JP2009528044A - Ｔ細胞アッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、新規なＴ細胞アッセイ方法に関し、特に、制御性Ｔ細胞の除去によってテスト抗原に対するＴ細胞応答が上昇することに関する。Ｔ細胞応答の検出を最適化させるために、抗原または他のサンプルとともに培養する時間（タイミング）を変化させる新規なアッセイを開示している。本発明は、特に、医薬品、アレルゲン、刺激源または他の物質に対するヒトＴ細胞応答の測定に関して特別な用途を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、新規なＴ細胞アッセイ方法に関し、特に、テスト抗原に対するＴ細胞応答は、制御性Ｔ細胞の除去によって増大することに関する。さらに、本発明は、抗原または他のサンプルとともに培養するタイミング（時間）を、Ｔ細胞応答の検出を最適化するために変化させる。特に、本発明は、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン放出の複数の測定タイムポイントを用いて、Ｔ細胞エピトープの最適な検出がなされる。さらに、本発明は、Ｔ細胞アッセイに関し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＴ細胞、もしくはＡＰＣおよびＴ細胞の両方と抗原をともに培養するタイミングを変化させ、Ｔ細胞エピトープの検出を最適にすることができる。本発明は、特に、ＡＰＣ、Ｔ細胞、またはＡＰＣとＴ細胞の両方に直接影響を与える免疫調節性サンプルまたは毒性サンプルを有するＴ細胞アッセイに関する。本発明は、薬剤、アレルゲン、刺激源またはヒトに関わる他の物質に対するヒトＴ細胞応答の測定に関する特別な用途である。

Ｔ細胞アッセイは、特にヒトにおいて、抗原および他のサンプルに対するＴ細胞応答を測定するための有効な方法を提供する。このようなアッセイは、「エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）」アッセイとしてみなされ、ここでは、血液サンプルをドナーから採って処置して、血液細胞の初期培養をＴ細胞アッセイに直接使用する。ペプチドおよびタンパク質サンプルに関して、ｅｘ ｖｉｖｏヒトＴ細胞アッセイは、ヒトのサンプルの潜在的な免疫原性を評価することを含むいくつかの目的に関して、ヒトＴ細胞エピトープを検出するために使用されてきた（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ２０４（２００４）ｐ５６０−５７２）。これにより、タンパク質配列内のＴ細胞エピトープをワクチン内に封入し、また、タンパク質配列内のＴ細胞エピトープを免疫原性を回避するために除去した（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ２４（２００４）ｐ５６０−５７２、および、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，ｖｏｌ３（２００５）ｐ１−１０）。従来のＴ細胞アッセイ法は、Ｔ細胞応答を測定する前に、ペプチドまたはタンパク質サンプルをＡＰＣとＴ細胞の混合物と一緒に培養すること、またはＡＰＣとともにペプチドまたはタンパク質サンプルを培養し、次に、Ｔ細胞応答を測定する前にＴ細胞を加えることを含む。両方のアッセイにおいて、複数の血液サンプルは、各々のペプチドまたはタンパク質サンプルの同時試験用に、それぞれ使用され、次いで、Ｔ細胞応答を、通常、一つのタイムポイントで測定する。Ｔ細胞応答は、通常、トリチウム化されたチミジン（３ＨＴｄＲ）など放射能標識パルスを増殖性Ｔ細胞に組み込むこと（「Ｔ細胞増殖」）によるか、または、活性化Ｔ細胞からＩＬ−２などのサイトカインの放出（「サイトカイン放出」）によって測定される。

従来のＴ細胞エピトープを検出するためのＴ細胞アッセイ方法は、免疫調節性サンプルまたは毒性サンプルによる干渉の一方または双方によって制限され、前記干渉は、弱い感受性および／またはＡＰＣ、Ｔ細胞、またはＡＰＣおよびＴ細胞の両方を阻害、刺激あるいは調節する。このように、従来のＴ細胞アッセイ方法は、所定のペプチドサンプルおよびタンパク質サンプル中のＴ細胞エピトープの一部または全てを検出するわけではなく、免疫調節性サンプルまたは毒性サンプルに対するＴ細胞応答を測定するのに適してはない。この免疫調製サンプルまたは毒性サンプルは、ペプチドサンプルおよびタンパク質サンプル、有機分子を含む非タンパク質サンプル、製剤自体が免疫調節性または毒性のあるタンパク質サンプルおよび非タンパク質サンプルを含む製剤、を含む。

