JP2007512536A

JP2007512536A - クワイエットゾーン中の質量スペクトルデータの分析

Info

Publication number: JP2007512536A
Application number: JP2006541512A
Authority: JP
Inventors: デレルジェイ．シー．パッピン，
Original assignee: アプレラコーポレイション
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2007-05-17
Anticipated expiration: 2024-11-24
Also published as: WO2005054871A3; JP4838725B2; CA2542941C; WO2005054871A2; US20050153456A1; CA2542941A1; DE602004009824T2; US20110236982A1; EP1687638B1; ATE377193T1; EP1687638A2; DE602004009824D1

Abstract

本発明の実施形態は、クワイエットゾーンにおける質量スペクトルデータの分析に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、質量スペクトル中のクワイエットゾーンにおいて、標識および／または標識された分析物の分析に有用である、方法、システム、および／または組成物に関する。上記分析を、クワイエットゾーンに向けることより、上記分析のダイナミックレンジを極大化することが可能である。これは、分析物の定性的分析および／または定量的分析に有用であり得る。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／５４７，３７５号の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、本明細書中に参考として援用される。

（本発明の分野）
本発明の実施形態は、質量スペクトルデータの分析に関する。

（序論）
いくつかの実施形態において、本発明は、質量スペクトルのクワイエットゾーンにおいて、標識および／または標識された分析物の分析に有用である、方法、システム、および／または組成物に関する。この方法、システム、および／または組成物は、上記標識された分析物を生成するために使用され得る標識化試薬を、利用し得る。いくつかの実施形態において、上記標識化試薬は、同位体濃縮され得る。上記標識化試薬が、同位体濃縮され得るので、質量分析計中の標識のフラグメンテーションによって生成された標識フラグメントイオンが、いくつかの実施形態において、異なるピーク配置の同位体クラスターを生成し得る。上記標識またはそれらの標識イオンの分析は、いくつかの実施形態において、１つ以上のサンプル中の分析物の同一性および／または量を決定するために、使用され得る。

本発明のいくつかの実施形態に従って、上記質量スペクトル中において観察される上記同位体クラスターを生成するためにフラグメントにする上記標識化試薬は、質量スペクトルの至るところにある「クワイエットゾーン」を対象とし得る。この「クワイエットゾーン」は、決定される分析物の型に依存し得る。例えば、上記クワイエットゾーンは、分析物の型（例えば、ペプチド）の多数のスペクトルについての強度の情報を決定し、この強度の情報を合計し、そして、この合計した結果からの「クワイエットゾーン」を決定することによって、決定され得る。上記「クワイエットゾーン」とは、上記分析物の型を合計した結果中に、質量強度の情報がわずかに存在するかまたは何も存在しない領域のことである。上記分析を、分析物のフラグメントイオンがわずかに検出されるかまたは何も検出されない上記クワイエットゾーンに向けることより、上記標識フラグメントイオンの決定に基づく、任意の上記標識の定性的分析および／または定量的分析の信頼性を改善することが可能となる。

（定義）
本明細書を解釈することを目的として、以下の定義を適用し、適切であれば、単数形で使用される用語は、複数形をも含み、逆の場合もまた同様である。

本明細書中で使用される「分析物」とは、決定され得る対象となる分子を呼ぶ。分析物の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡの両方の核酸）、炭水化物、脂質、および１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量の低分子が挙げられるが、限定はされない。上記分析物または上記分析物を含むサンプルの供給源には、制限はなく、任意の供給源に由来し得る。上記分析物は、天然物かまたは合成物であり得る。上記分析物または上記分析物を含むサンプルの供給源の非限定的な例としては、細胞もしくは組織、またはそれらの培養物（もしくは継代培養物）が挙げられる。分析物の供給源の他の非限定的な例としては、粗製な細胞可溶化物または処理済み細胞可溶化物、体液、組織抽出物、細胞抽出物または分離プロセス（例えば、クロマトグラフ分離、１次元電気泳動分離、２次元電気泳動分離、またはキャピラリー電気泳動分離）からの細胞画分（もしくは部分）が挙げられるが、限定はされない。体液としては、唾液、血液、尿、糞便、脳脊髄液、羊水、リンパ液、または腺分泌物からの液体が挙げられるが、限定はされない。処理済み細胞可溶化物により、細胞可溶化物が処理されており、細胞を溶解するために必要なその処理に加えて、その処理よって収集された材料のさらなる処理が実施されていることを意味する。例えば、上記サンプルは、１つ以上の分析物を含む細胞可溶化物であり得る。この分析物は、タンパク質分解酵素でこの細胞可溶化物を処理して、ペプチド前駆体またはタンパク質前駆体へと切断することによって、形成されたペプチドである。

本明細書中で使用される「フラグメンテーション」とは、共有結合を切断することを呼ぶ。

本明細書中で使用される「フラグメント（フラグメントにする）」とは、フラグメンテーションの生成物（名詞）か、またはフラグメンテーションを生じる操作（動詞）のことを呼ぶ。

本明細書中で使用される「同位体クラスター」とは、単一の化合物（例えば、標識）と関連する、質量スペクトル中の強度ピークのグループ化したものを呼ぶ。この化合物または標識は、同位体濃縮され得る。上記同位体クラスターは、単一のメイン同位体ピークと、２つ以上のサイドピークを含み得る。このサイドピークは、このメイン同位体ピークよりもより低い強度であり得、そして、このメインピークの低質量側および高質量側に位置し得る。上記メインピークとサイドピークとの間の分離は、自然数（例えば、１、２、３などのＤａ）で決定され得るが、この分離はまた、非自然数（例えば、０．５、１．２など）として決定され得る。例えば、ＸＤａでメインピークを有する同位体クラスターは、Ｘ＋１Ｄａにある少なくとも１つの高質量側のサイドピークの強度寄与、および、Ｘ−１Ｄａにある少なくとも１つの低質量側のサイドピークの強度寄与を含む。

本明細書中に使用される「同位体濃縮」とは、１つ以上の高質量同位体または「重」同位体（例えば、重水素、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^３７Ｃｌ、または^８１Ｂｒのような安定同位体）で、濃縮されている化合物（例えば、標識、標識化試薬、または標識フラグメントイオン）を呼ぶ。「濃縮」されるとは、天然同位体の存在比を超える高質量同位体を、化合物へ導入するプロセスの適用を意味する。化合物またはフラグメントが少なくとも１つの高質量同位体を含む場合、時折、この化合物またはフラグメントを、「重い」と呼ぶ。同位体濃縮が、１００％効果的ではないので、上記化合物に不純物が含まれ得、これは、濃縮のより劣った状態であり、かつより低い質量を有し得る。同様に、過度の濃縮（望まれない濃縮）と天然同位体の存在比に起因して、より大きな質量の不純物が含まれ得る。このことが、単一の同位体濃縮された化合物（またはそれらの一部）のサンプルが、質量分析計中で分析される場合に、大部分の化合物の性状であるメインピークに加えて、少なくとも１つの高質量側のサイドピーク、および少なくとも１つの低質量側のサイドピークを有する、フラグメントイオンの同位体クラスターを生成する理由である。

