ｇ１０＿ＵＬ３７ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｓｅｑと名付けられた単離されたクローンのヌクレオチド配列を示し；
配列番号４９は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ３７遺伝子のヌクレオチド配列を示し；
配列番号５０は、配列番号４８のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（ＨＳＶ２＿ＵＬ３７と名付けられた）を示し；
配列番号５１は、配列番号４９のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（ＨＳＶ２＿ＵＬ３７と名付けられた）を示し；
配列番号５２は、クローンＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５の挿入物に由来するＤＮＡ配列を示し；
配列番号５３は、クローンＧ１０の挿入物に由来するＤＮＡ配列を示し；
配列番号５４は、クローンＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５の挿入物に由来するアミノ酸配列を示し；
配列番号５５は、クローンＧ１０の挿入物に由来するアミノ酸配列を示し；
配列番号５６は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ１５のペプチド＃２３のアミノ酸配列（アミノ酸６８８〜７２２）であり；
配列番号５７は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ１５のペプチド＃３０のアミノ酸配列（アミノ酸７１６〜７３０）であり；
配列番号５８は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ２３のペプチド＃７のアミノ酸配列（アミノ酸２６５〜２７９）であり；
配列番号５９は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４６のペプチド＃２のアミノ酸配列（アミノ酸６２１〜６３５）であり；
配列番号６０は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４６のペプチド＃８のアミノ酸配列（アミノ酸６４５〜６５９）であり；
配列番号６１は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４６のペプチド＃９のアミノ酸配列（アミノ酸６４９〜６６３）であり；
配列番号６２は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４６のペプチド＃１１のアミノ酸配列（アミノ酸６５７〜６７１）であり；
配列番号６３は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＳ３のペプチド＃３３のアミノ酸配列（アミノ酸２６２〜２７６）であり；
配列番号６４は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＳ８Ａのペプチド＃５のアミノ酸配列（アミノ酸９９〜１１３）である。
配列番号６５は、全長ＨＳＶ−２ ＵＬ３９タンパク質のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号６６は、クローン３９によって認識される１Ｆ４、１Ｇ２および３Ｇ１１をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＵＬ３９の部分的ポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号６７は、クローン３９によって認識される２Ｃ４をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＵＬ３９の部分的ポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号６８は、クローン４７によって認識される３Ｈ６、３Ｆ１２および４Ｂ２をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＩＣＰ０の部分的ポリヌクレオチド配列の５’末端を示す。
配列番号６９は、クローン４７によって認識される３Ｈ６、３Ｆ１２および４Ｂ２をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＩＣＰ０の部分的ポリヌクレオチド配列の３’末端を示す。
配列番号７０は、クローン４７によって認識される３Ａ１をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＩＣＰ０の部分的ポリヌクレオチド配列の５’末端を示す。
配列番号７１は、クローン４７によって認識される３Ａ１をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＩＣＰ０の部分的ポリヌクレオチド配列の３’末端を示す。
配列番号７２は、クローン４７によって認識される２Ｂ２をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＩＣＰ０の部分的ポリヌクレオチド配列の５’末端を示す。
配列番号７３は、クローン４７によって認識される２Ｂ２をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＩＣＰ０の部分的ポリヌクレオチド配列の３’末端を示す。
配列番号７４は、クローン３９によって認識される１Ｆ４、１Ｇ２および３Ｇ１１をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＵＬ３９の部分的アミノ酸配列を示す。
配列番号７５は、クローン３９によって認識される２Ｃ４をプールするＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するＵＬ３９の部分的アミノ酸配列を示す。
配列番号７６は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ１９の全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号７７は、ワクシニアウイルスシャトルプラスミド、ｐＳＣ１１のＤＮＡ配列を示す。
配列番号７８は、ＨＳＶ−２遺伝子、ＵＬ４７の全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号７９は、ＨＳＶ−２遺伝子、ＵＬ５０の全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号８０は、ヒトユビキチン遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号８１は、ＨＳＶ−２遺伝子、ＵＬ４９の全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号８２は、ＨＳＶ遺伝子、ＵＬ５０のコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号８３は、ＨＳＶ遺伝子、ＵＬ４９のコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号８４は、ＨＳＶ遺伝子、ＵＬ１９のコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号８５は、ＨＳＶ遺伝子、ＵＬ２１のコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号８６は、Ｔｒｘ２融合配列を有するＨＳＶ−２ ＵＬ４７遺伝子のコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号８７は、ＨＳＶ遺伝子、ＵＬ４７のコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号８８は、ＨＳＶ遺伝子、ＵＬ４７Ｃフラグメントのコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号８９は、ＨＳＶ遺伝子、ＵＬ３９のコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号９０は、Ｈｉｓタグを有するＵＬ３９タンパク質に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９１は、Ｈｉｓタグを有するＵＬ２１タンパク質に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９２は、Ｔｒｘタグおよび２ヒスタジンタグと融合したＵＬ４７タンパク質に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９３は、Ｈｉｓタグを有するＵＬ４７Ｃフラグメントに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９４は、Ｈｉｓタグを有するＵＬ４７タンパク質に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９５は、Ｈｉｓタグを有するＵＬ１９タンパク質に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９６は、Ｈｉｓタグを有するＵＬ５０タンパク質に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９７は、Ｈｉｓタグを有するＵＬ４９タンパク質に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号９８は、ＵＬ２１の増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−６０２についてのプライマー配列を示す。
配列番号９９は、ＵＬ２１の増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−６０３についてのプライマー配列を示す。
配列番号１００は、ＵＬ３９の増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−４６６についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０１は、ＵＬ３９の増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−４６７についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０２は、ＵＬ４９の増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−７１４についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０３は、ＵＬ４９の増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−７１５についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０４は、ＵＬ５０の増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−４５８についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０５は、ＵＬ５０の増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−４５９についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０６は、ＵＬ１９の増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−４５３についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０７は、ＵＬ１９の増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−４５７についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０８は、ＵＬ４７の増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−６３１についてのプライマー配列を示す。
配列番号１０９は、ＵＬ４７の増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−６３２についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１０は、ＵＬ４７Ａの増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−６３１についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１１は、ＵＬ４７Ａの増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−６４５についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１２は、ＵＬ４７Ｂの増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−６４６についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１３は、ＵＬ４７Ｂの増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−６３２についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１４は、ＵＬ４７Ｃの増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−６３１についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１５は、ＵＬ４７Ｃの増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−７３９についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１６は、ＵＬ４７Ｄの増幅に使用されるセンスプライマーＰＤＭ−７４０についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１７は、ＵＬ４７Ｄの増幅に使用される逆方向プライマーＰＤＭ−６３２についてのプライマー配列を示す。
配列番号１１８は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＳ８の新規のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１１９は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＨＳＶ−２遺伝子ＵＳ８の公開されたＤＮＡ配列を示す。
配列番号１２０は、配列番号１１８にコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号１２１は、配列番号１１９にコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号１２２は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４７に由来するペプチド８５（ｐ８５）、ＣＤ８＋ペプチドの配列を示す。
配列番号１２３は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４７に由来するペプチド８９（ｐ８９）、ＣＤ８＋ペプチドの配列を示す。
配列番号１２４は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４７に由来するペプチド９８／９９（ｐ９８／９９）、ＣＤ８＋ペプチドの配列を示す。
配列番号１２５は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４７に由来するペプチド１０５（ｐ１０５）、ＣＤ８＋ペプチドの配列を示す。
配列番号１２６は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４７に由来するペプチド１１２（ｐ１１２）、ＣＤ８＋ペプチドの配列を示す。
配列番号１２７は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１５に由来するペプチド＃２３（アミノ酸６８８〜７０２）の配列を示す。
配列番号１２８は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１５に由来するペプチド＃３０（アミノ酸７１６〜７３０）の配列を示す。
配列番号１２９は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ２３に由来するペプチド＃７（アミノ酸２６５〜２７２）の配列を示す。
配列番号１３０は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に由来するペプチド＃２（アミノ酸６２１〜６３５）の配列を示す。
配列番号１３１は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に由来するペプチド＃８（アミノ酸６４５〜６５９）の配列を示す。
配列番号１３２は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に由来するペプチド＃９（アミノ酸６４９〜６６３）の配列を示す。
配列番号１３３は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に由来するペプチド＃１１（アミノ酸６５７〜６７１）の配列を示す。
配列番号１３４は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４７に由来するペプチド＃８６（アミノ酸３４１〜３５５）の配列を示す。
配列番号１３５は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４９に由来するペプチド＃６（アミノ酸２１〜３５）の配列を示す。
配列番号１３６は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４９に由来するペプチド＃１２（アミノ酸４５〜５９）の配列を示す。
配列番号１３７は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４９に由来するペプチド＃１３（アミノ酸４９〜６３）の配列を示す。
配列番号１３８は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４９に由来するペプチド＃４９（アミノ酸１９３〜２０８）の配列を示す。
配列番号１３９は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＳ３に由来するペプチド＃３３（アミノ酸２６２〜２７６）の配列を示す。
配列番号１４０は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＳ８Ａに由来するペプチド＃５（アミノ酸９９〜１１３）の配列を示す。
配列番号１４１は、クローンＦ１０Ｂ３に対応する全長挿入ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１４２は、クローンＦ１０Ｂ３に対応する全長挿入アミノ酸配列を示す。
配列番号１４３は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＳ４に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１４４は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ２１に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１４５は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ５０に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１４６は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＳ３に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１４７は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ５４に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１４８は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＳ８に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１４９は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１９に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５０は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５１は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１８に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５２は、ＨＳＶ−２タンパク質ＲＬ２に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５３は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ５０に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１５４は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ２１に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１５５は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＳ３に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１５６は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ５４に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１５７は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＳ８に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１５８は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１９に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１５９は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１６０は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１８に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１６１は、ＨＳＶ−２タンパク質ＲＬ２に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１６２は、ＨＳＶ−２タンパク質ＲＬ２に由来するペプチド＃４３（アミノ酸２１１〜２２５）の配列を示す。
配列番号１６３は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に由来するペプチド＃４１（アミノ酸２０１〜２１５）の配列を示す。
配列番号１６４は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に由来するペプチド＃５０（アミノ酸２４６〜２６０）の配列を示す。
配列番号１６５は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に由来するペプチド＃５１（アミノ酸２５１〜２６５）の配列を示す。
配列番号１６６は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ４６に由来するペプチド＃６０（アミノ酸２９６〜３１０）の配列を示す。
配列番号１６７は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＳ８に由来するペプチド＃７４（アミノ酸３６６〜３８０）の配列を示す。
配列番号１６８は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１９に由来するペプチド＃１０２（アミノ酸５０６〜５２０）の配列を示す。
配列番号１６９は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１９に由来するペプチド＃１０３（アミノ酸５１１〜５２５）の配列を示す。
配列番号１７０は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１９に由来するペプチド＃７４（アミノ酸３６６〜３８０）の配列を示す。
配列番号１７１は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１９に由来するペプチド＃７５（アミノ酸３７１〜３８５）の配列を示す。
配列番号１７２は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１８に由来するペプチド＃１７（アミノ酸６５〜７９）の配列を示す。
配列番号１７３は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１８に由来するペプチド＃１８（アミノ酸６９〜８３）の配列を示す。
配列番号１７４は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ５０に由来するペプチド＃１６（アミノ酸７６〜９０）の配列を示す。
配列番号１７５は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ５０に由来するペプチド＃２３（アミノ酸１１１〜１２５）の配列を示す。
配列番号１７６は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ５０に由来するペプチド＃４９（アミノ酸２４１〜２５５）の配列を示す。
配列番号１７７は、ＩＣＰ０（アミノ酸２１５〜２２３）に対する９マーのペプチドの配列を示す。
配列番号１７８は、ＵＬ４６（アミノ酸２５１〜２６０）に対する１０マーのペプチドの配列を示す。
配列番号１７９は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＵＳ４のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８０は、ＵＬ４７ Ｆコード領域に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８１は、ＵＬ４７ Ｆコード領域に対するアミノ酸配列を示す。
配列番号１８２は、ＵＬ４７ Ｆの増幅に使用されるプライマーＣＢＨ−００２に対する配列を示す。
配列番号１８３は、ＵＬ４７ Ｆの増幅に使用されるプライマーＰＤＭ−６３２に対する配列を示す。
配列番号１８４は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ１８に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８５は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＬＡＴ−ＯＲＦ−１に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８６は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ４８に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８７は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ４１に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８８は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ３９に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８９は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ３７に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９０は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ３６に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９１は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ２９に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９２は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ２５に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９３は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＩＣＰ４に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９４は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＩＣＰ２２に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９５は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ１８に対応する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号１９６は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＩＣＰ２２に対応する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号１９７は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＩＣＰ４に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９８は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＬＡＴ−ＯＲＦ−１に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９９は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ２５に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２００は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ２９に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０１は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ３６に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０２は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ３７に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０３は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ３９に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０４は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ４１に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０５は、ＨＳＶ−２オープンリーディングフレーム、ＵＬ４８に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０６は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現クローニングライブラリー挿入部分１／Ｆ３および１／Ａ７に由来するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０７は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現クローニングライブラリー挿入部分１／Ｈ６に由来するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０８は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現クローニングライブラリー挿入部分３／Ｃ１に由来するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０９は、挿入部分１／Ｆ３、１／Ａ７、１／Ｈ６および３／Ｃ１に共通のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１０は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ１９遺伝子に対する全長ＤＮＡ肺配列を示す。
配列番号２１１は、配列番号２０９によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号２１２は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ１９遺伝子に対する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２１３は、臨床的単離体ＲＷ１８７４に由来するＵＳ８遺伝子に対する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１４は、臨床的単離体ＨＶ５１０１に由来するＵＳ８遺伝子に対する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１５は、臨床的単離体ＲＷ１８７４に由来するＵＳ８遺伝子に対する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２１６は、臨床的単離体ＨＶ５１０１に由来するＵＳ８遺伝子に対する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２１７は、クローンＨＨ６Ｄ６＿Ｂ６に由来する挿入部分に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１８は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ２１遺伝子に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１９は、クローンＨＨ２０ Ｃ１２＿Ｅ１の第一挿入部分に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２０は、クローンＨＨ２０ Ｃ１２＿Ｅ１の第二挿入部分に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２１は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ２９遺伝子に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２２は、クローンＨＨ２２Ｆ７＿Ａ７に由来する挿入部分に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２３は、クローンＨＨ２２ ４／Ｅ８＿Ｃ８に由来する挿入部分に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２４は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ４６遺伝子に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２５は、クローンＨＨ２４Ｇ６＿Ｈ１１に由来する挿入部分に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２６は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ４７遺伝子に対するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２７は、クローンＨＨ６（Ｄ６Ｂ６：配列番号２１７）に由来する挿入部分にコードされるタンパク質配列を示す。
配列番号２２８は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＵＬ２１に対する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２２９は、２８１〜３００アミノ酸に及ぶＵＬ２１ Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３０は、クローンＨＨ２０に由来する挿入部分１Ｃ１２＿Ｅ１にコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号２３１は、クローンＨＨ２０に由来する挿入部分２Ｅ９＿Ｄ１１にコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号２３２は、ＨＳＶ−２、ＨＧ５２株タンパク質ＵＬ２９に対する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２３３は、挿入部分Ｆ７＿Ａ１、クローンＨＨ２２に由来するアミノ酸配列を示す。
配列番号２３４は、挿入部分４／Ｅ８＿Ｃ８、クローンＨＨ２２に由来するアミノ酸配列を示す。
配列番号２３５は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＵＬ４６タンパク質に対する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２３６は、６２１〜６４９アミノ酸に及ぶＵＬ４６に由来する反応性Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３７は、クローンＨＨ２４ Ｇ６＿Ｈ１１に由来する挿入部分によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号２３８は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４７に対する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２３９は、アミノ酸１３７〜１５５を貫通するＵＬ４７に由来する反応性Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４０は、クローン挿入部分ＴＭ１３およびＴＭ５８ Ｆ５＿Ｇ１に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４１は、クローン挿入部分ＴＭ１３およびＴＭ５８ Ｆ５＿Ｇ１によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号２４２は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ５４に対応する全長ＤＮＡ酸配列を示す。
配列番号２４３は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＵＬ５４（ＩＣＰ２７）に対応する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２４４は、挿入部分ＴＭ３９、Ｈ１１＿Ｃ３に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４５は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ２１に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４６は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ２２に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４７は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＬ３６に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４８は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＵＬ２１に対応する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２４９は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＵＬ２２に対応する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２５０は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＵＬ３６に対応する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２５１は、ＴＭ５１，Ｆ７＿Ａ８の挿入部分に対応するＤＮＡ配列を示す。