感受性に関し、エキソビボＴ細胞アッセイの弱感受性の主な原因は、アッセイ培養液内の細胞の種類や要素、を含むテスト抗原に対するＴ細胞応答、またはテスト抗原あるいはテストサンプルそれ自体によるＴ細胞応答、を減少させるアッセイ混合物の要素に関連する。エキソビボＴ細胞アッセイの弱感受性の更なる原因は、ペプチドサンプルまたはタンパク質サンプル内のＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答の反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に関連し、これによって、各々のＴ細胞エピトープは、様々な時間でＴ細胞応答を誘導する。一つのタイムポイントを用いるＴ細胞増殖に関して、一方では、所定のサンプルを付加したときのＴ細胞増殖は、開始時点で速く、次いで、大きな増殖反応が検出されないように放射能標識パルスが添加される時間で減少する。他方では、放射能標識パルスを添加した開始時点で、所定の他のサンプルを加えるときのＴ細胞増殖が遅いと、大きな増殖反応は、例えその後の増殖反応が大きくても、検出されない。一つのタイムポイントを用いる場合のサイトカイン放出に関して、所定のサンプルを付加する際のサイトカイン生成は、一方で、開始時点で急速であるが、これらのサイトカインは、次いで、アッセイ混合物内の細胞によって消費され、一つのアッセイタイムポイントでは多くのサイトカインが検出されない。他方、サイトカイン放出は、開始時点で遅いと、例えその後でサイトカイン放出が大きくなっても、大きな増殖反応は、一つのアッセイタイムポイントでは検出されない。Ｔ細胞増殖またはサイトカイン放出の反応速度は、以下の要素によって影響を受ける；アロタイプのばらつきなど要素の範囲、ＡＰＣによる取り込みおよび処理の効率および反応速度、ＡＰＣ内のペプチドサンプルおよびタンパク質サンプルの効率および反応速度、ペプチドサンプルまたはタンパク質サンプル内のＴ細胞ペプチドの強度および繰り返し頻度、Ｔ細胞エピトープの特定のＭＨＣクラスＩＩのアロタイプへの結合親和力、Ｔ細胞レセプタによるペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体の認識効率、同時刺激性細胞表面分子の頻度および濃度、ＣＤ８^＋Ｔ細胞または抑制性Ｔ細胞などのアッセイ混合物中の他の細胞による刺激、記憶Ｔ細胞の存在、ＡＰＣの表面に出現したＭＨＣクラスＩＩ分子に直接負荷される小さなペプチドなどのサンプルの能力。

免疫調節性サンプルまたは毒性サンプルによるＴ細胞アッセイ干渉に関して、このようなサンプルは、ＡＰＣ、Ｔ細胞、またはＡＰＣとＴ細胞の両方によって、直接結合するか、吸収される。このようなサンプルは、ＡＰＣおよび／またはＴ細胞の正常な免疫機能を下方制御または情報制御し、サンプルに対するＴ細胞エピトープまたはＴ細胞応答は検出されない。免疫調節性サンプルによるＴ細胞アッセイ干渉の他の原因は、ＡＰＣ、Ｔ細胞またはＡＰＣおよびＴ細胞の両方に対する毒性である。免疫調節性サンプルによるＴ細胞アッセイ干渉の別の原因は、ＣＤ８^＋細胞または抑制性Ｔ細胞の上方制御など、ＡＰＣやＴ細胞のサブセットを上方制御または下方制御することを含む。
Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ２４（２００４）ｐ５６０−５７２ Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，ｖｏｌ３（２００５）ｐ１−１０）

特にヒト用製剤の応用範囲において、Ｔ細胞アッセイを有効に利用するために、Ｔ細胞エピトープを最適に検出するためのより感受性の高いＴ細胞アッセイ方法が必要とされ、また、免疫調節性サンプルまたは毒性サンプルを用いることができるＴ細胞アッセイも必要とされている。