本明細書中に使用される「天然同位体の存在比」は、天然の同位体の自然界での存在率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）に基づいて、化合物中で発見された１つ以上の同位体のレベル（または分配）を呼ぶ。例えば、生きている植物物質から得た天然化合物は、代表的には、^１２Ｃと比較して１．０８％の^１３Ｃを含む。

本明細書中で使用される「標識」とは、決定のために分析物に印をつけるのに適した１部分である。用語標識は、用語タグおよび印、ならびに他の同等の用語および語句と同義である。例えば、標識された分析物は、タグ化された分析物、または印付けされた分析物として呼ばれ得る。標識は、溶液中で使用され得るか、または固体支持体と合わせて使用され得る。従って、標識化試薬または標識された分析物は、溶液中に存在し得るか、または固体支持体に沈殿し得るか、もしくは結合し得る。

本明細書中で使用される「標識フラグメントイオン」とは、標識の少なくとも１部分を含むイオンをいう。この「標識フラグメントイオン」は、質量分析計中で上記標識のフラグメンテーションによって生成され得る。上記標識は、分析物に結合していようとも結合していなくとも、質量分析計中でフラグメントとなり得る。上記標識フラグメントイオンは、代表的には、上記分析物のフラグメンテーションによって生成されたイオンではない。

本明細書中で使用される「支持体」、「固体支持体」、または「固体キャリア」とは、任意の固相材料をいう。標識化試薬は、支持体に固定化され得、その後、１つ以上の分析物を標識するのに使用され得る。分析物は、支持体に固定化され得、その後、標識化試薬で標識され得る。標識化分析物は、処理のための支持体に固定化され得る。固体支持体は、用語（例えば、「樹脂」、「合成支持体」、「固相」、「面」、「膜」、および／または「支持体」）を含む。固体支持体は、有機高分子（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙ）、ポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＶＤＦ）、およびポリアクリルアミド、ならびに、それらのコポリマーおよびグラフト）から構成され得る。固体支持体はまた、無機物（例えば、ガラス、シリカ、細孔制御グラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、または逆相シリカ）であり得る。固体支持体の構成は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜、または面の形態であり得る。面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨張特性または非膨張特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、凹部もしくは他の入れ物、容器、特徴もしくは位置を有する形態で構成され得る。複数の固体支持体は、種々の位置（ロボットを利用した試薬の送達のためか、あるいは検出方法および／または検出システムによって、アドレス指定が可能である位置）にあるアレイ中に構成され得る。

（本発明の種々の実施形態の説明）
いくつかの実施形態において、本発明は、質量スペクトル中のクワイエットゾーンにおいて、標識および／または標識された分析物の分析に有用である、方法、システム、および／または組成物に関する。上記分析を、クワイエットゾーンに向けることより、上記分析のダイナミックレンジを極大化することが可能である。これは、分析物の定性的分析および／または定量的分析に有用であり得る。

いくつかの実施形態において、重畳（ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）スペクトルは、質量分析計のような分析器から得た出力データからコンパイルされ得る。この出力データは、サンプルの分析によって生成された１つ以上のフラグメントイオンについての重畳スペクトルを構築するために使用され得る。上記重畳スペクトルは、逆重畳積分され得る。逆重畳積分は、１つ以上の同位体クラスターのフラグメントイオンについての正規化されたピーク強度情報を提供し得る。上記同位体クラスターは、上記質量スペクトルのクワイエットゾーンに向けられ得る。上記同位体クラスターについての正規化されたピーク強度が、決定され得、かつ、上記同位体クラスターのピーク強度が、特定の標識を規定し得るので、上記正規化されたピーク強度が、１つ以上の標識のフラグメントイオン（すなわち、標識フラグメントイオン）の定性的決定および／または定量的決定の両方のために使用され得る。標識の標識フラグメントイオンの存在および／または量が、上記分析器による分析の対象とされる１つ以上のサンプル中の分析物の存在および／または量に相関し得る場合、１つ以上のサンプル中の分析物の存在および／または量が、１つ以上の標識フラグメントイオンおよびそれらに関連する同位体クラスターの定性的分析および／または定量的分析によって、決定され得る。スペクトルのこのような逆重畳積分についての例示的な方法は、同時係属中かつ共有に係る、２００４年８月１２日に出願された米国特許出願第１０／９１６，６２９号において、見出され得、米国特許出願第１０／９１６，６２９号は、本明細書中において参考として援用される。

本発明のいくつかの実施形態において、上記重畳スペクトルは、対象とするスペクトル領域を規定する。この領域とは、同位体クラスターが、分析物が標識化試薬に結合しようとも結合しなくとも標識化試薬のフラグメンテーションから生成され得る領域である。いくつかの実施形態において、上記標識化試薬は、同位体濃縮され得る。いくつかの実施形態において、上記同位体濃縮された標識化試薬は、アイソバリックおよび／または異性体であり得る。

標識された分析物のフラグメンテーションは、上記分析物についてか、上記標識についてか、または上記標識の１部分（フラグメント）についてのフラグメントイオンを生成し得る。上記標識が、同位体濃縮される場合、フラグメンテーション点に依存して、上記同位体濃縮された標識の１つ以上の重原子が、上記標識フラグメントイオン中に存在しても、または存在しなくともよい。１つより多くの重同位体が、標識に組み込まれている場合、この重同位体のいくつかは、上記質量スペクトル中で観察される上記標識フラグメントイオンとともに残るが、一方で、他の重同位体は、（例えば、ニュートラルロス（ｎｅｕｔｒａｌｌｏｓｓ）により）電荷を失うので上記質量スペクトル中では観察されないフラグメント中に残ることがありうる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの重同位体を含む上記標識フラグメントイオンは、上記質量スペクトル中で観察された同位体クラスターの主要なイオンである。

上記標識化試薬（または上記標識した分析物）のフラグメンテーションは、上記標識および／または上記標識した分析物を、解離エネルギーにさらすこと（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））により、生じ得る。各々の同位体クラスターを規定する上記標識フラグメントイオンについての正規化されたピーク強度は、この同位体クラスターを生成する標識の存在および／または量と相関し得る。各々の同位体クラスターについての情報は、分析物の存在および／または量に相関し得る。上記重畳スペクトルを規定する種々の同位体クラスターは、異なる標識または異なる標識された分析物に、それぞれ起因し得る。上記標識または標識された分析物のフラグメントイオンは、同じサンプルからか、または異なるサンプルから得られ得る。いくつかの実施形態において、上記標識または標識された分析物のフラグメントイオンは、上記分析器による分析の対象とされる１つのサンプルへと組み合わされる異なるサンプルから、得られ得る。従って、上記重畳スペクトルの分析は、１つ以上のサンプル中の１つ以上の分析物の上記定性的分析および／または定量的分析において、使用され得る。

