JP2007332106A - Sustained release pharmaceutical composition for bone formation - Google Patents
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Abstract
【課題】各種ゼラチンハイドロゲルの中からヘパリン結合能の亢進した改変型ＢＭＰとの組み合わせに最も適したキャリアを選択し、改変型ＢＭＰおよび最適のゼラチンハイドロゲルを含む骨形成用徐放性医薬組成物を提供する
【解決手段】大腸菌を宿主として生産され、ヘパリン結合能の亢進した改変型ＢＭＰと、塩基性ゼラチンハイドロゲルとを含む構成の骨形成用徐放性医薬組成物とする。当該骨形成用徐放性医薬組成物は低コストで製造できるとともに、低用量の投与でも十分な骨形成効果を発揮できる。
【選択図】なし[PROBLEMS] To select a carrier most suitable for combination with modified BMP with enhanced heparin-binding ability from various gelatin hydrogels, and to provide a sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis comprising the modified BMP and the optimal gelatin hydrogel. [MEANS FOR SOLVING PROBLEMS] A sustained-release pharmaceutical composition for osteogenesis comprising a modified BMP produced using Escherichia coli as a host and having enhanced heparin-binding ability and a basic gelatin hydrogel. The sustained-release pharmaceutical composition for osteogenesis can be produced at a low cost and can exhibit a sufficient osteogenic effect even when administered at a low dose.
[Selection figure] None
Description
本発明は、骨形成用徐放性医薬組成物に関するものであり、特にヘパリン結合能の亢進した改変型ＢＭＰおよび塩基性ゼラチンハイドロゲルを含む骨形成用徐放性医薬組成物に関するものである。 The present invention relates to a sustained-release pharmaceutical composition for osteogenesis, and particularly to a sustained-release pharmaceutical composition for osteogenesis comprising a modified BMP with enhanced heparin binding ability and a basic gelatin hydrogel.
骨の再建、再生は、高齢化が進んだ現代において重要な解決課題として認識されている。現在、その解決策として、メンブレンと自家骨移植を併用したＧＢＲ（guided bone regeneration）法や、自己多血小板血漿（ＰＲＰ: platelet rich plasma）療法が試みられているが、それらの効果は限定的で未だに十分な解決策が提供されていない。 Bone reconstruction and regeneration are recognized as an important solution in today's aging society. Currently, as a solution, GBR (guided bone regeneration) method using membrane and autologous bone transplantation and autologous platelet rich plasma (PRP) therapy have been tried, but their effects are limited. There is still not enough solution available.
近年、強力な骨誘導能を有する骨形成因子（bone morphogenetic protein ;ＢＭＰ）が、その骨再生能力の高さから注目されている。ＢＭＰは異所性の骨形成を誘導する因子として１９６５年に発見されたが、完全な精製タンパク質として単離されず、具体的な構造は未解明のままであった。しかし、１９８８年にＷｏｚｎｅｙらによってヒトＢＭＰをコードする遺伝子がクローニングされたことによりその構造が明らかとなり、組み換えタンパク質としての製造が可能となっている（非特許文献１を参照）。また、その後の研究により、ＢＭＰはＴＧＦβファミリーに属する成長因子の一群でＢＭＰサブファミリーとして分類され、ＢＭＰサブファミリーに分類される多数のタンパク質が報告されている。 In recent years, bone morphogenetic protein (BMP) having a strong osteoinductive ability has attracted attention because of its high bone regeneration ability. BMP was discovered in 1965 as a factor that induces ectopic bone formation, but was not isolated as a fully purified protein and the specific structure remained unclear. However, since the gene encoding human BMP was cloned by Wozney et al. In 1988, its structure was clarified and it was possible to produce it as a recombinant protein (see Non-Patent Document 1). Subsequent studies have reported that BMP is classified as a BMP subfamily in a group of growth factors belonging to the TGFβ family, and many proteins are classified into the BMP subfamily.
ＢＭＰのうちいくつかは、２量体として活性をもつ。したがって、組み換えＢＭＰを生産するための宿主細胞としては、高次構造が取りにくいとされている大腸菌ではなく、哺乳動物細胞や昆虫細胞などの真核生物の細胞を利用することが適切である。しかしながら、哺乳動物細胞を宿主とし、さらに複雑な精製システムを用いて活性な２量体構造の組み換えＢＭＰを生産する方法は、コストが高くなるという問題がある。 Some of the BMPs are active as dimers. Therefore, as a host cell for producing recombinant BMP, it is appropriate to use eukaryotic cells such as mammalian cells and insect cells, instead of E. coli, which is considered to be difficult to obtain higher-order structures. However, a method for producing an active dimeric recombinant BMP using a mammalian cell as a host and using a more complicated purification system has a problem of high cost.
組み換えＢＭＰの効果は種々の動物実験で検討され、米国では臨床試験も実施された。その結果、組み換え型ＢＭＰは種々の骨欠損モデル動物に対して骨形成を促進し、骨欠損を修復できることが報告されている。しかしながら、霊長類などの大型の実験動物に対して十分な骨修復効果を発揮させるためには、大量のＢＭＰを投与しなければならず、ヒト臨床試験においてもミリグラム単位という大量のＢＭＰ−２が使用されている。このような大量投与は、コスト的な問題のみならず、副作用等の安全性面でも問題が生じる可能性がある。 The effects of recombinant BMP have been studied in various animal experiments and clinical trials have been conducted in the United States. As a result, it has been reported that recombinant BMP can promote bone formation and repair bone defects in various bone defect model animals. However, in order to exert a sufficient bone repairing effect on large laboratory animals such as primates, a large amount of BMP must be administered. in use. Such a large-scale administration may cause not only cost problems but also safety problems such as side effects.
ＢＭＰの生体内における作用は、当初骨形成の促進因子としての機能だけが注目されていたが、その後の研究により、発生現象に深く関わっていることが明らかにされてきている。具体的には、ＢＭＰは発生過程において四肢の形成や種々の臓器の器官形成過程に関与していることが明らかにされている。したがって、骨再生に有効な大量のＢＭＰを投与すれば、重篤な副作用が生じる可能性を否定できない。 The action of BMP in vivo was initially focused only on its function as a factor for promoting bone formation, but subsequent studies have revealed that it is deeply related to developmental phenomena. Specifically, it has been clarified that BMP is involved in limb formation and organ formation processes of various organs during development. Therefore, if a large amount of BMP effective for bone regeneration is administered, the possibility of serious side effects cannot be denied.
上記のような問題を解決するために、種々の検討がなされてきた。まず、生体内において安定かつ有効濃度を維持するための、優れた徐放特性を有し、より少ない量のＢＭＰ投与量で骨形成を誘導しうる担体が検討されている。このような担体としては、従来、天然高分子（コラーゲン、不溶性骨基質（ＩＢＭ：Insoluble bone matrix）、ヒアルロン酸など）、合成高分子（ポリ乳酸、Ｌ−乳酸−パラジオキサノンランダム共重合体とポリエチレングリコールからなる、ＡＢタイプのブロック共重合体など）、無機材料（ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウムなど）等が研究されてきた。なかでも、コラーゲンスポンジとＩＢＭとが優れた担体として、米国での臨床試験に使用されている。 Various studies have been made to solve the above problems. First, a carrier that has excellent sustained release characteristics for maintaining a stable and effective concentration in vivo and that can induce bone formation with a smaller dose of BMP has been studied. Conventionally, as such carriers, natural polymers (collagen, insoluble bone matrix (IBM), hyaluronic acid, etc.), synthetic polymers (polylactic acid, L-lactic acid-paradioxanone random copolymer and AB type block copolymers made of polyethylene glycol, etc.), inorganic materials (hydroxyapatite, β-tricalcium phosphate, etc.) have been studied. Among these, collagen sponge and IBM are used as excellent carriers in clinical trials in the United States.
さらに、上記コラーゲンスポンジやＩＢＭより優れた担体として、ゼラチンハイドロゲルが開発されている（特許文献１および非特許文献２参照）。 Furthermore, gelatin hydrogel has been developed as a carrier superior to the collagen sponge and IBM (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
また、ＢＭＰのアミノ酸配列を改変することで、ヘパリン結合活性を増強させ、野生型ＢＭＰより好ましい体内動態を示す改変型ＢＭＰが報告されている（特許文献２参照）。この改変型ＢＭＰは、ＢＭＰのＮ末端に存在するヘパリン結合ドメインの数を増加させるようにアミノ酸が挿入されたものであり、実際に、改良型ＢＭＰは野生型ＢＭＰと比較してヘパリン結合能が高いことが報告されている（特許文献２、非特許文献３参照）。また、ラット頭蓋骨欠損モデルにおいて改良型ＢＭＰは野生型ＢＭＰより骨再生能が優れていることが報告されている（非特許文献４参照）。
In addition, a modified BMP that enhances heparin-binding activity by modifying the amino acid sequence of BMP and exhibits a more preferable pharmacokinetics than wild-type BMP has been reported (see Patent Document 2). In this modified BMP, amino acids are inserted so as to increase the number of heparin-binding domains present at the N-terminus of BMP. In fact, improved BMP has heparin-binding ability compared to wild-type BMP. It is reported to be high (see
さらに、上記改変型ＢＭＰは、大腸菌を宿主細胞として生産することが可能である。
特許文献１にはＢＭＰおよびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤、および当該徐放製剤からなる骨形成の誘導を促進するための医薬組成物が開示されている。しかしながら、特許文献１に開示されているＢＭＰは、何ら機能が改変されていない野生型の組み換えＢＭＰである。 Patent Document 1 discloses a sustained-release preparation containing BMP and gelatin hydrogel, and a pharmaceutical composition for promoting the induction of bone formation comprising the sustained-release preparation. However, BMP disclosed in Patent Document 1 is a wild-type recombinant BMP in which no function is altered.