本発明は、Ｔ細胞アッセイ混合物から制御性Ｔ細胞を除去することによって、テスト抗原に対するヘルパーＴ細胞応答が実質的に増加したという発見に一部基づいている。従って、本発明は、培養液から抑制性Ｔ細胞を除去することによって、テスト抗原に対するＴ細胞応答が増加するような、Ｔ細胞エピトープの検出を最適にする新規なＴ細胞アッセイ方法を提供する。さらに、本発明は、Ｔ細胞および／またはＡＰＣを調節するタンパク質、あるいは、Ｔ細胞および／またはＡＰＣに毒性を有するタンパク質の免疫原性を最適に検出する新規なＴ細胞アッセイ方法を提供する。本発明は、さらに、非タンパク質性化合物の検出にも応用可能であり、このような非タンパク質化合物は、直接Ｔ細胞レセプタを介して、タンパク質に共有結合的に結合することによって、ＭＨＣクラスＩＩ分子が結合したペプチドに直接結合することによって、あるいは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に直接結合することによって、Ｔ細胞を刺激することができる。特に、本発明は、テスト抗原に対する応答を測定する前に、Ｔ細胞応答のエフェクタを通常下方制御する制御性Ｔ細胞を除去する方法を提供する。さらに、本発明は、抗原または他のサンプルとともに培養した後に、Ｔ細胞応答を検出するために複数のタイムポイントを最適化する、複数のタイムポイントで測定する方法を提供する。

第１の態様においては、本発明は、テスト物質に対するヘルパーＴ細胞応答を測定するための方法を提供し、当該方法は、以下のステップ：
（ａ）組織から得たサンプルから抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞を単離するステップと；
（ｂ）単離した細胞から制御性Ｔ細胞を除去するステップと；
（ｃ）テスト物質とともに（ｂ）で得られた前記ＡＰＣおよび制御性Ｔ細胞を除去した細胞を培養するステップと、
（ｄ）テスト物質に対するＴ細胞応答をアッセイするステップと、
を具える。

これらのＡＰＣやＴ細胞は、通常、血液サンプルから得られる。しかしながら、扁桃腺、バイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ Ｐａｔｃｈ）、腫瘍および細胞株などの様々なソース（取得源）からのＴ細胞および／またはＡＰＣを、本発明に使用することができる。好適な一実施例において、本発明の方法は、ヒト末梢血液単核球細胞（ＰＢＭＣ）を用いて実施することができる。

本明細書において用語「除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」は、いくつかの制御性Ｔ細胞を除去することを意味する。これは、物理的に細胞を除去することによって、または、Ｔ細胞応答を阻害または調節することによってなされる。従って、標的のＴ細胞の活性は低減される。好ましくは、除去プロセスによって、標的のＴ細胞活性は、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％低減する。

当業者であれば、本発明の一部として、制御性Ｔ細胞を除去する方法または制御性Ｔ細胞をターゲティングする方法は、ＣＤ２５^ｈｉによって制御性Ｔ細胞を除去することに代替して用いられることが理解されるであろう。本発明は、Ｔ細胞アッセイにおいて制御性Ｔ細胞の効果を調節する方法を含む。除去またはターゲティングに関して、制御性Ｔ細胞の表面に提示された分子は、これらの細胞を除去するためのＣＤ２５と関連して、またはその代替として使用可能である。このような分子は、限定する趣旨ではないが、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１０３、ＣＣケモカインレセプタ４、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含み、さらに、ＩＬ−１０およびＴＧＦβなど表面結合サイトカインまたは表面形状を含む。除去は、固相の上の制御性Ｔ細胞を吸着するために、もしくは、Ｔ細胞アッセイのために他のＴ細胞から制御性Ｔ細胞を分離するために、特定の抗体に結合することを含む方法によってなされる。調節に関して、制御性Ｔ細胞によって分泌された分子は、このような分泌を阻止されるか、または、分泌後に、ブロック／阻害／破壊される。上記分子は、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＴＧＦβなどサイトカインを含み、上記分子は、例えば、抗体または可溶レセプタなどの分子に結合する有機分子または無機分子を用いてブロックされ、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの阻害性核酸、もしくは、制御性Ｔ細胞内に輸送または誘導される他の核酸によって、ブロックされる。制御性Ｔ細胞活性の調節は、さらに、抑制機能を破壊するように、制御性Ｔ細胞のレセプタまたは他の表面分子をターゲティングすることによってなされ、前記制御性Ｔ細胞は、限定する趣旨ではないが、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１０３、ＣＣケモカインレセプタ４、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。例えば、機能の阻害は、アゴニスト機能を有する特定抗原によって、または、制御性Ｔ細胞は除去されないが機能しなくなるなるようなリガンド−ターゲット相互作用をブロックする特定抗原によってなされる。