いくつかの実施形態において、ＭＳ^ｎ分析は、タンデム質量分析計において実施される（ｎは、２以上）。ｎが２以上の分析において、イオンは、最初のＭＳ分析から選択され得、そして、次の分析のための別のＭＳ分析器に向けられ得る。上記選択されたイオンは、第二のＭＳ分析器へ向けられる前に、（フラグメンテーションを誘起するために）解離エネルギーにさらされ得る。（標識または標識された分析物の）特定のイオンを次の分析のために選択することによって、サンプルの複雑さが減少され得、その結果、サンプル中の対象としない他の分析物についてのランダムなフラグメントが質量分析から除去される。このようにして、上記選択されたイオンのフラグメントのみが、第２のまたは次の質量分析器中で検出される。例えば、上記分析物が、標識されたペプチドであり、かつフラグメンテーションの対象とされる場合、標識およびペプチドのフラグメントのみが、次に続く質量分析において、上記選択されたイオンの質量分析のスペクトル中において観察される。上記標識が、ペプチド分析のために質量スペクトルのクワイエットゾーンに向けられる場合、標識フラグメントイオンのみが、このクワイエットゾーン中で観察されるべきである。なぜなら、このペプチドについての上記可能性のあるフラグメントイオンは、これらの領域の外側に位置するからである。

分析がタンデム質量分析計で実施されることは本発明の要件ではない。さらに、上記質量分析計は、陽イオンモードまたは陰イオンモードのうちのいずれかにおいて実行され得る。本発明の実施形態と組み合わせて使用され得る、さらなる質量分析機器およびフラグメンテーション方法としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ機器中でのポストソース崩壊、および、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（飛行時間型）ＴＯＦＭＳを使用する高エネルギーＣＩＤが挙げられる。タンデム質量分析計の最近の総説については、Ｒ．ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＤ．Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｉｎＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９〜２９５（２００１）を参照のこと。また、米国特許第６，３１９，４７６号も参照のこと。これは、ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析技術の議論について、本明細書中において参考として援用される。

スペクトル中の「クワイエットゾーン」の位置は、分析される上記サンプルおよび上記分析物の性質に依存し得る。質量分析計中でのフラグメンテーションは、完全にランダムではなく、実際、特定の種類（例えば、ペプチドまたはタンパク質）の分析物に関して、ほぼ再現性がある。多くの異なる型のフラグメントイオンが、質量分析計中で生成され得るが、最も弱い結合は、代表的には、最初にフラグメントとなるものである。例えば、分析される上記サンプルが、ペプチドおよび／またはタンパク質を主に含む場合、このサンプルの質量分析計中で観察される上記フラグメントイオンは、類似するフラグメントイオンの型（例えば、より短いペプチドのイオン、アミノ酸のイオン、ならびにペプチド、およびアミノ酸の一部）を主に含む。従って、上記ペプチドおよびタンパク質の再現性のあるフラグメンテーションは、ペプチドまたはタンパク質のフラグメンテーションが、これらの特定の質量電荷比が検出可能なイオンを単に生成しない（例えば、シグナルが、弱いかまたは検出不可能であり得る）ことにより、フラグメントイオンがほとんど検出されないかまたは何も検出されないスペクトルの領域が存在するように、生じ得る。これらの質量電荷（ｍ／ｚ）スペクトル領域は、上記分析物がペプチドおよび／またはタンパク質である場合において、「クワイエットゾーン」である。核酸についてのクワイエットゾーンは、代表的には、タンパク質およびペプチドについて観察されるクワイエットゾーンとは異なる。なぜなら、質量スペクトル中での核酸のフラグメンテーションの生成物は、ペプチドのフラグメンテーションから得た生成物とは異なるからである。しかしながら、特定の種類の分析物についてのフラグメンテーションの一貫性に起因して、上記クワイエットゾーンは、代表的には、再現性があり、そして、分析物に依存的である。

特定の分析物の分析のためのクワイエットゾーンを決定するための１つの方法は、上記分析物の種類のフラグメントイオンの分析のために得られた質量スペクトルを合計し、その後、クワイエットゾーン（すなわち、上記合計された結果中において、フラグメントイオンがほとんど観察されない領域か、または何もフラグメントイオンが観察されない領域）を決定することである。上記スペクトルは、対象とする上記分析物についてランダムに選択されたスペクトルであり得る。合計される上記スペクトルは、現に収集されてもよく、またはそれらのスペクトルは、（例えば、データベースによって提供された）ヒストリカルであってもよい。従って、合計されるべきスペクトルの供給源に、制限はない。

一旦、クワイエットゾーンが確立されると、クワイエットゾーン中において標識フラグメントイオンを生成する標識化試薬が、化合物のフラグメンテーションパターンの知識に基づいて選択され得る。同位体濃縮された標識に関して、上記可能性のある同位体、および上記標識化試薬内のそれらの分布が、考慮されるべきであり、その結果、上記標識フラグメントイオンが、クワイエットゾーンへ向けられる。例えば、アイソバリックおよび／または異性体の標識化試薬は、セット内で、全ての上記標識が、１つ以上のクワイエットゾーン内で標識フラグメントイオンを生成するが、上記セットの各々の標識は、各々の異なる標識が、クワイエットゾーン内で独特の質量荷電比を有する独特の標識フラグメントイオンを生成するように、同位体の異なる分布を含み得るように調製され得る。このようにして、標識の各々のセットが、独立して、決定および／または定量され得る。

図１および実施例１を参照して、ペプチド／タンパク質分析の、約７５，０００のランダムヒストリカルスペクトルについて合計した強度データの複合体が、提示される。０〜７５原子質量単位（ａｍｕ）の拡大プロット（図２）、７６〜１５０ａｍｕ（図３）、および１５１〜２２５（ａｍｕ）（図４）もまた、提示される。クワイエットゾーンは、上記複合スペクトルまたは上記拡大プロットについて、目視検査によってかまたはプログラム化された分析によって、決定され得る。表１は、上記複合スペクトルまたは上記拡大プロットの目視検査によって得られた「クワイエットゾーン」を列挙する。「クワイエットゾーン」とは、上記合計した強度データ中において、ピーク強度がほとんど観察されないかまたは何も観察されない領域である質量スペクトル領域を含む。

（表１：ペプチドおよびタンパク質に関する標識フラグメントイオン（ｍ／ｚ）の選択のための潜在的な「クワイエットゾーン」）

従って、いくつかの実施形態において、本発明は、選択された分析物について得られた代表的な数のフラグメンテーションスペクトルの強度を合計し、それによって複合スペクトルを得る工程を包含する方法に関する。「フラグメンテーションスペクトル」により、本発明者らは、上記サンプル中の分析物の分子の少なくとも１部分をフラグメンテーションするために十分な解離エネルギーに分析物がさらされた後に得られたスペクトルを意味する。代表的な数により、本発明者らは、上記選択された分析物について代表的に観察される、大きなセットの可能性のあるフラグメントについての強度データを提供するスペクトルの十分な数を意味する。例えば、対象となる上記分析物の少なくとも１，０００の質量スペクトルが、合計され得る。その後、上記複合スペクトルのクワイエットゾーンは、上記複合スペクトルの分析から決定され得る。

