JP2009542689A - 選択的カスパーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

カスパーゼ３，７，８および９とレグメイン用の新規で、著しく選択的な阻害剤および活性系プローブ（ＡＢＰ）をここに記載する。位置走査組合せライブラリ（ＰＳＣＬ）手法を用いて、多くの精製組換えカスパーゼに対する活性用の天然および非天然の両方のアミノ酸を有するペプチドアシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫ）のプールをスクリーニングする。かかるスクリーニングを用いて、ターゲットカスパーゼに向けた阻害剤特異性を制御するように変調し得るペプチド骨格上の多数の位置で構造要素を同定する。さらに、活性系プローブとしての使用に様々なタグを備え得る個々に最適化した共有結合性阻害剤並びに標識化基質を開示する。

Description

本発明は、酵素阻害分野、特に有機化合物でのシステインプロテアーゼ（カスパーゼ）の阻害に関するもので、また特に特定のカスパーゼと選択的に結合する特異的阻害剤、プローブおよび基質に関するものである。

クランＣＤシステインプロテアーゼ（カスパーゼとして既知）は、アポトーシス、すなわち組織の恒常性および損傷細胞の除去に必須のプログラムされた細胞死の厳重に制御された形態において極めて重要な役割を果たす。アポトーシスの不適切な制御は、癌、特定の神経変性病および虚血後の再かん流傷害（Reed,1998）を含むヒトの病気の７０％において役割を持つとされる。したがって、基本および臨床設定の両方においてカスパーゼを研究する手段の需要が多い。

カスパーゼは、特異な死刺激に応じて活性化される不活性チモーゲンとしてシトゾルに存在する。一度活性化すると、イニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ８，９，１０）がエクセキューショナーカスパーゼ（カスパーゼ３，７）を開裂し、活性化する。細胞死プログラムを確立するのに用いた二つの一次経路がある。一般に、内因性経路が反応を仲介する一方、外因性経路がファス(Ｆａｓ)結合のような細胞外信号によってその同族受容体に誘発され、イニシエーターカスパーゼ８の活性化を導く。両経路において、イニシエーターカスパーゼが下流のエクセキューショナーカスパーゼを開裂し、活性化する（Boatright et al., 2003; Denault and Salvesen, 2002; Salvesen, 2002; Thornberry and Lazebnik, 1998）。

内因性および外因性アポトーシス信号が同じエクセキューショナーカスパーゼの活性化に至るため、各経路の生体内のアポトーシスプロセスへの寄与を画定するのが難しいままである。さらに、エクセキューショナーカスパーゼの活性が、最も大きい非特異的カスパーゼ活量アッセイを決定付けるのに生ずる時間と共に増大する。これは、初期の活性化事象の動力学の詳細な分析を妨げる。加えて、驚くべきことに、複合プロテオーム中で個々のカスパーゼ活性を直接観察するための僅かな手段が入手し得る。現在の戦略は、特異的カスパーゼの開裂事象わ検出し得る抗体ベースの方法に大きく頼っている。しかし、タンパク質分解開裂がしばしば活性化に要求されず、複雑な翻訳後機構によりカスパーゼ活性を制御するのに役立つ多くの内因性阻害剤が存在する（Deveraux et al., 1999）。或いはまた、カスパーゼを標的とした基質および阻害剤を用いてカスパーゼ活性を直接観察することができる。しかし、ほぼ全ての市販試薬の価値は、その全体的な低い選択性により制限される（James et al., 2004）。

多数のカスパーゼファミリーの基質特異性に関する過去の研究は、蛍光性ペプチド基質の位置走査組合せライブラリ（ＰＳＣＬ）の使用に集中している（Backes et al., 2000; Thornberry et al., 1997）。我々のライブラリは、組換え体と内因的に発現したプロテアーゼとの両方の著しく選択的な阻害剤を特定する同様の位置走査ライブラリ方法をすでに用いていた（Greenbaum et al., 2000; Greenbaum et al., 2002; Nazif and Bogyo, 2001）。

先行技術文献
特許文献１（国際公開第９８／１６５０２号）には、ＡＯＭＫ機能を有すると思われる一般式
の化合物が開示されている。Ｒ１は、様々な置換アリール基およびアルキル基とすることができる。

特許文献２（国際公開第９９／１８７８１号）には、一般式Ｒ１−ＡＡ−ＮＨ−ＣＨ（Ｃ−Ｃ−ＣＯ２Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２の化合物が開示されている。

特許文献３（米国特許第６５３１４７４号）には、カスパーゼ阻害剤、特にインターロイキン１β変換酵素（“ＩＣＥ”）阻害剤である新規なクラスの化合物が開示されている。これらの化合物の一般式は
である。

特許文献４（米国特許第６６８９８４号）には、ケトンを含む一般式の化合物が開示されている。

特許文献５（米国特許６８００６１９号）にも、ケトンを含む一般式の化合物が開示されている。

特許文献６（米国特許６８７８７４３号）には、ケトンを有する一般式の化合物が開示されている。

特許文献７（米国特許６５６６３３８号）には、Ｃ末端アスパラギン酸フルオロケトン（フルオロメチルケトンではない）基を有する化合物が開示され、ここで“ＡＡ”は、天然もしくは非天然のαアミノ酸もしくはβアミノ酸またはその誘導体の残基である。

特許文献８（米国特許６９１１４２６号）には、様々なコアペプチド構造を有する物質が開示されている。完全な化合物は、追加の基、例えば〔Ｂｏｃ−Ｄ−リシン（２−Ｃｌ−Ｚ）〕〔Ｂｏｃ−Ｄ−プロリン〕〔１−アダマンタン酢酸〕を有する。

非特許文献１には、パパイン様システインプロテアーゼ（クランＣＡ，ファミリーＣ１）パパイン、ブロメラインおよびヒトカテプシンＬ，Ｖ，Ｋ，Ｓ，Ｆ，Ｂ並びに五個の二官能性クマリン蛍光基の基質特異性の研究を用いてライブラリと個々のペプチド基質の合成を容易にすることが開示されている。個々のペプチド基質がヒトカテプシンの特異性の定量のために合成、テストされた。

非特許文献２には、カスパーゼ９以外のカスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７およびカスパーゼ８を効率的に標識化するＡｓｐ−ＡＯＭＫプローブと、カスパーゼ９並びにカスパーゼ３、カスパーゼ７およびカスパーゼ８の強固な標識化を示すｂＥＶＤ−ＡＯＭＫプローブとが開示されている。また、アシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫ）‘弾頭’を含有するシステインプロテアーゼ阻害剤の合成用の固相合成方法も開示されている。

ビオチンＤＥＶＤ−ＡＯＭＫが（Merck Frosst Canada and Co.）から市販されていることが報告されている。非特許文献３を参照。

カスパーゼ１および３阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ａｏｍｋおよびＤＥＶＤ−ＣＨＯが非特許文献４に報告されている。

国際公開９８／１６５０２号パンフレット（Para et al., “Aspartate Ester Inhibitors of Interleukin-1β Converting Enzyme“） 国際公開９９／１８７８１号パンフレット（Keana et al.,“Dipeptide Apoptosis Inhibitors and Use Thereof“ ） 米国特許６５３１４７４号明細書（Wannamarker, et al., 2003年3月11日発行 “Inhitors of caspases“） 米国特許６６８９８４号明細書（Bebbington, et al., 2004年2月10日発行 “Carbmate caspase inhibitors and uses thereof“ 米国特許６８００６１９号明細書（Charrier, et al., 2004年10月5日発行 “Caspase inhibitors and uses thereof“） 米国特許６８７８７４３号明細書（Choong, et al., 2005年4月12日発行 “Small molecule inhibitors of caspases“） 米国特許６５６６３３８号明細書（Weber, et al.., 2003年5月20日発行 “Caspase inhibitors for the treatment and prevention of chemotherapy and radiation therapy induced cell death“） 米国特許６９１１４２６号明細書（Reed, et al.,2005年6月28日発行 “Methods and compositions for derepressions of IAP-inhibited caspase“）

Choe, et al., May 5, 2006, "Substrate Profiling of Cysteine Using a Combinatorial Peptide Library Identifies Functionally Unique Specificities,"J.Biol. Chem., 281(18) 12824‐12832） Kato, et al.., "Activity-based probes that target diverse cysteine protease families," Natural Chemical Biorogy ,2005, 1, 33-38 Houde et al., "Caspase-7 Expanded Function and Intrinstic Expression Level Underlies Strain-Specific Brain Phenotype of Caspase-3-Null Mice,"The journal of Neuroscience, November 3, 2004, 24(44):9977-9984 Rami et al., "Okadic acid -induced apotosis in malignant glioma cells," Neurosurg Focus,2003,14(2):Article 4 発明の概要

以下の概要は、本発明のすべての特徴および態様を有するものではなく、本発明が本明細書において説明するすべての特徴および態様を有することを示しているわけでもない。

カスパーゼ３，７，８，９用の新規な高選択的阻害剤および活性系プローブ（ＡＢＰ）の作成と用途を以下に記述する。位置走査組合せライブラリ（ＰＳＣＬ）を用いて、多数の精製した組換えカスパーゼに対する活性用の天然および非天然アミノ酸の両方を含有するペプチドアシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫ）のプールをスクリーニングする。これらのスクリーニングは、ターゲットカスパーゼの方に阻害剤特異性を制御するために修飾し得るペプチド骨格上の多数の位置で構造要素を同定する。このスクリーニングデータを用いて、活性系プローブとしての使用の様々なタグを備え得る個々の最適な共有結合阻害剤を創出した（図１）。組換カスパーゼおよび内因性カスパーゼの特異的阻害と標識化を可能にする数個のカスパーゼ選択性阻害剤およびプローブを作成した。これらの物質を、一般的なＡＢＰと特異な阻害剤の両方の無細胞系を用いるカスパーゼ活性化の動力学の研究に適用し、アポトーシス形成の誘導により触媒活性化したカスパーゼ７の全長の未開裂形態を同定する。さらに、生成した阻害剤は不可逆性で、ビオチンまたは蛍光基のような小分子タグの付加によって活性系プローブに転換することもできる。

本発明に係るカスパーゼ阻害剤は、下記の式I又はIIで表すことができる。
いくつかの実施態様においては、Ｐ４を省略する。

上述した式において、Ｐ_２とＮとの間およびＰ_４とＮとの間の直線は、Ｐ４またはＰ２が以下に示すようなプロリンであるときにのみ存在する結合を示す；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれＨ，ＮＨ_２基，アミノカルボニル基、アリール基、置換アリール基（２−ニト，３−ヒドロキシル基を含む）、アミノ基、アミノカルボニル基、低級アルキル基、シクロアルキル基または標識であり、式Ｉに関するＰ２，Ｐ３およびＰ４は、それぞれ表１に列挙した可能性あるＰ２，Ｐ３，Ｐ４基から独立して選択した基である。

式IIは、ＡＢ５３，ＡＢ５０，ＡＢ４６，ＡＢ４５およびＡＢ３７のような化合物、すなわち、Ｐ２およびＰ３を有するがＰ４を有さない化合物によって例示される。表２を説明のために示す。

上述した式は、単一の式、すなわち
で表わすことができ、ここで角括弧はＰ４を随意的に含むことを示す。

上述の化合物は、さらにビオチンまたは蛍光色素のような標識を備えることができる。これは、選択したカスパーゼをその化合物への結合によって測定し、生成したシグナルを、例えば選択したカスパーゼ（例えばカスパーゼ３，７，８，９）のアポトーシス活性、すなわち増大した誘起を研究するテスト細胞内で蛍光によって検出できる方法で使用することができる。好ましい実施形態において、Ｒ１はビオチンである。また、Ｒ１標識は、例えばフルオレセイン、ローダミン、ジゴキシグニンまたはマレイミドを含むことができる。未標識化阻害剤におけるＲ１は、例えばニトロフェノール（ＮＰ）基、好ましくは２−ニトロ、３−ヒドロキシ−ベンジル基またはアミノ基とすることができる。

上述の化合物は、Ｐ２，Ｐ３およびＰ４位置における特異的に選択されたアミノ酸側鎖によって、好ましくは、Ｐ１位置におけるアスパラギン酸塩基と、Ｐ１位置に隣接するＡＯＭＫ基を備える不可逆な結合部分（「弾頭」）によって特徴付けられる。

他の態様において、本発明は、次式IIIの特異カスパーゼ酵素に対する選択的蛍光助剤基質からなる。
ここで、点線は、Ｐ４またはＰ２が以下に示すようなプロリンであるときのみ存在する結合である。
Ｒ１がＨ，ＮＨ_２基，アミノカルボニル基、アリール基、置換アリール基（２−ニト，３−ヒドロキシル基を含む）、アミノ基、アミノカルボニル基、低級アルキル基、またはシクロアルキル基であり、
また、Ｐ２，Ｐ３およびＰ４が、それぞれ表１に列挙した可能性のＰ２，Ｐ３およびＰ４基から独立して選択した基であり、
Ｚは、Ｈ，メチル基およびメチルアセトアミド基〔−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２〕から成る群から選択するものとする。

この場合、基質はカスパーゼ活性を阻害することを意図しない。ＡＯＭＫ基または他の弾頭は存在しない。該基質をカスパーゼ活性を修飾するようにした化合物または条件と合わせて使用し、生成したカスパーゼ活性における変化（カスパーゼ阻害剤の活性のような）を蛍光の変化によって測定することができる。抱合体は、通常或る波長の光を放出するが、特異的カスパーゼによるタンパク質分解開裂によって遊離のクマリン（例えば、４−トリフルオロメチルクマリン）が、検出可能で、対応するカスパーゼ活性に比例する異なった長波長で蛍光を放出する。

開発したカスパーゼ特異阻害剤および活性部位プローブを示す。 ２Ａ組換カスパーゼ３に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｂは、組換カスパーゼ３に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｃは、組換カスパーゼ３に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ２Ｄは、組換カスパーゼ８に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｅは、組換カスパーゼ８に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｆは、組換カスパーゼ８に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ２Ｇは、組換カスパーゼ９に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｈは、組換カスパーゼ９に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｉは、組換カスパーゼ９に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ２Ｊは、組換カスパーゼ３に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｋは、組換カスパーゼ３に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ２Ｌは、組換カスパーゼ３に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｍは、組換カスパーゼ８に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ２Ｎは、組換カスパーゼ８に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｏは、組換カスパーゼ８に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ２Ｐは、組換カスパーゼ９に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ、２Ｑは、、組換カスパーゼ９に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ２Ｒは、組換カスパーゼ９に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ３Ａは、組換カスパーゼの間接競争および直接標識化による、阻害剤およびプローブ選択性の分析を示す、３Ｂは、組換カスパーゼ９に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を表した棒グラフ。 ４Ａは、活性部位プローブを伴う、細胞抽出物および生細胞における内因性カスパーゼの選択性標識化を示す、４Ｂは、活性部位プローブを伴う、細胞抽出物および生細胞における内因性カスパーゼの選択性標識化を示す、４Ｃは、活性部位プローブを伴う、細胞抽出物および生細胞における内因性カスパーゼの選択性標識化を示す、４Ｄは、活性部位プローブを伴う、細胞抽出物および生細胞における内因性カスパーゼの選択性標識化を示す。 ５Ａ〜Ｃは、アポトーシスの細胞抽出物における新規のカスパーゼ７活性中間生成物の同定を示す、５Ｂは、アポトーシスの細胞抽出物における新規のカスパーゼ７活性中間生成物の同定を示す、５Ｃは、アポトーシスの細胞抽出物における新規のカスパーゼ７活性中間生成物の同定を示す。 ６Ａは、全長活性カスパーゼ７が、独特の阻害剤の特異性を有し、下流のエクセキューショナーカスパーゼによって成熟形態まで処理されることを図示し、６Ｂは、全長活性カスパーゼ７が、独特の阻害剤の特異性を有し、下流のエクセキューショナーカスパーゼによって成熟形態まで処理されることを図示し、６Ｃは、全長活性カスパーゼ７が、独特の阻害剤の特異性を有し、下流のエクセキューショナーカスパーゼによって成熟形態まで処理されることを図示し、６Ｄは、全長活性カスパーゼ７が、独特の阻害剤の特異性を有し、下流のエクセキューショナーカスパーゼによって成熟形態まで処理されることを図示し、６Ｅは、全長活性カスパーゼ７が、独特の阻害剤の特異性を有し、下流のエクセキューショナーカスパーゼによって成熟形態まで処理されることを図示する。 ７Ａは、規範的なエクセキューショナーカスパーゼ活性の描写、７Ｂは、規範的なエクセキューショナーカスパーゼ活性の描写。 ８Ａは、アポトーシスの活性後の、ＡＢ０６で処理した２９３の抽出物におけるカスパーゼ活性の反応速度を示し、８Ｂは、アポトーシスの活性後の、ＡＢ０６で処理した２９３の抽出物におけるカスパーゼ活性の反応速度を示し、８Ｃは、アポトーシスの活性後の、ＡＢ０６で処理した２９３の抽出物におけるカスパーゼ活性の反応速度を示す。 ９Ａは、Ｐ２，Ｐ３，およびＰ４位置を有する化合物の合成の仕組みを概略的に示し、９Ｂは、Ｐ２，Ｐ３，およびＰ４位置を有する化合物の合成の仕組みを概略的に示し、９Ｃは、Ｐ２，Ｐ３，およびＰ４位置を有する化合物の合成の仕組みを概略的に示す。 側鎖化合物の構造と、本発明の阻害剤に用いる「ＡＢ」の関連する称号を示す表である。 側鎖化合物の構造と、本発明の阻害剤に用いる「ＡＢ」の関連する称号を示す表である。 側鎖化合物の構造と、本発明の阻害剤に用いる「ＡＢ」の関連する称号を示す表である。 側鎖化合物の構造と、本発明の阻害剤に用いる「ＡＢ」の関連する称号を示す表である。 側鎖化合物の構造と、本発明の阻害剤に用いる「ＡＢ」の関連する称号を示す表である。 側鎖化合物の構造と、本発明の阻害剤に用いる「ＡＢ」の関連する称号を示す表である。 ＡＢ５３およびＡＢ５３−Ｃｙ５の構造を示す。 １２Ａは、ＡＢ４６、ＡＢ５０およびＡｂ５３の構造を示す。 １２Ｂは、ＲＡＷ細胞抽出物における３個の化合物のゲル活性を示し、１２Ｃは、組換カスパーゼ３に対するゲル活性を示す。 Ｒａｗ細胞抽出物（上の３個のパネル）および組換カスパーゼ（下の３個のパネル）に対する、ＡＢ４６−Ｃｙ５、ＡＢ５０−Ｃｙ５およびＡｂ５３−ＣＹ５の活性を示す。 １４Ａは、腎臓におけるＣｙ−５で標識化したＡＢ４６およびＡＢ５０で標識化したゲルを示し、１４Ｂは、脾臓におけるＣｙ−５で標識化したＡＢ４６およびＡＢ５０で標識化したゲルを示す。 １５Ａは、スキャナを用いた胸腺におけるカスパーゼ３の生体内の標識化を示し、１５Ｂは、ブロッティングを用いた胸腺におけるカスパーゼ３の生体内の標識化を示す。

図１は、開発したカスパーゼ特異阻害剤および活性部位プローブを示す。固相化学を用いて、ニトロフェニルアセテート（ＮＰ）でキャップしたペプチドアシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫ）の位置走査組合わせライブラリ（ＰＳＣＬ）を合成する。全てのライブラリに対して、反応性ＡＯＭＫ基と直接隣接するＰ１位置を、この残基での厳格なカスパーゼの開裂要求によりアスパラギン酸として一定に保持する。残る３個の位置のうち１個を、単一の天然アミノ酸（システインおよびメチオニン＋ノルロイシンを除く全１９個）または非天然アミノ酸（非天然の４１個−下表参照）として一定に保持する（上から下まで、Ｐ２，Ｐ３およびＰ４、灰色の丸）一方、他の位置が天然アミノ酸の等運動性混合物を含む（ここで、位置は丸における「Ｍ」で標識化した）。スクリーニング後単一阻害剤化合物を選択して個々のカスパーゼの結合優先を決定する。ビオチンのようなタグを選択的阻害剤のニトロフェニルアセテートキャップの位置に加えて活性系プローブ（ＡＢＰ）を作成する。