配列番号２５２は、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２に由来するＵＳ４に対応する全長ＤＮＡ配列を示す。
配列番号２５３は、クローンＴＭ５１ Ｆ７＿Ａ８に対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号２５４は、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株に由来するＵＳ４に対応する全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２５５は、ＩＣＰ０のペプチド＃４３のアミノ酸残基２１１〜２２５の配列を示す。
配列番号２５６は、ＩＣＰ０のペプチド＃４４のアミノ酸残基２１６〜２３０の配列を示す。
配列番号２５７は、ＩＣＰ０ペプチド＃４３および＃４４の最小ＣＤ８エピトープを示す。
配列番号２５８は、ＩＣＰ０のペプチド＃８９のアミノ酸残基４４０〜４５４の配列を示す。
配列番号２５９は、ＩＣＰ０のペプチド＃８２のアミノ酸残基４０５〜４１９の配列を示す。
配列番号２６０は、ＩＣＰ０のペプチド＃７９のアミノ酸残基３９０〜４０４の配列を示す。
配列番号２６１は、ＵＬ４７のペプチド＃９８のアミノ酸残基３８９〜４０３の配列を示す。
配列番号２６２は、ＵＬ４７のペプチド＃９９のアミノ酸残基３９３〜４０７の配列を示す。
配列番号２６３は、ＵＬ４７ペプチド＃９８および＃９９の最小ＣＤ８エピトープを示す。
配列番号２６４は、ＵＬ４７のペプチド＃１１２のアミノ酸残基４４５〜４５９の配列を示す。
配列番号２６５は、ＵＬ４７ペプチド＃１１２の推定ＣＤ８エピトープを示す。
配列番号２６６は、ＵＬ４７のペプチド＃４アミノ酸残基１３〜２７の配列を示す。
配列番号２６７は、ＵＬ４７のペプチド＃１アミノ酸残基１〜１５の配列を示す。
（発明の詳細な説明）
本明細書中および／または出願データシート中に列挙した米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
上に述べたように、本発明は、一般に、組成物、および組成物を製造し使用するための方法に関し、特に、ＨＳＶ感染の治療および診断における、組成物および組成物を製造し使用するための方法に関する。本明細書中に記載された特定の例示的な組成物は、ＨＳＶポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、結合因子（例えば、抗体）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および／または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む。特定のＨＳＶタンパク質およびその免疫原性部分は、ＨＳＶ感染した患者の抗血清と検出可能な程度に反応する（免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット）内で）ＨＳＶポリペプチドを含む。
従って、本発明は、例示的なポリヌクレオチド組成物、例示的なポリペプチド組成物、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチド組成物の免疫原性部分、このようなポリペプチドと結合し得る抗体組成物およびこのような組成物を使用するさらなる多数の実施形態（例えば、ヒトＨＳＶ感染の検出、診断および／または治療において組成物を使用する実施形態）を含む。
（ポリヌクレオチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離されたか、またはこのゲノムＤＮＡから精製された、１つ以上のコード配列を含むＤＮＡセグメントをいう。ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、そしてまた、組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含む）が、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」内に含まれる。
当業者に理解されるように、本発明のＤＮＡセグメントは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、実質的に他のコード配列から離れており、そしてＤＮＡセグメントが無関係のコードＤＮＡ（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子あるいはポリペプチドコード領域）の大部分を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、最初に単離され、そして人の手によってセグメントに加えられた後に遺伝子またはコード領域を除外しないＤＮＡセグメントをいう。
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含む。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、ＨＳＶタンパク質をコードする内因性配列またはその部分）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体、または生物学的もしくは抗原性の機能的均等物を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、以下にさらに記載されるように、好ましくはネイティブのＨＳＶタンパク質と比較して、コードされたポリペプチドの免疫原性が減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。コードされたポリペプチドの免疫原性の効果は、一般に、本明細書中に記載されるように評価され得る。用語「改変体」はまた、異種間の起源の相同な遺伝子を含む。
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大一致について整列される場合に同じときに、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）にわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列が連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
比較のための配列の最適な整列は、生命情報科学ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターで行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．（１９７８）Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ．Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ｖｏｌ．１８３，ｐｐ．６２６−６４５，１９９０；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＰ．Ｍ．Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３，１９８９；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＷ．Ｍｕｌｌｅｒ ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７，１９８８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ １１：１０５，１９７１；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．およびＭ．Ｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５，１９８７；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＲ．Ｒ．Ｓｏｋａｌ，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，１９７３；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０，１９８３。
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２，１９８１の局所同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の同定整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、生物工学情報についてのナショナルセンターを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。アミノ酸配列について、スコアリング行列は、累積スコアを算出するために使用され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９を参照のこと）は、５０の（Ｂ）、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を整列する。
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
従って、本発明は、本明細書中に開示される配列に実質的に同一性を有するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列（例えば、本明細書中に記載される方法（例えば、以下に記載するような標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用する本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含む配列）を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、適切に調整され得ることを認識する。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。例えば、本発明に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上、ならびにその間の中間の長さの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。本発明の状況において、「中間の長さ」が、示される値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なＤＮＡセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
他の実施形態において、本発明は、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列またはそのフラグメント、あるいはその相補配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに関する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野において周知である。例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、および０．２×ＳＳＣで各２０分、６５℃で２回の洗浄を含む。
さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって詳細に意図される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有するが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
（プローブおよびプライマー）
本発明の他の実施形態において、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸のハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。そのようなものとして、本明細書中で開示される１５ヌクレオチド長の連続した配列と同じ配列か、またはこの連続した配列に相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続した配列の配列領域を含む核酸セグメントが、特定の有用性を見出すことが意図される。より長い連続した同一または相補的な配列（例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間長さを含む）および全長配列までの配列）はまた、特定の実施形態において使用される。
このような核酸プローブの、目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプルにおける相補配列の存在を検出における使用を可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異体種プライマーの調製のための配列情報の使用、または他の遺伝的構築物の調製における使用のためのプライマーの使用）もまた想定される。
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチを含む配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。同様のフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定および選択的の両方の二重鎖分子の形成を可能にする。１５塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子は、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善する。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。必要とされる全ては、本明細書中に開示される配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の終端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産物のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントのいずれかの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度に達するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低い塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を使用することが望ましい。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、そして一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
（ポリヌクレオチドの同定および特徴づけ）
ポリヌクレオチドは、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、ｃＤＮＡのマイクロアレイをＨＳＶに関連する発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な組織における発現よりも、感染組織での少なくとも２倍高い発現）についてスクリーニングすることによって、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造者の指示に従ってＳｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して（そして本質的にＳｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、本明細書中で提供される配列に基づいて設計され得、そして購入または合成され得る。
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、ＨＳＶ ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。無作為に刺激されたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましい。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして拡大する。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、さらなる付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中にアセンブルし得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントに連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
あるいは、部分ｃＤＮＡ配列由来の全長コード配列を得るための多くの増幅技術が存在する。このような技術において、増幅は、一般的に、ＰＣＲを介して行われる。種々の市販キットのいずれかを使用して増幅工程を行い得る。例えば、当該分野で周知のソフトウエアを使用してプライマーを設計し得る。プライマーは、好ましくは、長さが２２〜３０ヌクレオチドであり、少なくとも５０％のＧＣ含有量を有し、そして標的配列に約６８℃〜７２℃の温度でアニールする。増幅した領域は、上記に記載されるように配列決定され得、そして重複配列を連続する配列へと構築する。
このような増幅技術の１つは、インバースＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内のフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環状化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ ９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内側プライマーおよび外側プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
（宿主細胞におけるポリヌクレオチド発現）
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現に方向付けるように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの先天的な縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローニングし、そして発現させ得る。
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するヌクレオチド配列をコードするポリペプチドを作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
さらに、本発明のポリペプチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為切断によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位指向性変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドン優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異を導入したりなどし得る。
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から精製されて取り出される。
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｍ，Ｔら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇ，Ｊ．Ｙら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
新たに合成されたペプチドは、分離高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドまたはその任意の部分のアミノ酸配列は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系。
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その長さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターが使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に都合良く使用され得る。
細菌系において、多数の発現ベクターが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、抗体の誘導のために大量に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を方向づけるベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）はまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローニングされた目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）を、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたはヒートショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，ＳまたはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅにおける外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローニングされ得て、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そして外殻タンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが、発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
組換えタンパク質の長期間で高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間の増殖が可能とされ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍら、（１９７７）Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉら、（１９９０）Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高くなっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリヌクレオチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術およびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
ポリヌクレオチドコード化産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドコード化産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイが他の場所に記載される（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）。
広範に種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、発現および細胞培養からタンパク質を回収するのに適した条件下において培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌または含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を方向付けるシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））の封入体を使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊら、（１９９３；ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｏｉｌ，１２：４４１−４５３）において提供される。
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して組み合わせられ得る。
（部位特異的変異誘発）
部位特異的変異誘発は、個々のペプチド、または生物学的に機能的等価なポリペプチドの調製の際に有用な技術であり、この変異誘発は、それらをコードする、基礎を成すポリヌクレオチドの特異的変異誘発を介する。当業者に周知の技術は、例えば、１つ以上の前述の考察を取り入れながら、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡ内に導入することによって配列改変体を調製し、そして試験する迅速な能力をさらに提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の産生を可能にし、横断される欠失結合部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズのプライマー配列および配列複雑性を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、修飾するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成物、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの抗原性）を変更するような開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。そのような実施形態において、代表的におよそ１４ヌクレオチド〜およそ２５ヌクレオチドくらいの長さから成るプライマーが使用され、配列の両側の結合部にある、およそ５残基〜およそ１０残基が変更される。
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位指向性変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに伝達する工程を取り除く部位指向性変異誘発において慣用的に使用される。
一般的に、本発明に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む、一本鎖ベクターを最初に入手する工程またはその配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異した配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供せられる。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さないもともとの鎖をコードし、そして２つめの鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列の配置（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列が入手され得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、鋳型依存的プロセスおよびベクター媒介増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語鋳型依存的プロセスとは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいい、ここで新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対の周知の規則によって指示され得る（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。これらの方法論の例は、具体的にその全体が参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
（ポリヌクレオチド増幅技術）
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼが、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応産物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）であり、欧州特許出願公開番号３２０，３０８（その全体が特に本明細書中に参考として援用される）において開示されている。ＬＣＲにおいては、２つの相補的プローブ対が調製され、そして標的配列の存在下では、各対がその標的の向かい合った相補鎖に結合し、その結果、それらは隣接する。リガーゼの存在下では、これらの２つのプローブ対は、連結して１つの単位を形成する。温度サイクリングによって、ＰＣＲＴＭにおけるのと同様に、結合した連結単位は標的から解離し、次いで過剰のプローブ対の連結のために「標的配列」として働く。米国特許第４，８８３，７５０号（その全体が参考として本明細書中に援用される）は、標的配列に対するプローブ対の結合のためのＬＣＲに類似する増幅の代替方法を記載する。
Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載され、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明におけるなお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的の配列に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加される。このポリメラーゼは、次いで検出され得る複製配列をコピーする。
等温増幅方法（ここで、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖におけるヌクレオチド５’−［α−チオ］三リン酸を含む標的分子の増幅を達成する（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、その全体が参考として本明細書中に援用される））もまた、本発明における核酸の増幅において有用であり得る。
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、複数のラウンドの鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を含む核酸の等温増幅を実行する別の方法である。同様の方法（修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）と呼ばれる）は、本発明において有用であり得る別の増幅方法であり、そして増幅のために標的化される領域全体にわたっていくつかのプローブをアニーリングする工程、続いて４塩基のうちの２塩基のみが存在する修復反応を包含する。他の２塩基は、容易な検出のためにビオチン化誘導体として添加され得る。同様のアプローチは、ＳＤＡにおいて使用される。
配列はまた、周期的プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ ｐｒｏｂｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰＲ）を使用して検出され得る。ＣＰＲにおいて、非標的ＤＮＡの３’配列および５’配列ならびに標的タンパク質特異的ＲＮＡの内部または「中間」配列を有するプローブは、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに際して、反応物はＲＮａｓｅＨで処理され、そしてプローブの産物は、消化後に遊離されるシグナルを生成することによって特有の産物として同定される。もともとの鋳型は、別のサイクリングプローブにアニーリングされ、そして反応が反復される。従って、ＣＰＲは、標的遺伝子特異的な発現した核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって生成されるシグナルを増幅する工程を包含する。
英国特許出願番号２ ２０２ ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるなお他の増幅方法は、本発明に従って使用され得る。前者の出願において、「修飾された」プライマーが、ＰＣＲ様の鋳型および酵素依存性合成において使用される。そのプライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチン）および／または検出体部分（例えば、酵素）で標識することによって修飾され得る。後者の出願において、過剰の標識したプローブがサンプルに添加される。標的配列の存在下において、プローブが結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的配列は、過剰のプローブによって結合されるためにインタクトで遊離される。標識されたプローブの切断は、標的配列の存在をシグナルによって示す。
他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（Ｋｗｏｈら、１９８９；ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ ８８／１０３１５（その全体が本明細書中に参考として援用される））が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、サンプルの熱変性、溶解緩衝液を用いる処理、ならびにＤＮＡもしくはＲＮＡの単離のためのミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩化グアニジウム抽出によって増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的配列に特異的な配列を有するプライマーをアニーリングさせる工程を包含する。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨで消化され、一方、二本鎖ＤＮＡ分子は再度熱変性される。いずれの場合においても、一本鎖ＤＮＡは重合の前の第２の標的特異的プライマーの添加によって完全に二本鎖にされる。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）によって相乗的に転写される。等温サイクル反応において、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、そして再度ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて転写される。得られる産物は、短縮型または完全型のいずれにせよ、標的特異的配列を示す。
欧州特許出願公開番号３２９，８２２（その全体が本明細書中に参考として援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（これらは、本発明に従って使用され得る）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは、第１のプライマーオリゴヌクレオチド（これは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される）のための最初の鋳型である。次いで、ＲＮＡは、得られるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖からリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの二重鎖中のＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって除去される。得られたｓｓＤＮＡは、第２のプライマーのための第２の鋳型（これはまた、その鋳型に対するその相同性に対して５’側であるＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の配列を含む）である。次いで、このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」フラグメントによって例示される）によって伸長させられ、プライマー間にもともとのＲＮＡの配列と同一の配列を有し、そして一方の端にプロモーター配列をさらに有する、二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子として得られる。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製するために適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。次いで、これらのコピーはサイクルに再び入り得、非常に迅速な増幅をもたらす。酵素の適切な選択を用いて、この増殖は、各サイクルで酵素の添加なしに等温で行われ得る。このプロセスのサイクル性の性質のために、開始の配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ ８９／０６７００（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、プロモーター／プライマー配列の多くのこの配列のＲＮＡコピーの転写の前の、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、サイクル性ではない；すなわち、新しい鋳型は、得られたＲＮＡ転写物から産生されない。他の増幅方法には、「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ（Ｏｈａｒａ、１９８９）」が挙げられ、これらは当業者に周知である。
生じる「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有し、それによってジ−オリゴヌクレオチドを増殖する核酸の存在下で２つ（または２より多い）のオリゴヌクレオチドの連結に基づく方法（ＷｕおよびＤｅａｎ、１９９６、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明のＤＮＡ配列の増幅において使用され得る。
（生物学的機能的等価物）
修飾および変化が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお、所望の特性を有するポリペプチドをコードする機能的分子を入手し得る。上述のように、特定のポリヌクレオチド配列に１以上の変異を導入することがしばしば所望される。いくつかの状況において、得られるコードされたポリペプチド配列はこの変異によって変更されるか、または他の場合において、このポリペプチドの配列は、コードするポリヌクレオチドにおける１以上の変異によっては変化しない。
等価物または改善された第２世代の分子さえを作製するために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることが所望される場合、このアミノ酸の変化は、表１に従ってＤＮＡ配列をコードするコドンの１以上を変化させることによって達成され得る。
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、容易に感知できる程度の相互作用的な結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知できる程度の損失なしで、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが本発明者らによって意図される。
Figure 2005522210
 このような変化を作製するために、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次には、そのタンパク質の他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
特定のアミノ酸が同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお同様の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として具体的に援用される）は、タンパク質の生物学的特性と相関するその隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、そのタンパク質の最大局所的平均親水性に言及する。
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、同様の親水性の値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的に等価なタンパク質（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
上記に概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；およびバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに修飾され得る。可能な修飾には以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；バックボーンにおいて、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）結合よりはむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
（インビボポリヌクレオチド送達技術）
さらなる実施形態において、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物は、インビボで細胞に導入される。これは、種々のまたは周知のアプローチのいずれかを用いて達成され得、これらのいくつかは、例示の目的で以下に概説される。
（１．アデノウイルス）