制御性Ｔ細胞活性の調節は、制御性Ｔ細胞が分泌する分子の標的レセプタの阻害によってなされるか、または、分泌された分子などを介して経路活性または下方制御のブロックによって、なされる。さらに調節に関して、制御性Ｔ細胞は、例えば、ｆｏｘｐ３などの転写因子の阻害によって、または、制御性Ｔ細胞に関連した他の機能または経路によって直接阻害される。このような阻害またはブロックは、有機分子または無機分子によってなされるか、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの阻害性核酸によってなされるか、または、制御性Ｔ細胞内に輸送または誘導される他の核酸によってなされる。有機分子、無機分子または核酸分子は、制御性Ｔ細胞の作用を阻害するか、または調節するために使用され、このような分子自体がＴ細胞アッセイを阻害するような全ての場合において、上記分子は、Ｔ細胞アッセイから除去されるか、またはＴ細胞アッセイを阻害しないように調節されることが好ましい。例えば、制御性Ｔ細胞によって分泌される分子を除去するために使用される特定抗体またはタンパク質は、Ｔ細胞アッセイと干渉しない。例えば、ヒトＴ細胞アッセイに関し、ヒトの場合の抗体またはタンパク質は、抗体またはタンパク質自体に対するＴ細胞応答を避けるために使用される。

Ｔ細胞および／またはＡＰＣ（通常、タンパク質またはペプチドであるが、非タンパク質化合物も含む）を調節しないテスト抗原を有する本発明のＴ細胞アッセイにおいて、重要なステップは、以下の通りである；
（１）ＰＢＭＣを、ヒト血液サンプルから単離し、
（２）選択的にＣＤ８^＋Ｔ細胞を取り除き、
（３）ＣＤ２５^ｈｉ＋Ｔ細胞を除去し、
（４）培養液を１又はそれ以上の濃度でテスト抗原とともに培養し、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン放出に関して１又はそれ以上のタイムポイントで試験した。

テスト抗原がＴ細胞および／またはＡＰＣを調節するような本発明のＴ細胞アッセイにおける重要なステップは、以下の通りである；
（１）ＰＢＭＣは、ヒト血液サンプルから単離され、
（２）ＡＰＣは、通常、プラスチックに付着し、ＡＰＣはサイトカインを用いて分化され、テスト抗原をＡＰＣに添加し、
（３）ＣＤ２５^ｈｉ＋Ｔ細胞および選択的にＣＤ８^＋Ｔ細胞が先に除去された自家ＰＢＭＣを、ＡＰＣと混合し、
（４）培養液を、１又はそれ以上の濃度のテスト抗原で培養し、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン放出に関する１又はそれ以上のタイムポイントで試験した。

テスト物質がペプチド、タンパク質サンプル、あるいは、ＡＰＣまたはＴ細胞に対して免疫調節性あるいは毒性のある非タンパク質サンプルであるとき、血液は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＡＰＣのソースとして（モノサイトおよび樹状細胞の形態で）使用される。通常、ドナー集団（ｃｏｈｏｒｔ）は、世界人口または研究対象において示されるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数および頻度を最もよく示すように選択される。この集団で示されるアロタイプは、通常、人口に示されるアロタイプの８０％以上であり、主なＨＬＡ−ＤＲアリールの全てがよく示されている。代替としては、集団に示されるアロタイプを、過剰提示（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）するように、または、研究中の特定の疾患に関連すると考えられるＨＬＡアロタイプを含むように選択する。本発明の好適な実施例において、ＰＭＢＣは、密度勾配における分画によって血液サンプルから調製され、次いで、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ２５^ｈｉＴ細胞を除去し、残ったＰＢＭＣは、主にＣＤ４^＋Ｔ細胞（〜７０％）およびＡＰＣ（モノサイト１０〜２０％および樹状細胞１〜３％）を具える。このようなＣＤ８^＋ＣＤ２５^ｈｉを除去したＰＢＭＣを細胞培養液中に作成し、１又はそれ以上のペプチドサンプル、タンパク質サンプルまたは非タンパク質サンプルを添加し、この培養液を培養した。