クワイエットゾーン決定の信頼度は、上記合計した結果を生成するために使用されるスペクトルの数に依存し得る。合計した結果を生成するために使用されるスペクトルの数がより多ければ多いほど、信頼度が高くなり、指定されたクワイエットゾーンにおいて、干渉がほとんどないかまたは何も干渉がなくなる。いくつかの実施形態において、少なくとも５，０００スペクトルの強度が、合計され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１０，０００スペクトルの強度が、合計され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２５，０００スペクトルの強度が、合計され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも５０，０００スペクトルの強度が、合計され得る。いくつかの実施形態において、なおさらに多くのスペクトルを合計することが、可能であるか、または望ましい。いくつかの実施形態において、上記合計されるスペクトルは、ランダムに選択される。上記合計されるスペクトルは、現に収集されてもよく、またはそれらのスペクトルは、（例えば、データベースのアーカイブによって提供される）ヒストリカルであり得る。

いくつかの実施形態において、上記方法は、１つ以上の標識化試薬を選択する工程であって、この標識化試薬が、選択された分析物を標識するために使用される場合、質量分析計中でフラグメント化され、複合スペクトルの１つのクワイエットゾーン中に位置し、質量電荷比を有する少なくとも１つの標識フラグメントイオンを生成する工程を、さらに包含し得る。フラグメンテーションして、クワイエットゾーンへ向ける標識フラグメントイオンを生成する標識化試薬を選択することにより、この標識フラグメントイオンの分析、および特に定量が、非常に信頼でき得る。いくつかの実施形態において、２つ以上のアイソバリックまたは異性体の標識化試薬が、同じ分析物を標識するために使用され得る。ここで、上記標識化試薬は、フラグメンテーションして、原子質量単位（すなわち、ダルトン）が１つ異なるフラグメントイオンを生成し、ここで、各々の異なる標識化試薬からのフラグメントは、対象となる上記分析物についての１つのクワイエットゾーン中に位置する質量電荷比を有する。いくつかの形態において、２つの同位体クラスターの各々の上記メインピークは、１ダルドンで隔てられ得る。

いくつかの実施形態において、上記選択された標識化試薬は、同位体濃縮され得る。この同位体濃縮された標識化試薬は、分析物を標識するために使用され得る。上記同位体濃縮された標識化試薬を使用するいくつかの実施形態において、上記方法は、ペプチドまたはタンパク質（またはペプチドもしくはタンパク質を含むサンプル）を、上記選択された標識化試薬で標識する工程を、さらに包含し得る。上記同位体濃縮された標識化試薬を使用するいくつかの実施形態において、上記方法は、核酸（または核酸を含むサンプル）を、上記選択された標識化試薬で標識する工程を、さらに包含し得る。上記分析物の性質に関係なく、上記方法は、質量分析計中で、上記標識された分析物のフラグメンテーションにより生成された少なくとも１つの標識フラグメントイオンを、上記選択された分析物の型のクワイエットゾーン中で検出する工程をさらに包含し得る。表１は、ペプチドまたはタンパク質である分析物の分析のためのクワイエットゾーンを列挙する。

いくつの実施形態において、上記指定された「クワイエットゾーン」は、２つ以上の異なる分析物の型の複合体について決定され得る。例えば、サンプルがペプチドおよび核酸を含む場合、フラグメント化されたペプチドおよびフラグメント化された核酸の両方についての、強度スペクトルおよび／または表データの複合体が、作成され得、かつ分析され得、それによって、２つ以上の分析物の型の複合体についての「クワイエットゾーン」が決定され得る。本発明の方法、システム、および／または組成物の実施形態が、１つより多くの選択された分析物に、この様式で適用され得ることが自明とされるべきである。

いくつかの実施形態において、上記標識化試薬は、２５０ａｍｕ未満の質量電荷比を有する標識フラグメントイオンを生成する低分子であり得る。例えば、標識フラグメントイオンを生成する標識は、ピペリジン化合物、ピペラジン化合物、またはモルホリン化合物由来であり得る。例えば、上記標識された分析物は、以下の式：

の化合物であり得、ここで、
Ｚが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ^１であり；
各Ｊが、同じであるかまたは異なり、そして各Ｊが、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ^１、ＯＲ^１、ＳＲ^１、ＮＨＲ^１、Ｎ（Ｒ^１）_２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり；
Ｗが、環窒素に対して、オルト、メタ、またはパラの位置にある原子または基であり、そして、ＮＨ、Ｎ−Ｒ^１、Ｎ−Ｒ^２、Ｐ−Ｒ^１、Ｐ−Ｒ^２、Ｏ、またはＳであり；
複素環式環の各炭素が、式ＣＪ_２を有し；
各Ｒ^１が、同じであるかまたは異なり、そして各Ｒ^１が、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基であり、このアルキル基は、必要に応じて、ヘテロ原子、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含み得、ここで、上記アルキル基および上記アリール基の炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含み；そして
Ｒ^２が、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、チオアルキル基、または、試薬を固体支持体に切断可能に連結する切断可能なリンカーであり、ここで、上記アミノアルキル基、上記ヒドロキシルアルキル基、または上記チオアルキル基が、１〜８個の炭素原子を含み、これらの基、必要に応じて、ヘテロ原子、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、上記アルキル基および上記アリール基の炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含む。ペプチド分析に有用なピペラジン標識化試薬のいくつかの実施形態は、１１３〜１１９ａｍｕのクワイエットゾーン中で、標識フラグメントイオンを生成し得る（図５参照）。この標識化試薬は、同位体濃縮され得る。上記標識化試薬は、異性体またはアイソバリックであり得る。適切な標識化試薬（異性体またはアイソバリックの標識化試薬のセットを含む）の他の非限定的な例は、同時係属中かつ共有に係る国際特許出願第ＷＯ２００４／０７０３５２号において見出され得、国際特許出願第ＷＯ２００４／０７０３５２号は、本明細書中において参考として援用される。

図５は、分析物（例えば、ペプチドまたはタンパク質）を標識するために使用され得る、ピペラジンに基づく同位体濃縮された４つのアイソバリック標識化試薬のセットの説明図である。それらが、アイソバリックであるので、重同位体の独特な分布にもかかわらず、それらは、同じ構造および同じ質量を含む。説明図が示すように、これらの４つの標識化試薬は、同様にフラグメント化する。しかしながら、各々の標識化試薬内の重同位体の独特の分布に起因して、各々の４つの標識化試薬は、セット内に独特の質量電荷比を有する標識フラグメントイオンを生成する。具体的には、この４つの標識フラグメントイオンの質量電荷比は、１１４〜１１７ｍ／ｚの範囲内において、１ダルトンで隔てられる。従って、これらの標識フラグメントイオンは、図３中で観察され、かつ表１中で同定されるようなペプチド／タンパク質分析のために、１１２〜１１９ｍ／ｚのクワイエットゾーンへ向けられる。