一方、本願発明に用いられるＢＭＰは、ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列が挿入されてヘパリン結合能が亢進した改変型ＢＭＰである。すなわち、改変型ＢＭＰは野生型ＢＭＰと比較して、そのヘパリン結合活性が大幅に異なるため、キャリアとの結合様式がまったく異なることが予想される。また、本願発明に用いられるＢＭＰは大腸菌を宿主として生産された組み換えタンパク質であるため、哺乳動物細胞を宿主として生産された組み換えＢＭＰと比較して、糖鎖の修飾が大きく異なることが予想される。 On the other hand, the BMP used in the present invention is a modified BMP in which the amino acid sequence of the heparin binding domain is inserted to enhance the heparin binding ability. That is, since the modified BMP has significantly different heparin binding activity than the wild-type BMP, it is expected that the binding mode with the carrier is completely different. In addition, since BMP used in the present invention is a recombinant protein produced using Escherichia coli as a host, it is expected that sugar chain modification is greatly different from recombinant BMP produced using mammalian cells as a host. .
そうすると、特許文献１に開示されている哺乳動物細胞で生産された野生型ＢＭＰとの組み合わせに好適なゼラチンハイドロゲルが、上記改変型ＢＭＰと組み合わせた場合にも適しているか否かについては容易に予測できるものではない。また、ゼラチンハイドロゲルは原料のゼラチンや製造方法を変更することにより、種々の物性を備えたハイドロゲルとすることが可能である。したがって、大腸菌を宿主として生産された改変型ＢＭＰとの組み合わせに最も適したゼラチンハイドロゲルを見出すことは、大量投与に伴う副作用やコストの問題から臨床適用が遅れているＢＭＰを用いる骨再生治療において、非常に意義のある成果を提供できると考えられる。さらに、信頼性の高い骨再生を目指すためには、再生現場における環境の差異（例えば、出血の多寡，骨欠損のタイプの差異）に大きく左右されない臨床効果が得られることが肝要である。このためにも、局所停滞性のよい改変型ＢＭＰをさらに組織吸収性徐放キャリアを用いて安定投与することは理にかなっている。 Then, it is easy to determine whether the gelatin hydrogel suitable for the combination with the wild type BMP produced in mammalian cells disclosed in Patent Document 1 is also suitable for the combination with the modified BMP. It is not predictable. The gelatin hydrogel can be made into a hydrogel having various physical properties by changing the raw material gelatin and the production method. Therefore, finding a gelatin hydrogel most suitable for combination with a modified BMP produced using Escherichia coli as a host is a bone regeneration treatment using BMP that has been delayed in clinical application due to side effects and cost problems associated with large-scale administration. It is thought that it can provide very meaningful results. Furthermore, in order to aim for highly reliable bone regeneration, it is important to obtain clinical effects that are not greatly influenced by environmental differences (for example, multiple hemorrhages and bone defect types) at the regeneration site. For this reason, it is reasonable to stably administer modified BMP with good local stagnation using a tissue-absorbing sustained-release carrier.
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、各種ゼラチンハイドロゲルの中から改変型ＢＭＰとの組み合わせに最も適したキャリアを選択し、改変型ＢＭＰおよび最適のゼラチンハイドロゲルを含む骨形成用徐放性医薬組成物を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-described problems. The object of the present invention is to select a carrier most suitable for combination with modified BMP from various gelatin hydrogels, and to modify the modified BMP and the optimum gelatin hydrogel. An object of the present invention is to provide a sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis comprising a gel.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、大腸菌を宿主として生産され、ヘパリン結合能の亢進した改変型ＢＭＰは、塩基性ゼラチンハイドロゲルをキャリアとして用いたときに、骨欠損モデル動物における骨形成効果が最も高いことを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have produced a modified BMP produced using Escherichia coli as a host and having enhanced heparin-binding ability when a basic gelatin hydrogel is used as a carrier. The present inventors have found that the osteogenesis effect in the deficient model animal is the highest and completed the present invention.
すなわち、本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物は、ヘパリン結合能の亢進した改変型ＢＭＰおよび塩基性ゼラチンハイドロゲルを含むことを特徴としている。 That is, the sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention is characterized in that it contains a modified BMP with enhanced heparin binding ability and a basic gelatin hydrogel.
上記改変型ＢＭＰは、野生型ＢＭＰのＮ末端領域にヘパリン結合ドメイン配列を含むペプチドが挿入されていることが好ましい。 The modified BMP preferably has a peptide containing a heparin-binding domain sequence inserted in the N-terminal region of the wild-type BMP.
また、上記野生型ＢＭＰはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＢＭＰ−８（ＯＰ−２）からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。 The wild type BMP is at least one selected from the group consisting of BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-1) and BMP-8 (OP-2). It is preferable that
上記ヘパリン結合ドメイン配列が、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の骨形成用徐放性医薬組成物。
（ａ）リジン−ヒスチジン−リジン；および
（ｂ）アルギニン−リジン−アルギニン
の少なくともいずれかであることが好ましい。
The sustained-release pharmaceutical composition for bone formation according to
Preferably, (a) lysine-histidine-lysine; and (b) arginine-lysine-arginine.
上記改変型ＢＭＰは大腸菌を宿主細胞として発現させた組換えタンパク質であることが好ましく、以下の（１）〜（４）から選択されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（４）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
The modified BMP is preferably a recombinant protein expressed using Escherichia coli as a host cell, and preferably comprises an amino acid sequence selected from the following (1) to (4).
(1) amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2) amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (3) shown in SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence (4) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
上記塩基性ゼラチンハイドロゲルは、等電点が７．０以上１３．０以下のゼラチンを原料として製造されることが好ましい。 The basic gelatin hydrogel is preferably produced from gelatin having an isoelectric point of 7.0 or more and 13.0 or less.
本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物は、ヘパリン結合能の亢進した改変型ＢＭＰおよびこれとの組み合わせにおいて最も高い骨形成効果をもたらす塩基性ゼラチンハイドロゲルを含むものである。したがって、低用量の投与でも十分な骨形成効果を発揮できるとともに、副作用の少ない骨形成用徐放性医薬組成物を提供できるという効果を奏する。 The sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention comprises a modified BMP with enhanced heparin binding ability and a basic gelatin hydrogel that provides the highest osteogenesis effect in combination with this. Therefore, it is possible to provide a sustained-release pharmaceutical composition for osteogenesis that can exhibit a sufficient osteogenesis effect even at a low dose and has few side effects.
さらに、本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物に含有される改変型ＢＭＰは、大腸菌を宿主細胞として生産されるので、哺乳動物細胞を宿主として生産される組み換えＢＭＰと比較して生産コストを低く抑えることができ、低価格の骨形成用徐放性医薬組成物を提供できるという効果を奏する。 Furthermore, since the modified BMP contained in the sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention is produced using Escherichia coli as a host cell, it is produced in comparison with a recombinant BMP produced using a mammalian cell as a host. Costs can be kept low, and the low-cost sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis can be provided.
