JP2007175017A - Ｓｎｐ判別方法、並びにｓｎｐ判別用ｄｎａチップ - Google Patents
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Abstract
【課題】ＳＮＰの塩基種を判別する場合における検出精度を高めること。
【解決手段】特定の遺伝子におけるＳＮＰの塩基種を判別するＳＮＰ判別方法を提供する。この方法は、特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、ＳＮＰの塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブと、同じくその遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有する試料中の標的核酸とを、それぞれハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素などを用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸の非相補的な塩基対部位を切断するミスマッチ部位切断工程、ミスマッチ部位切断工程において切断された核酸のみを一本鎖に変性させる核酸変性工程、核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する塩基種検出工程、などを含む。この方法は、ＤＮＡチップなどに応用できる。
【選択図】図９
【解決手段】特定の遺伝子におけるＳＮＰの塩基種を判別するＳＮＰ判別方法を提供する。この方法は、特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、ＳＮＰの塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブと、同じくその遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有する試料中の標的核酸とを、それぞれハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素などを用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸の非相補的な塩基対部位を切断するミスマッチ部位切断工程、ミスマッチ部位切断工程において切断された核酸のみを一本鎖に変性させる核酸変性工程、核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する塩基種検出工程、などを含む。この方法は、ＤＮＡチップなどに応用できる。
【選択図】図９
Description
本発明は、特定の遺伝子におけるＳＮＰ（一塩基多型）の塩基種を判別するＳＮＰ判別方法、ＳＮＰ判別用ＤＮＡチップなどに関する。
より詳細には、ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブと標的核酸とをそれぞれハイブリダイゼーションさせる工程、非相補的な塩基対部位を切断する工程、非相補的な塩基対部位が切断された二本鎖核酸のみを一本鎖に変性させる工程などを含むＳＮＰ判別方法、及び、特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブを、それぞれ、別個の反応領域に保持又は固定したＳＮＰ判別用ＤＮＡチップ、などに関する。
ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；一塩基多型）とは、遺伝子の塩基配列が１ヶ所のみ異なる状態及びその部位をいう。ＳＮＰは、ヒトのＤＮＡ構成塩基３０億個のうち、数百塩基に１ヶ所の割合で存在すると推測されており、また、ＳＮＰの塩基種の違いが、個々の体質などを決定していると推測されている。
ＳＮＰの機能解析を行うことにより、特定の疾患に対する罹りやすさや医薬品への反応性などを予測できる可能性がある。そのため、ＳＮＰ解析は、いわゆるテーラーメード医療への応用が期待されている。
ＳＮＰの塩基種を判別する手段として、例えば、ＡＰＥＸ法が提案されている。ＡＰＥＸ（ａｒｒａｙｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法は、ＳＮＰ部位の一つ手前までの配列を有する検出用プローブと標的核酸とをハイブリダイゼーションさせた後、４色の蛍光物質で修飾したデオキシヌクレオチド存在下で、ＤＮＡポリメラーゼで検出用プローブを一塩基だけ伸長させることにより、検出用プローブの先端（ＳＮＰ部位）に蛍光修飾したデオキシヌクレオチドを取り込ませる方法である。検出用プローブに取り込まれたデオキシヌクレオチドを蛍光励起させることにより、ＳＮＰの塩基種を判別することができる。
なお、ＳＮＰ検出に関する先行文献として、例えば、以下の文献が開示されている。特許文献１には、電気化学的方法によりミスマッチ対の有無を検出する方法が、特許文献２には、ピン電極を用いたＳＮＰなどの検出方法が、それぞれ、記載されている。
特開２００４−３５７５７０号公報
特開２００１−２４２１３５号公報