次いで、Ｔ細胞応答の測定を固定した１つのタイムポイントまたは複数のタイムポイントで行った。これらのタイムポイントは、類似のサンプルまたは最適化サンプルに対するＴ細胞応答の反応速度を測定することで予め決定することができる。

アッセイ用の最適条件は、最適化物質を用いて決定できる。本明細書において用いられる「最適化物質」は、個々の免疫調節性ペプチド／毒性ペプチド／総タンパク質などのＴ細胞応答を誘導することで周知な化合物であり、これらは、試験されるサンプルと同様の寸法および構造を有するか、またはテスト物質に対して同様の特性を有する。ペプチドサンプル、タンパク質サンプルまたは非タンパク質サンプルに関して、試験されるサンプルと同様の寸法および構造の１又はそれ以上のペプチド（通常では、長さが９〜４０アミノ酸）、総タンパク質または非タンパク質化合物を、最適化物質として使用することができる。この最適化物質をアッセイし、その結果を、典型的なＴ細胞応答の反応速度を決定するために使用する。例えば、Ｔ細胞応答を、１又はそれ以上の様々な代替のアッセイを用いて、サンプル添加後、通常、４〜９日の間で、様々なタイムポイントで測定する。最適化物質に対するＴ細胞応答の反応速度が一度決定されると、サンプルを連続的に試験するためにアッセイタイムポイントのセットを決定することができる。このように、テストサンプルに対するＴ細胞応答は、１又はそれ以上の適宜なタイムポイントでアッセイすることができる。代替もしくは追加として、２またはそれ以上の濃度を最適化物質に対するＴ細胞応答の反応速度を決定するために使用でき、次いで、サンプルを上記濃度で試験できる。

Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞増殖など、数多くある各種アッセイを用いて測定可能であり、このようなアッセイは、３ＨＴｄＲ（またはＴ細胞が増殖することによって吸収される他の放射活性、蛍光、化学蛍光化合物）のパルスを組み込むこと、ＩＬ−２またはＩＦＮγなどのサイトカインの放出、活性化マーカーｍＲＮＡの転写を増加させるｍＲＮＡの転写の変化、Ｃａ^２＋流入、および、表現型のマーカー、特に活性化Ｔ細胞に対するマーカーの変化を利用することによって行われる。通常、ペプチドまたはタンパク質サンプルに関して、Ｔ細胞応答は、サンプル添加後５、６、７および８日で３ＨＴｄＲのパルスを組み込むことによって測定されるか、サンプル添加後８日でサイトカイン（特にＩＬ−２）の放出を測定することによって（もしくは、３ＨＴｄＲの組み込みおよびサイトカイン放出測定の両方によって）行われる。代替としては、たくさん重なっている配列を有するペプチド（例えば、タンパク質配列中の１５マーが１２アミノ酸と重なっている場合）に関して、３ＨＴｄＲのパルス組み込みおよび／または１つのタイムポイント（通常、テストペプチド添加後７日目）でのサイトカイン放出測定を使用することができる。隣接して重なっているペプチドは、Ｔ細胞エピトープ検出に関する感受性をともに促進するＴ細胞エピトープを含む可能性がある。