〔改変型ＢＭＰ〕
本発明に使用されるヘパリン結合能の亢進した改変型ＢＭＰは、ヘパリン結合能が亢進するようにアミノ酸配列が改変されたＢＭＰであればよい。「ヘパリン結合能の亢進した」とは、アミノ酸配列が改変されていないＢＭＰ（野生型ＢＭＰ）と比較した場合に、より強くヘパリンと結合することができることを意味する。ヘパリン結合能が亢進しているか否かは、例えば、ヘパリンをコートした担体を用いた表面プラズモン共鳴分析によって測定できる（参考文献：Ruppert et al., Eur. J. Biochem. 237(1996), 252-261）
ヘパリン結合能が亢進するようにアミノ酸配列が改変される前のＢＭＰ、すなわち野生型ＢＭＰは、未分化の間葉系細胞に作用して、これを軟骨細胞や骨芽細胞へ分化させ、軟骨又は骨を形成させる活性を有するタンパク質であれば、特に限定されるものではなく、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２Ｂともいう）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２）、もしくはＢＭＰ−９、またはこれらの機能的等価改変体、すなわち天然に存在するＢＭＰのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然に存在するＢＭＰと同じ活性を有するタンパク質、を挙げることができる。なかでも、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＢＭＰ−８（ＯＰ−２）が好ましく、骨形成能が最も高いことが従来の基礎研究で明らかにされていることからＢＭＰ−２がより好ましい。
[Modified BMP]
The modified BMP with enhanced heparin-binding ability used in the present invention may be a BMP whose amino acid sequence has been modified so that heparin-binding ability is enhanced. “Enhanced heparin-binding ability” means that it can bind to heparin more strongly when compared with BMP whose amino acid sequence has not been modified (wild-type BMP). Whether heparin-binding ability is enhanced can be measured, for example, by surface plasmon resonance analysis using a carrier coated with heparin (reference: Ruppert et al., Eur. J. Biochem. 237 (1996), 252 -261)
BMP before the amino acid sequence is modified so that heparin-binding ability is enhanced, that is, wild-type BMP, acts on undifferentiated mesenchymal cells and differentiates them into chondrocytes or osteoblasts. The protein is not particularly limited as long as it has a bone forming activity. For example, BMP-2, BMP-3, BMP-4 (also referred to as BMP-2B), BMP-5, BMP-6, BMP -7 (OP-1), BMP-8 (OP-2), or BMP-9, or functionally equivalent variants thereof, ie, one or several amino acids deleted in the amino acid sequence of a naturally occurring BMP And a protein having a substituted or added amino acid sequence and having the same activity as a naturally occurring BMP. Among them, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-1) and BMP-8 (OP-2) are preferable, and the conventional basis is that bone formation ability is the highest. BMP-2 is more preferred because it has been demonstrated in research.
改変型ＢＭＰのアミノ酸配列は、野生型ＢＭＰのＮ末端領域にヘパリン結合ドメイン配列を含むペプチドが挿入されている。ここで、野生型ＢＭＰの「Ｎ末端領域」とは、成熟型ＢＭＰのアミノ酸配列におけるＮ末端から第２０位までのアミノ酸配列の範囲が意図される。 In the amino acid sequence of the modified BMP, a peptide containing a heparin-binding domain sequence is inserted into the N-terminal region of the wild-type BMP. Here, the “N-terminal region” of wild-type BMP is intended to be the range of the amino acid sequence from the N-terminal to the 20th position in the amino acid sequence of mature BMP.
ヘパリン結合ドメイン配列を含むペプチドは、ヘパリン結合能の亢進および骨形成活性に悪影響を及ぼさない限りにおいて、ヘパリン結合ドメイン配列以外のアミノ酸を含んでいてもよい。また、複数の異なるヘパリン結合ドメイン配列を含んでいてもよく、同一のヘパリン結合ドメイン配列を複数重複して含んでいてもよく、これらを複合的に含んでいてもよい。ヘパリン結合ドメイン配列は、具体的には、例えば、（ａ）リジン−ヒスチジン−リジン、および、（ｂ）アルギニン−リジン−アルギニン、を挙げることができる。 The peptide containing a heparin-binding domain sequence may contain amino acids other than the heparin-binding domain sequence as long as it does not adversely affect the enhancement of heparin-binding ability and osteogenic activity. In addition, a plurality of different heparin-binding domain sequences may be included, the same heparin-binding domain sequences may be included in duplicate, or these may be included in combination. Specific examples of the heparin-binding domain sequence include (a) lysine-histidine-lysine and (b) arginine-lysine-arginine.
改変型ＢＭＰは大腸菌を宿主細胞として発現させた組換えタンパク質であることが好ましい。大腸菌を宿主細胞とすることにより、安価な改変型ＢＭＰを生産することが可能となる。改変型ＢＭＰを、大腸菌を宿主細胞として生産する場合、成熟ＢＭＰのＮ末端に組換えタンパク質の発現に好適なメチオニン−アラニンを付加することが好ましい。 The modified BMP is preferably a recombinant protein expressed using E. coli as a host cell. By using E. coli as a host cell, it is possible to produce an inexpensive modified BMP. When the modified BMP is produced using Escherichia coli as a host cell, it is preferable to add methionine-alanine suitable for expression of the recombinant protein to the N-terminus of the mature BMP.
ここで、ヒトＢＭＰ−２の改変型について説明する。ヒトＢＭＰ−２のｍＲＮＡの塩基配列は、GenBank Accession NM_001200に、preproproteinのアミノ酸配列は、GenPept Accession NP_001191に開示されている。ヒトＢＭＰ−２の成熟タンパク質はpreproprotein（全３９６アミノ酸）の第２８３位〜第３９６位に該当し（配列番号５）、ヒトＢＭＰ−２の成熟タンパク質をコードする塩基配列はｍＲＮＡの塩基配列（全３１５０塩基）の第１６３２位〜第１９７３位（配列番号６）に該当する。 Here, a modified form of human BMP-2 will be described. The nucleotide sequence of human BMP-2 mRNA is disclosed in GenBank Accession NM_001200, and the amino acid sequence of preproprotein is disclosed in GenPept Accession NP_001191. The mature protein of human BMP-2 corresponds to positions 283 to 396 of preproprotein (all 396 amino acids) (SEQ ID NO: 5), and the base sequence encoding the mature protein of human BMP-2 is the base sequence of mRNA (all 3150 base) from position 1632 to position 1973 (SEQ ID NO: 6).
改変型ＢＭＰの１種であるヒトＢＭＰ−２Ｔ３（以下、「ＢＭＰ２Ｔ３」と記す）は、配列番号５に示されるヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列の第９位のアルギニンと第１０位のロイシンとの間に、アラニン−アルギニン−リジン−アルギニン（配列番号７）が挿入されるとともに、Ｎ末端にメチオニン−アラニンが付加されたアミノ酸配列（配列番号１）からなる、全アミノ酸数が１２０のタンパク質である。
Human BMP-2T3 (hereinafter referred to as “BMP2T3”), which is one type of modified BMP, is composed of arginine at
改変型ＢＭＰの他の１種であるヒトＢＭＰ−２Ｔ４（以下、「ＢＭＰ２Ｔ４」と記す）は、配列番号５に示されるヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列の第９位のアルギニンと第１０位のロイシンとの間に、アラニン−リジン−ヒスチジン−リジン−グルタミン−アルギニン−リジン−アルギニン（配列番号８）が挿入されるとともに、Ｎ末端にメチオニン−アラニンが付加されたアミノ酸配列（配列番号３）からなる、全アミノ酸数が１２４のタンパク質である。
Human BMP-2T4 (hereinafter referred to as “BMP2T4”), which is another type of modified BMP, is arginine at
これら２種類の改変型ＢＭＰは、野生型ＢＭＰ−２と比較してヘパリン結合能が高いことが報告されており（非特許文献２参照）、本発明に好適に用いることができる。また、これら２種類の改変型ＢＭＰのアミノ酸配列（配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列）において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、骨形成活性を維持しつつヘパリン結合能の亢進したタンパク質も本発明に好適に用いることができる。 These two types of modified BMP have been reported to have higher heparin-binding ability than wild-type BMP-2 (see Non-Patent Document 2) and can be suitably used in the present invention. In addition, the amino acid sequences of these two types of modified BMPs (amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3) consist of amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and bones A protein having enhanced heparin binding ability while maintaining its forming activity can also be suitably used in the present invention.
ここで「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。 Here, “one or several amino acids have been deleted, substituted or added” means that the number can be deleted, substituted or added by a known mutant peptide production method such as site-directed mutagenesis (preferably Means that 10 or less, more preferably 7 or less, and still more preferably 5 or less) amino acids are deleted, substituted or added.
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。 It is well known in the art that some amino acids in the amino acid sequence of a protein can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the protein. Furthermore, it is also well known that there are variants that not only artificially modify, but also do not significantly alter the structure or function of the protein in the native protein.
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。 Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. Silent substitution, addition and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not alter the polypeptide activity according to the invention.
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。 Typically seen as conservative substitutions are substitutions of one amino acid for another in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile, exchange of hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues Asp and Glu exchange, substitution between amide residues Asn and Gln, exchange of basic residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Phe, Tyr.
ＢＭＰ２Ｔ３は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに挿入し宿主細胞である大腸菌に導入して発現させ、これを精製することにより製造することができる。同様に、ＢＭＰ２Ｔ４は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに挿入し宿主細胞である大腸菌に導入して発現させ、これを精製することにより製造することができる。 BMP2T3 can be produced by inserting a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 into an appropriate expression vector, introducing it into E. coli as a host cell, and expressing it, followed by purification. Similarly, BMP2T4 is produced by inserting a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 into an appropriate expression vector, introducing it into E. coli as a host cell, and purifying it. Can do.