１以上の核酸配列のインビボ送達のための好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を包含する。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）この構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）センス方向またはアンチセンス方向でその中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するため、に十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。当然のことながら、アンチセンス構築物の文脈において、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。アデノウイルスの遺伝的構成の知見（３６ｋｂ、線状、二本鎖ＤＮＡウイルス）は、７ｋｂまでの外来性配列でアデノウイルスＤＮＡの大きな断片を置換することを可能にする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体への組込みを生じない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性を有さないエピソーム性様式で複製し得るからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そして大規模な増幅後にゲノム再構成は検出されなかった。アデノウイルスは、細胞の細胞周期段階に関わりなく、実質的にすべての上皮細胞に感染し得る。今日まで、アデノウイルス感染は、穏やかな疾患（例えば、ヒトの急性呼吸器疾患）にのみに関連しているらしい。
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広範な標的−細胞範囲、および高い感染力のため、遺伝子移入ベクターとしての使用のために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含み、これらは、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、異なる転写単位を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分裂する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節の原因であるタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。後期遺伝子の産物（ウイルスキャプシドタンパク質の大多数を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって与えられる単一の一次転写物の有意なプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期の間に特に効率的であり、そしてこのプロモーターに由来するすべてのｍＲＮＡは、５’−３成分リーダー（ＴＰＬ）配列（この配列は、ＲＮＡを翻訳のために好ましいｍＲＮＡにする）を有する。
現在の系では、組換えアデノウイルスが、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成する。２つのプロウイルスベクター間の可能な組換えに起因して、野生型アデノウイルスは、このプロセスから生成され得る。従って、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離すること、およびそのゲノム構造を調べることが重要である。
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、特有のペルパー細胞株（２９３と称される）に依存し、そのヘルパー細胞株は、Ａｄ５ＤＮＡフラグメントによりヒト胚性腎臓細胞から形質転換され、そしてＥ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから不必要であるので（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の補助のよって、現在のアデノウイルスベクターは、Ｅ１もしくはＤ３のいずれかまたはその両方の領域に、外来ＤＮＡを保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。本質的には、アデノウイルスは、ＤＮＡより約２ｋＢ多い容量を仮定すると、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージし得る（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）。Ｅ１およびＥ３領域で交換可能である約５．５ｋＢのＤＮＡと組合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は、７．５ｋＢより低いか、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスのウイルス性のゲノムの８０％より多くは、ベクター骨格内にあり、そしてベクター保有（ｂｏｒｎｅ）細胞傷害性の供給源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損は、不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現のリーク（ｌｅａｋａｇｅ）は、高い多重感染（ＭＯＩ）で、現在利用可能なベクターで観察された（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
ヘルパー細胞株は、ヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎臓細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性間葉細胞または上皮細胞）に由来し得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容性である他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉細胞または上皮細胞が挙げられる。上記のように、現在、好ましいヘルパー細胞株は、２９３である。
最近、Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞の培養およびアデノウイルスの増殖についての改良方法を開示した。１つのフォーマットにおいて、天然の細胞の凝集物は、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコン処理した攪拌フラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｇｅ、ＵＫ）内に、個々の細胞を接種することによって増殖する。４０ｒｐｍでの攪拌後、細胞生存度を、トリパンブルーで評価する。別のフォーマットにおいて、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を、以下のように使用する。５ｍｌの培地に再懸濁された細胞接種材料を、２５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、そして時々攪拌しながら、１〜４時間、静止させておく。次いで培地を、５０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そして振盪を開始する。ウイルス産生のために、細胞を、約８０％のコンフルーエンスまで増殖させ、その後、培地を置換し（最終容量の２５％まで）、そしてアデノウイルスを０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を、一晩静止させ、その後容量を１００％まで増やし、そしてさらに７２時間の振盪を開始する。
アデノウイルスベクターは、複製欠損または少なくとも条件付で複製欠損であるという必要性以外に、アデノウイルスの特性は、本発明の実施の成功に重要でないと考えられる。アデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆの任意のアデノウイルスであり得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において使用するための条件付複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始物質である。なぜならアデノウイルス５型は、大量の生化学的情報および遺伝学的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、そしてそれは、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物に歴史的に使用されてきたからである。
上記のように、本発明による代表的なベクターは、複製欠損であり、そしてアデノウイルスＥ１領域を有さない。従って、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、Ｅ１コード配列が除去された位置に導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は、本発明に重要ではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）に記載されるように、Ｅ３置換ベクターに、欠失したＥ３領域の代わりに挿入され得るか、またはヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補足するＥ４領域に挿入され得る。
アデノウイルスは、容易に増殖し、かつ容易に操作され、そしてインビトロおよびインビボでの広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高い力価（例えば、１０９〜１０１１プラーク形成ユニット／ｍｌ）で得られ得、そしてそれらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達された外来遺伝子は、エピソーム性であり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。副作用は、野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究において報告されていない（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）。このことは、インビボ遺伝子トランスファーベクターとしてのそれらの安全かつ治療的な可能性を示す。
アデノウイルスベクターを、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチンの開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用した。最近、動物研究は、組換えアデノウイルスは、遺伝子療法に使用され得ることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組換えアデノウイルスを投与する際の研究としては、気管点滴注入法（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）および脳における定位接種法（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。
（２．レトロウイルス）
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染された細胞においてそれらのＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに転換する能力によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じるＤＮＡを、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、そしてウイルスタンパク質を合成させる。この組込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出された配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた宿主細胞ゲノムへの組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
レトロウイルスベクターを構築するために、１つ以上の目的のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入され、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ成分およびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ配列およびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）導入される場合、パッケージング配列は、ウイルス粒子にパッケージングされる組換えプラスミドのＲＮＡの転写を可能にし、次いで培養培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、収集され、必要に応じて、濃縮され、そして遺伝子移入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広範な細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規な方法が最近、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的な付加によるレトロウイルスの化学的な変更に基づいて、開発された。この変更は、シアログリコタンパク質レセプターを介する肝細胞の特異的な感染を可能にし得る。
組換えレトロウイルスの標的化のための異なる方法が、設計され、この方法においては、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体が使用された。この抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主な組織適合性複合体の、クラスＩ型抗原およびクラスＩＩ型抗原に対する抗体を使用して、著者らは、インビトロでエコトロピックウイルスを用いた細胞表面抗原を保持する種々のヒト細胞の感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
（３．アデノ随伴ウイルス）
ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）は、パルボウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）であり、アデノウイルスのストックの汚染物質として発見された。ＡＡＶは、いかなる疾患にも関連していない偏在する（抗体は、アメリカ人の集団の８５％に存在する）ウイルスである。ＡＡＶはまた、ＡＡＶの複製がヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）の存在に依存するので、デペンドウイルスとして分類される。５つの血清型が単離されている。そのうち、ＡＡＶ−２は、最も特徴付けされている。ＡＡＶは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にキャプシド形成され、直径２０ｎｍ〜２４ｎｍの正二十面体のビリオンを形成する、一本鎖の線状ＤＮＡを有する（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８）。
このＡＡＶ ＤＮＡは、約４．７キロ塩基長である。このＤＮＡは、２つのオープンリーディングフレームを含み、そして２つのＩＴＲに隣接される（図２）。ＡＡＶゲノム中には、２つの主な遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ）が存在する。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製を担うタンパク質をコードし、これに対し、ｃａｐは、キャプシドタンパク質ＶＰ１−３をコードする。各々のＩＴＲは、Ｔ形状のヘアピン構造を形成する。これらの末端繰り返しは、染色体組み込みのために必須のＡＡＶのｃｉｓ成分のみである。従って、このＡＡＶは、送達のための遺伝子のカセットで全てのウイルスコード配列が除去および置換されたベクターとして使用され得る。それらの地図位置に従って、３つのウイルスプロモーターが同定され、そしてｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と称されている。ｐ５およびｐ１９からの転写はｒｅｐタンパク質の産生を生じ、そしてｐ４０からの転写はキャプシドタンパク質を産生する（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）。
発現ベクターとしてｒＡＡＶを使用する可能性を研究するために研究者を刺激するいくつかの因子が存在する。１つは、宿主染色体に組み込むために遺伝子を送達する必要が、驚くべきことに少ないことである。１４５ｂｐのＩＴＲ（ＡＡＶゲノムのわずか６％である）を有することが必要である。これは、４．５ｋｂのＤＮＡ挿入物を作製する余地をベクター残す。これは、ＡＡＶが大きな遺伝子を送達するのを妨げ得る、能力を保有するが、本発明のアンチセンス構築物を送達するのに十分に適している。
ＡＡＶはまた、その安全性に起因して、送達ビヒクルの優れた選択である。相対的に複雑な救援機構が存在する：野生型のアデノウイルス遺伝子だけでなく、ＡＡＶ遺伝子もｒＡＡＶを動員する必要がある。同様に、ＡＡＶは、病原性ではなく、そしていかなる疾患にも関連しない。ウイルスコード配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫応答を最小化し、従って、ｒＡＡＶは、炎症応答を招かない。
（４．発現構築物としての他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターを、宿主細胞へのオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の送達のための本発明における発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、レンチウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターを用いてもよい。これらは、種々の哺乳動物細胞に、いくつかの魅力のある特性を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
Ｂ型ヘルペス欠損ウイルスの最近の認識によると、新しい見識は、異なるウイルス配列の構造−機能の関連性を与えた。インビトロでの研究は、このウイルスが、そのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存パッケージングおよび逆転写についての能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。このことは、ゲノムの大部分が外来の遺伝物質と交換され得ることを示唆した。肝臓指向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および持続（組込み）は、肝臓指向性遺伝子移入についての特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇら、（１９９１）は、ポリメラーゼコード配列、表面コード配列、および前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）コード配列に代えて、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。これを、野生型ウイルスと共に、トリ肝癌細胞株へと、同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含む培養培地を用いて、初代仔ガモ肝細胞を感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現を、トランスフェクション後の少なくとも２４日間検出した（Ｃｈａｎｇら、１９９１）。
（５．非ウイルスベクター）
本発明のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の発現をもたらすために、発現構築物は、細胞に送達されなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験手順の際のように、インビトロで達成され得るか、または特定の疾患状態の処置の際のように、インビボもしくはエキソビボで達成され得る。上記のように、送達のための１つの好ましい機構は、ウイルス感染を介する機構であり、ここで、発現構築物は、感染性ウイルス粒子の中にカプセル化される。
一旦、発現構築物が、細胞の中に送達されると、所望のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、異なる部位に配置され、そして異なる部位で発現し得る。特定の実施形態では、この構築物をコードする核酸は、細胞のゲノムの中に安定に組込まれ得る。この組込みは、相同組換えを介する特定の位置および特定の配向であってもよい（遺伝子置換）し、またはこれは無作為な非特異的な位置に組込まれてもよい（遺伝子増強）。なおさらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして、細胞の中で安定に維持され得る。このような核酸セグメント、または「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立して、または宿主細胞周期に同調して維持および複製させるのに十分な配列をコードする。どのように発現構築物を細胞に送達させ、そして細胞の中のどこで核酸を維持するかは、用いられる発現構築物の型に依存する。
本発明の特定の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドから構成されてもよい。この構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過化処理する、上記の方法のいずれかにより行われ得る。このことは、特に、インビトロでの移入に適用可能であるが、これはインビボでの使用でも同様に適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（１９８４）は、ポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓に、リン酸カルシウム沈殿物の形態で首尾良く注入した。これは、能動的ウイルス複製および急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＲｅｓｈｅｆ（１９８６）はまた、沈降リン酸カルシウムプラスミドの直接的腹腔内注入が、トランスフェクトした遺伝子の発現を生じることを実証した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡはまた、インビボで同じ様式で移入され得、遺伝子産物を発現することが想定される。
細胞の中に裸のＤＮＡ発現構築物を移入するための本発明の別の実施形態では、粒子子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を包含し得る。この方法は、ＤＮＡをコートした微粒子を、この粒子が細胞膜を貫き、そして細胞を殺すことなく細胞に侵入することが可能な高速まで加速させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が、開発されている。このような装置の１つは、高電圧放電に依存して電流を発生させ、これは、次いで原動力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。用いられる微粒子は、タングステンビーズまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。
ラットおよびマウスの肝臓組織、皮膚組織、および筋肉組織を含む選択された器官は、インビボでボンバードされた（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。このことは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を除去する（すなわち、エキソビボ処置）ための、組織または細胞の外科的露出を必要とし得る。また、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達され、そしてなお本発明により取りこまれ得る。
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
遺伝子情報の流れの最終的結果は、タンパク質の合成である。ＤＮＡは、ポリメラーゼによってメッセンジャーＲＮＡへと転写され、そしてリボソーム上で翻訳されて、フォールディングされた機能性タンパク質が生じる。従って、この経路に沿って、タンパク質合成が阻害され得るいくつかの段階が存在する。本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするネイティブのＤＮＡセグメントは、すべての哺乳動物ＤＮＡ鎖のように、水素結合により結合された２つの鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を有する。ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡは、センスＤＮＡ鎖と同じヌクレオチド配列を有するが、ただし、そのＤＮＡのチミジンがウリジンに置き換わっている。従って、合成アンチセンスヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡに結合し、そしてそのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドにｍＲＮＡを標的とさせることは、タンパク質合成を妨げるための１つの機構であり、結果的に、強力かつ標的化された治療アプローチを示す。例えば、ポリガラクツウロナーゼの合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号（各々その全体が、本明細書中に特に参考として援用される））。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、１９８８；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、１９８９；Ｐｅｒｉｓら、１９９８；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号（各々その全体が、本明細書中に特に参考として援用される））。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号（各々その全体が、本明細書中に特に参考として援用される））。
従って、例示的実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。
所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列（すなわち、これらの例示的例においては、ラット配列およびヒト配列）の分析ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、相対的安定性の決定に基づき、そしてアンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択された。
ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウエアのバージョン４（Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９９７）およびＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を使用して実施された。
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０ Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９７）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる。
（リボザイム）
タンパク質が伝統的に、核酸の触媒のために使用されているが、別の種類の高分子が、この試みにおいて有用であるとして出現した。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｓｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
リボザイム触媒は、主に、核酸に関与する配列特異的切断／連結反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｅｃｈら、１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号（特に本明細書中に参考として援用される）は、特定のリボザイムが、配列特異性が既知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも高くかつＤＮＡ制限酵素の配列特異性に近い、エンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告している。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻害は、治療適用に特に適切であり得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。最近、リボザイムが適用されたいくつかの細胞株においてそのリボザイムが遺伝子変化を惹起したこと；その変化した遺伝子がオンコジーンであるＨ−ｒａｓ，ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶの遺伝子を含んだことが、報告された。この研究のほとんどは、特定のリボザイムにより切断される特定の変異体コドンに基づく、標的ｍＲＮＡの改変に関した。
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得）る。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素学的に作用するリボザイムの能力に影響を与える。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、１９９２）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
この酵素学的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡモチーフにおいて形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら（１９９２）に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ ０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌら（１９９０）および米国特許第５，６３１，３５９号（本明細書中で特に参考として援用される）に記載される。肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ（１９９２）に記載される。ＲＮａｓｅモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら（１９８３）に記載される。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９０；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９１；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，１９９３）に記載される。そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される（本明細書中で特に参考として援用される）。本発明の酵素学的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する基質結合部位内にヌクレオチド配列を有することまたはこの基質結合部位を取り囲むヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
特定の実施形態において、所望の標的のＲＮＡ（例えば、本明細書中において開示される配列の１つ）に対して高度の特異性を示す、酵素学的切断試薬を産生することが重要であり得る。好ましくは、この酵素学的核酸分子は、標的ｍＲＮＡの高度に保存された配列領域に対して標的化される。このような酵素学的核酸分子は、必要とされる場合、特定の細胞に外因的に送達され得る。あるいは、このリボザイムは、特定の細胞に送達されるＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターから発現され得る。
小さな酵素学的核酸モチーフ（例えば、ハンマーヘッド構造またはヘアピン王像のモチーフ）はまた、外因的送達のために使用され得る。これらの分子の単純な構造は、酵素学的核酸がｍＲＮＡ構造の標的化領域に浸潤する能力を増大させる。あるいは、触媒ＲＮＡ分子は、真核生物のプロモーターより細胞内で発現され得る（例えば、Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２；Ｄｒｏｕｐｕｌｉｃら、１９９２；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。当業者は、任意のリボザイムが、適切なＤＮＡベクター由来の真核生物細胞において発現されることを理解する。このようなリボザイムの活性は、第二リボザイムによる第一転写物からの解放によって増強され得る（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／２３５６９、および国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／０２５９５（これらの両方は、参考として援用される）；Ｏｈｋａｗａら、１９９２；Ｔａｉｒａら、１９９１；ならびにＶｅｎｔｕｒａら、１９９３）。
リボザイムは、直接的に添加されるか、またはリポソーム内にパッケージングされたカチオン性脂質と共に複合体化され（脂質複合体）、さもなければ、標的細胞に送達され得る。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、生体高分子中に取り込んだ状態または取り込んでない状態で、注射、エアロゾル吸入、注入ポンプまたはステントを介して、関連する組織（エキソビボ、またはインビボ）に局所的に投与され得る。
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピンリボザイムを、コンピュータフォールディング（Ｊａｅｇｅｒら、１９８９）によって個々に分析し、リボザイム配列が、適切な２次構造に折り畳まれたかどうかを評価し得る。結合アーム（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｒｍ）と触媒中心との間で好ましくない分子内相互作用を有するこれらのリボザイムは、考慮から外される。種々の結合アームの長さが、活性を最適化するために選択され得る。一般に、各アームにおいて少なくとも５個以上の塩基が標的ＲＮＡに結合するか、さもなくばこの標的ＲＮＡと相互作用し得る。
ハンマーヘッドモチーフまたはヘアピンモチーフのリボザイムは、ｍＲＮＡメッセージの種々の部位に対してアニールするように設計され得、そして化学的に合成され得る。使用される合成の方法は、Ｕｓｍａｎら（１９８７）およびＳｃａｒｉｎｇら、（１９９０）に記載されるように正常のＲＮＡ合成のための手順が使用され、そして一般的な核酸保護基および連結基（例えば、５’末端においてジメトキシトリチルおよび３’末端においてホスホルアミダイト）が使用される。平均的、段階的な連結収率は、代表的に、９８％より高い。ヘアピンリボザイムは、２個の部分で合成され得、そして活性リボザイムを再構築するためにアニールされ得る（ＣｈｏｗｒｉｒａおよびＢｕｒｋｅ、１９９２）。リボザイムは、大規模に改変され得、ヌクレアーゼ耐性基を用いて改変すること（例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−Ｈ（概説のために、例えばＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２を参照のこと））によって安定性が増大され得る。リボザイムは、一般的な方法を使用するゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーによって精製され得、そして水中に再懸濁され得る。
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（国際特許出願番号ＷＯ ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｅｎ、１９９２；国際特許公開番号ＷＯ ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ ９１／０３６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／１３６８８（これには、酵素学的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによる工程が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態またはピル形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許公開番号ＷＯ ９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として特に援用される）に提供される。
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現されることが提供される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、１９９０；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、１９９３；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３；Ｚｈｏｕら、１９９０）。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能し得る（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｒら、１９９２；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｙｕら、１９９３；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３）。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルス、セムリキフォレストウイルス、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
リボザイムを診断道具として使用して、疾患細胞内の遺伝的変動および変異を試験し得る。これらをまた使用して、標的ＲＮＡ分子のレベルを評価し得る。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の緊密な関係は、標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変える分子の任意の領域において変異の検出を可能にする。複数のリボザイムを使用することにより、インビトロならびに細胞および組織でのＲＮＡの構造および機構に対して重要であるヌクレオチドの変化をマップし得る。リボザイムを用いる標的ＲＮＡの切断を使用して、遺伝子発現を阻害し得、そして疾患の進行における特定の遺伝子産物の役割（必須性）を規定し得る。この様式で、他の遺伝子標的が、その疾患の重要な媒介物として、規定され得る。これらの研究は、組合せ治療の可能性（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のリボザイム、公知の低分子インヒビターに結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび／または他の化学的分子もしくは生物学的分子と組み合わせた間欠性処置）を提供することにより、疾患の進行のより良好な処置をもたらす。リボザイムの他のインビトロでの他の使用は、当該分野で周知であり、そしてＩＬ−５に関連する状態に関するｍＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡは、標準的な方法を使用してリボザイムと共に処置した後に、切断産物の存在を決定することによって検出される。
（ペプチド核酸）
特定の実施形態において、本発明者は、本発明の方法の実施において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用を考慮した。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した複数の方法において利用され得る。時々、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡまたはＤＮＡ配列よりも技術的により良く実施され、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有していた。産生方法、使用の特徴付け、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）によって提供され、そして本明細書中で参考として援用される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与される宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
ＰＮＡは、正常なＤＮＡのホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１；Ｈａｎｖｅｙら、１９９２；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，１９９６；Ｎｅｉｌｓｅｎ、１９９６）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要がない）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコル（Ｄｕｅｈｏｌｍら、１９９４）またはＦｍｏｃプロトコル（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５）を、固相ペプチド合成に使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５）。