図２Ａ〜Ｒは、組換えカスパーゼ３，８，９に対するＰＳＣＬのスクリーニングの結果を示す棒グラフである。精製した組換えカスパーゼ３，８又は９を阻害剤準ライブラリで予備培養し、続いて蛍光基質を添加する。蛍光を設定したエンドポイントで測定し、残留酵素活性を、阻害されたサンプルと対照の未阻害サンプル（後述した材料および方法を参照）の標準化蛍光信号の比から計算した。ペプチドライブラリに対するスクリーニングデータにおいて、横軸に沿って示すような所定の位置は、天然アミノ酸（図２Ａ〜Ｉ）および非天然アミノ酸（図２Ｊ〜Ｒ）を有する。残留活性値を色フォーマットに変換する階層的クラスタリングアルゴリズム（Eisen at al., 1998）を用いてクラスターダイアグラム（ヒートマップとも呼ぶ）を作成する。例えば、Ｐ２位置におけるＩは、棒グラフ上で１００％の阻害を示し、ヒートマップ（Provisional priority case 60/819,233参照）においては、ヒートマップ上の赤色または淡灰色として０％の活性を示す。

図３ＡおよびＢは、組換えカスパーゼの間接競争および直接標識化による阻害剤およびプローブ選択性の分析を示す。（ａ.）一般的なカスパーゼプローブＫＭＢ０１での阻害剤のパネルの間接競争である。個々のカスパーゼ３，７，８および９（それぞれ１００ｎＭ）を、３０分間指定阻害剤で培養し、続いて３０部位の標識化をストレプトアビジンＨＲＰを用いたビオチンブロッティングによって視覚化した。（ｂ.）特異的ＡＢＰを用いたカスパーゼ活性部位の直接標識化である。同量の活性カスパーゼ３，８，および９（１００ｍＭ）を、それぞれ指定したビオチン化活性部位プローブの増大濃度と共に３０分間培養した。活性部位標識化は、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ分析によって視覚化し、続いてステレプトアビジンＨＲＰを用いたビオチンブロッティングを行った。（＊）は、組換え酵素製剤を用いてのみ観察されるカスパーゼ３の全長形態の標識化を示す。

図４Ａ〜Ｄは、活性部位プローブによる細胞抽出物および生細胞における内因性カスパーゼの選択的標識化を示す。（ａ.）低浸透圧の２９３細胞質ゾル抽出物が、シトクロムｃ／ｄＡＴＰの添加によって内因性のアポトーシスを受けるように誘発された。ＫＭＢ０１，ｂＡＢ０６，およびｂＡＢ１３を活性化後１０分間加え、カスパーゼ活性部位の標識化を３分間行った。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いてストレプトアビジンＨＲＰを用いてビオチンブロッティングを行った。（ｂ）個々のカスパーゼの同一性を、カスパーゼ３，７および９用の特異抗血清を用いた免疫沈降を介して確認した（ＫＭＢ０１標識化後のカスパーゼ３および７の免疫沈降に関する図５Ｂも参照）。抽出物（２９３）をシトクロムｃ／ｄＡＴＰで１０分間活性化し、指定プローブ（ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３に対して最終濃度１００ｎＭ、ＫＭＢ０１に対して最終濃度１０μＭ）の添加によって標識化し、方法の項に記述したような特異抗血清を用いて標識化したカスパーゼを沈殿させた。Ｉは入力、Ｐはペレット、Ｓは特異な沈殿後の上澄みである。（ｃ.）組換えカスパーゼ８（１００ｎＭ）を直接標識化するか、またはシトクロムｃ／ｄＡＴＰ活性化若しくは活性化なしに細胞抽出物（２９３）に加え、次いで指定プローブ（最終濃度１００μＭ）で標識化した。カスパーゼ３の選択的阻害剤ＡＢ０６（最終濃度１０μＭ）も、指定サンプルへのプローブ添加前に１０分間加えた。カスパーゼの標識化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって監視し、続いてストレプトアビジンＨＲＰでビオチンブロッティングした。（ｄ.）エトポシドまたは抗ファス処理によりアポトーシスを受けるように誘発した無傷ジャーカット細胞における内因性カスパーゼ３および７の標識化である。細胞（３×１０⁶）をアポトーシス誘発剤で１５時間培養し、次いで指定プローブのパネルでさらに２時間培養することによって標識化した。ｂ−ＶＡＤ−ｆｍｋ，ＫＭＢ０１，およびｂＡＢ１９を、最終濃度１０μＭで用いた。ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３を、最終濃度１μＭで用いた。（＊）は、内因的にビオチン化したタンパク質を示す。

図５Ａ〜Ｃは、アポトーシス細胞抽出物における新しいカスパーゼ７活性化中間物の同定を示す。（Ａ）細胞質ゾル抽出物（２９３）を、シトクロムｃおよびｄＡＴＰの添加によって内因性アポトーシスを受けるよう指定時間誘発させた。各時点の終わりで、一般的なカスパーゼプローブＫＭＢ０１を加え、抽出物をさらに３０分間３７℃で培養した。標識化カスパーゼの活性部位をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって視覚化し、続いてストレプトアビジンＨＲＰでビオチンブロッティングした。サンプルを、カスパーゼ７および９特異性抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した（下のパネル）。カスパーゼの同一性は、（Ｂ）における免疫沈降実験に基づいて示された。ＦＬ−Ｃ７は、全長カスパーゼ７であり、ΔＮ−Ｃ７は２３Ｎ末端アミノ酸を除去した全長カスパーゼ７であり、ｐ２０はＮ末端ペプチドを除去したカスパーゼ７の大きな熟成サブユニットであり、またｐ２０＋Ｎ−Ｃ７は、２３残留Ｎペプチドがそのままのカスパーゼ７の大きな熟成サブユニットである。ｐ３５−Ｃ９はカスパーゼ９の大きいサブユニットの卓越した自動処理熟成形態であり、ｐ３３−Ｃ９はカスパーゼ９の大きな熟成サブユニットの代案として処理した形態である。（ｂ）特異抗血清を用いた標識化カスパーゼの免疫沈降である。細胞質ゾル抽出物（２９３）をシトクロムｃ／ｄＡＴＰの添加により１０分間活性化し（＋ｃｙｔ ｃ／ｄＡＴＰ）、次いで一般的なカスパーゼプローブＫＭＢ０１で３０分間標識化するか、または活性化せずにＫＭＢ０１で直接標識化した（−ｃｙｔ ｃ／ｄＡＴＰ）。特異抗血清を用いてカスパーゼを沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いてストレプトアビジンＨＲＰでビオチンブロッティングを行った。Ｉは標識化した抽出物の入力で、Ｐは免疫沈降したペレットである。（＊）は、交差反応のバンドを示す。（＊＊）は、多分メチオニン４５で第二転写開始部位の結果であるカスパーゼ７の形態を示す。（Ｃ）組換えＢｉｒ３ドメインによるカスパーゼ活性の阻害である。細胞質ゾル抽出物を（Ａ）と同様にして５分間活性化し、続いて１μＭのＢｉｒ３を加えた。ＫＭＢ０１（２０μＭ）を３０分間加えて、（Ａ）と同様にして残留カスパーゼ活性部位を標識化した。

図６Ａ〜Ｅは、全長活性カスパーゼ７が独特の阻害剤特異性を有し、下流のエクセキューショナーカスパーゼによって熟成形態に処理されることを示す。（Ａ）カスパーゼ３の特異的阻害剤が、カスパーゼ７の触媒活性の全長形態の蓄積を生起する。２９３細胞からの細胞質ゾル抽出物をシトクロムｃ／ｄＡＴＰで指定時間活性化し、続いてＫＭＢ０１（左パネル）で標識化し、図５Ａのようにカスパーゼ７特異抗体（右パネル）でウエスタンブロッティングを行った。（Ｂ）全長カスパーゼ７は、活性カスパーゼ３を欠いた細胞においては蓄積しない。（Ｂ）ＭＣＦ−７細胞からの抽出物を２９３抽出物に変えて用いたことを除いて（Ａ）と全く同じ実験である。（＊＊）は、多分メチオニン４５で第二転写開始部位の結果であるカスパーゼ７の形態を示す。（Ｃ）未阻害の２９３抽出物（図５Ａからの）、ＡＢ０６で処理した２９３抽出物（（Ａ）からの）、未阻害のＭＣＦ−７抽出物（（Ｂ）からの）におけるＦＬ−Ｃ７の相対活性の定量化である。（Ｄ）カスパーゼ７の全長および処理形態の阻害剤特異性である。抽出物（２９３）をシトクロムｃ／ｄＡＴＰで５分間活性化し、次いでＫＭＢ０１を加える前に指定の一次アミノ酸配列を有するＮＰでキャップしたＡＯＭＫ阻害剤で５分間培養し、残りのカスパーゼ活性部位を３０分間標識化できるようにした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、続いてストレプトアビジンＨＲＰ（左パネル）を用いたビオチンブロッティングまたはカスパーゼ７に対するウェスタンブロッティング（右パネル）を行った。標識化カスパーゼの同一性を示した。（Ｅ）長くした培養時間後のＡＢ０６の特異性である。抽出物を、シトクロムｃ／ｄＡＴＰと同時に指定濃度のＡＢＯ６で処理した。活性化後の指定時間で、サンプルをＫＭＢ０１（１０μＭ）で３０分間標識化した。標識化カスパーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により解析し、続いてストレプトアビジンＨＲＰを用いてビオチンブロッティングした。

図７ＡおよびＢは、規範的なエクセキューショナーカスパーゼ活性化（Ａ）の漫画表示と、「半開裂」中間物を介したカスパーゼ７活性化の提案モデルであり、ペプチドをカスパーゼ３によって除去し、続いてカスパーゼ９によって二量体の両側でリンカー領域を開裂し、十分に開裂した熟成ホモ二量体を作成する。このモデルにおいて、リンカー領域の開裂が、触媒活性部位（星）を生成するために要求される。図７Ｂは、カスパーゼ７活性化の代案モデルを示し、この場合未開裂のホモ二量体の初期処理が、リンカー領域の再配列および触媒的に有能な全長カスパーゼ７の形成になる。この「半開裂」ヘテロ二量体が、次いで下流のエクセキューショナーカスパーゼ３，６または７による急速処理用の基質となる。或いはまた、Ｎペプチドをカスパーゼ３によって除去し、続いてリンカー領域を開裂して「半開裂」複合体を生成することができる。両経路において、触媒活性の全長カスパーゼ７が生成する（破線の四角）。

図８Ａ〜Ｃは、アポトーシスの活性化後のＡＢ０６で処理した２９３抽出物におけるカスパーゼ活性化の動力学を示す。（ａ）抽出物（２９３）を図５Ａおよび６Ａにおけるのようにシトクロムｃ／ｄＡＴＰで活性化し、活性化後ＡＢ０６（最終濃度１０μＭ）で１０分間処理した。一般的なプローブＫＭＢ０１を指定時点で３０分間加えた。標識化カスパーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いてストレプトアビジンＨＲＰでビオチンブロッティングする。また、同じサンプルを、カスパーゼ７および９タンパク質レベルに対して特異なポリクロナール抗血清を用いたウェスタンブロットによって分析する。（Ｂ）図６Ａに示したサンプルのカスパーゼ９免疫ブロットである。（Ｃ）図６Ａに示したサンプルのカスパーゼ９の免疫ブロットである。

アポトーシス中のカスパーゼ活性化の詳細な研究は、高く制御された一時的な方法でプロテアーゼを監視するのに用いることができる高感度の道具を必要とする。カスパーゼの基質特異性および活性部位トポロジーのような生化学的性質の理解に対して相当な進歩を遂げているが、複雑なプロテオーム、無傷細胞または全有機体に関連して特異カスパーゼターゲットを監視するのに有効な小分子が欠如している。いくつかの最近の研究では、広いスペクトルの活性系プローブを用いて無傷細胞における内因性カスパーゼ活性を監視しているが（Denault and Salvesen, 2003; Tu et al., 2006）、プローブの総合的な高い反応性が、カスパーゼ活性化の実時間解析への使用を妨げている。これら特異な活性化事象を分析するのに用いることができる著しく選択的な活性部位プローブおよび阻害剤を以下に記述する。天然および非天然アミノ酸の両方を含有するペプチドアシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫ）での位置走査手法を用いて、著しく選択的な共有結合阻害剤および活性部位プローブの設計を可能にする特異な要素を同定する。これらの化合物は、カスパーゼ活性化の生体外研究に大きな価値を有し、また他のクラスの活性系プローブについて最近報告された（Blum et al., 2005; Joyce et al., 2004）ような生体内画像解析に適用できる可能性を有する。

ここで開発した試薬を用いて内因性死経路の活性化による無細胞抽出物におけるカスパーゼを監視する。このシステムが過去に多く使われていたが、ほぼ全ての研究は活性化経路を監視するための特異な抗体または外因的に加えた放射性同位標識化カスパーゼによっている。すなわち、多分タンパク質分解プロセシングと無関係に起こる重要な活性化事象が見落とされている。したがって、ここではシトクロムｃ／ｄＡＴＰによる抽出物の刺激後、様々な時点で活性カスパーゼの全形態を標識化するのに一般的なプローブを用いることを選択する。この初期動力学研究はいくつかの興味深い発見をもたらした。第一に、内因性アポトーシスの活性化中に観察されたカスパーゼ９の主な活性形態が、リンカー領域におけるＡｓｐ３１５残基での開裂による自動触媒ｐ３５形態であることがわかった。また、リンカー領域内で代替プロセッシングによる活性ｐ３３形態も検出した。カスパーゼ３仲介フィードバックループを通して形成することを提案（Slee et al., 1999）したカスパーゼ９のｐ３７形態は検出されなかった。さらに、プローブで検出したカスパーゼ９の全形態が、観察されたカスパーゼ９形態の全てが構造的に活性なフィードバック生成物でないことを示唆する組換えＢｉｒ３ドメインによる阻害に対して高感度のままであった。

抽出物のプロファイリング研究の結果による第二の大きな発見は、内因性アポトーシス経路の刺激により抽出物において触媒活性化されたｐ３７全長カスパーゼ７形態の外観である。全タンパク質レベルにおける変化のない全長カスパーゼ７の活性化形態の同定は、この活性化が未開裂のチモーゲン形態における特異的な構造変化によるものであることを示唆する。全長カスパーゼ７が触媒的に有能になるという発想は驚くべきことであり、その理由はエクセキューショナーカスパーゼが大小サブユニット間のイニシエーターカスパーゼによる開裂を要求する不活性なホモ二量体を先ず形成して活性になると考えられている（Boatright and Salvesen, 2003）からであるる。事実、チモーゲンと、カスパーゼ７の完全活性熟成形態との両方の高分解能結晶構造は、大小サブユニット間の可撓性のリンカー領域内のＮペプチドの除去および開裂を要求して活性部位における主要な触媒残基を適応させることを示唆する（Chai et al., 2001; Riedl et al., 2001）。しかし、完全未開裂で不活性なホモ二量体および完全開裂で活性なホモ二量体としてカスパーゼ７に関して得た結晶構造は、「スナップショット」、すなわち活性化処理における局所開始および終点を示す。半開裂のヘテロ二量体を含有し得る中間物も存在しうるが、まだ特徴付けるべきでない。開裂が起こるリンカー領域は可撓なため、二量体複合体の半分の確認は、活性化になる他の半分にアロステリック制御を施し得ることである。この半開裂したカスパーゼ７のヘテロ二量体等の立証は、Ｄａｎａｕｌｔらの研究によって支持される。これらの研究において、タンパク質活性化または触媒活性化のいずれかを妨げる変異体を有するカスパーゼ７の様々な形態を用いて半開裂のヘテロ二量体を生成する。これらの研究は、他の半分の開裂により複合体の未開裂のもう一方のプローブ標識化が増加することを確認した。したがって、ＦＬ−Ｃ７チモーゲンの標識化の増加が、アポトーシスによるホモ二量体の部分処理の結果起こり、もう一方を活性化すると考えられる（図７）。この全長カスパーゼ７の活性化形態が明白な阻害剤の結合特性も示すため、カスパーゼ７の開裂形態に対して独特な活性部位構造も有するだろう。したがって、この初期の中間物は、アポトーシス経路において特異な機能的役割を果たすか、または基質に作用しない比較的一時的な中間物を示すかもしれない。

本発明は、新しく開発した選択的阻害剤ＡＢ０６を用いたカスパーゼ３および７の成熟形態の阻害による活性ＦＬ−Ｃ７（全長カスパーゼ７）の蓄積を見出した。活性ＦＬ−Ｃ７がカスパーゼ９の触媒活性を変えない阻害剤の濃度でさえも蓄積するため、これは特に興味深い。本データは、半開裂の複合体形態であろうＦＬ−Ｃ７の初期活性がアポトーシスによって仲介される一方、完全開裂ホモ二量体を生成するのにこの複合体によって効率的に処理できないことを示唆している。さらに、ＦＬ−Ｃ７をカスパーゼ３の欠如したＭＣＦ−７細胞抽出物におけるほぼ通常の動力学で処理することは、ＦＬ−Ｃ７の成熟形態へのプロセシングがカスパーゼ３依存でないことを示唆する。これらの結果を考慮すると、カスパーゼ７活性化は、ホモ二量体複合体の半開裂を仲介した初期カスパーゼ９を含み、その後開放されさらに下流のカスパーゼ７活性によって主に処理される逐次プロセスであることを示唆する。

高選択的阻害剤および活性部位プローブの開発は、アポトーシスの処理中に各カスパーゼの役割を選択的に監視する手段を提供する。さらに、活性化の一過性相を監視する能力によって一時的な中間物を曝露でき、その重要性がわかる。

本発明は、カスパーゼを例えば１個（または多くともヒトカスパーゼファミリーの４個［例えばカスパーゼ３，７，８及び９］）のメンバー、又はある実施形態においては、レグメイン（アスパラギン酸エンドペプチダーゼ）およびわずか１個のカスパーゼを選択的に阻害するカスパーゼの阻害剤である化合物からなる。

以下の表IIIは、選択性ＡＢ化合物のＫ_ｉ（ａｐｐ）値を表す。Ｋｉ（ａｐｐ）値（Ｋ_ａｓｓまたはＫ_ｏｂｓ／Ｉとも呼ぶ）は、ターゲット酵素に結合する阻害剤の速度を示す。単位は[Ｍ^−１Ｓ^−１]である。ＮＩは、試験した濃度で阻害のないことを表す。親化合物ＡＢ０９，ＡＢ０８およびＡＢ０７は、それぞれThornberryらによって画定された（Thornberry et al., 19970）カスパーゼ３，７，８および９に対する最適な基質特異性配列を含む；

最後に、表IIIにおけるデータを、化合物同定子、すなわちＡＢ数で整理して、以下の表IV において示す。

以下の表Ｖは、ＡＢ数および構造によってさらに説明した化合物を例示する。

命名法
上述した例示化合物は、「ＡＢ」で始まる任意の称号による「省略名」で始まる第１コラムにおいて同定される。「化合物名」で始まる上表の第２コラムにおいては、すぐ上のＡＢ４６に対して「Ｃｂｚ-Ｅ-８-Ｄ−ＤＭＢＡ」等の群のリストを与える。この表記法において、既知のように、Ｃｂｚはベンジルカルバメート（「Ｎｐ」またはニトロフェノール）を示し、Ｅはグルタミン酸塩に対する標準的なアミノ酸コードを示し、８は、図１０における非天然アミノ酸＃８を示し、Dはアスパラギン酸塩に対する標準的な１文字のアミノ酸コードを示し、ＤＭＢＡはジメチル安息香酸キャップを示す。この構造は、左から右に、Ｒ１，Ｐ３，Ｐ２，（アスパラギン酸塩）およびＲ２と読む。いくつかの実施例において、この構造は、Ｒ１，Ｐ３，Ｐ２，アスパラギン酸塩およびＲ２（式ＩＩ）のみを有する。さもなければ、称号はＲ１、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｒ２を有する。

定義
ここで用いる全ての用語は、特記しない限り、一般的に受け入れられている科学的意味で用いる。

用語「カスパーゼ」は、一般的に受け入れられている意味において用いる、すなわち、「ｃ」は、システインプロテアーゼ機構を示し、また、「ａｓｐａｓｅ」は、このプロテアーゼファミリーの最も明白な触媒特徴であるアスパラギン酸を開裂するグループの能力を示す。これら酵素の各々を、タンパク質分解活性化してヘテロ二量体触媒ドメインを形成する酵素前駆体として合成する。グループＩのカスパーゼは、炎症反応および類似の経路に含まれる。グループＩＩのカスパーゼは、上流／頂端カスパーゼおよびアポトーシス信号経路における臨界成分である。グループＩＩＩのカスパーゼは、下流／エフェクターカスパーゼである。カスパーゼは、Ｃ末端をポリペプチドにおけるアスパラギン酸残基に開裂し、アポトーシスへ導く細胞死経路に含まれる（Martin and Green, Cell 82:349-352(1995)参照）。カスパーゼは、インターロイキン-１β（ＩＬ-１ベータ）変換酵素（Ｉｃｅ）のファミリーの最初に同定されたメンバーに対する相同性に基づいて以前「アイス」プロテアーゼと呼ばれ、ＩＬ-１ベータの不活性な３３キロダルトン（ｋＤａ）形態を活性な１７．５ｋＤａに転換する。アイスプロテアーゼは、Ｃエレガンス発育間アポトーシスに含まれる線虫ｃｅｄ-３遺伝子と同族であることがわかり、遺伝子導入実験で線維芽細胞におけるアイスの発現がアポトーシスを細胞に誘発することを示した（Martin and Green, supra, 1995 参照）。カスパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーに関する特異なタンパク質配列は、Wang et al., “Functional Divergence in the Caspase Gene Family and family are Altered Functional Constraints : Statistical Analysis and Prediction,” Genetics, Vol.158, 1311-1320, July 2001により与えられ、以下の通りである。（1）casp-3,U13737(ヒト３)，U13738（ヒト３-β）、U49930（ラット３-），U58656（ラット３-β），Ｙ13086（マウス），U27463（ハムスター），AF083029（ニワトリ），D89784（カエル）；（２）casp-7,U37448（ヒト），Y13088（マウス），AF072124（ラット），U47332（ハムスター）；（３）casp-6,U20536（ヒト），AF025670（ラット），Y13087（マウス），AF082329（ニワトリ）：（４）casp-8,AF102146(ヒト)，AF067841（マウス）；（５）casp-10,U60519(ヒト１０ａ)，U86214（ヒト１０／b），AF111345（ヒト１０／d）；（６）casp-9,U60521(ヒト); (7) casp-2, U13021 (ヒト), U77933 (ラット), Y13085 (マウス), U64963 (ニワトリ); (8) casp-14, AF097874 (ヒト), AJ007750 (マウス); (9) casp-1, X65019 (ヒト), AF090119 (ウマ), L28095 (マウス), U 14647 (ラット), D89783 (カエル ICE-A), D89785 (カエル ICE- B); (10) casp-4, Z48810 S78281 (ヒト); (11) casp-5, X94993 (ヒト); (12) casp-13, AF078533 (ヒト); (13) casp-11, Y13O89 (マウス); (14) casp-12, Y13090 (マウス); (15)無脊椎動物のカスパーゼ, P42573 (Ｃエレガンス CED-3), Y 12261 (キイロショウジョウバエ), U81510 (寄生虫, 昆虫培養細胞)。

アイスおよびｃｅｄ-３と相同性を持つ追加のポリペプチドが同定され、カスパーゼと呼ばれ、各カスパーゼが数によって区別される。例えば、初めに同定されたアイスプロテアーゼは現在カスパーゼ１と呼ばれ、またカスパーゼ３と呼ばれるプロテアーゼは以前ＣＰＰ３２，ＹＡＭＡ，ａｐｏｐａｉｎとして知られており、また現在カスパーゼ９を示すプロテアーゼは以前Ｍｃｈ６またはＩＣＥ−ＬＡＰ６として知られていた。プロテアーゼのカスパーゼファミリーは、それぞれがC末端をアスパラギン酸残基に開裂するシステインプロテアーゼであり、通常アミノ酸配列ＱＡＣＸＧを備える保存活性部位システインを有し、Ｘが任意のアミノ酸、しばしばアルギニンにとすることを特徴とする。カスパーゼは、さらにカスパーゼ３およびカスパーゼ７を含むＤＥＶＤ開裂活性を有するものと、カスパーゼ１を含むＹＶＡＤ開裂活性を有するものとに下位範疇化される。

カスパーゼは、一般にファミリーＣ１４に分類されるが、以下に示した阻害剤は、C１４のような類似ファミリーのメンバー、レグメインを選択的に阻害する。これらファミリーは、システインペプチターゼの一般的な分類（http://www.expasy.org の分類参照）の一部である。例えば、ある場合の選択的阻害剤は、一つのファミリーメンバーだけに選択的で、以下に記述するある実施形態においては、カスパーゼを活性化する場合のみレグメインおよびカスパーゼをターゲットにし得る。カスパーゼを活性化しない場合、レグメインのみがターゲットである。

以下の説明により決定し得るように、「選択的システインプロテアーゼ阻害剤」の用語は、特定のファミリーメンバー、例えば、カスパーゼ３（EC 3.4.22.56）, カスパーゼ７(EC 3.4.22.60), カスパーゼ８（EC 3.4.22.61), カスパーゼ ９(EC 3.4.22.62), レグメイン (EC 3.4.22.34)等の活性化したシステインプロテアーゼ、および一般的ではない他のシステインプロテアーゼに結合し阻害する阻害剤を示す。ある阻害剤は、一つ以上のファミリーメンバーに対して特異的であり得る。ある阻害剤は、他のプロテアーゼに対しては低活性であるが、主なターゲットはカスパーゼ３，７，８または９の一つ以上である。的外れの阻害は、通常特異的カスパーゼに対する活性のわずか約１／５以下である。

ここで用いるような用語「アミノ」は、式ＮＲ^３ _２で表される一価の基を示し、各Ｒ^３はそれぞれ、水素、アルキル基またはアリール基である。第１級アミノ基において、各Ｒ^３基は水素である。第２級アミノ基において、Ｒ^３基の一つは水素で、他のＲ^３基はアルキル基またはアリール基である。第３級アミノ基において、Ｒ^３基の両方が、アルキル基またはアリール基である。

ここで用いるような用語「アミノカルボニル」は、式（ＣＯ）ＮＲ^４ _２で表される一価の基を示し、各Ｒ^４はそれぞれ水素、アルキル基またはアリール基である。

ここで用いるような用語「芳香族」は、炭素環式化合物もしくは基と、複素環式芳香族化合物もしくは基とを示す。炭素環式化合物は、芳香族環式構造に炭素原子のみを含有する化合物である。複素環式芳香族化合物は、芳香族環式構造にＳ，Ｏ，Ｎから選択した少なくとも１個のヘテロ原子またはその組み合わせを含有する化合物である。

ここで用いるような用語「アリール」は、一価の「芳香族」（複素環式芳香族を含む）炭素環式ラジカルを示す。このアリールは、１個の芳香族環を有するか、または芳香族環に結合もしくは融合した５員環までの炭素環式構造を含むことができる。他の環構造は、芳香族、非芳香族またはその組み合わせとすることができる。アリール基の例としては、限定することはないが、フェニル基、ビフェニル基、ターフェニル基、アントリル基、ナフチル基、アセナフチル基、アントラキノニル基、フェナントリル基、アントラセニル基、ピレニル基、ペリレニル基およびフルオレニル基がある。アリールの用語は、環状炭素原子がメチル基もしくは他の低級アルキル基、アミン基、スルホキシ基、ヒドロキシル基または窒素含基のような付加的な置換基を有する「置換アリール」基を含む。特に、以下に示すようなジメチルベンジル基を含む。また特に、２-ニトロ、３-ヒドロキシベンジル基を含む。

ここで用いるような用語「低級アルキル」は、ヒドロキシル基、窒素、ニトロキシ基、スルフヒドリル基またはサルファイド基で随意的に置換したC１-C１０の直鎖または分岐鎖アルキル化合物を示す。

用語「シクロアルキル」は、単一環もしくは多縮合環を有する３〜２０の炭素原子の環状アルキル基を示す。このシクロアルキル基は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等のような単一環構造、またはアダマンタニル等のような多環構造を含む。

阻害剤ライブラリ設計
３-ニトロ４-ヒドロキシフェニルアセチル（ＮＰ）でキャップしたテトラペプチドアシルオキシメチルケトンの初期ライブラリを、Ellman等によって開発され（Amstad et al., 2001）、当グループによって広域ペプチドＡＯＭＫ用に最適化した（Kato et al., 2005）固相法を用いて合成した（図１）。固相合成法のロバスト性によって、様々な疎水性の芳香族または嵩高な側鎖を有する非天然アミノ酸のセットを組み込むことができる。全てのライブラリに対して、反応性ＡＯＭＫ基に直接隣接したＰ１位置は、カスパーゼの厳しいＰ１特異性要求を満たすため、アスパラギン酸として一定に保持される（Stennickee et al., 2000）。全てのライブラリにおいて、残りの３個の位置のうち一つが、単独の天然アミノ酸（システインおよびメチオニン＋ノルロイシンを除く全１９個）または非天然アミノ酸（非天然の４１個からの、データ参照）として一定に保持される一方、他の位置が天然アミノ酸の混合物を含有する。したがって、全６０個のアミノ酸のスクリーニングは、それぞれ３６１の化合物を含有する１８０個の準ライブラリから成る３個のＰＳＣＬの合成によって達成された。全ての阻害剤およびプローブは、カスパーゼを標的としたＡＢＰに対して最適なものとして説明されているジメチル安息香酸アシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫ）弾頭を有する（Kato et al., 2005， Thornberry et al., 1994）。

図１に示すように、代表的な化合物の固相化学を用いて、ニトロフェニル（ＮＰ）でキャップしたペプチドアシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫ）の位置走査組合せライブラリを合成する。全てのライブラリに対して、反応性ＡＯＭ基に直接隣接したＰ１位置は、この残基においてカスパーゼの厳しい開裂要求によりアスパラギン酸として一定に保持される。残りの３個の位置の一つも、単独の天然アミノ酸（システインおよびメチオニン＋ノルロイシンを除く全１９個）または非天然アミノ酸（非天然の４１個からの−図１０参照）として一定（上から下まで、Ｐ２，Ｐ３，およびＰ４、灰色の丸）に保持される一方、他の位置は天然アミノ酸の等運動性混合物を含む（「Ｍ」の周りの灰色の丸）。単一の阻害剤化合物が、個々のカスパーゼの結合優位性を画定するスクリーニング後に選択された。ビオチンのようなタグを選択的阻害剤のニトロフェニル酢酸塩キャップの位置に付加して活性系プローブ（ＡＢＰ）を作った。

合成法の詳細は、以下の方法と材料において示す。

精製組換えカスパーゼを用いた阻害剤ライブラリスクリーニング
ペプチドＡＯＭＫのＰＳＣＬ（位置走査組合せライブラリ）の完全なセットを、簡単な蛍光性ペプチド基質アッセイを用いて３通りにスキャニングする。精製組換えカスパーゼ３，８または９を阻害剤準ライブラリで予備培養し、その後最適な蛍光基質（それぞれカスパーゼ３．８および９用のＤＥＶＤ−ＡＦＣ，ＩＥＴＤ−ＡＦＣおよびＬＥＨＤ−ＡＦＣ）を加えた。蛍光副生成物の生成をセットの終点で測定した。残留酵素活性は、阻害されたサンプルと、対照の未阻害サンプルとの基準化蛍光信号の比から計算した。カスパーゼ７は、カスパーゼ３と共通の拡張特異性を有し（Thornberry et al., 1997）、その結果全体特異性パターンがカスパーゼ３用に観察したものと類似のものとなるため、初期動力学スクリーンに用いなかった。

データ分析の手助けのために、残留酵素活性値は、残留活性値をカラーフォーマット、すなわちヒートマップに変換する階層的クラスタアルゴリズム（Eisen et al, 1998）を用いて整理され、ここで赤色および青色がそれぞれ０％および１００％の残留活性であることを示す。ヒートマップ（図２に棒グラフとして表す）は、各カスパーゼに対する阻害剤特異性領域における好ましいアミノ酸の「親和性フィンガープリント」（Greenbaun et al., 2000）を与えるように生成し、選択的阻害剤をデザインするのに用いた。この手法のさらなる詳細は、Greenbaum et al., 2000;Greenbaum et al., 2002;Nazif and Bogyo, 2001で見出し得る。

天然アミノ酸準ライブラリに対する阻害剤特異性は、従来報告されたカスパーゼに対する基質特異性データ（Thornberry et al., 1997）とよく一致する。これは、共有結合ＡＯＭＫ系阻害剤が基質と類似の方法で結合することを示唆する。しかし、基質ライブラリスクリーニングによって同定した最適なヒスチジンＰ２は、ペプチドＡＯＭＫとの関連で最適でない。さらなる構造解析が、観察した阻害剤特異性プロファイルを説明するのに手助けとなり得る。

全体として、いくつかの一般的な特異性のテーマが、ライブラリスクリーニングデータの分析で明らかになった。Ｐ２位置におけるアラニン、プロリンおよびプロリン状の非天然アミノ酸３５を含有する阻害剤は、カスパーゼ９に有利に働く一方、Ｐ３位置における非天然アミノ酸３および３４のような芳香族環を有するアミノ酸は、特異性をカスパーゼ８，９ではなくカスパーゼ３に指向させた。加えて、カスパーゼ８は、Ｐ４位置における非天然アミノ酸２９および３１のようなフェニルアラニン類似体を好み、他のカスパーゼと比べてＰ３位置におけるグルタミン酸により厳格な要求を有する。これらの一般的な特異性テーマを用いて最適な阻害剤および活性系プローブを構築する。

選択的阻害剤およびアクティビティベースドプローブの設計と評価
基質
初めに、選択的阻害剤の設計のために報告された最適基質配列の実用性を試験した。このため、基質に対して報告されたアミノ酸配列のＡＯＭＫバージョンを合成し、多数の市販の「選択的」阻害剤に用いた。

ＡＢ０７，ＡＢ０８，ＡＢ０９に対する阻害曲線
阻害剤ＡＢ０７（ＮＰ−ＬＥＨＤ−ＡＯＭＫ，カスパーゼ９）、ＡＢ０８（ＮＰ−ＬＥＴＤ−ＡＯＭＫ，カスパーゼ８）およびＡＢ０９（ＮＰ−ＤＥＶＤ−ＡＯＭＫ，カスパーゼ３）を合成し、擬一次反応速度論（Salvesen, 1989）に対するプログレス曲線方法を用いて、カスパーゼ３，７，８，９の全化合物に対して動力学の阻害定数（Ｋｉａｐｐ）を得た（表Ｉに示した構造）。さらなる情報を表IVに示し、これはＡＢ化合物に対するＫｉ（ａｐｐ）値を示した。Ｋｉ（ａｐｐ）値（ＫａｓｓまたはＫｏｂｓ／Ｉとも呼ぶ）は、ターゲット酵素に結合する阻害剤の速度を表す。単位は［Ｍ^−１ｓ^−１］である。ＮＩは、試験した濃度では阻害がないことを示し、ＮＤは、データが画定していないことを示し、ＳＤは、標準偏差を示す。

選択的カスパーゼ阻害剤の調製
一般に、予測した最適な基質配列に基いて設計した化合物は選択性に欠ける。特に、カスパーゼ９をターゲットに設計したＮＰ−ＬＥＨＤ−ＡＯＭＫは、カスパーゼ８のより速い阻害を示した。同様に、カスパーゼ３をターゲットに設計したＮＰ−ＤＥＶＤ−ＡＯＭＫは、カスパーゼ８に対して強い活性を示した。これらのデータは、最適な天然ペプチド配列の選択性が欠けることを示し、カスパーゼの業務用の「選択的」阻害剤を使用する際には注意が必要であることを示唆する。

ＰＳＣＬ法の主な制限の一つは、所定の阻害剤に対する多特異性部位に関する共同の結合相互作用の重要性を予測することができないライブラリであることである。したがって、多数の準部位からの特異性データを組合わせて添加剤選択的特性を有する単一の最適な化合物を生成するのがしばしば困難である。これは、とくに天然アミノ酸を含有するペプチドとの関連で非天然アミノ酸を用いるときに困難である。したがって、親基質系の配列におけるＰ２〜Ｐ４の位置のうち１個、２個または全てを、我々のスクリーニングデータからの最適な残基と置換するように選択した。加えて、カスパーゼターゲットのサブセットへの結合に対して選択した残基を用いて選択性を高めた。

カスパーゼ３阻害剤ＡＢ０６，ＡＢ１３，ＡＢ１２
カスパーゼ８，９ではなくカスパーゼ３，７によく委ねられた多数の天然および非天然アミノ酸があるので、カスパーゼ３に対して最適なＤＥＶＤ配列のＰ３位置における変化に注目することにした。非天然アミノ酸ＮＮ２９（ｐ−メチルフェニルアラニン）、ＮＮ３（２ピリジルアラニン）およびＮＮ３４（フェニルグリシン）を選択して配列Ｄ３ＶＤ（ＡＢ０６）、Ｄ３４ＶＤ（ＡＢ１３）およびＤ２９ＶＤ（ＡＢ１２）を生成した（図１０における非天然（ＮＮ）アミノ酸構造を参照）。相当な３／７選択性を失うことなく細胞透過性を改善するのを願って、投入したＰ４アスパラギン酸を嵩高な疎水性非天然アミノ酸２６（ナフチルアラニン）と交換することを試みた。興味深いことに、Ｐ３位置でのＮＮ３およびＮＮ３４の配置は、著しく強力で選択的なカスパーゼ３，７阻害剤を生成するのに十分であり、一方Ｐ３位置でのＮＮ２９、およびＰ４位置でのＮＮ２６の使用がカスパーゼ８との反応性を高めることにより選択性を低減させた。したがって、最適なカスパーゼ３阻害剤としてＡＢ０６およびＡＢ１３を選択した。これら化合物は共に、ＮＰキャップを長鎖ビオチン部分で置換することによって、ビオチン標識化プローブ（ｂＡＢ０６、ｂＡＢ１３）に転換される。重要なことに、これらプローブはそのカスパーゼ３，７に対する選択性を維持した（表IV）。

カスパーゼ３阻害剤ＡＢ４６，Ａｂ５０、およびＡＢ５３
コア配列ＮＰ−Ｘ−Ｍｉｘ−Ｄ−ＡＯＭＫを有する多様性の位置走査ライブラリを組換えカスパーゼ３およびＲＡＷ抽出物に対してスクリーニングし、カスパーゼ３に対して最適でレグメインには適さないＰ３残基を同定した。残基“Ｘ”は、選択した非天然アミノ酸を示し、”Ｍｉｘ“は、システイン及びメチオニンを除き、かつノレウシンを加えた全ての天然アミノ酸の混合物を示す。

阻害剤準ライブラリでの処理後レグメインまたはカスパーゼ３の残留活性パーセントを表すヒートマップを作成する。ヒートマップにおいてわかるように、赤色正方形は０％残留活性を示し、青色正方形は１００％残留活性を示す。表VIは、Ｒ＝赤色，Ｂ＝青色，Ｗ＝白色であるヒートマップとして見出した活性、すなわち約５０％を示する。

レグメインに対する最も「青い」のは、カスパーゼ３に対する最も「赤い」のでクラスターされる。残基１６（太字）は、それぞれレグメインおよびカスパーゼ３に対して最低／最高活性を示し、ＡＢ５３およびＡＢ５３−Ｃｙ５に含まれる。また、１９および３０が選択的に活性である。逆に、太字の残基６，３９，および３６は、レグメインの高い阻害と、カスパーゼ３の低い阻害になる。レグメインの残留活性パーセントは、ＲＡＷ抽出物（ＲＡＷ細胞がカテプシンＢおよびレグメイン活性とマクロファージである）において、該抽出物を阻害剤準ライブラリで前処理し、次いでプローブＡＢ５０−Ｃｙ５を加えて残留レグメイン活性部位を標識化することにより決定される。次いで、抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、Typhoonスキャナを用いて蛍光に対してスキャニングした。カスパーゼ３スクリーンデータが以前に発行され、レグメインのデータとの比較として用いた（Berger et al., 2006）。非天然アミノ酸１６が、カスパーゼ３に対して最適な特異性を付与することがわかった（上記参照）。ＡＢ５３は、非天然アミノ酸１６をカテプシンＢから選択性を離すように以前見出したＰ２プロリンを含有する足場に組み込む。ＡＢ５３およびＡＢ５３−ｃｙ（同様に高活性）を図１１に示す。

図１２につき、ＡＢ４６，ＡＢ５０およびＡＢ５３の特異性は、様々な化合物濃度で処理した後のカテプシンＢ、レグメインおよびカスパーゼ３の残留活性と比較することによって測定した。カテプシンＢおよびレグメインに対する特異性は、高レベルのプロテアーゼオフターゲットを含有するマクロファージ（ＲＡＷ）細胞抽出物において評価した（図１２Ｂ）。カスパーゼ３に対する活性は、精製した組換えプロテインを用いてテストした（図１２Ｃ）。図１２Ｂにおいて、抽出物を阻害剤で前処理し、カテプシンＢの標識化が見られるようにＡＢ４６−Ｃｙ５で標識化した。下のパネルは、レグメインとの競争を強調するためにＡＢ５０−Ｃｙ５（Ｃｙ５―ｈｅｘ−ＥＰＤ−ＡＯＭＫとして示す）で標識化したことを除いて同じ実験である。これらのデータは、プロリンを阻害剤のＰ２位置に挿入すると選択性がカテプシンＢから離れることを示す。非天然アミノ酸１６（ビフェニルアラニン）のＰ３位置へのさらなる付加によって、選択性をレグメインから離れるようにすることができる。全ての阻害剤が、組換えカスパーゼ３に対して類似の反応性を有する（図１２Ｃ）。

３個の最良なカスパーゼプローブのＣｙ５蛍光標識化バージョンを、組換えカスパーゼ３（図１３、下パネル）およびＲＡＷ細胞（図１３、上パネル）を用いた直接標識化実験で比較した。ＡＢ４６−Ｃｙ５はレグメインおよびカテプシンＢを標識化し、ＡＢ５０−Ｃｙ５はレグメインのみ標識化し、ＡＢ５３−Ｃｙ５は最高濃度でのみレグメインを標識化する。全てのプローブが、組換えカスパーゼ３に対して同様の反応性を有する。

カスパーゼ８阻害剤ＡＢ２０，ＡＢ１９，ｂＡＢ１９
内因性イニシエーターカスパーゼ９と外因性イニシエーターカスパーゼ８を判別できる化合物を設計するため、まずＰ２およびＰ４位置に注目することにした。というのは、カスパーゼ８はＰ３位置に狭い選択的優位性を有するからである。Ｐ４Ｌｅｕのカスパーゼ８の最適ＮＮ２９に対する代用は、これまで測定したカスパーゼ８の最大動力学阻害定数を有する化合物（ＡＢ２０）をもたらす。しかし、この効能の増加は、カスパーゼ３および９の両方に対する選択性の減少を犠牲にする。非天然アミノ酸２３でのＡＢ２０のＰ２位置の更なる置換は、カスパーゼ８に対して比較的良い効能を有し、カスパーゼ９に対する活性は測定できない化合物（ＡＢ１９）をもたらす。この化合物はカスパーゼ３に対して相応な活性レベルを依然有するが、この交差反応性をカスパーゼ８の特異的標識化を可能にするより選択的なカスパーゼ３阻害剤でのサンプルの前処理によって阻止し得るので、これは大きな問題ではない。したがって、ＡＢ１９は最適リードとして機能し、カスパーゼ８選択性を維持するビオチン標識化プローブ（ｂＡＢ１９）に転換した（表IV）。

カスパーゼ９阻害剤ＡＢ３８，ＡＢ４２
カスパーゼ９の選択的阻害剤の開発をさらに行った。初期の基質最適化配列ＬＥＨＤは、カスパーゼ９よりカスパーゼ８に対してより高い効能を示した。したがって、Ｐ２〜Ｐ４位置における最適な天然アミノ酸残基を用いてペプチド配列を完全に再びデザインすることによって始めることにした。加えて、カスパーゼ８よりカスパーゼ９に対する潜在的に高い選択性度合いの結果としてＮＮ３８をＰ２位置に用いた。とくに、Ｐ３位置に焦点を当てた。というのは、カスパーゼ８はこの位置に酸性Ｇｌｕ残基を高次に好む一方、カスパーゼ９はロイシンおよびフェニルアラニンを含む様々な残基を許容するからである。最適カスパーゼ９阻害剤として選択した７個の化合物のうち、数個しかカスパーゼ９に対して活性を示さず、その多くが実際カスパーゼ８に対して選択性を示した。これは、２個の酵素の全触媒効率における大きな違いの結果であるだろう。組換えカスパーゼ９は、慨して、小分子による弱い阻害を導く弱い酵素である。すなわち、最も有効な阻害剤は、カスパーゼ８との交差反応性をもたらす完全阻害ための高い濃度をまだ必要とする。したがって、組換え酵素のスクリーニングは最適でなく、また細胞質抽出物において活性化した内因性カスパーゼ９を用いるより徹底的な分析が、完全に最適化したカスパーゼ９の選択的阻害剤およびプローブを開発するのに必要であると思われる。それにも関わらず、現在のＬＥＨＤ配列を改良し、カスパーゼ９に対してある程度の選択性を有する化合物を生成することができた（ＡＢ３８およびＡＢ４２）。

一般的なカスパーゼ阻害剤ＡＢ２８，ＡＢ１１
最後に、テストした全てのカスパーゼに対する最適配列に基づいたいくつかの一般的なカスパーゼ化合物を選択した。予想した最適な６Ｅ８Ｄ配列の合成は、ＮＰキャップのヒンダードＮＮ６アミノ酸への結合困難なため、遊離のアミノ生成物（ＮＨ２−６Ｅ８Ｄ；ＡＢ２８）しか生成しなかった。しかし、この遊離アミン阻害剤（ＡＢ２８）は、全カスパーゼへの広い阻害を示した。同様に、ＤＥＰＤ配列（ＡＢ１１）は、以前報告した一般的なプローブＫＭＢ０１に匹敵し得る阻害速度を示した。

組換え及び内因性カスパーゼ用のカスパーゼ阻害剤と活性系プローブ（ＡＢＰ）の選択性
一連の最適カスパーゼ３，８，９選択的阻害剤を選択して、広範囲のＡＢＰを用いて残留活性を測定する標識化用の間接競争によって全選択性および効能をさらに論証する。まず、組換えカスパーゼ３，７，８，９に焦点を当てた。各カスパーゼをそれぞれ、一連の最適な選択的阻害剤を用いて種々の濃度で予備培養し、残留活性を一般的なカスパーゼプローブＫＭＢ０１の付加によって測定した。全体的に、競争データは、所望のターゲットの特異的な競争を示すカスパーゼ３および８の特異性化合物の動力学データを映した。

これは、組換えカスパーゼの間接競争および直接標的化による阻害剤およびプローブ選択性の分析によって示された。一般的なカスパーゼプローブＫＭＢ０１と阻害剤のパネルとの間接競争を、個々のカスパーゼ３，７，８，９（それぞれ１００ｎＭ）で行い、これらカスパーゼを３０分間特異性阻害剤で培養し、その後ＫＭＢ０１で３０分間培養した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、残留活性部位の標識化を、ストレプトアビジンＨＲＰを用いたビオチンブロッティングにより視覚化した。また、カスパーゼ活性部位の直接標的化を、特異性ＡＢＰを用いて行った。等量の活性カスパーゼ３，８，９（１００ｍＭ）を、３０分間指示されたビオチニル化活性部位プローブのそれぞれの濃度を上げながら培養した。活性部位標識化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって視覚化し、続いてストレプトアビジンＨＲＰを用いてビオチンブロッティングした。

組換えカスパーゼの混合物におけるＡＢ０６，ＡＢ１３，ＡＢ１９，およびＡＢ３８
カスパーゼ９特異化合物ＡＢ３８およびＡＢ４２は、カスパーゼ８よりもカスパーゼ９に対して低い選択性を示したが、他のカスパーゼ９特異化合物ＡＢ４０およびＡＢ４１は特異性阻害を示さなかった（データはなし）。一般的な阻害剤ＡＢ２８は、完全阻害を得るのに最高濃度を必要とするカスパーゼ９での４個全てのカスパーゼターゲットの標識化を阻止した。

競争および動力学データを基にして、ＡＢ０６，ＡＢ１３，ＡＢ１９およびＡＢ３３を含む最も期待できる選択的阻害剤のビオチニル化バージョンを合成した。この配列の全選択性をテストし、選択的活性系プローブとしての有用性を画定するため、組換えカスパーゼの混合物の直接標識化を監視した。ビオチニル化プローブを様々な濃度で組換えカスパーゼ３，８，９の混合物に加え、その活性を活性部位滴定に基づいて基準化した。ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３がカスパーゼ３を選択的に標識化する一方、ｂＡＢ１９は上記段落に記述した実験における１０μＭのような高い濃度でもカスパーゼ９を標識化することなくカスパーゼ８を標識化した。驚くべきことではないが、ｂＡＢ３８はカスパーゼ８およびカスパーゼ９を共に標識化した。

プロテオームにおけるテスト
これら心強い結果によって、複雑なプロテオームにおける内因性カスパーゼターゲットに対するプローブの選択性を評価するのを促進した。内因性アポトーシス経路を細胞質抽出物中でシトクロムｃおよびｂＡＴＰの添加によって活性化することができる。このシステムは、アポトーシス経路を一時的に制御し、カスパーゼ３および７と同様にカスパーゼ９の活性化も導く（Liu et al, 1996）。１０分間の無細胞アポトーシスの活性化により、一般的なプローブＫＭＢ０１は、３５ｋＤａカスパーゼ９種と、１７および２０ｋＤａでのカスパーゼ３の２個の主要な成熟形態並びに３３ｋＤａの全長Ｎペプチドで処理したカスパーゼ７の２０ｋＤａの主要な成熟形態とを標識化した。これら標識化した種の同定を、以下の段落に記載するような特異的抗血清を用いた免疫沈降実験によって確認した。２個のカスパーゼ３選択的プローブｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３は、１０ｎＭ〜１０μＭのプローブ濃度でカスパーゼ３および７種を効率的かつ選択的に標識化した。

活性部位プローブでの細胞抽出物および生細胞における内因性カスパーゼの選択的標識化を以下のように行う。低張２９３細胞質抽出物に、シトクロムｃ／ｄＡＴＰを加えることによって内因性アポトーシスを誘引した。カスパーゼ活性部位の活性化および標識化を３分間行った後に、ＫＭＢ０１，ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３を１０分間加えた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いてストレプトアビジンＨＲＰを用いてビオチンブロッティングを行った。個々のカスパーゼの同定は、カスパーゼ３，７および９用の特異的抗血清を用いる免疫沈降を介して確認した。抽出物（２９３）をシトクロムｃ／ｄＡＴＰで１０分間活性化し、指定プローブ（ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３は最終濃度１００ｎＭ、ＫＭＢ０１は最終濃度１０μＭ）を加えて標識化し、方法および材料の項に記述したように特異的抗血清を用いて標識化カスパーゼを沈殿させた。組換えカスパーゼ８（１００ｎＭ）を直接標識化するか、またはシトクロムｃ／ｄＡＴＰ活性化もしくはなしに細胞抽出物（２９３）に加え、次いで指定プローブ（最終濃度１００μＭ）で標識化した。カスパーゼ３の選択的阻害剤ＡＢ０６（最終濃度１０μＭ）も、指定サンプルへのプローブ付加に先立って１０分間加えた。カスパーゼの標識化をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって監視し、続いてストレプトアビジンＨＲＰでビオチンブロッティングした。エトポシドまたは抗Ｆａｓ処理によるアポトーシスを誘発させた無傷ジャーカット細胞における内因性カスパーゼ３および７の標識化を以下のようにして行った。細胞（３×１０⁶）をアポトーシス誘発剤で１５時間培養し、次いで指定プローブのパネルでさらに２時間培養して標識化した。ｂ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（フルオロメチルケトン），ＫＭＢ０１およびｂＡＢ１９を最終濃度１０μＭで用いた。ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３を最終濃度１μＭで用いた。

したがって、カスパーゼ３の選択的プローブが、複雑なプロテオームにおける内因性カスパーゼターゲットに対する使用に価値があることがわかった。

シトクロムｃ／ｄＡＴＰの添加による内因性アポトーシスを誘発した細胞質抽出物が活性内因性カスパーゼ８の検出可能な量を含まないため、外因性活性組換えカスパーゼ８を抽出物へ加えることによってシトクロムｃ／ｄＡＴＰ活性化と連動してカスパーゼ８および９の選択的プローブの選択性を評価した。Ｆａｓ受容体活性化ジャーカット細胞における活性カスパーゼ８の報告された内因性レベルの範囲である活性部位滴定カスパーゼ８（１００ｎＭ）の濃度を用いた（Boatright et al., 2003）。一般的なプローブＫＭＢ０１は、シトクロムｃ／ｄＡＴＰの抽出物への付加により、内因性カスパーゼ３，７および９並びに外因的に付加したカスパーゼ８の強い標識化を示した（図４Ｃ）。予想通り、カスパーゼ８の無刺激な抽出物への付加は、下流カスパーゼ３，７の活性化と微量のカスパーゼ９の活性化を導いた。カスパーゼ３の選択的阻害剤ＡＢ０６をシトクロムｃ／ｄＡＴＰと共に抽出物に加えるとき、カスパーゼ３および７を選択的に阻害して、カスパーゼ８および９を選択的に標識化した。高濃度のカスパーゼ８の選択的プローブｂＡＢ１９を用いた類似の標識化実験は、外因性活性カスパーゼ８を効率的に標識化し、カスパーゼ３を少し標識化する一方、シトクロムｃ／ｄＡＴＰによる刺激後でさえもカスパーゼ９の標識化を示さないことを確認した。カスパーゼ９の選択的プローブｂＡＢ３８は、カスパーゼ３，８に対する交差反応性を有するカスパーゼ９の標識化を示した。全体として、これらデータは、カスパーゼ３および８の選択的プローブが内因性カスパーゼターゲットを標識化するポテンシャルを有し、様々な内因性および外因性カスパーゼを差別化することができることを示唆する。

カスパーゼ８特異性化合物ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３による細胞全体の標識化
プローブの有用性の最終テストとして、外因性（抗Ｆａｓ抗体）または内因性（エトポシド）信号のいずれかによってアポトーシスを誘発した無損細胞における内因性カスパーゼターゲットを標識化できる能力を試験した。ビオチニル化したプローブＫＭＢ０１，ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３は、抗Ｆａｓおよびエトポシドで処理したジャーカット細胞における下流カスパーゼ３および７の強い標識化を行った。さらに、この標識化は、細胞の細胞質ゾルに直接アクセスでき、像化剤としての使用に対し高いポテンシャルを有することを示唆するプローブの比較的低い濃度（１μＭ）で達成された。驚くべきことに、ｂＡＢ０６およびｂＡＢ１３のように２個の負電荷残基を有する関連したカスパーゼ８の特異性化合物ｂＡＢ１９は、無損細胞システムにおいてあらゆるカスパーゼの標識化を示さなかった。同様に、ＫＭＢ０１は、エトポシド処理後でさえもカスパーゼ９の標識化を示さなかった。これらの発見は、一つにはプローブ（ｂＡＢ１９の）の細胞透過性の問題、またはこれら活性化条件下での活性カスパーゼ８および９の潜在的な低いレベルおよび速い代謝回転によるものとすることができる。疎水性蛍光基を備えた活性部位プローブは、細胞透過性を高めると思われる。

アポトーシスプロテオームにおけるカスパーゼ活性化の動力学研究への活性系プローブの応用
無細胞アポトーシスプロテオームにおけるカスパーゼ開裂が、抗体ベースの検出方法および外因性放射標識化カスパーゼを用いて広く研究された（Liu et a., 1996; Orth et al., 1996; Rodriguez and Lazebnik,1999; Slee et al., 1999; Srinivasula et al., 1998）。しかし、これらの研究は、特異的内因性カスパーゼの活性化を直接監視することができなかった。無細胞抽出物システムは、内因性アポトーシス経路の刺激によるイニシエーターおよびエクセキューショナーカスパーゼ両方の活性化を一時的に監視することができる。すなわち、活性系プロファイリングと結合した新たに開発したカスパーゼ３特異性阻害剤を用いて内因性カスパーゼ活性化の動力学を直接監視することができる。

シトクロムｃ／ｄＡＴＰ付加後数時間にわたって２９３細胞抽出物におけるカスパーゼ活性化を監視することから開始した。一般的なプローブＫＭＢ０１を、以下の段落で説明するような活性化後に様々な時間隔で抽出物に加えた。同じサンプルを、特異的ポリクロナール抗血清を用いてカスパーゼ７および９のタンパク質レベルに対して免疫ブロッティングする。シトクロムｃ／ｄＡＴＰ付加の最初の５〜１０分間以内で、著しく活性な下流エクセキューショナーカスパーゼ３および７（１７〜２２ｋＤａの範囲）のロバスト標識化を観察した。この活性は２０〜３０分でピークとなり、実験の間高い状態を維持した。加えて、大きさ３５ｋＤａ前後の多数の高分子量バンドが活性化経路に早期に見られる。これら標識化したタンパク質の免疫沈降は、以下の段落で説明するように、カスパーゼ７の形態としてのｐ３７およびｐ３２種と、カスパーゼ９の形態としてのｐ３５およびｐ３３とを同定した。更に、これは、同じサンプルのウェスタンブロットで観察したカスパーゼ７および９の様々な中間物の位置によって確認された。

アポトーシス細胞抽出物における新規なカスパーゼ７活性化中間物の同定を以下の実験で立証した。（ａ）細胞質ゾル抽出物（２９３）にシトクロムｃおよびｄＡＴＰを０〜２４０分間加えて内因性アポトーシスを誘発した。各時点の終わりで、一般的なカスパーゼプローブＫＭＢ０１を加え、抽出物をさらに３０分間３７℃で培養した。標識化カスパーゼの活性部位をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって視覚化し、続いてストレプトアビジンＨＲＰでビオチンをブロッティングした。サンプルは、カスパーゼ７および９特異抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。カスパーゼの同定は、以下の（ｂ）における免疫沈降実験に基づいて示した。免疫沈降は、全長カスパーゼ７であるＦＬ−Ｃ７、２３のＮ末端アミノ酸を除去した全長カスパーゼ７であるΔＮ−Ｃ７、Ｎ末端ペプチドを除去したカスパーゼ７の大きな熟成サブユニットであるｐ２０、また２３の残基Ｎペプチドがそのままのカスパーゼ７の大きな熟成サブユニットでｐ２０＋Ｎ−Ｃ７で行った。ｐ３５−Ｃ９はカスパーゼ９の大きいサブユニットの主な自動処理した熟成形態であり、ｐ３３−Ｃ９はカスパーゼ９の大きな熟成サブユニットの代替処理した形態である。（ｂ）標識化カスパーゼの免疫沈降は、特異的抗血清を用いて行った。細胞質ゾル抽出物（２９３）を１０分間のシトクロムｃ／ｄＡＴＰの添加により活性化し（＋ｃｙｔ ｃ／ｄＡＴＰ）、次いで一般的なカスパーゼプローブＫＭＢ０１で３０分間標識化するか、または活性化（−ｃｙｔ ｃ／ｄＡＴＰ）せずにＫＭＢ０１で直接標識化した。カスパーゼを特異的抗血清を用いて沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いてストレプトアビジンＨＲＰでビオチンブロッティングを行った。Ｉは流入標識化抽出物、Ｐは免疫沈降したペレットである。（ｃ）組換えＢｉｒ３ドメインによるカスパーゼ活性の阻害である。細胞質ゾル抽出物を５分間（ａ）と同様に活性化し、続いて１μＭのＢｉｒ３を加えた。ＫＭＢ０１（２０μＭ）を３０分間加えて、（ａ）と同様に残留カスパーゼ活性部位を標識化した。

すなわち、無傷Ｎ末端を有する全長カスパーゼ７（ＦＬ−Ｃ７）としてのｐ３７バンドと、Ｎ末端ペプチドを欠いた全長カスパーゼ７（ΔＮ−Ｃ７）（Denault and Salvesen, 2003）としてのｐ３２種との同定をすることができた。

全長カスパーゼの標識化は、このエクセキューショナーカスパーゼがカスパーゼ３によるＮペプチドの除去およびイニシエーターカスパーゼ活性によるチモーゲンの大小サブユニットへの処理後のみに生体内で活性化されると考えられた（Denault and Salvesen, 2003; Yang et al., 1998）ので、予想外であった。しかし、カスパーゼ７の全長形態は、活性部位プローブを結合することができ、またこの種の標識化を内因性の死経路の活性化により１０倍以上高めることを発見した（データは示さず）。この予想外の結果は、カスパーゼ７の活性化が細胞質ゾル抽出物における全長チモーゲンの活性を測定できなかったためにかつて見逃されていた触媒活性中間物を含むことを示唆する。

ＫＭＢ０１によって標識化したカスパーゼ９の種は、Ａｓｐ３１５でのチモーゲンの自動処理に起因するカスパーゼ９の優性ｐ３５形態（ｐ３５−Ｃ９）と、大小サブユニットの間のリンカー領域における代替残基でのチモーゲンの処理に起因するカスパーゼ９のｐ３３形態（ｐ３３−Ｃ９）として帰属させた。この帰属を支持して、カスパーゼ９の３３ｋＤａ形態（ｐ３３）も、リンカー領域におけるＥ３０５／Ｄ３０６／Ｅ３０７配列内の開裂の結果として組換え酵素内に観察される（Stennicke et al., 1999）。驚くべきことに、リンカー領域におけるＡｓｐ３３０でのカスパーゼ３仲介開裂の結果として形成されると予想されたカスパーゼ９のｐ３７形態を標識化していない。この処理は、ＸＩＡＰのＢｉｒ３ドメイン（アポトーシスタンパク質のＸリンク阻害剤）によって阻害しにくいカスパーゼ９の活性形態を生成すると考えられている（Srinivasula et al., ,2001）。この種は活性化プロセスの初期段階にのみ存在し、カスパーゼ９の他の形態に速やかに転換され得るため、抽出物中で標識化することができなかった。しかし、この可能性は、シトクロムｃ／ｄＡＴＰ付加後の短時間を用いて同様の実験を行っても起こりそうもなく、ウェスタンブロットによってカスパーゼ９のｐ３７形態を観察することはなかった（データは示さず）。

標識化した種の帰属をさらに確認するため、サンプルをＸＩＡＰの精製した組換えＢｉｒ３ドメインで様々な活性化時間で処理した。このポリペプチドは、カスパーゼ３または７ではなくカスパーゼ９に特異的に結合および阻害した。カスパーゼ９のｐ３５およびｐ３３形態の両方の標識化は、Ｂｉｒ３タンパク質での予備培養によりブロックされる一方、カスパーゼ７のｐ３７とｐ３３のいずれ形態もＢｉｒ３により阻害されない。これらの結果は、カスパーゼ９のｐ３３形態がＢｉｒ３阻害に対する感受性を保持し、カスパーゼ９のｐ３７形態の処理に恐らく起因しないことを確認する。ｐ３３カスパーゼ９が、予めＫＭＢ０１により標識化もしくはＢｉｒ３により阻害した後に、他のプロテアーゼまたはそれ自体による開裂の結果である可能性を示すことができなかった。

選択的阻害剤のアポトーシスプロテオームにおけるカスパーゼ活性化の動力学研究への応用
帰属した抽出物システムにおける活性カスパーゼの全ての主要な形態の同定を行う際、前駆体カスパーゼ形態の活性化に対する下流カスパーゼ３および７の阻害効果を次に検討する。とくに、活性全長カスパーゼ７の処理をカスパーゼ３および７の熟成形態によって仲介される可能性を調べることに焦点を当てた。上流中間物の処理における各エクセキューショナーカスパーゼの役割を画定するため、カスパーゼ３および７の特異的阻害剤ＡＢ０６の存在下もしくは不在下の２９３抽出物と、カスパーゼ３を欠いたＭＣＦ−７抽出物とにおいて、一般的なプローブＫＭＢ０１を用いてプロファイリング実験を行った。活性カスパーゼ３を欠くＭＣＦ−７細胞の使用（Janicke et al., 2001）は、カスパーゼ７によって仲介された処理をカスパーゼ３によって仲介された処理と分けることができた。

シトクロムｃ／ｄＡＴＰと同時にＡＢ０６で処理した２９３抽出物におけるカスパーゼ活性のプロファイリングで阻害剤の選択性を確認した。全ての熟成下流カスパーゼ（大きさ１７〜２２ｋＤａの範囲内）の標識化が完全にブロックされる一方、カスパーゼ９の処理形態およびカスパーゼ７の前駆体形態の標識化が変わらない。興味深いことに、全長カスパーゼ７中間物の活性化の動力学における劇的な変化と、Ｎペプチドの除去に起因するΔＮ−ＦＣ７形態の標識化の完全損失がある。とくに、ＦＬ−Ｃ７は、２０分でピークを有する遅く長時間にわたる活性化を示し、これが２４０分の検定の終わりまで続く。Ｆｌ−Ｃ７の類似蓄積が、シトクロムｃ／ｄＡＴＰ付加後１０分間ＡＢ０６で処理した抽出物において観察される。同じタンパク質濃度のＭＣＦ−７細胞抽出物におけるＦｌ−Ｃ７活性化は、若干遅れるが、未阻害の２９３抽出物で観察されたものと類似の活性ＦＬ−Ｃ７の蓄積および消失率を示す。同時に、これらのデータは、ＦＬ−Ｃ７の活性化が、アポトーシスの形成に依存するが、カスパーゼ３および７の熟成形態の活性化とは独立した処理を介して生起することを示唆する。この仮説は、Ｆｌ−Ｃ７の形成率が熟成エクセキューショナーカスパーゼの状態に関わらず比較的類似していることから支持される。興味深いことに、ΔＮ−Ｃ７はＡＢ０６で処理した抽出物においても、このＮ末端処理をカスパーゼ３によって仲介される概念と一致したＭＣＦ−７抽出物においても形成されない。

阻害剤の研究におけるさらに驚くべき発見は、カスパーゼ７の熟成ｐ２０形態に対するＡＢ０６によるＦＬ−Ｃ７種の阻害の全体的な欠如である。これは、ＡＢ０６の配列（ＮＰ−Ｄ３ＶＤ−ＡＯＭＫ）がＫＭＢ０１プローブ配列（Ｂｉｏ−ＥＶＤ−ＡＯＭＫ）とＰ３残基でのみ異なるから驚くべきことである。このデータは、ＦＬ−Ｃ７がより嵩高なＰ３ＮＮ３（２ピリジルアラニン）残基の結合を排除する明白な活性部位トポロジーを有することを示唆していると理由付けた。したがって、阻害剤を用いて、カスパーゼ７の全長でｐ２０熟成形態に結合する異なるＰ３要素の能力を比較しようとした。１０分間のシトクロムｃ／ｄＡＴＰの付加によって活性化した抽出物を、阻害剤ＮＰ−ＤＥＶＤ−ＡＯＭＫ（ＡＢ０９），ＮＰ−Ｄ３ＶＤ−ＡＯＭＫ（ＡＢ０６），ＮＰ−ＥＶＤ−ＡＯＭＫおよびＣｂｚ−３ＶＤ−ＡＯＭＫで５分間処理し、次いで一般的なプローブＫＭＢ０１で３０分間標識化する。サンプルを活性部位標識化に対して分析し、カスパーゼ７の全長形態およびｐ２０形態の両方のタンパク質レベルをウェスタンブロットによって監視する（図６Ｄ）。４個の阻害剤全てが、不完全阻害を示すＡＶＤ配列を有するカスパーゼ７の熟成ｐ２０形態の標識化を効率的にブロックする。逆に、ＦＬ−Ｃ７は、Ｐ３ ＮＮ３を含有する両方の阻害剤による阻害に対して比較的不感受性で、Ｐ３ Ｇｌｕ残基を含有する２個の阻害剤によってほとんど全て阻害される。興味深いことに、この特異性のパターンは、Ｐ３ ＮＮ３を含有するプローブおよび阻害剤による阻害に対しても不感受性であるイニシエーターカスパーゼ９とより厳密に合致する。これらのデータは、未開裂カスパーゼ７チモーゲが基質へのアクセスを制限し得る活性部位を含有するという仮説を支持する。

ＡＢ０６による抽出物処理によるＦＬ−Ｃ７種の蓄積は、この活性化中間物がイニシエーターカスパーゼ９よりもむしろ下流エクセキューショナーカスパーゼによって処理されやすいことを示唆する。阻害剤ＡＢ０６がカスパーゼ７の緩徐な処理と、部分処理した中間物の蓄積をもたらすカスパーゼ９の活性の減少を生じないことを確認するため、抽出物を様々なＡＢ０６濃度で処理し、シトクロムｃ／ｄＡＴＰ付加後の様々な時点でカスパーゼ９の阻害を監視した。これらの結果、３０分までは１０μＭほどの高い濃度でさえもＡＢ０６の交差反応性がないことが確認された。試験した最高濃度で最長時点でのＡＢ０６によるカスパーゼ９のいくらかの阻害を観測したが、ＦＬ−Ｃ７の種の蓄積がカスパーゼ９の阻害のない時点かつ阻害剤濃度で明らかに観察された。すなわち、Ｆｌ−Ｃ７の種は、下流カスパーゼ３および７によって通常急速に処理されカスパーゼ９に対して無能な基質である活性化経路における中間物であることを確証した。

材料および方法
ＡＯＭＫ阻害剤、標識及び基質の合成方法
全ての阻害剤および活性系プローブを、Ｐ１ Ａｓｐ−ＡＯＭＫ化合物に関してすでに報告された固相合成法を用いて合成する。全ての位置走査ペプチドライブラリを、以前報告されたように合成する（Greenbaum et al., 2002; Nazif and Bogyo,2001,ここで参照のため援用）。手短に言えば、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＡＯＭＫを添加した樹脂をＦＭＯＣ保護基の除去により長くし、その後一定位置用の単一アミノ酸、または混合物位置用の１９個の天然アミノ酸（全天然アミノ酸から酸化を防ぐためにメチオニンの代わりにノレウシンを有するシステインを除いたもの）の等運動性混合物のいずれかでカップリングする。Ｐ２〜Ｐ４（またはＰ２〜Ｐ３）位置のそれぞれを、１９個の天然アミノ酸および４０個の非天然アミノ酸でスキャンする（使用する非天然アミノ酸の構造については図１０参照）。全ライブラリを５０μｍｏｌスケールで合成し、樹脂からの開裂後の粗混合物として検定する。個々の阻害剤および活性系プローブを、１００μｍｏｌスケールで合成し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Delta-Pak, Water Corp）を用いて精製する。化合物の同定および純度は、エレクトロスプレー界面を備えたＡＰＩ１５０マススペクトロメーター（Applied Biosystems/SCIEX）に接続したＡｇｉｌａｎｔ ＨＰＬＣを用いるＬＣ−ＭＳ分析によって評価する。

図９における反応スキームは、本ＡＯＭＫ阻害剤用に使用し得る固相反応スキームを示す。ステップ（ａ）は、ある範囲のアミノ酸側鎖Ｒ１（ＰＧ）を含有するＦｍｏｃで保護されたクロロメチルおよびブロモメチルケトン（２ａ〜ｆ）の合成を示す。ステップ（ｂ）は、２ａ〜ｆの一例、すなわちＰＩアスパラギンＡＯＭＫペプチドの固相合成を示す。Ｆｍｏｃで保護されたＡｓｐ−ＡＯＭＫ（４ｆ）を対応するＢＭＫ（２ｆ）から合成し、側鎖カルボキシレート（５ｆ）を介してリンクアミド樹脂に直接結合する。ステップ（ｃ）ｃに概略した固相ペプチド合成および樹脂開裂方法を用いて、ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１−およびＲ１＝アスパラギン酸塩（−Ｃ−ＣＯＯＨ）を含む構造を有する反応スキームの下部に示したＰＩアスパラギンＡＯＭＫを製造する。ステップ（ｃ）は、ヒドラジン樹脂を用いたペプチドＡＯＭＫの固相合成を示す。ペプチドクロロメチルケトン（２ａ〜ｅ）を、ヒドラゾン連鎖（５ａ〜ｅ）を介して樹脂に結合し、指定の最適化固相ペプチド合成方法（６）を用いて伸長する。スキーム中の下記の典型的な化合物は、ＰＩ側鎖の同定に基づいた番号付け帰属された小文字、ａがグリシン、ｂがアルギニン、ｃがロイシン、ｄがリジン、ｅがアスパラギン酸、ｆがアスパラギンである。用いる側鎖は、上表I〜IVに示したものである。ＡｃＯＨは酢酸；ＤＣＭはジクロロメタン；ＤＩＣはＮ，Ｎ‘−ジイソプロピルカルボジイミド；Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル；ＨＯＢＴは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸；ＴＨＦはテトラヒドロフラン；ＲＴは室温；Ｚはベンジルオキシカルボニルである。ページ下のこの機構において、Ｒ２は既に定義した。Ｒ３はＲ１と同じである。

図９に示すようなＡＯＭＫペプチドの合成スキームをKatoらから得た。とくに断りのない限り、全ての樹脂および試薬は、商用のものを購入しており、さらに精製することなく使用した。使用した溶媒は、ＨＰＬＣ級である。全ての感水反応を、無水溶媒中でアルゴン正圧下で行った。反応は、蛍光指示薬を用いてＷｈａｔｍａｎ０．２５μｍシリカ板上で薄層クロマトグラフィによって分析した。フラッシュクロマトグラフィは、ＥＭＤ２３０〜４００メッシュシリカゲルを用いて行った。逆相ＨＰＬＣは、ＡＫＴＡエクスプローラー１００（Amersham Phaemacia Biotech）を用いたＣ_１８カラムで行った。ＬＣＭＳデータは、ＡＰＩ１５０ＥＸ ＬＣ／ＭＳシステム（Applied Biosystems）を用いて得た。高分解能ＭＳ分析は、Bruker Autoflex MALDI TOF/TOF マススペクトルを用いてStanford Proteomics およびIntegrative Resetch Fasilityによって行った。

ハロメチルケトン前駆体（上の化合物２ａ−ｆ）およびそのカルバぜートリンカーを介した固体支持結合誘導体（５ａ〜ｅ）は、以下に記述するような手続き変更で合成される。とくに断りのない限り、反応は、三方ナイロン活栓（BioRad Laboratories, Hercules, CA）を有する１２μＬポリプロピレンカートリッジ（Applied Separations, Allemtown, PA）内で行われる。カートリッジは、カートリッジから溶媒および試薬を排出するのに用いる２０ポート真空マニホールド（Waters, Milford, MA）に接続した。樹脂を固相反応の間回転シェイカーで穏やかに振った。

Ｎ−α―Ｆｍｏｃ保護アミノ酸のハロメチルケトン誘導体（２ａ−ｆ）の一般的な合成方法
対応するＮ−α―Ｆｍｏｃアミノ酸（１ａ−ｅ，５ミリモル）の０．２Ｍ無水ＴＨＦ溶液を−１０℃で氷／アセトン浴で攪拌した。この溶液にＮ−メチルモルホリン（６．２５ミリモル，１．２５当量）およびイソブチルクロロホルメート（５．７５ミリモル，１．１５当量）を順に加える。後者の化合物の添加直後に、白い沈殿物ができた。反応混合物を−１０℃で２５分間維持した。ジアゾメタンを、Aldrich technical Bulletin(AL-180)に記載された処理を用いて現場で発生させた。エーテルジアゾメタン（１６．６−２１．４ミリモル）を０℃で混合した無水物の攪拌溶液へ移す。反応混合物を３時間かけて室温まで温める。対応するクロロメチルケトン（２ａ−ｅ）を得るために、濃塩酸と氷酢酸の１：１溶液１５ｍＬを反応混合物に０℃で滴下する。窒素ガスの発生を止めた直後に、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、分液漏斗に移す。反応混合物を水、ブライン溶液および飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で順に洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去した。或いはまた、臭化水素（３０重量％酢酸溶液）と水の１：２溶液１０ｍＬを反応混合物に０℃で滴下することによりブロメチルケトン（２ｆ）を得た。クロロメチルケトン合成について記載したように作業を行った。クロロメチルケトン類２ａ（グリシン）、２ｃ（ロイシン）、２ｄ（リジン）、２ｅ（アスパラギン酸）を白色固体（定量的収率）として得、またブロモメチルケトン２ｆ（アスパラギン酸）を黄色油（定量的収率）として得、精製なしで使用した。他のアミノ酸残基を上述したように置換した。粗製クロロメチルケトン２ｂ（アルギニン）をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中５０〜６０％酢酸エチル）により精製して白色固体（３．１３ミリモル、６２％）を得た。

アミノメチルポリスチレン樹脂上でのカルバゼートリンカーの合成
アミノメチルポリスチレン樹脂（１．１ミリモル／ｇ）を１２ｍＬポリプロピレンカートリッジ中で一晩真空乾燥した。この樹脂をＤＭＦで３０分間予備溶媒和させ、次の３０分間ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶媒和させる。Ｎ，Ｎ−カルボニルジミダゾール（６当量）１ＭのＣＨ_２Ｃｌ_２溶液を樹脂に加え、該樹脂を室温で３時間振った。試薬を排出し、樹脂をＣＨ_２Ｃｌ_２、続いてＤＭＦで洗浄した。ヒドラジン（６０当量）１０ＭのＤＭＦ溶液を樹脂に加え、樹脂を室温で１時間振った。この樹脂をＤＭＦ、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し、真空乾燥し、−４℃で保管した。

クロロメチルケトン誘導体の装填および２，６−ジメチルベンゾイルオキシメチルケトン誘導体の合成
対応するＮ−α―Ｆｍｏｃ―Ｌ−アミノ酸のクロロメチルケトン誘導体（２ａ−ｅ）０．５ＭのＤＭＦ溶液を樹脂に加えた。カートリッジを固く密閉し、クロロメチルケトンによって様々な時間５０℃で振った。グリシンＣＭＫ（２ａ）を１０分間培養し、他の全て（２ｂ−ｅ）を３時間培養した。反応後、溶液を除去し、樹脂をＤＭＦで洗浄した。樹脂上のＡＯＭＫの形成は、ＡＯＭＫの溶液相合成に対し報告されたようなＫＦを用いて行った。この方法によって、カルボン酸の使用量を減らすことができる。具体的には、２，６−ジメチル安息香酸（５当量）およびフッ化カリウム（１０当量）の０．５ＭのＤＭＦ溶液を樹脂に加えた。樹脂を室温で一晩振った。溶液を除去した後、樹脂をＤＭＦ、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し、真空乾燥した。樹脂装填量を自由ＦｍｏｃのＵＶ吸収によって見積もった。

リンク樹脂（５ｆ）上でのＮ−α―Ｆｍｏｃ―Ｌ−アスパラギン酸の２，６−ジメチルベンゾイルオキシメチルケトン誘導体の合成
Ｎ−α―Ｆｍｏｃ―Ｌ−アスパラギン酸−β―ｔｅｒｔ―ブチルエステルのブロモメチルケトン誘導体（２ｆ）０．２ＭのＤＭＦ溶液を０℃で攪拌し、フッ化カリウム（３当量）を固体として加える。０℃で１分攪拌した後、２，６−ジメチル安息香酸（１．２当量）を固体として加え、反応混合物を室温まで温めた。一晩攪拌した後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、分液漏斗へ移す。反応混合物を、水、ブライン溶液および飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で順に洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去した。生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン中〜１７％酢酸エチル）によって精製して黄色油（収率９８％）を得た。

生成物Ｎ−α―Ｆｍｏｃ―Ｌ−アスパラギン酸―β―ｔｅｒｔ―ブチルエステルの２，６−ジメチルベンゾイルオキシメチルケトン誘導体（３ｆ）の０．２Ｍ溶液を２５％ｖ／ｖのＴＦＡ／ＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、時折振りながら３０分間放置する。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈した。開裂溶液を、トルエンとの同時蒸発によって除去した。生成物をさらに真空乾燥した。粗製生成物（４ｆ；収率９６％）をさらなる精製なしに使用した。

リンク樹脂（０．７５ミリモル／ｇ）をＤＭＦ内で１時間振ることにより予備溶媒和させた。樹脂上のＦｍｏｃ保護基を２０％ピペリジン／ＤＭＦで１５分間除去した。該樹脂をＤＭＦ、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。Ｎ−α―Ｆｍｏｃ―Ｌ−アスパラギン酸の２，６−ジメチルベンゾイルオキシメチルケトン誘導体（４ｆ、１．２５当量）およびＨＯＢＴ（１．２５当量）の０．５Ｍ溶液を樹脂に加え、続いてＤＩＣ（１．２５当量）を加えた。２．５時間振った後、樹脂をＤＭＦで洗浄して装填樹脂（５ｆ）を得た。樹脂装填量を自由ＦｍｏｃのＵＶ吸収によって画定した。

ペプチドＡＯＭＫの塩基脱保護の最適化
固相ペプチド合成を拡張ペプチドに対して行う前に、Ｆｍｏｃ基の脱保護に対する最適な塩基の調査を行ってＡＯＭＫ基の置換なしにＦｍｏｃ除去を可能にする条件を同定した。Ｎ−α―Ｆｍｏｃ―Ｌ−ロイシン２，６−ジメチルベンゾイルオキシメチルケトン装填樹脂（５ｃ，〜１ｍｇ、〜３．７×１０^−４ミリモル）の１８アリコートをＤＭＦで３０分間溶媒和させた。各塩基のＤＭＦ溶液を各溜めに加え、反応物を２０分間振った。樹脂をＤＭＦ、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。２５０μＬのＤＭＦ中の無水酢酸（１０当量）およびＤＩＥＡ（１５当量）を各溜めに加え、脱保護した遊離のアミンをアシル化した。反応物を１５分間振り、樹脂をＤＭＦ、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。反応物塊を真空下〜１５分間置いた。開裂カクテル（９５％ＴＦＡ，５％Ｈ_２Ｏ）２００μＬを樹脂に加えた。１時間後、開裂混合物を収集し、メタノールで希釈し、直接注入イオンスプレーマススペクトル法によって分析した。

アミノメチルポリスチレン上での固相ペプチド合成
アミノメチルポリスチレンまたはリンク樹脂上のＮ−Ｆｍｏｃで保護した２，６−ジメチルベンゾイルオキシメチルケトン誘導体をＤＭＦで３０分間溶媒和させた。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を５％ジエチルアミンのＤＭＦ溶液で１５分間処理し、その後フレッシュ溶液で１５分間処理して除去した。樹脂をＤＭＦ、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。Ｎ−Ｆｍｏ保護アミノ酸（３当量）（８，９ａ−ｃ用のＺ保護アミノ酸），ＨＯＢＴ（３当量）の０．２ＭのＤＭＦ溶液およびＤＩＣ（３当量）を順に樹脂に加えた。樹脂を室温で２時間振り、ＤＭＦ、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。固相ペプチド合成の各後続ステップに対して、同一の脱保護およびカップリング反応を行った。脱保護およびカップリング反応を１級アミンに対するニンヒドリン試験によって監視した。最終化合物用のＮ末端アミンのキャッピングは、無水酢酸（１０当量）およびＤＩＥＡ（１５当量）の０．５ＭのＤＭＦ溶液で樹脂を振ることによって達成された。１５分間室温で振った後、樹脂をＤＭＦ、続いてＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し、真空乾燥した。

アミノメチルポリスチレン樹脂からの一般的な開裂方法
三方ナイロン活栓を、耐ＴＦＡのポリプロピレンニードル弁（Waters）に交換した。９５％ＴＦＡ／５％Ｈ_２Ｏの溶液を樹脂に加えた。室温で１．５時間放置した後、開裂混合物を収集し、樹脂を新しい開裂溶液で洗浄した。一緒にした混合物を冷エーテル中に−２０℃で２時間沈殿させた。沈殿したペプチドを−１０℃で３１５分間０００ｒｐｍの遠心分離により収集した。このペレットを正のアルゴン流によって乾燥し、最小量のＤＭＳＯに溶解した。生成物を、０〜１００％水―アセトニトリルの直線勾配を用いるＣ_１８逆相ＨＰＬＣ（Waters, Delta-Park）上で精製した。生成物含有留分をプールして、凍結乾燥した。生成物の同定をマススペクトルによって行った。

リンク樹脂からの一般的な開裂方法
２０％ＴＦＡ／２．５％トリイソプロピルシランのＣＨ_２Ｃｌ_２溶液を樹脂に加え、反応時間を１５分間に短縮させたこと以外は、アミノメチルポリスチレン樹脂と同様の処理を行う。

化合物の特徴付け
生物学的研究に用いる全ての最終化合物をＨＰＬＣにより精製し、Bruker Autoflex TOF/TOFマススペクトロメーターを用いる高分解能マススペクトル（ＨＲＭＳ）法によって特徴付ける。

ライブラリスクリーニング
カスパーゼ反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ ＤＴＴ，０．１％ＣＨＡＰＳ，１０％ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ７．４）に組換えカスパーゼ３，８及び９を用いてライブラリスクリーニングを行った。スクリーニングの前にカスパーゼ反応緩衝液中３７℃で１５分間培養することによってこれらカスパーゼを予備活性化した。カスパーゼ３（１０ｎＭ），カスパーゼ８（２０ｎＭ）およびカスパーゼ９（１００ｎＭ）は、阻害剤ライブラリを用いて３７℃で培養された。阻害剤ライブラリの濃度は、規準化前に１０％〜８０％の範囲の残留活性値のスペクトルを与えるように選択された。カスパーゼ３に対しては、全てのライブラリを最終濃度５０ｎＭでスクリーニングした。カスパーゼ８に対しては、天然および非天然Ｐ２およびＰ４ライブラリを５０ｎＭでスクリーニングし、一方天然および非天然Ｐ３ライブラリを最終濃度５００ｎＭでスクリーニングした。カスパーゼ９に対しては、全てのライブラリを最終濃度５００ｎＭでスクリーニングした。阻害剤ライブラリで３０分間培養した後、１００μＭの蛍光基質（カスパーゼ３に対してはＤＥＶＤ−ＡＦＣ，カスパーゼ８に対してはＬＥＴＤ−ＡＦＣ，カスパーゼ９に対してはＬＥＨＤ−ＡＦＣ，Calbiochem）を加え、反応物を１５分間培養した。蛍光表示の終点（Ａｂｓ ４９５ｎｍ／Ｅｍｉｓ ５１５ｎｍ）は、Spectra M5 plate reader (Molecular Devices)を用いて測定された。相対蛍光値を、未阻害対照物に対する相対残留活性％に変換した。これら値は、最低残留活性パーセントを０％に、最高残留活性パーセントを１００％となるように内部規準化された。残留活性値は、記述した（Greenbaum et al., 2000; Greenbaum et al., 2002;Nazif and Bogyo,2001）ような階層的クラスターを用いて比較した。

動力学化合物スクリーニング
化合物スクリーニングを、記述した（Salvesen,1989）ようなプログレス曲線方法を用いて完成した。全てのスクリーニングをカスパーゼ反応緩衝液中で行った。カスパーゼ９の特異的化合物ＡＢ３８，４０，４１及び４２を、カスパーゼ反応緩衝液および記述した（Pop, 2006）ようなスクロースの代わりに１Ｍのクエン酸ナトリウムを有するカスパーゼ緩衝液中でスクリーニングした。使用した活性カスパーゼの濃度は以下のとおりである。５ｎＭの活性カスパーゼ３，５ｎＭの活性カスパーゼ７，１０ｎＭの活性カスパーゼ８，５０ｎＭの活性カスパーゼ９である。完全な活性化を確保するため、動力学測定を行う前に、カスパーゼ３／７，８および９を３７℃でそれぞれ５，１０または４０分間培養した。

ビオチンおよびカスパーゼ７，９の免疫ブロット法
全てのタンパク質サンプルを、ＳＤＳサンプル緩衝液中で急冷し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に９０℃で５分間沸騰した。サンプルを、前述の通り、１０〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ勾配ゲル（Novex, Invitrogen）上で分離した。タンパク質をニトロセルロース（ＢｉｏＲａｄ）膜に転換した。全てのビオチンおよびカスパーゼ９ブロットをＰＢＳＴ−５％Ｍｉｌｋ溶液で１時間ブロックし、また全てのカスパーゼ７ブロットをＰＢＳＴ−３％ＢＳＡでブロックした。次いで、ビオチンブロットをＰＢＳＴで３０分間洗浄し、続いてストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）の１：３５００のＰＢＳＴ希釈液で４５分間培養した。カスパーゼ９ブロットを、ＰＢＳＴ−５％ミルク溶液もしくはＰＢＳＴ−３％ＢＳＡにおけるポリクローンカスパーゼ９抗体Ａ−１９Ｂ（Burnham Institute for Medical Reserch）（Stennicke et al., 1999）の１：３０００希釈液またはポリクローンカスパーゼ７（Cell Signaling Technologies, cat #9492）の１：２０００希釈液で一晩培養した。２×３０分間のＰＢＳＴでの洗浄後、抗体ブロットをＰＢＳＴ−５％ミルクまたはＰＢＳＴ−３％ＢＳＡにおける二次抗ウサギ（Santa Cruz）の１：３０００希釈液で３０分間培養した。全ブロットをＰＢＳＴで３×５分間洗浄し、Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrateを用いて視覚化した。

組換えカスパーゼの競争および直接標識化
全ての競争および直接標識化実験に対して、組換えカスパーゼをカスパーゼ反応緩衝液において３７℃で１５分間予備培養した。競争実験に対して、１００ｎＭの活性部位滴定カスパーゼを適切な阻害剤で３７℃で３０分間培養し、次いで残留活性部位を５μＭ ＫＭＢ０１でさらに３０分間標識化した。直接標識化に対して、１００ｎＭのカスパーゼ３，８及び９を一緒に適切なＡＢＰの存在下指定濃度で３０分間３７℃で培養した。

細胞培養
ジャーカット細胞およびＭＣＦ−７細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ），２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補ったＲＰＭＩ１６４０内で培養し、５％ＣＯ_２において３７℃で維持した。ＤＭＥＭをＲＰＭＩ１６４０の代わりに用いた以外、上述したように２９３個の細胞を培養した。

低張抽出物調製
低張２９３およびＭＣＦ−７抽出物をすでに記述（Liu et al., 1996）したように調製した。

アポトーシス２９３およびＭＣＦ−７抽出物における内因性および外因性カスパーゼの直接標識化
低張抽出物のタンパク質濃度を、標準のBradford Protein Assay(Bio Rad)を用いて測定した。２９３抽出物を全タンパク質濃度４．７μｇ／μＬで得、ＭＣＦ−７抽出物をこの濃度まで希釈した。シトクロムｃ（最終濃度１００μＭ）およびｄＡＴＰ（最終濃度１ｍＭ）を抽出物（２０μＬ最終容積において全プロテイン７３μｇ）に時間０で加え、１０分間３７℃で培養を続けた。活性系プローブ（指定最終濃度）を加え、さらに３０分間標識化を続けた。サンプル（全タンパク質１３．５μｇ）を１０〜２０％Tris-Glycine 勾配ゲル（Novex Invitrogen）上で分析した。或いはまた、組換えカスパーゼ８（１００ｎＭ）を、所要に応じてシトクロムｃ／ｄＡＴＰ（上述した）と共に、２９３の抽出物（上述した）に加えた。抽出物を１０μＭのＫＭＢ０１，ｂＡＢ１９及びｂＡＢ３８で標識化し、１０分間経過したら、後活性化／カスパーゼ８添加を３７℃で３０分間行った。サンプル（上述した）を、１０〜２０％勾配ゲル（上述した）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって上述したように分析した。

生ジャーカット細胞における内因性カスパーゼ活性の直接標識化
培地（１μｌ）中の細胞（３×１０６）を、エトポシド（２．５μｇ；Calbiochem）または抗ファス抗体（０．５μｇ；clone CH11，Upstate Signaling Solution）で１５時間処理した。次いで、細胞をＫＭＢ０１，ｂＶＡＤ−ｆｍｋ（Calbiochem），ｂＡＢ１９の最終濃度１０μＭで２時間、またはｂＡＢ０６もしくはｂＡＢ１３の最終濃度１μＭで２時間培養した。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液において４回９０℃で５分間沸騰させることにより溶解させた。標識化タンパク質を、上述したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびブロッティングによって分析した。

細胞抽出物における内因性アポトーシス検定
低張２９３またはＭＣＦ−７抽出物（全タンパク質濃度４．７μｇ／μｌ；単位時間あたりの全プロテイン７３μｇ）を、前述したとおり、シトクロムｃ（最終濃度１００ｕＭ）およびｄＡＴＰ（最終濃度１ｍＭ）の添加により０〜２４０分の範囲の時間活性化した。ＫＭＢ０１（最終濃度２０μＭ）または媒体対照物（ＤＭＳＯ）を指定した活性化時間の最後に加え、標識化を３７℃でさらに３０分間行った。サンプルを４回のＳＤＳサンプル緩衝液の添加により急冷し、その後５分間沸騰した。各時点の部分（全タンパク質１３．５μｇ）を１０〜２０％勾配ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いて上述したようにビオチンブロッティングを行った。

外因性Ｂｉｒ３の存在下での細胞抽出物における内因性アポトーシス検定
低張２９３抽出物（全タンパク質７３μｇ）を上述したように活性化し、指定時間培養した。組換え精製Ｂｉｒ３（１μｇ）を必要に応じて抽出物に加え、ＫＭＢ０１（最終濃度２０μＭ）の添加前にさらに５分間培養を続けた。標識化をさらに３０分間行い、サンプル（全タンパク質１３．５μｇ）を上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ビオチンブロッティングを行った。

低張２９３抽出物におけるＦＬ−Ｃ７標識化の定量化
経時的検定におけるＦＬ−Ｃ７のＫＭＢ０１標識化の強度を、一般的に利用可能なＩｍａｇｅＪ（http://rsb.info.nih.gov/ij）を用いて定量化した。

低張２９３抽出物におけるＦＬ−Ｃ７の阻害剤特異性
低張２９３抽出物（全タンパク質７３μｇ）を、上述したように、３７℃で５分間活性化した。ＮＰ−ＥＶＤ−ＡＯＭＫ，ＮＰ−ＤＥＶＤ−ＡＯＭＫ（ＡＢ０９），ＮＰ−Ｄ３ＶＤ−ＡＯＭＫまたはＮＰ−３ＶＤ−ＡＯＭＫ（最終濃度２０μＭ）を、ＫＭＢ０１（最終濃度２０μＭ）の添加前に抽出物に５分間加え、３７℃で３０分間培養できるようにした。サンプル（全タンパク質１３．５μｇ）を、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ビオチンブロッティングを行った。

低張２９３抽出物におけるＡＢ０６の滴定
低張２９３抽出物を上述したように活性化し、ＡＢ０６を指定した最終濃度まで５分間加えた。５分間の培養後、ＫＭＢ０１（最終濃度２０μＭ）を加え、３０分間培養できるようにした。全反応を３７℃で行った。

免疫沈降
タンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズ（４０μＬ）を、５μｇの指定抗体と共に３００μＬ ＩＰ緩衝液（ＩＸ ＰＢＳ ｐＨ７．４，０．５％ ＮＰ−４０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）において４℃で一晩予備培養した。使用した抗体は以下の通りである。Ｈ−２７７カスパーゼポリクローン（ネコ＃：ｓｃ−７１４８、Santa Cruz），カスパーゼ７モノクローン（ネコ＃５５６５４１，BD-Pharmingen），カスパーゼ９ ＡＲ−１９Ｂ（Stennickeら,1999）である。ＩＰ緩衝液で３回洗浄後、ビーズを３００μＬのＩＰ緩衝液に再懸濁させ、サンプルを加え、４℃で一晩振りながら培養できるようにした。ビーズをＩＰ緩衝液で３回洗浄し、続いて０．９％ＮａＣｌで３回洗浄した。ビーズを１回サンプル緩衝液中で５分間沸騰させた。全ての上澄みサンプルを、アセトンを用いて−８０℃で２時間沈殿させ、乾燥し、１回サンプル緩衝液に再懸濁させた。全サンプルに、上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてビオチンブロッティングを行った。

蛍光基質
上述したように、本発明は、Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４で挙げた残基の選択に基づく表１〜３に挙げた化合物の特異性を有する蛍光基質からなる。これら基質は、必ずしもＡＯＭＫ構造を有するわけではないが、Ｄ（アスパラギン酸塩）残基がアミド結合したクマリンまたはクマリン誘導体のすぐ隣にある上記式IIIに示した構造によって例示することができる。これら基質の合成は、ＡＯＭＫ阻害剤とは異なる経路で進めることができる。様々なペプチド蛍光基質の合成方法が知られている。典型的な合成方法は、例えば米国特許第６６８０１７８号（Harris et al., January 20, 2004, “Profiling of protease specificity using combinatorial fluorogenic substrate libraries“）にあり、ここで参考のため援用する。この特許文献には蛍光ペプチドまたは蛍光ペプチドを含む材料の製造方法が開示されている。この方法は、（ａ）固体担体に共有結合した蛍光部分を備える第１の抱合体で、特異な式に従った構造を有する該抱合体を用意し、（ｂ）前記第１抱合体を第１の保護したアミノ酸部分（ｐＡＡ^１）および活性化剤と接触させて、ｐＡＡ^１のカルボキシル基と第１抱合体のアニリン窒素との間にペプチド結合を形成し、（ｃ）ｐＡＡ^１を脱保護して、反応性ＡＡ^１アミン部分を有する第２の抱合体を形成し、（ｄ）前記第２抱合体を第２の保護したアミノ酸（ｐＡＡ^２）および活性化剤と接触させて、ｐＡＡ^２のカルボキシル基と反応性Ａ^１アミン部分との間にペプチド結合を形成し、（ｅ）ｐＡＡ^２を脱保護して、反応性ＡＡ^２アミン部分を有する第３の抱合体を形成し、（ｆ）前記第３抱合体を第３の保護したアミノ酸（ｐＡＡ^３）および活性化剤と接触させて、ｐＡＡ^３のカルボキシル基と反応性ＡＡ^２アミン部分との間にペプチド結合を形成し、（ｇ）ｐＡＡ^３を脱保護して、反応性ＡＡ^３アミン部分を有する第４の抱合体を形成することを備える。共役するのが困難なアミノ酸（Ｉｌｅ，Ｖａｌなど）に対して、遊離の未反応のアニリンが担体上に残存し、続く合成と検定操作を困難にする場合がある。酢酸の３−ニトロトリアゾール活性エステルを用ＤＭＦにいる特別なキャッピングステップは、残存アニリンを効率的にアシル化する。未精製基質溶液中に存在し得る生成した酢酸でキャップしたクマリンは、通常プロテアーゼ基質ではない。これらの方法によって得たＰ１置換樹脂を用いてあらゆるＡＣＣ蛍光基質を製造することができる。ここで参照のため援用する下記の特許文献にも、本発明の蛍光基質の製造に適用できる合成方法が開示されており、さらなる蛍光部分の記述を付与し、該特許文献は米国特許第６３７２８９５号（Bensten et al., May 16, 2002, “Fluorogenic Compounds“）である。

本発明の化合物は、上述の発明の概要で説明した上記標識を含むクマリンおよび関連する化合物で結合する際に、蛍光基質としても機能することができる。本発明のペプチドークマリン基質は、例えばSigma Aldrich株式会社によって生産されたCaspase-6 Assay Kit、など他のクマリン基質と類似している。この蛍光検定は、蛍光７−アミド−４−メチルクマリン［ＡＭＣ］の放出をもたらすカスパーゼ６によるペプチド基質アセチル−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−７−アミド−４−メチルクマリン［Ａｃ−ＶＥＩＤ−ＡＭＣ］の加水分解に基づく。本発明の基質は、これらの表に挙げたカスパーゼに対して特異であるという点で有利である。

他の蛍光化合物を、例えば、Monsigny et al., "Assay for proteolytic activity using a new fluorogenic substrate (ペプチジル-3-アミノ-9-エチル-カルバゾール); quantitative determination of lipopolysaccharide at the level of one pictogram," EMBO J. 1982; 1(3): 303-306において開示されているように、クマリンまたはクロメンの代わりに用いることができる。他の例は、Lee et al., "DEVDase detection in intact apoptotic cells using the cell permeant fluorogenic substrate, (z-DEVD)2-cresyl violet," BioTechniques, November 2003, 35:1080- 1085,であり、ペプチド配列ＤＥＶＤを有する蛍光クレシルヴァイオレットの使用を教唆している。また、本発明のペプチド配列は、従来技術のペプチド配列よりもターゲットカスパーゼに対して高い親和性を有することを示されてきた。本発明のペプチド配列を用いる基質の他の例として、本発明のペプチドを蛍光色素分子の蛍光発光が９０〜９９％急冷されるローダミン誘導二量体として製造することができる。プロテアーゼがこの抱合体のペプチド主鎖を開裂する場合、蛍光色素分子を組み込んだ環状構造が壊れ、２個の高い蛍光置換ペプチド断片を発生する。Komoriya et al., "Assessment of Caspase Activities in Intact Apoptotic Thymocytes Using Cell-permeable Fluorogenic Caspase Substrates," The Journal of Experimental Medicine, June 5, 2000, Volume 191, Nnmber 11, 1819-1828 を参照されたい。

また、クマリン誘導体４―メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）または７−アミノー４−メチルクマリン（７−ＡＭＣ）から誘導したクマリン類似体を本発明の蛍光合成酵素基質に用いることもできる。

標識化化合物
本発明の化合物は、例えば蛍光色素、ビオチン、量子ドットのような標識、放射標識等で標識化することができる。本発明の化合物はアミノ酸状の側鎖を有するため、ペプチドを標識化するのに用いた方法を適用して本発明の化合物を標識化することができる。ここに例を挙げると、ビオチンで標識化された化合物ｂＡＢ０６，ｂＡＢ１４，ｂＡＢ１９．およびｂＡＢ３８である。

かかる化合物は、蛍光分子、すなわち入射放射線の吸収によって刺激された際に電磁放射線、特に可視光の放射線を放出するものを含有することができる。これは、免疫蛍光の標識化において広範囲の適用を享受するこれまでデザインされてきた最も知られた蛍光色素のうちの１つであるフルオレセインを含む。このキサンテン色素は、４９５ナノメートルに吸収極大を持つ。関連する蛍光色素分子は、フルオレセインのフッ素化誘導体である、Oregon Greenである。これは、さらに、ボラーホジアザインデセン、ローダミンおよびシアニン色素を含む。この用語には５−ＥＤＡＮＳ（ヌクレオチド類似体アデノシン５‘―トリホスフェート［ｇ］−１−ナフタレンスルホン酸―５（２−アミノエチルアミド）（ＡＴＰ［ｇ］−１，５−ＥＤＡＮＳ）および８−アジドアデノシン５’−トリホスフェート［ｇ］−１−ナフタレンスルホン酸―５（２−アミノエチルアミド）（８Ｎ３ＡＴＰ［ｇ］−１，５−ＥＤＡＮＳ）を含む。

他の好ましい標識には、「ボラージアザーインデセン」、すなわち、ＢＯＤＩＰＹ(R)色素として既知の４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ,４a-ジアザ−ｓ−インデセンがある。これら色素の様々な誘導体が既知で、本発明の定義に含まれる例えば、Chen et al., "拡張共役および限定結合回転用に変性した4,4- ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インデセン (BODIPY)色素" J Org Chem. 2000 May 19;65(10):2900-6 である。これらの化合物は、さらに以下の「蛍光色素分子」の項目で示した構造を参照にして定義する。例示したＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘにおいて、蛍光色素分子におけるＲ１はベンジルメトキシ基であり、この構造をさらにスキーム１に示した。リンカーは、ジペプチド出発材料の一部として選択したリジン側鎖に対するアミド結合である。他の好ましい標識は、「ローダミン」、すなわちローダミン環状構造に基づいた色素がある。ローダミンは（他に）以下のようなもの、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）：タンパク質抱合体、とくに抗体およびアビジン抱合体の製造用の極めて普通の蛍光色素分子、およびオリゴヌクレオチド標識化および自動核酸配列に用いるカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）がある。ローダミンは、フルオレセインを基にした蛍光色素分子に対する天然の補足物として確立され、より長い極大波長発光を提供し、したがって多色の標識化または汚染化に対する機会を増やす。これは、また、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素として既知のシリーズのる蛍光色素分子である「スルホン酸化ローダミン」を含む。

また、様々な炭素数のポリアルケン架橋を介して結合した２個の芳香族ユニットを有する部分飽和インドール窒素複素環核に基づた一群のシアニン色素Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｃｙ７およびその誘導体が適している。これらのプローブは、フルオレセインやテトラメチルローダミンのような多くの伝統的な色素と同様の蛍光励起および発光プロファイルを示すが、水溶性、光安定性が高く、量子収率も高い。シアニン色素のほとんどは、その伝統的な対応物よりも環境的に安定しており、その蛍光発光強度のｐＨおよび有機固定媒介物に対する感度を低くする。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓと同様の方法において、合成色素のＣｙ群の励起波長は、特に一般的なレーザーおよびアーク放電光源との使用に対し調整され、また蛍光発光を伝統的なフィルタの組合せで検出することができる。

シアニン色素は、様々な二次抗体、デキストリン、ストレプトアビジンおよび卵白アビジンに結合した反応色素または蛍光色素として容易に入手可能である。一般に、シアニン色素は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ群のメンバーよりも広い吸収スペクトル領域を有し、共焦点顕微鏡でレーザー励起光源を選択する際により融通が効く。

有用な標識には、本発明のペプチド阻害剤にキレート化によって結合する金属がある。とくに、これらには、診断トレーサーとしての使用に対して、または細胞もしくは組織内の医学的に有能な放射線の堆積に対して柔軟であるという崩壊特性を有する放射性核種がある。本発明のカスパーゼ阻害剤の共役配位錯体は、放射性金属（放射性核種）を用いて製造することができる。放射性核種は、例えば、Tc, Ru, In, Ga, Co, Pt, Fe, Os, Ir, W, Re, Cr, Mo, Mn, Ni, Rh, Pd, Nb, Cu及びTaの放射性同位体からなる群から選択することができる。 同位体を例示すれば、Tc-99m, Tc-99, In- 111, Ga-67, Ga-68, Cu-64, Ru-97, Cr-51, Co-57, Re-188, 1-123, 1-125, I- 130, 1-131, 1-133, Sc-47, As-72, Se-72, Y-90, Y-88, Pd-100, Rh-100 m, Sb-119, Ba-128, Hg- 197, At-211, Bi-212, Pd-212, Pd-109, Cu-67, Br-75, Br-76, Br-77, C-Il, N-13, O-15, F-18, Pb-203, Pb-212, Bi-212, Cu-64, Ru-97, Rh-105, Au-198, および Ag-199 and Re-186がある。

放射性標識のさらなる議論が、米国特許第６５８９５０３号, Piwnica-Worms, July 8,2003, “Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy” において見られる。活性化カスパーゼの医学画像化に有用な放射性核種には、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用の^１１Ｃ（ｔ_１／２２０．３分），^１３Ｎ（ｔ_１／２９．９７分），^１８Ｆ(ｔ_１／２２０．３分)，^６４Ｃｕ（ｔ_１／２１２時間），^６８Ｇａ（ｔ_１／２６８分）と、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）（Horn and Katzenellenbogen, Nucl Med. Biol., 1997, 24:485-498）用の^６７Ｇａ（ｔ_１／２６８分），^９９ｍＴｃ（ｔ_１／２６時間），^１２３Ｉ(ｔ_１／２１３時間)，^２０１Ｔｌ（ｔ_１／２７３．５時間）がある。これらの金属を、本発明のペプチド様構造に結合する。このようなカップリングは、共役配位錯体を製造することによって行う。ペプチド金属配位錯体は、例えば上述した特許文献に記載されたような当業界で既知の方法によって容易に製造することができる。例えば、リンカーと共役すべきカスパーゼ阻害剤ペプチドと、金属キレート部分とを、適切な還元剤の存在下で放射性金属塩と、所要に応じて水性媒体中で室温から還流温度までの間の温度で混合し、最終生成物の配位錯体を得、マクロ（キャリア付加、例えばＴｃ−９９）濃度とトレーサー（キャリア付加なし、例えばＴｃ−９９ｍ）濃度の両方で高収率で単離することができる。既知であるように、（Ｔｃ−９９ｍ）過テクネチウム（ＴｃＯ_４）を限定することはないが、Ｎ_２Ｓ_２，Ｎ_２ＳＯ，Ｎ_３ＳおよびＮＳ_３部分を含有するもののようなキレート化配位子の存在下で塩化第一スズのような還元剤によって還元する場合、(ＴｃＯ)Ｎ_２Ｓ_２，(ＴｃＯＮ_２ＳＯ，(ＴｃＯ)Ｎ_３Ｓおよび(ＴｃＯ)の錯体が形成される（Meegalla et al., J Med. Chem., 1997, 40:9-17）。

本発明のペプチド様構造上のキレート化部位は、例えば、米国特許第６３２３３１３号，Tait et al., issued November 27, 2001, "Annexin derivative with endogenous chelation sites“に開示されているように、設けることができる。この方法は、システインおよびグリシンのようなあるアミノ酸残基を活性配列に付加することを含む。他の方法が、米国特許５８０３４３１号，Srinivasan et al, November 3, 1998, "Radiolabeled peptide compositions for site-specific targeting"に開示されている。この特許文献は、カルボキシ末端アミノ酸をカルボン酸形態で有することを特徴とする放射性同位体で標識化したペプチドで、該ペプチドをキレート剤によって診断または治療用の放射性核種に結合することを開示している。キレート剤は、これに選択した放射性核種を共有結合することができる。一般に、適切なキレート剤は、既知のＮ_３ＳおよびＮ_２Ｓ_２配位子のような金属放射性核種を結合するのに入手し得る少なくとも１個の硫黄族を有する四座配位子を含有するものがある。とくに、この方法に関連して使用し得るキレート基及び本発明の化合物を含む他のものとして、２，３−ビス（メルカプトアセトアミド）プロパノエート（米国特許第４４４４６９０号）、Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリシン（米国特許第４８６１８６９号）、ＤＴＰＡ，ＥＤＴＡのような二環式二無水物およびその誘導体（米国特許４４７９９３０号），キレート化速度を早くするアミノ基を有するＮＳキレート（米国特許第５３１０５３６号），米国特許４９６５３９２号に記載されるようなＮ_２Ｓ_２キレート、米国特許５１２０５２６号に記載されるようなＮ_３Ｓキレート、および米国特許５１７５２５７号に記載されるような開裂性リンカーを有するＮ準２Ｓ準２がある。キレート剤を本技術分野で既知の標準的な手法によって本発明化合物のペプチド様部分に結合し、ペプチドの特異的活性カスパーゼ結合活性に悪影響を与えないようなペプチドのあらゆる位置に付加することができる。好ましくは、キレート基をペプチドのアミノ末端アミノ酸に共有結合する。キレート基を固相ペプチド合成中にペプチドに結合するか、またはペプチドを得た後固相化学により付加されるのが有利な場合がある。好ましいキレート基には、ＤＴＰＡ，カルボキシメチルＤＴＰＡ，ＮとＳドナー原子の組み合わせもしくはＮドナー原子を含むテトラ四座配位子がある。この方法は、銅を含む様々な放射性核種に有用である。

また、Thakur et al., "The Role of Radiolabeled Peptide-Nucleic Acid Chimeras and Peptides in Imaging Oncogene Expression," Indian Journal of Nuclear Medicine, 2004, 19(3):98-114に開示されているように、^６４Ｃｕを^９９Ｔｃに対して説明された方法、つまり０．１ＭのＨＣＬにおけるＣｕＣＬ_２をｐＨ５．５の０．１Ｍのクエン酸アンモニウム中の精製阻害剤に加え、９０℃で２０分間培養し、ＥＤＴＡで急冷し、サイズ排除クロマトグラフィで精製することによりキレート化することができる。

^１８Ｆでの標識化を、Schottelius et al., "First ¹⁸F- Labeled Tracer Suitable for Routine Clinical Imaging of sst Receptor-Expressing Tumors Using Positron Emission Tomography," Clinical Cancer Research, June 1, 2004, Vol. 10, 3593-3606に開示されているように行うことができる。放射性ハロゲン化ケトンもしくはアルデヒド、例えば４−［^１８Ｆ］フルオロベンズアルデヒドと、アミノオキシ官能性で官能化されたペプチドとの間のオキシム結合の化学選択的形態が開示されている。この手法は、抗体の放射性ヨウ素化（Kurth M, Pelegrin A, Rose K, et al "Site-specific conjugation of a radioiodinated phenethylamine derivative to a monoclonal antibody results in increased radioactivity localization in tumor," J Med Chem, 1993, 36: 1255-61）に適用され、また小ペプチドの放射性ヨウ素化（Thumshirn G, Hersel U, Goodman SL, Kessler H. "Multimeric cyclic RGD peptides as potential tools for tumor targeting: solid-phase peptide synthesis and chemoselective oxime ligation," Chemistry Eur J, 2003, 9: 2717-2725）に提案されてきた。

前述したことから明らかなように、式Iおよび式IIにおける末端基Ｒ１およびＲ２をキレート化部位を与えるように修正することができる。Ｒ１はＣｙｓおよびＧｌｙから選択した約４個のアミノ酸を有するペプチドキレート化部位とすることができる。Ｒ２は−ＣＯＯＨなどとすることができる。

医薬組成物
医薬品としてのカスパーゼ阻害剤の素質は、数々の動物モデルにおけるプロトタイプの阻害剤で実証された。アルコール性肝臓疾患またはＢ型およびＣ型ウィルス肝炎感染症などの肝臓疾患は、促進的なアポトーシスと関連がある。動物モデルにおいて、既知の広義の不可逆カスパーゼ阻害剤、ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）は保護的で、死受容体介在の肝臓傷害を効率的に阻止する（Rodriguez I, Matsuura K, Ody C, Nagata S, and Vassalli P (1996) Systemic injection of a tripeptide inhibits the intracellular activation of CPP32-like proteases in vivo and fully protects mice against Fas-mediated fulminant liver destruction and death. J Exp Med 184: 2067-2072; Kunstle G, Leist M, Uhlig S, Revesz L, Feifel R, MacKenzie A, and Wendel A (1997) ICE-protease inhibitors block murine liver injury and apoptosis caused by CD95 or by TNF-alpha. Immunol Lett 55: 5-10）。関節モデルにおいて、カスパーゼー１−依存化膿を阻止することによる炎症性サイトカイン放出の抑制（ＩＬ−１｛ｂｅｔａ｝，ＩＬ−１８）が病気の重症度の効率的減少を導く（Miller BE, Krasney PA, Gauvin DM, Holbrook KB, Koonz DJ, Abruzzese RV, Miller RE, Pagani KA, Dolle RE, and Ator MA (1995) Inhibition of mature IL-I beta production in murine macrophages and a murine model of inflammation by WIN 67694, an inhibitor of IL-I beta converting enzyme. J Immunol 154: 1331-1338; Ku G, Faust T, Lauffer LL, Livingston DJ, and Harding MW (1996) Interleukin- 1 beta converting enzyme inhibition blocks progression of type II collagen-induced arthritis in mice. Cytokine 8: 377-386）。心筋梗塞およびその結果起こる筋細胞死が、動物モデルにおけるｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよび関連するぺプチド阻害剤によって改善されたことを示す（Yaoita H, Ogawa K, Maehara K, and Maruyama Y (1998) Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation 97: 276-281）。また、リンパ球の広範なアポトーシスと関連があり人間の場合約２９％致死である敗血症が、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるマウスモデルで効果的に減少し、生存率の上昇をもたらした（Hotchkiss RS, Chang KC, Swanson PE, Tinsley KW, Hui JJ, Klender P, Xanthoudakis S, Roy S, Black C, Grimm E, et al., (2000) Caspase inhibitors improve survival in sepsis: a critical role of the lymphocyte. Nat Immunol 1 : 496-501）。加えて、カスパーゼ阻害剤は、ストローク方式において神経細胞の死および梗塞面積を減少させる（Cheng Y, Deshmukh M, D'Costa A, Demaro JA, Gidday JM, Shah A, Sun Y, Jacquin MF, Johnson EM, and Holtzman DM "Caspase inhibitor affords neuroprotection with delayed administration in a rat model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury," J Clin fnvestig, 1998,101: 1992-199）。外因性および内因性アポトーシス経路の活性化を脊髄損傷後の動物モデルにおいて実証、すなわちｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによって効率的に阻止して損傷範囲を狭め運動機能を改善させた（Springer JE, Azbill RD, and Knapp PE "Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury," Nat Med, 1999, 5: 943-946）。

上述した技術において、生体内のデータに基づき、また後述する適当な製剤に従つてここで記述した化合物を投与することによりアポトーシスに関連する疾患を治療した。

本発明の治療化合物は、治療すべき動物が耐えられる賦形剤に処方することができる。この賦形剤の例には、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス液、および他の生理学的平衡塩類溶液がある。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような非水性媒体も使用することができる。他の有用な製剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような粘度増進剤を含む懸濁液がある。賦形剤には、等張性および化学安定性を高める物質のような添加剤も少量含むことができる。緩衝液の例には、リン酸緩衝液、重炭酸塩緩衝液およびトリス緩衝液があり、一方防腐剤の例には、チメロサール、すなわちｏ―クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールがある。標準的な製剤には、液体注射剤、または注射用の懸濁液または溶液として適切な液体に溶解し得る固体のいずれかとすることができる。すなわち、非液体製剤において、賦形剤はデキストロース、ヒト血清アルブミン、防腐剤等からなり、これに滅菌水、または生理食塩水を投与に先立って加えることができる。本発明の一実施形態において、治療用組成物は、キャリアを含むことができる。キャリアには、治療した動物における治療用組成物の半減期を長くする化合物がある。適切なキャリアには、限定するわけではないが、重合制御放出媒体、生分解性インプラント、リポソーム、バクテリア、ウィルス、他の細胞、油、エステルおよびグリコールがある。

本発明の一実施形態は、本発明の化合物を動物に緩徐に放出することができる制御放出製剤である。ここで用いるように、制御放出製剤は、本発明の化合物を制御放出媒体に備える。適切な制御放出媒体は、限定するわけではないが、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微小粒子、ボーラス調剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポ球および経皮的伝達システムがある。本発明の他の制御放出製剤には、動物への投与によりその場で固体またはゲルを形成する液体がある。好ましい制御放出製剤は、生分解性（すなわち生体内分解性）である。

本発明の化合物の製剤および投与に関するさらなる助言は、米国特許第６９０６０３７号、Little, II, et al., issued June 14, 2005, entitled "Therapeutic peptide-based constructs）から得ることができる。この文献に記載されているように、既知の界面活性剤もしくは治療剤なしでまたは一緒に投与し得るＢＰＩタンパク質産物を有するペプチド製剤を調製することができる。ＢＰＩタンパク質産物（例えばｒＢＰＩｓｕｂ２３）を含む安定な医薬組成物は、０．１重量％のポロキシマー１８８（Pluronic F-68, BASF Wyandotte, Parsippany, NJ.）と、０．００２重量％のポリソルベート８０（Tween 80, ICI Americas Inc., Wilmington, Del）とを有するクエン酸緩衝食塩水（５または２０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．０）にＢＰＩタンパク産物を濃度１ｍｇ／ｍｌで含有する。他の安定な医薬組成物は、５ｍＭクエン酸塩中濃度２ｍｇ／ｍｌの活性ポリペプチド、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．２％ポロキシマー１８８及び０．００２％ポリソルベート８０を備える。非経口的に投与する場合、製品組成物は、一般に１日当たり１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投与量、好ましくは１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量で注射される。この治療は、連続注入または間欠注射によって継続することができ、同時に、またさらに治療する医師によって決定されるように例えば１〜３日間一日あたりの投与量を増減させる。

生体内撮像
本発明の選択的カスパーゼ阻害剤を、生体内撮像用に使用することができる。ＡＢ４６およびＡＢ５０のＣｙ５蛍光標識化バージョンを正常マウスに注射し、腎臓および脾臓におけるカテプシンおよびレグメインの標識化を監視した（図１４）。予想通り、プローブＡＢ４６は、レグメインおよびカテプシンＢの両方の相当な標識化を示したが、ＡＢ５０はレグメインのみを標識化した。プローブが生体内で著しく選択的（すなわち、非常に低い背景標識化）で、生体外で観察された特異性パターンが生体内で維持されることを示すため、これらの結果はとくに心強い。

図１４ＡおよびＢは、ＡＢ４６およびＡＢ５０のｃｙ５標識化バージョンによるカテプシンＢおよびおレグメインの生体内標識化を示す。正常なマウスにプローブを静脈注射し、注射後２時間で組織を収集した。組織を均質化し、全タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、続いて蛍光スキャナを用いてゲルをスキャニングした。

図１４は、ＡＢ４６およびＡＢ５０による腎臓におけるレグメインの生体内標識化を示す。これらの化合物は、アテローム性動脈硬化のような条件下で活性レグメインを検出するのに有用である。さらなる詳細は、"Targeted delivery to legumain-expressing cells.”の表題の米国特許公開第2006/0135410号からわかる。

同様に、Papaspyridonos et al., "Novel Candidate Genes in Unstable Areas of Human Atherosclerotic Plaques," Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2006;26:1837を参照されたい。

以下のサンプルは、胸腺におけるデキサメタゾン誘起アポトーシスを利用する。Cristina et al., "Dexamethasone-induced apoptosis of thymocytes: role of glucocorticoid receptor-associated Src kinase and caspase-8 activation," prepublished online as a Blood First Edition Paper on August 29, 2002; DOI 10.1182/blood-2002-06-1779を参照されたい。これは、正常なマウスに低投与量のデキサメタザンを注射することによって、胸腺におけるアポトーシスを特に活性化することができる特にシンプルなモデルである。このモデルによって、アポトーシスを受ける特異な組織におけるカスパーゼ活性を監視し、この標識化を活性カスパーゼを含まない組織と比較することができる。また、アポトーシスの誘引後カスパーゼの活性化の時間変化を監視することができる。

図１５は、デキサメタゾン処理したマウスの胸腺におけるカスパーゼ３の生体内標識化の結果を示す。野生型Ｂａｌｂ−ｃマウスに、ＩＰ注射によってデキサメタゾン（４０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。１２または２４時間後、一般的なカスパーゼプローブＡＢ５０を尾動脈に注射し、プローブを３時間循環させ、その時点で胸腺、肺、肝臓および脾臓から組織を収集した。胸腺、脾臓および肺を除去し、ＩＶＩＳ２０００システムを用いて全臓器を撮像した。次いで、この組織をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルの蛍光スキャンにより分析した。比較のため、特異な抗体を用いて、開裂した活性カスパーゼ３のレベルを監視した。胸腺からの結果を表す図１５に示すように、均質化細胞からの全タンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、続いて蛍光スキャンを行う（図１５Ａ）か、またはレーザー平台スキャナー（図１５Ｂ）で分析し、カスパーゼ３の開裂形態に対し特異な抗血清を用いてブロッティングした。

ＡＢ５３も、カスパーゼ３に特異的であり、血清安定であり生体内使用に適切であると考えられる。

これらの結果は、カスパーゼプローブが胸腺においてカスパーゼ３を効率的および選択的に標識化することを示し、またアポトーシスを受けない他の組織ではほとんどもしくは全く標識化のないことを示す。また、プローブは、化学療法剤で治療した肺がん異種移植片にも用いることができる。

本発明のカスパーゼプローブは、癌治療の結果としてのアポトーシスを受ける組織を撮像するのに用いることができる。Shah et al., "In Vivo Imaging of S-TRAIL-Mediated Tumor Regression and Apoptosis," Molecular Therapy, June 2005, Vol. 11, No. 926 6を参照されたい。この文献には、カスパーゼ３特異基質を用いた撮像方法が教示されている。また、ここに記載されているように、他のカスパーゼ、例えばカスパーゼ７に対して特異なプローブを用いることができる。カスパーゼ７は、外傷性脳損傷に関連する。Zhang et al., "Proteolysis Consistent with Activation of Caspase-7 after Severe Traumatic Brain Injury in Humans," Journal of Neurotrauma, Nov 2006, Vol. 23, No. 11 : 1583 -1590を参照されたい。

キット
本発明のカスパーゼ阻害剤は、アポトーシスおよび細胞シグナル伝達における特異的カスパーゼ活性を測定するためのキットを付与することができる。これを用いて他の阻害薬物を同定することができる。ＡＦＣ（７−アミノートリフルオロメチルクマリン）系の基質は、プロテアーゼ開裂中に青色蛍光を得る。本発明で説明した一連のＡＦＣ系ペプチド基質を有するキットを、カスパーゼプロテアーゼ活性を検定する蛍光表示として提供する。該キットは、一連のＡＦＣ系カスパーゼ基質を正および負の対照物で被覆した９６、３８４または他の大きさのウェルプレートを含有する。これは、カスパーゼまたはカスパーゼ阻害剤をプロファイルするための最善の解決策を与える。また、このキットは、細胞溶解緩衝液；検定緩衝液；ＡＦＣ（更生用の蛍光参考基準）；および詳細なプロトコルを含有する場合がある。

他のキットフォーマットは、カスパーゼ３およびカスパーゼ７の両方がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＤＥＶＤ）用の基質特異性を有する事実を利用する。このキットは、カスパーゼ３／７活性を検定する蛍光表示としてカスパーゼ３−７選択基質を用いる。カスパーゼ３／７の開裂により、この基質は、明るい青色蛍光を有し、励起／発光＝３８０ｎｍ／５００ｎｍで検出し得るクマリン（例えばＡＦＣ蛍光色素分子）を発生する。このキットにおけるニ機能検定緩衝液は、細胞を分解し、同時に酵素活性を測定するように設計する。すなわち、このキットは、細胞培養におけるカスパーゼ３／７活性を９６ウェルまたは３８４ウェルプレートにおいて直接測定する。また、このキットは、カスパーゼ８または９基質を含有することもできる。

他のキットフォーマットは、本発明の基質を開裂して遊離のＡＦＣを放出し、次いでマイクロタイタープレートリーダーを用いて定量化できる活性カスパーゼを提供する。スクリーニングすべき潜在的な阻害化合物を反応物に直接加え、次いでカスパーゼの阻害レベルを画定することができる。この検定をマイクロタイタープレートで直接行うことができる。

他のキットフォーマットは、上述した化合物記載に係る阻害剤の詰め合わせ、カスパーゼ３および７に選択的なもの、カスパーゼ８に対するもの、カスパーゼ９に対するもの、および一般的な阻害剤を備える。これらの化合物を矛盾のない結果用に処方し、負の対照物を与える。

修飾および置換アミノ酸
本発明化合物に用いるアミノ酸に関して、あらゆる自然発生するアミノ酸を用いることができる。加えて、本発明のペプチドのアミノ酸も修飾することができる。例えば、アミノ基をアシル化、アルキル化またはアリール化することができる。ベンジル基を、ハロゲン化、ニトロシル化、アルキル化、スルホン化又はアシル化することができる。

以下の残基は、本発明の選択的阻害剤に用いるのに好ましい。アスパラギン酸塩、バリン、グルタミン酸塩、トレオニン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニン並びに特異な非天然側鎖３,６,８，２３，２６，２９，３１，３４，３８である。選択性は、上述したように異なるシステインプロテアーゼでテストすることによって画定することができる。天然の側鎖をさらに修飾することができる。例えば、化学修飾したアミノ酸を本発明の化合物に組み込むことができる。

アセチル化物
Ｎ−アセチルーＬ−アラニン，Ｎ−アセチルーＬ−アルギニン；Ｎ−アセチルーＬ−アスパラギン；Ｎ−アセチルーＬ−アスパラギン酸；Ｎ−アセチルーＬ−システイン；Ｎ−アセチルーＬ−グルタミン；Ｎ−アセチルーＬ−グルタミン酸；Ｎ−アセチルグリシン；Ｎ−アセチルーＬ−ヒスチジン；Ｎ−アセチルーＬ−イソロイシン；Ｎ−アセチルーＬ−ロイシン；Ｎ２−アセチルーＬ−リジン；Ｎ６−アセチルーＬ−リジン；Ｎ−アセチルーＬ−メチオニン；Ｎ−アセチルーＬ−フェニルアラニン；Ｎ−アセチルーＬ−プロリン；Ｎ−アセチルーＬ−セリン；
Ｎ−アセチルーＬ−トレオニン；Ｎ−アセチルーＬ−トリプトファン；Ｎ−アセチルーＬ−チロシン；Ｎ−アセチルーＬ−バリン

アミド化物
Ｌ−アラニンアミド，Ｌ−アルギニンアミド

ホルミル化物
Ｎ−ホルミルーＬ−メチオニン

ヒドロキシル化物
４−ヒドロキシルーＬ−プロリン

メチル化物
Ｎ−メチルーＬ−アラニン，Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルーＬ−アラニン，オメガーＮ，オメガーＮ−ジメチルーＬ−アルギニン，Ｌ−ベーターメチルチオアスパラギン酸，Ｎ５−メチルーＬ−グルタミン，Ｌ−グルタミン酸５−メチルエステル，３‘−メチルーＬ−ヒスチジン，Ｎ６−メチルーＬ−リシン，Ｎ６−Ｎ６−ジメチルーＬ−リシン，Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルーＬ−リシン，Ｎ−メチルーＬ−メチオニン、Ｎ−メチルーＬ−フェニルアラニン

リン酸化物
オメガーＮ−リン酸―Ｌ−アルギニン，Ｌ−アスパラギン４−無水リン酸，Ｓ−リン酸―Ｌ−システイン
１‘リン酸―Ｌ−ヒスチジン，３’−リン酸―Ｌ−ヒスチジン，Ｏ−リン酸ーＬ−セリン，Ｏ−リン酸―Ｌ−トレオニン
Ｏ４‘−リン酸―Ｌ−チロシン

その他
２‘−［３−カルボキシアミドー３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］−Ｌ−ヒスチジン（ジフテリアアミド）
Ｎ６−ビオチニルーＬ−リシン
Ｎ６−（４−アミノー２−ヒドロキシブチル）−Ｌ−リシン（ヒプシン）

したがって、例えば「Ａ」は、自然に起こるＡｌａを示すが、上表で例示したようにアミド化したＡｌａも含むことがわかる。以下のアミノ酸も同様であることがわかっており、したがって、例示した化合物の活性誘導体を製造するのに有用である。「活性」であるために、誘導体は、少なくとも５０００００、好ましくは少なくとも１００００００のＫｉ（ａｐｐ）を有するべきである。以下の置換基は、D. Bordo and P. Argos, "Suggestions for 'Safe' Residue Substitutions in Site-Directed Mutagens is," J. MoI. Biol., 1991 , 217, 721-729に基づく。
Ａ−Ｓ，Ｋ，Ｐ，Ｅ
Ｄ−Ｎ，Ｅ
Ｅ−Ｄ，Ｑ，Ａ
Ｆ―Ｙ
Ｉ−Ｖ，Ｌ
Ｌ−Ｉ，Ｖ
Ｐ−Ａ
Ｔ−Ｓ，Ｋ
Ｖ−Ｉ，Ｌ

結論
上述の詳細な説明は、本発明を例示および図示し、本発明の範囲を限定することはなく、添付の請求項によってのみ定義する。本明細書において述べた特許文献および出版物は、この特許に関連し本発明の詳細を伝えたい当業者のレベルで示し、当業者によって理解されるように例示的ではない。このような特許文献および出版物は、厳密に個々に参照することにより組み込まれているかのように同程度参照することにより組み込まれているが、参照する方法または材料を説明し可能にする目的があるからである。

Claims (26)

1. 以下の化学式で表わされる選択的システインプロテアーゼ阻害剤で、
   式中のＰ４―ＮおよびＰ２−Ｎの直線は、Ｐ４またはＰ２が以下に示すようなプロリンであるときのみ存在する結合を示し、
   Ｒ１およびＲ２は、それぞれＨ，ＮＨ_２基，アミノカルボニル基、アリール基、置換アリール基（２−ニトロ，３−ヒドロキシベンジル基を含む）、アミノ基、アミノカルボニル基、低級アルキル基、シクロアルキル基、および標識用のキレート基からなる群から選択され、
   Ｐ２，Ｐ３およびＰ４の各々は、以下に示すような各カスパーゼ内に可能なＰ２，Ｐ３およびＰ４基からそれぞれ選択した基であり、
   （ａ）主なターゲットがカスパーゼ３，７，８および９の場合、Ｐ４が６またはＤ；Ｐ３がＥ；およびＰ２が８またはＰであり
   （ｂ）主なターゲットがカスパーゼ３および７の場合、Ｐ４がＤ；Ｐ３がＥ，３４または２９；およびＰ２がＶであり
   （ｃ）主なターゲットがカスパーゼ８の場合、Ｐ４が２９または３１；Ｐ３がＥ；およびＰ２がＴまたは２３であり
   （ｄ）主なターゲットがカスパーゼ９の場合、Ｐ４がＬ，ＩまたはＰ；Ｐ３がＥ，ＬまたはＦ；およびＰ２がＨ，Ａ，Ｐまたは３８であり、
   さらに角括弧内のＰ４が選択的カスパーゼ阻害剤において以下の状況によって除かれている場合
   （ｅ）主なターゲットがカスパーゼ３の場合、Ｐ３がＥまたは１６；およびＰ２が８またはＰであり
   また、さらに、Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｐ，ＴおよびＶが、標準的なアミノコード文字におけるアミノ酸側鎖であり、アセチル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化またはオキシル化された側鎖を含み、以下の置換基が作られる：Ａには−Ｓ，Ｋ，ＰまたはＥ；Ｄには−ＮまたはＥ；Ｅには−Ｄ，ＱまたはＡ；Ｉには−ＶまたはＬ；Ｐには−Ａ；Ｔには−ＳまたはＫ；１６にはー１７，２６、Ｙ，ＷまたはＦとすることを特徴とする選択的システインプロテアーゼ阻害剤。
2. 下表の基（ａ）〜（ｏ）から選択した式を有する請求項１に記載の選択的システインプロテアーゼ阻害剤。
   
3. （ａ）カスパーゼ３，（ｂ）カスパーゼ７および（ｃ）カスパーゼ３および７のうち一つに対し選択的である請求項１または２に記載の選択的カスパーゼ阻害剤。
4. カスパーゼ８に対して選択的である請求項１または２に記載の選択的カスパーゼ阻害剤。
5. カスパーゼ９に対して選択的である請求項１または２に記載の選択的カスパーゼ阻害剤。
6. 第１のカスパーゼに対し６０００００より大きいＫｉ（ａｐｐ）［Ｍ^−１ｓ^−１］を有し、第２のカスパーゼに対し１５００００より小さいＫｉ（ａｐｐ）［Ｍ^−１ｓ^−１］を有し、前記第１および第２カスパーゼが、カスパーゼ３，７，８および９から成る群の異なるメンバーである請求項１〜５のいずれか一項に記載の選択的カスパーゼ阻害剤。
7. 請求項６の式を有し、Ｐ４，Ｐ３およびＰ２がそれぞれ、なし，１６およびＰのいずれかであり、１６およびＰを請求項１に与えたように置換し得るものとする選択的カスパーゼ阻害剤。
8. 請求項６の式を有し、Ｐ４，Ｐ３およびＰ２がそれぞれ、請求項１に与えたように置換したＤ，３およびＶのいずれかであるものとする選択的カスパーゼ阻害剤。
9. 請求項６の式を有し、Ｐ４，Ｐ３およびＰ２がそれぞれ、請求項１に与えたように置換したＤ，３４，およびＶのいずれかであるものとする選択的カスパーゼ阻害剤。
10. 請求項１に記載の式を有し、Ｐ４，Ｐ３およびＰ２がそれぞれ、なし，ＥおよびＰの一つであるものとする選択的システインプロテアーゼ阻害剤。
11. Ｒ２標識を蛍光色素およびキレート化放射性核種から選択する請求項１に記載の選択的システインプロテアーゼ阻害剤。
12. カスパーゼを請求項１〜１１のいずれか一項に記載の阻害剤化合物と接触させるステップを備えることを特徴とするカスパーゼ３，７，８および９からなる群から選択したカスパーゼの阻害方法。
13. カスパーゼがヒトカスパーゼである請求項１２に記載の方法。
14. カスパーゼが細胞内にある請求項１２に記載の方法。
15. １個以上のカスパーゼ阻害剤を加えるステップを備える請求項１２に記載の方法。
16. カスパーゼ３および７をまず阻害し、その後カスパーゼ８または９を阻害する請求項１５に記載の方法。
17. カスパーゼが動物内にある請求項１６に記載の方法。
18. 阻害剤が医薬品である請求項１６に記載の方法。
19. 阻害剤が前記カスパーゼを阻害した位置を撮像するステップをさらに備える請求項１６に記載の方法。
20. 次式の選択的蛍光発生システインプロテアーゼ基質で、
    
    Ｎ―Ｐ２およびＮ−Ｐ４の直線は、Ｐ４またはＰ２が以下に示すＰであるときのみ存在する結合を示し、
    Ｒ１は、Ｈ，ＮＨ_２基，アミノカルボニル基、アリール基、置換アリール基、アミノ基、アミノカルボニル基、低級アルキル基またはシクロアルキル基であり、
    Ｐ２，Ｐ３，およびＰ４は、下表の基（ａ）〜（ｏ）から選択した可能なＰ２，Ｐ３，およびＰ４からそれぞれ選択した基であり、
    角括弧が省略しうるＰ４を表し
    Ｚは、Ｈ，メチルトリフルオロメチル基およびメチルアセトアミド基〔−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２〕から成る群から選択することを特徴とする選択的蛍光発生システインプロテアーゼ基質。
21. Ｒ１をニトロフェノール、ビオチンーＣ_４Ｈ_８−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基およびベンジル基から成る群から選択する請求項２０に記載の基質。
22. 請求項１に記載の式を有する標識化化合物を細胞に投与するステップを備えることを特徴とする細胞内の活性システインプロテアーゼを標識化する方法。
23. 前記活性システインプロテアーゼをカスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９およびレグメインから成る群から選択する請求項２２に記載の方法。
24. 前記カスパーゼが３，７，８および９の一つで、細胞がアポトーシスである請求項２３に記載の方法。
25. 前記細胞が癌性である請求項２３に記載の方法。
26. 前記システインプロテアーゼがレグメインである請求項２２に記載の方法。