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるものであれば限定されない。具体定期には、例えば、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。配列番号２に示される塩基配列は、ヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡの塩基配列における成熟ヒトＢＭＰ−２をコードする部分に該当する塩基配列（配列番号６）の第２７位のシトシンと第２８位のシトシンとの間にgctcgtaaacgt（配列番号９）を挿入するするとともに５’末端にatggct（配列番号１０）を付加することにより得ることができる。なお、塩基配列の挿入および付加は、公知の遺伝子工学的手法を用いることにより行うことができる。 The gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is not limited as long as it consists of the base sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Specific examples of the periodicity include DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 comprises cytosine at position 27 and cytosine at position 28 of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 6) corresponding to the portion encoding mature human BMP-2 in the nucleotide sequence of human BMP-2 mRNA. It can be obtained by inserting gctcgtaaacgt (SEQ ID NO: 9) between and atggct (SEQ ID NO: 10) at the 5 ′ end. In addition, insertion and addition of a base sequence can be performed by using a known genetic engineering technique.
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるものであれば限定されない。具体定期には、例えば、配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。配列番号４に示される塩基配列は、ヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡの塩基配列における成熟ヒトＢＭＰ−２をコードする部分に該当する塩基配列（配列番号６）の第２７位のシトシンと第２８位のシトシンとの間にgctaagcataagcaacgtaagcgt（配列番号１１）を挿入するするとともに５’末端にatggct（配列番号１０）を付加することにより得ることができる。 The gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is not limited as long as it consists of the base sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. Specific examples of the periodicity include DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 comprises cytosine at position 27 and cytosine at position 28 of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 6) corresponding to the portion encoding mature human BMP-2 in the nucleotide sequence of human BMP-2 mRNA. It can be obtained by inserting gctaagcataagcaacgtaagcgt (SEQ ID NO: 11) in between and adding atggct (SEQ ID NO: 10) to the 5 ′ end.
ＢＭＰ２Ｔ３やＢＭＰ２Ｔ４を製造するためにこれらのタンパク質をコードする遺伝子を作製し、組み換え発現ベクターを構築し、宿主細胞である大腸菌に導入し、組み換えタンパク質を発現させ、精製して取得する一連の操作は、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより行うことができる。 In order to produce BMP2T3 and BMP2T4, a series of operations to prepare genes encoding these proteins, construct recombinant expression vectors, introduce them into host cells E. coli, express recombinant proteins, purify and obtain It can be carried out by appropriately combining known genetic engineering techniques.
〔ゼラチンハイドロゲル〕
ゼラチンは、牛、豚、魚類など各種の動物の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。
[Gelatin hydrogel]
Gelatin can be collected from all parts of the body such as skin, bones and tendons of various animals such as cattle, pigs, and fish, or from substances used as collagen, alkaline hydrolysis, acid hydrolysis, and enzymatic degradation It can obtain by modifying | denaturing by various processes, such as.
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルの原料として利用可能なゼラチンは、塩基性ゼラチンである。本明細書において「塩基性ゼラチン」とは、等電点が７．０以上１３．０以下のものが意図される。本発明に用いる塩基性ゼラチンの等電点は、７．５以上１０．０以下であることがより好ましく、８．５以上９．５以下であることがさらに好ましい。 The gelatin that can be used as a raw material for the gelatin hydrogel used in the present invention is basic gelatin. In this specification, “basic gelatin” is intended to have an isoelectric point of 7.0 or more and 13.0 or less. The isoelectric point of the basic gelatin used in the present invention is more preferably 7.5 or more and 10.0 or less, and further preferably 8.5 or more and 9.5 or less.
なお、ゼラチンの等電点を測定する方法は限定されないが、例えば以下に示すパギィ法を挙げることができる。したがって、市販のゼラチンを購入して等電点を測定すれば、本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルの原料として利用可能な塩基性ゼラチンを取得することができる。また、等電点を表示して市販されているゼラチンから、上記範囲の等電点を有するゼラチンを購入してもよい。例えば、等電点９のゼラチンは、新田ゼラチン株式会社からＡＰＨ２００という商品名で市販されている。 The method for measuring the isoelectric point of gelatin is not limited, and examples thereof include the following Puggy method. Therefore, basic gelatin that can be used as a raw material for the gelatin hydrogel used in the present invention can be obtained by purchasing commercially available gelatin and measuring the isoelectric point. Alternatively, gelatin having an isoelectric point in the above range may be purchased from commercially available gelatin with an isoelectric point displayed. For example, gelatin having an isoelectric point of 9 is commercially available from Nitta Gelatin Co., Ltd. under the trade name APH200.
パギィ法について説明する。パギィ法は、ｐＨ計を用い、イオン交換樹脂の混床カラムに通した被検液の水素イオン濃度を測定する方法である。被検液には試料ゼラチンの１％溶液を用いる。側手操作は以下の(1)〜(5)に記載のとおりである。
(1) 強酸性陽イオン交換樹脂５ｍｌと強塩基性陰イオン交換樹脂（Ｉ形）１０ｍｌを混合してカラムに均一に詰める。ジャケットには４０〜４５℃の湯を通しておく。
(2) カラムに４０〜４５℃の湯１００ｍｌ通して温める。
(3) ４０〜４５℃とした検液１００ｍｌを、１時間に５０ｍｌの速さでカラムに通す。
(4) 流出点の初めの約２５ｍｌを除いた後、約５０ｍｌを取り、液温を３５℃にしてｐＨを測定する。得られたｐＨ値を等イオン点（等電点）とする。
(5) 測定値は小数点以下２位に丸める。
The Puggy method will be described. The Puggy method is a method of measuring the hydrogen ion concentration of a test solution that has passed through a mixed bed column of ion exchange resin using a pH meter. A 1% sample gelatin solution is used as the test solution. Side hand operation is as described in the following (1) to (5).
(1) Mix 5 ml of a strongly acidic cation exchange resin and 10 ml of a strongly basic anion exchange resin (form I) and uniformly pack the column. Pour 40-45 ° C hot water through the jacket.
(2)
(3)
(4) After removing about 25 ml at the beginning of the pour point, take about 50 ml and measure the pH at 35 ° C. The obtained pH value is defined as an isoionic point (isoelectric point).
(5) The measured value is rounded to the second decimal place.
強酸性陽イオン交換樹脂には、アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ、またはこれと同等の性能を有するものが使用できる。また、強酸性陽イオン交換樹脂は予め洗浄したものを使用する。洗浄方法としては、樹脂をカラムに詰め、樹脂の５倍量の６％塩酸を空間速度３で通した後、空間速度１０で水洗する方法を挙げることができる。水洗は、流出液が硝酸銀溶液を加えても、白濁しなくなるまで行う。 As the strongly acidic cation exchange resin, Amberlite IR-120B or one having a performance equivalent to this can be used. A strong acid cation exchange resin that has been washed in advance is used. Examples of the washing method include a method in which a resin is packed in a column, 5% of the resin 6% hydrochloric acid is passed at a space velocity of 3, and then washed at a space velocity of 10. Wash with water until the effluent does not become cloudy even when a silver nitrate solution is added.
強塩基性陰イオン交換樹脂（Ｉ形）には、アンバーライトＩＲＡ−４０１、またはこれと同等の性能を有するものが使用できる。また、強塩基性陰イオン交換樹脂（Ｉ形）は予め洗浄したものを使用する。洗浄方法としては、樹脂をカラムに詰め、樹脂の５倍量の１０％水酸化ナトリウム溶液を空間速度３で通した後、空間速度１０で水洗する方法を挙げることができる。水洗は、流出液がフェノールフタレインを加えても、着色しなくなるまで行う。 As the strongly basic anion exchange resin (form I), Amberlite IRA-401 or one having the same performance can be used. In addition, a strongly basic anion exchange resin (form I) that has been washed in advance is used. Examples of the washing method include a method in which a resin is packed in a column, a 10% sodium hydroxide solution having a volume five times that of the resin is passed at a space velocity of 3, and then washed at a space velocity of 10. Wash with water until the effluent is no longer colored even when phenolphthalein is added.
また、パギィ法に用いるイオン交換樹脂カラムは、ガラス製、ジャケット付き、内径約１７ｍｍ、長さ約２５０ｍｍのものが好ましい。ｐＨ計は、形式０（ＪＩＳ Ｚ８８０２、繰り返し性±０．００５）と同等の性能を有するものが用いられる。 The ion exchange resin column used in the Puggy method is preferably made of glass, with a jacket, an inner diameter of about 17 mm, and a length of about 250 mm. A pH meter having a performance equivalent to that of type 0 (JIS Z8802, repeatability ± 0.005) is used.