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。このマニュアルプロトコールは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産生の際に、１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、非効率的に加えられているようである残基の連結を繰り返すべきであることを提案する。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要性の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析器によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を産生および利用した（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５；Ｈａａｉｍａら、１９９６；Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏら、１９９６；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９５；Ｕｌｍａｎｎら、１９９６；Ｋｏｃｈら、１９９５；Ｏｒｕｍら、１９９５；Ｆｏｏｔｅｒら、１９９６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９５；Ｋｒｅｍｓｋｙら、１９９６；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｌａｎｄｓｄｏｒｐら、１９９６；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、１９９６；Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９７；Ｓｅｅｇｅｒら、１９９７；Ｒｕｓｋｏｗｓｋｉら、１９９７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生体中で修飾するタンパク質、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
負に荷電した連結を含有するＤＮＡおよびＲＮＡと比較して、ＰＮＡ骨格は、中性である。この劇的な変更にも係らず、ＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対形成によって相補的なＤＮＡおよびＲＮＡを認識し（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）による初期のモデル化を確認する。ＰＮＡは、３’〜５’の極性を欠き、そして平行様式または逆平行様式のいずれかで結合し得るが、逆平行様式が好ましい（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＤＮＡおよびＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、負に荷電した相補鎖のリン酸骨格の間に静電気的な反発によって不安定化される。対照的に、ＰＮＡ−ＤＮＡまたはＰＮＡ−ＲＮＡの二重鎖において電荷の反発がないことにより、融解温度（Ｔｍ）が上昇し、そして一価のカチオンまたは二価のカチオンの濃度へのＴｍの依存度が減少する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。ハイブリダイゼーションの増加した速度および親和性は重要である。なぜならば、これらは、緩和した二重鎖ＤＮＡ内の相補配列の鎖侵入を実施するようなＰＮＡの驚くべき能力の原因となるからである。さらに、逆方向反復での効果的なハイブリダイゼーションは、ＰＮＡが、二重鎖ＤＮＡ内で効果的に二次構造を認識し得ることを示唆する。増強した認識はまた、表面上に固定化されたＰＮＡで生じ、Ｗａｎｇらは、支持体に結合したＰＮＡが、ハイブリダイゼーション事象を検出するために使用され得ることを示した（Ｗａｎｇら、１９９６）。
相補的な配列に対するＰＮＡの強固な結合がまた、類似の（同じではない）配列との結合を増加し、ＰＮＡ認識の配列特異性を減少させることが予期される。しかし、ＤＮＡハイブリダイゼーションに関して、選択的認識は、オリゴマー長およびインキュベーション温度を平均化することにより達成され得る。さらに、ＰＮＡの選択的ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションよりも低い塩基ミスマッチを許容するＰＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって促進される。例えば、１６ｂｐのＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖内での１個のミスマッチは、１５℃までＴｍを低下させ得る（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。高いレベルの識別は、点変異の分析に対して、数種のＰＮＡに基づく戦略の開発を可能にする（Ｗａｎｇら、１９９６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９６；Ｔｈｉｅｄｅら、１９９６；ＷｅｂｂおよびＨｕｒｓｋａｉｎｅｎ、１９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６）。
高い親和性結合は、ＰＮＡに対する分子認識および新規適用の開発のための明確な利点を提供する。例えば、１１〜１３個のヌクレオチドＰＮＡは、テロメアーゼ（本質的なＲＮＡ鋳型を使用するテロメア末端を伸長するリボヌクレオ−タンパク質）の活性を阻害するが、アナログＤＮＡオリゴマーは、阻害しない（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９６）。
中性ＰＮＡは、アナログＤＮＡオリゴマーよりもより疎水性であり、そしてこのことは、特に、ＰＮＡが高いプリン含有量を有する場合、または二次構造を形成するような能力を有する場合に、このＰＮＡを中性のｐＨで溶解するのをより困難にし得る。これらの溶解度は、１以上の正に電荷をＰＮＡ末端に付与することによって増加され得る（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。
Ａｌｌｆｒｅｙおよび共同実験者による発見は、鎖の侵入が染色体ＤＮＡ内の配列において自然に起こることを示唆している（Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９６）。これらの研究は、ヌクレオチドＣＡＧの三塩基反復に対してＰＮＡを標的化し、そして転写性活性ＤＮＡを精製（Ｂｏｆｆａら、１９９５）し、そして転写を阻害（Ｂｏｆｆａら、１９９６）するためのこの認識を使用した。この結果は、ＰＮＡが細胞内に送達され得た場合、このＰＮＡが遺伝子発現の一般的な配列特異的調節因子となる能力を有することを示唆する。ＰＮＡのアンチセンスおよび抗遺伝子試薬の使用に関する研究および総説には、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３ｂ）、Ｈａｎｖｅｙら（１９９２）、およびＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９７）が挙げられる。Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓら（１９９７）は、ＨＩＶ−１の逆転写を阻害するためにＰＮＡを使用して、ＰＮＡが抗ウイルス治療に使用され得ることを示した。
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づけする方法は、Ｒｏｓｅ（１９９３）およびＪｅｎｓｅｎら（１９９７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドとの結合を決定する。同じタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用してＪｅｎｓｅｎらによって成された。
ＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）、アンチセンス阻害（Ｈａｎｖｅｙら、１９９２）、変異分析（Ｏｒｕｍら、１９９３）、転写の増強（Ｍｏｌｌｅｇａａｒｄら、１９９４）、核酸の精製（Ｏｒｕｍら、１９９５）、転写活性遺伝子の単離（Ｂｏｆｆａら、１９９５）、転写性活性結合因子の阻害（Ｖｉｃｋｅｒｓら、１９９５）、ゲノムの切断（Ｖｅｓｅｌｋｏｖら、１９９６）、バイオセンサー（Ｗａｎｇら、１９９６）、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｔｈｉｓｔｅｄら、１９９６）、およびサザンブロットの代替（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、１９９６）における使用が挙げられる。
（ポリペプチド組成物）
他の局面において、本発明は、ポリペプチド組成物を提供する。一般に、本発明のポリペプチドは、ＨＳＶ由来の単離されたポリペプチド（もしくはエピトープ、改変体、またはその活性フラグメント）である。好ましくは、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列または本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列に対して穏やかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされるポリペプチドである。あるいは、ポリペプチドは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列由来の連続アミノ酸配列を含むポリペプチド、または本明細書中に開示される全体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとして規定され得る。
本発明において、ポリペプチド組成物はまた、本発明のポリペプチド（特に、本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）、あるいは活性フラグメント、またはその改変体もしくは生物学的機能性等価物に対して産生される抗体および／もしくはＴ細胞と免疫学的に反応性である、１以上のポリペプチドを含むと考えられる。
同様に、本発明のポリペプチド組成物は、本明細書に開示されるアミノ酸配列に含まれる１以上の連続する核酸配列、あるいは活性フラグメントまたはその改変体、または中程度から高いストリンジェンシーな条件下で、１以上のこれらの配列とハイブリダイズする１以上の核酸配列によってコードされる１以上のポリペプチドと免疫学的に反応性である抗体もしくはＴ細胞を誘発し得る、１以上のポリペプチドを含むことが理解される。特に、例示的なポリペプチドとしては、配列番号２、３、５、６、７、１０−１２、１４−１５、１７−１８、２０−２３、２５−３３、３９−４７、５０−５１、５４−６４、７４−７５、９０−９７、１２０−１２１、１２２−１４０、１４２−１４３、１５３−１７８、１８１、１９５−２０５、２１１−２１２、２１５−２１６、２２７−２３９、２４１、２４３、２４８−２５０、２５３−２５４および２５５−２６７に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの活性フラグメントは、ポリペプチドの全体または一部を含み、これは、従来の技術（例えば、突然変異誘発）により、または付加、失欠、もしくは置換によって改変されるか、活性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなポリペプチドとして、実質的に同一の構造的機能性、抗原性などを示す。
特定の例示的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、ＨＳＶ抗原あるいはそれの改変体または生物学的機能的均等物の免疫原性の少なくとも一部分を含み得る。本明細書に記載のポリペプチドは、任意の長さであり得る。ネイティブなタンパク質および／または非相同的な配列由来のさらなる配列が存在し得、そしてこのような配列は、さらに免疫原性特性または抗原性特性を有し得るが、必要であるわけではない。
本明細書中で使用される場合、「免疫原性部分」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）タンパク質の一部である。一般に、このような免疫原性部分は、ＨＳＶタンパク質またはそれの改変体の、少なくとも５個のアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、そしてさらにより好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基を含む。特定の好ましい免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されているペプチドを含む。他の好ましい免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して、少ないＮ末端および／またはＣ末端失欠（例えば、１〜３０個のアミノ酸、好ましくは、５〜１５個のアミノ酸）を含み得る。
免疫原性部分は、一般的にＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに引用される参考文献に要約されるような周知技術を使用して、同定され得る。このような技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／あるいはＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程を包含する。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてそのタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない）場合、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を使用して調製され得る。ネイティブのＨＳＶタンパク質の免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）その全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に小さくないレベルで、このような抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。このような免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、その全長ポリペプチドの反応性と類似またはそれより大きいレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは、一般的に、当業者に周知の方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載のような技術）を使用して行われ得る。例えば、ポリペプチドを固体支持体に固定し、そして患者の血清を接触させて、その血清中の抗体をその固定されたポリペプチドに結合させ得る。次いで、結合されなかった血清を除去し、結合された抗体を、例えば、１２５Ｉ標識化プロテインＡを使用して検出し得る。
上記のように、組成物は、ネイティブのＨＳＶタンパク質の改変体を含み得る。本明細書中で使用される場合、ポリペプチド「改変体」は、ネイティブのＨＳＶタンパク質と、１以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なるポリペプチドであり、その結果、そのポリペプチドの免疫原性が、実質的には減少されない。言い換えると、抗原特異的な抗血清と反応する改変体の能力は、そのネイティブタンパク質と比較して、増強されても、または変化されなくてもよく、あるいは、そのネイティブタンパク質と比較して、５０％未満、そしてより好ましくは、２０％未満で減少されてもよい。このような改変体は、一般に、本明細書中に記載のように、上記ポリペプチド配列の１つを改変し、この改変ポリペプチドの抗原特異的な抗体または抗血清との反応性を評価することによって同定され得る。好ましい改変体は、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が取り除かれた改変体を含む。他の好ましい改変体は、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が、成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から取り除かれた改変体を含む。
本発明によって含まれるポリペプチド改変体は、本明細書中に開示されたポリペプチドに対して、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％以上の同一性（上記のように決定された）を示すポリペプチド改変体を含む。
好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換されている置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）性質が、実質的に変化されないことを予測する。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；および類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５または５より少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性性質に最小限の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
ポリペプチドは、任意の種々の周知技術を使用して調製され得る。上記のようなＤＮＡ配列によってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用して、ＤＮＡ配列から容易に調製され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、および高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞および植物細胞）が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地中に分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清は、市販のフィルターを使用して、最初に濃縮され得る。濃縮後、この濃縮物を、適切な精製マトリックス（例えば、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂）に適用し得る。最終的に、１以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。
約１００アミノ酸未満、そして一般に、約５０アミノ酸未満のアミノ酸を有する部分および他の改変体もまた、当業者に周知の技術を使用して、合成手段によって生成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、任意の市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（ここでは、アミノ酸が連続的に付加されて、アミノ酸鎖を成長させる））を使用して、合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給者から市販され、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知のタンパク質）を含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質（発現エンハンサー）を発現する際に補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増加するように、またはタンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーには、親和性タグ（これは、タンパク質の精製を容易にする）が挙げられる。
融合タンパク質は、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合タンパク質は、発現系において、組換えタンパク質として発現され、非融合タンパク質と比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々にアセンブルし得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同じ相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳を可能にする。
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド構成要素を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）フレキシブルな伸長したコンホメーションを採る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
融合タンパク質もまた提供される。このようなタンパク質は、関連しない免疫原性ポリペプチドと共に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含む。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、ほぼ３分の１のタンパク質（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端に含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
別の実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａｌ２ポリヌクレオチドは、本発明のＨＳＶポリヌクレオチドの免疫原性の少なくとも一部分に連結される。異種ポリヌクレオチド配列の発現を増大させることにおいて、これらの使用のためのＲａｌ２組成物および方法は、米国特許出願第６０／１５８，５８５号に記載され、これらの開示はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短には、Ｒａｌ２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性株および非病原性株の中の遺伝子によりコードされる３２ＫＤの分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、開示されている（米国特許出願第６０／１５８，５８５号；Ｓｋｅｉｋｙら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８−４００７も参照のこと（本明細書中に参考として援用される））。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＲａｌ２ Ｃ末端フラグメントは、それ自身で高レベルで発現し、そして精製プロセスを通して可溶性タンパク質のままである。さらに、融合タンパク質の中のＲａｌ２ポリペプチドフラグメントの存在は、Ｒａｌ２が融合された異種抗原性ＨＳＶポリペプチドの免疫原性を増大させ得る。１つの実施形態において、ＨＳＶ抗原との融合ポリペプチドに存在するＲａｌ２ポリペプチド配列は、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３のいくつかまたはすべてを含む。
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）への親和性についての原因である。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために開発された。アミノ酸末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
一般に、本明細書に記載されるようなポリペプチド（融合タンパク質を含む）およびポリヌクレオチドが単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然の環境の一部でないベクターにクローニングされる場合、単離されていると考えられる。
（結合因子）
本発明は、さらにＨＳＶタンパク質に特異的に結合する因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。本明細書において用いる場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＳＶタンパク質と検出可能レベルで反応し（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）、そして類似の条件下で無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない場合、ＨＳＶタンパク質に「特異的に結合する」といわれる。本明細書において用いる場合、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、「複合体」が形成されるような２つの別々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、複合体の濃度を成分濃度の積で割って得られる値である。一般に、２つの化合物は、複合体形成の結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合、本発明の文脈中で「結合している」といわれる。結合定数は、当該分野で周知の方法を用いて決定され得る。
結合因子は、本明細書において提供される代表的アッセイを用いて、ＨＳＶ感染を有する患者と有さない患者の間でさらに区別され得る。例えば、好ましくは、ＨＳＶタンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、疾患を有する少なくとも約２０％の患者においては感染の存在を示すシグナルを生成し、そしてＨＳＶ感染を有さない少なくとも約９０％の個体においては疾患の存在しないことを示すネガティブなシグナルを生成する。結合因子がこの要件を満たすか否かを決定するために、ＨＳＶを有する患者およびＨＳＶを有さない患者（標準的臨床試験を用いて決定した場合）由来の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または生検）は、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載のようにアッセイされ得る。疾患を有するサンプルおよび疾患を有さないサンプルの、統計的に有意な数のサンプルをアッセイすべきであることが明白である。それぞれの結合因子は、上記の基準を満たすべきであるが、当業者は、結合因子が感受性を改善する組み合わせで用いられ得ることを認識する。
上記の要件を満たす任意の因子が結合因子であり得る。例えば、結合因子はリボソーム（ペプチド成分を伴うかまたは伴わない）、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、組換え抗体の産生を可能にするために、細胞培養技術（本明細書中に記載のモノクローナル抗体の産生を含む）によってか、または適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、抗体は産生され得る。１つの技術では、ポリペプチドを含む免疫原は、任意の広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）にまず注射される。この工程で、本発明のポリペプチドは、改変なしの免疫原としてはたらき得る。あるいは、特に、相対的に短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合する場合、優れた免疫応答が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは所定のスケジュール（１回以上のブースター免疫を組み込む）に従って、動物宿主に注射され、そしてこの動物は、定期的に採血される。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、安定な固体支持体に結合しているポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
目的の抗原性ポリペプチドについて特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術、ならびにその改良型を使用して調製され得る。手短に言うと、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように、免疫された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間組み合わせられ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地上で低密度でプレートされる。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常約１〜２週間）後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてそれらの培養上清が、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
モノクローナル抗体を、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離し得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注入）が、収量を増大させるために利用され得る。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から収集し得る。夾雑物を、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出）によって抗体から除去し得る。本発明のポリペプチドを、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程における精製工程において使用し得る。
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましくあり得る。このようなフラグメントは、標準的な技術を使用して調製され得るＦａｂフラグメントを含む。手短に言うと、免疫グロブリンを、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィー（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）によってウサギ血清から精製し得、そしてパパインによって消化して、ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを産生し得る。ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによって分離され得る。
本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療薬剤に結合され得る。この点において適切な薬剤は、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびその誘導体を含む。好ましい放射性核種には、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが含まれる。好ましい薬物には、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが含まれる。好ましい分化誘導剤には、ホルボールエステルおよび酪酸が含まれる。好ましい毒素には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれる。
治療剤は、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで（例えば、リンカー基を介して）適切なモノクローナル抗体にカップリング（例えば、共有結合によって）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が互いに反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物）または良好な遊離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基などと反応し得る。
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とをカップリングさせることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるために働き得、従ってカップリング効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にし得、これはさもなければ可能ではない。
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中への内部移行の間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきた。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
１つより多い薬剤を抗体にカップリングさせることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、複数の薬剤の分子が１つの抗体分子にカップリングされる。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体にカップリングされ得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的にカップリングされ得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアには、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）を含む。キャリアはまた、例えばリポソームベシクル内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
抗体および免疫結合体についての投与の種々の経路が使用され得る。代表的には、投与は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などである。抗体／免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、抗原密度、および抗体のクリアランスの速度に依存して変化することは明白である。
（Ｔ細胞）
免疫治療組成物はまた、あるいは、ＨＳＶタンパク質に特異的なＴ細胞を含み得る。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
Ｔ細胞は、ＨＳＶポリペプチド、ＨＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、このポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下で十分な時間、行われる。特定の実施形態において、ＨＳＶポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特異的Ｔ細胞の生成を容易にする。
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、またはＨＳＶポリペプチドで被覆されるかもしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、ＨＳＶポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間のＨＳＶポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じるべきである。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように、Ｔ細胞の活性化を生じるべきであり、ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ １９９８）を参照のこと）。ＨＳＶポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されているＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。ＨＳＶタンパク質特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して展開され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および展開後にその患者に投与される。
治療目的で、ＨＳＶポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に展開され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、ＨＳＶポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチド、および／またはＨＳＶポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、ＨＳＶタンパク質の存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物に、単独で、または１つ以上の他の様式の療法との組み合わせのいずれかで投与するための、薬学的に受容可能な溶液中の本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の処方物に関する。
所望の場合、本明細書に開示されるようなポリペプチドを発現する核酸セグメント、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡ組成物は、同様に、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤）と組み合わせて投与され得ることがまた理解される。事実、さらなる薬剤が、標的細胞または宿主組織との接触の際に有意な有害な効果を引き起こさなければ、また含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、これらの組成物は、特定の場合に必要とされる種々の他の薬剤とともに送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物は、置換されたか、または誘導体化されたＲＮＡまたはＤＮＡ組成物をさらに含み得る。
薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は当業者に周知であり、これは、種々の処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内および筋肉内投与および処方が挙げられる）における、本明細書中に記載される特定の組成物の使用についての適切な用量および処置レジメンの開発である。
（１．経口送達）
特定の適用において、本明細書に開示される薬学的組成物は、経口投与を介して動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性な希釈剤とともに処方され得るか、もしくは吸収可能な食用キャリアとともに処方され得るか、または、それらは、硬質シェルまたは軟質シェルのゼラチンカプセルに封入され得るか、またはそれらは、錠剤に圧縮され得るか、またはそれらは、治療食の食物と、直接混合され得る。
活性な化合物は、賦形剤となお混合され得、そして経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、カシェ剤などの形態で使用され得る（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、１９９７；Ｈｗａｎｇら、１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号（各々は、本明細書中で、その全体が参考として具体的に援用される））。錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、以下を含み得る：バインダー（例えば、カラヤゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、添加され得るスクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）。投薬単位形態が、カプセルである場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、脂質キャリアを含み得る。種々の他の材料は、コーティングとして存在し得るか、または投薬単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、シェラックか、糖か、または両方でコートされ得る。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味料としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピパラベン、色素および香料（例えば、チェリーまたはオレンジ味）を含み得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であるべきであり、そして使用される量で実質的に無毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放性調製物および処方物に組み込まれ得る。
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含み得るが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合に、全処方物の重量または体積の約１％または２％と、約６０％または７０％以上との間であり得る。自然に、治療的に有用な処方物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような要因、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって企図され、そしてそのように、種々の投薬量および処置レジメンが、所望され得る。
あるいは、経口投与について、本発明の処方物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。例えば、うがい薬は、活性成分を、必要とされる量で、適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ溶液））に組み込むように調製される。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、バインダー、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
