JP2008222603A

JP2008222603A - 神経変性疾患の予防・治療剤

Info

Publication number: JP2008222603A
Application number: JP2007060829A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Nukina; 信行貫名; Kanketsu O; 漢傑王
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2008-09-25
Also published as: US20080242680A1; EP1967192A1

Abstract

【課題】新規で有用な神経変性疾患の予防・治療剤を提供すること。
【解決手段】以下の式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する、神経変性疾患の予防・治療剤。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はそれぞれ独立して、置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ^４はハロゲンを示す。）
【選択図】なし

Description

本発明は、神経変性疾患の予防・治療剤に関する。

神経変性疾患の１つとして、原因遺伝子のＣＡＧ塩基配列の繰り返しが異常に伸長することにより、異常に伸長したグルタミン鎖を含む原因遺伝子産物が神経細胞に異常蓄積し、神経細胞死や機能異常を引き起こす疾患であるポリグルタミン病が知られている。
ポリグルタミン病としては、ハンチントン病、球脊髄筋萎縮症、脊髄小脳変性症１型、脊髄小脳変性症２型、脊髄小脳変性症３型（Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病）、脊髄小脳変性症６型、脊髄小脳変性症７型、脊髄小脳変性症１７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症などが公知である（非特許文献１）。

これらの疾患のうち、ハンチントン病は、常染色体における優性遺伝性の進行性致死性神経変性疾患であり、その罹患率は全世界でおよそ１０万人に５人（０．００５％）であり、発症年齢の中央値は３９歳であるとされている。
ハンチントン病は、運動症状（舞踏運動、ジストニア、協調運動障害、姿勢不安定）、認知症状（短期記憶、スキル習熟、企画及び組織化の欠損）、情動症状（抑うつ）を特徴とする。
ハンチントン病の臨床所見は、ハンチントン病遺伝子のエクソン１におけるＣＡＧ伸長が３５を超えたときに見られる。成人におけるハンチントン病の発症は、一般には、４０〜６０リピートのポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）長と関連しており、若年におけるハンチントン病の発症は、一般的には、７０リピートを超えるｐｏｌｙＱ長と関連している。
異常に伸長したポリグルタミンが発現されると、神経細胞において異常な凝集体が形成される。シャペロン系がその凝集を抑制しようとしているにもかかわらず、凝集抑制がうまくいかないと、細胞のタンパク質分解系プロテアソームが阻害されて、結果的に神経細胞死が引き起こされる（非特許文献２〜４）。

アミロライドは、ナトリウムチャネルを阻害することによって作用を発現するカリウム保持性の遠位利尿薬として使用される周知の化合物である。
アミロライドのアナログであるベンザミル及びフェナミルも、ナトリウムチャネルインヒビターとして知られており、これらの化合物は、肺疾患の治療に使用できることが知られている（特許文献１）。
米国特許第５６５６２５６号明細書ＲｏｓｓＣ．Ａ．，Ｎｅｕｒｏｎ３５，８１９−８２２（２００２）．Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｈ．，Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｋｏｔｌｉａｒｏｖａ，Ｓ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ａ．，Ｎａｇａｏ，Ｙ．，Ｔｏｋｕｈｉｒｏ，Ｓ．，Ｉｗａｔｓｕｂｏ，Ｔ．，Ｋａｎａｚａｗａ，Ｉ．，ａｎｄＮｕｋｉｎａ，Ｎ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ１０，２４３５−２４３８（１９９９）．Ｊａｎａ，Ｎ．Ｒ．，Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．，ａｎｄＮｕｋｉｎａ，Ｎ．，ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ９，２００９−２０１８（２０００）．Ｊａｎａ，Ｎ．Ｒ．，Ｚｅｍｓｋｏｖ，Ｅ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．，ａｎｄＮｕｋｉｎａ，Ｎ．，ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ１０，１０４９−１０５９（２００１）．

神経変性疾患の予防・治療剤は様々な点から開発が進められているが、致死性の疾患もあることから、新規で有用な予防・治療剤が依然として求められている。

本発明者らは、腎疾患や肺疾患の治療剤として使用されているアミロライド及びそのアナログが、予想外にも、神経変性疾患、特に、ＣＡＧリピートの異常伸長などに代表される異常タンパク質の分解機構の異常によって引き起こされる神経変性疾患に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は以下のとおりである。
〔１〕以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、神経変性疾患の予防・治療剤。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はそれぞれ独立して、置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ^４はハロゲンを示す。）
〔２〕Ｒ^１が、置換されていてもよい低級アルキル基又は置換されていてもよいアリール基、で置換されたアミノ基を示す、上記〔１〕に記載の予防・治療剤。
〔３〕Ｒ^１が、アリール基で置換された低級アルキル基又は非置換のアリール基、で置換されたアミノ基を示し、Ｒ^２及びＲ^３が非置換のアミノ基を示す、上記〔２〕に記載の予防・治療剤。
〔４〕Ｒ^４が塩素である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の予防・治療剤。
〔５〕式（Ｉ）で表される化合物が、アミロライド、ベンザミル又はフェナミルである、上記〔１〕に記載の予防・治療剤。
〔６〕神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選ばれる、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の予防・治療剤。
〔７〕神経変性疾患がハンチントン病である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の予防・治療剤。
〔８〕上記〔１〕に記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、プロテアソーム活性増強剤。

本発明によれば、新規な神経変性疾患の予防・治療剤を提供することができる。

本発明で提供される神経変性疾患の予防・治療剤（以下、本発明の予防・治療剤ともいう）は、以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はそれぞれ独立して、置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ^４はハロゲンを示す。）

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３で示されるアミノ基が有していてもよい置換基としては、式（Ｉ）で表される化合物が有する神経変性疾患の予防・治療効果に悪影響を与えないかぎり、いかなる置換基であってもよく、例えば、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアリール基などが挙げられるが、置換されていてもよい低級アルキル基及び置換されていてもよいアリール基が好ましい。
上記低級アルキル基の置換基としては、ハロゲン、置換又は非置換のアリール基などが挙げられるが、非置換のアリール基が好ましい。
本明細書において低級アルキル基とは、炭素数が１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル基であり、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、なかでも、炭素数が１〜６の直鎖のアルキル基が好ましく、特に、メチルが好ましい。
本明細書におけるアリール基は、ハロゲン、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいアリール基などの置換基を置換可能な位置に有していてもよいが、フェニル、ナフチルなどの非置換のアリール基が好ましく、フェニルが特に好ましい。
本明細書におけるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素などが挙げられる。
Ｒ^４で示されるハロゲンとしては、フッ素又は塩素が好ましく、塩素が特に好ましい。
式（Ｉ）で表される化合物としては、アミロライド、ベンザミル又はフェナミルが特に好ましい。
本発明の予防・治療剤が対象とする神経変性疾患としては、プロテアソーム活性を増強することによって予防・治療可能な疾患、例えば、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などが挙げられるが、ポリグルタミン病が特に好ましい。
ポリグルタミン病としては、ＣＡＧリピートの異常伸長により特徴付けられるものであれば特に限定されないが、例えば、ハンチントン病、球脊髄筋萎縮症、脊髄小脳変性症１型、脊髄小脳変性症２型、脊髄小脳変性症３型（Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病）、脊髄小脳変性症６型、脊髄小脳変性症７型、脊髄小脳変性症１７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症などが挙げられる。
ここで、ＣＡＧリピートの異常伸長とは、病因遺伝子に、３６リピート以上、好ましくは４０リピート以上のＣＡＧリピートを含むことを意味する。

本発明はまた、式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、プロテアソーム活性増強剤（以下、本発明の増強剤ともいう）を提供する。式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩は、チャネル分子に作用し、プロテアソーム活性を増強するため、プロテアソームによるタンパク質分解を促進し、タンパク質の異常な折り畳みによって生じるタンパク質凝集を抑制することができる。また、異常な折り畳みやタンパク質凝集によって生じる神経細胞死を抑制することができる。

式（Ｉ）で示される化合物は必要に応じ、薬理学的に許容される塩、水和物、溶媒和物としてもよい。薬理学的に許容される塩としては、例えば、無機酸との塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）、有機酸との塩（酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩など）などが挙げられる。

本発明の予防・治療剤及び増強剤は、そのまま又は薬理学的に許容される担体などと混合し、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの固形製剤、シロップ剤、乳剤、注射剤（皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、点滴剤を含む）などの液剤、舌下錠、バッカル剤、トローチ剤、マイクロカプセル化や徐放性コーティングを施した製剤、坐剤などの剤形で、経口又は非経口的に投与することができる。
薬理学的に許容される担体としては、製剤材料として慣用の各種有機又は無機の担体物質を用いることができ、固形製剤の場合には、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが、液状製剤の場合には、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが、適宜用いられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、香料などの各種添加物を加えてもよい。
上記剤形の製剤は、当該分野で公知の製剤方法に準じ、製造することができる。
また、本発明の予防・治療剤及び増強剤の投与対象としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなどの哺乳動物が挙げられる。

以下、実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。

試薬及び抗体
アミロライド・ＨＣｌ及びベンザミル・ＨＣｌはＡｌｅｘｉｓから、ラクタシスチンはペプチド研究所から、ＭＧ−１３２（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−アルデヒド）は和光純薬から、抗ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ抗体及び抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎから、抗ＲＦＰ抗体はＭＢＬから、抗Ｖ５抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから、入手した。特記していない場合、他の薬品はすべて、Ｓｉｇｍａから入手した。

細胞培養及び処理
３７℃の５％ＣＯ_２のインキュベーター中、神経芽細胞腫２ａ（Ｎｅｕｒｏ２ａ）細胞及びマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１０％非働化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭＬ−グルタミン、０．４ｍｇ／ｍｌＺｅｏｃｉｎ、０．４ｍｇ／ｍｌＧ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ^ＴＭＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ中に維持した。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を誘導して、１μＭｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅＡによりｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱを発現させ、５ｍＭｄｂｃＡＭＰにより神経表現型へと分化させた。アミロライド又はベンザミルを、分化・誘導時にある誘導性のＮｅｕｒｏ２ａ細胞とともにインキュベートした。ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの一過性発現については、トランスフェクション効率に干渉するのを避けるために、トランスフェクションの５時間後に試験薬物を加えた。

発現構築物
チャネルタンパク質のｍＲＮＡ配列を、取扱説明書に従い、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。各遺伝子の完全長ｍＲＮＡ配列をｎｅｓｔｅｄＰＣＲで増幅した。各ｍＲＮＡのアクセッション番号を以下に示す：ＮＨＥ−１，Ｕ５１１１２；ＮＨＥ−５，ＡＦ１１１１７３；ＮＣＸ−１，ＮＭ＿０１１４０６；ＮＣＸ−２，ＮＭ＿１４８９４６；ＮＣＸ−３，ＮＭ＿０８０４４０；ＢＮａＣ１，ＢＣ０３８５５１；ＢＮａＣ２，ＮＭ＿００９５９７。全てのプラスミドはｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｖｅｒｉｆｉｅｄであり、その発現及び予想分子量は抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてウエスタンブロットでチェックした。１７、６２又は１５０のグルタミンリピートをもつヒトｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎのトランケート型Ｎ末端をコードし、これを高感度ＧＦＰに融合して発現するため、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を用いてＷａｎｇ，Ｇ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ１０，２４３５−８（１９９９）に記載されるように、コンストラクトを作成した。単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）のｃＤＮＡは、ｐＲＳＥＴ_Ｂ中のｍＲＦＰ１に由来し、Ｍａｃｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ３４３，１９０−７（２００６）に記載されているようにして、ｐｃＤＮＡ３中にライゲーションした。ユビキチン化（ｕｂｉ）Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲｅｄ）２／Ｎ１プラスミドは、Ｋｈａｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔａｌ．ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ９８，５７６−８７（２００６）に記載されているようにして作製し、使用した。

ＤＮＡトランスフェクション
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、取扱説明書に従い、ＤＮＡをＮｅｕｒｏ２ａ細胞中に一過性トランスフェクトした。一般的には、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ及びｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ（又はＲＦＰ）の一過性発現のために、２００ｎｇ又は７０ｎｇのＤＮＡをそれぞれトランスフェクトした。細胞を５時間トランスフェクトし、培地を次の処理のために交換した。

ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）定量
凝集体の割合、ＲＦＰ又はｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の数あるいはｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ強度を定量するために、細胞のサイズ、形、強度及び培養形式におけるその他特性の変化を捕捉する数値データへと画像を自動変換する画像分析モジュール（ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を取り付けた自動蛍光顕微鏡イメージングシステム（ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩＨＣＳＲｅａｄｅｒ）を使用した。プロトコールは、取扱説明書に具体的に従い、各目的について記載し、設計した。スキャニング前に、細胞をまずＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で１時間固定し、５μｇ／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）で３０分間染色した。次いで、これをＰＢＳで２回洗浄し、ハイスループットアナリシスのために上記顕微鏡イメージングシステムに供した。細胞中の凝集体の割合を定量するために、第１のプロトコールでは、各フィールドにおけるＥＧＦＰポジティブのスポット数をカウントし、第２のプロトコールでは、同フィールドにおけるＨｏｅｃｈｓｔポジティブ核の数をカウントした。一方、ＲＦＰ／ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の定量は、単一のスキャニングプロトコールで達成できた。スキャニングは、２４ウェルプレートを用い、それぞれの実験条件下、通常、二連又は三連で行った。一般的には、３０，０００〜５０，０００個の細胞を各ウェル（約２００スキャニングフィールド）でスキャンし、ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）によって作成されたデータを、各実験の構成における少なくとも２００，０００個の細胞の定量から得た。

Ｒ６／２マウスを用いたベンザミルのインビボ研究
１４５ＣＡＧリピートを含むＨＤマウスモデルＲ６／２系は、オリジナルをＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。１２０〜１３０のＣＡＧリピート（ＰＣＲで確認）を持つマウスを、ベンザミルを使用したインビボ試験用に選択した。水に溶解したベンザミルを５ｍｇ／ｋｇ（Ｂｅｎ−５）又は１ｍｇ／ｋｇ（Ｂｅｎ−１）で、４週齢から１日１回、１週間に６回（１週間に１日は投与しない日を設けた）死亡するまで経口投与した。体重を１週間に１回測定した。ｃｌａｓｐｉｎｇ試験については、マウスを３０秒間しっぽで吊り下げ、ｃｌａｓｐｉｎｇのパターンを以下の指標に基づき、以下のレベルにグレード分けした。０：ｃｌａｓｐｉｎｇなし、１：前肢のみのｃｌａｓｐｉｎｇ、２：前肢と後肢の両方の１回又は２回のｃｌａｓｐｉｎｇ、３：前肢と後肢の両方の５秒を超えて３回以上のｃｌａｓｐｉｎｇ。ｒｏｔａ−ｒｏｄ試験については、マウスをまず４ｒｐｍで動く回転ロッド上に配置し、その速度を３００秒間で４０ｒｐｍまで直線的に増加させ、６０秒超の間４０ｒｐｍに維持した。５〜１２週齢のマウスを同じ動作速度のｒｏｔａ−ｒｏｄ試験にすべて供した。生存分布については、各マウスが生存した日数を記録し、すべての処置について集めたデータ（１３週以上生存したマウス；水，ｎ＝８；ｔｇ−Ｂｅｎ１，ｎ＝１０及びｔｇ−Ｂｅｎ５，ｎ＝９）を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析、次いでｌｏｇ−ｒａｎｋｔｅｓｔｉｎｇに付した。マウスに関連したすべての実験は、理研脳科学研究所の動物実験委員会の承認を得た。

半定量ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、取扱説明書に従って、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＤＮＡ混入の完全除去を保障するように、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してゲノムＤＮＡを設計した。全ＲＮＡ量は、２６０ｎｍでの吸収により定量した（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^ＴＭＩＩＩＲＮａｓｅＨ⁻ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して各サンプル由来の１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。ＰＣＲをサーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中で行った。各プライマーについてｍｉｄ−ｌｏｇｐｈａｓｅの増幅が得られるサイクル数をまず決定し、目的の遺伝子を引き続いて増幅した。２．５％アガロースゲルを用いて、ＰＣＲ産物を電気泳動して分離した。ＤＮＡ像をＵＶトランスイルミネーター（東洋紡）によりキャプチャし、バンド強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＣＢＩ）により定量した。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を、遺伝子発現レベルの変化のｉｎｔｅｒｎａｌｌｏａｄｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌとして働くように、各ＰＣＲ実験において増幅させた。この研究に使用したＰＣＲプライマーは以下のとおりである（Ｓｉｇｍａ又はＯｐｅｒｏｎにより合成；すべて５’から３’；Ｆ−フォワード；Ｒ−リバース）：ＮＨＥ１−ＦＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＣＧＣＧＧＣＴＴＴ（配列番号１）， −ＲＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＴ（配列番号２）；ＮＨＥ５−ＦＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＣＣＡＧ（配列番号３）， −ＲＡＡＡＧＡＣＧＧＣＣＡＡＣＡＣＧＧＣＣＡ（配列番号４）；ＮＣＸ１−ＦＴＧＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣ（配列番号５）， −ＲＴＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧＡＧＴＣＡＣＧ（配列番号６）；ＮＣＸ２−ＦＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＴＴＣＣＴＡＣＣ（配列番号７）， −ＲＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号８）；ＮＣＸ３−ＦＣＴＴＣＧＴＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡ（配列番号９）， −ＲＣＴＣＡＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＧＧＴＧＧＴ（配列番号１０）；ＢＮａＣ１−ＦＣＣＧＴＣＣＣＴＧＡＧＴＣＧＣＡＣＴＡＡ（配列番号１１）， −ＲＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＡＴＧＣ（配列番号１２）；ＢＮａＣ２−ＦＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＣＡＴＣ（配列番号１３）， −ＲＧＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＣＧＴ（配列番号１４）；ｅｇｆｐ−ＦＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ（配列番号１５）， −ＲＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡＴＣＣＣＧＧ（配列番号１６）；Ｇａｐｄｈ−ＦＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１７）， −ＲＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣ（配列番号１８）。すべてのプライマー配列をＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）にかけたところ、これらは高度に特異的であった。

ＲＮＡ干渉
１９ヌクレオチドの配列を、各遺伝子のｍＲＮＡ（アクセッション番号：ＮＨＥ−１，Ｕ５１１１２；ＮＣＸ−１，ＮＭ＿０１１４０６；ＮＣＸ−２，ＮＭ＿１４８９４６；ＮＣＸ−３，ＮＭ＿０８０４４０；ＢＮａＣ１，ＢＣ０３８５５１；ＢＮａＣ２，ＮＭ＿００９５９７）から選択した。実験時点で完全なマウスＮＨＥ−５配列はなかったので、ＲＮＡｉ実験を行い、ヒトＮＨＥ−５配列ＡＦ１１１１７３をマウスＥＳＴデータベース（ＴＧＩ）に提出し、２２の短いＥＳＴ配列にクラスタ化することによって、９１％のホモロジーの予測マウスＮＨＥ−５配列を見出した。マウスＮＨＥ５についてのｓｈＲＮＡを、これ（ＭＧＩｒｅｐｏｒｔ）に基づいて、オンライン（ｈｔｔｐ：／／ｉ．ｃｓ．ｈｋｕ．ｈｋ／〜ｓｉｒｎａ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｉｒｎａ．ｐｈｐ）で入手可能なｓｉＲＮＡＤｅｓｉｇｎＳｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳ）により設計した。このソフトウェアは、１２のｓｉＲＮＡ設計ソフトウェアを主要なバイオテクノロジーの会社から採用し、効果的なｓｉＲＮＡ配列を選択する機会を最大化するために、個々の配列の注目度をランク付けしていた。各サーチからの上位５番目までの配列をＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）にかけ、順序付けの前にそのｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙを確認した。ヘアピン骨格を持つ各センス及びアンチセンステンプレートをそれぞれ合成し（Ｏｐｅｒｏｎ）、アニールし、使用説明書（Ａｍｂｉｏｎ）に従って、Ｕ６プロモーターによって駆動するｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０ベクター中に連結した。すべてのｓｈＲＮＡ産生のためのシークエンスを含むプラスミドの配列を確認した。本研究に使用したｓｈＲＮＡ産生シークエンスを以下に示す（効果があることを試験したもの；すべて５’から３’）：ＮＨＥ１−１：ＧＧＡＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＴＴＴ（配列番号１９）；ＮＨＥ１−２：ＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＣＧＣＡＡＡ（配列番号２０）；ＮＨＥ５−１：ＧＡＧＧＡＧＴＧＡＴＴＡＣＣＡＣＡＡＡ（配列番号２１）；ＮＨＥ５−２：ＡＧＧＧＣＧＴＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴ（配列番号２２）；ＮＣＸ１−１：ＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴ（配列番号２３）；ＮＣＸ１−２：ＡＧＡＧＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧ（配列番号２４）；ＮＣＸ２−１：ＣＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＴＡＧＴＧＧ（配列番号２５）；ＮＣＸ２−２：ＧＡＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡ（配列番号２６）；ＮＣＸ３−１：ＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＣＧＴＡ（配列番号２７）；ＮＣＸ３−２：ＡＣＡＡＴＴＣＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡＴＧ（配列番号２８）；ＢＮａＣ１／ＡＳＩＣ２−１：ＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧ（配列番号２９）；ＢＮａＣ１／ＡＳＩＣ２−２：ＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣ（配列番号３０）；ＢＮａＣ２／ＡＳＩＣ１−１：ＴＣＡＡＴＧＡＧＴＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧ（配列番号３１）；ＢＮａＣ２／ＡＳＩＣ１−２：ＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＡＧＴＡＣＴＡＣＴ（配列番号３２）；ＢＮａＣ２／ＡＳＩＣ１−３：ＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡ（配列番号３３）。ＬａｃＺ：ＴＣＴＡＴＣＧＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号３４）（トランスフェクション及びサイレンシングのネガティブコントロールとして）。ｓｈＲＮＡ挿入物を含むプラスミドをＮｅｕｒｏ２ａ細胞中にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してトランスフェクトした。サイレンシングを２日間生じさせ、全ＲＮＡを集めて、半定量ＰＣＲを上記したようにして行った（転写レベルの本発明者らのｓｈＲＮＡのサイレンシング効果は、図１ａに示した）。サイレンシング効果がまた翻訳後レベルで起こることを示すために、各チャネルタンパク質の発現ベクター及びその対応するｓｈＲＮＡサイレンシングベクターをコトランスフェクトした。ＬａｃＺｓｈＲＮＡをネガティブコントロールとして使用した。図１ｂは、抗Ｖ５抗体によって明らかにされた有意なダウンレギュレーションを示している。

ウエスタンブロット
被験体となる細胞を冷ＰＢＳでリンスし、適当量の溶解緩衝液（８．６％スクロース、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＶＯ_４）、１０ｍＭフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、５０ｍＭＴｒｉｓ、０．０３８％ＥＧＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＣｏｍｐｌｅｔｅ^ＴＭ）中に溶解した。次いで、タンパク質溶解物を短時間超音波処理した。タンパク質濃度を、ＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃＡｃｉｄ（ＢＣＡ）ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し、使用説明書に従って測定した。次いで、適当量のタンパク質溶解物を４ＸＳＤＳｇｅｌ−ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４００ｍＭＤＴＴ、８％ＳＤＳ、４０％グリセロール及び適当量のブロモフェノールブルー）と混合し、１００℃で５分間沸騰させ、５〜２０％のグラジエントのポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）で分離した。引き続いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜（０．２２μｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し、その膜を、ＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｓｉｇｍａ）中５％の無脂肪乳で１時間ブロックした。次いで、ブロットを、適当に希釈した一次及びＨＲＰ結合二次抗体とともにインキュベートした（それぞれ室温で１時間。それぞれのインキュベーションの間及び後にはＴＢＳ−Ｔで十分に洗浄）。最終的に、ブロットを、ＥＣＬ溶液を使用して現像して、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ^ＴＭＭＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に感光させた。

チェイス実験
可溶性ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱがベンザミルの存在下でより早く分解するかどうかを決めるために、チェイス実験を行った。ｔＮｈｔｔ−６０Ｑを発現する誘導性Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を選択した。ｔＮｈｔｔ−６０Ｑの大部分は溶解性のままであり、いくらかの凝集体のみがインキュベーション１日後に観察されうる。手短に記載すると、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞がまず分化されて、２４時間ｔＮｈｔｔ−６０Ｑを発現するように誘導される。ＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅＡをその後除去し（ｄｂｃＡＭＰは分化状態を保ったまま）、細胞を水（コントロール）又は５０μＭのベンザミル（Ｄａｙ０）とともに、４日間（Ｄａｙ４）インキュベートした。同濃度のベンザミルを含む新鮮な培地に２日ごとに交換し、細胞をＤａｙ４まで１日１回収集した。細胞を引き続いて溶解し、可溶性ｔＮｈｔｔ−６０Ｑの発現を、抗ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ抗体（抗ｅｍ４８）を用いたウエスタンブロットにより分析した。

フィルタートラップアッセイ
フィルタートラップアッセイを、Ｈｙｂｒｉ−Ｄｏｔｍａｎｉｆｏｌｄ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）及び孔径０．２μＭのセルロースアセテートメンブレンフィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ）を使用して行った。手短に記載すると、分析の準備が整った細胞をウエスタンブロットに使用したものと同じ溶解緩衝液中に溶解し、短時間超音波処理し、上記したＢＣＡ法によりタンパク質濃度を定量した。脳のサンプルについては、まず、５ｃｍ^３ガラス管中で、１ｍｌのホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭＰＭＳＦ及びｃｏｍｐｌｅｔｅｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ）を用いて、脳組織を１５００ｒｐｍで１０回ホモジナイズした。次いで、脳溶解物を短時間超音波処理し、濃度を測定した。各実験条件からの同量のタンパク質を、ＰＢＳ中２％のＳＤＳにより１００μｌに希釈し、メンブラン上にアプライした。ウェルを２％ＳＤＳ／ＰＢＳで２回洗浄し、２０分間真空吸引して、ＳＤＳに不溶な凝集体を完全にかつしっかりとトラップした。メンブランを引き続いて５％スキムミルクでブロックし、ウエスタンブロットを続けた。

統計的分析
２つのサンプル間の比較には、ｕｎｐａｉｒｅｄｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔを使用した。複数のサンプルの比較には、Ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡＦｉｓｈｅｒ’ｓｔｅｓｔ、続いて、Ｔｕｋｅｙ’ｓＨＳＤｔｅｓｔを、信頼度９５％で使用した。異なる母集団間の有意性の測定については、ｔｗｏ−ｓａｍｐｌｅＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖｔｅｓｔを使用した。生存率については、生存分布曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用してプロットし、続いて、ｌｏｇ−ｒａｎｋｔｅｓｔｉｎｇにより求めた（すべてのデータは、ＸＬＳＴＡＴソフトウェアを使用して作成した）。比較間の差は、すべての統計的分析についてｐ＜０．０５のときに有意であるとした。

その他
イムノブロットのバンド強度は、ＥＰＳＯＮＥＳ−８０００スキャナーでスキャンした後にＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．３２ｊ、ＮＣＢＩ）で定量するか、ＦＵＪＩＦＩＬＭＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓｓｙｓｔｅｍでキャプチャし画像分析ソフトウェアを使用して分析した。１つのデータポイントから得られた値を、それ自身の内部コントロール（β−ｔｕｂｕｌｉｎ）について得られ１００％に設定した値で割った。他のデータポイントから得られた比も同様にして比較し、変化の相対比として表した。

結果
アミロライド及びベンザミルは、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集体を用量依存的に減少させた。
アミロライド（Ａｍｉ）及びその誘導体ベンザミル（Ｂｅｎ）がｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱによって形成されるタンパク質凝集体に何らかの影響を与えるかどうかを試験するために、まず、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ−ＥＧＦＰ（ｔＮｈｔｔ、Ｎ末端トランケート型Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ；ｐｏｌｙＱ、６０又は１５０のポリグルタミンリピート）の発現が１μＭｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅＡにより誘導されかつ５ｍＭＮ６，２’−Ｏ−ジブチリルアデノシン−３’，５’−環状モノリン酸ナトリウム塩（ｄｂｃＡＭＰ）［Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ１０，２４３５−８（１９９９）］での処理に応答して細胞が神経細胞様に分化されうる安定なマウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞系を採用した。Ａｍｉ及びＢｅｎが同様にして、最大５０μＭまで（図２ｂ、^＊ｐ＝０．１０５及び^＊＊ｐ＝０．００１；５０μＭ以下を細胞系における研究に亘って使用する）有意な毒性なしに、ｔＮｈｔｔ−６０Ｑ−ＥＧＦＰ及びｔＮｈｔｔ−１５０Ｑ−ＥＧＦＰ細胞質凝集体を用量依存的に減少させることが見出された（図２ａ、未処置群に対する処置群についてｐ＜０．０００１；^＊及び^＊＊ｐ＝０．０１９；^＊＊＊及び^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。Ａｍｉ及びＢｅｎはまた、ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑｎｌｓ−ＥＧＦＰ核凝集体も同様の誘導系により有意に減少させた（図２ｃ、^＊及び^＊＊ｐ＝０．０３）。Ａｍｉ及びＢｅｎがｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅＡ誘導系と干渉することによって凝集体を減少する可能性を除去するために、６２又は１５０のポリグルタミンリピートを含む発現プラスミドで、核局在シグナルペプチドの存在又は非存在下、ネイティブなＮｅｕｒｏ２ａ細胞をトランスフェクトした（図２ｄ）。誘導系で得られた結果と同様にして、両薬物は、細胞質及び核の凝集体を４０％顕著に減少させた（^＊ｐ＝０．００８；アミロライド、データ示さず）。フィルタートラップアッセイではまた、Ａｍｉ及びＢｅｎが同量のタンパク質をロードしたセルロースアセテートメンブレン上にトラップされる凝集体の量を減少させることが示された（図２ｅ）。これは、Ａｍｉ及びＢｅｎがＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩＨＣＳＲｅａｄｅｒによってキャプチャされうるＥＧＦＰ蛍光をマスキングすることによって凝集体を減少させるのではないことを示している。半定量ＰＣＲでは、Ａｍｉ及びＢｅｎがｔＮｈｔｔ−１６／６０／１５０Ｑの発現レベルに影響しないことが示されたので（図２ｆのイメージ及び図２ｇの定量）、これまで得られたデータは、これらの薬物が転写後のメカニズムを介してｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集体を減少することを示唆している。

ベンザミルは、Ｒ６／２マウスにおけるＨＤの病状を緩和する。
細胞系におけるアミロライド及びベンザミルでのｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集の有意で顕著な減少により、本発明者らは、同様の凝集抑制効果がＨＤの動物モデルでも観察されるかどうかを調べることとした。アミロライド及びベンザミルがｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙ凝集を減少させるメカニズムは不明であったが、アミロライドと比較して標的タンパク質に対する高い親和性を有する［Ｃｕｔｈｂｅｒｔ，Ａ．Ｗ．＆Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ＪＰｈａｒｍＰｈａｒｍａｃｏｌ３１，３８２−６（１９７９）］ことから、まず、マウスでの研究にはベンザミルを選択した。インビボにおけるベンザミルの有利な効果を検討するために、進行性のＨＤ症状がよくキャラクタライズされ薬物の前臨床試験に広範に使用されているＲ６／２（トランスジェニック、ｔｇ）マウスモデル［Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ，Ｌ．，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ８７，４９３−５０６（１９９６）］を採用した。Ｒ６／２マウス（１２０〜１３０のｐｏｌｙＱリピートを有する）に、Ｂｅｎ１ｍｇ／ｋｇ（Ｂｅｎ１）又は５ｍｇ／ｋｇ（Ｂｅｎ５）を１週間に６回経口投与し、比較用のコントロールとしては水を使用した（図３）。ｔｇマウスのｌｉｍｂｃｌａｓｐｉｎｇｐｏｓｔｕｒｅは、Ｂｅｎを与えた８週齢のマウス（ｔｇ−Ｂｅｎ１及びｔｇ−Ｂｅｎ５）において顕著に緩和された（図３ａ、^＊及び^＊＊ｐ＜０．０００１）。すべてのコントロールマウス（水を与えたトランスジェニックマウス）がレベル３のｃｌａｓｐｉｎｇｐｏｓｔｕｒｅに達したとき、ベンザミル１ｍｇ／ｋｇによりｃｌａｓｐｉｎｇｐｏｓｔｕｒｅの良好な緩和が得られ、１２週齢においてさえもその有利な効果は示され続けた（図３ａ、^＊＊＊ｐ＝０．００９）。トランスジェニックＲ６／２マウスにおける運動障害がベンザミルで緩和されうることを示すより客観的な評価を得るために、１ｍｇ／ｋｇのベンザミルを与えた野生型マウス及びトランスジェニックマウスでｒｏｔａ−ｒｏｄ研究を行った（図３ｂ）。野生型群においては実質的な差異はなかったが、ｔｇ−Ｂｅｎ１は、トランスジェニックマウスがｒｏｔａ−ｒｏｄ上に乗り続ける時間を大いに増大し、このことはさらに、Ｒ６／２の運動障害が顕著に減少したことを示している（図３ｂ、^＊ｐ＝０．００１５及び^＊＊ｐ＝０．０４２）。
次に、ベンザミルが脳におけるＨＤ病状を緩和するかどうかを検討した（図３ｃ及び３ｄ）。野生型、ｔｇ−ｗａｔｅｒ、ｔｇ−Ｂｅｎ１及びｔｇ−Ｂｅｎ５から脳全体の溶解物を作製した。図３ｃに示されるように、凝集体の有意な減少が、Ｂｅｎ１又はＢｅｎ５で処置したマウスで観察された。フィルタートラップメンブラン上のスポット強度の定量により、８週齢及び１２週齢の両方で、抗ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ（ｅｍ４８）抗体により検出される凝集体の３０％を超える減少が明らかとなった（図３ｄ、８週水ｖｓＢｅｎ、ｐ＝０．００３；１２週水ｖｓＢｅｎ、ｐ＝０．０４；^＊ｐ＝０．００９；^＊＊ｐ＝０．００４；^＊＊＊及び^＊＊＊＊ｐ＝０．００７）。同じタンパク質溶解物を使用したウエスタンブロットでは、β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体により明らかとなったものと同じローディングが示された（データ示さず）。ベンザミルは、実験ラットの脳脊髄液（ＣＳＦ）中に検出し定量することができたので、ベンザミルがｐｏｌｙＱ凝集の量を減少する直接効果を脳組織で発揮したと考えられた（図４）。脳の症状及び運動障害の緩和に付随して、１０週齢後のｔｇ−Ｂｅｎ１及びｔｇ−Ｂｅｎ５において、体重の有意な増加が観察された（図３ｅ、^＊ｐ＝０．０３４及び^＊＊ｐ＝０．０４４）。さらに重要なことには、Ｂｅｎ１は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法、続いてｌｏｇ−ｒａｎｋ試験で分析されたＲ６／２マウスの生存率を有意に増大した（図３ｆ）。ｔｇ−水の平均生存期間は１１４．６２５±２．４４日であり、ｔｇ−Ｂｅｎ１の平均生存期間は１２６．１±４．００１日であった（ｔｇ−水ｖｓｔｇ−Ｂｅｎ１、ｐ＝０．０２４）。ｔｇ−Ｂｅｎ５は生存率の全般的な増大を示さなかったが、水だけで処置されたマウスよりもずっと長く生存したマウスも存在した（図３ｆの黒丸のライン）。要約すると、Ｒ６／２マウスから収集したデータにより、ベンザミルがＨＤの哺乳動物モデルにおける運動障害及び症状を緩和し、生存率を増加させるという結論が得られた。

ベンザミルは、プロテアソーム活性を全般的に増強する。
ベンザミルがインビトロ（図２）及びインビボ（図３）のモデルの両方でＨＤの症状を緩和するとの確信が得られた後で、それがｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集を減少するメカニズムを検討した。Ａｍｉ及びＢｅｎが転写レベルのｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの発現レベルに影響を与えない（図２ｆ及び図２ｇ）と考えると、可溶性ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ発現の持続性の一貫性の減少の所見により、Ａｍｉ及びＢｅｎで処置した条件では分解系が増強されうると結論付けることが促された。図５ａに示し、図５ｂで定量したように、５０μＭのＡｍｉ及びＢｅｎ（図５ｂ、^＊ｐ＝０．００８、アミロライド、データ示さず）で処置したＮｅｕｒｏ２ａ細胞において、可溶性ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎの有意な減少が一貫して観察された。さらに、ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩＨＣＳＲｅａｄｅｒでキャプチャされたイメージにより、ＧＦＰポジティブな細胞の割合及びベンザミルで処置された誘導系及び一時系の両方におけるＧＦＰ強度の有意な減少があることが繰り返し示された（図５ｃ、^＊ｐ＜０．０００１）。まず、ベンザミルで処置した細胞におけるユビキチンプロテアソームシステム（ＵＰＳ）を検討した。試験を可能とするために、ユビキチンで標識されたＤｉｓｃｏｓｏｍａＲｅｄ蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）（ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ）を発現する発現構築物を使用した。ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の数及びｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ蛍光強度はインビボプロテアソーム活性を直接反映すること及びｐｏｌｙＱはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ及びインビトロ細胞ＨＤモデルの両方でＵＰＳをブロックすることが示されている［Ｋｈａｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔａｌ．ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ９８，５７６−８７（２００６）］。ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤを使用して、ベンザミル存在下でのインビボプロテアソーム活性の試験を行った。
ベンザミルがインビボプロテアソーム活性を増強しうるかどうかを試験するために、まず、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をごく少量のｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ構築物でトランスフェクトし、次いで、種々の濃度のプロテアソームインヒビターＭＧ−１３２及びベンザミルを添加した。ベンザミルは、ＭＧ−１３２によって引き起こされるプロテアソーム阻害を用量依存的に緩和することができた（図５ｄ及び図５ｅ）。ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞数をベンザミルで処置していない状態にノーマライズすることによって、ベンザミル濃度の上昇に伴うｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の段階的な減少を観察した（図５ｄ、ＭＧ−１３２ｖｓＢｅｎ、ｐ＜０．０００１；^＊ｐ＝０．０１９）。ＭＧ−１３２濃度の上昇によりｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の凝集が導かれたが、ベンザミル濃度の上昇により、ウエスタンブロットで示されるようにこの凝集が緩和された（図５ｅ）。これらのデータにより、ベンザミルにプロテアソーム活性を全般的に増大する能力があること、これが、ベンザミルがｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集をインビトロ及びインビボで減少させるメカニズムの１つであることが示唆される。

ベンザミルは、ｐｏｌｙＱ保持細胞におけるプロテアソーム活性を増大し、可溶性ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの分解を増強する。
ベンザミルが、ｐｏｌｙＱリピートを有する細胞においてプロテアソーム活性を増強するかどうかを検討した。まず、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞において３：１の比でＥＧＦＰ、１７Ｑ−ＥＧＦＰ又は１５０Ｑ−ＥＧＦＰとｕｂｉ−ｄｓＲＥＤとをコトランスフェクトし、ＥＧＦＰポジティブ細胞におけるｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ蛍光強度を定量した。図６ａに示されるように、ｐｏｌｙＱの長さに依存する増大をｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ蛍光強度において観察した（ＥＧＦＰｖｓ１７Ｑ−ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰｖｓ１７Ｑ−ＥＧＦＰ又は１７Ｑ−ＥＧＦＰｖｓ１５０Ｑ−ＥＧＦＰの分布はすべて有意に異なっている。ｔｗｏ−ｓａｍｐｌｅＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖｔｅｓｔにより分析されたｐ＜０．０００１）。これらのデータは、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱはＵＰＳをブロックすることが可能であること［Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｊ．，Ｂｅｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．，Ｊａｙａｋｕｍａｒ，Ｒ．＆Ｋｏｐｉｔｏ，Ｒ．Ｒ．ＭｏｌＣｅｌｌ１７，３５１−６５（２００５）；Ｂｅｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．，Ｓａｍｐａｔ，Ｒ．Ｍ．＆Ｋｏｐｉｔｏ，Ｒ．Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２，１５５２−５（２００１）］及びｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ構築物がｐｏｌｙＱ保持細胞におけるプロテアソーム活性を反映する有効なツールであること［Ｋｈａｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔａｌ．ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ９８，５７６−８７（２００６）］をサポートしている。
単量体のＲＦＰ（ｍＲＦＰ）［Ｍａｃｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ３４３，１９０−７（２００６）］を内部コントロールとして使用して、まず、ベンザミルの存在又は非存在下で、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ及びｕｂｉ−ｄｓＲＥＤと一過性コトランスフェクトした細胞におけるプロテアソーム活性を調べた。ＲＦＰとｐｏｌｙＱとのコトランスフェクションの場合には、凝集体及びｐｏｌｙＱの完全な同時局在が観察され、実質的にベンザミルは、この同時局在に影響を与えなかった（図６ｂ、Ａ及びＢ、並びに、図６ｃ、ＲＦＰ）。しかし、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ及びｕｂｉ−ｄｓＲＥＤが完全な同時局在を維持している一方で（図６ｂ、Ｃ〜Ｆ）、ｐｏｌｙＱ保持細胞のかなりの集団が、ベンザミルの添加により、もはやｕｂｉ−ｄｓＲＥＤとは同時局在していなかった（図６ｂのＧ〜Ｋ及び図６ｃのＵｂｉ−ｄｓＲＥＤ；^＊ｐ＜０．０００１、水ｖｓｐｏｌｙＱ）。ｐｏｌｙＱとｕｂｉ−ｄｓＲＥＤとの間の同時局在の減少と一致して、ｐｏｌｙＱ保持集団におけるｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞数（図６ｄ）及びｐｏｌｙＱ保持細胞における平均ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ強度（図６ｅ）もまた有意に減少した。抗ＲＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットでも、１０μＭのｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎを添加した場合には、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の凝集を大いに増加させるのに対し、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の凝集がベンザミル処理細胞には大部分存在していないことが明らかとなった（図６ｆ）。ＲＦＰを用いて同様の実験を行ったが、同様の結果は観察されなかった（データ示さず）。ここで示したデータは、ｐｏｌｙＱ保持細胞におけるプロテアソーム活性が顕著に増強されていることを強く示唆している。
インビボプロテアソーム活性がベンザミルの存在下で大いに増強されるならば、可溶性ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの分解が増強されると予測される。可溶性ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの分解速度がベンザミルで処置した場合にさらに速いかどうかを検討するために、ｔＮｈｔｔ−６０Ｑの発現を１日誘導し、その後、ベンザミルの添加によりそれを停止し（これをＤａｙ０とした）、タンパク質分解物をＤａｙ４まで収集する追跡実験を行った（図６ｇ）。ベンザミル処置は、ｔＮｈｔｔ−６０Ｑ発現の当初の増大（Ｄａｙ１。おそらく残留量のｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅＡによって生じる）を抑制し、その後（Ｄａｙ２から４）、水コントロールと同様の分解速度であることを示していた。Ｄａｙ３及びＤａｙ４におけるベンザミル存在下での可溶性ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの絶対量には有意な減少があり（それぞれ、^＊ｐ＝０．０３７及び^＃ｐ＝０．０３９）、可溶性ｔＮｈｔｔ−６０Ｑの半減期は、水コントロールの場合５．２９４±０．５２日、ベンザミルの場合３．８４６±０．３２日であると決定された。ｔＮｈｔｔ−１６Ｑについても同様の実験を行ったところ、水とベンザミル処置との分解速度に有意差は存在しなかった（データ示さず）。

自食作用（オートファジー）ではなくＵＰＳが、ベンザミルがｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱクリアランスを強化する主要な経路である。
ＵＰＳ系に加えて、ｐｏｌｙＱの自食性の分解は、Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎのグループによって証明され神経変性分野において非常に注目されている［Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．ｅｔａｌ．ＣｕｒｒＴｏｐＤｅｖＢｉｏｌ７６，８９−１０１（２００６）］。マクロ自食作用は、ＨＤモデルにおいてｐｏｌｙＱ凝集及び毒性を減少する重要な経路の一つであることが証明されている［Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，Ｂ．ｅｔａｌ．ＮａｔＧｅｎｅｔ３６，５８５−９５（２００４）］。ここまでに得られた証拠では、自食作用が、ＵＰＳとともに又は二次的に、ベンザミルによる可溶性又は凝集したｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの分解に関与していない可能性を排除することはできなかった。ベンザミルによるｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの分解に他の分解経路が大きな役割を果たしているかどうかを検討するために、まず、プロテアソーム経路を特異的プロテアソームインヒビターであるｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ又はＭＧ−１３２でブロックし、これらの実験条件でのｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集体数を定量した。ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ又はＭＧ−１３２によるプロテアソームの遮断により、プロテアソームインヒビター自体の添加に比べて減弱は不完全であったが、ベンザミルにより引き起こされる凝集抑制効果は減弱された（図７ａ、^＊ｐ＝０．００６；^＊＊、^＊＊＊、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。完全な無効化は、プロテアソームと（５ｍＭ３−メチルアデニンでの）自食性分解経路の両方が同時にブロックされた場合にのみ達成されうるようである（図７ｂ、^＊ｐ＝０．０９、有意ではない）。プロテアソームインヒビターで処置した細胞から調製した溶解物を抗ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体でプローブすることによっても、ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ及びＭＧ−１３２がＡｍｉ又はＢｅｎの凝集抑制効果をほぼ完全に無効にすることが明らかとなり、これは、ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）により定量したデータ（図７ｃ）と一致していた。ベンザミルが介在するｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱクリアランスにおいてマクロ自食作用が重要な役割を担っている可能性をさらに排除するために、自食遺伝子５（Ａｔｇ５）の発現がテトラサイクリンの添加によって簡単に操作できる安定なマウス胎仔線維芽（ＭＥＦ）細胞株を採用した。Ａｔｇ１２−Ａｔｇ５凝集体は、１ｎｇ／ｍｌのｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを４日間添加することにより、完全に抑制できることが示されている［Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｎ．，Ｈａｒａ，Ｙ．＆Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ５８０．２６２３−９（２００６）］。トランケート型Ｎｈｔｔ−ｐｏｌｙＱをｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅで５日間処置したＭＥＦ中にトランスフェクトし、続いて、ベンザミルを１８時間添加した。Ａｔｇ５の存在又は非存在が、凝集の度合いには実質的に影響を与えなかったことにより、マクロ自食作用がベンザミルにより引き起こされるｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱのクリアランスに必要ではないことがさらに示唆された（図７ｄ、^＊ｐ＞０．０５、有意ではない）。

ＡＳＩＣ／ＢＮａＣ及びＮＣＸＲＮＡｉは、プロテアソーム活性を増大し、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集を減少させる。
インビボプロテアソーム活性を促進することによってベンザミルがｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集を減少させるようであることが示されたので、本発明者らはＡｍｉ及びＢｅｎがプロテアソーム活性を増大する基本メカニズムを検討した。Ａｍｉ及びＢｅｎは、ＮＨＥ、ＡＳＩＣ／ＢＮａＣ及びＮＣＸなどのいくつかの共通する標的タンパク質を有する。Ａｍｉ及びＢｅｎが、これらのチャネルタンパク質を阻害することによって、プロテアソーム活性を増大させる可能性を本発明者らは考えた。
この目的のため、これらのチャネルタンパク質の発現を干渉（ＲＮＡｉ）により減少させることによって、ＮＨＥ、ＡＳＩＣ／ＢＮａＣ及びＮＣＸの薬理学的遮断を擬態することを試みた。メッセンジャーＲＮＡの様々な領域を標的とする少なくとも５つの異なるｓｈＲＮＡを設計し、Ｕ６プロモーターで駆動するｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０ベクター中にクローニングした。図１は、これらすべての遺伝子の発現レベルが、転写レベル（内因性レベル、図１ａ）と翻訳後レベル（外因性で誘導された。図１ｂ及び１ｃ）の両方で、対応するｓｈＲＮＡにより有意にブロックされたことを示している。ＲＮＡｉ実験のすべての比較コントロールとしてＬａｃＺｓｈＲＮＡ発現構築物も作製した。
まず、これらのチャネルタンパク質のブロックが、Ａｍｉ又はＢｅｎの効果と同様に、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集に影響を与えるかどうかを検討した。誘導性のＮｅｕｒｏ２ａ細胞（１５０Ｑ）をまず、各遺伝子に対応するｓｈＲＮＡで２日間トランスフェクトし、ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑを発現するように１日間誘導した。ＡＳＩＣ／ＢＮａＣ（図８ａ、^＊ｐ＝０．００３；^＊＊ｐ＝０．００６及び^＊＊＊ｐ＜０．０００１）又はＮＣＸ（図８ｂ、^＊ｐ＜０．０００１）の発現を阻害することにより、凝集の割合は減少し、ＡＳＩＣ／ＢＮａＣ及びＮＣＸの両方をブロックすることにより、６０Ｑ細胞及び１５０Ｑ細胞における凝集体の量は顕著に減少する（図８ｃ、^＊ｐ＜０．０００１）。興味深いことに、ＮＨＥアイソフォーム又はＮＨＥ１とＮＨＥ５の両方をブロックした場合には、凝集の有意な減少は得られなかった。このことは、ＮＨＥがｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集のプロセスには積極的には関与していないことを示唆している（図８ｄ）。次いで、チャネルタンパク質の発現をｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ構築物により抑制した細胞におけるプロテアソーム活性を検討した。ＬａｃＺｓｈＲＮＡコントロールと比較して、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の数は、ＮＣＸ、ＡＳＩＣ／ＢＮａＣ又はＮＣＸとＡＳＩＣ／ＢＮａＣの両方の発現をブロックした場合に有意に減少し、これは図６で得られた結果と類似していた（図８ｅ；^＊ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、アミロライド又はベンザミルによるインビボプロテアソーム活性の増大が、ＵＰＳ系への直接の影響の可能性は排除することはできないものの、細胞膜上に発現したＡＳＩＣ／ＢＮａＣ及び／又はＮＣＸの遮断によって媒介されうることを強く示唆している。

遺伝子の発現レベルが、転写レベル（ａ）と翻訳後レベル（ｂ、ｃ）の両方で、対応するｓｈＲＮＡにより有意にブロックされた。ｃは、ｂ（ＮＨＥ１、ＢｎａＣ２しか示していない）の実験の定量化データである（Ｎ１＝ＮＨＥ１、Ｘ１〜３＝ＮＣＸ１〜３、Ｂ１〜２＝ＢｎａＣ１〜２）。

アミロライド及びその誘導体であるベンザミルは、転写後メカニズムを介して、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集体を用量依存的に減少させた。（ａ）Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞株は、ｔＮｈｔｔ−６０Ｑ又はｔＮｈｔｔ−１５０Ｑを形成するように１日間誘導し、ＥＧＦＰポジティブな凝集体の数をＡｒｒａｙＳｃａｎにより定量した。アミロライド又はベンザミルの添加により、凝集体数は用量依存的に減少した。ｎ＝５、^＊及び^＊＊ｐ＝０．０１９；^＊＊＊及び^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（ｂ）５０μＭまでのベンザミルの添加では、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に対する有意な毒性は生じなかった。示された種々の濃度のベンザミルで処置したＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、５μｇ／ｍｌのｐｒｏｐｒｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で３７℃で１０分間染色して、細胞死を検出した。ｎ＝３、^＊ｐ＝０．１０５（Ｎ．Ｓ．、有意ではない）；^＊＊ｐ＝０．００１。（ｃ）アミロライド及びベンザミルは、ＡｒｒａｙＳｃａｎによって定量されるｔＮｈｔｔ−１５０Ｑｎｌｓにより形成される核凝集体を減少させた。ｎ＝３、^＊及び^＊＊ｐ＝０．０３。（ｄ）ベンザミルは、一過性発現系におけるｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ（＋／− ｎｌｓ）により形成される凝集体を減少させた。細胞を、種々の長さのｐｏｌｙＱ（＋／− ｎｌｓ）を発現する示したプラスミドで５時間一過性トランスフェクトし、続いて、５０μＭのベンザミルを添加した。１２時間後に、細胞をＡｒｒａｙＳｃａｎ定量のために収集した。ｎ＝３、^＊ｐ＜０．０００１。（ｅ）アミロライド及びベンザミルは、フィルタートラップアッセイにより示される凝集体負荷（ｌｏａｄ）を減少させる。示した処置の後、細胞を溶解し、溶解物を２％ＳＤＳで処置した。アミロライド及びベンザミルの両方が、メンブラン上にトラップされるＳＤＳ耐性凝集体を減少した。β−ｔｕｂｕｌｉｎは、同量のタンパク質負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）を示す。（ｆ、ｇ）半定量ＰＣＲは、種々の濃度のアミロライド及びベンザミルで処置した細胞においてｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの不変の発現を示した。導入遺伝子の発現レベルをＥＧＦＰ又はｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙ−ＥＧＦＰを標的とするプライマーを用いて増幅した。Ｇａｐｄｈは、同量のＲＮＡ投入を示している。５０μＭまでのアミロライド又はベンザミルでは、凝集体の除去が転写後メカニズムにより媒介されることを示唆する、２つの異なるプライマー対により示される導入遺伝子の発現レベルは目に見えて変化しなかった。ｔＮｈｔｔ−１６ＱについてのＰＣＲの結果の定量は（ｇ）に示した。

ベンザミルは、Ｒ６／２マウスにおいて、運動障害及び症状を緩和し、生存率を向上させた。（ａ）Ｃｌａｓｐｉｎｇスコア。ベンザミル処置が、８週及び１２週の両方でｃｌａｓｐｉｎｇスコアレベル３に達するマウスの数を顕著に減少させた。グレード分けについては実施例の記載を参照のこと。各群ｎ＝１０。^＊及び^＊＊ｐ＜０．０００１並びに^＊＊＊ｐ＝０．００９。（ｂ）Ｒｏｔａ−ｒｏｄ試験。ベンザミル１ｍｇ／ｋｇが、Ｒ６／２マウスのｒｏｔａｔｉｎｇｒｏｄ上での行動を改善して運動障害を緩和する。各群ｎ＝５。^＊ｐ＝０．００１５及び^＊＊ｐ＝０．０４２。（ｃ、ｄ）ベンザミル処置が、フィルタートラップアッセイで示されるＳＤＳ耐性の凝集体量を減少させた。各年齢（８又は１２週）の３匹の別々の動物から採取したＳＤＳ処置溶解物をセルロースアセテートメンブレン上にアプライした。ベンザミル（１ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウス由来の脳溶解物では、メンブラン上にトラップされる凝集体はより少なかった。（ｄ）は、（ｃ）の定量の結果を示している。ｎ＝３、^＊ｐ＝０．００９；^＊＊ｐ＝０．００４；^＊＊＊及び^＊＊＊＊ｐ＝０．００７。（ｅ）ベンザミル処置は、Ｒ６／２マウスの体重を増加させた。ベンザミル処置により、８週齢後のＲ６／２マウスの体重は増加した。Ｔｇ−水、ｎ＝１０；ｔｇ−Ｂｅｎ１、ｎ＝１３及びｔｇ−Ｂｅｎ５、ｎ＝１０。^＊ｐ＝０．０３４及び^＊＊ｐ＝０．０４４。（ｆ）ベンザミルは、Ｒ６／２マウスの生存率を有意に増大させた。各処置からの生存データを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法、続いて、ｌｏｇ−ｒａｎｋｔｅｓｔｉｎｇによって分析した。ｔｇ−水の場合の平均生存期間は、１１４．６２５±２．４４日であり、ｔｇ−Ｂｅｎ１の場合は、１２６．１±４．００１日であった（ｔｇ−水ｖｓｔｇ−Ｂｅｎ１、ｐ＝０．０２４）。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示した。

ベンザミルは、実験ラットの脳脊髄液（ＣＳＦ）中に検出し定量することができたので、ベンザミルがｐｏｌｙＱ凝集の量を減少する直接効果を脳組織で発揮したと考えられた。

可溶性ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの発現レベルはベンザミル処置により減少し、ベンザミルはインビボプロテアソーム活性を増強した。（ａ、ｂ）アミロライド又はベンザミルの添加は、ウエスタンブロットにより示される可溶性ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑの発現レベルを減少させた。アミロライド又はベンザミルで処置した細胞を溶解し、抗ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ抗体を用いたウエスタンブロットに供した。アミロライド及びベンザミルでの処置により、可溶性ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑの発現レベルは減少した。β−ｔｕｂｕｌｉｎは、タンパク質負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）を示す。ベンザミル処置後のｔＮｈｔｔ−１５０Ｑ発現の定量を（ｂ）に示した。ｎ＝３、^＊ｐ＝０．０００８。（ｃ）ＡｒｒａｙＳｃａｎにより、誘導性及び一過性トランスフェクション系の両方において、ベンザミルで処置した細胞における可溶性ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑの発現が減少することも明らかとなった。ｎ＝５、^＊ｐ＜０．０００１（水コントロールと比較して）。（ｄ、ｅ）ベンザミルは、ＭＧ−１３２により生じるプロテアソーム阻害を、用量依存的に緩和した（ｄ、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞のＡｒｒａｙＳｃａｎ定量；ｅ、抗ＲＦＰ抗体を用いたウエスタンブロット分析）。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をまずｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ構築物で５時間トランスフェクトし、次いで、増加濃度のＭＧ−１３２で処置してＵＰＳをブロックした。ＵＰＳのブロックにより、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤの凝集は濃度依存的に増大し、一方、ベンザミルは、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ凝集を緩和した。このことは、ベンザミルがＵＰＳ活性を全般的に増大しうることを示している。β−ｔｕｂｕｌｉｎは、（ｅ）において同量のタンパク質負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）を示す。ｎ＝３、^＊ｐ＝０．０１９。

ベンザミルは、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ保持細胞におけるプロテアソーム活性を増大し、ｔＮｈｔｔ−６０Ｑの分解を促進した。（ａ）プロテアソーム活性は、ｐｏｌｙＱの長さに依存してブロックされた。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ及びＥＧＦＰ発現（ＥＧＦＰのみ、ｔＮｈｔｔ−１７Ｑ−ＥＧＦＰ又はｔＮｈｔｔ−１５０Ｑ−ＥＧＦＰ）構築物とコトランスフェクトし、１８時間後、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ蛍光強度をＡｒｒａｙＳｃａｎで分析した。ＥＧＦＰトランスフェクションにより、比較的弱いシグナルが得られたが、ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑ−ＥＧＦＰは、強いシグナルを生じた。このことは、ＵＰＳがｐｏｌｙＱの長さに依存してグルタミンリピートによりブロックされることを示している。この実験では、ｕｂｉ−ｓｄＲＥＤが、ｐｏｌｙＱ保持Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＵＰＳの活性を示す有効なツールであることを証明している。各集合が、１０，０００超の細胞を含み、異なる集団間の分布は、非常に有意であった。すべてのｐ＜０．０００１。（ｂ、ｃ）ベンザミルは、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱにより生じるＵＰＳの遮断を緩和した。蛍光顕微鏡像は、ベンザミル存在又は非存在下での、ＲＦＰ及びＥＧＦＰポジティブな６２Ｑ凝集体の同時発現（Ａ及びＢ）並びにｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ及び６２Ｑの同時発現（Ｃ〜Ｋ）を示している。ベンザミルの添加により、ｐｏｌｙＱ保持細胞のＵＰＳ活性も増大するようにしてＵＰＳ遮断が全般的に緩和され、これにより、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤとｐｏｌｙＱとの同時局在は減少し、一方、ＲＦＰ及び６２Ｑの同時局在は実質的に不変であった（ｃ：ＡｒｒａｙＳｃａｎにより定量、^＊ｐ＜０．０００１）。Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎは、ＵＰＳ遮断のポジティブコントロールとして作用した。（ｄ、ｅ、ｆ）ベンザミルがｐｏｌｙＱ保持細胞におけるＵＰＳ活性を増強することを示すさらなる証拠である。ベンザミルは、ＡｒｒａｙＳｃａｎにより定量された細胞質と核の両方に視認可能なｐｏｌｙＱ凝集体を有する細胞において、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ細胞の割合（ｄ）及び平均ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ強度（ｅ）を減少させた。同様の実験構成由来の細胞を用いた、抗ＲＦＰ抗体によるウエスタンブロット分析により、ＡｒｒａｙＳｃａｎにより得られたデータ（ｆ）が確認された。Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎは、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤを凝集させ、一方、ベンザミルはｕｂｉ−ｄｓＲＥＤを緩和した。ｎ＝３、^＊ｐ＜０．０００１。（ｇ）ベンザミルは、チェイス実験により明らかにされた可溶性ｔＮｈｔｔ−６０Ｑの分解を増大した。ベンザミルの添加により、可溶性ｔＮｈｔｔ−６０Ｑの分解は向上し、可溶性ｔＮｈｔｔ−６０Ｑの絶対量は、ベンザミル処置３及び４日後に有意により少なかった。ｎ＝３、^＊ｐ＝０．０３７及び^＃ｐ＝０．０３９。

自食作用ではなくＵＰＳが、ベンザミルがｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱクリアランスを増強する主要な経路である。（ａ）ＵＰＳの遮断は、ベンザミルの効果を顕著に無効化した。ｔＮｈｔｔ−１５０ＱのｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅＡ誘導に加えて、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、２つの異なる濃度で、ベンザミル及びプロテアソームインヒビターであるｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ又はＭＧ−１３２とともにインキュベートした。Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ又はＭＧ−１３２は、コントロールとして、ベンザミルの非存在下でも使用した。Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ又はＭＧ−１３２は、ベンザミルの凝集抑制効果を顕著に逆転し無効化した。これは、ＵＰＳが、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱクリアランスについて、ベンザミルによって主に使用されている分解系であることを示している。ｎ＝３、^＊ｐ＝０．００６；^＊＊、^＊＊＊及び^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（ｂ）ＵＰＳ及びマクロ自食作用の両方の遮断は、ベンザミルの効果を完全に無効にした。５μＭのｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎとともに５ｍＭの３−メチルアデニン（３−ＭＡ）を添加したところ、ベンザミルの凝集抑制効果は完全に無効化された。これは、関与は非常に顕著ではないかもしれないが、マクロ自食作用も、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱの分解に関与している可能性を示唆している。ｎ＝３、^＊ｐ＝０．０９、Ｎ．Ｓ．、有意ではない。（ｃ）（ａ）で得られた結果と一致して、抗ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体を用いたウエスタンブロット分析によっても、プロテアソーム阻害が、ベンザミルの凝集抑制効果を無効化することが示された。（ｄ）ベンザミルは、Ａｔｇ５（マクロ自食作用の必須要素）の非存在下でも、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集を減少した。ＭＥＦを１ｎｇ／ｍｌのｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅと５日間インキュベートし、種々の長さ（＋／− ｎｌｓ）のｐｏｌｙＱを一過性トランスフェクトした。ベンザミルがＡｔｇ５の存在又は非存在下で同程度まで凝集を減少するという能力は、マクロ自食作用がベンザミルにより生じるｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱクリアランスに必要ではないことを示しており、（ａ）〜（ｃ）で得られたデータをさらにサポートしていた。ｎ＝３、^＊ｐ＞０．０５、有意ではない。

ＡＳＩＣ／ＢＮａＣ又はＮＣＸの発現のサイレンシングにより、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集は減少し、インビボプロテアソーム活性は増大した。（ａ）ＡＳＩＣ／ＢＮａＣの発現のサイレンシングは、ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑ凝集量を減少した。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をまず、ＢＮａＣのサイレンシングに特異的なｓｈＲＮＡをコードするｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６と２日間一過性トランスフェクトした。続いて、トランケート型Ｎｈｔｔ−１５０Ｑを１日間誘導した。ＬａｃＺｓｈＲＮＡをトランスフェクション及びサイレンシングのネガティブコントロールとして使用した。ＢＮａＣ１（ＡＳＩＣ２）、ＢＮａＣ２（ＡＳＩＣ１）又はその両方の発現レベルを減少することにより、ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑ凝集の減少が導かれた。これは、これらのタンパク質チャネルの発現又は活性がｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集体の形成又は進行に関与しうることを示唆している。ｎ＝９、^＊ｐ＝０．００３；^＊＊ｐ＝０．００６及び^＊＊＊ｐ＜０．０００１。（ｂ）ＮＣＸ発現のサイレンシングにより、ｔＮｈｔｔ−ｐｏｌｙＱ凝集量は減少した。ｎ＝９、^＊ｐ＜０．０００１。（ｃ）ＢＮａＣ及びＮＣＸの両方の発現のサイレンシングにより、ｔＮｈｔｔ−６０Ｑ及びｔＮｈｔｔ−１５０Ｑの凝集量は減少した。ｎ＝５、^＊ｐ＜０．０００１。（ｄ）ＮＨＥ発現のサイレンシングにより、ｔＮｈｔｔ−１５０Ｑ凝集量は変化しなかった。（ｅ）ＮＣＸ、ＢＮａＣ又はその両方のチャネルタンパク質発現のサイレンシングにより、プロテアソーム活性の有意な増強が導かれた。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をまず、対応するｐＳｉｌｅｎｃｅｒｓｈＲＮＡｓで２日間トランスフェクトして、遺伝子をサイレンシングした。引き続いて、これらの条件下におけるインビボプロテアソーム活性を評価するために、７０ｎｇのｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ構築物をトランスフェクトした。ＲＦＰ発現には有意な変化はなかったが（全体集団において、同じ割合のＲＦＰ細胞）、ｕｂｉ−ｄｓＲＥＤ発現は、ＬａｃＺｓｈＲＮＡコントロールと比較して顕著に減少した。ｎ＝３、^＊ｐ＜０．０００１。

配列番号１〜１８：プライマー
配列番号１９〜３４：ｓｈＲＮＡ産生シークエンス

Claims

以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、神経変性疾患の予防・治療剤。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はそれぞれ独立して、置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ^４はハロゲンを示す。）
Ｒ^１が、置換されていてもよい低級アルキル基又は置換されていてもよいアリール基、で置換されたアミノ基を示す、請求項１に記載の予防・治療剤。
Ｒ^１が、アリール基で置換された低級アルキル基又は非置換のアリール基、で置換されたアミノ基を示し、Ｒ^２及びＲ^３が非置換のアミノ基を示す、請求項２に記載の予防・治療剤。
Ｒ^４が塩素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の予防・治療剤。
式（Ｉ）で表される化合物が、アミロライド、ベンザミル又はフェナミルである、請求項１に記載の予防・治療剤。
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の予防・治療剤。
神経変性疾患がハンチントン病である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の予防・治療剤。
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、プロテアソーム活性増強剤。