ペプチドサンプルまたはタンパク質サンプルが、ＡＰＣまたはＴ細胞に対して免疫調節性または毒性があるとき、組織から得られたサンプルを処理して、ＡＰＣを他の細胞から分離させる。これは、通常、プラスチックに付着させることによって行われ、次いで、ペプチドまたはタンパク質サンプルをＡＰＣとともに培養する。ＡＰＣを、インターロイキン４、顆粒球−マクロファージコロニー刺激性因子、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン１αなどのサイトカインとともに培養して、成熟ＡＰＣ表現型を誘導することができる。予め分画したＡＰＣを有する標準Ｔ細胞アッセイにおけるサンプルは、通常、最大４８時間のＡＰＣ培養時間を必要とする。好ましくは、半成熟ＡＰＣを、最大４日間インターロイキン４および顆粒球−マクロファージコロニー刺激性因子を含む増殖培地で培養することで得た。次いで、免疫調節性または毒性サンプルを含むサンプルを、半成熟ＡＰＣに添加して短時間培養した。サンプルの毒性または免疫調節性機能に応じて、半成熟ＡＰＣを有する培養時間は、３〜１０時間の範囲とすることができる。サンプルのＡＰＣを培養した後、半成熟ＡＰＣを繰り返し洗浄することによって外来性サンプルを除去した。次いで、成熟サンプルを適用（パルス）したＡＰＣを、腫瘍壊死因子、インターロイキン１、ＣＤ４０リガンドまたはリポポリサッカライドなど炎症促進性因子とともに培養して得る。自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）Ｔ細胞であって通常、ＰＢＭＣから調節されたＣＤ４^＋ＣＤ８⁻ＣＤ２５^ｈｉを除去したＴ細胞を、成熟サンプルを適用したＡＰＣに加える。ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻ＣＤ２５^ｈｉを除去したＴ細胞を、成熟サンプルを適用したＡＰＣとともにさらなる培養タイムポイントの範囲で培養した。上述した最適化物質を、様々なＡＰＣ培養タイムポイントおよび／または様々なＴ細胞培養タイムポイントとともに応答の反応速度を決定するために使用することができる。最適化物質を用いたこれらの結果を、サンプルを連続的に試験するために、ＡＰＣ培養および／またはＴ細胞タイムポイントのセットを決定するために使用することができる。このように、テストサンプルに対するＴ細胞応答を１又はそれ以上のアッセイタイムポイントで検出する。代替として、２またはそれ以上の濃度を、最適化物質に対するＴ細胞応答の反応速度を確定するために使用し、次いで、サンプルをこれらの濃度で試験することができる。

試験するサンプルが非タンパク質のとき、上記の方法のいずれか（すなわち、免疫調節性または毒性特性を有する、もしくは有しないペプチドサンプルまたはタンパク質サンプルに対する方法）は、非タンパク質サンプルがＡＰＣまたはＴ細胞、もしくはその両方に対して、免疫調節性があるか、または、毒性があるかに応じて使用することができる。

ＡＰＣまたはＴ細胞、もしくはその両方に対して免疫調節性があるタンパク質または非タンパク質サンプルに関して、選択的な付加ステップは、例えば、Ｔ細胞活性またはＡＰＣ分化など、表現型マーカーを上方制御または下方制御するために直接試験することである。典型的なＴ細胞活性化マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲおよび細胞間Ｃａ^２＋流入（ｆｌｕｘ）の発現の変化を含む。ＡＰＣの分化を評価するために使用される一般的な表現型マーカーは、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６を含み、これら全ては成熟ＡＰＣで高頻度で発現する。これらの付加的ステップは、テストサンプルに対するＴ細胞応答の反応速度の情報を提供することができ、これによって、テストサンプルに対するＴ細胞応答を最適に試験するためのアッセイタイムポイントを決定するのが支援される。

本発明の新規なエキゾビボＴ細胞アッセイ方法は、特にヒト用の薬剤に関する用途範囲を有する。薬剤として前向きに使用されるタンパク質に関して、本発明のＴ細胞アッセイは、タンパク質配列と重なっているペプチドを試験することによって、タンパク質配列内のＴ細胞エピトープを同定するために使用される。このようなＴ細胞エピトープの位置および強度は、次いで、ヒトにおいて、タンパク質の潜在的免疫原性を評価するために使用することができる。あるいは、ヒトに使用する前に、タンパク質内のＴ細胞エピトープをタンパク質配列の変異によって除去することができる。さらに、所定のタンパク質内のＴ細胞エピトープを本発明の方法によって同定することができ、次いで、タンパク質ワクチン内のＴ細胞エピトープ配列（またはその変異体）を含むこと、もしくは、ワクチンの一部として他の成分に付加されることによって、ワクチン内に組み込まれる。