（２．注入送達）
特定の状況において、本明細書に開示される薬学的組成物を、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号（各々は、その全体が、本明細書中で参考として具体的に援用される）に記載されるように、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、または腹腔内にでさえ、送達することが所望される。遊離塩基としての活性化合物または薬理学的受容可能な塩の溶液は、水中で界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合されて、調製され得る。分散系はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、そしてオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
注入用途のために適切な薬学的形態は、滅菌水溶液または分散系および滅菌注射用溶液または分散系の即時調製のための滅菌散剤を含む（米国特許第５，４６６，４６８号（これは、本明細書中でその全体が参考として具体的に援用される））。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易な注射能力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、溶媒または、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散系の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが、好ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によって、もたらされ得る。
水溶液中での非経口投与のために、例えば、必要な場合、その溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の知見を考慮して、当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張のＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して、必ず生じる。投与に責任のある人物は、いずれにしても、個々の被験体のための適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与に対して、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、および一般的な安全性標準および純度標準を満たさなくてはならない。
滅菌注入溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を、上記に列挙される種々の他の成分と混合し、必要ならば、濾過滅菌して調製される。一般に、分散系は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上に列挙される成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注入溶液の調製のための滅菌散剤の場合において、調製の好ましい方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらは、活性成分の散剤および既に滅菌濾過された溶液から任意のさらなる所望の成分を得る。
本明細書中に開示される組成物は、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含み、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸、リン酸など）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成された塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄（ＩＩＩ））、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。この処方物は、種々の投薬形態（例えば、注入溶液、薬物放出カプセルなど）で容易に投与される。
本明細書中で使用される場合、「キャリア」は、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。どの従来の媒体または薬剤も、活性成分と不適合でない限り、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。
語句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生成しない分子実体および組成物をいう。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。代表的に、このような組成物は、注入可能物として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され；注入前に、液体中の溶液、液体中の懸濁液に適切な固体形態もまた、調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。
（３．経鼻送達）
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号（各々は、本明細書中で、その全体が、参考として特に援用される）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号（本明細書中で、その全体が参考として特に援用される））を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が、参考として本明細書中で特に援用される）に記載される。
（４．リポソーム媒介送達、ナノカプセル媒介送達、および微粒子媒介送達）
特定の実施形態において、本発明者らは、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフィア、脂質粒子、小胞などを、本発明の組成物の適切な宿主細胞への導入のために、使用することを、企図する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化されて、送達のために処方され得る。
このような処方物は、本明細書中に開示される核酸または構築物の薬学的に受容可能な処方物の導入のために好ましくあり得る。リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に公知である（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ、１９８８；Ｌａｓｉｃ、１９９８；これらは、細胞内細菌感染および細胞内細菌疾患に対する標的化抗生物質治療におけるリポソームおよびナノカプセルの使用を記載する）。近年、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが、開発された（ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９８８；ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｕｎ，１９８７；米国特許第５，７４１，５１６号（その全体が、参考として本明細書中で特に援用される））。さらに、潜在的な薬物キャリアとしての、リポソーム調製物およびリポソーム様調製物の種々の方法は、総説されている（Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎら，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，１９９５；米国特許５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許５，５６５，２１３号；米国特許５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（各々、その全体が、参考として本明細書中で特に援用される））。
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションに通常耐性である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、１９９０；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達システムを代表するＤＮＡ長制限がない。リポソームは、遺伝子、薬物（ＨｅａｔｈおよびＭａｒｔｉｎ，１９８６；Ｈｅａｔｈら、１９８６；Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓら、１９８９；ＦｒｅｓｔａおよびＰｕｇｌｉｓｉ，１９９６）、放射線治療剤（Ｐｉｋｕｌら、１９８７）、酵素（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ａ；Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ｂ）、ウイルス（ＦａｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８４）、転写因子およびアロステリックエフェクター（ＮｉｃｏｌａｕおよびＧｅｒｓｏｎｄｅ、１９７９）を、種々の培養された細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソーム媒介薬物送達の有効性を試験するいくつかの成功した臨床試験が、完了している（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら、１９８５ａ；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ、１９８８；Ｓｃｕｌｉｅｒら、１９８８）。さらに、いくつかの研究は、リポソームの使用が、全身送達後の、自己免疫応答、毒性または生殖腺局在化に関連しないことを示唆している（ＭｏｒｉおよびＦｕｋａｔｓｕ、１９９２）。
リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層の同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成を生じる。この単層小胞は、そのコアに水溶液を含む２００〜５００Åの直径を有する。
リポソームは、細胞膜との類似点を有し、そしてペプチド組成物のためのキャリアとして、本発明と関連した使用が企図される。それらは、トラップされ得る水溶性物質および脂溶性物質の両方として（すなわち、それぞれ水性空間において、そして二重層自体内で）、広範に適切である。薬物保有リポソームは、リポソーム処方物を選択的に改変することによって、活性薬剤の部位特異的送達のためにさらに使用され得ることが可能である。
Ｃｏｕｖｒｅｕｒら（１９７７；１９８８）の教示に加えて、以下の情報が、リポソーム処方物を作製する際に利用され得る。リン脂質は、水中に分散される場合、水に対する脂質のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比において、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価のカチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対する低い透過性を示し得る。しかし、高温において、リポソームは、それらの透過性を顕著に変える相転移を受ける。この相転移は、密にパッキングした秩序構造（ゲル状態として既知）から、ゆるくパッキングした秩序性の低い構造（流体状態として既知）への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度で起こり、そしてイオン、糖および薬物に対する透過性の増加を生じる。
温度に加えて、タンパク質への暴露は、リポソームの透過性を変更し得る。特定の可溶性タンパク質（例えば、シトクロムｃ）は、二重層に結合し、その二重層を変形させ、そしてその二重層を貫通し、それによって、透過性の変化を引き起こす。コレステロールは、リン脂質をより密にパッキングすることによって、明らかにタンパク質のこの貫通を阻害する。抗生物質およびインヒビターの送達のための最も有用なリポソーム処方物が、コレステロールを含むことが企図される。
溶質をトラップする能力は、異なるタイプのリポソーム間で変化する。例えば、ＭＬＶは、溶質のトラッピングにおいて、中程度に効率的であるが、しかし、ＳＵＶは、極端に非効率である。ＳＵＶは、サイズ分布における均一性および再現性についての利点を提供するが、サイズとトラップ効率との間の歩み寄りが、大きい単層小胞（ＬＵＶ）によって提供される。これらは、エーテルエバポレーションによって調製され、そしてＭＬＶのトラップより溶質のトラップが、３〜４培効率的である。
リポソームの特徴に加えて、トラップ化合物における重要な決定因子は、化合物自体の物理化学的特性である。極性化合物は、水性空間にトラップされ、そして非極性化合物は、小胞の脂質二重層に結合する。極性化合物は、浸透を通してか、または二重層が壊れた場合に放出されるが、非極性化合物は、温度によって崩壊するか、またはリポタンパク質に暴露されるまで、二重層に関係したままである。両方のタイプは、相転移温度において、最大の流出速度を示す。
リポソームは、以下の４つの異なる機構を介して細胞相互作用する：細網内皮系の食作用細胞（例えば、マクロファージおよび好中球）によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力もしくは静電力によってか、または細胞表面成分との特異的な相互作用によってかのいずれかによる、細胞表面への吸着；リポソーム内容物の細胞質への刺激性放出を伴う、リポソームの脂質二重膜の形質膜への挿入による形質細胞膜との融合；およびリポソーム内容物の任意の会合がなく、リポソーム脂質の細胞膜または細胞内膜への移動、またはその逆による。どの機構が作用しているのか、そして１より多い機構が同時に作用しているのかを、決定することはしばしば困難である。
静脈内注入されたリポソームの運命および性質は、それらの物理的特質（例えば、サイズ、流動性、および表面電荷）に依存する。それらは、それらの組成に依存して数時間〜数日の間、組織内で持続し得、そして血液の範囲で分〜数時間の半減期を有する。より大きいリポソーム（例えば、ＭＬＶおよびＬＵＶ）は、細網内皮系の食作用細胞によって、急速に取り込まれるが、循環器系の生理学は、ほとんどの部位においてこのような大きな種の放出を制限する。それらは、大きな開口部または孔が、毛細管の内皮（例えば、肝臓および脾臓の洞様毛細血管）に存在する場所においてのみ出て行く。従って、これらの器官は、取り込みの主な部位である。一方で、ＳＵＶは、より広い組織分布を示すが、なおも肝臓および脾臓において、高度に隔離される。一般に、このインビボ挙動は、リポソームの、それらの大きなサイズへのアクセス可能な、これらの器官および組織のみへの潜在的な標的化を制限する。これらは、血液、肝臓、脾臓、骨髄およびリンパ器官を含む。
標的化は、一般的には、本発明に関しては限定ではない。しかし、特定の標的化が所望される場合は、これを達成する方法が利用可能である。抗体は、リポソーム表面に結合するため、そしてその抗体およびその薬物内容物を特定の細胞型表面上に位置する特定の抗原性レセプターへと指向するために使用され得る。糖質決定基（細胞間の認識、相互作用および接着にて役割を果たす、糖タンパク質または糖脂質細胞表面成分）もまた、それらは特定の細胞型にリポソームを指向させることに能力を有するので、認識部位として使用され得る。たいてい、リポソーム調製物の静脈内注射が使用されることが企図されるが、他の投与経路も考えられる。
あるいは、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供し得る。ナノカプセルは、安定かつ再現可能な様式で、一般的に化合物を捕捉する（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄら、１９８７；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、１９８８；Ｄｏｕｇｌａｓら、１９８７）。過剰な細胞内ポリマー負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微細粒子（約０．１μｍの大きさ）が、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリル酸ナノ粒子が、本発明における使用のために企図される。このような粒子は、記載されるように（Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９８０；１９８８；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎら、１９９８；Ｚａｍｂａｕｘら、１９９８；Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙら、１９９５および米国特許第５，１４５，６８４号（本明細書中にその全体が参考として特に援用される））、容易に作製され得る。
（ワクチン）
本発明の特定の好ましい実施形態において、ワクチンが提供される。このワクチンは一般的に、免疫刺激剤と組み合わせて、１つ以上の薬学的組成物（例えば、上記のようなもの）を含む。免疫刺激剤は、外因性抗原に対する免疫応答（抗体媒介性および／または細胞媒介性）を促進または増強する任意の物質であり得る。免疫刺激剤の例としては、アジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクトシド）およびリポソーム（その化合物が中に組み込まれる；例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号を参照のこと）が挙げられる。ワクチン調製物は、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）に一般的に記載されている。本発明の範囲内にある薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性であっても不活性であってもよい、他の化合物を含み得る。例えば、他のＨＳＶ抗原の１つ以上の免疫原性部分が、その組成物またはワクチン中に、融合ポリペプチドへと組み込まれてかまたは別個の化合物としてかのいずれかで、存在し得る。
例示的ワクチンは、上記のようなポリペプチドのうちの１つ以上をコードするＤＮＡを、そのポリペプチドがインサイチュで生成されるように含み得る。上記のように、そのＤＮＡは、当業者に公知の種々の送達系（核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系を含む）のいずれかに存在し得る。多数の遺伝子送達技術が当該分野で周知であり、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５：１４３〜１９８、１９９８およびその中に引用される参考文献により記載される技術である。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターおよび終止コドン（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ））を含む。細菌送達系は、その細胞表面上にそのポリペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープを分泌する、細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を包含する。好ましい実施形態において、そのＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用して導入され得、このウイルス発現系は、非病原性（欠損）複製コンピテントウイルスの使用を含み得る。適切な系は、例えば、以下に開示される：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ ２，２００，６５１：ＥＰ ０，３４５，２４２号；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。このような発現系にＤＮＡを組み込む技術は、当業者に周知である。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載されそしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３により概説されるように、「裸」でもあり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコートすることによって増加され得る。ワクチンがポリヌクレオチド成分およびポリペプチド成分の両方を含み得ることは、明らかである。このようなワクチンは、増強した免疫応答を提供し得る。
ワクチンが、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、薬学的に受容可能な非毒性塩基（有機塩基（例えば、一級アミンの塩、二級アミンの塩および三級アミンの塩、ならびに塩基性アミノ酸の塩）ならびに無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明のワクチン組成物にて使用され得るが、キャリアの型は、投与様式に依存して変化する。本発明の組成物は、適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む）のために処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）のために、そのキャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝剤を含む。経口投与のために、上記のキャリアのいずれか、または固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、および炭酸マグネシウム）が使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変肝炎Ｂコアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９ ４０９３４およびこの中で挙げられた参考文献（これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載のキャリア系）もまた、適切である。米国特許第５，９２８，６４７号に記載される微粒子−タンパク質複合体を含むキャリアもまた使用され得、このようなキャリアは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
このような組成物はまた、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱い高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。化合物はまた、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。
種々の任意の免疫刺激剤が、本発明のワクチンにおいて使用され得る。例えば、アジュバントが含まれ得る。ほとんどのアジュバントは、抗原を迅速な異化作用から保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のタンパク質またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム塩、鉄塩または亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；カチオン誘導体化多糖またはアニオン誘導体化多糖；ポリフォスファーゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａとして市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、あるいはインターロイキン−２、インターロイキン−７、またはインターロイキン−１２）もまた、アジュバントとして使用され得る。
本明細書中に提供されるワクチンにおいて、そのアジュバント組成物は、好ましくは、優勢にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
優勢なＴｈ１型応答を惹起する際の使用に好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ））とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（そのＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、優勢なＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ ９６／０２５５５、ＷＯ ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列もまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２、１９９６により記載されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン（好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）であり、これは、単独でも他のアジュバントと組み合わせても使用され得る。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ）またはＷＯ ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応生成が低い（ｌｅｓｓ ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）組成物を含む。他の好ましい処方物は、水中油エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む、特に強力なアジュバント処方物が、ＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。
他の好ましいアジュバントとしては、Ｍｏｎｔｈａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ならびに他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号（その開示は、全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるもの）が挙げられる。他の好ましいアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９Ａ１に記載される）が挙げられる。
本明細書中に提供される任意のワクチンは、抗原、免疫応答エンハンサーおよび適切なキャリアもしくは賦形剤の組み合わせを生じる、周知の方法を使用して調製され得る。本明細書中に記載される組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後に化合物のゆっくりした放出をもたらす、カプセル、スポンジまたはゲル（例えば、多糖から構成される）のような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般的に、周知の技術（例えば、Ｃｏｏｍｂｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １４：１４２９〜１４３８、１９９６を参照のこと）を使用して調製され得、そしてたとえば、経口投与、直腸投与もしくは皮下移植または所望の標的部位への移植により投与され得る。徐放性処方物は、キャリアマトリックス中に分散されており、そして／または速度制御膜により囲まれた貯蔵物中に含まれる、ポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは抗体を含み得る。
このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた、生分解性であり得；好ましくはその処方物は、比較的一定なレベルの活性成分放出を提供する。このようなキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の遅延性放出キャリアとしては、超分子バイオベクター（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）が挙げられ、これは、非脂質親水性コア（例えば、架橋した多糖またはオリゴ糖）と、必要に応じて両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含む外層とを含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ ９６／０６６３８を参照のこと）。徐放性処方物中に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予想持続期間、ならびに処置もしくは予防される状態の性質に依存する。
種々の任意の送達ビヒクルが、ＨＳＶ細胞感染を標的とする抗原特異的免疫応答の生成を促進するために、薬学的組成物およびワクチンにて使用され得る。送達ビヒクルとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、ならびに有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）が挙げられる。このような細胞は、抗原を提示するための能力を増加するように、Ｔ細胞応答の活性化および／もしくは維持を改善するように、それ自体が抗ＨＳＶ効果を有するように、そして／または受容物と免疫学的に適合性（すなわち、一致したＨＬＡハロタイプ）であるように、遺伝子改変され得るが、必ずしもその必要はない。ＡＰＣは、一般的には、種々の生物学的流体ならびに器官のいずれかから単離され得、そして自系細胞でも、同種異系細胞でも、同系細胞でも、または異種細胞でもよい。
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆体を使用する。樹状細胞は、非常に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５〜２５１、１９９８）、そして、予防的免疫または治療的免疫応答を惹起するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ，Ｍｅｄ．５０：５０７〜５２９、１９９９を参照のこと）。一般的には、樹状細胞は、その代表的形状（インサイチュで星状であり、顕著な細胞質突起（樹状突起）がインビトロで見える）、高効率に抗原を取り込み、プロセッシングして提示する能力、ならびに未刺激Ｔ細胞応答を活性化する能力に基づいて同定され得る。樹状細胞は、当然、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常は見出されない特定の細胞表面レセプターもしくはリガンドを発現するように操作され得、そしてそのような改変樹状細胞が、本発明により企図される。樹状細胞の代替物として、分泌小胞抗原ロード樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）（エキソソームと呼ばれる）が、ワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：５９４〜６００、１９９８を参照のこと）。
樹状細胞および前駆体が、末梢血、骨髄、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、あるいは他の適切な任意の組織もしくは体液から入手され得る。例えば、樹状細胞は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦα）の組み合わせを末梢血から収集した単球の培養物に添加することによって、エキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集したＣＤ３４陽性細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを、培養培地に添加することによって、樹状細胞へと分化され得る。
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として簡便に分類されており、これにより、簡単な方法によって２つの十分に特徴づけられた表現型間を区別することが可能である。しかし、この命名法は、可能なすべての分化の中間段階を排除すると見なされるべきではない。未熟樹状細胞は、抗原取り込みおよびプロセッシングについて高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、これはＦｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高発現と相関する。成熟表現型は、代表的には、これらのマーカーの低い発現により、しかしＴ細胞活性化の原因である細胞表面分子（例えば、クラスＩ ＭＨＣおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ））の高発現により、特徴付けられる。
ＡＰＣは、一般的には、ＨＳＶタンパク質（あるいはその一部もしくは他の改変体）をコードするポリヌクレオチドで、そのＨＳＶポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上で発現されるように、トランスフェクトされ得る。このようなトランスフェクションは、エキソビボで生じ得、次いで、このようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書中に記載されるような治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが患者に投与され得、インビボで生じるトランスフェクションをもたらす。例えば、樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、一般的には、当該分野で公知の任意の方法（例えば、ＷＯ ９７／２４４４７に記載される方法、あるいはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６〜４６０、１９９７により記載される遺伝子銃アプローチ）を使用して実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を、ＨＳＶポリペプチド、ＤＮＡ（裸またはプラスミドベクター内）もしくはＲＮＡとともに、または抗原を発現する組換え細菌もしくは組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター）とともに、インキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、そのポリペプチドは、Ｔ細胞の補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合により結合体化され得る。あるいは、樹状細胞は、非結合体化免疫学的パートナーを用いて、別々にかまたはそのポリペプチドの存在下で、パルスされ得る。
ワクチンおよび薬学的組成物は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、シールされたアンプルまたはバイアル）にて提供され得る。このような容器は、好ましくは、使用するまで処方物の滅菌性を保存するために密封シールされる。一般的には、処方物は、油状ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、ワクチンまたは薬学的組成物は、滅菌した液体キャリアを使用直前に添加することのみ必要な、凍結乾燥状態で保存され得る。
（免疫治療適用）
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載される組成物は、ＨＳＶ感染の免疫治療に使用され得る。このような方法において、薬学的組成物およびワクチンは代表的には、患者に投与される。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物（好ましくはヒト）をいう。上記薬学的組成物およびワクチンは、ＨＳＶによる感染を薬学的に予防するためかもしくは、ＨＳＶによる感染の程度を薬学的に緩和するためか、または、ＨＳＶにすでに感染した患者を薬学的に処置するために、使用され得る。投与は、適切な任意の方法（静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻内経路、皮内経路、肛門経路、膣経路、局所経路および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
特定の実施形態において、免疫療法は、能動免疫療法であり得、この能動免疫療法において、処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中に提供されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与による、ＨＳＶ感染に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
他の実施形態において、免疫療法は受動免疫療法であり得、この受動免疫療法において、処置は、治療効果を直接または間接に媒介し得そしてインタクトな宿主免疫系に必ずしも依存しない、ＨＳＶ免疫応答性が確立された因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および本明細書中に提供されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、クローニングされ得、発現され得、そして養子免疫療法のために他のベクターもしくはエフェクター細胞に移入され得る。本明細書中に提供されるポリペプチドはまた、抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載されるような）を受動免疫療法のために生成するために使用され得る。
エフェクター細胞は、一般的には、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖による養子免疫療法に十分な量で得られ得る。インビボで抗原認識を保持しつつ、単一の抗原特異的エフェクター細胞から数十億個へと数が増殖するための培養条件は、当該分野で周知である。このようなインビトロ培養条件は、代表的には、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂中でないフィーダー細胞の存在下で、抗原による間欠性刺激を使用する。上記のように、本明細書中に提供されるような免疫反応性ポリペプチドは、免疫療法のために十分な数の細胞を生成するために、抗原特異的Ｔ細胞培養物を迅速に増殖するために使用され得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞および／またはＢ細胞）が、当該分野で周知の標準的技術を使用して、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞が、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増加するために適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療における使用のための培養エフェクター細胞は、インビボで増殖し得、そして広範に分布し得、そして長期に生存し得なければならない。研究により、培養エフェクター細胞が、インビボで増殖するように、そしてかなりの数で長期間生存するように、ＩＬ−２を補充した抗原による反復刺激によって誘導され得ることが示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
あるいは、本明細書中に列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から採取された抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に移植し戻すためにエキソビボでクローン増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段を使用して、好ましくは滅菌形態で、静脈投与、腔内投与または腹腔内投与によって、その患者に再導入され得る。
本明細書中に記載される治療組成物の投与の経路および頻度、ならびに投与量は、個体間で変化するが、標準的技術を使用して容易に確立され得る。１つの実施形態において、１用量と約１０用量との間が、５２週間にわたって投与され得る。別の実施形態において、約６用量が、約１ヶ月間隔で投与され、そしてブースターワクチン接種が、代表的には、その後定期的に与えられ得る。代替プロトコルが、個々の患者に適切であり得る。
適切な用量は、上記のように投与される場合、抗ＨＳＶ免疫応答を促進し得、かつ好ましくは基礎（すなわち、未処置）レベルを少なくとも１０〜５０％超える、化合物の量である。このような応答は、例えば、患者における抗ＨＳＶ抗体を測定することによって、モニタリングされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較した場合、ワクチン接種された患者において改善した臨床成果（例えば、より頻繁な完全または部分的な寛解、あるいは疾患を伴わないより長期の生存）をもたらす免疫応答を生じ得る。一般的に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、１用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主１ｋｇあたり約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量の大きさは、患者の大きさとともに変化するが、代表的には、約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
一般的に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的利益および／または予防的利益を提供するために十分な量で活性化合物を提供する。このような応答は、未処置の患者と比較した場合に、処置された患者において、改善された臨床成果（例えば、より頻出する完全または部分的な寛解、あるいは疾患を伴なわないより長い生存）を確立することによってモニタリングされ得る。ＨＳＶタンパク質に対する既存の免疫応答の増加は、改善された臨床的成果に相関する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイまたはサイトカインアッセイを用いて評価され得、これらのアッセイは、処置の前および後に患者から得たサンプルを用いて実行され得る。
（ＨＳＶの検出および診断）
一般的に、ＨＳＶは、患者から得た生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰尿および／または他の適切な組織）中の１つ以上のＨＳＶタンパク質および／または、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいてその患者において検出され得る。言いかえると、このようなタンパク質は、患者においてＨＳＶの存在または不在を示すマーカーとして使用され得る。本明細書中で提供される結合因子は、一般的に、この生物学的サンプルにおいてこの因子に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ＨＳＶタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、これはまた、ＨＳＶ感染の存在または不在を示す。
サンプルにおいてポリペプチドマーカーを検出するために結合因子を使用する、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般的に、患者におけるＨＳＶの存在または不在は、患者から得た生物学的サンプルを結合因子と接触させる工程およびこの結合因子に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程、によって決定され得る。
好ましい実施形態において、アッセイは、残りのサンプル由来のポリペプチドに結合してそれを除去するために、固体支持体に固定化された結合因子の使用を含む。次いで、結合ポリペプチドは、レポーター基を含みかつ結合因子／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合因子あるいはこの結合因子（例えば、抗免疫グロブリン、Ｇタンパク質、Ａタンパク質またはレクチン）に特異的に結合する他の因子を含み得る。あるいは、競合アッセイが、利用され得、このアッセイにおいて、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルとの結合因子のインキュベーション後に、固定化された結合因子に結合することを可能にする。サンプルの成分が、結合因子への標識されたポリペプチドの結合を阻害する程度は、固定化された結合因子とのそのサンプルの反応性を示す。このようなアッセイにおける使用のために適切なポリペプチドとしては、上述のように、全長ＨＳＶタンパク質および結合因子が結合するその部分が挙げられる。
固体支持体は、ＨＳＶタンパク質が付着され得る、当業者に公知な任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロース膜もしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、この支持体は、ガラス、ファイバーガラス、ラテックスまたはプラスチック材料（例えば、ポリスチレンもしくはポリビニルクロリド）のようなビーズあるいはディスクであり得る。この支持体はまた、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるような、磁気粒子または光ファイバーセンサーであり得る。結合因子は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これは、特許および科学文献において詳細に記載されている。本発明の文脈において、用語「固定化」は、吸着のような非共有結合的会合および共有結合的付着（これは、因子と支持体上の官能基との間の直接的結合であり得るか、または架橋剤の手段による結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートにおけるウェルまたは膜に対する吸着による固定化が、好ましい。このような場合において、吸着は、適切な緩衝液中で、適切な長さの時間の間、結合因子と固体支持体とを接触することによって達成され得る。接触時間は、温度とともに変化するが、代表的には約１時間と約１日との間である。一般に、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド）のウェルと約１０ｎｇ〜約１０μｇの範囲、および好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子とを接触させることは、結合因子の適切な量を固定化するために十分である。
固体支持体に対する結合因子の共有結合的付着は、一般的に、この支持体および結合薬剤上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬を、この支持体とまず反応させることによって達成され得る。例えば、この結合因子を、ベンゾキノンを使用するか、または結合パートナーのアミンおよび活性な水素と支持体のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に対して共有結合的に付着し得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２〜Ａ１３を参照のこと）。
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定化されている抗体をサンプルと接触させて、サンプル内のポリペプチドを固定化抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去され、そしてレポーター基を含む検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体）が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出剤の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、通常ブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定化抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、ＨＳＶ感染を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡が少なくとも約９５％で達成される結合レベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基としては、上記で列挙された基が挙げられる。
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性基もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
ＨＳＶの存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、ＨＳＶの検出のためのこのカットオフ値は、固定化抗体を、ＨＳＶを有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られた平均シグナル値である。代わりの実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果について各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、陽性と見なされる。
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合因子は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定化結合因子に結合する。次いで、第２の標識化された結合因子が、この第２の結合因子を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合因子−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合因子の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合因子が結合される膜の一端をサンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合因子を含む領域を通って、そして固定化結合因子の領域まで移動する。固定化抗体の領域での第２の結合因子の濃度が、ＨＳＶの存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合因子の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合因子の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおいて使用するための好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
もちろん、本発明のＨＳＶタンパク質または結合因子との使用に適する多数の他のアッセイプロトコルが存在する。上記の記載は、例示のみを意図する。例えば、上記のプロトコルは、生物学的サンプルにおいてこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出するためのＨＳＶポリペプチドを使用するように容易に改変され得ることが、当業者に理解される。このようなＨＳＶタンパク質特異的抗体の検出は、ＨＳＶ感染の同定を可能にし得る。
あるいは、ＨＳＶ感染はまた、生物学的サンプル中のＨＳＶタンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法において、患者から単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む生物学的サンプルが、ＨＳＶポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてそのＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるが、これに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用的技術（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離）によって、患者から単離され得る。Ｔ細胞は、ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともに、３７℃で約２〜９日間（代表的には４日間）、インビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立つように、ＨＳＶポリペプチドの非存在下でインキュベーションすることが、所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞について、活性化は、好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞について、活性化は、好ましくは細胞溶解活性を評価することによって、検出される。疾患に罹患していない患者においてよりも少なくとも２倍高いレベルの増殖、および／または少なくとも２０％高いレベルの細胞溶解活性は、その患者におけるＨＳＶの存在を示す。
あるいは、上記のように、ＨＳＶ感染はまた、生物学的サンプル中のＨＳＶタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、生物学的サンプル由来のＨＳＶ ｃＤＮＡの一部を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて使用され得、このオリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、この増幅されたｃＤＮＡは、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、分離および検出される。同様に、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、生物学的サンプル中のこのＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するために、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さのＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有する、オリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上で定義したように、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中で開示される配列を有するＤＮＡ分子のうちの、少なくとも１０個連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５１：２６３、１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）。
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ＰＣＲが、逆転写と組み合わせて適用される。代表的には、ＲＮＡが、生検組織のような生物学的サンプルから抽出され、そしてｃＤＮＡ分子を生成するように逆転写される。少なくとも１つの特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅は、例えば、ゲル電気泳動を使用して分離および可視化され得る、ｃＤＮＡ分子を生じる。増幅は、試験患者およびＨＳＶに感染していない個体から採取された、生物学的サンプルに対して実施され得る。この増幅反応は、例えば２桁の大きさに及ぶｃＤＮＡのいくつかの希釈物に対して実施され得る。
上記のように、感度を改善するために、複数のＨＳＶタンパク質マーカーが、所定のサンプルにおいてアッセイされ得る。種々のＨＳＶポリペプチドに特異的な結合因子が、単一のアッセイ中で混合され得ることは、明らかである。さらに、多数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。ＨＳＶタンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的実験に基づき得る。さらに、またはあるいは、本明細書中に提供されるＨＳＶタンパク質についてのアッセイが、他の公知のＨＳＶ抗原についてのアッセイと組み合わせられ得る。
本発明は、上記の診断方法および／または治療方法のうちのいずれかにおける使用のためのキットをさらに提供する。このようなキットは、代表的には、診断アッセイおよび／または治療アッセイを実施するために必要な２つ以上の成分を含み、そしてこのキットの使用のための指示書をさらに含む。成分は、化合物、試薬、容器および／または装置であり得る。例えば、診断キット中の１つの容器が、ＨＳＶタンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように、支持体材料に結合して提供され得る。１つ以上のさらなる容器が、このアッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を含み得る。このようなキットはまた、またはあるいは、抗体結合の直接検出または間接検出に適切な、レポーター基を含む上記のような検出試薬を含み得る。
あるいは、生物学的サンプル中のＨＳＶタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するための、キットが設計され得る。このようなキットは、一般的に、上記のような、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。このようなキット中に存在し得るさらなる成分としては、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするための、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは診断容器が挙げられる。
以下の実施例は、例示として提供され、限定としては提供されない。
（実施例１）
（ＨＳＶ−２抗原の同定）
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示するためおよび同一物の製造および使用において、当業者を補助するために提示される。実施例は、他のいかなる点においても、本発明の範囲を限定することを意図しない。
（ＨＳＶ−２陽性ドナーの供給源）
二つの型のドナーからリンパ球を得た：群Ａ）臨床状態の不明な血清陽性ドナー、および群Ｂ）十分に特徴付けられた臨床状態（ウイルス散布性および肛門性器障害再発性）を有する血清陽性ドナー
群Ａ：血液サンプル（５０ｍｌ）を、１３人の潜在的ドナーから入手した。ＨＳＶ−２感染の臨床歴に関する情報は、考慮しなかった。血液を、ウエスタンブロットにより、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する血清抗体に対してスクリーニングした。ＰＭＢＣもまた、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２溶解物抗原（ＡＢＩ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）に対する特異的増殖性Ｔ細胞応答についてスクリーニングした。３人のドナー（ＡＤ１０４、ＡＤ１１６およびＡＤ１２０）は、ＨＳＶ−２血清抗体に対して陽性であり、それらのＰＢＭＣは、ＨＳＶ−２抗原に応答して特異的に増殖した。白血球瀉血ＰＢＭＣをこれらのドナーから回収し、液体窒素中で凍結保存した。
群Ｂ：肛門性器障害生検を、ドナーＤＫ２１３１８およびＪＲ５０３２から入手した。障害生検リンパ球をインビトロで、５０μＭアシクロビルの存在下で、ＩＬ−２およびＰＨＡとともに増殖させ、その後液体窒素中で凍結保存した。代表的には、２週間後に５×１０６〜５×１０７個のリンパ球を入手する。自家ＰＢＭＣもまた、ＤＫ２３１８およびＪＲ５０３２の血液から回収し、液体窒素中で凍結保存した。
（ＣＤ４＋ Ｔ細胞株の産生）
凍結保存したＰＢＭＣまたは障害生検リンパ球を解凍し、インビトロで、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ヒト血清＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−７中で、１μｇ／ｍｌ ＨＳＶ−２抗原（ＡＢＩ）で刺激した。照射された自家ＰＢＭＣを抗原提示細胞として障害生検リンパ球のみに添加した。組換えＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）を１日目および４日目に添加した。７日目に、細胞を回収し、洗浄し、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する新鮮培地中に再プレートした。１０日目に、組換えＩＬ−２を再度添加した。培養の１４日目に、同じ様式で、Ｔ細胞を回収し、洗浄し、インビトロで、照射した自家ＰＢＭＣを加えたＨＳＶ−２抗原で再刺激した。Ｔ細胞株を、２回目の刺激の１１日および１２日目に液体窒素中で、１×１０７細胞／バイアルで、凍結保存した。溶解後、凍結保存したＴ細胞は、インビトロでＨＳＶ−２抗原に対して特異的に増殖する能力を保持していた。以下に示すように、これらのＴ細胞を、その後Ｅ．ｃｏｌｉ中で調製されるＨＳＶ−２遺伝子フラグメント発現クローニングライブラリーをスクリーニングするために使用した。
（ＨＳＶ−２（３３３）ＤＮＡの調製）
ＨＳＶ−２株３３３ウイルスを、ローラーボトル（培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）＋５％ＦＣＳの２００ｍｌ／ボトル）中で培養したベロ細胞中で増殖した。ベロ細胞を、ＡＴＣＣから入手した（カタログ番号 ＣＣＬ−８１）アフリカミドリザル線維芽細胞様細胞に形質転換する。コンフルーエンスに近いベロ細胞（ローラーボトル１０個分）を、培地１９９＋１％ＦＣＳの５０ｍｌ／ボトル中で、０．０１のＭＯＩで、ＨＳＶ−２株３３３ウイルスで感染した。細胞および培地をローラーボトルから回収し、細胞をペレット化した。上清を氷上に保存し、細胞ペレットを新鮮な培地１９９＋１％ＦＣＳ中に再懸濁し、６サイクルの凍結／融解により溶解した。溶解物中の細胞破片をペレット化し、上清を保存した培養上清とともにプールした。プールした上清からのウイルスを、超遠心（１２，０００ｇ、２時間、４℃）によりペレット化し、２ｍｌの新鮮な培地１９９＋１％ＦＣＳ中に再懸濁した。以前記載されたように、ウイルスを、超遠心（１９，０００ｇ、２時間、４℃）により、５〜１５％直線的Ｆｉｃｏｌｌ勾配でさらに精製した（第１０章：Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３）；著者：Ｆ．Ｊ．ＲｉｘｏｎおよびＪ．ＭｃＣｌａｕｇｈｌａｎ、編集者：Ａ．Ｊ．ＤａｖｉｓｏｎおよびＲ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔ；出版社；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）。ＨＳＶ−２ウイルス含有バンドを勾配から抽出し、培地１９９で１０倍希釈し、そして、４℃で、１９，０００ｇで、４時間超遠心することによりウイルスをペレット化した。ウイルスペレットを回収し、１０ｍｌのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中に再懸濁した。インタクトなビリオンをＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅで処理し、細胞性ＤＮＡおよび細胞性ＲＮＡを除去した。次いで、ＥＤＴＡを添加し、６５℃でインキュベートすることにより、酵素を不活性化した。ＥＤＴＡの存在下で、ＳＤＳを使用したウイルス粒子の溶解により、勾配精製ウイルスからＤＮＡを調製し、その後フェノール／クロロホルム抽出によりゲノムウイルスＤＮＡを精製した。ＨＳＶ−２ ＤＮＡをＥｔＯＨで沈殿し、ＤＮＡペレットを乾燥し、１ｍｌのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁した。ＤＮＡの濃度および精製度は、ＵＶ分光光度計のＯＤ２６０およびＯＤ２８０を読み取ることにより決定した。この様式で調製したゲノムＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＨＳＶ−２ゲノムフラグメント発現ライブラリーの構築物に使用した。
（ｐＥＴ１７ｂベクター中のＨＳＶ−２ ＤＮＡフラグメントライブラリーの構築）
ＨＳＶ２−Ｉライブラリーを以下のように構築した。ゲノムＨＳＶ−２ ＤＮＡを、Ｆｉｓｈｅｒ「６０ ＳｏｎｉｃＤｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ」（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、１５％の出力で４秒間超音波処理することにより、ＤＮＡフラグメントを産生した。次いで、超音波処理したＤＮＡを沈殿し、ペレット化し、１１μＬ ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。ＤＮＡフラグメントのおよその大きさを、１μＬのフラグメント化したＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡ 対 １．５μｇの超音波処理していない材料のアガロースゲル電気泳動により測定した。ＤＮＡフラグメントの平均の大きさは、ゲルのエチジウムブロマイド染色後に可視化した場合、約５００ｂｐであった。不完全なＤＮＡフラグメント末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して塞いだ（平滑末端化した）。次いで、ＥｃｏＲ１アダプターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、ＤＮＡフラグメントの平滑末端にライゲーションした。次いで、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してＤＮＡをリン酸化し、Ｓ−４００−ＨＲ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（Ｓｉｇｍａ）の手動ロードカラムを使用して精製し、ｐＥＴ１７ｂ発現ベクターにライゲーションした。ＨＳＶ２−ＩＩライブラリーを、同様の様式で構築した。このライブラリーの挿入部分の平均の大きさを、約１０００ｂｐであると決定した。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中のＨＳＶ−２フラグメント発現ライブラリーの産生）
グリセロールストックの調製のためおよびＨＳＶ−２ ＤＮＡ挿入部分の発現の試験のために、ＨＳＶ２−Ｉライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。大量のＨＳＶ−２／ｐＥＴ１７ｂライブラリーＤＮＡを調製するために、ＤＮＡをＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｇｉｂｃｏ）中に形質転換した。形質転換された細菌を、３ＬＢ／アンピシリンプレート（約７５０ＣＦＵ／プレート）上で増殖し、コロニーの少量部分をＤＮＡ挿入部分の配列決定のために選別し、各プレートに由来する残りの細菌を、プラスミドＤＮＡの調製のためのプールとして回収した。これらのプールを、ＨＳＶ−２プール９、１０および１１と名付けた。これらの細菌プールの部分のグリセロールストックを、−８０℃で保存した。プールの残りからプラスミドを精製した。３個のプールのそれぞれ由来の等量のプラスミドＤＮＡを混合し、プラスミドＤＮＡの単一プールを作製した。プールしたＤＮＡの形質転換効率は、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を用いて、実験的に決定した。ＪＭ１０９（ＤＥ３）細菌を、次いで、プレートあたり１５コロニー形成単位（ＣＦＵ）を生じると予測されるライブラリーＤＮＡの最後のプールの量で形質転換した。形質転換した細菌を、次いで、１００ＬＢ／ａｍｐプレート上にプレートした。１００プレートのそれぞれで、２０ＣＦＵ（平均）が実際に観察された：従って、このＨＳＶ−２ライブラリーのプールの大きさは、約２０クローン／プールであった。細菌コロニーを、ＬＢ＋２０％グリセロールの約８００μｌ／プレートの各プレートからプールとして回収した。各プールを、４枚の９６ウェルＵ底プレートに、等しく（２００μｌ／ウェル）分配し、これらの「マスターストック」プレートを、−８０℃で保存した。従って、このＨＳＶ−２遺伝子フラグメントライブラリー（今後は、ＨＳＶ２Ｉと呼ぶ）の大きさは、９６プールの２０クローン／プールであった。無作為に抽出した２０個のコロニーから調製したプラスミドＤＮＡおよび挿入部分を配列決定した。約１５％（３／２０）が、ＨＳＶ−２ ＤＮＡを挿入部分として含み、８０％（１６／２０）が、非ＨＳＶ−２ ＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉまたはベロ細胞ＤＮＡ）を含み、５％（１／２０）が、挿入ＤＮＡを含まなかった。ＨＳＶ２−ＩＩ ＤＮＡライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、同様の様式で、コロニーを無作為に分析した。ライブラリーＨＳＶ２−ＩＩの構築物中の関連した違いとしては、プールするための大量のプラスミドの調製のための電気泳動を使用する代わりに、ＮｏｖａＢｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）（化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ）へのＨＳＶ−２／ｐＥＴ１７ｂライゲーション産物の形質転換および実験に基づいて評価するためのＪＭ１０９（ＤＥ３）細菌への形質転換が挙げられる。さらに、プラスミドＤＮＡを、１０個のプールから平均１６０コロニー／プレートで調製した。これらの１０個のプラスミドプールを、上記のように、ＪＭ１０９（ＤＥ３）中に形質転換するための一つのプール中に、当量様式（分光光度計読み値に基づいて基準化した）で混合し、平均２０コロニー（クローン）／プレートを得、上記のようにグリセロールストックプール中に回収した。約２５％が、ＨＳＶ−２ ＤＮＡを挿入部分として含み、残りの７５％が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡを挿入部分として含んだ。
（ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞をスクリーニングするためのＨＳＶ−２フラグメント発現ライブラリーの誘導）
マスターＨＳＶ２Ｉライブラリー９６ウェルプレートの一つを、室温で融解した。各ウェルからアリコート（２０μＬ）を、１８０μＬ／ウェルのＬＢ培地＋アンピシリンを含む新規の９６ウェルプレートに移した。細菌を一晩増殖し、次いで、４０μｌを、１６０μＬの２×ＹＴ培地＋アンピシリンを含む二つの新規９６ウェルプレートに移した。細菌を、３７℃で１時間１５分増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを２００ｍＭまで添加することにより、タンパク質発現を誘導した。細菌をさらに３時間培養した。細菌数／ウェルを基準化するために、これらのプレートの一枚を使用して、分光光度計読み値を得た。細菌をペレット化（約２×１０７／ウェル）し、上清を除去した後、第二の基準化プレートを、ＣＤ４＋ Ｔ細胞に対するスクリーニングに使用した。ＨＳＶ２−ＩＩライブラリーを増殖し、類似の様式で誘導した。
（自家樹状ＡＰＣの調製）
ＲＰＭＩ １６４０＋１０％のＦＣＳ：ＨＳの１：１混合物＋１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含む６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５０６）中での３７℃でのプラスチック接着性ドナー細胞（１×１０８ＰＢＭＣに由来する）の培養によって、樹状細胞（ＤＣ）を産生した。非接着ＤＣを培養の６日目にプレートから回収し、３３００Ｒａｄを照射した。次いで、ＤＣを平底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９６）中に１×１０４／ウェルでプレートし、３７℃で一晩培養した。次の日、細菌ペレットを、抗生物質を含まない２００μｌ ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、抗生物質を含まない１９０μｌの同一培地中にＤＣを含むウェルに、１０μｌ／ウェル移動することにより、ＤＣを、誘導されたＨＳＶ２−ＩまたはＨＳＶ２−ＩＩライブラリープールにパルスした。ＤＣおよび細菌を、３７℃で９０分間共培養した。次いで、ＤＣを洗浄し、１００μｌ／ウェル ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＨＳ＋Ｌ−ｇｌｕｔ．＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン抗生物質中に再懸濁した。
（応答性Ｔ細胞の調製）
凍結保存したＣＤ４＋ Ｔ細胞株を、使用の５日前に融解し、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＨＳ＋１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−７中で、３７℃で培養した。２日後、培地をＩＬ−２およびＩＬ−７を含まない新鮮な培地に置き換えた。
（ＨＳＶ−２ライブラリーの一次スクリーニング）
Ｔ細胞を、新鮮なＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＨＳ中に２×１０４ウェルで再懸濁し、Ｅ．ｃｏｌｉパルス自家ＤＣを含むプレートに添加した。３日後、１００μｌ／ウェルの上清を除去し、新規９６ウェルプレートに移した。後に、上清の半分を、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γ含有量を調べ、残りを−２０℃で保存した。次いでＴ細胞を、３７℃で約８時間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でパルスした。次いで、３Ｈパルスした細胞を、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ＧＦ／Ｃプレート（Ｐａｃｋａｒｄ；Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）上で回収し、その後、［３Ｈ］取り込みのＣＰＭをシンチレーションカウンター（Ｔｏｐ−Ｃｏｕｎｔ；Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して測定した。ヒトＩＦＮ−ｇについての標準的サイトカイン捕捉ＥＬＩＳＡプロトコルの後、ＥＬＩＳＡアッセイを、細胞上清について実施した。
ＨＳＶ２−ＩライブラリーからのＤ１０４由来のＴ細胞のスクリーニングによって、ＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１０およびＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１２の両方のウェルのＣＰＭおよびＩＦＮ−ｇレベルが、バックグラウンドより有意に高くなり、陽性と記録された。
（陽性ＨＳＶ２Ｉライブラリープールの崩壊）
最初のＣＤ４＋ Ｔ細胞スクリーニング実験由来の陽性ウェル（ＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１０およびＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１２）を、再度マスターグリセロールストックプレートから増殖させた。各プール由来の４８個のサブクローンを無作為に抽出し、増殖させ、上記のようにＩＰＴＧ誘導させた。ＡＤ１０４ ＣＤ４＋ Ｔ細胞株に対して、上記のようにサブクローンをスクリーニングした。ＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１２プール崩壊物由来のクローン（ＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１２Ａ１２）は、陽性と記録された。この陽性の結果は、第二のＡＤ１０４ ＣＤ４＋ Ｔ細胞アッセイにより、証明された。
（ＣＤ４＋ Ｔ細胞抗原としてのＵＬ３９の同定）
陽性クローン（ＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１２Ａ１２）をサブクローニングし、ＥｃｏＲＩ ＮＢ＃６７５ｐｇ．３４を使用した制限消化分析のために、１０個のクローンを選択した。１０個のクローン全てが、同じ大きさ（約９００ｂｐ長）のＤＮＡ挿入部分を含んでいた。これらのクローンのうちの三個（ＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１２Ａ１２＿１、７および８）を、配列決定のために選択し、全てが挿入部分の５’末端および３’末端の両方に、同一の挿入配列を含んでいた。挿入部分のＤＮＡ配列は、配列番号１に示され、配列番号２に示されるオープンリーディングフレームを含む。挿入配列を、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２（ＮＣＢＩ部位 受託番号Ｚ８６０９９）の全長ゲノム配列と比較し、ＨＳＶリボヌクレオチドリダクターゼの大サブユニット（１４０ｋＤ）であり、配列番号３に示される配列であるＵＬ３９（別名ＩＣＰ６）と高い相同性を有する配列を決定した。配列番号１に示される挿入配列は、ＵＬ３９オープンリーディングフレーム（３，４３２ｂｐ）のヌクレオチド８７６〜１６９０に及び、配列番号２（ＵＬ３９（全長＝１１４３アミノ酸）のアミノ酸２９２〜５６３に対して、高い相同性を有する）に示されるアミノ酸配列をコードする。
（ＣＤ４＋ Ｔ細胞抗原としてのＵＳ８Ａ、ＵＳ３／ＵＳ４、ＵＬ１５、ＵＬ１８、ＵＬ２７およびＵＬ４６の同定）
上に記載したＵＬ３９のＴ細胞抗原としての同定と本質的に同一の様式で、さらなるＨＳＶ−２遺伝子フラグメント発現クローニングライブラリー（ＨＳＶ２−ＩＩと呼ぶ）を調製し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ドナーＴ細胞を用いてスクリーニングした。
クローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ８ＡｆｒａｇＤ６．Ｂ＿Ｂ１１＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑを同定するドナーＡＤ１１６由来のＴ細胞でＨＳＶ２−ＩＩライブラリーをスクリーニングすることにより、配列番号４に示される挿入配列を有することを決定したこの配列番号４は、配列番号５および６に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードし、この配列番号５は、配列番号７に示される配列であるＨＳＶ−２ ＵＳ８Ａタンパク質と高い相同性を有する。
さらに、ドナーＡＤ１０４由来のＴ細胞を用いたＨＳＶ２−ＩＩライブラリーのスクリーニングは、以下のクローン挿入部分：
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する潜在的オープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ３／ＵＳ４ｆｒａｇＦ１０Ｂ３＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑに対応する配列番号８；
ＨＳＶ−２ ＵＳ３タンパク質（配列番号１２）と高い相同性を共有する配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ３／ＵＳ４ｆｒａｇＦ１０Ｂ３＿Ｔ７Ｐ．ｓｅｑに対応する配列番号９；
ＨＳＶ−２ ＵＬ４６タンパク質（配列番号１５）と高い相同性を共有する配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑに対応する配列番号１３；
ＨＳＶ−２ ＵＬ２７タンパク質（配列番号１８）と高い相同性を共有する配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ２７ｆｒａｇＨ２Ｃ７＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑに対応する配列番号１６；
配列番号２０、２１および２２（この配列番号２２は、ＨＳＶ−２ ＵＬ１８タンパク質（配列番号２３）と高い相同性を共有する）に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１８ｆｒａｇＦ１０Ａ１＿ｒｃ．ｓｅｑに対応する配列番号１９；および
ＨＳＶ−２ ＵＬ１５タンパク質（配列番号２６）と高い相同性を共有する配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１５ｆｒａｇＦ１０Ａ１２＿ｒｃ．ｓｅｑに対応する配列番号２４、
を同定した。
（実施例２）
（ＨＳＶ−２抗原の同定）
実施例１に詳細に記載されるように、ＡＤ１０４由来のＣＤ４＋ Ｔ細胞は、クローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑ（配列番号１３）およびＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１８ｆｒａｇＦ１０Ａ１＿ｒｃ．ｓｅｑ（配列番号１９）由来の挿入部分を認識することが見出された。これらのクローン由来の配列は、ＨＳＶ２−Ｉ遺伝子、ＵＬ４６（配列番号１５）およびＵＬ１８（配列番号２３）それぞれに対する高い相同性を共有する。従って、これらのＴ細胞によって認識されるエピトープをさらに特徴付けるために、重複する１５マーのペプチドを、ＵＬ１８およびＵＬ４６のクローン挿入フラグメントを超えて作製した。ＡＤ１０４のＣＤ４＋ Ｔ細胞によるペプチド認識を、４８時間ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて試験した。９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートに、１ウェルあたり１×１０４個の自家ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞（ＬＣＬ）またはＤＣを添加することにより、ＥＬＩＳＰＯＴを実施した。２×１０４個のＡＤ１０４株由来のＡＤ１０４ ＣＤ４＋ Ｔ細胞に、１ウェルあたり５μｇ／ｍｌのＨＳＶ−２ペプチドを添加した。ＡＤ１０４ ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＵＬ１８のペプチド２０および２１（配列番号３２および３３）およびＵＬ４６のペプチド１、４、９、１０および２０（配列番号２７〜３１）を認識した。
（実施例３）
（ＨＳＶ−２抗原の同定）
ＤＫ２３１８およびＪＲ５０３２障害生検からＣＤ４＋ Ｔ細胞株を産生する。ＣＤ４＋リンパ球を、実施例１に記載されるように、照射した自家ＰＢＭＣおよびＨＳＶ−２抗原で、インビトロで２度刺激した。その株を実施例１に記載されるようにそれらの抗原特異性を試験し、凍結保存した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞株を、実施例１で産生されたＨＳＶ−ＩＩ発現クローニングライブラリーに対してスクリーニングした。
ＤＫ２３１８は、クローンＣ１２およびＧ１０との反応を示した。クローンＣ１２が、配列番号３６に示される挿入配列を有することを決定した。この挿入部分は、ＨＳＶ−ＩＩ遺伝子のフラグメント（ＵＬ２３のヌクレオチド７２３〜１３１１およびＵＬ２２のヌクレオチド１〜８５２）と相同な配列を有することが見出された。これらの配列は、配列番号４０に示されるＵＬ２３のアミノ酸２４１〜３７６および配列番号４１に示されるアミノ酸１〜２８４に対応する。配列番号３６のＤＮＡ配列を、公開データベース（Ｇｅｎｂａｎｋを含む）に対して調査し、それぞれ配列番号３７および配列番号３８に示されるＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ２３およびＵＬ２２と高い配列相同性を有することが示された。配列番号３７および３８によってコードされるタンパク質配列は、配列番号３９および４５に示される。クローンＧ１０は、配列番号４８（配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードする）に示される挿入配列を有することを決定し、この配列番号４８は、ＨＳＶ−２ ＵＬ３７（配列番号４９に示される）と高い相同性を有し、この配列番号４９は、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードする。ＤＫ２３１８のＣＤ４＋ Ｔ細胞株を、ＵＬ２３タンパク質を網羅する重複する１５マーに対してスクリーニングした。ＤＫ２３１８のＣＤ４株は、３個のＵＬ２３特異的ペプチド（配列番号４１〜４３）に対して応答することを示し、このことは、ＵＬ２３が標的であることを示唆している。
ＪＲ５０３２から産生したＣＤ４＋ Ｔ細胞株は、クローンＥ９と反応することを見出され、クローンＥ９は、配列番号３４に示される挿入配列を含み、配列番号３４は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードし、ＨＳＶ−２ ＲＬ２（ＩＣＰ０とも呼ぶ）と高い相同性を有し、ＨＳＶ−２ ＲＬ２の配列は、配列番号３５に示され、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードする。
（実施例４）
（ＣＤ４クローンＦ１１Ｆ５およびＧ１０Ａ９の特徴づけ）
実施例２および３は、ＨＳＶ−２ ３３３株を使用して産生されたｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングしたドナーＡＤ１０４およびＤＫ２３１３由来のＣＤ４ Ｔ細胞株の産生を記載する。ＡＤ１０４は、クローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５に対して反応することが見出された。この挿入部分を、配列番号１３に開示された配列を用いて部分的に配列決定した。挿入部分の全長配列決定は、それが、ＨＳＶ−２ ３３３株に由来するＵＬ４６のフラグメントをコードすることを明らかにした。この挿入部分由来のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号５２および配列番号５４にそれぞれ開示される。
ＤＫ２３１２は、クローンＧ１０に対して応答することが見出された。この挿入部分は、部分的に配列決定され、その配列は、配列番号４８に開示された。全長配列決定は、それが、ＨＳＶ−２ ３３３株に由来するＵＬ３７のフラグメントをコードすることを明らかにした。この挿入部分由来のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３および配列番号５５に開示される。
（実施例５）
（ＨＳＶ−２に由来するＣＤ−８特異的免疫応答性ペプチドの同定）
正常なドナーＡＤ１０４、ＡＤ１１６、ＡＤ１２０およびＤ４７７から末梢血単核細胞を入手した。これらのドナーは、低分解能ＤＮＡ分類方法を使用すると、ＨＬＡに分類され、その結果を表２に示す。
（表２）
Figure 2005522210
 ＨＳＶ−２のエピトープが免疫応答性であることを決定するために、合成ペプチドを合成した。これらのペプチドは、１１アミノ酸が重複する１５アミノ酸長であった。ペプチドを、以下のＨＳＶ−２遺伝子の以下の領域を超えて合成した：ＵＬ１５（ａａ ６００〜７３４）、ＵＬ１８（ａａ １〜１１０）、ＵＬ２３（ａａ ２４１〜３７６）、ＵＬ４６（ａａ ６１７〜７２２）、ＵＳ３（ａａ １２５〜２７６）およびＵＳ８Ａ（ａａ ８３〜１４６）。
ＣＤ８＋ 細胞を、上記のネガティブ選択を使用した各ドナーのＰＢＭＣから精製した。精製したＣＤ８＋ Ｔ細胞を次いで、ＨＳＶ−２特異的ペプチドに対する反応性について試験した。２×１０５個のＣＤ８＋ Ｔ細胞、１×１０４個の自家樹状細胞および１０μｇ／ｍｌのペプチドプール（平均１０ペプチド／プール含有）を含む共培養物を、抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（１Ｄ１Ｋ：ｍＡｂＴｅｃｈ）で予めコートした９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート中で確立した。２４時間後、当業者に周知の標準的プロトコルを使用して、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを構築した。次いで、ウェルあたりのスポットの数を、自動ビデオ顕微鏡ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーを使用して計数した。次いで、ペプチドプールに対して陽性反応を示すドナー由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞を、二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるプールの個々のペプチドに対して試験した。ペプチド反応性の結果を、表３に示す。
（表３）
Figure 2005522210
 （実施例６）
（ＣＤ４＋Ｔ細胞クローニングを使用するＨＳＶ−２抗原の同定）
この実施例は、二つのドナーに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの産生を記載する。ドナーＪＨは、ウイルス培養および毎日の塗抹標本（ｓｗａｂ）上のＰＣＲによって決定されるように、生殖器病変のまれな再発を経験し、まれにウイルスを除去する（ｓｈｅｄ）ＨＳＶ−２血清陽性ドナーである。ＨＨは、ＨＳＶ−２に曝露されたが、ＨＳＶ−２血清陰性のドナーである。
ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１４日間ＵＶで不活性化したＨＳＶ−２ ３３３株で刺激することにより、ＪＨに対するＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを産生した。二週間の刺激後、限界希釈を使用して、細胞を９６ウェルプレートにクローニングし、そして、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体を使用して非選択的に刺激した。２週間の増殖後、クローンをＵＶで不活性化したＨＳＶ−２、ｇＢ２タンパク質、ｇＤ２タンパク質およびＵＬ５０に対する反応性を試験した。クローン５およびクローン３４はｇＢ２を認識し、クローン３０はｇＤ２を認識し、クローン１１はＵＬ５０を認識した。
クローン３９およびクローン４７を発現クローニングのために使用した。Ｔ細胞の増殖および発現クローニングの両方に使用された抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＨＬＡ−適合正常ドナーに由来した。二つのＨＳＶ−２特異的ライブラリー、ＨＳＶ２−ＩＩおよびＨＳＶ２−ＩＩＩに対して、クローンをスクリーニングした。
クローン３９は、ＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリープール１Ｆ４、１Ｇ２、２Ｃ４および３Ｇ１１によって提示されるＵＬ３９に由来する部分的配列を特異的に認識することを見出した。ＵＬ３９の全長ＤＮＡ配列を、配列番号３に開示したタンパク質配列に対応する配列番号６５に開示する。クローン３９が反応するプール１Ｆ４、１Ｇ２および３Ｇ１１由来の特定のＤＮＡ配列は同一である。挿入部分は、８７５ｂｐ長であることが見出され、そのＤＮＡ配列を配列番号７４に開示する対応するアミノ酸配列を有する配列番号６６に開示する。プール２Ｃ４に由来する挿入部分は、８００ｂｐ長であることが見出され、そのＤＮＡ配列を配列番号６７に開示し、その配列は、配列番号７５に開示する対応するアミノ酸配列を有する。
クローン４７は、ＨＳＶ−２ＩＩＩライブラリープール２Ｂ２、３Ａ１、３Ｆ１２、３Ｈ６および４Ｂ２によって提示されるＩＣＰ０（ＲＬ２）に由来する部分配列を特異的に識別することが見出された。ＩＣＰ０の全長ＤＮＡ配列を、配列番号４７に開示したタンパク質配列に対応する配列番号３５に開示した。プール３Ｈ６、３Ｆ１２および４Ｂ２に由来する配列挿入部分は、同一であることが見出され、１１００ｂｐの大きさの挿入部分を有していた。この配列の５’末端に対応するＤＮＡ配列を、配列番号６８に開示し、その配列は、配列番号６９に開示する３’末端を有する。プール３Ａ１に由来する挿入部分は、１０００ｂｐ長であることが見出され、配列番号７０に開示するＤＮＡ配列の５’部分および配列番号７１に開示する挿入部分の３’末端を有することが見出された。プール２Ｂ２に由来する挿入部分は、１３００ｂｐであることが見出された。挿入部分の５’末端に対応するＤＮＡ配列を、配列番号７３に開示する配列の３’末端を有する配列番号７２に開示する。
ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１４日間ＵＶで不活性化したＨＳＶ−２ ３３３株で刺激することにより、ＨＨに対するＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを産生した。二週間の刺激後、限界希釈を使用して、細胞を９６ウェルプレートにクローニングし、そして、ＰＨＡを使用して非選択的に刺激した。ＨＳＶ−１タンパク質およびＨＳＶ−２タンパク質の両方に反応して増殖する能力に対して、クローンをスクリーニングした。クローン６、１８、２０、２２、２４、２７、２８、２９、４１および４５は全て、ＨＳＶ−１に対して強く反応するが、ＨＳＶ−２に対しては、クローン６、１８、２０、２２および２４のみが強く反応することが見出された。従って、クローン６、１８、２０、２２および２４を、発現クローニングの使用のために選択した。ＨＬＡ−適合ドナーに由来するＡＰＣを、インビトロでのクローンの増殖および発現クローニングのために使用した。クローンを、ＨＳＶ−２特異的ライブラリーである、ＨＳＶ２−ＩＩおよびＨＳＶ２−ＩＩＩの二つに対してスクリーニングした（ライブラリーの詳細については、実施例１を参照のこと。）
クローン２２は、ＨＳＶ２−ＩＩライブラリー（ＨＳＶ２−ＩＩＩライブラリーに由来するプール４Ｅ８に加えて、プールＦ７およびプールＦ１１）によって示されるＵＬ４６を認識することが見出された。
（実施例７）
（ワクシニアウイルスを発現するＵＬ１９の産生）
ＵＬ１９遺伝子をワクシニアウイルスの西部保存株（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｓｔｒａｉｎ）中にクローニングした。このウイルスベクターは、ワクシニアウイルスに感染した任意の細胞でＵＬ１９の発現を可能にするか、またはさらに、ワクシニアウイルスを使用して、ＵＬ１９に対する免疫応答を生じるようにヒトまたは動物を免疫し得る。
ＵＬ１９を発現するワクシニアウイルスを産生するために、配列番号７６に開示する配列であるＵＬ１９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＨＳＶ−２からクローニングし、ワクシニアウイルスシャトルプラスミド、ｐＳＣ１１（そのＤＮＡ配列は、配列番号７７に開示する）中に挿入した。シャトルベクターをトランスフェクトしたＣＶ−１細胞（ｐＳＣ１１／ＵＬ１９）を野生型西部保存ワクシニアウイルスで共感染した。いくつかの細胞では、シャトルプラスミドは、ワクシニアウイルスと相同組換えを受け、ＵＬ１９遺伝子をチミジンキナーゼ位置に挿入する。これらの組換えビリオンを、βガラクトシダーゼを発現した５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）耐性ウイルスのプラーク精製により単離した。精製したウイルスを次いで、ＵＬ１９タンパク質を発現させるために、細胞の感染に使用し得る。
（実施例８）
（ワクシニアウイルスを発現するＵＬ４７の産生）
ＵＬ４７遺伝子をワクシニアウイルスの西部保存株中にクローニングした。このウイルスベクターは、ワクシニアウイルスに感染した任意の細胞でのＵＬ４７の発現を可能にするか、またはさらに、ＵＬ４７に対する免疫応答を生じるようにヒトまたは動物を免疫化するためにワクシニアウイルスを使用し得る。
ＵＬ４７を発現するワクシニアウイルスを産生するために、配列番号７８に開示する配列であるＵＬ４７ ＯＲＦをＨＳＶ−２からクローニングし、ワクシニアウイルスシャトルプラスミド、ｐＳＣ１１（そのＤＮＡ配列は、配列番号７７に開示する）中に挿入した。シャトルベクターでトランスフェクトしたＣＶ−１細胞（ｐＳＣ１１／ＵＬ４７）を、野生型西部保存ワクシニアウイルスで共感染した。いくつかの細胞では、シャトルプラスミドは、ワクシニアウイルスと相同組換えを受け、ＵＬ４７遺伝子をチミジンキナーゼ位置に挿入する。これらの組換えビリオンを、βガラクトシダーゼを発現した５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）耐性ウイルスのプラーク精製により単離した。精製したウイルスを次いで、ＵＬ４７タンパク質を発現させるために、細胞の感染に使用し得る。
（実施例９）
（ワクシニアウイルスを発現するＵＬ５０の産生）
ＵＬ５０遺伝子をワクシニアウイルスの西部保存株中にクローニングした。このウイルスベクターは、ワクシニアウイルスに感染した任意の細胞でのＵＬ５０の発現を可能にするか、またはさらに、ＵＬ５０に対する免疫応答を生じるようにヒトまたは動物を免疫するためにワクシニアウイルスを使用し得る。
ＵＬ５０を発現するワクシニアウイルスを産生するために、配列番号７９に開示する配列であるＵＬ５０ＯＲＦをＨＳＶ−２からクローニングし、ワクシニアウイルスシャトルプラスミド、ｐＳＣ１１（そのＤＮＡ配列は、配列番号７７に開示する）中に挿入した。シャトルベクターでトランスフェクトしたＣＶ−１細胞（ｐＳＣ１１／ＵＬ５０）を野生型西部保存ワクシニアウイルスで同時感染した。いくつかの細胞では、シャトルプラスミドは、ワクシニアウイルスと相同組換えを受け、ＵＬ５０遺伝子をチミジンキナーゼ位置に挿入する。これらの組換えビリオンを、βガラクトシダーゼを発現した５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）耐性ウイルスのプラーク精製により単離した。精製したウイルスを次いで、ＵＬ５０タンパク質を発現させるために、細胞の感染に使用し得る。
（実施例１０）
（ワクシニアウイルスを発現するＵＬ４９の産生）
細胞内分解を促進し、単純ヘルペスウイルス遺伝子、ＵＬ４９（配列番号８１に開示するＤＮＡ配列である）のクラスＩの提示を促進するために、ヒトユビキチン遺伝子（そのＤＮＡ配列は、配列番号８０に開示される）およびＵＬ４９の融合物を、ＵＬ４９遺伝子の５’に位置するユビキチン遺伝子で構築した。ユビキチンＯＲＦの最後のアミノ酸は、グリシンからアラニンへ変異し、融合タンパク質の同時翻訳切断（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ）を防止する。ＰＣＲにより融合物を構築した後、それを、ワクシニアウイルスシャトルベクター、ｐＳＣ１１（配列番号７７に開示するＤＮＡである）中にクローニングした。シャトルベクターでトランスフェクトしたＣＶ−１細胞、ｐＳＣ１１／ユビキチン−ＵＬ４９を、野生型西部保存型ワクシニアウイルスで同時感染させた。いくつかの細胞では、シャトルプラスミドは、ウイルスと相同組換えを受け、ユビキチン−ＵＬ４９遺伝子をチミジンキナーゼ位置に挿入する。これらの組換えビリオンを、βガラクトシダーゼを発現する５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）耐性ウイルスのプラーク精製により単離した。精製したウイルスを次いで、ＵＬ４９タンパク質を発現するために、細胞の感染に使用し得る。
ＵＬ４９を発現するように操作した細胞を使用して、ＵＬ４９タンパク質に対する特異的な免疫応答についてアッセイする。このワクシニアウイルスベクターをまた、ＨＳＶ−２に対する予防的反応または治療的反応を生じるためのヒトにおけるワクチンとして使用し得る。
（実施例１１）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける単純ヘルペスウイルス抗原の発現）
この実施例は、Ｎ末端ヒスチジンタグと組み合わせたＥ．ｃｏｌｉ発現系を使用する組換えＨＳＶ抗原の発現を記載する。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ ＵＬ２１の発現）
ＨＳＶ ＵＬ２１コード領域（そのＤＮＡ配列を、配列番号８５に開示する）を、以下のプライマー：
ＰＤＭ−６０２ ５’ｇａｇｃｔｃａｇｃｔａｔｇｃｃａｃｃａｃｃ３’（配列番号９８）
ＰＤＭ−６０３ ５’ｃｇｇｃｇａａｔｔｃａｔｔａｇｔａｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａａａａａｇ３’（配列番号９９）
を使用して、ＰＣＲ増幅した。
（ＰＣＲを、以下の反応成分を用いて実施した：）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２μｌ １０μＭの各プライマー
８３μｌの滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅は、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後以下の４０サイクル：
９６℃で２０秒間；
６０℃で１５秒間；そして、
７２℃で２分間、その後最終の伸張工程：
７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。ＵＬ２１−Ｈｉｓ構築物に対するアミノ酸配列を確認し、配列番号９１に開示する。次いで、構築物をＢＬＲ ｐＬｙｓおよびＢＬＲ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＰ細胞中に形質転換した。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ ＵＬ３９の発現）
ＨＳＶ ＵＬ３９コード領域（そのＤＮＡ配列を、配列番号８９に開示する）を、以下のプライマー：
ＰＤＭ−４６６ ５’ｃａｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｃｃｃｃａｇｇｃｇｇａｃ３’（配列番号１００）
ＰＤＭ−４６７ ５’ｃｇｇｃｇａａｔｔｃａｔｔａｇｔａｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａａａａａｇ３’（配列番号１０１）
を使用して、クローンｐＥＴ１７ｂからＰＣＲ増幅した。
（ＰＣＲを、以下の反応成分を用いて実施した：）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２μｌ １０μＭの各プライマー
８３μｌの滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅を、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後以下の４０サイクル：
９６℃で２０秒間；
６６℃で１５秒間；そして、
７２℃で２分間、その後最終の伸張工程：
７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。ＵＬ３９−Ｈｉｓ構築物に対するアミノ酸配列を確認し、配列番号９０に開示する。次いで、構築物をＢＬＲ ｐＬｙｓおよびＢＬＲ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＰ細胞中に形質転換した。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ ＵＬ４９の発現）
ＨＳＶ ＵＬ４９コード領域（配列番号８３に開示される配列のＤＮＡ配列）を、以下のプライマー：
ＰＤＭ−４６６：５’ｃａｃａｃｃｔｃｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｇｔｃａａｇｔｃ３’（配列番号１０２）
ＰＤＭ−４６７：５’ｃａｔａａｇａａｔｔｃａｃｔａｃｔｃｇａｇｇｇｇｇｃｇｇｃｇｇｇｇａｃｇ３’（配列番号１０３）
を使用してクローンｐＥＴ１７ｂからＰＣＲ増幅した。
（ＰＣＲを、以下の反応成分を用いて実施した：）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１０μｌ １０×ＰＣＲｘエンハンサー溶液
３μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
３μｌ ５０ｍＭ ｍｇＳＯ４
２μｌ １０μＭの各プライマー
６８μｌの滅菌水
１．０μｌ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅を、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後以下の４０サイクル：
９６℃で２０秒間；
６７℃で１５秒間；そして、
７２℃で２分間、その後最終の伸張工程：
７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。ＵＬ４９−Ｈｉｓ構築物に対するアミノ酸配列を確認し、配列番号９７に開示する。次いで、構築物をＢＬＲ ｐＬｙｓおよびＢＬＲ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＰ細胞中に形質転換した。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ ＵＬ５０の発現）
ＨＳＶ ＵＬ５０コード領域（配列番号８２に開示される配列のＤＮＡ配列）を、以下のプライマー：
ＰＤＭ−４５８：５’ｃａｃａｇｔｃａｇｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｇａｔｃｃ３’（配列番号１０４）
ＰＤＭ−４５９：５’ｃｃｔａｇａａｔｔｃａｃｔａｇａｔｇｃｃａｇｔｇｇａｇｃｃａａａｃｃｃ３’（配列番号１０５）
を使用してクローンｐＥＴ１７ｂからＰＣＲ増幅した。
（ＰＣＲを、以下の反応成分を用いて実施した；）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２μｌ １０μＭの各プライマー
８３μｌの滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅を、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後以下の４０サイクル：
９６℃で２０秒間；
６８℃で１５秒間；そして、
７２℃で２分３０秒間、その後最終の伸張工程：
７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。ＵＬ５０−Ｈｉｓ構築物に対するアミノ酸配列を確認し、配列番号９６に開示する。次いで、構築物をＢＬＲ ｐＬｙｓおよびＢＬＲ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＰ細胞中に形質転換した。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ ＵＬ１９の発現）
ＨＳＶ ＵＬ１９コード領域（配列番号８４に開示される配列のＤＮＡ配列）を、以下のプライマー：
ＰＤＭ−４５３：５’ｇｃｃｇｃｔｃｃｔｇｃｃｃｇｃｇａｃｃｃｃｃｃ３’（配列番号１０６）
ＰＤＭ−４５７：５’ｃｃａｇａａｔｔｃａｔｔａｃａｇａｇａｃａｇｇｃｃｃｔｔｔａｇｃ３’（配列番号１０７）
を使用してクローンｐＥＴ１７ｂからＰＣＲ増幅した。
（ＰＣＲは、以下の反応成分を用いて実施した：）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２μｌ １０μＭの各プライマー
８３μｌの滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅を、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後以下の４０サイクル：
９６℃で２０秒間；
７０℃で１５秒間；そして、
７２℃で４分間、その後最終の伸張工程：
７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。ＵＬ１９−Ｈｉｓ構築物に対するアミノ酸配列を確認し、配列番号９５に開示する。次いで、構築物をＢＬＲ ｐＬｙｓおよびＢＬＲ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＰ細胞中に形質転換した。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ ＵＬ４７の発現）
ＨＳＶ ＵＬ４７コード領域（配列番号８７に開示される配列のＤＮＡ配列）を、以下のプライマー：
ＰＤＭ−６３１：５’ｃａｃｔｃｃｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｃａｔｇｃｃｇ３’（配列番号１０８）
ＰＤＭ−６３２：５’ｃｃｇｔｔａｇａａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｃｇｔｇｇｃｇｇｇｃｃ３’（配列番号１０９）
を使用してＰＣＲ増幅した。
（ＰＣＲを、以下の反応成分を用いて実施した：）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２μｌ １０μＭの各プライマー
８３μｌの滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅を、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後以下の４０サイクル：
９６℃で２０秒間；
６７℃で１５秒間；そして、
７２℃で２分３０秒間、その後最終の伸張工程：
７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。ＵＬ４７−Ｈｉｓ構築物に対するアミノ酸配列を確認し、配列番号９４に開示する。次いで、構築物をＢＬＲ ｐＬｙｓおよびＢＬＲ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＰ細胞中に形質転換した。この構築物を使用するタンパク質収量は、低かった。ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化した二つのヒスタジンタグを有するｐＰＤＭ Ｔｒｘ中に、ＵＬ４７もまたクローニングした。この構築物に対するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号８６および９２に開示する。この融合構築物を使用するタンパク質収量は、非常に高かった。
ＵＬ４７のさらなる４つのフラグメント（ＵＬ４７ Ａ〜Ｄと名付けられた）もまた、ＰＣＲ増幅した。
（ＵＬ４７Ａコード領域を、以下のプライマー対：）
ＰＤＭ−６３１：５’ｃａｃｔｃｃｇｔｇｃｇｃｇｇｇｃａｔｇｃｃｇ３’（配列番号１１０）
ＰＤＭ−６４５：５’ｃａｔａｇａａｔｔｃａｔｃａｃｇｃｇｃｇｇｇａｇｇｇｇｃｔｇｇｔｔｔｔｔｇｃ３’（配列番号１１１）
を使用して増幅した。
（ＵＬ４７Ｂコード領域を、以下のプライマー対：）
ＰＤＭ−６４６：５’ｇａｃａｃｇｇｔｇｇｔｃｇｃｇｔｇｃｇｔｇｇｃ３’（配列番号１１２）
ＰＤＭ−６３２：５’ｃｃｇｔｔａｇａａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｃｇｔｇｇｃｇｇｇｃｃ３’（配列番号１１３）
を使用して増幅した。
（両方のフラグメントを、以下のＰＣＲ反応成分を用いて増幅した；）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２μｌ １０μＭの各プライマー
８３μｌの滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅を、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後以下の４０サイクル：
９６℃で２０秒間；
６７℃で１５秒間；そして、
７２℃で２分間、その後最終の伸張工程：
７２℃で４分間。
（ＵＬ４７Ｃコード領域を、以下のプライマー対：）
ＰＤＭ−６３１：５’ｃａｃｔｃｃｇｔｇｃｇｃｇｇｇｃａｔｇｃｃｇ３’（配列番号１１４）
ＰＤＭ−７３９：５’ｃｇｔａｔｇａａｔｔｃａｔｃａｇａｃｃｃａｃｃｃｇｔｔｇ３’（配列番号１１５）
を使用して増幅した。
（ＵＬ４７Ｄコード領域を、以下のプライマー対：）
ＰＤＭ−７４０：５’ｇｔｇｃｔｇｇｃｇａｃｇｇｇｇｃｔｃａｔｃｃ３’（配列番号１１６）
ＰＤＭ−６３２：５’ｃｃｇｔｔａｇａａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｃｇｔｇｇｃｇｇｇｃｃ３’（配列番号１１７）
を使用して増幅した。
（両方のフラグメントを、以下のＰＣＲ反応成分を用いて増幅した；）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２μｌ １０μＭの各プライマー
８３μｌの滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅を、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後以下の４０サイクル：
９６℃で２０秒間；
６３℃で１５秒間；そして、
７２℃で２分間、その後最終の伸張工程：
７２℃で４分間。
ＵＬ４７ＣからのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。配列を確認し、次いで、構築物をＢＬＲ ｐＬｙｓＳおよびＢＬＲ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＰ細胞中に形質転換した。ＵＬ４７ＣのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号８８および９３に開示する。
（実施例１２）
（ＨＳＶ−２遺伝子、ＵＳ８をコードする新規ＤＮＡ配列の同定）
ＨＳＶ−２のＵＳ８遺伝子をＨＧ５２ウイルス株からクローニングし、配列決定した。そのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１８および配列番号１２０に開示する。次いで、配列番号１１８をＧｅｎＢａｎｋに含まれるＨＳＶ−２ ＨＧ５２株ゲノム配列（寄託番号Ｚ８６０９９）（そのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１９および配列番号１２１に開示される）と比較した。この比較は、配列番号１１８が、位置５４２で、フレームシフトを生じる付加塩基対を含んでいることを明らかにした。付加塩基対の存在はまた、ＨＳＶ−２、３３３の第二実験株でも確認された。配列番号１１８中の第一終止コドンの上流に、ＧｅｎＢａｎｋ ＵＳ８配列（配列番号１１９）とは異なる一つの付加塩基対（ｂｐ１５６）が存在した。ＵＳ８アミノ酸配列において、塩基対１５６でのヌクレオチド配列における変化から生じる変化はない。
ＨＳＶ−２の多数の実験株の配列の試験に加えて、二つの臨床的に単離したウイルスサンプル（ドナーＲＷ１８７４およびＨＶ５１０１）からゲノムＤＮＡ配列もまた入手した。位置５４２挿入部分の上流および下流の両方の遺伝子特異的配列のために設計したＰＣＲプライマーを使用して、この領域をＰＣＲ増幅し、同一のプライマー対を用いて精製した単位複製配列から直接配列決定した。ＲＷ１８７４およびＨＶ５１０１の両方から入手した配列は、位置５４２に付加グアニンヌクレオチドを示した。ＨＶ５１０１は、ＨＧ５２（配列番号１１９）と比較した場合、塩基対５７１（Ｇ／５７１／Ｃ：ＨＶ５１０１／位置／ＨＧ５２）に一つのさらなる塩基対変化を有していた。この差異は、フレームシフト形態の非保存的変化である。
（実施例１３）
（ＨＳＶ−２ ＵＬ４７タンパク質による予防接種は、ＣＤ４＋特異的Ｔ細胞反応およびＣＤ８＋特異的Ｔ細胞反応の両方を誘発する）
この実施例は、ＨＳＶ−２に対するワクチンとしてのＵＬ４７の効果を示す。ＵＬ４７（プラスミドＤＮＡによって送達される）で予防接種したＢａｌｂ／ｃマウスは、ＵＬ４７特異的ＣＤ４＋細胞反応およびＣＤ８＋細胞反応を始める。
二匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、１００μｇのＵＬ４７プラスミドＤＮＡ（ＵＬ４７ ＤＮＡ）を用いて三回免疫化し、さらに四匹のマウスを、ＵＬ４７を用いて二回免疫化し、その後、１×１０３ｐｆｕの弱めたＨＳＶ−２株３３３ｖｈｓＢ（ＵＬ４７ＤＮＡ／ＨＳＶ）で感染させた。さらに４匹のマウスは、ＨＳＶ−２感染のみを受けた（ＨＳＶコントロール）。最後の免疫化の二週間後、脾臓を回収し、７日間インビトロでワクシニアＵＬ４７で刺激した。
ＵＬ４７遺伝子（全体で１８プール）を貫通する１０〜１５マーのペプチドのプールによりパルスしたＰ８１５細胞に対して、クロム放出により、７日目に、細胞傷害性活性について脾細胞をアッセイした。脾細胞をインビトロで再刺激し、次いで、構成的１５マーペプチドを添加した陽性ペプチドプールに対して再アッセイした。１００：１のエフェクター：標的比では、ＣＤ８＋細胞による特異的溶解活性は、ペプチド８５（配列番号１２２）、ペプチド８９（配列番号１２３）、ペプチド９９およびペプチド９８（配列番号１２４）、ペプチド１０５（配列番号１２５）ならびにペプチド１１２（配列番号１２６）でパルスしたＰ８１５細胞に反応して見え得た。
ＣＤ４＋Ｔ細胞反応の存在を決定するために、脾細胞をインビトロで５μｇ／ｍｌ組換えＵＬ４７（ｒＵＬ４７）で刺激した。刺激の３日後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γをアッセイした。「ＵＬ４７ ＤＮＡ」マウス（これらは、免疫化した）および「ＵＬ４７ ＤＮＡ／ＨＳＶ」マウス（これらは、免疫化後、ＨＳＶ感染した）由来の両方の脾細胞から回収した上清は、「ＨＳＶコントロール」マウス（これらは、免疫化せず、感染した）と比較して、顕著なレベルのＩＦＮ−γが存在した。
さらに４匹のマウスをＵＬ４７ＤＮＡを用いて４回免疫化し、その後脾細胞を回収した。次いで、その脾細胞をペプチドｐ８５、ｐ８９、ｐ９８、ｐ１０５およびｐ１１２で刺激し、フローサイトメトリーを使用して、細胞内ＩＦＮ−γ産生の存在について、ＣＤ８＋細胞をアッセイした。ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋細胞の割合は、コントロール細胞（培地またはＰＢＳのみで刺激した細胞）と比較して、ペプチドｐ８５、ｐ８９、ｐ９８、ｐ９９、ｐ１０５およびｐ１１２で刺激した脾細胞内では、顕著であった。ペプチドｐ９８およびｐ９９に対して観察された反応性は、細胞内ＩＦＮ−γに対して陽性である全てのＣＤ８＋脾細胞の２％より多くで、最も高い割合であるべきである。
これらのデータはさらに、ＨＳＶ感染に対する防御またはＨＳＶ感染の処置において、ＵＬ４７のワクチン候補体としての効果を示す。
（実施例１４）
（ＨＳＶ−２血清陽性ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞反応）
どのＨＳＶ−２タンパク質が、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導し得るか決定するために、６個のＨＳＶ−２血清陽性ドナーをスクリーニングした。ドナーは、以下：ＡＤ１０４、ＡＤ１１６、ＡＤ１２０、Ｄ４７７、ＨＶ５１０１およびＪＨ６３７６を含む。どのＨＳＶ−２タンパク質が免疫原性であるか決定するために、合成ペプチド（１１アミノ酸により重複する１５マー）を、いくつかのＨＳＶ−２ポリペプチドの以下の領域（ＵＬ１５（ａ．ａ．６００〜７３４）、ＵＬ１８（ａ．ａ．１〜１１０）、ＵＬ２３（ａ．ａ．２４１〜３７６）、ＵＬ４６（ａ．ａ．６１７〜７２２）、ＵＬ４７（ａ．ａ．１〜６９６）、（ａ．ａ．１〜３００）、ＩＣＰ２７（ａ．ａ．１〜５１２）、ＵＳ３（ａ．ａ．１２５〜２７６）およびＵＳ８Ａ（ａ．ａ．８３〜１４６）を含む）にわたって合成した。ＵＬ４７、ＵＬ４９およびＩＣＰ２７に対して合成したペプチドは、全長ポリペプチドにわたっていた。ＵＬ１５、ＵＬ１８、ＵＬ２３、ＵＬ４６、ＵＳ３およびＵＳ８Ａに対して合成したペプチドは、ＣＤ４発現クローニングライブラリースクリーニングの間にＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される抗原をコードすることを以前に決定したこれらのポリペプチドの一部にわたっていた。
以下の手順を使用して、ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから単離した：最初に、プラスチック付着性を用いて、マクロファージから末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離した。次いで、市販のＭＡＣＳ ビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、非ＣＤ８＋細胞の枯渇により、ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに精製した。この方法を使用して単離したＣＤ８＋Ｔ細胞は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定した場合、一般に、＞９５％ ＣＤ８＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４−であった。抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を予めコートした９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート中で、ペプチドを２４時間、ＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０５／ウェル）、自家樹状細胞（１×１０４／ウェル）およびペプチド（各１０μｇ／ｍｌ）と共培養することにより、ペプチドをスクリーニングした。ペプチドを最初、≧１０ペプチドのプールとしてスクリーニングした。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを後に、標準的プロトコルによって、構築した。ウェルあたりのスポットの数を、自動ビデオ顕微鏡ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用して計数した。陽性をスクリーニングするプール由来のペプチドを後に、第二ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて個々に試験した。
ＡＤ１０４については、ペプチドＵＳ３ ＃３３（配列番号１３９：アミノ酸２６２〜２７６）のみが、陽性を記録した。
ＡＤ１１６については、ＵＬ１５ ＃２３（配列番号１２７：アミノ酸６８８〜７０２）、ＵＬ１５ ＃３０（配列番号１２８：アミノ酸７１６〜７３０）、ＵＬ２３ ＃７（配列番号１２９：アミノ酸２６５〜２７２）、ＵＬ４６ ＃２（配列番号１３０：アミノ酸６２１〜６３５）、ＵＬ４６ ＃８（配列番号１３１：アミノ酸６４５〜６５９）、ＵＬ４６ ＃９（配列番号１３２：アミノ酸６４９〜６６３）、ＵＬ４６ ＃１１（配列番号１３３：アミノ酸６５７〜６７１）、ＵＬ４７ ＃８６（配列番号１３４：アミノ酸３４１〜３５５）、ＵＬ４９ ＃６（配列番号１３５：アミノ酸２１〜３５）、ＵＬ４９ ＃４９（配列番号１３８：アミノ酸１９３〜２０８）およびＵＳ８Ａ ＃５（配列番号１４０：アミノ酸９９〜１１３）が、プールしたものおよび、個々の両方で陽性を記録した。さらにまた、ＡＤ１１６は、Ｂ＊０７０２制限エピトープＵＬ４９ ＃１２（配列番号１３６：アミノ酸４５〜５９）およびＵＬ４９ ＃１３（配列番号１３７：アミノ酸４９〜６３）を認識した。
ドナーＤ４７７、ＨＶ５１０１およびＪＨ６３７６ Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープＵＬ４７ ＃７３＃７４（アミノ酸２８９〜２９７）およびＵＬ４７ ＃１３７／＃１３８（アミノ酸５５０〜５５９）をそれぞれ認識した。
ドナーＡＤ１２０は、一つのペプチドプール、ＵＬ４６ ＃１〜１２に対して、陽性を記録した。
ドナーＤ４７７は、５個のペプチドプール：ＵＬ１８ ＃１〜１２、ＵＬ２３ ＃１〜１０、ＵＬ２３ ＃１１〜２０、ＵＬ４６ ＃１〜１２およびＵＬ４９ ＃１１〜２０に対して、陽性を記録した。
（実施例１５）
（ＨＳＶ−２のＵＳ４タンパク質をコードする新規配列の同定）
ドナーＡＤ１０４に由来するＴ細胞で、ＨＳＶ２−ＩＩライブラリーをスクリーニングすることにより、以前にクローン挿入部分Ｆ１０Ｂ３を同定した（詳細については、実施例１を参照のこと）。配列番号８は、クローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ３／ＵＳ４ｆｒａｇＦ１０Ｂ３＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑに由来する挿入部分の部分配列に対応し、そして、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する潜在的オープンリーディングフレームを含む。挿入配列に対応する全長ＤＮＡ配列および全長アミノ酸配列を、配列番号１４１および１４２に、それぞれ開示する。全長ＵＳ４ ＨＧ５２ ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、配列番号１７９および配列番号１４３にそれぞれ開示し、それらは、以下：Ｓ３５Ｎ（ＨＧ５２／位置／３３３）挿入配列とは異なる。
（実施例１６）
（ＨＳＶ−２内でのＨＳＶ−２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の同定）
種々のＨＳＶ−２タンパク質に反応する性能について、ＨＳＶ−２血清陽性ドナーのパネルから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞をスクリーニングした。簡単にいうと、ＰＢＭＣを、ドナーＥＢ５４９１、ＡＧ１０２９５、ＬＭ１０２９５および４４７から入手し、マイクロビーズまたはＭｉｌｔｅｎｙｉからのＣＤ８＋ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔを使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮した。合成ペプチド（１５アミノ酸長であって、かつ配列中で１０個または１１個のアミノ酸が重複する）を、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２（タンパク質ＵＬ２１（配列番号１４４および配列番号１５４に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）、ＵＬ５０（配列番号１４５および配列番号１５３に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）、ＵＳ３（配列番号１４６および配列番号１５４に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）、ＵＬ５４（配列番号１４７および配列番号１５６に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）、ＵＳ８（配列番号１４８および配列番号１５７に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）、ＵＬ１９（配列番号１４９および配列番号１５８に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）、ＵＬ４６（配列番号１５０および配列番号１５９に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）、ＵＬ１８（配列番号１５１および配列番号１６０に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）、およびＲＬ２（配列番号１５２および配列番号１６１に、それぞれ開示する全長ＤＮＡ／アミノ酸）を含む）に由来するいくつかの完全ＯＲＦまたは部分的ＯＲＦを越えて合成した。抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を予めコートした９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート中のドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞（２〜５×１０５細胞／ウェル）、自家樹状細胞（２〜５×１０４細胞／ウェル）およびペプチド（各０．５μｇ／ｍｌ）の２４個の共培養によって、ペプチドをスクリーニングした。各ペプチドプールを個々のウェル中でスクリーニングした。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、標準的プロトコルによって構築した。ウェルあたりのスポットの数を、自動ビデオ顕微鏡ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用して計数した。陽性を試験するペプチドプールから決定した個々の１５マーペプチドを、上記のようにスクリーニングし、次の結果に戻した。
ドナーＥＢ５４９１は、ＨＳＶ−２抗原：ＩＣＰ０ペプチド ＃４３（アミノ酸２１１〜２２５：ＩＷＴＧＮＰＲＴＡＰＲＳＬＳＬ：配列番号１６２）に対して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞反応を示した。ＵＬ４６ペプチド＃４１（アミノ酸２０１〜２１５：ＹＭＦＦＭＲＰＡＤＰＳＲＰＳＴ：配列番号１６３）、ＵＬ４６ ＃５０（アミノ酸２４６〜２６０：ＶＣＲＲＬＧＰＡＤＲＲＦＶＡＬ：配列番号１６４）、ＵＬ４６ ＃５１（アミノ酸２５１〜２６５：ＧＰＡＤＲＲＦＶＡＬＳＧＳＬＥ：配列番号１６５）およびＵＬ４６＃６０（アミノ酸２９６〜３１０：ＳＤＶＬＧＨＬＴＲＬＡＨＬＷＥ：配列番号１６６）。ドナーＥＢ５４９１もＨＳＶ−２タンパク質（ＵＳ８ ＃７４（アミノ酸３６６〜３８０：ＨＧＭＴＩＳＴＡＡＱＹＲＮＡＶ：配列番号１６７））に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を示した。
ドナーＪＨ６３７６は、ＨＳＶ−２タンパク質ＩＣＰ０（アミノ酸２１５〜２２３（ＮＰＲＴＡＰＲＳＬ：配列番号１７７）に位置する９マーに対応する）およびＵＬ４６（アミノ酸２５１〜２６０（ＧＰＡＤＲＲＦＶＡＬ：配列番号１７８）に位置する１０マーに対応する）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を示した。
ドナーＡＧ１０５９は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１９ペプチド１０２（アミノ酸５０６〜５２０：ＬＮＡＷＲＱＲＬＡＨＧＲＶＲＷ：配列番号１６８）、ＵＬ１９ ＃１０３（アミノ酸５１１〜５２５：ＱＲＬＡＨＧＲＶＲＷＶＡＥＣＱ：配列番号１６９）およびＵＬ１８ ＃１７（アミノ酸６５〜７９：ＬＡＹＲＲＲＦＰＡＶＩＴＲＶＬ：配列番号１７２）およびＵＬ１８ ＃１８（アミノ酸６９〜８３：ＲＲＦＰＡＶＩＴＲＶＬＰＴＲＩ：配列番号１７３）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を示した。
ドナーＬＭ１０２９５は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ１９ ＃７４（アミノ酸３６６〜３８０：ＤＬＶＡＩＧＤＲＬＶＦＬＥＡＬ：配列番号１７０）およびＵＬ１９＃７５（アミノ酸３７１〜３８５：ＧＤＲＬＶＦＬＥＡＬＥＲＲＩＹ：配列番号１７１）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を示した。
ドナー４７７は、ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ５０ ＃１６（アミノ酸７６〜９０：ＣＡＩＩＨＡＰＡＶＳＧＰＧＰＨ：配列番号１７４）、ＵＬ５０ ＃２３（アミノ酸１１１〜１２５：ＰＮＧＴＲＧＦＡＰＧＡＬＲＶＤ：配列番号１７５）およびＵＬ５０ ＃４９（アミノ酸２４１〜２５５：ＬＲＶＬＲＡＡＤＧＰＥＡＣＹＶ：配列番号１７６）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を示した。
（実施例１７）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＵＬ４７の短縮型の発現）
全長ＵＬ４７コード領域のＣ末端短縮を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ＵＬ４７Ｆと名付けた。このＵＬ４７の短縮部分は、アミノ酸５００〜５５９に対応するＵＬ４７のＣ末端Ｔ細胞エピトープを含む。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ ＵＬ４７ Ｆの発現）
ＨＳＶ ＵＬ４７Ｆ コード領域（配列番号１８０および配列番号１８１にそれぞれ開示するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）を、以下のプライマー：
ＣＢＨ−６３１：５’ｃｔｇｇｇｔｃｔｇｇｃｔｇａｃａｃｇｇｔｇｇｔｃｇｃｇｔｇｃｇｔｇ３’（配列番号１８２）
ＰＤＭ−６３２：５’ｃｃｇｔｔａｇａａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｃｇｔｇｇｃｇｇｇｃｃ３’（配列番号１８３）
を用いて、ＰＣＲ増幅した。
（ＰＣＲを、以下の反応成分を用いて実施した：）
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２μｌ １０μＭの各プライマー
８３μｌの滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）
５０ｎｇ ＤＮＡ
（ＰＣＲ増幅を、以下の反応条件を用いて実施した：）
９６℃で２分間、その後４０サイクルの：
９６℃で２０秒間；
６８℃で１５秒間；そして、
７２℃で１分３０秒間、その後最後の伸長工程：
７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。構築物の配列を確認し、次いで、構築物をＢＲＬ ｐＬｙｓ ＳおよびＢＬＲ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ ＲＰ細胞中に形質転換した。
（実施例１８）
（ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞により識別されるＨＳＶ−２由来の新規抗原の同定）
この実施例は、ＨＳＶ−２ペプチドのＥＬＩＳＰＯＴスクリーニングを使用する複合的免疫原性ＨＳＶ−２抗原の同定を例証する。これらの発見は、インビボにおける細胞免疫応答を誘発し得るＨＳＶ−２抗原を同定する。このような抗原の同定は、ＨＳＶ−２感染に対して防御するためのワクチンの開発ならびにＨＳＶ−２感染の処置に使用し得る化合物の開発を可能にする。
ＨＳＶ−２血清陽性ドナーのパネル（ＡＤ１０４、ＡＤ１１６、Ｄ５７４、ＧＩ１０８９７、ＲＷ１８７４、ＹＳ１００６３、ＡＣ１００２２、ＬＢ１０８０２、ＮＨ９８９４、ＰＡ１０９３９、ＶＢ１０５７６、ＭＡ１１２５９（血清陰性）およびＪＧ１０７５８（詳細は、表４に記載される）を含む）を使用して、ＨＳＶ−２の免疫原性部分を同定した。血液を各ドナーから入手し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を使用して末梢血短核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣを、ＰＢＳ／ＥＤＴＡを使用して、十分に洗浄し、１０％ＤＭＳＯ／５０％ＦＢＳ／４０％ＲＰＭＩ溶液に懸濁し、凍結した。
（表４）
Figure 2005522210
 合成ペプチド（１５アミノ酸長であって、かつ１０または１１アミノ酸が重複する）を、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株由来のいくつかの全長または一部のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を横切って合成した。これらのＯＲＦとしては、ＵＬ１８（配列番号１８４および配列番号１９５に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＬＡＴ−ＯＲＦ１（配列番号１８５および配列番号１９８に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＵＬ４８（配列番号１８６および配列番号２０５に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＵＬ４１（配列番号１８７および配列番号２０４に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＵＬ３９（配列番号１８８および配列番号２０３に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＵＬ３７（配列番号１８９および配列番号２０２に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＵＬ３６（配列番号１９０および配列番号２０１に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＵＬ２９（配列番号１９１および配列番号２００に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＵＬ２５（配列番号１９２および配列番号１９９に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＩＣＰ４（配列番号１９３および配列番号１９７に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＩＣＰ０（配列番号３５および配列番号４７に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ＵＳ３（配列番号１４６および配列番号１５４に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）およびＩＣＰ２２（配列番号１９４および配列番号１９６に、それぞれ開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）が挙げられた。各ペプチドをＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することにより、個々の１５マーペプチドストックを作製した。個々のペプチドを１００μｇ／ｍｌで組み合わせることにより、１６〜９０の間のペプチド／プールを含むペプチドプールを、個々のペプチドストックから作製した。
個々のドナーのＰＢＭＣから富化したＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、ペプチドプールをスクリーニングした。ＣＤ８＋マイクロビーズまたはＭｉｌｔｅｎｙｉからのＣＤ８＋富化キットを製造者の教示により使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の富化を行った。抗ヒトＩＦＮ−γ抗体で予めコートした９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート中のＣＤ８＋Ｔ細胞（５×１０５／ウェル）、自家樹状細胞（５×１０４／ウェル）およびペプチドプール（各０．５μｇ／ｍｌ）の２４時間の共培養により、ペプチドをスクリーニングした。各ペプチドプールを、個々のウェル中でスクリーニングした。その後、標準的プロトコールによって、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、構築し、ウェルあたりのスポットの数を、自動ビデオ顕微鏡ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用して計数した。
以下のドナーは、以下のＨＳＶ−２抗原およびペプチドプールに反応した：
ドナーＬＢ１０８０２は、ＵＬ３９，ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）およびペプチドプールＤ（アミノ酸７５１〜１１４２）、ＵＬ２１、ペプチドプールＢ（アミノ酸２６０〜５３０）、ＵＬ１９、ペプチドプールＥ（アミノ酸１００１〜１３７４）およびペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜５１０）、ならびにＩＣＰ０、プールＣ（アミノ酸４９９〜８２５）に応答した。
ドナーＰＡ１０９３９は、ＵＬ２５、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜５８５）、ＵＬ４７、ペプチドプールＣ（アミノ酸４０１〜６９６）およびＵＬ４６、ペプチドプールＣ（アミノ酸５００〜７２２）に応答した。
ドナーＮＨ９８９４は、ＵＬ３９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）、ＵＬ３６、ペプチドプールＧ（アミノ酸２６７１〜３１２２）、ＵＬ２９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）、ＵＬ２５、ペプチドプールＡ（アミノ酸１〜２６０）、ＵＬ４９、アミノ酸１〜３００、ＵＬ４７、ペプチドプールＣ（アミノ酸４０１〜６９６）、ＵＬ４６、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜５１０）、ＵＬ１９、ペプチドプールＤ（アミノ酸７５１〜１０１０）およびＩＣＰ０、ペプチドプールＡ（アミノ酸１〜２５９）に応答した。
ドナー５７４は、ＵＬ３９、ペプチドプールＤ（アミノ酸７５１〜１１４２）、ＵＬ１８（アミノ酸１〜３１８）およびＩＣＰ０、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜５１０）に応答した。
ドナーＡＤ１０４は、ＵＬ２９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）、ＵＬ２５、ペプチドプールＡ（アミノ酸１〜２６０）およびＩＣＰ４、ペプチドプールＤ（アミノ酸７５１〜１０１０）に応答した。
ドナーＹＳ１００６３は、ＵＬ２５、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜５８５）、ＵＳ３、アミノ酸１６３〜４８１、ＵＬ４７、ペプチドプールＣ（アミノ酸４０１〜６９６）およびペプチドプールＢ（アミノ酸２０１〜４１１）、ＵＬ１９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）およびＩＣＰ０、ペプチドプールＣ（アミノ酸４９９〜８２５）およびペプチドプールＡ（アミノ酸１〜２５９）に応答した。
ドナーＪＧ１０７５８は、ＵＬ３９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）に応答した。
ドナーＡＤ１１６は、ＵＬ４１、ペプチドプールＡ（アミノ酸１〜２６０）およびＩＣＰ２２、ペプチドプールＢ（アミノ酸２０６〜４１３）に応答した。
ドナーＶＢ１０５７６は、ＬＡＴ−１、ペプチドプールＢ（アミノ酸４２〜８２）、ＵＬ３９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）、ＵＬ３６、ペプチドプールＡ（アミノ酸１〜４５５）およびペプチドプールＣ（アミノ酸８８９〜１３４５）、ＩＣＰ２２、ペプチドプールＢ（アミノ酸２０６〜４１３）、ＵＬ１９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）およびペプチドプールＡ（アミノ酸１〜２６０）、ＩＣＰ２７、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５３〜５１２）およびＩＣＰ０、ペプチドプールＣ（アミノ酸４９９〜８２５）に応答した。
ドナーＧＩ１０８９７は、ＵＬ３９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）およびペプチドプールＡ（アミノ酸１〜２６０）、ＵＬ３７、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）、ＵＬ３６、ペプチドプールＣ（アミノ酸８８９〜１３４５）およびＵＬ２５、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜５８５）に応答した。
ドナーＲＷ１８７４は、ＵＬ４１、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜４９２）、ＵＬ３９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）およびＵＬ２５、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜５８５）に応答した。
ドナーＡＣ１００２２は、ＵＬ１８アミノ酸１〜３１８およびＩＣＰ４、ペプチドプールＤ（アミノ酸７５１〜１０１０）およびペプチドプールＢ（アミノ酸２５１〜５１０）に応答した。
ドナーＭＡ１１２５９は（ＨＳＶ血清陰性ドナー）は、ＵＬ３９、ペプチドプールＣ（アミノ酸５０１〜７６０）、ＩＣＰ２７、ペプチドプールＢ（アミノ酸２５３〜５１２）およびＩＣＰ０、ペプチドプールＡ（アミノ酸１〜２５９）に応答した。
（実施例１９）
（ＣＤ４＋Ｔ細胞クローニングを用いたＨＳＶ−２抗原の同定）
ドナーＨＨは、ＨＳＶ−２を曝露されているが、非感染性の血清陰性のドナーである。前述の実施例６に、ＨＳＶ−２特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞株の作製を記載した。この実施例は、Ｅ．Ｃｏｌｉ遺伝子フラグメントの発現ライブラリーのＴ細胞発現クローニングを用いた、免疫応答性ＨＳＶ−２抗原の同定について説明する。ＨＳＶ−２の３３３株を用いて、これらのライブラリーを作製した。本質的に実施例１１に記載したように、これらの実験を実施した。
ＨＳＶ−２ライブラリーから、３つの異なるライブラリー挿入物を同定した：
挿入物１／Ａ７および１／Ｆ３は、塩基対３６，１６８〜３７，６０５（このＤＮＡ配列を配列番号２０６に開示する）において対応するＨＳＶ−２（ＨＧ５２株）ゲノムにわたり；挿入物１／Ｈ６は、塩基対３６，０５５〜３７、３５４（このＤＮＡ配列を配列番号２０７に開示する）にわたり；そして、挿入物３／Ｃ１は、塩基対３６，４７３〜３７，７２７（このＤＮＡ配列を配列番号２０８に開示する）にわたる。
各々のこれらの挿入物は、ＵＬ１９のＣ末端のフラグメント（ＶＰ５またはＩＣＰともいう）をコードする。ＵＬ１９についての全長ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号２１０および配列番号２１２にそれぞれ開示する。全ての３つのライブラリー挿入物によって共有される配列は、塩基対３６，４７３〜３７，３５４（このＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２０９および配列番号２１１にそれぞれ開示する）において対応するＨＳＶ−２（ＨＧ５２株）ゲノムにわたる。
ＵＬ１９ ＯＲＦは、塩基対３６，４４８〜４０，５７２におけるＨＧ５２のゲノム配列にわたり、ＨＳＶ−２の主要カプシドタンパク質をコードする。ライブラリー挿入物（ＨＳＶ−２株３３３由来）およびＨＧ５２由来の対応するＵＬ１９配列（Ａ３６７１０Ｇ、Ｇ３７２４８ＣおよびＣ３７３１７Ｔ（３３３／位置／ＨＧ５２））によってコードされる共有領域の間には、３つのヌクレオチドの相違がある。最初の２ヌクレオチド置換は、アミノ酸置換を生じるが、３番目のヌクレオチド置換は、アミノ酸置換を生じない。この置換は、ＮをＳに、そしてＧをＡにそれぞれ置換する（ＨＧ５２から３３３まで）。
（実施例２０）
（臨床的に単離したウイルスＤＮＡ由来のＨＳＶ−２ ＵＳ８遺伝子の配列）
ＨＳＶ−２のＵＳ８遺伝子に対応するＤＮＡ配列を、研究室のＨＧ５２ウイルス株からクローニングし、配列決定し、そして、ＤＮＡおよびその対応するアミノ酸配列を配列番号１１８および配列番号１２０にそれぞれ開示する。これらの実験の詳細を、実施例１２に説明する。次いで、配列番号１１８を、ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号Ｚ８６０９９）に含まれるＨＳＶ−２ ＨＧ５２株ゲノム配列と比較し、このＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号１１９および配列番号１２１にそれぞれ開示する。この比較によって、配列番号１１８がフレームシフトを生じた５４２位における特別な塩基対を含んだことを明らかになった。この特別な塩基対の存在はまた、実験室の第２のＨＳＶ−２株（３３３）で確認した。ＧｅｎＢａｎｋ ＵＳ８配列（配列番号１１９）とは異なる配列番号１１８において、第１の終止コドンの上流に１つの追加塩基対（１５６塩基対）が存在した。塩基対１５６におけるヌクレオチド配列の変化からＵＳ８アミノ酸配列における変化は、生じない。２つの臨床的な単離体（ＲＷ１８７４ドナーおよびＨＶ５１０１ドナー）から、全長ＵＳ８遺伝子を配列決定した。これらの配列を誘導するために、各々の臨床的なウイルスＤＮＡ単離体由来のＰＣＲ産物を、配列決定するためにクローニングし、プラスミドベクターに連結した。このベクターは、潜在性のタンパク質発現を増強して、切断部位を提供するための融合パートナー（Ｒａｌ２／トロンビン部位）を上流に含み、その結果、臨床的なＵＳ８遺伝子配列は、重複性を除去するように開始コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）配列を欠如する。ベクターおよび予測される内部配列の両方に対して特異的なＤＮＡプライマーを用いて、これらの各々のクローンを含むプラスミドＤＮＡを配列決定した。
ＲＷ１８７４ついての全長ＵＳ８ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２１３および配列番号２１５に開示し；そして、ＨＶ５１０１についての全長ＵＳ８ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２１４および配列番号２１６それぞれに開示する。次いで、これらの配列を研究室の確立されたＨＳＶ−２株（ＨＧ５２）と比較し、この結果を表５に記載する。
（表５）
Figure 2005522210
 これらの臨床的な単離体で観察される相違は、高度に保存される配列の領域または可変性を示す配列の領域に関する、価値ある情報を提供する。この配列情報は、ＨＳＶ／ＨＳＶ−２感染の処置および予防のために、治療および診断抗体の開発に利用され得る価値ある情報を提供する。ＨＳＶ−２遺伝子の配列における可変性は、ほとんど不明である。この配列情報はまた、ワクチンの使用において、単一の抗原または複数の抗原の選択のための価値ある情報を提供する（つまり、最も臨床的に相当し、関連するＨＳＶ−２配列を同定する）。
（実施例２１）
（ＣＤ４＋Ｔ細胞クローニングを用いたＨＳＶ−２抗原の同定）
本実施例は、ＨＳＶ−２を曝露されているが、血清陰性のドナーであるＨＨドナーから作製されたＣＤ４＋Ｔ細胞クローンのさらなる特徴付けについて説明する。これらのＴ細胞クローンの作製について、実施例６に詳細を記載する。
クローンＨＨ６は、ＨＳＶ２−ＩＩライブラリー由来のプールＤ６に加えて、ＨＳＶ−２−ＩＩＩライブラリープール３Ｈ１１によって表されたＵＬ２１を認識することが見出された。挿入物ＤＮＡ配列および対応するタンパク質配列を、配列番号２１７および配列番号２２７にそれぞれ開示する。これらの配列は、ＨＳＶ２株の３３３由来であった。このＤＮＡ配列は、ＨＧ５２ウイルスゲノムの相同領域の塩基対４２，９０８〜４４，２９６にわたる。ＨＳＶ−２のＨＧ５２株由来のＵＬ２１の全長ＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、配列番号２１８および配列番号２２８に開示される。１０アミノ酸分オーバーラップする１５マーのペプチドを用いて、クローンＨＨ６由来のＴ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＨＳＶ−２ペプチドで置換した場合に反応する能力について試験した。結果は、反応性Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸２８１〜３００との間のＵＬ２１遺伝子内に位置したことを示した。この配列の領域に対応するアミノ酸は、以下の通りである：ＰＬＲＥＬＷＷＶＦＹＡＧＤＲＡＬＥＥＰＨ（配列番号２２９）。
クローンＨＨ２０は、ＨＳＶ−２ ＯＲＦ（ＵＬ２９）のフラグメントを認識することが見出された。このクローンは、２つのＵＬ２９をコードする挿入物を含むことが見出され、これらの両方はＨＧ５２株由来であった。ＨＳＶ−２のＨＧ５２株由来のＵＬ２９の全長ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、配列番号２２１および配列番号２３２にそれぞれ開示する。第１の挿入物（クローンｌ／Ｃ１２＿Ｅｌ（配列番号２１９）は、ＨＧ５２ウイルスゲノムの塩基対６１，５３９−６２，２９９にわたり、ＵＬ２９（アミノ酸４８〜３０３（配列番号２３０））をコードする。第２の挿入物（２／Ｅ９＿Ｄ１１（配列番号２２０）は、ＨＧ５２ウイルスゲノムの塩基対６１，５３８−６２３６０にわたり、ＵＬ２９（アミノ酸３０〜３０３（配列番号２３１））をコードする。この挿入物の配列は、以下のように、ＨＧ５２とは異なる：Ｒ１２１ＰおよびＳ１２６Ａ（３３３／位置／ＨＧ５２）。
クローンＨＨ２２は、ＵＬ４６のＨＳＶ−２ ＯＲＦのフラグメントを認識し、２つの挿入物を含むことが見出された。ＨＳＶ−２のＨＧ５２株由来のＵＬ４６の全長ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２２４および配列番号２３５にそれぞれ開示する。ＨＳＶ−２のＨＧ５２株由来の、第１の挿入物（Ｆ７＿Ａ１）は、ＨＧ５２ウイルスゲノムにおける相同領域の塩基対９９，２５３〜１００，０１４にわたることが見出され、ＵＬ４６／アミノ酸５２９〜７２２をコードする。ＤＮＡ配列および挿入物Ｆ７＿Ａ１でコードされるアミノ酸配列を、配列番号２２２および配列番号２３３にそれぞれ開示する。Ｆ７＿Ａ１挿入物のアミノ酸配列は、以下のようにＨＧ５２とは異なる：：−５９０Ａ、Ｓ６１３Ｇ、Ｌ６４３Ｐ、Ｑ６３７Ｒ、Ｄ６３８Ｌ、Ｐ６４４Ｌ、Ｐ６７２Ｒ、Ｇ６７３Ｒ（３３３／位置／ＨＧ５２）。ＨＳＶ−２のＨＧ５２株由来の、第２の挿入物（４／Ｅ８＿Ｃ８）は、ＨＧ５２ウイルスゲノムの９９，２３２〜１００，２６２にわたり、ＵＬ４６／アミノ酸４４６〜７２２をコードする。挿入物のＤＮＡ配列およびそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号２２３および配列番号２３４にそれぞれ開示する。Ｔ細胞エピトープの位置を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける１０アミノ酸分のオーバーラップする１５マーペプチドをスクリーニングすることによってマッピングし、ＵＬ４６／６２１−６４９（ＥＥＩＰＷＶＲＶＹＥＮＩＣＬＲＲＱＤＡ：配列番号２３６）内に位置する。
ＨＳＶ−２ ＯＲＦ ＵＬ４７のフラグメントを認識するクローンＨＨ２４、ＨＳＶ−２のＨＧ５２株由来の全長ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２２６および配列番号２３８にそれぞれ開示する。挿入物Ｇ６＿Ｈ１１のＤＮＡ配列（配列番号２３７をコードする配列番号２２５）は、ＨＧ５２ウイルスゲノムの相同領域の塩基対１０１，６２２〜１０３，３８６にわたる。Ｔ細胞エピトープの位置を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける１０アミノ酸分オーバーラップする１５マーペプチドをスクリーニングすることによってマッピングし、これは、ＵＬ４７／アミノ酸１３７〜１５５（ＬＧＲＶＧＧＳＲＶＶＰＳＰＬＦＬＤＥＬ：配列番号２３９）に位置する。
（実施例２２）
（ＣＤ４＋Ｔ細胞クローニングを用いたＨＳＶ−２抗原の同定）
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＨＳＶ−２血清陽性ドナー（ＴＭ）（生殖器病変のまれな再発を患い、まれにウイルスを脱落する（ウイルス培養およびＰＣＲの両方によって、日々の塗布に対して評価するように））から作製した。ＵＶで不活性化したＨＳＶ−２（３３３株）を用いたＰＢＭＣの刺激によって、１４日間、ＴＭクローンを誘導し、抗ＣＤ３ ｍＡｂの限界希釈クローニングを引き続き行った。その後、反応性について、ＵＶで不活性化したＨＳＶ−２および組換え型のＨＳＶ−２タンパク質のパネルを用いて、クローンを試験した。
クローンＴＭ１３およびクローンＴＭ５８は、ＩＣＰ２７としても知られているＨＳＶ−２ ＯＲＦ ＵＬ５４の同一フラグメントを認識する。挿入物３／Ｆ５＿Ｇ１に対応するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２４０および配列番号２４１にそれぞれ開示する。対応するＨＧ５２ ＤＮＡ配列は、ウイルスゲノムの塩基対１１５，０６１〜１１５，７８５にわたり、ＵＬ５４のフラグメントをコードする。全長ＵＬ５４に対応するＨＧ５２配列を、配列番号２４２に開示する。３／Ｆ５＿Ｇ１によってコードされる実際のアミノ酸配列（配列番号２４１）は、ＨＧ５２アミノ酸１５９〜３９９に対応する。全長ＵＬ５４に対応するＨＧ５２アミノ酸配列を、配列番号２４３に開示する。３／Ｆ５＿Ｇ１挿入物配列は、単一アミノ酸（Ｎ１６９Ｋ）（３３３／位置／ＨＧ５２）において、ＨＧ５２ ＵＬ５４配列とは異なる。
クローンＴＭ３９は、ＨＳＶ−２の２つのゲノムフラグメントから成る挿入物を認識した。挿入物３／Ｈ１１＿Ｃ３に対するＤＮＡ配列を、配列番号２４４に開示する。対応するＨＧ５２ ＤＮＡ配列は、ウイルスゲノムの塩基対４３，７１７〜４４，０８６および塩基対７０，２９４〜７１，８４６を含む。第１のフラグメント（塩基対７０，２９４〜７１，８４６）は、ＨＧ５２ ＵＬ２１およびＵＬ２２の一部をコードする。塩基対４３，７１７〜４４，０８６は、ＵＬ３６の一部をコードする。Ｕ１２１、ＵＬ２２およびＵＬ３６に対応する全長ＤＮＡ配列を、配列番号２４５〜２４７にそれぞれ開示する。ＵＬ２１、ＵＬ２２およびＵＬ３６に対応する全長ＨＧ５２アミノ酸配列を、配列番号２４８〜２５０にそれぞれ開示する。
クローンＴＭ５１は、ＨＳＶ−２ ＯＲＦ ＵＳ４のフラグメントを認識した。ＴＭ５１（Ｆ７＿Ａ８）由来の挿入物のＤＮＡ配列を、配列番号２５１に開示する。対応するＨＧ５２ ＤＮＡ配列は、ウイルスゲノムの塩基対１３９，５０５〜１４０，１０４にわたり、ＵＳ４のフラグメントをコードする。対応するＨＧ５２ ＤＮＡ配列を、配列番号２５２に開示する。Ｆ７＿Ａ８によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号２５３に開示し、これは、ＨＧ５２ ＵＳ４アミノ酸５４４〜６９９に対応する。全長ＵＳ４配列に対応するｈｇ５２アミノ酸配列を、配列番号２５４に開示する。Ｆ７＿Ａ８挿入物およびＨＧ５２アミノ酸配列は、単一アミノ酸（Ｄ５６Ｅ）で異なる（３３３／位置／ＨＧ５２）。
（実施例２３）
（ＩＣＰ０およびＵＬ４７に対するＣＤ４ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８ Ｔ細胞エピトープの同定）
ＨＳＶ−２のＩＣＰ０タンパク質にわたる１５マーのペプチド（１１アミノ酸残基でオーバーラップする）を合成し、プールへアレイした。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μｇのＩＣＰ０プラスミドＤＮＡを用いて３週間の間隔で、３回免疫し、最終免疫の２〜３週間後に脾臓を採取した。ＭＡＣＳビーズおよびカラムを用いたポジティブセレクションによって、免疫した脾臓からＣＤ８ Ｔ細胞を精製した。ＣＤ８ Ｔ細胞が精製される由来の細胞をまた保存し、「ＣＤ８枯渇」免疫脾細胞と命名した。
天然のＢＡＬＢ／ｃの脾臓ＡＰＣ（５×１０５／ウェル）と同時培養した精製ＣＤ８ Ｔ細胞（１．５×１０５／ウェル）を使用して、ＣＤ８ Ｔ細胞応答の検出を実施し、これに、ＩＣＰ０ペプチドのアレイしたプール（最終濃度は、プールにおいてそれぞれ０．５μｇ／ｍｌのペプチドであった）を、２４時間のマウスＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために添加し、培地のみは、ネガティブコントロールとして、そしてＣｏｎ Ａ（５μｇ／ｍｌ）は、ポジティブコントロールとして機能した。
１５マーのペプチドのアレイしたプール（最終濃度は、プールにおいてそれぞれ０．０５μｇ／ｍｌのペプチドであった）と同時培養したＣＤ８枯渇免疫脾細胞（１×１０６／ウェル）を使用して、ＣＤ４ Ｔ細胞応答の検出を、２４時間のマウスＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで実施した。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを発色し、アッセイの結果を定量的および定性的の両方で決定した。２つのプールはポジティブと判明し、ＩＣＰ０のこれらのプールである４３番目のアミノ酸残基２１１〜２２５（ＩＷＴＧＮＰＲＴＡＰＲＳＬＳＬ（配列番号２５５））およびＩＣＰ０の４４番目のアミノ酸残基２１６〜２３０（ＰＲＴＡＰＲＳＬＳＬＧＧＨＴＶ（配列番号２５６））由来のペプチドは、共通して１０アミノ酸残基を共有する。ＣＤ８ Ｔ細胞によって認識される最小のＩＣＰ０ペプチドを同定するために、本発明者らは、上記のＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて、精製した免疫ＣＤ８ Ｔ細胞を、一連の合成ＩＣＰ０ペプチド（各１μｇ／ｍｌ）に対して試験した。ＩＣＰ０のアミノ酸残基２１７〜２２５（ＲＴＡＰＲＳＬＳＬ配列番号２５７）をＣＤ８ Ｔ細胞によって認識される最小量のエピトープであると決定した。
ＣＤ４ Ｔ細胞は、３つのペプチド（ＩＣＰ０の７９番目のアミノ酸残基３９０〜４０４（ＡＱＶＳＳＧＰＧＧＧＧＬＰＱＳ（配列番号２６０））、ＩＣＰ０の８２番目のアミノ酸残基４０５〜４１９（ＳＧＲＡＡＲＰＲＡＡＶＡＰＲＶ（配列番号２５９））およびＩＣＰ０の８９番目のアミノ酸残基４４０〜４５４（ＰＡＰＰＡＶＰＶＤＡＨＲＡＰＲ（配列番号２５８）））を認識した。
ＨＳＶ−２のＵＬ４７抗原にわたる１５マーのペプチド（１１アミノ酸残基でオーバーラップする）を合成し、プールへアレイし、上記のようにアッセイした。５つのペプチドをポジティブプールから同定し、これらの２つ（ＵＬ４７の第９８番目のアミノ酸残基３８９〜４０３（ＹＡＧＲＭＴＹＩＡＴＧＡＬＬＡ（配列番号２６１））およびＵＬ４７の第９９番目のアミノ酸残基３９３〜４０７（ＭＴＹＩＡＴＧＡＬＬＡＲＦＮＰ（配列番号２６２）））は、１０アミノ酸残基のオーバーラップを共有し、ＵＬ４７のアミノ酸残基３９４〜４０１（ＴＹＩＡＴＧＡＬＬ（配列番号２６３））を、ＣＤ８ Ｔ細胞によって認識される最小のエピトープであると決定した。ポジティブプールから同定した別のペプチドは、ＵＬ４７の第１１２番目のアミノ酸残基４４５〜４５９（ＡＲＬＨＰＨＳＡＨＰＡＦＡＤＶ（配列番号２６４））であった。第１１２番目のペプチドのアミノ酸残基４４８〜４５６（ＨＰＨＳＡＨＰＡＦ（配列番号２６５））は、推定ＣＤ８エピトープと考えられる。
ＣＤ４ Ｔ細胞は、ペプチドであるＵＬ４７の第１番目のアミノ酸残基１〜１５（ＭＳＶＲＧＨＡＶＲＲＲＲＡＳＴ（配列番号２６７））、ＵＬ４７の第４番目のアミノ酸残基１３〜２７（ＡＳＴＲＳＨＡＰＳＡＨＲＡＤＳ（配列番号２６６））、ＵＬ４７の第９９番目のアミノ酸残基３９３〜４０７（ＭＴＹＩＡＴＧＡＬＬＡＲＦＮＰ（配列番号２６２））およびＵＬ４７の第１１２番目のアミノ酸残基４４５〜４５９（ＡＲＬＨＰＨＳＡＨＰＡＦＡＤＶ（配列番号２６４））を認識した。
当業者は、上記の説明に開示される概念および特定の実施形態が、本発明の同一の目的を実施するために、他の実施形態を改変するかまたは設計するための基礎として容易に利用され得ることを理解する。当業者はまた、このような同等の実施形態が、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲から逸脱しないことを理解する。
上記から、本発明の特定の実施形態は、例示の目的について本明細書に記載されているが、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく作製され得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いては、限定されない。
【配列表】
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Claims (25)

  1. 少なくともＨＳＶ抗原の免疫原性部分を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該抗原が、以下、
    配列番号１６１、７４〜７５、９０〜９７、１２０〜１２１、１２２〜１４０、１４２〜１４３、１５３〜１６０、１６２〜１７８、１８１、１９５〜２０５、２１５〜２１６、２２７〜２３９、２４１、２４３、２４８〜２５０、２５３〜２５４および２５５〜２６７の任意の一つの中に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  3. 請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号１５２、６５〜７３、７６〜８９、９８〜１１７、１１８〜１１９、１４１、１４４〜１５１、１７９〜１８０、１８２〜１８３、１８４〜１９４、２０６〜２１０、２１３〜２１４、２１７〜２２６、２４０、２４２、２４４〜２４７および２５１〜２５２の任意の一つの中に示される配列を含む、ポリヌクレオチド。
  4. 少なくともＨＳＶ ＵＬ１９抗原の免疫原生部分を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該抗原が、配列番号２１２に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  5. 請求項１に記載のポリペプチドおよび融合パートナーを含む融合タンパク質。
  6. 請求項５に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記融合パートナーが、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトさせた宿主細胞中で、該融合タンパク質の発現を増加する発現エンハンサーを含む、融合タンパク質。
  7. 請求項５に記載の融合タンパク質であって、ここで、該融合パートナーが、請求項１に記載のポリペプチド内に存在しないＴヘルパーエピトープを含む、融合タンパク質。
  8. 前記融合パートナーが、アフィニティタグを含む、請求項５に記載の融合タンパク質
  9. 請求項５に記載の融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  10. 請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または抗原の結合するそれらのフラグメント。
  11. 請求項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび生理学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  12. 請求項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび免疫賦活剤を含有する、薬学的組成物。
  13. 請求項１２に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記免疫賦活剤がモノホスホリル脂質Ａ、リン酸アミノアルキルグルコサミニド、サポニンまたはこれらの組合せからなる群から選択される、薬学的組成物。
  14. 患者の免疫応答を刺激するための方法であって、該方法が請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
  15. 患者のＨＳＶ感染を検出するための方法であって、以下
    （ａ）前記患者から生物学的サンプルを入手する工程；
    （ｂ）該サンプルを請求項１に記載のポリペプチドと接触させる工程；
    （ｃ）前記ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出する工程
    を包含する、方法。
  16. 請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記生物学的サンプルが全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、方法。
  17. 生物学的サンプルにおいて、ＨＳＶ感染を検出するための方法であって、以下：
    （ａ）該生物学的サンプルを、請求項１に記載のポリペプチドに結合し得る結合物質と接触させる工程
    （ｂ）該結合物質に結合するポリペプチドをサンプル中で検出し、それによって、該生物学的サンプル中でＨＳＶ感染を検出する工程
    を包含する、方法。
  18. 前記結合物質がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記結合物質がポリクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記生物学的サンプルが、全血、痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  21. 診断キットであって、以下：
    （ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
    （ｂ）請求項５に記載の融合タンパク質；
    （ｃ）少なくとも一つの、請求項１０に記載の抗体または抗原の結合した該抗体のフラグメント；および
    （ｄ）検出試薬
    からなる群から選択される構成要素を備える、診断キット。
  22. 前記ポリペプチドが固体支持体上に固定される、請求項２１に記載のキット。
  23. 前記検出試薬が結合試薬に結合したレポーター群を含有する、請求項２１に記載のキット。
  24. 前記結合物質が、抗免疫グロブリン、Ｇタンパク質、Ａタンパク質およびレクチンからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
  25. 前記レポーター群が、放射性同位元素、蛍光基、発光基、酵素、ビオチンおよび色素粒子からなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
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