いくつかの実施形態において、本発明は、質量分析計中の標識された分析物のフラグメンテーションによって生成された標識フラグメントイオンを、質量分析計中で検出する工程を包含する方法に関する。ここで、この標識フラグメントイオンは、この選択された分析物についてのクワイエットゾーンにおける質量荷電比を有する。上記標識された標識は、同位体濃縮され得る。上記標識フラグメントイオンを生成する標識は、異性体かまたはアイソバリックであり得る。上記標識された分析物は、任意の分析物であり得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、質量分析計中の標識された分析物のフラグメンテーションによって生成された標識フラグメントイオンに関する。この標識フラグメントイオンは、この選択された分析物についてのクワイエットゾーンにおける質量荷電比を有する。上記標識フラグメントイオンを生成する標識は、同位体濃縮され得る。いくつかの実施形態において、上記標識フラグメントイオンは、２つの異なる重同位体（例えば、少なくとも１つの^１３Ｃ、および少なくとも１つの^１５Ｎ）を含み得る。上記標識フラグメントイオンを生成する標識は、異性体かまたはアイソバリックであり得る。上記標識された分析物は、任意の分析物であり得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、質量分析計中の標識された生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、脂質など）のフラグメンテーションによって生成された、標識フラグメントイオンに関する。この標識フラグメントイオンは、生体分子の予想されたフラグメントが低い強度であるかまたは何も強度がない質量スペクトルの領域において、質量電荷比を有する。例えば、ペプチドの予想されたフラグメントとしては、アミノ酸と、より短いペプチドと、それらのフラグメントが挙げられる。上記標識フラグメントを生成する標識は、同位体濃縮され得る。上記標識フラグメントイオンを生成する標識は、異性体かまたはアイソバリックであり得る。上記標識された分析物は、任意の分析物であり得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、質量分析計中の標識された生体分子のフラグメンテーションによって生成された標識フラグメントイオンに関する。この標識フラグメントイオンは、生体分子の予想されたフラグメントが低い強度のものであるかまたは存在しない質量スペクトルの領域において、質量電荷比を有する。上記標識フラグメントイオンを生成する標識は、同位体濃縮され得る。いくつかの実施形態において、上記標識フラグメントイオンが、２つの異なる重同位体（例えば、少なくとも１つの^１３Ｃ、および少なくとも１つの^１５Ｎ）を含み得る。上記標識フラグメントイオンを生成する標識は、異性体かまたはアイソバリックであり得る。上記標識された分析物は、任意の分析物であり得る。

なおいくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中で上述のように上記標識されたフラグメントイオンを生成する標識された分析物と組み合わせた、質量分析器（例えば、質量分析計）に関する。なおいくつかの他の実施形態において、本発明は、本明細書中で上述の方法うちのいずれかの操作と組み合わせた、質量分析器（例えば、質量分析計）に関する。

図６は、本発明のいくつかの実施形態が実施され得るシステムのブロック図である。図６において、重畳スペクトル供給源６１０は、コンピューターシステム６２０と連結され得る。重畳スペクトル供給源６１０としては、例えば、質量分析計（ＭＳ）（ポストソース崩壊をし得る質量分析計を含む）、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ^ｎ、四重極ＭＳ、ならびにヒストリカルＭＳ分析からのデータファイルが挙げられ得るが、限定はされない。コンピューターシステム６２０は、ディスプレイ６２４と入力装置６２６（例えば、キーボード）とに連結した処理装置６２２を備え得る。他の入力装置６２６としては、電子式表示タブレット（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｗｒｉｔｉｎｇｔａｂｌｅｔ）、マウス、音声起動入力装置などが挙げられ得るが、限定はされない。処理装置６２２としては、メモリおよび大容量記憶装置と連結したプロセッサ（例えば、マイクロプロセッサ、またはマルチプロセッサ）が挙げられ得るが、限定はされない。処理装置６２２に関する可能性のある構成を限定することを、決して意図するわけではないが、例えば、上記プロセッサとしては、マイクロプロセッサが挙げられ得、上記メモリとしては、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）が挙げられ得、そして上記大容量記憶装置としては、ハードディスク装置が挙げられ得るが、限定はされない。コンピューターシステム６２０は、重畳スペクトルデータ、ヒストリカルスペクトル、および／または公知の同位体クラスター情報を重畳スペクトルデータ供給源６１０から受け取り得、そして、この重畳スペクトルデータを、この公知の同位体クラスター情報を用いて、逆重畳積分し得る。

図７は、本発明のいくつかの実施形態が実施され得る別のシステムのブロック図である。図７において、重畳スペクトル供給源６１０と、図６からのコンピューターシステム６２０とは、ネットワーク７１０（例えば、通信ネットワーク、インターネット、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、およびワイヤレスネットワーク）を介して、図７において連結され得る。図７中のシステムの操作ならびに類似の構成要素は、重畳スペクトル供給源６１０からコンピューターシステム６２０への情報の通信が、上記ネットワーク７１０を介して行われ得る点を除いて、図６中のシステムと同じである。

図８は、本発明のいくつかの実施形態が実施され得るなお別のシステムのブロック図である。図８において、重畳スペクトル供給源６１０は、周辺サブシステム８２０（例えば、ディスプレイ装置８２２および入力装置８２４をが挙げられる）と連結され得る処理装置８１０を備え得る。処理装置８１０は、処置装置６２２に関して上述された図６のように構成され得る。図８中でのシステムの操作ならびに類似の構成要素は、処理装置８１０が、重畳スペクトル供給源６１０に配置される点を除いて、図６中のシステムと同じである。

本発明は、詳細に開示されてきたが、種々の変更、代替、および変化が本明細書中においてなされ得ることが理解されるべきである。さらに、ソフトウェアおよびハードウェアが、特定の機能を制御すると記載されるが、このような機能は、当該分野において周知のように、ソフトウェア、ハードウェア、またはソフトウェアとハードウェアの組合せのうちのいずれかを使用して、実施され得る。他の例が、特許請求の範囲で定義されたような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって容易に確かめられ得、そして行われ得る。

（発明を実施するための形態）
（実施例１：ペプチド／タンパク質分析についてのクワイエットゾーンの決定）
図１は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの４７００ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析計を使用して得た、約７５，０００のペプチドＣＩＤスペクトルを合計した強度の複合スペクトルである。上記ペプチドは、種々の供給源（酵母およびヒト細胞株ならびに組織サンプルを含む）に由来した。上記スペクトルは、可能性のあるアミノ酸配列および組成物の非常に大きな集団にまたがって観察されていた、フラグメントイオンの表示を提供することを目的とする。これらのフラグメントは、タンパク質分析および／またはペプチド分析にとって特徴的である。複合スペクトルの精密検査は、シグナルが低いかまたはシグナルがない領域が存在することを示す（図２、図３、および図４を参照のこと）。上記複合スペクトルから決定したところのペプチドサンプルについてのクワイエットゾーンのデータを、表１中にまとめる。例えば、クワイエットゾーンのうちの１つは、１１３〜１１９ａｍｕである。類似する複合スペクトル、およびクワイエットゾーンの付随した分析は、他の分析物（例えば、核酸、脂質、炭水化物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および低分子）について調製され得る。

図１は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７００質量分析器を使用して得た、ペプチド／タンパク質含有サンプルの約７５，０００のヒストリカル衝突誘起解離（ＣＩＤ）質量スペクトルを合計した強度データの結果の複合スペクトル（０〜２０００原子質量単位（ａｍｕ））である。図２は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７００質量分析器を使用して得た、ペプチド／タンパク質含有サンプルの約７５，０００のヒストリカル質量スペクトルを合計した強度データの結果の上記複合スペクトル（０〜７５ｍ／ｚ（１０〜７５についてのデータ））の拡大プロットである。図３は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７００質量分析器を使用して得た、ペプチド／タンパク質含有サンプルの約７５，０００のヒストリカル質量スペクトルを合計した強度データの結果の上記複合スペクトル（７５〜１５０ｍ／ｚ）の拡大プロットである。図４は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７００質量分析器を使用して得た、ペプチド／タンパク質含有サンプルの約７５，０００のヒストリカル質量スペクトルを合計した強度データの結果の上記複合スペクトル（１５０〜２２５ｍ／ｚ）の拡大プロットである。図５は、４つの同位体濃縮されたアイソバリック標識化試薬のセットの構造の説明図である。この試薬は、質量分析計中で、他と比べて異なる質量電荷比の標識フラグメントイオンを生成するために、それぞれフラグメント化され得る。全ての標識フラグメントイオンの質量電荷比は、ペプチド分析／タンパク質分析についてのクワイエットゾーンにある。図６は、本発明の実施形態が実施され得るシステムのブロック図である。図７は、本発明の実施形態が実施され得る別のシステムのブロック図である。図８は、本発明の実施形態が実施され得るなお別のシステムのブロック図である。

Claims

質量分析計中の標識された分析物のフラグメンテーションにより生成され、選択された分析物についてクワイエットゾーンにおける質量電荷比を有する、標識フラグメントイオン。
前記選択された分析物が、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ペプチド核酸、または１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量の低分子である、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
１つ以上の重同位体を含む、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記１つ以上の重同位体が、重水素、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^３７Ｃｌ、または^８１Ｂｒからなる群より選択される安定同位体である、請求項３に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、少なくとも１つの^１３Ｃおよび少なくとも１つの^１５Ｎを含む、請求項４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、同位体のクラスターの主要なイオンであり、少なくとも１つの重同位体を含む、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、１０〜１４ａｍｕ、１９〜２２ａｍｕ、２４〜２６ａｍｕ、３１〜３８ａｍｕ、４６〜５０ａｍｕ、１３１〜１３５ａｍｕ、１３７〜１４７ａｍｕ、１４９〜１５４ａｍｕ、１６０〜１７４ａｍｕ、１７７〜１８２ａｍｕ、１８８〜１８９ａｍｕ、２０２〜２０７ａｍｕ、２１６〜２２２ａｍｕ、または２２４〜２２６ａｍｕである、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、６１〜６９ａｍｕ、７４〜８３ａｍｕ、８９〜９７ａｍｕ、１０３〜１０９ａｍｕ、１１３〜１１９ａｍｕ、または１２１〜１２５ａｍｕである、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、４０ａｍｕ、５２ａｍｕ、５８ａｍｕ、７１ａｍｕ、１２８ａｍｕ、１５６ａｍｕ、１８４ａｍｕ、１９１ａｍｕ、または２１０ａｍｕである、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、２５０ａｍｕ未満の質量電荷比を有する、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、前記分析物から生成されたフラグメントではない、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、ピペリジン化合物、ピペラジン化合物、またはモルホリン化合物のフラグメンテーションによって生成されるフラグメントイオンである、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識された分析物が、以下の式：

の化合物であって、ここで、
Ｚが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ^１であり；
各Ｊが、同じであるかまたは異なり、そして各Ｊが、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ^１、ＯＲ^１、ＳＲ^１、ＮＨＲ^１、Ｎ（Ｒ^１）_２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり；
Ｗが、環窒素に対して、オルト、メタ、またはパラの位置にある原子かまたは基であり、そして、それらが、ＮＨ、Ｎ−Ｒ^１、Ｎ−Ｒ^２、Ｐ−Ｒ^１、Ｐ−Ｒ^２、Ｏ、またはＳであり；
複素環の各炭素が、式ＣＪ_２を有し；
各Ｒ^１が、同じであるかまたは異なり、そして各Ｒ^１が、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基であり、該アルキル基は、必要に応じて、ヘテロ原子か、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、該アルキル基および該アリール基の該炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含み；そして
Ｒ^２が、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、チオアルキル基、または、試薬を固体支持体に切断可能に連結する切断可能なリンカーであり、ここで、該アミノアルキル基、該ヒドロキシルアルキル基、または該チオアルキル基が、１〜８個の炭素原子を含み、これらの基は、必要に応じて、ヘテロ原子か、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、該アルキル基および該アリール基の該炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含む、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンの質量荷電比が、１１３〜１１９ａｍｕである、請求項１３に記載の標識フラグメントイオン。
標識された分析物の選択されたイオンを、質量分析計中で解離エネルギーにさらすことにより、前記標識フラグメントイオンを生成する、請求項１に記載の標識フラグメントイオン。
前記解離エネルギーが、衝突誘起解離である、請求項１５に記載の標識フラグメントイオン。
前記選択された分析物が、ペプチド、タンパク質、またはペプチド核酸である、請求項２に記載の標識フラグメントイオン。
前記選択された分析物が、核酸である、請求項２に記載の標識フラグメントイオン。
質量分析計中の標識された分析物のフラグメンテーションによって生成された標識フラグメントイオンを、質量分析計中で検出する工程を包含する方法であって、ここで、該標識フラグメントイオンが、選択された分析物についてのクワイエットゾーンにおける質量荷電比を有する、方法。
前記選択された分析物が、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ペプチド核酸、または１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量の低分子である、請求項１９に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが１つ以上の重同位体を含む、請求項１９に記載の方法。
前記１つ以上の重同位体が、重水素、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^３７Ｃｌ、または^８１Ｂｒからなる群より選択される安定同位体である、請求項２１に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、少なくとも１つの^１３Ｃおよび少なくとも１つの^１５Ｎを含む、請求項２２に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、同位体のクラスターの主要なイオンであり、かつ少なくとも１つの重同位体を含む、請求項１９に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、１０〜１４ａｍｕ、１９〜２２ａｍｕ、２４〜２６ａｍｕ、３１〜３８ａｍｕ、４６〜５０ａｍｕ、１３１〜１３５ａｍｕ、１３７〜１４７ａｍｕ、１４９〜１５４ａｍｕ、１６０〜１７４ａｍｕ、１７７〜１８２ａｍｕ、１８８〜１８９ａｍｕ、２０２〜２０７ａｍｕ、２１６〜２２２ａｍｕ、または２２４〜２２６ａｍｕである、請求項１９に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、６１〜６９ａｍｕ、７４〜８３ａｍｕ、８９〜９７ａｍｕ、１０３〜１０９ａｍｕ、１１３〜１１９ａｍｕ、または１２１〜１２５ａｍｕである、請求項１９に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、４０ａｍｕ、５２ａｍｕ、５８ａｍｕ、７１ａｍｕ、１２８ａｍｕ、１５６ａｍｕ、１８４ａｍｕ、１９１ａｍｕ、または２１０ａｍｕである、請求項１９に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、２５０ａｍｕ未満の質量電荷比を有する、請求項１９に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、前記分析物から生成されたフラグメントではない、請求項１９に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、ピペリジン化合物、ピペラジン化合物、またはモルホリン化合物のフラグメンテーションによって生成されるフラグメントイオンである、請求項１９に記載の方法。
前記標識された分析物が、以下の式：

の化合物であって、ここで、
Ｚが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ^１であり；
各Ｊが、同じであるかまたは異なり、そして各Ｊが、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ^１、ＯＲ^１、ＳＲ^１、ＮＨＲ^１、Ｎ（Ｒ^１）_２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり；
Ｗが、環窒素に対して、オルト、メタ、またはパラの位置にある原子かまたは基であり、そして、それらが、ＮＨ、Ｎ−Ｒ^１、Ｎ−Ｒ^２、Ｐ−Ｒ^１、Ｐ−Ｒ^２、Ｏ、またはＳであり；
複素環の各炭素が、式ＣＪ_２を有し；
各Ｒ^１が、同じであるかまたは異なり、そして各Ｒ^１が、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基であり、該アルキル基は、必要に応じて、ヘテロ原子か、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、該アルキル基および該アリール基の該炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含み；そして
Ｒ^２が、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、チオアルキル基、または、試薬を固体支持体に切断可能に連結する切断可能なリンカーであり、ここで、該アミノアルキル基、該ヒドロキシルアルキル基、または該チオアルキル基が、１〜８個の炭素原子を含み、これらの基は、必要に応じて、ヘテロ原子か、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、該アルキル基および該アリール基の該炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含む、請求項１９に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンの質量荷電比が、１１３〜１１９ａｍｕである、請求項３１に記載の方法。
前記選択された分析物が、ペプチドまたはタンパク質である、請求項２０に記載の方法。
前記選択された分析物が、核酸である、請求項２０に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、標識された分析物の選択されたイオンを、質量分析計中で解離エネルギーにさらすことによって生成される、請求項１９に記載の方法。
前記解離エネルギーが、衝突誘起解離である、請求項１９に記載の方法。
ａ）選択された分析物について得られた多くの代表的なフラグメンテーションスペクトルの強度を合計し、それによって複合スペクトルを得る工程；および
ｂ）該複合スペクトルにおいて１つ以上のクワイエットゾーンを決定する工程；
を包含する、方法。
ｃ）１つ以上の標識化試薬を選択する工程であって、該標識化試薬が前記選択された分析物を標識するために使用される場合、質量分析計中で該選択された分析物がフラグメントとなり、前記複合スペクトルのクワイエットゾーンのうちの１つに位置した質量電荷比を有する少なくとも１つの標識フラグメントを生成する、工程；
をさらに包含する、請求項３７に記載の方法。
少なくとも１，０００スペクトルの前記強度が合計される、請求項３７に記載の方法。
少なくとも５，０００スペクトルの前記強度が合計される、請求項３７に記載の方法。
少なくとも１０，０００スペクトルの前記強度が合計される、請求項３７に記載の方法。
少なくとも２５，０００スペクトルの前記強度が合計される、請求項３７に記載の方法。
少なくとも５０，０００スペクトルの前記強度が合計される、請求項３７に記載の方法。
合計される前記スペクトルが、ランダムに選択される、請求項３７に記載の方法。
合計される前記スペクトルが、すぐに収集される、請求項３７に記載の方法。
合計される前記スペクトルが、ヒストリカルである、請求項３７に記載の方法。
前記選択された分析物が、ペプチド、タンパク質、またはペプチド核酸である、請求項３７に記載の方法。
前記選択された分析物が、核酸である、請求項３７に記載の方法。
前記選択された標識化試薬が、１つ以上の重同位体を含む、請求項３８に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、少なくとも１つの^１３Ｃ、および少なくとも１つの^１５Ｎを含む、請求項４９に記載の方法。
前記１つ以上の重同位体が、重水素、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^３７Ｃｌ、または^８１Ｂｒからなる群より選択される安定同位体である、請求項４９に記載の方法。
ｄ）前記選択された分析物を、前記選択された標識化試薬で標識する工程；
ｅ）質量分析計中で、前記標識された分析物のフラグメンテーションによって生成された標識フラグメントイオンを、質量分析計中で検出する工程であって、ここで、該標識フラグメントイオンが、前記複合スペクトルのクワイエットゾーンのうちの１つに位置した質量荷電比を有する、工程
をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
前記選択された分析物が、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ペプチド核酸、または１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量の低分子である、請求項５２に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、同位体クラスターの主要なイオンであり、かつ少なくとも１つの重同位体を含む、請求項５２に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンの質量電荷比が、１０〜１４ａｍｕ、１９〜２２ａｍｕ、２４〜２６ａｍｕ、３１〜３８ａｍｕ、４６〜５０ａｍｕ、１３１〜１３５ａｍｕ、１３７〜１４７ａｍｕ、１４９〜１５４ａｍｕ、１６０〜１７４ａｍｕ、１７７〜１８２ａｍｕ、１８８〜１８９ａｍｕ、２０２〜２０７ａｍｕ、２１６〜２２２ａｍｕ、または２２４〜２２６ａｍｕである、請求項５２に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンの質量電荷比が、６１〜６９ａｍｕ、７４〜８３ａｍｕ、８９〜９７ａｍｕ、１０３〜１０９ａｍｕ、１１３〜１１９ａｍｕ、または１２１〜１２５ａｍｕである、請求項５２に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、４０ａｍｕ、５２ａｍｕ、５８ａｍｕ、７１ａｍｕ、１２８ａｍｕ、１５６ａｍｕ、１８４ａｍｕ、１９１ａｍｕ、または２１０ａｍｕである、請求項５２に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、２５０ａｍｕ未満の質量電荷比を有する、請求項５２に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、ピペリジン化合物、ピペラジン化合物、またはモルホリン化合物のフラグメンテーションによって生成されるフラグメントイオンである、請求項５２に記載の方法。
前記標識された分析物が、以下の式：

の化合物であって、ここで、
Ｚが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ^１であり；
各Ｊが、同じであるかまたは異なり、そして各Ｊが、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ^１、ＯＲ^１、ＳＲ^１、ＮＨＲ^１、Ｎ（Ｒ^１）_２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり；
Ｗが、環窒素に対して、オルト、メタ、またはパラの位置にある原子かまたは基であり、そして、それらが、ＮＨ、Ｎ−Ｒ^１、Ｎ−Ｒ^２、Ｐ−Ｒ^１、Ｐ−Ｒ^２、Ｏ、またはＳであり；
複素環の各炭素が、式ＣＪ_２を有し；
各Ｒ^１が、同じであるかまたは異なり、そして各Ｒ^１が、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基であり、該アルキル基は、必要に応じて、ヘテロ原子か、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、該アルキル基および該アリール基の該炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含み；そして
Ｒ^２が、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、チオアルキル基、または、試薬を固体支持体に切断可能に連結する切断可能なリンカーであり、ここで、該アミノアルキル基、該ヒドロキシルアルキル基、または該チオアルキル基が、１〜８個の炭素原子を含み、これらの基は、必要に応じて、ヘテロ原子か、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、該アルキル基および該アリール基の該炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含む、請求項５２に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンの質量荷電比が、１１３〜１１９ａｍｕである、請求項６０に記載の方法。
前記標識フラグメントイオンが、標識された分析物の選択されたイオンを解離エネルギーにさらすことによって生成される、請求項５２に記載の方法。
前記解離エネルギーが、衝突誘起解離である、請求項６２に記載の方法。
質量分析計中の標識された生体分子のフラグメンテーションによって生成され、生体分子の自然に生じるフラグメントが存在しないことが期待される質量スペクトルのゾーン中で、質量電荷比を有する、標識フラグメントイオン。
１つ以上の重同位体を含む、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記１つ以上の重同位体が、重水素、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^３７Ｃｌ、または^８１Ｂｒからなる群より選択される安定同位体である、請求項６５に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、少なくとも１つの^１３Ｃおよび少なくとも１つの^１５Ｎを含む、請求項６６に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、同位体のクラスターの主要なイオンであり、かつ少なくとも１つの重同位体を含む、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、１０〜１４ａｍｕ、１９〜２２ａｍｕ、２４〜２６ａｍｕ、３１〜３８ａｍｕ、４６〜５０ａｍｕ、１３１〜１３５ａｍｕ、１３７〜１４７ａｍｕ、１４９〜１５４ａｍｕ、１６０〜１７４ａｍｕ、１７７〜１８２ａｍｕ、１８８〜１８９ａｍｕ、２０２〜２０７ａｍｕ、２１６〜２２２ａｍｕ、または２２４〜２２６ａｍｕである、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、６１〜６９ａｍｕ、７４〜８３ａｍｕ、８９〜９７ａｍｕ、１０３〜１０９ａｍｕ、１１３〜１１９ａｍｕ、または１２１〜１２５ａｍｕである、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンの前記質量電荷比が、４０ａｍｕ、５２ａｍｕ、５８ａｍｕ、７１ａｍｕ、１２８ａｍｕ、１５６ａｍｕ、１８４ａｍｕ、１９１ａｍｕ、または２１０ａｍｕである、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、２５０ａｍｕ未満の質量電荷比を有する、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、前記分析物から生成されたフラグメントではない、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンが、ピペリジン化合物、ピペラジン化合物、またはモルホリン化合物のフラグメンテーションによって生成されるフラグメントイオンである、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識された分析物が、以下の式：

の化合物であって、ここで、
Ｚが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ^１であり；
各Ｊが、同じであるかまたは異なり、そして各Ｊが、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒ^１、ＯＲ^１、ＳＲ^１、ＮＨＲ^１、Ｎ（Ｒ^１）_２、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり；
Ｗが、環窒素に対して、オルト、メタ、またはパラの位置にある原子かまたは基であり、そして、それらが、ＮＨ、Ｎ−Ｒ^１、Ｎ−Ｒ^２、Ｐ−Ｒ^１、Ｐ−Ｒ^２、Ｏ、またはＳであり；
複素環の各炭素が、式ＣＪ_２を有し；
各Ｒ^１が、同じであるかまたは異なり、そして各Ｒ^１が、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基であり、該アルキル基は、必要に応じて、ヘテロ原子か、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、該アルキル基および該アリール基の該炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含み；そして
Ｒ^２が、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、チオアルキル基、または、試薬を固体支持体に切断可能に連結する切断可能なリンカーであり、ここで、該アミノアルキル基、該ヒドロキシルアルキル基、または該チオアルキル基が、１〜８個の炭素原子を含み、これらの基は、必要に応じて、ヘテロ原子か、または置換アリール基もしくは非置換アリール基を含んでいてもよく、ここで、該アルキル基および該アリール基の該炭素原子が、独立して、連結した水素原子、重水素原子、および／またはフッ素原子を含む、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記標識フラグメントイオンの質量荷電比が、１１３〜１１９ａｍｕである、請求項７５に記載の標識フラグメントイオン。
標識された分析物の選択されたイオンを、質量分析計中で解離エネルギーにさらすことにより、前記標識フラグメントイオンを生成する、請求項６４に記載の標識フラグメントイオン。
前記解離エネルギーが、衝突誘起解離である、請求項７７に記載の標識フラグメントイオン。
前記選択された分析物が、ペプチド、またはタンパク質である、請求項６５に記載の標識フラグメントイオン。
前記選択された分析物が、核酸である、請求項６５に記載の標識フラグメントイオン。
質量分析計中の標識された分析物のフラグメンテーションによって生成され、２つ以上の選択された分析物の複合体について決定された、クワイエットゾーンにおける質量荷電比を有する、標識フラグメンテーションイオン。
質量分析計中の標識された分析物のフラグメンテーションによって生成された標識フラグメントイオンを、質量分析計中で検出する工程を包含する方法であって、ここで、該標識フラグメントイオンが、２つ以上の選択された分析物の複合体について決定された、クワイエットゾーンにおける質量荷電比を有する、方法。
ａ）２つ以上の選択された分析物について得られた多くの代表的なフラグメンテーションスペクトルの強度を合計し、それによって２つ以上の分析物の型の複合スペクトルを得る工程；および
ｂ）該複合スペクトルにおいて１つ以上のクワイエットゾーンを決定する工程；
を包含する、方法。
ｃ）１つ以上の標識化試薬を選択する工程であって、該標識化試薬が前記選択された分析物を標識するために使用される場合、質量分析計中で該試薬がフラグメントとなり、前記複合スペクトルのクワイエットゾーンのうちの１つに位置し、質量電荷比を有する少なくとも１つの標識フラグメントを生成する、工程；
をさらに包含する、請求項８３に記載の方法。
ｄ）１つ以上の前記選択された分析物の型を、前記選択された標識化試薬で標識する工程；
ｅ）質量分析計中で、前記標識された分析物のフラグメンテーションによって生成された標識フラグメントイオンを、質量分析計中で検出する工程であって、ここで、該標識フラグメントイオンが、該複合スペクトルのクワイエットゾーンのうちの１つに位置した質量荷電比を有する、工程
をさらに包含する、請求項８４に記載の方法。