本発明の新規なＴ細胞アッセイは、ペプチド、タンパク質および非タンパク質（有機分子、脂質、炭化水素、もしくは、複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）および製剤を含む２又はそれ以上の様々な部分からなる分子、を含む分子タイプの潜在的免疫原性を評価するために使用できる。本発明のＴ細胞アッセイは、医薬品の調査（ｒｅｓｅａｒｃｈ）、開発、製造および臨床試験において広く応用できる。調査において、例えば、活性化分子の様々な類似体に対するＴ細胞応答は、ヒトにおける類似体の潜在的な免疫原性を評価するために使用できる。このようなＴ細胞応答は、次いで、さらなる開発のために、前駆的な（リード）医薬品の選別に関する基準として使用することができる。開発において、例えば、同一分子の様々な製剤に対するＴ細胞応答は、ヒトにおける製剤の潜在的な免疫原性を評価するために決定することができる。このようなＴ細胞応答は、従って、臨床試験用の最適な製剤を選別するための基準として使用することができる。製造において、例えば、同一分子のバッチの製造に対応するＴ細胞応答は、バッチの潜在的免疫原性を評価し、さらに、バッチ間の分子におけるあらゆる変化を評価するために決定することができる。このようなＴ細胞応答は、製造用品質試験に使用することができる。臨床試験において、例えば、Ｔ細胞応答は臨床試験中の医薬品に対する免疫原性を評価するために、患者の血液を使用して決定することができる。さらに、本発明のＴ細胞アッセイは、医薬品に対するＴ細胞応答のあらゆるＭＨＣ制御を決定することができる。本発明の細胞アッセイは、製剤に対するＴ細胞応答のあらゆるＭＨＣ制御を決定するために使用することもできる。

Ｔ細胞エピトープを検出する際に使用することの代替例として、本発明のＴ細胞アッセイは、好ましくはヒト用に、医薬品に対する潜在的有害反応を評価するために使用することができる。これらの有害反応は、過敏症、アレルギ、刺激性、免疫抑制、過免疫刺激および注射部位反応を含む。本発明のＴ細胞アッセイ方法は、移植などの非医薬品治療、花粉アレルゲンなどの環境因子、食料品、化粧品、ならびに、界面活性剤や酵素などの工業的に製造された試薬などに対する潜在的有害反応を評価するために使用することができる。

なお、当業者であれば、本発明のＴ細胞アッセイ方法の変形を使用することができるが、例えば、Ｔ細胞応答の分析に複数のアッセイタイムポイントを使用することなど、これらの変形は、本発明の範囲内に入ることを理解されたい。例えば、本発明の範囲内には、Ｔ細胞応答に対する各々のステップを決定するＭＨＣ−ペプチド結合などの方法を含む、Ｔ細胞応答の分析として当分野で周知な様々な方法がある。上述したようなＴ細胞およびＡＰＣの分画の代替として、他の細胞を、本発明のＴ細胞アッセイを使用して分画してもよい。Ｔ細胞アッセイは、ランゲルハンス細胞、様々なマクロファージサブセットあるいは様々なＡＰＣサブセットが豊富なＡＰＣを用いて実行可能であり、および／または、様々なＴ細胞サブセットを用いるか、または豊富にすることによって実行可能である。なお、サイトカインは、例えば、感受性を改良するために、あるいは、特定のＡＰＣまたはＴ細胞を下方制御または上方制御するために、本発明のＴ細胞アッセイのアッセイ混合物に付加すること（またはアッセイ混合物から除去すること）ができる。Ｔ細胞がタンパク質またはペプチドのＡＰＣ提示によってプライム化され、次いで、同一のまたは関連するタンパク質あるいはペプチドによって再チャレンジされる、例えばリコールアッセイフォーマットなど本発明において、Ｔ細胞アッセイの様々なフォーマットを使用することができる。

以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：Ｔ細胞応答のＣＤ２５^＋細胞除去の効果
末梢血液単核球細胞を、国立血液輸血サービス（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ ｈｏｓｐｉｔａｌ、ケンブリッジ、英国）から得られ、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｌｏｃａｌ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって許可された（２４時間内に採血した血液から）健康なコミュニティドナーの軟膜から単離される。ＰＭＢＣをＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ，ＵＫ）密度遠心分離によって軟膜から単離し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＣＤ８^＋ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐ^ＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて除去した。ドナーを、Ａｌｌｓｅｔ^ＴＭ ＳＳＰ−ＰＣＲに基づいた組織型キット（Ｄｙｎａｌ，Ｗｉｒｒａｌ，ＵＫ）を用いてＨＬＡ−ＤＲはプロタイプを同定することによって特徴付け、ならびに、コントロール抗原であるＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｍ（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）、Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｏｉｄ（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびインフルエンザＨＡ（Ｃ３２、ａａ３０７〜３１９）に対するＴ細胞応答を決定することによって特徴付けた。

ＣＤ２５^ｈｉＴ細胞の除去は、供給者（サプライヤ）の標準プロトコルおよびマグネットを用いてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）製の抗ＣＤ２５マイクロビーズを用いて実施された。各ドナーの１０バイアルを解凍し、細胞を３０ｍｌの２％不活性化ヒト血清／ＰＢＳ（Ａｕｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｃｌｅａｒ，Ｃａｌｎｅ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に再懸濁した。５×１０^７細胞を３×１５ｍｌチューブに移し、残りの細胞を総ＰＢＭＣとして保持した。抗ＣＤ２５マイクロビーズの希釈混合液を、３００μｌのビーズと４２００μｌの分離バッファ（０．５％ヒト血清／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）で作成される。この１５ｍｌのチューブを遠心分離し、５００μｌのマイクロビーズ希釈混合液に再懸濁した。次いで、チューブをコラムで分離する前に５、１０または２０分間４℃で保持した。スタンド上に支持されたマグネットにコラムを配置することによってコラムをセットアップし、２ｍｌの分離バッファをコラムに加え、ドリップした。ビーズとともに培養した後、１０ｍｌの分離バッファを加え、チューブを１５００ｒｐｍで７分間遠心分離した。次いで、細胞を５００μｌの分離バッファに再懸濁し、カラムに加え、続いて、２×１ｍｌの分離バッファで洗浄した。カラムを通る流れを１５ｍｌのチューブに回収し、これにはＣＤ２５^ｈｉＴ細胞を除去したフラクションが含まれていた。これらの細胞を１５００ｒｐｍで７分間スピンダウンし、カウントする前に３ｍｌのＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ）に再懸濁した。

細胞のＣＤ４およびＣＤ２５を染色し、細胞数をＦＡＣＳで検出した。各細胞集団の５〜１０×１０^５細胞を９６ウェルのＵ字底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１ウェルに入れた。このプレートを１２００ｒｐｍで４分間スピンダウンした。上澄みを排除し、細胞を５０μｌの抗体希釈液で再懸濁した。抗体希釈液は、ＦＡＣＳバッファ（１％ヒト血清／０．０１％アジ化ナトリウム／ＰＢＳ）中のＦＩＴＣラベルされた抗ＣＤ４抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）の１／５０希釈液、および、ＰＥラベルされた抗ＣＤ２５抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）の１／２５希釈液からなる。コントロール用ウェルは、未染色のまま、アイソタイプコントロールで染色、または、ラベル化された抗体で単一染色する。

プレートを暗闇で３０分間氷上で培養した。次いで、プレートを１２００ｒｐｍで４分間スピンダウンした。上澄みを排除し、細胞を２００μｌＦＡＣＳバッファに再懸濁した。これを２回繰り返し、次いで、細胞をＦＡＣＳチューブに移す。細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）にかけ、データを集め、寸法、粒度および蛍光タグに基づいて分析した。

増殖アッセイを、以下のように行った。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を除去したＰＢＭＣおよびＣＤ８^＋ＣＤ２５^ｈｉを除去したＰＢＭＣの全てを、１００μｌのＡＩＭＶ中に１ウェルあたり２×１０^５加えた。平底の９６ウェルプレートを用いて、各試験条件に対して３回培養（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行った。各ペプチド１００μｌを、細胞培養液に加え、終濃度を５μＭとした。各ウェルに１ｍＣｉ／ｍｌの３ＨＴｄＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ ