JP2008530245A - 尿路病原性菌株由来の抗原 - Google Patents

Abstract

本明細書において、病原性大腸菌株に特異的な免疫原性組成物中に含め得る種々の遺伝子を開示する。該遺伝子は尿路病原性菌株由来であるが、非病原性菌株には存在せず、そのコードタンパク質は、自身を免疫系に利用可能にする細胞部位を有する。本発明はまた、患者に、本発明の医薬組成物または免疫原性組成物を投与する工程を含む、患者の免疫応答を高めるための方法に関する。特定の一実施形態において、免疫応答は、ＥｘＰＥＣ感染に対して防御的である。

Description

本明細書に引用された全ての文献は、その全体が参考として本明細書に援用される。

（関連出願）
本出願は、２００５年２月１８日に出願された米国仮出願第６０／６５４，６３２号（この教示の全体が、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

（技術分野）
本発明は、大腸菌生物学の分野におけるものであり、特に、腸外病原性大腸菌（ＥｘＰＥＣ）株に対する免疫処置における使用のための免疫原に関する。

大腸菌ほど多用途な微生物はほとんどない。哺乳動物の通常の腸内微生物叢の重要な一員である他、組換えＤＮＡ手法における宿主として広く利用されている。しかしながら、また、大腸菌は致死性の病原体でもあり得る。

大腸菌株は、伝統的には、片利共生または病原性のいずれかに分類されており、病原性菌株は、さらに腸内または腸外株に下位分類されている。より細菌の分類学的手法、例えば、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）などでは、大腸菌は５つの系統発生的なグループ（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、ＤおよびＥ）に分類され、これらのグループ分けは、伝統的なものと適合しない。例えば、ＭＬＥＥグループＢ１は片利共生および病原性菌株の両方を含み、グループＤは腸内および腸外株の両方を含む。

大腸菌の腸外病原性菌株（または「ＥｘＰＥＣ」株［１］（非特許文献１））は、ＭＬＥＥグループＢ２およびＤに分類され、尿路病原性（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）（ＵＰＥＣ）株および髄膜炎／敗血症関連（ＭＮＥＣ）株の両方を含む。ＵＰＥＣ株は尿路感染（ＵＴＩ）を引き起こし、膀胱炎の最も一般的な形態である。該病原性菌株はまた、腎盂腎炎（およびその合併症、例えば敗血症など）ならびにカテーテル関連感染を引き起こす。ＭＮＥＣ株は新生児髄膜炎を引き起こし（１０００生児出生あたり０．１例）、その場合、死亡率は２５〜４０％の範囲であり、また、敗血症の症例の原因のほぼ１／６を担う。

これまでのＥｘＰＥＣ ワクチンの大部分は、細胞ライセートまたは細胞構造体を主成分としたものである。ＳＯＬＣＯＵＲＯＶＡＣ^ＴＭは、６種類のＥｘＰＥＣ株を含む１０種類の異なる加熱殺菌された細菌を含むものであり、好成績のフェーズＩＩ臨床試験が、参考文献２（非特許文献２）において報告された。ＵＲＯ−Ｖ ＡＸＯＭ^ＴＭは、１８種類の選択された大腸菌株の凍結乾燥細菌ライセートを含有する経口錠剤ワクチンである［３］（非特許文献３）。Ｂａｘｔｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓでは、６〜１０種の異なる株由来のピリ線毛を主成分とするＵＴＩワクチンが開発されたが、この製品は禁止されている。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅでは、ＦｉｍＨ付着因子複合体を主成分とするＭＥＤＩ ５１６とよばれる製品が開発されたが［４］（非特許文献４）、フェーズＩＩ臨床試験では、有効性が不充分なことが示された。さらに、このワクチンは、通常の腸内微生物叢内の非病原性ＦｉｍＨ^＋ｖｅ株にも影響し得るリスクを伴い、このワクチンは、その膀胱特異的付着機構のため、ＵＰＥＣ株に対してのみ有効であり得、他のＥｘＰＥＣ株は制御不能であり得ることが予測された。

従って、改善されたＥｘＰＥＣワクチンの必要性、例えば、粗製細胞ライセートからより明確な分子に向かって遊離（ｍｏｖｅ ａｗａｙ）させる必要性、およびワクチンに含めるのに適したさらなる抗原、特に、片利共生菌株にも同時に見られることなく、ＥｘＰＥＣ臨床株間に広く見られる抗原を同定する必要性が存在する。

これらの必要性に取り組む方法の一例は参考文献５で報告され、その発明者らは、ＭＬＥＥのＢ２およびＤ型のゲノム内に存在するが、ＭＬＥＥのＡおよびＢ１型には存在しない遺伝子を探した。サブトラクティブハイブリダイゼーションに基づくさらなる比較アプローチが、参考文献６および７に報告された。また、ＥｘＰＥＣ株におけるビルレンス遺伝子が参考文献８において同定されている。参考文献９には、ＵＰＥＣ大腸菌株５３６内の４種類の病原遺伝子島の解析が開示されている。

参考文献１０（特許文献１）では、ＵＰＥＣ（Ｏ６：Ｋ２：Ｈ１）株ＣＦＴ０７３［１１，１２］のゲノム配列を用いて、非病原性大腸菌株には存在しない配列が同定された。参考文献１３には、ＵＰＥＣである大腸菌ヒト腎盂腎炎の単離菌５３６（Ｏ６：Ｋ１５：Ｈ３１）と、株ＣＦＴ０７３（ＵＰＥＣ）、ＥＤＬ９３３（腸管出血性）およびＭＧ１６５５（非病原性実験菌株）の配列データとのゲノム配列の比較が開示されている。病原性菌株のゲノム配列は、データベースにおいて受託番号ＡＥ００５１７４、ＢＡ０００００７およびＮＣ−００４４３１で入手可能である。非病原性菌株由来の配列は、受託番号Ｕ０００９６にて入手可能である。
米国特許出願公開第２００３／０１６５８７０号明細書 ＲｕｓｓｏおよびＪｏｈｎｓｏｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（２０００）１８１：１７５３〜１７５４ Ｕｅｈｌｉｎｇら、Ｊ Ｕｒｏｌ（１９９７）１５７：２０４９〜２０５２ Ｔａｍｍｅｎ Ｂｒ Ｊ Ｕｒｏｌ（１９９０）６５：６〜９ Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：６０７〜６１１

本発明の目的は、病原性大腸菌株、特にＥｘＰＥＣ株、より特別にはＵＰＥＣ株に対する免疫処置における使用のためのさらなる抗原を提供することである。

（発明の要旨）
本発明者らは、病原性大腸菌株に特異的な免疫原性組成物中に含め得る種々の遺伝子を同定した。該遺伝子は尿路病原性菌株（ＵＰＥＣ）由来であるが、非病原性菌株には存在せず、そのコードタンパク質は、自身を免疫系に利用可能にする細胞部位を有する．
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号

および５９９からなる群より選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片であるアミノ酸配列；または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。特定の一実施形態において、本発明のこの態様のポリペプチドは、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む断片を含む。

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号２２、１２０、２１９、２２１、３０５、３７１、４００、４８９、５５５、５６５、５９７、５９８および５９９からなる群より選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片であるアミノ酸配列；または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。特定の一実施形態において、本発明のこの態様のポリペプチドは、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む断片を含む。

本発明のポリペプチドは、医薬において、および患者の免疫応答を高めるための医薬の製造において使用され得る。

本発明はまた、薬学的に許容され得る担体と混合された本発明のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明は、さらに、薬学的に許容され得る担体と混合された本発明の２種類以上のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。特定の一実施形態において、本発明の医薬組成物は、ワクチンアジュバントをさらに含む。

本発明はさらに、（ａ）配列番号からなる群より選択されるアミノ酸配列２２、１２０、２１９、２２１、３０５、３７１、４００、４８９、５５５、５６５、５９７、５９８および５９９；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片であるアミノ酸配列；または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含む１種類以上のポリペプチドを発現または過剰発現する１種類以上の外膜小胞（ＯＭＶ）を含む免疫原性組成物に関する。特定の一実施形態において、本発明のこの態様の免疫原性組成物は、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む断片を含む１種類以上のポリペプチドを含む。

本発明はまた、患者に、本発明の医薬組成物または免疫原性組成物を投与する工程を含む、患者の免疫応答を高めるための方法に関する。特定の一実施形態において、免疫応答は、ＥｘＰＥＣ感染に対して防御的である。

本発明のさらなる態様を以下に記載する。

（発明の詳細な説明）
本発明者らは、病原性大腸菌株に特異的な免疫原性組成物中に含め得る種々の遺伝子と同定した。該遺伝子はＵＰＥＣ株由来であるが、非病原性菌株には存在せず、そのコードタンパク質は、自身を免疫系に利用可能にする細胞部位を有する。

ポリペプチド
本発明は、実施例に開示したアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。これらのアミノ酸配列を、配列表に配列番号１〜５９６および５９７〜５９９として示す。配列番号１〜５９６の好ましいサブセットを表２、３および５に示す。

本発明はまた、実施例に開示したアミノ酸配列と配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。具体的な配列に依存するが、配列同一性の程度は、好ましくは、５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）。これらのポリペプチドには、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子バリアントおよび変異型が含まれる。典型的には、２つのポリペプチド配列間の５０％以上の同一性が、機能的等価性の表示とみなされる。ポリペプチド間の同一性は、好ましくは、ギャップ開始ペナルティ＝１２およびギャップ伸張ペナルティ＝１のパラメータでアフィンギャップ検索を用い、ＭＰＳＲＣＨ プログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。

これらのポリペプチドは、実施例の配列と比較したとき、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の同類アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸の関連する側鎖を有する別のものとの置換を含むものであり得る。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般的に、４つのファミリー：（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；（２）塩基性、すなわち、リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、場合によっては一緒に芳香族アミノ酸に分類される。一般に、これらのファミリー内での単一のアミノ酸の置換は、その生物学的活性に対して大きな効果はない。該ポリペプチドは、参照配列に対して１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）単一のアミノ酸の欠失を有するものであり得る。該ポリペプチドはまた、参照配列に対して１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸の各々）を含むものであり得る。

好ましいポリペプチドとしては、脂質化された、外膜内に局在した、内膜内に局在した、またはペリプラズム内に局在したポリペプチドが挙げられる。特に好ましいポリペプチドは、これらのカテゴリーの１つより多くに分類されるもの、例えば、外膜内に局在した脂質化されたポリペプチドである。リポタンパク質は、シグナルペプチドの翻訳後プロセッシング後に脂質が共有結合するＮ末端システインを有するものであり得る。

脂質化され得るポリペプチドは、配列番号：

を含むものである。

好ましいポリペプチドは表２、３および５に示したものであり、特に、表３に示したものである。

本発明は、さらに、実施例に開示したアミノ酸配列の断片を含むポリペプチドを提供する。該断片は、該配列由来の少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むものであるのがよく、具体的な配列に依存するが、ｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である。該断片は、該配列の少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたは、好ましくはＢ細胞エピトープを含むものであり得る。Ｔ−およびＢ−細胞エピトープは、実験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［１４，１５］または同様の方法を用いて）同定され得るか、または予測され得る（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数［１６］、マトリックス系アプローチ［１７］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１８］、中性ネットワーク［１９］、ＯｐｔｉＭｅｒ ＆ ＥｐｉＭｅｒ［２０，２１］、ＡＤＥＰＴ［２２］、Ｔ部位［２３］、親水性［２４］、抗原性指数［２５］または参考文献２６に開示された方法などを用いて）。他の好ましい断片は、（ａ）本発明のポリペプチドのＮ末端シグナルペプチド、（ｂ）該ポリペプチドであるが、そのＮ末端シグナルペプチドを含まないもの、（ｃ）該ポリペプチドであるが、そのＮ末端アミノ酸残基を含まないものである。

他の好ましい断片は、潜在的開始コドン（ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ）にコードされるアミノ酸で始まるものである。表示した開始コドンの下流の開始コドンにコードされるメチオニンで始まる断片は、本発明のポリペプチドである。

他の好ましい断片は、本発明のポリペプチドと参考文献５、６、８、１０および１１のいずれかで同定されるポリペプチドに共通するものである。

本発明のポリペプチドは、多くの様式で、例えば、化学合成（完全または一部）、プロテアーゼを用いた長鎖ポリペプチドの消化、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物（例えば、組換え発現による）からの精製によって、生物そのもの（例えば、細菌の培養後、または患者から直接）などから調製され得る。＜４０アミノ酸長のペプチドの作製のための好ましい方法はインビトロ化学合成を伴う［２７，２８］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［２９］化学的性質に基づく方法などの固相ペプチド合成は、特に好ましい。酵素的合成［３０］もまた、一部または全体において使用され得る。化学合成の代替法として、生物学的合成が使用され得、例えば、ポリペプチドは、翻訳によって生成され得る。これは、インビトロまたはインビボで行なわれ得る。生物学的方法は、一般に、Ｌ−アミノ酸を主体とするポリペプチドの作製に限定されるが、翻訳機構（例えば、アミノアシルｔＲＮＡ分子）の操作を用いて、Ｄ−アミノ酸（または他の非天然アミノ酸、例えば、ヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニンなど）の導入を可能にし得る［３１］。しかしながら、Ｄ−アミノ酸を含める場合は、化学合成を使用することが好ましい。本発明のポリペプチドは、共有結合性の修飾をＣ末端および／またはＮ末端に有するものであり得る。

本発明のポリペプチドは、種々の形態（例えば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化され、非脂質化され、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体型、多量体型、微粒子状、変性型など）をとり得る。

本発明のポリペプチドは、好ましくは、精製された、または実質的に精製された形態で、すなわち、実質的に他のポリペプチドを含まない（例えば、天然に存在するポリペプチドを含まない）、特に、他のＥｘＰＥＣまたは宿主細胞ポリペプチドを含まない形態で提供され、一般的に、少なくとも約５０％純粋（重量基準で）、通常、少なくとも約９０％純粋すなわち、組成物の約５０％未満、より好ましくは、約１０％未満（例えば、５％以下）が、他の発現ポリペプチドで構成されている。本発明のポリペプチドは、好ましくは、ＥｘＰＥＣポリペプチドである。

本発明のポリペプチドは、固相に結合させてもよい。本発明のポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射能もしくは蛍光標識またはビオチン標識）を含むものであってもよい。

用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。該ポリマーは線状または分枝鎖であり得、修飾アミノ酸を含むものであってもよく、非アミノ酸によって分断されたものであってもよい。該用語はまた、天然で、または介在；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾（例えば、標識との成分コンジュゲーションなど）によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、該定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類縁体（例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる）を含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で知られた他の修飾も包含される。ポリペプチドは、単鎖または会合鎖として存在し得る。本発明のポリペプチドは、天然状態でグリコシル化されたもの、または非天然状態でグリコシル化されたもの（すなわち、該ポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドに見られるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）であり得る。

本発明のポリペプチドは、少なくとも４０アミノ酸長（例えば、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれ以上）であり得る。本発明のポリペプチドは、５００アミノ酸以下（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸以下）であり得る。

本発明は、配列−Ｘ−Ｙ−または−Ｙ−Ｘ−（式中、−Ｘ−は上記規定のアミノ酸配列である、および−Ｙ−は上記規定の配列ではない）を含むポリペプチドを提供する、すなわち、本発明は融合タンパク質を提供する。ポリペプチドコード配列のＮ末端コドンがＡＴＧでない場合、該コドンはＭｅｔ（コドンが開始コドンとして翻訳される場合に存在する）ではなく、該コドンの標準アミノ酸として翻訳される。

本発明は、本発明の宿主細胞を、ポリペプチド発現を誘導する条件下で培養する工程を含む、本発明のポリペプチドの作製方法を提供する。

本発明は、ポリペプチドの一部または全体が化学的手段を用いて合成される本発明のポリペプチドの作製方法を提供する。

本発明は、本発明の２種類以上のポリペプチドを含む組成物を提供する。

本発明はまた、式ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは上記の本発明のポリペプチドである、Ｌは任意選択のリンカーアミノ酸配列である、Ａは任意選択のＮ末端アミノ酸配列である、Ｂは任意選択のＣ末端アミノ酸配列である、およびｎは１より大きい整数である）で表されるハイブリッドポリペプチドを提供する。ｎの値は２〜ｘの間であり、ｘの値は、典型的には、３、４、５、６、７、８、９または１０である。好ましくは、ｎは２、３または４である；より好ましくは２または３である；最も好ましくは、ｎ＝２である。各ｎの場合では、−Ｘ−は同じであっても異なっていてもよい。［−Ｘ−Ｌ−］の各ｎの場合では、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在しても存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドは、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列（１つまたは複数）−Ｌ−は、典型的には、短鎖（例えば、２０個以下、すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１のアミノ酸）である。例としては、クローニングを容易にする短鎖ペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙ_ｎ（式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓ_ｎ、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が挙げられる。他の好適なリンカーアミノ酸配列は、当業者に自明である。−Ａ−および−Ｂ−は任意選択の配列であって、典型的には、短鎖（例えば、４０個以下、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１のアミノ酸）である。例としては、ポリペプチド輸送を指令するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短鎖ペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグすなわち、Ｈｉｓ_ｎ、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が挙げられる。他の好適なＮ末端およびＣ末端アミノ酸配列は、当業者に自明である。

種々の試験が、本発明のポリペプチドのインビボ免疫原性を評価するために使用され得る。例えば、該ポリペプチドは、組換えにより発現され得、患者に血清をイムノブロットによってスクリーニングするために使用され得る。ポリペプチドと患者の血清間の陽性反応は、患者が、対象のタンパク質に対して以前に免疫応答を表すことがあることを示す。すなわち、該タンパク質は免疫原である。この方法はまた、免疫優性タンパク質を同定するためにも使用され得る。

抗体
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。これは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、任意の適当な手段（例えば、組換え発現）によって作製され得る。ヒト免疫系との適合性を増大させるため、該抗体をキメラまたはヒト化したものにしてもよく［例えば、参考文献３２および３３］、または完全ヒト抗体を使用してもよい。該抗体は、検出可能な標識（例えば、診断用アッセイのため）を含むものであり得る。本発明の抗体は、固相に結合させてもよい。本発明の抗体は、好ましくは中和抗体である。

モノクローナル抗体は、これが使用される個々のポリペプチドの同定および精製に特に有用である。本発明のモノクローナル抗体はまた、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）などにおける試薬として使用され得る。これらの適用において、該抗体は、解析により検出可能な試薬、例えば、放射性同位体、蛍光分子または酵素などで標識され得る。上記の方法によって作製されるモノクローナル抗体はまた、本発明のポリペプチドの分子の同定およびキャラクタライゼーション（エピトープマッピング）に使用され得る。

本発明の抗体は、好ましくは、大腸菌のＥｘＰＥＣ株に特異的である、すなわち、他の細菌と比べて（例えば、非ＥｘＰＥＣ大腸菌と比べて、および非大腸菌細菌と比べて）ＥｘＰＥＣ大腸菌に優先的に結合する。より好ましくは、該抗体は、ＵＰＥＣ株に特異的である、すなわち、他のＥｘＰＥＣ大腸菌などの他の細菌と比べてＵＰＥＣ細菌優先的に結合する。

本発明の抗体は、好ましくは、精製された、または実質的に精製された形態で提供される。典型的には、該抗体は、実質的に他のポリペプチドを含まない、例えば、９０％未満（重量基準で）、通常６０％未満、より通常では５０％未満が他のポリペプチドで構成される組成物中に存在する。

本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ すなわち、α、γまたはμ重鎖）であり得るが、一般的にはＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプの中で、該抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスであり得る。本発明の抗体は、κまたはλ軽鎖を有するものであってもよい。

本発明の抗体は、種々の形態、例えば、完全抗体、抗体断片（Ｆ（ａｂ’）_２およびＦ（ａｂ）断片など）、Ｆｖ断片（非共有結合ヘテロ二量体）、単鎖抗体（単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）など）、ミニボディ、オリゴボディなどを採用し得る。用語「抗体」は、なんら特定の起源を示すものではなく、ファージディスプレイなどの非慣用的プロセスにより得られる抗体を含む。

本発明は、（ａ）本発明の抗体を生物学的試料と、 抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；および（ｂ）前記複合体を検出する工程を含む、本発明のポリペプチドの検出方法を提供する。

本発明は、（ａ）本発明のポリペプチドを生物学的試料（例えば、血液または血清試料）抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；および（ｂ）前記複合体を検出する工程を含む、本発明の抗体の検出方法を提供する。

好ましい抗体は本発明のポリペプチドに、当該技術分野で知られた抗体よりも実質的に大きい親和性で結合する。好ましくは、親和性は、当該技術分野で知られた抗体よりも、少なくとも１．５倍、２倍、５倍 １０倍、１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍など強力である。

核酸
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明はまた、かかるヌクレオチド配列と配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。配列間の同一性は、好ましくは、上記のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。

本発明はまた、これらの核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。ハイブリダイゼーション反応は、種々の「ストリンジェンシー」条件下で行なわれ得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件は、当該技術分野において広く知られ、公開されている［例えば、参考文献３４の第７．５２頁］。関連する条件の例としては（ストリンジェンシーが増大する順に）、２５℃、３７℃、５０^０Ｃ、５５℃および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ここで、ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸バッファー）のバッファー濃度および他のバッファー系を用いたその同等濃度；０％、２５％、５０％および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキュベーション時間；１、２回またはそれ以上の洗浄工程；１、２または１５分間の洗浄インキュベーション時間；ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。ハイブリダイゼーション手法およびその最適化は、当該技術分野で知られている［例えば、参考文献３４〜３７などを参照のこと］。

ある一部の実施形態において、本発明の核酸は標的に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする；他の実施形態では、中程度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする；好ましい実施形態では、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的な組は、５０℃および１０×ＳＳＣである。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的な組は、５５℃および１×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的な組は、６８℃および０．１×ＳＳＣである。

これらの配列の断片を含む核酸もまた提供される。これは、該配列由来の少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを含むものであるのがよく、具体的な配列に依存するが、ｎは、１０またはそれ以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００またはそれ以上）である。好ましい断片は、本発明の核酸と参考文献５、６、８、１０および１１のいずれかで同定される核酸配列に共通するものである。

本発明は、式５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’の核酸を提供し、式中、−Ｘ−は、ｘ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である；−Ｚ−は、ｚ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である；−Ｙ−は、（ａ）配列番号：１〜５９６の１つをコードする核酸配列の断片、（ｂ）配列番号：５９７〜５９９の１つをコードする核酸配列の断片、または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の相補配列のいずれかからなるヌクレオチド配列である；および前記核酸５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’は、（ｉ）配列番号：１〜５９６の１つをコードするか、もしくは配列番号：５９７〜５９９の１つをコードするいずれかの核酸配列の断片でもなく、（ｉｉ）（ｉ）の相補配列でもない。−Ｘ−および／または−Ｚ−部分は、プロモーター配列（もしくはその相補配列）を含み得る。

本発明は、これらの配列に相補的な配列（例えば、アンチセンスもしくはプローブ検索用、またはプライマーとしての使用のため）を含む核酸を含む。

本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノーザンもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイもしくは「遺伝子チップ」）および増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）ならびに他の核酸手法において使用され得る。

本発明による核酸は、種々の形態（例えば、単鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識されたものなど）をとり得る。本発明の核酸は環状または分枝鎖であり得るが、一般的には線状である。特に指定または必要とされない限り、核酸を用いる本発明の任意の実施形態では、二本鎖形態および該二本鎖形態を構成する２つの相補的単鎖形態の各々の両方が使用され得る。プライマーおよびプローブは、一般的に単鎖であり、アンチセンス核酸である。

本発明の核酸は、好ましくは、精製された、または実質的に精製された形態で提供される、すなわち、実質的に他の核酸を含まず（例えば、天然に存在する核酸を含まない）、特に、他のＥｘＰＥＣまたは宿主細胞核酸を含まず、一般的に、少なくとも約５０％純粋（重量基準で）、通常、少なくとも約９０％純粋である。本発明の核酸は、好ましくはＥｘＰＥＣ核酸である。

本発明の核酸は、多くの様式で、例えば、全体または一部を化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホロアミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を用いて長鎖の核酸を消化することによって、短鎖の核酸またはヌクレオチドを連結する（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用）ことによって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーなどから調製され得る。

本発明の核酸は、固相（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、膜、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂など）結合させ得る。本発明の核酸は、例えば、放射能もしくは蛍光標識またはビオチン標識で標識し得る。これは、核酸が検出手法において使用される場合、例えば、核酸がプライマーまたはプローブである場合、特に有用である。

用語「核酸」は、一般的な意味において、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含み、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはこれらの類縁体が含まれる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも含まれる。また、ＤＮＡまたはＲＮＡの類縁体、例えば、修飾された主鎖（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはホスホロチオエート）または修飾された塩基を含有するものなども含まれる。したがって、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝鎖核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどを含む。本発明の核酸がＲＮＡの形態を採用する場合、５’キャップを有していても、そうでなくでもよい。

本発明の核酸は配列を含むものであるが、これはまた、非ＥｘＰＥＣ配列（例えば、上記の式５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’の核酸において）を含んでいてもよい。これは、プライマーに特に有用であり、従って、これは、核酸標的に相補的な第１の配列および該核酸標的に相補的でない第２の配列を含むものであり得る。プライマーにおける任意のかかる非相補配列は、好ましくは、相補配列に対して５’である。典型的な非相補配列は、制限部位またはプロモーター配列を含む。

本発明の核酸は、多くの様式で、例えば、化学合成（少なくとも一部分）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を用いて長鎖の核酸を消化することによって、短鎖の核酸を連結する（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用）ことによって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーなどから調製され得る。

本発明の核酸は、ベクターの一部分、すなわち、１種類以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部分であり得る。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖および複製用に設計される「クローニングベクター」、宿主細胞内でのヌクレオチド配列の発現用に設計される「発現ベクター」、組換えウイルスまたはウイルス様粒子の生成もたらすために設計された「ウイルスベクター」、または１つより多くの型のベクターの属性を構成する「シャトルベクター」であり得る。好ましいベクターはプラスミドである。「宿主細胞」としては、外来核酸のレシピエントであり得る、または外レシピエントであった個々の細胞または細胞培養物が挙げられる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、該子孫は、自然的、偶発的または意図的な変異および／または変化により、必ずしも起源の親細胞と完全に同一（形態またはまたは全ＤＮＡ相補鎖において）でなくてもよい。宿主細胞には、本発明の核酸を用いてインビボまたはインビトロでトランスフェクトまたは感染させた細胞が含まれる。

核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列の「Ｕ」はＤＮＡの「Ｔ」で置き換えられることは認識されよう。同様に、核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ配列の「Ｔ」はＲＮＡの「Ｕ」で置き換えられることは認識されよう。

用語「相補鎖」または「相補的」は、核酸に関して用いる場合、ワトソン−クリック塩基対合をいう。したがって、Ｃの相補鎖はＧであり、Ｇの相補鎖はＣであり、Ａの相補鎖はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の相補鎖はＡである。また、例えば、相補的なピリミジン（ＣまたはＴ）に対してＩ（プリンイノシン）などの塩基を使用することが可能である。該用語はまた方向を示し、５’−ＡＣＡＧＴ−３’の相補鎖は、５’−ＴＧＴＣＡ−３’ではなく５’−ＡＣＴＧＴ−３’である。

本発明の核酸は、例えば、ポリペプチドを産生させるため；生物学的試料中の核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして；さらなる核酸コピーを生成させるため；リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するため；単鎖ＤＮＡプライマーもしくはプローブとして；または三重鎖形成性オリゴヌクレオチドとして使用され得る。

本発明は、核酸の一部または全体が化学的手段を用いて合成される本発明の核酸の作製方法を提供する。

本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびかかるベクターで形質転換され宿主細胞を提供する。

本発明はまた、ＥｘＰＥＣ核酸配列内に含まれる鋳型配列の増幅のためのプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）を備えるキットを提供し、該キットは第１のプライマーおよび第２のプライマーを備え、ここで、第１のプライマーは前記鋳型配列に実質的に相補的であり、第２のプライマーは前記鋳型配列相補鎖に実質的に相補的であり、前記プライマーの実質的に相補性を有する部分は、増幅される鋳型配列の末端を規定する。第１のプライマーおよび／または第２のプライマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含んでいてもよい。

本発明はまた、単鎖または二本鎖核酸（またはその混合物）内に含まれるＥｘＰＥＣ鋳型核酸配列の増幅を可能にする第１および第２の単鎖オリゴヌクレオチドを備えるキットであって、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドは、前記鋳型核酸配列に実質的に相補的なプライマー配列を含む；（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドは、前記鋳型核酸配列の相補鎖に実質的に相補的なプライマー配列を含む；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、前記鋳型核酸に相補的でない配列を含む；ならびに（ｄ）前記プライマー配列は、増幅される鋳型配列の末端を規定するキットを提供する。特徴（ｃ）の非相補配列（１つまたは複数）は、好ましくは、プライマー配列の上流（すなわち、５’側）である。これらの（ｃ）配列の一方または両方は、制限部位［例えば、参考文献３８］またはプロモーター配列［例えば、３９］を含み得る。第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含むものであってもよい。

本発明は、（ａ）本発明による核酸プローブを生物学的試料と、デュプレックスを形成するハイブリダイズ条件下で接触させる工程；および（ｂ）前記デュプレックスを検出する工程を含む、本発明の核酸の検出方法を提供する。

本発明は、本発明による核酸を生物学的試料とハイブリダイズ条件下で接触させる工程を含む、生物学的試料（例えば、血液）中での検出方法を提供する。該方法は、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）またはハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ、ブロット、溶液中でのプローブとのハイブリダイゼーションなど）を伴うものであり得る。臨床試料中でのＥｘＰＥＣのＰＣＲ検出が報告されている［例えば、参考文献４０を参照］。核酸に基づく臨床アッセイは、参考文献４１に一般に記載されている。

本発明は、核酸プライマーの伸長によって調製される標的配列の断片の調製方法を提供する。標的配列および／またはプライマーは本発明の核酸である。プライマー伸長反応は、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）を伴うものであり得る。

本発明による核酸増幅は、定量的および／またはリアルタイムであり得る。

本発明のある特定の実施形態では、核酸は、好ましくは、少なくとも７ヌクレオチド長（例えば、

ヌクレオチド長またはそれ以上）である。本発明のある特定の実施形態では、核酸は、好ましくは、最大５００ヌクレオチド長（例えば、

ヌクレオチド長またはそれ以下）である。

本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションに用いられる他の核酸は、好ましくは、１０〜３０ヌクレオチド長（例えば、

または３０ヌクレオチド）である。

小胞
参考文献４２には、ｍｌｔＡ（ムレイン溶解性トランスグリコシラーゼ）または大腸菌Ｔｏｌ−Ｐａｌ複合体の１種類以上の成分［４３］、例えば、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＢ、ｐａｌおよび／またはｔｏｌＲなどのノックアウトによる尿路病原性（ＵＰＥＣ）菌株からの小胞の調製が記載されている。これらの小胞は、小胞の表面上の防御的抗原の量および／または免疫利用可能性（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を増大させるため、細菌の染色体に対して１つ以上のさらなる遺伝子変更を行なうことにより、またはエピソーム性エレメント（例えば、発現ベクター）の挿入により改善され得る。

かかる改善を得る方法の一例は、本発明のポリペプチドの発現を上方調節することである。標的タンパク質の発現を増大させるための多くの異なる遺伝子ストラテジーが、当該技術分野でよく知られており、大きく２つのカテゴリーに分類され得、一方は、内在遺伝子の発現を増大させるための染色体の修飾（例えば、野生型プロモーターのより強力なプロモーターとの置換え、天然リプレッサー遺伝子の不活性化など）に依存するものであり、他方は、エピソーム性エレメント（例えば、多コピー数のプラスミド、改変された標的遺伝子を保有するベクターなど）または染色体内への外来遺伝子の組込みによる組換え発現に基づくものである。これらのアプローチの各々の実際の例は、参考文献４４〜５０をみるとよい。

小胞の免疫原性および選択性を増大させる別の様式は、免疫優性の非防御的抗原の発現を下方調節すること、または片利共生菌株に見られるタンパク質に相同なタンパク質を下方調節することである。さらなる改善は、ＬＰＳのリピドＡ部分の無毒化によって達成され得る。以前に、改善された小胞を他のグラム陰性病原体から作製するための同様の変更が報告されている（例えば、参考文献５１および５２を参照）。

上記のすべてのストラテジーは単独または組合せのいずれかで、免疫原性組成物における使用のための改善された小胞を得るために使用され得る。本発明は、ｍｌｔＡおよび／またはそのＴｏｌ−Ｐａｌ複合体の成分のノックアウト、ならびに（ｉ）本発明のポリペプチドをコードし、該ポリペプチドをコードする遺伝子と天然状態で関連しているプロモーターよりも高い発現レベルの該ポリペプチドをもたらすプロモーターの制御下にある染色体遺伝子；（ｉｉ）本発明のポリペプチドをコードする自己複製染色体外エレメント；および／または（ｉｉｉ）野生型ＬＰＳと比べて大腸菌ＬＰＳのリピドＡ部分の毒性を低減させる遺伝子修飾の１つ以上を有する病原性大腸菌細菌（特に、ＵＰＥＣ）を提供する。

本発明はまた、かかる細菌培養することにより得られ得る小胞（例えば、細菌の培養中に培養培地中に放出される小胞など）を提供する。

医薬組成物
本発明は、（ａ）本発明のポリペプチド、抗体、小胞および／または核酸；ならびに（ｂ）薬学的に許容され得る担体を含む組成物を提供する。このような組成物は、例えば、免疫原性組成物、診断用試薬またはワクチンとして好適であり得る。本発明によるワクチンは、予防用（すなわち、感染を予防するため）または治療用（すなわち、感染を処置するため）であり得るが、典型的には、予防用である。

特定の態様において、本発明は、１種類以上の本発明のポリペプチドを発現または過剰発現する１種類以上の外膜小胞（ＯＭＶ）を含む免疫原性組成物を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２２、１２０、２１９、２２１、３０５、３７１、４００、４８９、５５５、５６５、５９７、５９８および５９９からなる群より選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片であるアミノ酸配列；または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含む１種類以上のポリペプチドを発現または過剰発現する１種類以上のＯＭＶを含む免疫原性組成物を提供する。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、配列番号２２、１２０、２１９、２２１、３０５、３７１、４００、４８９、５５５、５６５、５９７、５９８および５９９からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含むポリペプチドを含む。

「薬学的に許容され得る担体」としては、それ自体は、該組成物を受ける個体に有害な抗体の生成を誘発しない任意の担体が挙げられる。好適な担体は、典型的には、大きな低速で代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース、ラクトース、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）などである。かかる担体は、当業者によく知られている。ワクチンはまた、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含有するものであり得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを存在させてもよい。滅菌されたパイロジェンフリー、リン酸緩衝生理食塩水は典型的な担体である。薬学的に許容され得る賦形剤のさらなる論考は、参考文献２９６にて得られ得る。

本発明の組成物は、特に、反復投与形式でパッケージングされる場合は、抗菌薬を含むものであり得る。

本発明の組成物は、デタージェント、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含むものであってもよい。デタージェントは、一般的に、低レベル、例えば、＜０．０１％で存在させる。

本発明の組成物は、等張性を与えるためのナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含むものであってもよい。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が典型的である。

本発明の組成物は、一般的にバッファーを含む。リン酸バッファーが典型的である。
本発明の組成物は、特に、凍結乾燥される場合、または凍結乾燥された材料から再構成された材料を含む場合は、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースもしくはトレハロース）を、例えば１５〜３０ｍｇ／ｍｌ前後（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で含むものであり得る。凍結乾燥用の組成物のｐＨは、凍結乾燥前に６．１前後に調整され得る。

本発明のポリペプチドは、他の免疫調節剤をともに投与され得る。特に、該組成物は、通常、ワクチンアジュバントを含む。アジュバントは、後にさらに記載するＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる群の１種類以上から選択され得る。本発明の組成物に使用され得るアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。

Ａ． 無機質含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した無機質含有組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩類が挙げられる。本発明は、無機塩類、例えば、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など［例えば、参考文献５３の第８および９章を参照］、または異なる無機質化合物の混合物（例えば、リン酸塩と水酸化物アジュバントとの混合物、任意選択で、リン酸塩は過剰である）を含み、該化合物は、任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶質、非晶質など）をとり、該塩（１種または複数種）への吸着が好ましい。無機質含有組成物はまた、無機塩の粒子として製剤化され得る［５４］。

典型的なリン酸アルミニウムアジュバントは、非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．８４〜０．９２のＰＯ_４／Ａ１モル比を有し、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌで含まれる。低用量のリン酸アルミニウムによる吸着は、例えば、５０〜１００μｇ Ａｌ^３＋／コンジュゲート／用量が使用され得る。リン酸アルミニウムが使用され、抗原をアジュバントに吸着させないことが所望される場合、これは、遊離リン酸イオンを溶液中に含めること（例えば、リン酸バッファーの使用によって）により有利になる。

リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点（ＰＺＣ）は、リン酸塩のヒドロキシルでの置換の程度に反比例し、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応体の反応条件および濃度に応じて異なり得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変更すること（より多くのリン酸塩＝より多くの酸性ＰＺＣ）、またはヒスチジンバッファーなどのバッファーを添加すること（ＰＺＣをより塩基性にする）により改変される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。

本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液は、バッファー（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはＴｒｉｓバッファー）を含有するものであり得るが、これは、常に必要であるわけではない。該懸濁液は、好ましくは滅菌され、パイロジェンフリーである。懸濁液は、例えば１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含むものであり得る。該懸濁液はまた、塩化ナトリウムを含み得る。

本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物が使用され得る。この場合、水酸化物よりもリン酸アルミニウムが、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で多く存在し得る。

アルミニウム塩は本発明のワクチンに、Ａｌ^３＋の用量が０．２〜１．０ｍｇ／用量となるように含め得る。

Ｂ． 油状エマルジョン
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油状エマルジョン組成物は、スクアレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９（５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０、０．５％のＳｐａｎ ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化）［参考文献５３の第１０章；また、参考文献５５〜５７、参考文献５８の第１２章も参照］などを含む。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ^ＴＭインフルエンザウイルス三価サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして使用される。該エマルジョンは、好都合には、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーを含む。

該組成物における使用のための特に好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油型エマルジョンである。本明細書における使用に好ましいイサブミクロン水中油型エマルジョンは、任意選択で種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有するスクアレン／水エマルジョン、例えば、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）および／または０．２５〜１．０％ Ｓｐａｎ ８５（トリオレイン酸ソルビタン）、ならびに任意選択でＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリル（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌ）オキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロン水中油型エマルジョンなどである。サブミクロン水中油型エマルジョン、その作製方法および該組成物における使用のためのムラミルペプチドなどの免疫賦活剤は、参考文献５５および５９〜６０に詳細に記載されている。

スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ ８０のエマルジョンを使用してもよい。該エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含むものである得る。これはまた、Ｓｐａｎ ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンを含むものであり得る。このようなエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｎ ８０を有するものであり得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、より安定なエマルジョンをもたらすため≦１である。かかるエマルジョンの一例は、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳに溶解して２％溶液を得、次いで、この溶液の９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いで、混合物をマイクロフルイダイザーで処理することにより作製され得る。得られるエマルジョンは、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有するものであり得る。

スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎデタージェント（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョンを使用してもよい。

スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョンを使用してもよい。該エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．４）中にて製剤化され得る。このエマルジョンはムラミルジペプチド有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［６１］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）において、トレオニル−ＭＤＰとともに使用されている。これはまた、「ＡＦ」アジュバント［６２］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）の場合のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで使用され得る。マイクロフルイダイザー処理が好ましい。

完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。

Ｃ． サポニン製剤［参考文献５３の第２２章］
サポニン製剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花にさえ見られる異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）群のステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体である。バラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）という樹木のの樹皮から単離されたサポニンアジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ）およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ）から市販品として入手され得る。サポニンアジュバント製剤としては、精製され製剤（例えば、ＱＳ２１など）ならびに脂質製剤（例えば、ＩＳＣＯＭなど）が挙げられる。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの手法を用いて特別に精製された画分、例えば、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は、参考文献６３に開示されている。サポニン製剤はまた、コレステロールなどのステロールを含むものであり得る［６４］。

サポニンとコレステロールの組合せが、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）［参考文献５３の第２３章］と呼ばれる特有の粒子を形成するために使用され得る。また、ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質を含むものである。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭに使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１つ以上を含むものである。ＩＳＣＯＭは、参考文献６４〜６６にさらに記載されている。任意選択で、ＩＳＣＯＭＳは、さらなるデタージェント（１種類または複数種）を含まないものであってもよい［６７］。

サポニン系アジュバントの開発の概説は、参考文献６８および６９をみるとよい。

Ｄ． ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、一般的に、任意選択でリン脂質と合わせた、または製剤化されたウイルス由来の１種類以上のタンパク質を含む。これらは、一般的に、非病原性で非複製性であり、一般的に、天然ウイルスのゲノムを全く含まない。ウイルス系タンパク質は、組換えにより産生されたもの、または完全体ウイルスから単離されたものであり得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適したこのようなウイルス系タンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス由来（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス由来、麻疹ウイルス由来、シンドビスウイルス由来、ロタウイルス由来、口蹄疫ウイルス由来、レトロウイルス由来、ノーウォークウイルス由来、ヒトパピローマウイルス由来、ＨＩＶ由来、ＲＮＡ−ファージ由来、Ｑβ−ファージ由来（例えば、外皮タンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ ファージ由来、およびＴｙ由来（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）のタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献７０〜７５にさらに論考されている。ビロソームは、例えば、参考文献７６にさらに論考されている。

Ｅ． 細菌誘導体または微生物誘導体
本発明における使用に適したアジュバントとしては、細菌または微生物の誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）のの無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体などが挙げられる。

ＬＰＳの無毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４，５または６アシル化鎖とのの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態は、参考文献７７に開示されている。３ｄＭＰＬのかかる「小粒子」は、０．２２μｍ膜を通して滅菌濾過されるのに充分小さい［７７］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、例えば、ＲＣ−５２９などが挙げられる［７８，７９］。

リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４などの大腸菌由来のリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献８０および８１に記載されている。

本発明におけるアジュバントとしての使用に適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシン連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含有するヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。

ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾／類縁体（例えば、ホスホロチオエート修飾など）を含むものであり得、二本鎖または単鎖であり得る。参考文献８２、８３および８４には、可能な類縁体置換、例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンとの置換えが開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献８５−９０にさらに論考されている。

ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９、例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどに指向され得る［９１］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得るか（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮなど）、またはＢ 細胞応答の誘導により特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献９２〜９４に論考されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。

好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識に利用可能となるように構築される。任意選択で、２つのＣｐＧ オリゴヌクレオチド配列を、その３’末端で結合し、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成させ得る。例えば、参考文献９１および９５〜９７を参照のこと。

他の免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、二本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。

細菌のＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体は、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好ましくは、該タンパク質は、大腸菌由来（大腸菌易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ毒素（「ＣＴ」）または百日咳毒素（「ＰＴ」）である。無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献９８に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は参考文献９９に記載されている。該毒素または類毒素は、好ましくは、ＡおよびＢ両方のサブユニットを含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットは無毒化変異を含み、好ましくは、Ｂサブユニット変異されていない。好ましくは、該アジュバントは、無毒化ＬＴ変異型、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２などである。ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、参考文献１００〜１０７をみるとよい。アミノ酸置換についての数値符号（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、好ましくは、参考文献１０８に示されたＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットとのアラインメントに基づく。

参考文献１０９に規定された式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物またはその塩

例えば、「ＥＲ ８０３０５８」、「ＥＲ ８０３７３２」、「ＥＲ ８０４０５３」、「ＥＲ ８０４０５８」、「ＥＲ ８０４０５９」、「ＥＲ ８０４４４２」、「ＥＲ ８０４６８０」、「ＥＲ ８０４７６４」、「ＥＲ ８０３０２２」または「ＥＲ ８０４０５７」、例えば、

もまた、アジュバントとして使用され得る。

Ｆ． ヒト免疫調節剤
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節剤としては、サイトカイン、例えば、インターロイキンなど（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１１０］など）［１１１］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子ならびにマクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−ｌα）およびＭＩＰ−１β［１１２］が挙げられる。

Ｇ． 生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜接着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好適な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［１１３］または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体などが挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る［１１４］。

Ｈ． 微粒子
微粒子もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性で無毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）とポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から形成される微粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、最も好ましくは約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）が好ましく、任意選択で、負電荷を有する表面（例えば、ＳＤＳで）または正電荷を有する表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン系デタージェントで）を有するように処理される。

Ｉ． リポソーム（参考文献５３の第１３および１４章）
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献１１５〜１１７に記載されている。

Ｊ． ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［１１８］。かかる製剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤を、オクトキシノール［１１９］ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルとの組合せで、またはエステル界面活性剤を少なくとも１つのさらなる非イオン系界面活性剤（例えば、オクトキシノールなど）［１２０］との組合せでさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。

Ｋ． ホスファゼン 例えば、ＰＣＰＰ
ホスファゼンアジュバントとしては、例えば、参考文献１２１および１２２に記載のようなポリ［ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）が挙げられる。

Ｌ． ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。

Ｍ． イミダゾキノリン化合物．
イミダゾキノリンアジュバントとしては、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ−８３７」）［１２３，１２４］、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ−８４８」）［１２５］、およびこれらの類縁体；ならびにその塩（例えば、塩酸塩）が挙げられる。免疫刺激性イミダゾキノリンに関するさらなる詳細は、参考文献１２６〜１３０を見るとよい。

Ｎ． チオセミカルバゾン化合物．
チオセミカルバゾン化合物、ならびに該化合物の製剤化、製造およびスクリーニング方法（すべて、本発明におけるアジュバントとしての使用に適する）の例としては、参考文献１３１に記載されたものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、ＴΝＦ−αなどのサイトカインの産生ためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。

Ｏ． トリプタントリン化合物．
トリプタントリン化合物、ならびに該化合物の製剤化、製造およびスクリーニング方法（すべて、本発明におけるアジュバントとしての使用に適する）の例としては、参考文献１３２に記載されたものが挙げられる。トリプタントリン化合物は、ＴΝＦ−αなどのサイトカインの産生ためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。

Ｐ． ヌクレオシド類縁体
種々のヌクレオシド類縁体、例えば、（ａ）Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ（ＡΝＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：

およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１３３〜１３５に開示された化合物；（ｆ）式：

（式中：
Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲ_ａＲ_ｂ、−ＯＨ、Ｃ_１〜６アルコキシ、置換Ｃ_１〜６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ_６〜１０アリール、置換Ｃ_６〜１０アリール、Ｃ_１〜６アルキルもしくは置換Ｃ_１〜６アルキルである；
Ｒ_３は、非存在であるか、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_６〜１０アリール、置換Ｃ_６〜１０アリール、ヘテロシクリルもしくは置換ヘテロシクリルである；
Ｒ_４およびＲ_５は、各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_ｄ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキルであるか、もしくは一緒に結合してＲ_４〜５のような５員環を形成する：

（結合形成は、

で示す結合においてなされる）
Ｘ_１およびＸ_２は、各々独立して、Ｎ、Ｃ、ＯもしくはＳである；
Ｒ_８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ_２〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲ_ａＲ_ｂ、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_ｃ、−Ｏ−（Ｃ_１〜６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）_ｐＲ_ｅもしくは−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_ｄである；
Ｒ_９は、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルもしくはＲ_９ａである、ここでＲ_９ａは：

（結合形成は、

で示す結合においてなされる）
である；
Ｒ_１０およびＲ_１１は、各々独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ_１〜６アルコキシ、置換Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＮＲ_ａＲ_ｂもしくは−ＯＨである；
各Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｄ、Ｃ_６〜１０アリールである；
各Ｒ_ｃは、独立して、Ｈ、リン酸基、二リン酸基、三リン酸基、Ｃ_１〜６アルキルもしくは置換Ｃ_１〜６アルキルである；
各Ｒ_ｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、置換Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＮＨ（Ｃ_１〜６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ_１〜６アルキル）、−Ｎ（Ｃ_１〜６アルキル）_２、−Ｎ（置換Ｃ_１〜６アルキル）_２、Ｃ_６〜１０アリールもしくはヘテロシクリルである；
各Ｒ_ｅは、独立して、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_６〜１０アリール、置換Ｃ_６〜１０アリール、ヘテロシクリルもしくは置換ヘテロシクリルである；
各Ｒ_ｆは、独立して、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｄ、リン酸基、二リン酸基、三リン酸基である；
各ｎは、独立して、０、１、２もしくは３である；
各ｐは、独立して、０、１もしくは２である）
を有する化合物；または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に許容され得る塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体もしくは該互変異性体の薬学的に許容され得る塩が、アジュバントとして使用され得る。

Ｑ． リン酸基含有アクリル系主鎖に連結された脂質
リン酸基含有アクリル系主鎖に連結された脂質を含有するアジュバントとしては、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１３６，１３７］：

が挙げられる。

Ｒ． 小分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）
ＳＭＩＰとしては：
・ Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ １−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ １−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
・ １−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
・ ２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノールである；
・ 酢酸２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチル；
・ ４−アミノ−ｌ −（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン；
・ Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・ １−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール；
・ １−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール；
・ Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
が挙げられる。

Ｓ． プロテオソーム
アジュバントの一例は、第２のグラム陰性菌由来のリポ糖調製物と組合せて第１のグラム陰性菌から調製される外膜タンパク質プロテオソーム調製物であり、ここで、該外膜タンパク質プロテオソームと該リポ糖調製物は、安定な非共有結合性アジュバント複合体を形成する。かかる複合体としては、ナイセリア・メニンギティディス外膜およびリポ多糖類で構成された複合体「ＩＶＸ−９０８」が挙げられる。これらは、インフルエンザワクチン用のアジュバントとして使用されている［１３８］。

Ｔ． 他のアジュバント
免疫賦活剤として作用する他の物質は、参考文献５３および５８に開示されている。
さらに有用なアジュバント物質としては：
・ メチルイノシン５’−モノリンエステル（「ＭＩＭＰ」）［１３９］。
・ ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１４０］、例えば、式：

（式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖、非置換または置換、飽和または不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群から選択される）
を有するもの、または薬学的に許容され得るその塩もしくは誘導体。例としては、限定されないが、カジュアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カジュアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カジュアリン、７−エピ−カジュアリン、３，７−ジエピ−カジュアリンなどが挙げられる。
・ ガンマイヌリン［１４１］またはその誘導体、例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。
・ 参考文献１４２に開示された化合物。
・ 参考文献１４３に開示された化合物、例えば、アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドラ（ｈｙｄｒａ）イソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１４４，１４５］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１４６］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物およびベンズアゾール化合物［１４７］。
・ ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１４８］。
・ カチオン脂質と（通常、中性の）共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）、例えば、アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパナミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）ブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^ＴＭ」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパナミニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）などとの製剤が挙げられる。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウム塩を含有する製剤が好ましい［１４９］。

本発明はまた、上記に特定したアジュバント１種類以上の組合せを含み得る。例えば、以下の組合せ：（１）サポニンと水中油型エマルジョン［１５０］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１５１］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意選択で、＋ステロール）［１５２］；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組合せ［１５３］；（６）１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、５％のｐｌｕｒｏｎｉｃ−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、マイクロフルイダイザー処理してサブミクロンエマルジョンにしたもの、またはボルテックスして大粒径エマルジョンを作製したもののいずれか（７）。２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）からなる群由来の１種類以上の細菌の細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；（８）１種類以上の無機塩類（例えば、アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬなど）；ならびに（９）１種類以上の無機塩類（例えば、アルミニウム塩など）＋免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列など）が、本発明におけるアジュバント組成物として使用され得る。

本発明の組成物は、好ましくは、尿路病原性感染に有効に対処するために、細胞媒介性免疫応答ならびに体液性免疫応答の両方を惹起する。この免疫応答は、好ましくは、長期持続性（例えば、中和）抗体およびＵＰＥＣ関連抗原に曝露されると速やかに応答し得る細胞媒介性免疫を誘発する。

一般的に、２つの型のＴ細胞、ＣＤ４およびＣＤ８細胞が細胞媒介性免疫および体液性免疫を開始および／または増強するのに必要であると考えられている。ＣＤ８ Ｔ細胞はＣＤ８コレセプターを発現し得、一般に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とよばれる。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示された抗原を認識（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ）するか、またはこれと相互作用することができる。ＣＤ４ Ｔ細胞はＣＤ４コレセプターを発現し得、一般に、Ｔヘルパー細胞とよばれる。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合された抗原性ペプチドを認識することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、ＣＤ４細胞は、サイトカインなどの因子を分泌し得る。このような分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答を増強する他の細胞を活性化し得る。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４^＋細胞は、機能的に異なる２つのサブセット：ＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型にさらに分けることができ、これらは、そのサイトカインおよびエフェクター機能において異なる。

活性化されたＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増強し（例えば、抗原特異的ＣＴＬ産生の増大）、したがって、細胞内感染における応答において特に重要である。活性化されたＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βの１種類以上を分泌し得る。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が活性化されることにより、局所炎症性反応をもたらし得る。ＴＨ１免疫応答はまた、ＩＬ−１２によってＢ細胞およびＴ細胞の成長が刺激されることにより、免疫応答を拡張する機能を果たし得る。ＴＨ１に刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。

活性化されたＴＨ２細胞は、抗体産生を増強し、したがって、細胞外感染における応答において特に重要である。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の１種類以上分泌し得る。ＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞の産生をもたらし、将来的な防御をもたらし得る。

免疫応答の増強としては、ＴＨ１免疫応答の増強およびＴＨ２免疫応答の１つ以上が挙げられ得る。ＴＨ１免疫応答の増強としては、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関連する１種類以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β）の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増大、またはＩｇＧ２ａ産生の増大の１つ以上が挙げられ得る。好ましくは、ＴＨ１免疫応答の増大としては、ＩｇＧ２ａ産生の増大が挙げられる。ＴＨ２免疫応答の増強としては、ＴＨ２免疫応答と関連する１種類以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）の増大、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞産生の増大の１つ以上が挙げられ得る。好ましくは、ＴＨ２免疫応答の増大としては、ＩｇＧ１産生の増大が挙げられる。

ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを用いて惹起され得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的に、アジュバントなしの抗原の免疫処置に比べて、ＩｇＧ２ａ産生のレベルの増大を誘発する。本発明における使用に適したＴＨ１アジュバントとしては、例えば、サポニン製剤、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドなどは、本発明における使用に好ましいＴＨ１アジュバントである。

ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを用いて惹起され得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的に、アジュバントなしの抗原の免疫処置に比べて、ＩｇＧ１産生のレベルの増大を誘発する。本発明における使用に適したＴＨ２アジュバントとしては、例えば、無機質含有組成物、油状エマルジョンならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体が挙げられる。アルミニウム塩などの無機質含有組成物は、本発明における使用に好ましいＴＨ２アジュバントである。

好ましくは、本発明は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントの組合せを含む組成物含む。好ましくは、かかる組成物は、ＴＨ１の増強およびＴＨ２応答の増強、すなわち、アジュバントなしの免疫処置と比べてＩｇＧ１の産生およびＩｇＧ２ａ産生の両方の増大を誘発する。さらにより好ましくは、ＴＨ１およびＴＨ２アジュバントの組合せを含む組成物は、単一のアジュバントを用いた免疫処置と比べて（すなわち、ＴＨ１アジュバント単独を用いた免疫処置またはＴＨ２アジュバント単独を用いた免疫処置と比べて）ＴＨ１の増加および／またはＴＨ２免疫応答の増大を誘発する。

免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答は、ＴＨ１応答の増強およびＴＨ２応答の増強の一方または両方をもたらす。

免疫応答の増強は、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答は、全身性免疫応答のの増強および粘膜免疫応答の増強の一方または両方をもたらす。好ましくは、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＩｇＡの産生の増大を含む。

水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に好ましく、抗原は、一般的に、これらの塩に吸着させる。リン酸カルシウムは別の好ましいアジュバントである。

本発明の組成物のｐＨは、好ましくは６〜８、好ましくは約７である。安定なｐＨは、バッファーの使用によって維持され得る。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジンバッファー［１５４］を用いることが好ましい。該組成物は、滅菌された、および／またはパイロジェンフリーであり得る。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。

該組成物は、バイアルにて提示され得るか、または充填済シリンジにて提示され得る。シリンジは、針が設けられたものであっても、そうでなくてもよい。シリンジは、単回用量の該組成物を含むものであるが、バイアルは、単回用量または反復用量を含むものであり得る。注射用組成物は、通常、液状の溶液または懸濁液である。あるいはまた、該組成物は、注射前に液状ビヒクル中で溶液または懸濁液にするための固体形態（例えば、凍結乾燥）にて提示され得る。

本発明の組成物は、単位投与形態または反復形態にパッケージングされたものであり得る。反復投与形態には、バイアルが予め充填されたシリンジよりも好ましい。有効投薬用量は、常套的に確立され得るが、注射用組成物の典型的なヒト用量は０．５ｍｌの容量を有する。

本発明の組成物が使用前に即時調製され、（例えば、成分が凍結乾燥された形態で提示される）、キットとして提示される場合、キットは、２つのバイアルを含むものであり得るか、または１つの充填済シリンジおよび１つのバイアルを含む（シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化するために使用される）ものであり得る。

したがって、本発明は、第１の成分および第２の成分を備えるキットであって、第１の成分が、１種類以上の本発明のポリペプチド、抗体、小胞および／または核酸を含み、第２の成分が、以下：患者への組成物の投与のための使用説明書、シリンジまたは他の送達デバイス、アジュバントおよび／または薬学的に許容され得る配合用溶液の１つ以上を含むキットを提供する。

本発明はまた、本発明の免疫原性組成物が予め充填された送達デバイス（例えば、シリンジ）を提供する。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原（１種類または複数種）、ならびに、必要に応じて任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」により、単回用量または一連の量の一部としてのいずれかでの個体への該量の投与が、処置または予防に有効であることが意図される。この量は、処置対象の個体の健康状態および体調、処置対象の個体の年齢、分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの配合、処置する医師による病状の評価、ならびに他の関連要素に応じて異なる。該量は、常套的な試行により決定され得る比較的広い範囲に含まれ、各髄膜炎菌糖抗原／用量の典型的な量はｌμｇ〜１０ｍｇ／抗原であることが期待される。

医薬的使用
本発明はまた、患者に、治療有効量の本発明の組成物投与することを含む、患者の処置方法を提供する。患者は、疾患自体のリスクがあり得るか、または妊娠女性であり得る（「母体免疫処置」［１５５］）のいずれかである。

本発明は、医薬（例えば、免疫原性組成物もしくはワクチンとして）または診断用試薬としての使用のための本発明の核酸、ポリペプチド、小胞または抗体を提供する。また、（ｉ）ＥｘＰＥＣ菌によって引き起こされる疾患および／または感染を処置または予防するため医薬；（ｉｉ）ＥｘＰＥＣ菌に対して惹起される抗体もしくはその存在を検出するための診断用試薬；および／または（ｉｉｉ）ＥｘＰＥＣ菌に対する抗体を惹起し得る試薬の製造における本発明の核酸、ポリペプチド、小胞または抗体の使用が提供される。前記ＥｘＰＥＣ菌は、任意の血清型または菌株のものであり得る。好ましくは、ＥｘＰＥＣ菌はＵＰＥＣ菌株である。

本発明は、菌血症、髄膜炎、尿路感染、腎盂腎炎および／または膀胱炎などの疾患の予防および／または処置に有用である。本発明は、尿路感染の処置に特に有用である。

患者は、好ましくはヒトである。ヒトは、好ましくは、成人（例えば、年齢２０〜５５歳の間）である。また、小児または青年期の人を対象とするワクチンも、例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するために成人に投与され得る。女性患者は、好ましいサブセットであり、年齢が２０〜５５歳の性的に活発な女性は、特に好ましい患者群である。別の群の患者は、年齢が１２〜２０の女性である（特に、予防的使用のため）。

他の考えられ得る患者動物としては、ＥｘＰＥＣのキャリアであるイヌが挙げられる［１５６，１５７］。

治療用処置の有効性を確認する方法の一例は、本発明の組成物の投与後の感染のモニタリングを伴う。予防用処置の有効性を確認する方法の一例は、投与後の投与されたポリペプチドに対する免疫応答のモニタリングを伴う。本発明の組成物の免疫原性は、これを試験被験体（例えば、年齢１２〜１６ヶ月の小児、または動物モデル、例えばマウスモデル）に投与し、次いで、標準的なパラメータ、例えば、ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を測定することにより測定され得る。このような免疫応答は、一般的に、組成物投与後の４週間前後に測定し、組成物の投与前に測定した値と比較する。組成物が用量で投与される場合、１回より多くの投与後測定が行なわれ得る。ＵＴＩの種々のマウスモデルが入手可能である［例えば、参考文献１５８および１５９〜１６０］。

ポリペプチド抗原の投与は、免疫を誘発するための処置に好ましい方法である。本発明の抗体の投与は、別の好ましい処置方法である。この受動免疫処置方法は、新生児または妊娠女性に特に有用である。この方法では、典型的には、ヒト化された、または完全にヒトのモノクローナル抗体が使用される。

本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接的送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内もしくは組織の間質腔に）によって、または経直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー剤）、経膣、経表面、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮膚貫通（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻腔内、舌下、眼内、耳内（ａｕｒａｌ）、肺経由もしくは他の粘膜投与によって行なわれ得る。大腿部または上腕部への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下注射針）を介するものであり得るが、無針注射も択一的に使用され得る。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。

本発明は、全身性および／または粘膜免疫を惹起するために使用され得る。好ましくは、全身性および／または粘膜免疫の増強は、ＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答の増強に反映される。好ましくは、免疫応答の増強には、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増大が含まれる。

投薬処置は、単回用量スケジュールまたは反復投与スケジュールであり得る。反復投与は、初回免疫処置スケジュールおよび／または追加免疫処置スケジュールにおいて使用され得る。初回免疫刺激投与スケジュールの後に追加免疫刺激投与スケジュールが行なわれ得、反復投与スケジュールでは、種々の用量が同じまたは異なる経路で投与され得、例えば、非経口初回免疫刺激および粘膜追加免疫刺激、粘膜初回免疫刺激および非経口追加免疫刺激などである。初回免疫刺激投与間の好適なタイミング（例えば、４〜１６週間）および初回免疫刺激と追加免疫刺激間の好適なタイミングは、常套的に決定され得る。例えば、ワクチン接種の初回免疫刺激の過程は、１〜１０の別々の投与を含むものであり得、その後、続いて他の用量が免疫応答を維持および／または強化するのに必要とされる時間間隔、例えば、１〜４ヶ月間隔で第２の投与として投与され、必要な場合は、続いて数ヵ月後に１回または複数の投与が行なわれる。

細菌感染は、身体の種々の領域に影響を及ぼし、そのため組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、組成物は、液状の溶液または懸濁液のいずれかとして注射用物質として調製され得る。注射前に液状ビヒクル中で溶液または懸濁液にするのに適した固体形態もまた、調製され得る（例えば、凍結乾燥された、または噴霧凍結乾燥された組成物）。組成物は、経表面的投与用、例えば、軟膏、クリーム剤または散剤として調製され得る。組成物は、経口投与用、例えば、錠剤またはカプセル剤として、スプレー剤として、またはシロップ剤として（任意選択で、フレーバー含有）として調製され得る組成物は、肺投与用、例えば、微粉末剤またはスプレー剤を用いて吸入剤として調製され得る。組成物は、挫剤またはペッサリーとして調製され得る。組成物は、経鼻、耳内または眼内投与用、例えば、スプレー剤、滴剤、ゲル剤または粉剤として調製され得る［例えば、参考文献１６１および１６２］。組成物は、組み合わされた組成物が、患者への投与直前に再構成されるように設計されたキットの形態であり得る。かかるキットは、液状形態の１種類以上の抗原および凍結乾燥された１種類以上の抗原を含むものであり得る。

本発明の組成物は患者に、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同じ診察（ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ）中、または医療従事者（ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）の訪問（ｖｉｓｉｔ）中）、例えば、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、コンジュゲートＨ．インフルエンザｂ型ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチンなどと実質的に同時に投与され得る。同様に、該組成物は患者に、抗生物質、特に、ＵＰＥＣに対して活性ならびに抗生物質化合物と実質的に同時に（例えば、同じ診察中または医療従事者の訪問中）投与され得る。

本発明の組成物のさらなる抗原性成分
本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび１種類以上の以下のさらなる抗原：
− Ｎ． メニンギティディス血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ（好ましくは、４種類すべて）由来の糖抗原、例えば、血清群Ｃ由来の参考文献１６３に開示されたオリゴ糖または参考文献１６５のオリゴ糖［参考文献１６４もまた参照］など
− Ｎ．メニンギティディス血清群Ｂ由来の抗原、例えば、参考文献１６６〜１７４などに開示されたものなど
− ストレプトコッカス・ニューモニエ由来の糖抗原［例えば、１７５，１７６，１７７］
− Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、不活化ウイルスなど［例えば、１７８，１７９］
− Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、表面抗原および／またはコア抗原など［例えば、１７９，１８０］
− Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、１８１］
− ＨＩＶ由来の抗原［１８２］
− ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイドなど［例えば、参考文献１８３の第３章］、例えば、ＣＲＭ_１９７変異型［例えば、１８４］
− 破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイドなど［例えば、参考文献１８３の第４章］
− 百日咳菌由来の抗原、例えば、百日咳ホロ毒素（ＰＴ）など、および百日咳菌由来線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、任意選択でまた、ペルタクチンならびに／または細胞凝集原２および３との組合せで ［例えば、参考文献１８５および１８６］
− ヘモフィルス・インフルエンザＢ由来の糖抗原［例えば、１６４］
− ポリオ抗原（１種類または複数種）［例えば、１８７，１８８］、例えば、ＩＰＶなど
− 麻疹、流行性耳下腺炎および／または風疹抗原［例えば、参考文献１８３の第９章、１０章および１１章］
− 水痘抗原
− インフルエンザ抗原（１種類または複数種）［例えば、参考文献１８３の第１９章］、例えば、血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質など（インフルエンザ抗原は、大流行の狭間（例年）の流感菌株由来のものであり得る。インフルエンザ抗原は、大流行の勃発を引き起こす可能性を有する菌株（すなわち、現在循環している菌株の血球凝集素と比べて新しい血球凝集素を有するインフルエンザ株、またはトリ被験体において病原性であり、ヒト集団に水平に伝染する可能性を有するインフルエンザ株、またはインフルエンザ株ヒトに対して病原性）由来のものであり得る。インフルエンザ抗原は、卵または細胞培養物中で増殖したウイルス由来のものであり得る。）
− モラクセラ・カタラーリス由来の抗原［例えば、１８９］
− ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）由来の糖抗原
− ストレプトコッカス・アガラクティエ由来のタンパク質抗原（Ｂ群ストレプトコッカス）［例えば、１９０〜１９５］
− 淋菌由来の抗原［例えば、１９６〜１９９］
− 肺炎クラミジア由来の抗原［例えば、参考文献２００〜２０６］または肺炎クラミジア由来の抗原の組合せ［例えば、２０７］
− クラミジア・トラコマチス由来の抗原、またはＣ．トラコマチス由来の抗原の組合せ［例えば、２０８］
− ポルフィロモナス・ジンジバリス由来の抗原［例えば、２０９］
− 狂犬病抗原（１種類または複数種）［例えば、２１０］、例えば、凍結乾燥された不活化ウイルスなど［例えば、２１１、ＲａｂＡｖｅｒｔ^ＴＭ］
− パラミクソ・ウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ［２１２，２１３］）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［２１４］）由来の抗原（１種類または複数種）
− バシラス・アンスラシス由来の抗原［例えば、２１５，２１６，２１７］
− 化膿連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）由来の抗原［例えば、１９１，２１８，２１９］
− 黄色ブドウ球菌由来の抗原［例えば、２２０］
− フラビウイルスファミリー（フラビウイルス属）のウイルス、例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、４つの血清型のテング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス由来の抗原など
− ぺスティウイルス抗原、例えば、ブタコレラ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｆｅｖｅｒ）ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルスおよび／またはボーダー病ウイルスなど
− パルボウイルス抗原、例えば、パルボウイルスＢ１９由来
− ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原［２２１］
を含む組成物を提供する。

該組成物は、これらのさらなる抗原の１種類以上を含むものであり得る。

別の実施形態において、本発明の抗原は、泌尿生殖器の疾患および／または性感染疾患に対して女性を保護するために設計されたワクチンにおける使用に適した１種類以上のさらなる非大腸菌抗原と組み合わされる。例えば、該抗原は、ストレプトコッカス・アガラクティエ、クラミジア・トラコマチス、淋菌、パピローマウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群由来の抗原と合わされ得る。ヒトパピローマウイルス抗原が使用される場合、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ １８、ＨＰＶ ６および／またはＨＰＶ １１の１種類以上に由来のものであり得る。

好ましい淋菌性抗原としては、ｎｇｓ１３（ＯｍｐＡ）、ＯｍｐＨ、ｎｇｓ５７６（ペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）タンパク質）、ｎｇｓ４１およびｎｇｓ１１７の１種類以上が挙げられる。

好ましいＨＰＶ抗原としては、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ １８、ＨＰＶ ６およびＨＰＶ １１の１種類以上が挙げられる。

好ましいクラミジア・トラコマチス抗原としては、ＷＯ ０５／００２６１９に開示されたＣＴ０４５、ＣＴ０８９、ＣＴ２４２、ＣＴ３１６、ＣＴ３８１、ＣＴ３９６、ＣＴ３９８、ＣＴ４４４、ＣＴ４６７、ＣＴ５４７、ＣＴ５８７、ＣＴ８２３、ＣＴ７６１の１種類以上およびこれらの抗原の特定の組合せが挙げられる。

好ましい肺炎クラミジア抗原としては、ＷＯ ０５／０８４３０６に開示されたＣＰｎＯ３２４、Ｃｐｎ０３０１、Ｃｐｎ０４８２、Ｃｐｎ０５０３、Ｃｐｎ０５２５、Ｃｐｎ０５５８、Ｃｐｎ０５８４、Ｃρｎ０８００、Ｃｐｎ０９７９、Ｃｐｎ０４９８、Ｃｐｎ０３００、Ｃｐｎ００４２、Ｃｐｎ００１３、Ｃｐｎ４５０、Ｃｐｎ０６６１、Ｃｐｎ０５５７、Ｃｐｎ０９０４、ＣｌｐｎＯ７９５、Ｃｐｎ０１８６およびＣｐｎ０６０４の１種類以上ならびにこれらの抗原の特定の組合せが挙げられる。

好ましいＧＢＳ抗原としては、ＧＢＳ８０、ＧＢＳ １０４、ＧＢＳ ５９、ＧＢＳ ６７、ＧＢＳ ３２２およびＧＢＳ ２７６の１種類以上が挙げられる。

別の実施形態において、本発明の抗原の組合せは、高齢者または免疫障害の個体を保護するために設計されたワクチンにおける使用に適した１種類以上のさらなる非ＥｘＰＥＣ抗原と合わされる。例えば、該抗原の組合せは、エンテロコッカス・フェカリス、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミディス、シュードモナスエルギノーサ、レジオネラ・ニューモフィラ、リステリア・モノサイトゲネス、髄膜炎菌、インフルエンザ、およびパラインフルエンザウイルス（「ＰＩＶ」）からなる群由来の抗原と合わされ得る。

毒性タンパク質抗原は、必要な場合は無毒化され得る（例えば、化学的および／または遺伝子学的手段による百日咳毒素の無毒化［１８６］）。

ジフテリア抗原を該組成物に含める場合、破傷風抗原および百日咳抗原もまた含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原を含める場合、ジフテリアおよび百日咳抗原もまた含めることが好ましい。同様に、百日咳抗原を含める場合、ジフテリアおよび破傷風抗原もまた含めることが好ましい。従って、ＤＴＰの組合せが好ましい。

糖抗原は、好ましくは、コンジュゲートの形態である。コンジュゲート担体タンパク質としては、細菌の毒素（例えば、ジフテリア類毒素または破傷風トキソイドなど）、Ｎ．メニンギティディス外膜タンパク質［２２２］、合成ペプチド［２２３，２２４］、熱ショックタンパク質［２２５，２２６］、百日咳タンパク質［２２７，２２８］、Ｈ．インフルエンザ由来のプロテインＤ［２２９，２３０］、サイトカイン［２３１］、リンホカイン［２３１］、Ｈ．インフルエンザタンパク質、ホルモン［２３１］、増殖因子［２３１］、Ｃ．ディフィシル由来のトキシンＡまたはＢ［２３２］、鉄取込みタンパク質［２３３］、種々の病原体由来抗原由来の多数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［２３４］、例えば、Ｎ１９タンパク質［２３５］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［２３６］、ニューモリシン［２３７］などが挙げられる。好ましい担体タンパク質はＣＲＭ１９７タンパク質である［２３８］。

該組成物中の抗原は、典型的には、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在させる。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、該抗原に対して免疫応答を惹起する充分なものである。

抗原は、好ましくは、アルミニウム塩に吸着させる。

核酸免疫処置
上記の免疫原性組成物は、ポリペプチド由来の抗原ＵＰＥＣを含む。本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質抗原の使用の代替として、該抗原をコードする核酸（好ましくは、例えば、プラスミドの形態のＤＮＡ）が、核酸免疫処置に基づく組成物、方法および使用を得るために使用され得る。核酸免疫処置は、現在、発展分野であり（例えば、参考文献２３９〜２４６などを参照）、多くのワクチンに適用されている。

免疫原をコードする核酸は、患者への送達後にインビボで発現され、発現された免疫原が、次いで免疫系を刺激する。活性成分は、典型的には、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）免疫原をコードし、プロモーターに作動可能に連結された配列；および任意選択で、（ｉｉｉ）選択可能なマーカーを含む核酸ベクターの形態をとる。好ましいベクターは、（ｉｖ）複製起点；および（ｖ）（ｉｉ）の下流に、これに作動可能に連結された転写ターミネータをさらに含むものであり得る。一般に、（ｉ）および（ｖ）は真核生物系であり、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は原核生物系である。

好ましいプロモーターは、ウイルス系プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のものである。ベクターはまた、プロモーターに加えて転写調節配列（例えば、エンハンサー）（これは、プロモーターと機能的に相互作用する）を含むものであり得る。好ましいベクターとしては、極初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターが挙げられ、また、より好ましいベクターとしては、ＣＭＶイントロンＡが挙げられる。プロモーターは免疫原をコードする下流配列に、免疫原コード配列の発現がプロモーターの制御下となるように作動可能に連結されている。

マーカーを使用する場合、これは、好ましくは微生物宿主（例えば、原核生物、細菌、酵母）内で機能を果たす。マーカーは、好ましくは、原核生物の選択可能なマーカー（例えば、原核生物のプロモーターの制御下で転写される）である。好都合には、典型的なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である
本発明のベクターは、好ましくは、自己複製性エピソームベクターまたは染色体外ベクター、例えば、プラスミドなどである。

本発明のベクターは、好ましくは複製起点を含む。複製起点は、原核生物内で活性であるが、真核生物内ではそうでないことが好ましい。

従って、好ましいベクターは、該ベクターの選択のための原核生物のマーカー、原核生物の複製起点を含むが、免疫原コード配列の転写を駆動するための真核生物のプロモーターは含まない。したがって、該ベクターは、（ａ）ポリペプチド発現なしで原核生物宿主内にて増幅および選択されるが、（ｂ）増幅されることなく真核生物宿主内で発現される。この構成は、核酸免疫処置ベクターに理想的である。

本発明のベクターは、コード配列の下流に真核生物の転写ターミネータ配列を含むものであり得る。これにより、転写レベルが増強され得る。コード配列がそれ自身のターミネータ配列を有するものでない場合、本発明のベクターは、好ましくはポリアデニル化配列を含む。好ましいポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン由来のものである。

本発明のベクターは、マルチクローニング部位を含むものであり得る。

免疫原およびマーカーをコードする配列に加え、該ベクターは、第２の真核生物のコード配列を含むものであり得る。該ベクターはまた、免疫原として同じ転写物由来の第２の真核生物のポリペプチドの翻訳を可能にするため、前記第２の配列の上流に、ＩＲＥＳを含むものであり得る。あるいはまた、免疫原コード配列はＩＲＥＳの下流に存在し得る。

本発明のベクターは、非メチル化ＣｐＧモチーフ、例えば、２つの５’プリンと２つの３’ピリミジンに隣接する、グアノシンの前にシトシンを共通に有する非メチル化ＤＮＡ配列を含むものであり得る。その非メチル化形態では、このようなＤＮＡモチーフは、いくつかの型の免疫細胞の強力な刺激因子であることが示されている。

ベクターは、標的化された様式で送達され得る。受容体媒介性ＤＮＡ療法の手法は、例えば、参考文献２４７〜２５２に記載されている。核酸を含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコルにおける局所投与では、ＤＮＡが約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲で投与される。また、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約ｌμｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、約２０μｇ〜約１００μｇの範囲の濃度のＤＮＡも、遺伝子療法プロトコルにおいて使用され得る。作用の方法（例えば、コードされた遺伝子産物のレベルを増強または抑制するため）ならびに形質転換および発現の有効性などの要素は、最終的な有効性に必要とされる投薬量に影響を及ぼす考慮事項である。より広い組織面積にわたってより高い発現が所望され場合、より多くの量のベクターまたは同じ量が連続的投与プロトコルにおいて再投与されること、または種々の隣接もしくは近接する組織部分に数回投与することが、陽性治療成績を得るために必要とされる。すべての場合で、臨床試験における常套的な実験手法により、最適な治療用効果のための具体的な範囲が決定される。

ベクターは、遺伝子送達媒体を用いて送達され得る。遺伝子送達媒体は、ウイルス系または非ウイルス系起源であり得る（一般的に、参考文献２５３〜２５６を参照）。

所望の核酸の送達および所望の細胞内での発現のためのウイルス系ベクターは、当該技術分野で知られている。例示的なウイルス系ビヒクルとしては、限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば、参考文献２５７〜２６７）、アルファウイルス系ベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）；（これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラもまた使用され得る）、ポックスウイルスベクター（例えば、痘疹、鶏痘、カナリア痘、アンカラ修飾ワクシニアなど）、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献２６８〜２７３参照）が挙げられる。死菌アデノウイルス［２７４］に連結させたＤＮＡの投与もまた使用され得る。

非ウイルス系送達媒体および方法もまた使用され得、限定されないが、死菌アデノウイルス単独に連結された、または連結されていないポリカチオン縮合ＤＮＡ［例えば、２７４］、リガンド連結ＤＮＡ［２７５］、真核生物の細胞送達媒体細胞［例えば、参考文献２７６〜２８０］および核酸電荷中和または細胞膜との融合が挙げられる。裸ＤＮＡもまた使用され得。例示的な裸ＤＮＡの導入方法は、参考文献２８１および２８２に記載されている。遺伝子送達媒体としての機能を果たし得るリポソーム（例えば、イムノリポソーム）は、参考文献２８３〜２８７に記載されている。さらなるアプローチは参考文献２８８および２８９に記載されている。

使用に適したさらなる非ウイルス系送達としては、参考文献２８９に記載されたアプローチなどの機械的送達系が挙げられる。さらに、コード配列およびその発現産物は、光重合ヒドロゲル物質の堆積または電離放射線の使用［例えば、参考文献２９０および２９１］によって送達され得る。コード配列の送達に使用され得る遺伝子導入のための他の慣用的な方法としては、例えば、携帯型（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ）遺伝子導入粒子銃の使用［２９２］、または導入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用［２９０および２９３］が挙げられる。

ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）｝ 微粒子を用いるＤＮＡの送達、例えば、微粒子（これは、任意選択で、負電荷を有する表面を有するように処理される（例えば、ＳＤＳでの処理）か、または正電荷を有する表面を有するように処理される（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン系デタージェントでの処理））への吸着による送達は、特に好ましい方法である。

一般
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを含む「（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなるものであり得るか、または何か他の要素を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）もの、例えば、Ｘ＋Ｙである得る。

数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

語句「実質的に」は、「全く」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まないものであり得る。必要に応じて、語句「実質的に」は、本発明の定義で省略されていることがある。

配列表のアミノ酸配列におけるＮ末端残基は、対応するヌクレオチド配列の第１のコドンにコードされるアミノ酸で示されている。第１のコドンがＡＴＧでない場合、これは、該コドンが開始コドンである場合はメチオニンとして翻訳されるが、該配列が融合パートナーのＣ末端にある場合は、表示した非Ｍｅｔアミノ酸として翻訳されることは理解されよう。本発明では、任意の表示した非Ｍｅｔ残基の代わりにＮ末端メチオニン残基（例えば、ホルミル−メチオニン残基）を有する配列表のアミノ酸配列の各々を具体的に開示し、これらを包含する。また、配列内の任意の内部メチオニン残基で始まる配列表のアミノ酸配列の各々を具体的に開示し、これらを包含する。

上記の本文中に示すように、本発明の核酸およびポリペプチドは：
（ａ）配列表に開示する配列と同一（すなわち、１００％同一）である；
（ｂ）配列表に開示する配列と配列同一性を共有する；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比べて、離れた位置に存在し得るか、または連続的であり得る１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の単一のヌクレオチドまたはアミノ酸改変（欠失、挿入、置換）を有する；および
（ｄ）配列表のある特定の配列と、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用い、開始点（Ｎ末端または５’）から末端（３’のＣ末端）に移動するｘ個の単量体（アミノ酸またはヌクレオチド）のウィンドウをアラインメントがｐ個の単量体（このとき、ｐ＞ｘ）に拡張（ｅｘｔｅｎｄ）されるように移動させてアラインメントしたとき、ｐ−ｘ＋１個のかかるウィンドウが存在し、各ウィンドウは、少なくともｘ−ｙ個の同一のアラインメントされた単量体を有する（ここで：ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択される；ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択される；およびｘ・ｙが整数でない場合、ほぼその整数に近くなるように端数を切り上げる。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えば、ギャップ開始ペナルティ＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５で、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用）を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［２９４］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツール（ｎｅｅｄｌｅ ｔｏｏｌ）［２９５］において簡便に行なわれる）
配列を含むものであり得る。

本発明の核酸およびポリペプチドは、これらの配列（ａ）〜（ｄ）のＮ末端／５’および／またはＣ末端／３’に、さらなる配列をさらに有するものであり得る。

本発明の実施においては、特に記載のない限り、当該技術分野の技量の範囲内である化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の慣用的な方法が用いられる。かかる手法は、文献に充分に説明されている。例えば、参考文献２９６〜３０３などを参照のこと。

実験
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態または様式の実施例である。実施例は、例示の目的のためだけに提供され、本発明の範囲をなんら限定することは意図されない。

使用した数値（例えば、量、温度など）に関して正確さが確保されるように努力したが、もちろん、いくらかの実験誤差および偏差は斟酌されたい。

発明を実施するための形態
コンピュータに基づく比較用および予測用ツールを用い、
（ａ）少なくとも２つのＵＰＥＣ株と共通するが、非病原性菌株には見られない、および
（ｂ）表面会合または膜会合している
５９６個のポリペプチドを同定した。これらの５９６ ポリペプチドを表１に示し、そのアミノ酸配列を配列表に配列番号：１〜５９６として示す。表１にこれらの５９６個の配列の「ｇｉ」（ＧｅｎＩｎｆｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）受託番号を示し［１１］、この情報を用いて、（ａ）該ポリペプチドの完全な配列データベースレコードおよび（ｂ）大腸菌ゲノム内の対応するコード配列などの情報が検索され得る。例えば、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚシステム［３０４］は、「２６１１１６７４」で照会（ｑｕｅｒｙ）すると単一のレコードが得られ得［３０５］、該レコード内の「ＣＤＳ」リンクをクリックすると、対応するコード配列が表示され得る［３０６］。

本発明のポリペプチド配列は、既に公のデータベースで利用可能であるため、そのアノテーション（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）機能もまた利用可能である。該５９６個のポリペプチドの一部は、現在のアノテーションにおいて認識された機能をもたない（例えば、データベースにおいて「仮想タンパク質」と注釈が付けられている）。本発明者らは、これらのポリペプチドの基盤となる生物学的機能を解明していないが、本発明は、ここに、これらのポリペプチドの信頼性のある有用性、すなわち、本明細書に記載する免疫原性組成物を提供する。

表４に、菌株ＭＧ１６５５［３０７］、Ｗ３１１０およびＤＨ１０Ｂについて非病原性Ｋ１２配列の配列番号：１〜５９６との最も近いマッチングを報告する。

表５は、２つの異なるＵＰＥＣゲノム間で最も強いマッチングを有する４１４／５９６個のポリペプチドを示し、下線の配列番号は１００％保存を有するものである。残りの１８２個のポリペプチドは、ＵＰＥＣ株間での保存がより弱く、そのため、表５のポリペプチドが好ましい（特に、下線のもの）。

５９６個の配列のうち、１５６個を優先して選択した（表２）。表６に、これらの１５６個の配列に関する種々の情報を示す。

６６個のさらに好ましい抗原は、非病原性菌株が存在しない、表面会合している、少なくとも２つのＵＰＥＣ株に存在する、およびこれまでに抗原として同定されていないため選択した（表３）。これらのうち１９個を最初の研究用に選択した（表３において「＋」を表示）。

これらのポリペプチドをクローニングし、発現させ、精製する。精製した抗原を用いてマウスを免疫処置し、その血清をウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって解析し、インビトロおよびインビボ実験の両方においてさらに試験する。好適なインビトロ実験としては、抗体が、相補鎖媒介性細菌の死滅および／またはオプソニン食作用（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性を誘発する能力、または、ヒト上皮細胞（例えば、膀胱細胞内の）もしくは他の細胞株へのＥｘＰＥＣ株（または精製抗原）の結合をブロックする能力、および／または脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）への大腸菌細菌（例えば、Ｋ１菌株）の付着／侵入を阻害する能力を試験することが挙げられる。好適なインビボ実験としては、ＵＴＩのマウスモデル（成体マウス）における能動的および／または受動的全身性免疫処置ならびに抗原刺激、大腸菌Ｋ１株で抗原刺激した５日齢ラットにおける菌血症および髄膜炎に対する能動的または受動的免疫処置による防御、ならびにＥｘＰＥＣ株での成体マウスの免疫処置および腹腔内感染が挙げられる。

細菌のライフサイクルに対する該タンパク質の重要性は、同質遺伝子型ノックアウト変異型を創製することにより試験される。該変異型はまた、抗原によって惹起される血清が該抗原に特異的であることを確実にするために使用され得る。マイクロアレイを用いて発現パターンが試験される。保存および／または変異性は、多数の異なるＥｘＰＥＣ株由来の遺伝子を配列決定することにより評価される。

ＵＰＥＣ株に特異的であるが、非病原性菌株（片利共生および研究用菌株）には存在しない予測される表面露出タンパク質を選択するため、アッセイを行なった。選択したら、これらのタンパク質を発現させ、精製し、マウスを免疫処置するために使用する。

参考文献４３から、大腸菌のいずれかのｔｏｌ−ｐａｌ遺伝子における変異は、天然外膜タンパク質を含有する小胞の形成をもたらすことが知られている。ＵＰＥＣ株と非病原性菌株の小胞内に存在するタンパク質を比較することにより、潜在的に抗原として使用され得る小さな一群のタンパク質を選択することが可能である。

片利共生および病原性大腸菌におけるλ ｒｅｄ媒介性遺伝子操作
この方法は、野生型大腸菌株由来のｔｏｌＲ遺伝子を不活化するために使用される迅速なＰＣＲ系の方法である［３０８］。簡単には、第１の工程は、標的遺伝子（ｔｏｌＲ）および耐性マーカーカセットの上流および下流の領域を独立して増幅することからなる。工程１で得られた２種類のＰＣＲ産物をＡＢカセットの増幅産物生成体（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）と等モル濃度で混合し、第２回目のＰＣＲ（スリーウェイ（ｔｈｒｅｅ ｗａｙ）ＰＣＲ）に供し、標的遺伝子に相同な５００ｂｐ（またはそれ以上）の領域の上流および下流に隣接した耐性マーカーカセットを作製する。第３の工程では、大量（１μｇ）の所望の線状ＤＮＡを、λ−ｒｅｄコンピテント細胞内にエレクトロポレーションする。

小胞の調製
１． ＴＣＡでの沈殿による小胞の調製
ＬＢ培地に、プレートで増殖させた菌体を播種し、穏やかな攪拌下で一晩３７℃にてインキュベートした。この培養物を用いて、２００ｍｌのＬＢにＯＤ６００ ０．１で播種した。菌体をＯＤ６００ ０．４まで（または規定のとおりに）増殖させた。培養液を１０分間、４０００×ｇで遠心分離し、上清みを０．２２ｍｍフィルターに通して濾過して残留菌体除去した。

また、同じ実験を、ジピリジル（０．２５ｍＭ）をＬＢ培地に添加することにより、鉄分制限条件でも行なった。

培養上清みに、最終１０％の溶液（１００％（ｗ／ｖ）のＴＣＡ、０．４％（ｗ／ｖ）のデオキシコール酸）を添加することにより、沈殿を行なった。沈殿は、４℃で３０分間進行させた。４℃において２００００×ｇで１０分間の遠心分離により沈殿物を回収した。ペレット状物質を１０％ＴＣＡ（ｗ／ｖ）１回および無水エタノールで２回洗浄した。このペレット状物質をｓｐｅｅｄ ｖａｃにより乾燥し、−２０℃で保存した。

野生型および変異型の菌株をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、これにより、変異型菌株の上清み中には野生株よりも多くのバンドが存在することを観察することができた。無作為に選出したバンドにより、上清み中のずべてのタンパク質が膜タンパク質であることが示された。

２． 超遠心分離による小胞の調製
培養上清みを、２０００００×ｇで２時間、４℃において超遠心分離した。ペレット状物質をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、−２０℃で保存した。

３． 小胞のグアニジニウム変性
グアニジニウム変性の前に、小胞をエタノールで沈殿させた。ＰＢＳ中の１０μｇのＯＭＶは、低温無水エタノールを最終９０％まで添加することにより沈殿させた。沈殿は、−２０℃で２０分間進行させた。１３０００×ｇでの１０分間の遠心分離により沈殿物を回収した。ペレット状物質を、６Ｍグアニジニウム、１５ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を５０ｍｌで用いて再懸濁した。変性は、６０℃で６０分間進行させた。消化前、溶液を１．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）の溶液を用いて１／８に希釈し、５ｍｇのトリプシンを該希釈溶液に添加した。消化を一晩３７℃で進行させた。反応を、最終０．１％のギ酸を添加することにより停止させた。Ｏａｓｉｓ抽出カートリッジを用いてペプチドを抽出した。ペプチドを、ＭＳ−ＭＳと合わせてＬＣによって解析した。

４． 表面消化
５ｍｇのトリプシンをＰＢＳ中の１０ｍｇの小胞に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。最終０．１％のギ酸を添加することにより停止させた。ペプチドを３０Ｋｄａ排除フィルターに通す濾過によって回収し、Ｏａｓｉｓ抽出カートリッジにより抽出した。ペプチドを、ＭＳＭＳと合わせてＬＣを用いて解析した。

小胞の解析
タンパク質の定量
タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法により、ＢＳＡを標準として用いて定量した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）４〜１２％ポリアクリルアミドゲルにより、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ電気泳動装置を用いて解析した。試料をＳＤＳ試料バッファー（０．０６ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ６．８、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール、１０ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルー）中に懸濁し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｉｓ）の前に、１００℃まで５分間加熱した。泳動後、ゲルをクマシーブルーで染色した。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
タンパク質のバンドおよびスポットをゲルから切り出し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／アセトニトリル（５０／５０、ｖ／ｖ）で洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ遠心分離機（Ｓａｖａｎｔ）により乾燥させた。乾燥させたスポットを、５ｍＭ重炭酸アンモニウム、０．０１２ｍｇの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）グレードのトリプシンを含有する溶液７〜１．０ｍｌを添加することにより、３７℃で２時間消化した。消化後、０．６ｍｌを、予めスポットされた標的のマトリックス上に負荷し、風乾した。スポットを、７０％エタノール、０．１％トリフルオロ酢酸の溶液０．６ｍｌで洗浄した。ウルトラフレックスＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計を用いて質量スペクトルを得た。スペクトルを、標的上に予めスポットされた標準の組合せを用いることにより外部較正（ｅｘｔｅｒｎａｌｌｙ ｃａｌｉｂｒａｔｅ）した。タンパク質の同定を、Ｍａｓｃｏｔプログラムを用いてコンピュータにより作製フィンガープリントにより、７００〜３，０００Ｄａの質量範囲のペプチドの実験により作製したモノアイソトピックピークの自動および手動両方での比較によって行なった。

２次元電気泳動
２００ｍｇの小胞をＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ再膨潤溶液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（２％ ｗ／ｖ）ＡＳＢ１４、２％（ｖ／ｖ）ＩＰＧバッファーｐＨ ３〜１０ＮＬ、２ｍＭ ＴＢＰ、６５ｍＭ ＤＴＴ）中に再懸濁し、７ｃｍのＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐｓ（ｐＨ３〜１０ＮＬ）上に一晩吸着させた。次いで、タンパク質を２Ｄ電気泳動によって分離させた。１次元では、ＩＰＧｐｈｏｒ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｕｎｉｔを用い、逐次、１５０Ｖを３５分間、５００Ｖを３５分間、１，０００Ｖを３０分間、２，６００Ｖを１０分間、３，５００Ｖを１５分間、４，２００Ｖを１５分間、最後に５，０００Ｖを１０ｋＶｈに達するまで印加することにより泳動させた。２次元では、ストリップを、４Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、５ｍＭ ＴＢＰ、５０Ｍｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２．５％のアクリルアミドおよびブロモフェノールブルー０．２％中での２回の１０分間のインキュベーションによって平衡化した。次いで、タンパク質を、直線４〜１２％プレキャストポリアクリルアミドゲル上で分離させた。

ゲルをコロイド状クマシーブルーで染色し、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＳＩでスキャンした。画像をＩｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｅｌｉｔｅソフトウエアを用いて解析した。

ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
ペプチドを、ナノスプレー供給源を備えたＱ−ＴｏＦ Ｍｉｃｒｏ ＥＳＩ質量分析計に接続したＣａｐＬＣ ＨＰＬＣシステム上でナノＬＣによって分離した。試料を、Ｃ１８トラップカラム（３００μｍ内径×５ｍｍ）を介してＡｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８ ＮａｎｏＥａｓｅカラム（１００μｍ内径×１００ｍｍ）上に負荷した。ペプチドを、４００ｎｌ／分の流速で０．１％ギ酸の溶液中、２％〜６０％の９５％ＡＣＮの５０分間の勾配によって溶出した。溶出されたペプチドを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア、バージョン４．０を用いる自動データ依存収集（ｄａｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）プログラムに供し、このとき、ＭＳサーベイスキャンを用い、さらなるＭＳ／ＭＳフラグメンテーションのための、４００〜２，０００のｍ／ｚ範囲を超える多電荷（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｒｇｅｄ）ペプチドを自動的に選択した。３種類までの異なる成分を、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションに同時に供した（ｗｈｅｒｅ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ）。データ収集後、個々のＭＳ／ＭＳスペクトルを合わせ、ＭａｓｓＬｙｎｘによって平滑化（ｓｍｏｏｔｈ）し、セントロイド処理（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）した。ペプチドの検索および同定は、認可バージョンのＭＡＳＣＯＴを用いてバッチモードで行なった。ＭＡＳＣＯＴ検索パラメータは、（１）種：ＥｘＰＥＣ（２）誤切断の許容数（トリプシン消化の場合のみ）：６；（３）可変翻訳後修飾：メチオニン酸化；（４）ペプチド許容誤差（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：±５００ ｐｐｍ；（５）ＭＳ／ＭＳ許容誤差：±０．３Ｄａおよび（６）：ペプチド電荷：＋１〜＋４とした。先のプラットフォームに関して、ＭＡＳＣＯＴ確率解析によって規定されるわずかに有意なヒットを考慮した。少なくとも１つのペプチドからのタンパク質同定の許容のスコアの閾値をＭＡＳＣＯＴによって、トリプシン消化では１８およびプロテイナーゼＫ消化では３６と設定した。

結果
上記の解析の結果、１３個の好ましい抗原がＣＦＴ０７３株から同定された。すなわち：ｇｉ−２６１１０８６６（配列番号４８９）、ｇｉ−２６１０９８９８（配列番号５９７）、ｇｉ−２６１０７５１３（配列番号１２０）、ｇｉ−２６１０８６０４（配列番号５９８）、ｇｉ−２６１０９１３７（配列番号３０５）、ｇｉ−２６１０６４９３（配列番号２２）、ｇｉ−２６１０８１９４（配列番号２２１）、ｇｉ−２６１０８１９２（配列番号２１９）、ｇｉ−２６１０９９３１（配列番号４００）、ｇｉ−２６１１１４２８（配列番号５６５）、ｇｉ−２６１０９８３５（配列番号３７１）、ｇｉ−２６１０９８６６（配列番号５９９）およびｇｉ−２６１１１４１４（配列番号５５５）。これらを表７に示す。

抗原の解析
全身感染のマウスモデル
病原性大腸菌株と非病原性大腸菌株間の比較ゲノム解析によって選択された多数の抗原をスクリーニングするため、古典的なビルレンスアッセイに基づいた防御モデルを確立した。また、択一的に使用され得る実験モデルとしては、参考文献１５８、１５９および１６０に概要が示されたものが挙げられる。

実験モデル（免疫処置および感染）には、ビルレントＣＦＴ０７３大腸菌株の腹腔内接種によって抗原刺激された５週齢のＣＤ１異系交配マウスを使用する。抗原刺激用量は、実験的に、細菌が、成体マウスの８０％を７２時間以内に致死させることができる量と決定されており、ＣＦＴ０７３株では７×１０^７ｃｆｕ／マウスに相当する。

免疫処置プロトコル
マウスは、フロイントアジュバントを用いて１５０μｌのタンパク質溶液の皮下注射によって３回、以下の表に示したとおりに免疫処置する。

血液試料を、最初の免疫処置の前日（免疫前血清）、第３４日および第４８日（抗原刺激の前日）に採取する。免疫処置動物由来の血清を、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによって試験し、抗体力価を測定する。

抗原刺激
第４８日目に、大腸菌ＣＦＴ０７３株を、ＬＢ寒天プレート上に凍結ストックから画線培養し、インキュベーター内で一晩（ＯＮ）３７℃にてインキュベートする。第４９日目、ＯＮプレート培養物を用いて５０ｍｌのＬＢ培地に、Ｏ．Ｄ．_６００＝０．１を有するように播種し、１．５時間３７℃で攪拌下にて、菌体培養液がＣＦＴ０７３株に関して７×１０^８ｃｆｕ／ｍｌに相当するＯ．Ｄ．_６００＝０．６に達するまで増殖させる。培養液を遠心分離し、ペレット状物質を同じ用量の生理溶液中に再懸濁し、抗原刺激に未希釈で使用する。標準的なプレート計測法を用いて培養物をプレーティングし、イノキュラムを確認する。７×ｌ０^７ ＣＦＴ０７３菌体を含有する細胞懸濁液１００μｌを、１ｍｌ容シリンジを用いて対照および免疫処置マウスの腹腔内内に注射する。感染の２４、４８および７２時間後の各動物群の死亡数を記録する。

ワクチン接種による防御を、抗原刺激から７２時間のマウスのワクチン接種群における生存と対照群における生存との比較によって評価する。対照に対する生存のパーセントを、式：
（ワクチン群における生存割合−対照群における生存割合）／対照群における生存割合
を用いて計算する。

結果
免疫処置は、熱不活化ＣＦＴ０７３を用いて行なった。図１においてわかるように、ＣＦＴ０７３での抗原刺激後のマウスの生存％は、熱不活化ＣＦＴ０７３での免疫処置後に増加している。

免疫処置試験
抗原は、組み合わせて本発明の組成物が得られるように選択する。ＢＡＬＢ／ｃマウスを９つの群に分け、以下のとおりに免疫処置する。

マウスは、２週間隔で免疫処置する。最後の免疫処置から２〜３週間後、すべてのマウスに適切なＵＰＥＣ株で抗原刺激する。粘膜免疫処置（例えば、鼻腔内）を用いる場合、動物モデルには抗原刺激もまた粘膜経由で行ない、粘膜免疫原の防御効果を試験する。抗原刺激の直前、マウスから採血し、投与された抗原に対する力価を測定する。

マウスの抗原刺激のため、ビルレント細菌を適切な培地中で増殖させる。菌体を遠心分離によって回収し、再懸濁し、抗原刺激イノキュラム用に連続希釈する。ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原刺激し、曝露後３０日間、毎日観察する。

全ＩｇＧおよびＩｇＧ１／ＩｇＧ２Ａサブタイプが種々の免疫処置レジメンによるマウス血清中において、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、完全菌体および精製され組換えタンパク質において測定され得る。さらにまた、免疫処置マウスから単離された脾臓細胞および／またはＰＢＭＣにおける抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｈ細胞の評価が、マルチパラメータＦＡＣＳ解析によって行なわれ得、抗原特異的Ｔ−細胞のサイトカイン発現プロフィールが評価され得る。特に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５の産生は、精製抗原でのＴ細胞のインビトロ刺激後に測定され得る。また、各抗原／ワクチン製剤で免疫処置したマウス由来の脾細胞および／またはＰＢＭＣを、最後の免疫処置の投与の１０〜１２日後に回収し、ＵＰＥＣ菌で刺激してもよい。刺激の４時間後、続く１２時間の間ブレフェルジンＡを細胞に添加し、サイトカイン分泌をブロックする。その後、細胞を固定し、抗体で染色し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５を発現するＵＰＥＣ特異的Ｔ細胞を検出する。

Ｔ細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から、当業者に知られたさまざまな手順によって単離され得る。例えば、Ｔ細胞集団はＰＢＬの集団から、アクセサリー細胞およびＢ細胞の除去によって「富化」されたものであり得る。特に、Ｔ細胞の富化は、抗ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体を用いた非Ｔ細胞の排除によって行なわれ得る。同様に、他の抗体を用いて特定の集団の非Ｔ細胞を枯渇させ得る。例えば、抗Ｉｇ抗体分子を用いてＢ細胞を枯渇させ得、抗ＭａｃＩ抗体分子を用いてマクロファージを枯渇させ得る。

Ｔ細胞は、当業者に知られた手法によって、いくつかの異なる下位集団にさらに分画され得る。２つの主な下位集団が、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８示差発現に基づいて単離され得る。例えば、上記のようなＴ細胞の富化後、ＣＤ４＋細胞を、ＣＤ４に特異的な抗体を用いて富化させ得る。該抗体は、磁気ビーズなどの固相にカップリングさせてもよい。逆に、ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ４に特異的な抗体の使用（ＣＤ４＋細胞を除去するため）によって富化させ得るか、または固相にカップリングさせたＣＤ８抗体の使用によって単離し得る。ＵＰＥＣ感染患者由来のＣＤ４リンパ球を、形質導入の前または後にエキソビボで拡張してもよい。

Ｔ細胞の精製後、精製されたＴ細胞を、リンパ球の増殖および活性化を促進する種々のサイトカイン、例えば、限定されないが、ｒＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５で予備刺激する。

ＵＰＥＣ特異的Ｔ細胞は、上記の免疫原性ポリペプチドによって活性化され得る。ＵＰＥＣ特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋であり得る。ＵＰＥＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり得、これは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成した上記のポリペプチドまたはその断片のいずれかを提示するＵＰＥＣ感染細胞を死滅させ得る。クラミジア特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、例えば、^５１Ｃｒ放出アッセイによって検出され得る。^５１Ｃｒ放出アッセイでは、ＵＰＥＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、これらのエピトープの１種類以上を提示する標的細胞を溶解する能力が測定される。ＩＦＮγなどの抗ウイルス系因子を発現するＵＰＥＣ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞もまた本明細書において想定され、また、免疫学的方法によって、好ましくは、上記のＵＰＥＣポリペプチドの１種類以上でのインビトロ刺激後、ＩＦＮ−γまたは同様のサイトカインに関する細胞内染色によって検出され得る。ＵＰＥＣ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、リンパ増殖アッセイによって検出され得る。リンパ増殖アッセイでは、ＵＰＥＣ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞が、上記のポリペプチドの１種類以上
に応答して増殖する能力が測定される。

本発明は、一例として記載したにすぎず、本発明の範囲および精神の範囲内に留まる
変形がなされ得ることは理解されよう。

（表１−５９９個の病原性Ｅ．ｃｏｌｉ配列）

（表２−１５６個の好ましい抗原）

（表３−６６個の好ましい抗原）

（表４−Ｋ１２ヒット）

空欄は、この株において１０％を超える同一性のヒットがないことを示す。

（ＵＰＥＣ間で最も強いヒットを有する配列番号）

欄：
・ ＰＳＯＲＴ：ＰＳＯＲＴアルゴリズムによって予測される位置。Ｉ＝内膜；Ｏ＝外膜；Ｐ＝ペリプラズム
・ ＬＰ：星印は、リポタンパク質を示す
・ ＴＭＤ：膜貫通ドメインの数
・ Ｔｏｐ ｈｉｔ：特許データベースにおいて最も近いマッチング
・ ＨｉｔＬｅｎ：最も近いマッチングの長さ
・ ｅ：ＢＬＡＳＴ解析における「期待」値
・ 同一性：アラインメントの長さ全体における同一残基の数、およびアラインメントの長さ
・ クエリー％／標的％：ＥｘＰＥＣまたはデータベース配列の観点（ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）からの配列同一性％

欄：
・ ＰＳＯＲＴ：ＰＳＯＲＴアルゴリズムによって予測される位置。Ｉ＝内膜；Ｏ＝外膜；Ｐ＝ペリプラズム；Ｃ＝細胞質
・ ＴＭＤ：膜貫通ドメインの数
・ ％ＩＤ：アラインメントの長さ全体における同一残基のパーセント。

参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）

図１は、熱不活化ＣＦＴ０７３での免疫処置の後、ＣＦＴ０７３での抗原刺激後のマウスの生存％を示す。

Claims (12)

1. （ａ）配列番号
   

   

   からなる群より選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片であるアミノ酸配列；または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列、を含むポリペプチド。
2. （ａ）配列番号２２、１２０、２１９、２２１、３０５、３７１、４００、４８９、５５５、５６５、５９７、５９８および５９９からなる群より選択されるアミノ酸配列；
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
   （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片であるアミノ酸配列；または
   （ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列、
   を含むポリペプチド。
3. 前記断片が、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 医薬における使用のための請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
5. 薬学的に許容され得る担体と混合された、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
6. 薬学的に許容され得る担体と混合された２種類以上の請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
7. ワクチンアジュバントをさらに含む、請求項５または６に記載の組成物。
8. （ａ）配列番号２２、１２０、２１９、２２１、３０５、３７１、４００、４８９、５５５、５６５、５９７、５９８および５９９からなる群より選択されるアミノ酸配列；
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
   （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片であるアミノ酸配列；または
   （ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列、
   を含む１種類以上のポリペプチドを発現または過剰発現する１種類以上の外膜小胞（ＯＭＶ）を含む免疫原性組成物。
9. 前記断片が、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
10. 患者の免疫応答を高めるための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項８もしくは９に記載の免疫原性組成物の使用。
11. 患者に、請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項８もしくは９に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、患者の免疫応答を高めるための方法。
12. 前記免疫応答がＥｘＰＥＣ感染に対して防御的である、請求項１０に記載の使用または請求項１１に記載の方法。

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