また、塩基性ゼラチンはさらに人為的に塩基性の化合物（例えばアミン化合物など）で修飾することによりカチオン化することが可能であるが、本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルの原料として好適な塩基性ゼラチンは、何ら人為的な修飾を施していない塩基性ゼラチンである。 In addition, basic gelatin can be cationized by artificially modifying with a basic compound (for example, an amine compound), but a base suitable as a raw material for the gelatin hydrogel used in the present invention. The basic gelatin is a basic gelatin without any artificial modification.
ここで、「ハイドロゲル」は、水分を多量に含むことにより膨潤する性質を持つ高分材料が意図される。本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルは、上記塩基性ゼラチンを原料として製造されるハイドロゲルである。このようなゼラチンハイドロゲルは、上記塩基性ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤とゼラチン分子間に化学架橋を形成させることで製造できる。化学的架橋剤としては、ＥＤＣ等の水溶性カルボジイミド、プロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱処理または紫外線照射によっても化学架橋することができる。また、これらの架橋処理を組み合わせて用いることもできる。さらに、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製することも可能である。 Here, the “hydrogel” is intended to be a highly divided material having a property of swelling when it contains a large amount of moisture. The gelatin hydrogel used in the present invention is a hydrogel produced using the above basic gelatin as a raw material. Such a gelatin hydrogel can be produced by forming chemical crosslinks between various chemical crosslinkers and gelatin molecules using the above basic gelatin. As the chemical cross-linking agent, a condensing agent that forms a chemical bond between water-soluble carbodiimide such as EDC, propylene oxide, diepoxy compound, hydroxyl group, carboxyl group, amino group, thiol group, and imidazole group can be used. Preference is given to glutaraldehyde. Gelatin can also be chemically crosslinked by heat treatment or ultraviolet irradiation. These crosslinking treatments can be used in combination. Furthermore, it is also possible to produce a hydrogel by physical crosslinking using salt crosslinking, electrostatic interaction, hydrogen bonding, hydrophobic interaction, and the like.
ゼラチンの架橋度は、所望の含水率、すなわちハイドロゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度０．０１〜１ｗ／ｗ％である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。 The degree of crosslinking of gelatin can be appropriately selected according to the desired water content, that is, the level of bioabsorbability of the hydrogel. The preferred ranges of the concentration of gelatin and the crosslinking agent in preparing the gelatin hydrogel are a gelatin concentration of 1 to 20 w / w% and a crosslinking agent concentration of 0.01 to 1 w / w%. The crosslinking reaction conditions are not particularly limited, but can be performed, for example, at 0 to 40 ° C. for 1 to 48 hours. In general, as the concentration of gelatin and the crosslinking agent and the crosslinking time increase, the degree of crosslinking of the hydrogel increases and the bioabsorbability decreases.
ゼラチンハイドロゲルの形状は、特に限定されないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などを挙げることができる。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、埋込片として用いるのに適しており、あるいは細かく砕いて粒子状にして用いることも可能である。また、球状、粒子状、ペースト状のものは注射投与も可能である。 The shape of the gelatin hydrogel is not particularly limited, and examples thereof include a columnar shape, a prismatic shape, a sheet shape, a disk shape, a spherical shape, and a particle shape. A cylindrical shape, a prismatic shape, a sheet shape, or a disk shape is suitable for use as an embedded piece, or can be finely pulverized into particles. In addition, spherical, particulate, and paste-like materials can be administered by injection.
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンハイドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、ｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。反応に用いられた架橋剤および低分子物質を完全に除去する目的で、得られたゼラチンハイドロゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。 Cylindrical, prismatic, sheet, and disk-shaped gelatin hydrogels can be cross-linked by adding an aqueous crosslinking agent solution to an aqueous gelatin solution, or adding gelatin to an aqueous crosslinking agent solution and pouring it into a mold of the desired shape. Can be prepared. Further, an aqueous crosslinking agent solution may be added to the formed gelatin gel as it is or after drying. In order to stop the crosslinking reaction, it is brought into contact with a low-molecular substance having an amino group such as ethanolamine or glycine, or an aqueous solution having a pH of 2.5 or less is added. The obtained gelatin hydrogel is washed with distilled water, ethanol, 2-propanol, acetone or the like for the purpose of completely removing the cross-linking agent and low-molecular substances used in the reaction, and used for preparation of the preparation.
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、EYELA miniD.C. スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーAdvantec TME-21、ホモジナイザー、polytron PT10-35等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンハイドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンハイドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。ゼラチンハイドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
Spherical and particulate gelatin hydrogels are, for example, a stirring motor (for example, Shinto Kagaku Co., Ltd., Three One Motor, EYELA miniD.C. Stirrer, etc.) fixed to a three-neck round bottom flask and a propeller for Teflon (registered trademark) The gelatin solution is put into a device fixed together with the flask, and oil such as olive oil is added thereto and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm to obtain a W / O type emulsion, and an aqueous crosslinking agent solution is added thereto. Alternatively, an aqueous gelatin solution previously emulsified in olive oil (for example, using a vortex mixer Advantec TME-21, a homogenizer, polytron PT10-35, etc.) is dropped into olive oil to form finely divided W / After preparing an O-type emulsion, adding an aqueous solution of a crosslinking agent to this to cause a crosslinking reaction, and collecting the gelatin hydrogel by centrifugation It can be prepared by washing with acetone, ethyl acetate or the like and further immersing in 2-propanol or ethanol to stop the crosslinking reaction. The obtained gelatin hydrogel particles are sequentially washed with distilled water containing 2-propanol,
得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は、上述の粒子作製時におけるゼラチン濃度、ゼラチン水溶液とオリーブ油との体積比、および撹拌スピードなどにより変化する。一般には粒径は１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが２０μ以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲルを得ることができる。 The average particle size of the obtained gelatin hydrogel particles varies depending on the gelatin concentration at the time of preparing the above-mentioned particles, the volume ratio of the gelatin aqueous solution and olive oil, the stirring speed, and the like. In general, the particle size is 1-1000 μm, and particles having a necessary size may be appropriately screened and used according to the purpose. Further, by pre-emulsifying, a gelatinous gelatin hydrogel having a particle size of 20 μm or less can be obtained.
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００mMグリシン水溶液または０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ ＨＣ１等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
Another method for preparing spherical and particulate gelatin hydrogels is as follows. Olive oil is put in the same apparatus as the above method, and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm. A gelatin aqueous solution is dropped into this to prepare a W / O type emulsion. After cooling this, acetone, ethyl acetate, etc. are added. In addition, the mixture is stirred and uncrosslinked gelatin particles are recovered by centrifugation. The collected gelatin particles are further washed with acetone, ethyl acetate, etc., then 2-propanol, ethanol, etc., and then dried. The dried gelatin particles are suspended in an aqueous solution of a crosslinking agent containing 0.1
本発明のゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、または−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行うことができる。 The gelatin hydrogel of the present invention can be appropriately used after being cut into an appropriate size and shape, lyophilized and sterilized. Freeze-drying is performed, for example, by putting gelatin hydrogel in distilled water and freezing it in liquid nitrogen for 30 minutes or more, or at -80 ° C for 1 hour or more, and then drying it in a freeze dryer for 1 to 3 days. Can do.
〔骨形成用徐放性医薬組成物〕
本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物は、改変型ＢＭＰおよび塩基性ゼラチンハイドロゲルを含むものであればよい。
[Slow release pharmaceutical composition for bone formation]
The sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention only needs to contain modified BMP and basic gelatin hydrogel.
本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物は、例えば、凍結乾燥した塩基性ゼラチンハイドロゲルに改変型ＢＭＰ溶液を滴下すること、またはゼラチンハイドロゲルを改変型ＢＭＰ溶液中に浸漬させることにより得ることができる。この操作は、通常、４〜３７℃で１５分間〜１時間、好ましくは４〜１０℃で６〜８時間で終了し、その間にハイドロゲルは改変型ＢＭＰ溶液で膨潤する。 The sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention can be obtained by, for example, dropping a modified BMP solution onto a lyophilized basic gelatin hydrogel or immersing the gelatin hydrogel in the modified BMP solution. Obtainable. This operation is usually completed at 4 to 37 ° C. for 15 minutes to 1 hour, preferably 4 to 10 ° C. for 6 to 8 hours, during which time the hydrogel swells with the modified BMP solution.
ゼラチン（乾燥重量）に対する改変型ＢＭＰの重量比は約１倍〜約１００００倍の範囲内であることが好ましい。より好ましくは、ゼラチン（乾燥重量）に対して改変型ＢＭＰは約２倍〜約５０００倍の重量比であり、さらに好ましくは約１０倍〜約１０００倍の重量比である。 The weight ratio of modified BMP to gelatin (dry weight) is preferably in the range of about 1 to about 10,000 times. More preferably, the modified BMP is in a weight ratio of about 2 times to about 5000 times, more preferably in a weight ratio of about 10 times to about 1000 times with respect to gelatin (dry weight).