例えば、ＤＮＡチップなどを用いてＳＮＰの塩基種を判別する場合、ハイスループットな解析が可能であるが、検出精度を高めることが難しいという課題があった。そこで、本発明は、ＳＮＰの塩基種を判別する場合における検出精度を高めることができ、かつ、ＤＮＡチップなどにも応用できる新規手段を提供することを主な目的とする。
本発明では、特定の遺伝子におけるＳＮＰ（一塩基多型、以下同じ）の塩基種を判別するＳＮＰ判別方法であって、
（１）その遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、ＳＮＰの塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブと、同じくその遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有する試料中の標的核酸とを、それぞれハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、（２）一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素などを用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸のうち、非相補的な塩基対部位を切断するミスマッチ部位切断工程と、（３）非相補的な塩基対部位が切断された二本鎖核酸のみを一本鎖に変性させる核酸変性工程と、（４）前記核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する塩基種検出工程と、を少なくとも含むＳＮＰ判別方法を提供する。
（１）その遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、ＳＮＰの塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブと、同じくその遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有する試料中の標的核酸とを、それぞれハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、（２）一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素などを用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸のうち、非相補的な塩基対部位を切断するミスマッチ部位切断工程と、（３）非相補的な塩基対部位が切断された二本鎖核酸のみを一本鎖に変性させる核酸変性工程と、（４）前記核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する塩基種検出工程と、を少なくとも含むＳＮＰ判別方法を提供する。
まず、特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、ＳＮＰの塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブを準備する。そして、４つの検出用プローブと標的核酸とをそれぞれハイブリダイゼーションさせ、二本鎖核酸を形成させる。その際、１つの検出用プローブでは、ＳＮＰ部位の塩基対が相補的になり、残りの３つの検出用プローブでは、ＳＮＰ部位の塩基対が非相補的（ミスマッチ）になる。
次に、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素などを用いて、二本鎖核酸のうち、非相補的な塩基対部位（ミスマッチ部位）を切断する。これにより、ＳＮＰ部位の塩基対が非相補的な３つの検出用プローブでは、二本鎖核酸がＳＮＰ部位で切断される。一方、ＳＮＰ部位の塩基対が相補的な１つの検出用プローブでは、ＳＮＰ部位が切断されずに保持される。
次に、例えば、ミスマッチ部位切断工程において切断されない二本鎖核酸（フルマッチ核酸）と、ミスマッチ部位切断工程において非相補的な塩基対部位が切断される二本鎖核酸（ミスマッチ核酸）とのＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｒａｔｕｒｅ）の差を利用して、切断された二本鎖核酸のみを一本鎖に変性させる。そして、ミスマッチ核酸を一本鎖に変性させた後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを、二本鎖核酸と特異的に結合する物質（インターカレーターなど）を用いて検出する。
検出用プローブのＳＮＰ部位がハイブリダイゼーションの際にミスマッチであった場合、その検出用プローブは核酸変性工程において一本鎖に変性するため、二本鎖核酸と特異的に結合する物質（インターカレーターなど）は結合しない。一方、検出用プローブにおけるＳＮＰ部位が相補的である場合（フルマッチの場合）、核酸変性工程の後も二本鎖の状態が保持される。従って、二本鎖核酸と特異的に結合する物質（インターカレーターなど）が結合する。
以上の通り、この方法により、４つの検出用プローブの中から、ハイブリダイゼーションの際にＳＮＰ部位が相補的であった検出用プローブを検出できる。従って、生物試料中の特定の遺伝子に係るＳＮＰの塩基種を判別できる。
なお、本発明に係る方法は、ＳＮＰ部位におけるハイブリダイゼーションにより、ＳＮＰの塩基種を判別するのではなく、ミスマッチ部位を特異的に認識する酵素によりＳＮＰ部位を判別するため、検出精度を高くできるという利点がある。即ち、塩基対が相補的な場合と非相補的な場合との核酸同士の結合力の差（水素結合による結合力の差）よりも、酵素における反応特異性のほうが高いため、検出精度を高くできる。
本発明に係るＳＮＰ判別方法は、例えば、遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、前記ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブを予め基板表面に保持又は固定したＤＮＡチップなどを用いて行うことができる。
本発明により、ＳＮＰの塩基種を判別することができ、また、検出精度を高くできる。その他、例えば、本発明をＤＮＡチップなどに応用することにより、ハイスループットな解析が可能となる。
＜本発明に係るＳＮＰ判別用ＤＮＡチップについて＞
はじめに、本発明を応用可能なＤＮＡチップの例について、以下、説明する。なお、本発明は、ＤＮＡチップを用いて行う場合に限定されない。
はじめに、本発明を応用可能なＤＮＡチップの例について、以下、説明する。なお、本発明は、ＤＮＡチップを用いて行う場合に限定されない。
本発明に係るＳＮＰ判別用ＤＮＡチップは、ハイブリダイゼーションの場となる反応領域が基板表面に複数形成されたＤＮＡチップであって、特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、前記ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブを、それぞれ、別個の反応領域に保持又は固定したものであればよい。
ＳＮＰ情報は、公開データベースなどから取得する。そして、取得した情報に基づき、検出用プローブの設計を行う。
検出用プローブには、ＳＮＰを有する遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を用いる。そして、ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）になっている４種類の検出用プローブを合成し、用いる。各検出用プローブは、別個の反応領域に保持又は固定する。
検出用プローブにおけるＳＮＰ部位は、固定端の反対側の端から２０〜３５％の位置が好ましい。即ち、例えば、３０ｍｅｒの検出用プローブの場合、固定端の反対側の端から７〜８番目の位置である。ＳＮＰ部位が固定端に近すぎる場合、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素が、ＳＮＰ部位におけるミスマッチを認識できなくなる場合がある。
検出用プローブには、その配列の一部に、メチル化などの人工修飾を加えてもよい。配列の一部を人工修飾することにより、その検出用プローブのＴｍを調整することができる。例えば、複数の検出用プローブのうち、Ｔｍが最も高いものとＴｍが揃うように、その他の各検出用プローブに人工修飾を加えることにより、全ての検出用プローブにおけるＴｍのばらつきを少なくできる。これにより、ＤＮＡチップのハイスループットな取り扱いが容易になり、また、検出精度を高めることができる。
検出用プローブの固定端側でもハイブリダイゼーションするように、検出用プローブが、所定の長さのリンカー（連結配列）を介して基板表面などに固定されるように、予め、プローブ設計を行ってもよい。これにより、検出用プローブが基板表面からある程度離れた位置に固定されるため、基板表面による立体障害を防止でき、より確実にハイブリダイゼーションさせることができる。従って、検出時のノイズを軽減でき、検出精度を高めることができる。
プローブ核酸の固定手段については、特に限定されない。例えば、基板表面をストレプトアビジンなどでコーティングし、検出用プローブの末端（固定端）をビオチン化し、アビジン−ビオチン結合により、プローブ核酸を固定してもよい。また、基板表面をチオール（ＳＨ）基で表面処理し、検出用プローブの末端（固定端）にチオール基を付加し、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により、プローブ核酸を固定してもよい。
＜本発明に係るＳＮＰ判別方法について＞
続いて、本発明に係るＳＮＰ判別方法の例について、以下説明する。
続いて、本発明に係るＳＮＰ判別方法の例について、以下説明する。
本発明に係るＳＮＰ判別方法は、特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、前記ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブを、それぞれ、別個の反応領域に保持又は固定したものを用いて行う。例えば、上述のＳＮＰ判別用ＤＮＡチップを用いることができる。但し、本発明に係るＳＮＰ判別方法は、ＤＮＡチップを用いた場合に狭く限定されない。
上述の通り、本発明に係るＳＮＰ判別方法は、（１）特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、ＳＮＰの塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブと、同じくその遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有する試料中の標的核酸とを、それぞれハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程、（２）一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素などを用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸のうち、非相補的な塩基対部位を切断するミスマッチ部位切断工程、（３）非相補的な塩基対部位が切断された二本鎖核酸のみを一本鎖に変性させる核酸変性工程、（４）前記核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する塩基種検出工程、などを含む。
（１）標的核酸調製手順及びハイブリダイゼーション工程について：
この工程では、標的核酸の調製を行った後、標的核酸を反応領域に滴下又は供給し、検出用プローブと標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる。
この工程では、標的核酸の調製を行った後、標的核酸を反応領域に滴下又は供給し、検出用プローブと標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる。
標的核酸は、特に限定されないが、例えば、人体などから採取した生物試料を用いる。標的核酸の調製は、例えば、試料から核酸を抽出・分離などした後、制限酵素で短く切断したり、ＰＣＲなどにより検出用核酸とハイブリダイゼーションする配列を増幅したり、などして行う。ＰＣＲなどで増幅する場合、プライマーは、検出用プローブ配列のすぐ上流及び／又は下流の配列に基づいて設計する。
また、標的核酸には、その配列の一部にメチル化などの人工修飾を加えてもよい。即ち、標的核酸の配列の一部を人工修飾することにより、その標的核酸のＴｍを調整することができる。
検出用プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの場となる反応領域には、例えば、リン酸緩衝液、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液などのグット緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液を入れる。緩衝液の塩（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２など）の濃度を調整することにより、核酸などの基板表面などへの非特異的吸着を防止できる。また、緩衝液として、塩を含むＨＥＰＥＳ緩衝液などを用いた場合も、核酸などの基板表面などへの非特異的吸着を防止できる。
そして、緩衝液を入れた反応領域内に標的核酸を滴下又は供給し、検出用プローブと標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる。
反応領域内の温度は、ハイブリダイゼーション後、検出用プローブのうち最もＴｍ値の低いものが一本鎖核酸に変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）しない温度にする。
（２）ミスマッチ部位切断工程について：
この工程では、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素などを用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸のうち、非相補的な塩基対部位（ミスマッチ部位）を切断する。
この工程では、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素などを用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸のうち、非相補的な塩基対部位（ミスマッチ部位）を切断する。
一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素としては、二本鎖核酸の非相補的な塩基対部位のリン酸バックボーンを特異的に切断する酵素であれば特に限定されないが、例えば、「Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ」を用いることができる。
反応領域内の温度は、例えば、用いる酵素の至適温度の範囲内にし、また、最もＴｍの低い検出用プローブにおいても、ハイブリダイゼーション後の二本鎖状態を保持できる温度にする。
（３）核酸変性工程について：
この工程では、ミスマッチ部位切断工程において切断された核酸のみを、温度処理などにより一本鎖に変性させる。
この工程では、ミスマッチ部位切断工程において切断された核酸のみを、温度処理などにより一本鎖に変性させる。
Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、主に、ＧＣ含量とヌクレオチドの長さに依存する。従って、ミスマッチ部位切断工程においてミスマッチ部位を切断することにより、一部が切断された二本鎖核酸と、切断されなかった二本鎖核酸の間には、Ｔｍ値に差が生じる。
そこで、例えば、それぞれの反応領域内の温度を、ＳＮＰ部位の塩基対が相補的にな検出用プローブのＴｍよりも少し低い温度に設定することにより、その検出用プローブでは二本鎖状態を保持させることができ、かつ、他の３つの検出プローブでは一本鎖核酸に変性（解離）させることができる。即ち、ＳＮＰ部位の塩基対が相補的な１つの検出用プローブのみ、二本鎖状態を保持させることができる。
（４）塩基種検出工程について：
この工程では、核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する。
この工程では、核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する。
二本鎖の状態を保持している検出用プローブは、例えば、二本鎖核酸と特異的に結合するインターカレーターを用いることにより、高精度に検出できる。また、例えば、標的核酸に蛍光標識などを付して、二本鎖の状態を保持している核酸を検出してもよい。
以上の工程を行うことにより、特定の遺伝子におけるＳＮＰの塩基種を判別できる。なお、本発明は、上述の事項のみに狭く限定されない。
実施例１では、「Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ」を用いて二本鎖核酸の非相補的な塩基対部位を切断した場合、全ての一塩基ミスマッチにおいて部位特異的切断が起きるかどうか、及び、その酵素による切断後に二本鎖核酸が一本鎖に変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）するかどうかなどについて、検証した。
まず、検出用プローブ及び標的核酸として、それぞれ、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを準備した。検出用プローブでは、その一端をビオチン修飾した。各オリゴヌクレオチドは、エスペックオリゴサービス株式会社が受託合成した。
全ての塩基対が相補的（フルマッチ）な場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に、ＡＧミスマッチの場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に、ＴＴミスマッチの場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号５及び配列番号６に、ＴＧミスマッチの場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号７及び配列番号８に、ＴＣミスマッチの場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号９及び配列番号１０に、ＧＧミスマッチの場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２に、ＣＣミスマッチの場合のにおける検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号１３及び配列番号１４に、ＡＡミスマッチの場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６に、ＡＣミスマッチの場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号１７及び配列番号１８に、それぞれ示す。また、別途合成したＧＴミスマッチの場合における検出用プローブ及び標的核酸の配列をそれぞれ配列番号１９及び配列番号２０に示す。
次に、Ａｕ表面上をアビジンで被覆した水晶振動子を用意した。アビジンは、和光純薬工業株式会社製（製品名「アビジン」）のものを用いた（以下同じ）。Ａｕ表面上へのアビジンの被覆は、本実験に用いた生体分子間相互作用定量ＱＣＭ装置「ＡＦＦＩＮＩＸ Ｑ」（型式「ＱＣＭ２０００」、水晶発振方式、発振周波数２７ｍＨｚ、株式会社イニシアム製、以下「ＱＣＭ装置」とする）のプロトコルに記載された方法に従って行った。
次に、１０ｎＭの検出用プローブ標的核酸溶液に水晶振動子を入れ、アビジン−ビオチン結合により、水晶振動子に検出用プローブを固定化した。
次に、ＱＣＭ装置の反応槽を２５℃（図９及び図１０に係る実験では３７℃）に設定し、水晶振動子をＱＣＭ装置の反応槽に浸した後、反応槽に１０ｎＭの標的核酸を添加した。そして、水晶振動子の振動数の変化（ΔＦ、単位Ｈｚ、以下同じ）を測定することにより、水晶振動子に固定化した検出用プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション量を測定した。
次に、ＱＣＭ装置の反応槽に、「Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ（ミスマッチ部位を認識する酵素、ＴＲＥＶＩＧＥＮ社製）」を３Ｕ（ユニット）添加した。そして、水晶振動子の振動数の変化を測定することにより、水晶振動子に固定化した検出用プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション量（酵素処理後も保持されたハイブリダイゼーション量）を測定した。
次に、ＱＣＭ装置の反応槽に、ＲｅｃＡ（一本鎖ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質）を５μｇ添加した。そして、水晶振動子の振動数の変化を測定することにより、一本鎖核酸の量（酵素処理後、変性した一本鎖核酸の量）を測定した。
結果を図１から図１０に示す。なお、図１から図１０において、図中に記載された各グラフの横軸は、時間（分）を、縦軸は、水晶振動子の振動数の変化（ΔＦ（Ｈｚ））を、それぞれ示す。
図１は全ての塩基対が相補的な核酸（フルマッチ）を用いた場合の結果を、図２はＡＧミスマッチを用いた場合の結果を、図３はＴＴミスマッチを用いた場合の結果を、図４はＴＧミスマッチを用いた場合の結果を、図５はＴＣミスマッチを用いた場合の結果を、図６はＧＧミスマッチを用いた場合の結果を、図７はＣＣミスマッチを用いた場合の結果を、それぞれ示す。
図１から図７において、各（Ａ）のグラフは、反応槽に標的核酸を添加した場合における水晶振動子の振動数の変化を表す。
これらの各グラフでは、標的核酸の添加により、水晶振動子の振動数が、経時的に減少した。この結果は、水晶振動子に固定化した検出用プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションして重量が増加したことを示す。
図１から図７において、各（Ｂ）のグラフは、前記手順の後に、反応槽にＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖを添加した場合における水晶振動子の振動数の変化を表す。
図１（Ｂ）のグラフでは、酵素を添加した後も、水晶振動子の振動数はほとんど変化しなかったのに対し、図２から図７の各（Ｂ）のグラフでは、酵素処理後、水晶振動子の振動数が、経時的に増加した。この結果は、ミスマッチ部位が存在する二本鎖核酸を酵素処理した場合、二本鎖核酸の量が減少することを示し、経時的に一本鎖に変性することを示唆する。
図１から図７において、各（Ｃ）のグラフは、前記手順の後に、反応槽にＲｅｃＡを添加した場合における水晶振動子の振動数の変化を表す。
図１（Ｃ）では、ＲｅｃＡを添加した後も、水晶振動子の振動数はほとんど変化しなかったのに対し、図２から図７の各（Ｃ）のグラフでは、ＲｅｃＡを添加することにより、水晶振動子の振動数が経時的に減少した。この結果は、水晶振動子に存在する一本鎖核酸にＲｅｃＡが結合し、その重量が増加したことを示す。従って、この結果は、ミスマッチ部位が存在する二本鎖核酸を酵素処理した場合、ミスマッチ核酸は経時的に一本鎖に変性したことを示す。
以上、これらの結果は、ミスマッチの二本鎖核酸の場合、ミスマッチ部位を認識する酵素を用いてミスマッチ部位を切断することにより、全ての一塩基ミスマッチにおいて部位特異的切断が起き、かつ、その酵素による切断後に二本鎖核酸が一本鎖に変性（解離）することを強く示唆する。
従って、これらの結果は、例えば、ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブを用いて、前記酵素処理などの各処理を行うことにより、ＳＮＰ部位が相補的な検出用プローブのみを検出できることを示唆する。
図８はＡＡミスマッチを用いた場合の結果を、図９はＡＣミスマッチを用いた場合の結果を、図１０はＧＴミスマッチを用いた場合の結果を、それぞれ示す。
図８は反応槽の温度を２５℃に設定した場合の結果であり、図９及び図１０は３７℃に設定した場合の結果である。また、図８及び図９は、ミスマッチ部位を上（固定端の反対側の端）から７番目にした場合の結果であり、図１７は、ミスマッチ部位を下（固定端）から７番目にした場合の結果である。
図８では、検出用プローブ（Ｐｒｏｂｅ）１０ｎＭ及び標的核酸（Ｔａｒｇｅｔ）１０ｎＭを添加することにより、水晶振動子の振動数が３６０Ｈｚ減少し、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖを添加することにより、水晶振動子の振動数が１７．０Ｈｚさらに減少した後、約３０分後に振動数が増加し始め、１５０分経過後には、約２９．０Ｈｚ増加した。
図９では、検出用プローブ（Ｐｒｏｂｅ）１０ｎＭを添加することにより、水晶振動子の振動数が１００Ｈｚ減少し、標的核酸（Ｔａｒｇｅｔ）１０ｎＭを添加することにより、水晶振動子の振動数がさらに１４５Ｈｚ減少し、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖを添加することにより、水晶振動子の振動数が２０Ｈｚさらに減少した後、約６分後に振動数が増加し始め、１５０分経過後には、約１５１Ｈｚ増加した。
図１０では、検出用プローブ（Ｐｒｏｂｅ）１０ｎＭ及び標的核酸（Ｔａｒｇｅｔ）１０ｎＭを添加することにより、水晶振動子の振動数が４０３Ｈｚ減少し、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖを添加することにより、水晶振動子の振動数が４６Ｈｚさらに減少したが、その後、振動数は、ほとんど変化しなかった。
図８と図９を比較すると、図８では、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖを添加した後、振動数が増加し始めるまでに、約３０分間経過しているのに対し、図９では、約６分間で振動数が増加し始めた。この結果は、酵素処理によりミスマッチ部位を切断した二本鎖核酸に、温度処理を施すことにより、より短時間で一本鎖に変性させることができることを示す。
図９と図１０を比較すると、図９では、時間経過とともに、一本鎖に変性する核酸量が増加したのに対し、図１０では、ほとんど一本鎖に変性しなかった。この結果は、ＳＮＰ部位が固定端に近すぎる場合、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素が、ＳＮＰ部位におけるミスマッチを認識できなくなることを示唆し、また、検出用プローブにおけるＳＮＰ部位は、固定端の反対側の端から２０〜３５％の位置が好ましいことを示唆する。
実施例２では、検出用プローブの一部を化学修飾することにより、Ｔｍを調整できるか、調べた。
まず、検出用プローブ及び標的プローブを準備した。検出用プローブの配列を配列番号２１に、標的プローブの配列を配列番号２２に、それぞれ示す。次に、検出用プローブの５’末端から６番目、１４番目、１５番目のシトシンをメチル化した。次に、配列の一部をメチル化した場合としなかった場合における、Ｔｍを調べた。
結果を表１に示す。
表１に示す通り、メチル化した場合、メチル化しなかった場合と比較して、Ｔｍが上昇した。
この結果は、検出用プローブの一部を化学修飾することにより、Ｔｍを調整できることを示唆する。
本発明により、種々の遺伝子のＳＮＰの塩基種を高精度に判別できる。加えて、本発明はＤＮＡチップなどにも応用できるため、ＳＮＰの網羅的かつ高精度な判別が可能になる。従って、本発明により、例えば、個々の体質を判定したり、特定の疾患に対する罹りやすさや医薬品への反応性などを予測したりできる可能性がある。即ち、いわゆるテーラーメード医療へ応用できる可能性がある。
Claims (9)
- 特定の遺伝子におけるＳＮＰ（一塩基多型、以下同じ）の塩基種を判別するＳＮＰ判別方法であって、
前記遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、前記ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブと、同じく前記遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有する試料中の標的核酸とを、それぞれハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、
前記ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸のうち、非相補的な塩基対部位を切断するミスマッチ部位切断工程と、
非相補的な塩基対部位が切断された二本鎖核酸のみを一本鎖に変性させる核酸変性工程と、
前記核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する塩基種検出工程と、
を少なくとも含むＳＮＰ判別方法。 - 前記ミスマッチ部位切断工程では、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素を用いて前記非相補的な塩基対部位を切断することを特徴とする請求項１記載のＳＮＰ判別方法。
- 前記酵素は、ミスマッチ部位のリン酸バックボーンを特異的に切断する酵素であることを特徴とする請求項２記載のＳＮＰ判別方法。
- 前記核酸変性工程では、前記ミスマッチ部位切断工程において切断されない二本鎖核酸と、前記ミスマッチ部位切断工程において非相補的な塩基対部位が切断される二本鎖核酸とのＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｒａｔｕｒｅ、以下同じ）の差を利用して、非相補的な塩基対部位が切断された二本鎖核酸のみを一本鎖に変性させることを特徴とする請求項１記載のＳＮＰ判別方法。
- 前記塩基種検出工程では、二本鎖核酸と特異的に結合するインターカレーターを用いることを特徴とする請求項１記載のＳＮＰ判別方法。
- 前記検出用プローブのＴｍを調整する目的で、前記検出用プローブの配列の一部が人工修飾されていることを特徴とする請求項１記載のＳＮＰ判別方法。
- 前記標的核酸の配列の一部を人工修飾することにより、その標的核酸のＴｍを調整する手順を含むことを特徴とする請求項１記載のＳＮＰ判別方法。
- ハイブリダイゼーションの場となる反応領域が基板表面に複数形成されたＤＮＡチップであって、
特定の遺伝子のＳＮＰ近傍の配列を少なくとも有し、かつ、前記ＳＮＰ部位の塩基種がそれぞれ異なる４種類の検出用プローブを、それぞれ、別個の反応領域に保持又は固定したＳＮＰ判別用ＤＮＡチップ。 - 前記検出用プローブのＴｍを調整する目的で、前記検出用プローブの配列の一部が人工修飾されていることを特徴とする請求項８記載のＳＮＰ判別用ＤＮＡチップ。
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