本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物は、任意の方法で生体に投与することができるが、目的とする特定部位で改変型ＢＭＰを持続的に放出させるためには局所投与が特に好ましい。また、本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物は、更に必要に応じて薬学的に許容し得る公知の担体（安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）を含有することができる。 The sustained-release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention can be administered to a living body by any method, but local administration is particularly preferred for the sustained release of modified BMP at a specific site of interest. preferable. Further, the sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention further comprises known pharmaceutically acceptable carriers (stabilizers, preservatives, solubilizers, pH adjusters, thickeners if necessary). Etc.).
本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物は、目的に応じて種々の形状の製剤化が可能である。例えば、粒状、円・角柱状、シート状、ディスク状、スティック状、ロッド状等の固形、半固形製剤が挙げられる。好ましくは目的とする特定部位での徐放効果に優れ、また局所投与に好適な固形製剤である。例えばシート状製剤は、局所に埋め込むのに適している。 The sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention can be formulated into various shapes depending on the purpose. For example, solid, semi-solid preparations such as granular, circular and prismatic, sheet, disc, stick, and rod shapes can be mentioned. Preferably, it is a solid preparation excellent in sustained release effect at a specific target site and suitable for local administration. For example, a sheet-form preparation is suitable for local implantation.
本発明に係る骨形成用徐放性医薬組成物は、骨形成治療に好適に用いられる。骨形成治療とは、骨組織や軟骨組織の形成が必要な疾患の予防または治療、あるいは、骨組織や軟骨組織の形成または補填が必要な症状の改善を意味する。具体的には、例えば、（１）事故、疾患、先天性異常、または各種手術に伴う骨または軟骨の欠損部位の修復、（２）各種骨折の治癒促進、（３）人工関節、人工骨、若しくは人工歯根等の人工インプラント周囲での骨の形成、人工インプラント使用時の固着促進、脊椎固定促進、または脚延長等の整形外科分野における骨若しくは軟骨の再生若しくは補填、または関節の再建、（４）形成外科分野での骨または軟骨の補填、あるいは、（５）歯科領域での顎骨の修復、歯槽骨の再生、セメント質の修復、またはインプラント使用のための骨の増大等が含まれる。また、骨組織での骨吸収と骨形成とのバランスが破綻した場合に生じる骨粗鬆症、線維性骨炎、骨軟化症、またはページェット病等を含む代謝性骨疾患や変形性関節炎の予防または治療も含まれる。 The sustained release pharmaceutical composition for osteogenesis according to the present invention is suitably used for osteogenesis treatment. Osteogenic treatment means prevention or treatment of a disease that requires formation of bone tissue or cartilage tissue, or improvement of symptoms that require formation or compensation of bone tissue or cartilage tissue. Specifically, for example, (1) repair of bone or cartilage defect sites associated with accidents, diseases, congenital abnormalities, or various operations, (2) promotion of healing of various fractures, (3) artificial joints, artificial bones, Alternatively, bone formation around an artificial implant such as an artificial tooth root, promotion of fixation when using an artificial implant, promotion of spinal fixation, regeneration or replacement of bone or cartilage in the orthopedic field such as leg extension, or reconstruction of a joint (4 Or bone or cartilage replacement in the field of plastic surgery, or (5) jaw bone repair in the dental field, alveolar bone regeneration, cementum repair, or bone augmentation for implant use. In addition, prevention or treatment of metabolic bone diseases and osteoarthritis, including osteoporosis, fibrotic osteoarthritis, osteomalacia, or Paget's disease, which occurs when the balance between bone resorption and bone formation in bone tissue is broken Is also included.
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。 It should be noted that the specific embodiments and the following examples made in the section of the best mode for carrying out the invention are intended to clarify the technical contents of the present invention, and to such specific examples. It is not to be construed as limiting in any way whatsoever, and those skilled in the art can implement the invention within the spirit of the invention and the scope of the appended claims.
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
〔実施例１：マウス皮下における徐放性試験１〕
（１）各種ゼラチンハイドロゲルの作製
塩基性ゼラチン（分子量９９，０００、等電点９．０、新田ゼラチン社製Type;G-2141 Lot:050803）および酸性ゼラチン（分子量９９，０００、等電点５．０、新田ゼラチン社製Type;G-2140 Lot:050803）をそれぞれ供与された。
[Example 1: Sustained release test 1 in mice subcutaneously]
(1) Preparation of various gelatin hydrogels Basic gelatin (molecular weight 99,000, isoelectric point 9.0, Type: G-2141 Lot: 050803 manufactured by Nitta Gelatin Co.) and acidic gelatin (molecular weight 99,000, isoelectric) 5.0, Nitta Gelatin Co., Ltd. Type; G-2140 Lot: 050803).
塩基性ゼラチンのカルボキシル基にEthylenediamine（エチレンジアミン; C2H8N2=60.1）またはSupermine（スペルミン; C10H26N4=202.3）を化学導入することで２種類のカチオン化ゼラチンを作製した。すなわち、１０ｇの塩基性ゼラチンに２５０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）を加え、４０℃で一時間撹拌し、塩基性ゼラチン水溶液を得た。ゼラチンのカルボキシル基に対して５０倍モル等量のエチレンジアミンまたはスペルミンを加え、濃塩酸にて水溶液のｐＨを５に調整した後、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochroride salt（ＥＤＣ:ナカライテスク株式会社、東京）を５．３５ｇ加えた。０．１Ｍリン酸緩衝液を加え、全量を５００ｍｌ（最終ゼラチン濃度０．０２ｇ／ｍｌ）とした後、３７℃、１８時間撹拌下反応させた。反応後、セルロースチューブ（分画分子量12,000−14,000：三光純薬株式会社、東京）を用い、超純水（Milli Q）に対してして４８時間、室温で透析し、未反応のエチレンジアミンまたはスペルミン、ＥＤＣ、および副生成物を除去した。透析後、得られた内容物を−８０℃で凍結した後、凍結乾燥し、カチオン化ゼラチンを得た。 Two kinds of cationized gelatin were prepared by chemically introducing Ethylenediamine (ethylenediamine; C 2 H 8 N 2 = 60.1) or Supermine (spermine; C 10 H 26 N 4 = 202.3) into the carboxyl group of basic gelatin. That is, 250 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 5) was added to 10 g of basic gelatin and stirred at 40 ° C. for 1 hour to obtain a basic gelatin aqueous solution. After adding 50 times molar equivalent of ethylenediamine or spermine to the carboxyl group of gelatin and adjusting the pH of the aqueous solution to 5 with concentrated hydrochloric acid, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochroride salt (EDC: 5.35 g of Nacalai Tesque Corporation, Tokyo) was added. 0.1M phosphate buffer was added to make the total volume 500 ml (final gelatin concentration 0.02 g / ml), and the reaction was allowed to proceed with stirring at 37 ° C. for 18 hours. After the reaction, dialyzed against ultrapure water (Milli Q) for 48 hours at room temperature using cellulose tube (fraction molecular weight 12,000-14,000: Sanko Junyaku Co., Ltd., Tokyo), unreacted ethylenediamine or spermine , EDC, and by-products were removed. After dialysis, the obtained contents were frozen at −80 ° C. and then lyophilized to obtain cationized gelatin.
また、酸性ゼラチンのアミノ基にslufoacetic acid（スルホ酢酸; C2H4O5S=140.12）、Undecanoic acid（ウンデカン酸: C11H22O2=186.3）またはsuccinic anhydride(コハク酸：C4H6O4＝118)を化学導入することで３種類のアニオン化ゼラチンを作製した。 In addition, slufoacetic acid (sulfoacetic acid; C 2 H 4 O 5 S = 140.12), Undecanoic acid (undecanoic acid: C 11 H 22 O 2 = 186.3) or succinic anhydride (succinic acid: C 4 H) Three kinds of anionized gelatin were prepared by chemical introduction of 6 O 4 = 118).
すなわち、スルホ酢酸修飾ゼラチンおよびウンデカン酸修飾ゼラチンに関しては以下のとおり作製した。２ｇの酸性ゼラチンに４５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）を加え、４０℃で一時間撹拌し、酸性ゼラチン水溶液を得た。別途、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）５ｍｌにスルホ酢酸；２．６０６ｇまたはＣ１１；３．４６４ｇをそれぞれ溶解させ、ＥＤＣを１．０７ｇ加えて撹拌した。当該反応液を上記酸性ゼラチン水溶液に滴下し全量を５０ｍｌ（最終ゼラチン濃度０．０４ｇ／ｍｌ）とした後、３７℃、１８時間撹拌下反応させた。反応後、上記カチオン化ゼラチンの作製と同様の手法でスルホ酢酸修飾ゼラチンおよびウンデカン酸修飾ゼラチンを得た。
That is, the sulfoacetic acid modified gelatin and undecanoic acid modified gelatin were prepared as follows. To 2 g of acidic gelatin, 45 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 5) was added and stirred at 40 ° C. for 1 hour to obtain an acidic gelatin aqueous solution. Separately, sulfoacetic acid; 2.606 g or C11; 3.464 g was dissolved in 5 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 5), and 1.07 g of EDC was added and stirred. The reaction solution was added dropwise to the acidic gelatin aqueous solution to make the
コハク酸修飾ゼラチンに関しては２ｇの酸性ゼラチンに１６ｍｌのdehydrated demethylsulfoxide（ＤＭＳＯ）を加え、常温で３日間溶解させ酸性ゼラチンのＤＭＳＯ溶液を得た。コハク酸８１ｍｇをＤＭＳＯ９ｍｌに溶解させ、上記酸性ゼラチンのＤＮＳＯ溶液（最終ゼラチン濃度０．０８ｇ／ｍｌ）と混合して３７℃、１時間反応させた。反応後ゼラチン溶液をアセトン中に滴下してゼラチンを再沈させ、得られたゼラチンをアセトンで３回洗浄し真空乾燥させることでコハク酸修飾ゼラチンを得た。 Regarding succinic acid-modified gelatin, 16 ml of dehydrated demethylsulfoxide (DMSO) was added to 2 g of acidic gelatin and dissolved at room temperature for 3 days to obtain a DMSO solution of acidic gelatin. 81 mg of succinic acid was dissolved in 9 ml of DMSO, mixed with the above-mentioned acidic gelatin in DNSO (final gelatin concentration: 0.08 g / ml), and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, the gelatin solution was dropped into acetone to reprecipitate the gelatin, and the resulting gelatin was washed with acetone three times and vacuum dried to obtain succinic acid-modified gelatin.
供与された２種類のゼラチン（塩基性ゼラチンおよび酸性ゼラチン）、並びに、作製した２種類のカチオン化ゼラチンおよび３種類のアニオン化ゼラチンを用いてゼラチンハイドロゲルを調製した。具体的には、７種類のゼラチンをそれぞれ超純水（Milli Q）に溶解し５％ゼラチン水溶液を調製した。この各ゼラチン水溶液に濃度０．２５ｍｇ／ｍｌのグルタルアルデヒドを添加した。この混合液をポリプロピレン製秤量皿（１４×１４ｃｍ2）に流延後、４℃にて１２時間静置することによって、化学架橋したゼラチンハイドロゲルシート（厚さ２ｍｍ）を得た。１００ｍＭ濃度のグリシン水溶液で３７℃にて３時間処理し、未反応のグルタルアルデヒドあるいはアルデヒド基を不活性化した。次に、蒸留水にて数回洗浄し、凍結乾燥することによって架橋ゼラチンハイドロゲルを得た。凍結乾燥したハイドロゲルはエチレンオキシドガスを用いて滅菌した。
Gelatin hydrogels were prepared using the two types of gelatin provided (basic gelatin and acidic gelatin) and the two types of cationized gelatin and three types of anionized gelatin. Specifically, 7 types of gelatin were dissolved in ultrapure water (Milli Q), respectively, to prepare a 5% gelatin aqueous solution. Glutaraldehyde having a concentration of 0.25 mg / ml was added to each gelatin aqueous solution. This mixed solution was cast on a polypropylene weighing dish (14 × 14 cm 2 ) and allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours to obtain a chemically crosslinked gelatin hydrogel sheet (
（２）ＢＭＰの放射線標識
大腸菌に発現させたＢＭＰ２Ｔ４は、株式会社オステオファーマより供与された。当該ＢＭＰ２Ｔ４は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなることが確認されており、当業者に周知の遺伝子工学的手法を用いて、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ）を含む発現ベクターを大腸菌に導入し、発現、精製することにより取得することができる。
(2) Radiolabeling of BMP BMP2T4 expressed in E. coli was provided by Osteophoma. The BMP2T4 has been confirmed to consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (for example, using genetic engineering techniques well known to those skilled in the art) The DNA can be obtained by introducing an expression vector containing a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4) into E. coli, and expressing and purifying it.
放射線標識にはクロラミンＴ法を用いた。すなわち、１．０ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ２Ｔ４溶液１０μｌに０．５Ｍ pottasium phosphate buffer（KPB：pH 7.5）を９０μｌ加え、１０μｌのＮａ125Ｉ（740Mbq/ml in 0.1 N NaOH）を混和した。続いて０．２ｍｇ／ｍｌのクロラミンＴ溶液１００μｌを加え２分間撹拌反応させた後、４ｍｇ／ｍｌの二亜硫酸ナトリウム１００μｌで反応停止させた。反応物をカラムに添加し、その上から１５００μｌのＰＢＳを加え、２５０μｌずつＰＢＳをカラムに滴下することで放射線標識されたＢＭＰ２Ｔ４を回収した。 Chloramine T method was used for radiolabeling. That is, 90 μl of 0.5M pottasium phosphate buffer (KPB: pH 7.5) was added to 10 μl of 1.0 mg / ml BMP2T4 solution, and 10 μl of Na 125 I (740 Mbq / ml in 0.1 N NaOH) was mixed. Subsequently, 100 μl of a 0.2 mg / ml chloramine T solution was added and allowed to react with stirring for 2 minutes, and then the reaction was stopped with 100 μl of 4 mg / ml sodium disulfite. The reaction product was added to the column, 1500 μl of PBS was added from above, and 250 μl of PBS was added dropwise to the column to recover radiolabeled BMP2T4.
（３）マウス皮下における徐放性試験
上記（１）で作製した７種類の凍結乾燥ゼラチンハイドロゲルをそれぞれ２ｍｇにカットし、（２）により得られた２０μｌの放射線標識ＢＭＰ２Ｔ４を４℃で一夜かけて含浸させた。
(3) Sustained release test in mouse subcutaneously Each of the 7 types of freeze-dried gelatin hydrogels prepared in (1) was cut into 2 mg, and 20 μl of the radiolabeled BMP2T4 obtained in (2) was applied overnight at 4 ° C. And impregnated.
放射線標識ＢＭＰ２Ｔ４を含む７種類のゼラチンハイドロゲルのγ線量をそれぞれ測定した後、１群あたり３匹のマウス（ｄｄｙ系雄性マウス（日本エスエルシー株式会社、京都）、６週齢、体重２２〜２４ｇ）の背部皮下に埋入した。３日後に皮下のゼラチンハイドロゲルを回収してγ線量を測定し、埋入前のγ線量と比較することでＢＭＰ２Ｔ４の残存率を算出した。なお、γ線量はガンマカウンター（ARC-301B,Aloka Co.,Ltd）にて計測した。 After measuring the γ dose of each of the seven types of gelatin hydrogels containing radiolabeled BMP2T4, three mice per group (ddy male mice (Japan SLC, Kyoto), 6 weeks old, weight 22-24 g) ). Three days later, the subcutaneous gelatin hydrogel was collected, the γ dose was measured, and the residual rate of BMP2T4 was calculated by comparing with the γ dose before implantation. The γ dose was measured with a gamma counter (ARC-301B, Aloka Co., Ltd).
（４）結果
結果を図１に示した。各ゼラチンハイドロゲルは、ゼラチンの電荷が最も負に帯電しているものを左端、最も正に帯電しているものが右端となるように電荷の順に記載されている。なお、「スルホアセチル化」はスルホ酢酸修飾アニオン化ゼラチン、「コハク化」はコハク酸修飾アニオン化ゼラチン、「Ｃ１１」はウンデカン酸修飾アニオン化ゼラチン、「ＰＩ５」は供与された酸性ゼラチン、「ＰＩ９」は供与された塩基性ゼラチン、「ＥＤ」はエチレンジアミン修飾カチオン化ゼラチン、「ＳＭ」はスペルミン修飾カチオン化ゼラチンを表す略称である。以下、適宜各ゼラチンハイドロゲルについてこれらの略称で表記する。
(4) Results The results are shown in FIG. Each gelatin hydrogel is described in order of charge so that the leftmost end of the gelatin is the most negatively charged and the right end is the most positively charged. “Sulfoacetylation” is sulfoacetic acid-modified anionized gelatin, “succination” is succinic acid-modified anionized gelatin, “C11” is undecanoic acid-modified anionized gelatin, “PI5” is donated acidic gelatin, “PI9” "Is abbreviated basic gelatin," ED "is an abbreviation for ethylenediamine modified cationized gelatin, and" SM "is spermine modified cationized gelatin. Hereinafter, these gelatin hydrogels will be appropriately indicated by these abbreviations.
図１から明らかなように、電荷が正に帯電しているＳＭ、ＥＤおよびＰＩ９のほうが、電荷が負に帯電している他の４種類のゼラチンハイドロゲルより皮下埋入３日後の残存率が高かった。したがって、電荷が正に帯電しているＳＭ、ＥＤおよびＰＩ９がＢＭＰ２Ｔ４と高い親和性を有することが明らかとなった。 As can be seen from FIG. 1, SM, ED and PI9, which are positively charged, have a residual rate 3 days after implantation subcutaneously than the other four types of gelatin hydrogels which are negatively charged. it was high. Therefore, it was revealed that SM, ED and PI9, which are positively charged, have a high affinity with BMP2T4.
〔実施例２：マウス皮下における徐放性試験２〕
実施例１において、ＢＭＰ２Ｔ４と最も高い親和性（高い徐放性）を示したＳＭおよびスペルミン修飾を施していないＰＩ９の２種類について、マウス皮下において、より長期間の徐放性を試験した。
[Example 2:
In Example 1, the long-term sustained release property was tested subcutaneously in mice for two types of SM, which showed the highest affinity (high sustained release property) with BMP2T4, and PI9 not subjected to spermine modification.
実施例１と同様に放射線標識したＳＭおよびＰＩ９を作製し、マウス皮下に埋入した。埋入後１、３、７、１０および１４日後に、各３匹のマウスについて皮下のゼラチンハイドロゲル、並びに周囲の皮膚および皮下組織を回収してγ線量を測定し、埋入前のγ線量と比較することで残存率を算出した。 Radiolabeled SM and PI9 were prepared as in Example 1 and implanted subcutaneously in mice. At 1, 3, 7, 10 and 14 days after implantation, subcutaneous gelatin hydrogel and surrounding skin and subcutaneous tissue were collected for each of 3 mice, and γ dose was measured. The residual rate was calculated by comparing with.
なお、対照としてキャリアを用いずに放射線標識ＢＭＰ２Ｔ４溶液（２０μｌ）のみを皮下投与する群を設けた。 As a control, a group in which only a radiolabeled BMP2T4 solution (20 μl) was subcutaneously administered without using a carrier was provided.
結果を図２に示した。図２から明らかなように、対照のキャリアを用いない場合と比較して、ＳＭおよびＰＩ９とも高い徐放性を示した。ＳＭとＰＩ９とを比較した場合、実施例１と同様にＳＭのほうがわずかに徐放性の程度が高い傾向が認められたが、有意な差はなかった。 The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 2, both SM and PI9 showed higher sustained release properties than when the control carrier was not used. When SM and PI9 were compared, SM had a tendency to have a slightly higher degree of sustained release as in Example 1, but there was no significant difference.
〔実施例３：ラット頭蓋骨欠損モデルにおける骨再生能の検討〕
（１）被検物質
ゼラチンハイドロゲルは、上記実施例２と同じＳＭおよびＰＩ９を用いた。ゼラチンハイドロゲルを直径６ｍｍの円形に成形し、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水を溶媒として０．１、１．０および５．０（μｇ／２０μｌ）に濃度調整したＢＭＰ２Ｔ４溶液２０μｌを４℃、２４時間含浸させた。
[Example 3: Examination of bone regeneration ability in rat skull defect model]
(1) Test substance The same SM and PI9 as in Example 2 were used as the gelatin hydrogel. Gelatin hydrogel was molded into a circle with a diameter of 6 mm, and impregnated with 20 μl of BMP2T4 solution adjusted to concentrations of 0.1, 1.0 and 5.0 (μg / 20 μl) using sterile MilliQ water as a solvent at 4 ° C. for 24 hours. .
（２）ラット頭蓋骨欠損モデル
Wister系ラット（雄性、８週例、220〜240ｇ、日本クレア株式会社、東京）の頭蓋骨に、トレフィンバー（ブローネマルク社製）を用い、直径６．２ｍｍの円形の全層骨欠損部を作製し、各用量のＢＭＰ２Ｔ４溶液を含むＳＭもしくはＰＩ９を欠損部に填塞した。その後、絹糸（MANI社製）にて骨膜および皮膚を縫合した。また、対照として頭蓋骨に欠損部を作製し、薬剤を填塞せずにそのまま縫合した群を設けた。なお、１群当たり５匹のラットを使用した。
(2) Rat skull defect model
Using a trephine bar (manufactured by Brunemark) on the skull of a Wister rat (male, 8 weeks old, 220-240 g, Clea Japan Co., Tokyo), a circular full-thickness bone defect with a diameter of 6.2 mm was produced. Then, SM or PI9 containing each dose of BMP2T4 solution was filled in the defect. Thereafter, the periosteum and the skin were sutured with silk thread (mani). As a control, a defect was prepared in the skull, and a group was sutured as it was without filling the drug. In addition, 5 rats were used per group.
（３）サンプリングおよび骨再生の測定
治癒期間を２週、４週、８週として組織を回収した。回収した組織は軟エックス線撮影を行い、得られた画像について、画像解析ソフト（image J）を用い、骨欠損部の周囲既存骨から骨欠損部の中心を通る直線を等間隔に設け直線的な輝度を３カ所測定した（図３参照）。骨欠損部を作製していないものを健常骨（natural bone）とし実験側／健常骨でradiopacity ratioを算定した。
(3) Measurement of sampling and bone regeneration Tissues were collected with healing periods of 2, 4, and 8 weeks. The collected tissue is subjected to soft X-ray photography, and the obtained image is linearly arranged by using image analysis software (image J), with straight lines passing from the existing bone around the bone defect part to the center of the bone defect part at equal intervals. The luminance was measured at three locations (see FIG. 3). Radiopacity ratio was calculated on the experimental side / healthy bone as a natural bone that did not produce a bone defect.
（４）結果
図４に、ＢＭＰ２Ｔ４填塞４週間後の軟エックス線写真の輝度のスキャンチャートを示した。（ａ）はＳＭの結果であり、（ｂ）はＰＩ９結果である。図４においてnatural boneは欠損部を作製していない頭蓋骨を表し、controlは薬剤を填塞していない対照群を表す。図４（ａ）および（ｂ）から明らかなように、ＳＭを用いた場合、５．０μｇの用量においても欠損部の骨は殆ど再生していなかった。一方、ＰＩ９を用いた場合、用量５．０μｇではほぼ欠損部の骨が再生していた。
(4) Results FIG. 4 shows a brightness scan chart of the soft X-ray photograph after 4 weeks of BMP2T4 filling. (A) is the SM result and (b) is the PI9 result. In FIG. 4, natural bone represents a skull without a defect, and control represents a control group not filled with a drug. As is clear from FIGS. 4 (a) and (b), when SM was used, the bone at the defect was hardly regenerated even at a dose of 5.0 μg. On the other hand, when PI9 was used, the bone in the defective part was almost regenerated at a dose of 5.0 μg.
図５にＰＩ９およびＳＭの各サンプリング時の骨再生の程度を示した。また、図６には８週間後の骨再生の程度と用量との関係を示した。図５および図６において縦軸の数値が１００であれば欠損部の骨が再生していると認められる。また、contは薬剤を填塞していない対照群である。図５および図６から、ＰＩ９は４週間後においてほぼ欠損部の骨が再生しており、８週間目の再生の程度から明らかな用量依存性が認められることがわかる。一方、実施例１および２の結果から最も高い骨再生能を有することが期待されたＳＭは、予想に反してＰＩ９よりラット頭蓋骨における骨再生能が低いことが明らかとなった。 FIG. 5 shows the degree of bone regeneration at each sampling of PI9 and SM. FIG. 6 shows the relationship between the degree of bone regeneration and the dose after 8 weeks. In FIGS. 5 and 6, if the numerical value on the vertical axis is 100, it is recognized that the bone of the defect is regenerated. In addition, cont is a control group not filled with the drug. 5 and 6, it can be seen that PI9 has almost completely regenerated bone after 4 weeks, and a clear dose dependency is recognized from the degree of regeneration at 8 weeks. On the other hand, from the results of Examples 1 and 2, it was revealed that SM, which was expected to have the highest bone regeneration ability, had lower bone regeneration ability in the rat skull than PI9, contrary to expectation.
本発明は、製薬産業に利用可能である。 The present invention is applicable to the pharmaceutical industry.
Claims (7)
（ａ）リジン−ヒスチジン−リジン
（ｂ）アルギニン−リジン−アルギニン The sustained-release pharmaceutical composition for bone formation according to claim 2, wherein the heparin-binding domain sequence is at least one of the following (a) and (b).
(A) lysine-histidine-lysine (b) arginine-lysine-arginine
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（４）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列 6. The sustained release pharmaceutical composition for bone formation according to claim 5, wherein the modified BMP comprises an amino acid sequence selected from the following (1) to (4).
(1) amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2) amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (3) in SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence shown (4) Amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
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| WO2011021706A1 (en) | 2009-08-19 | 2011-02-24 | 国立大学法人東北大学 | Sheet for corneal transplants |
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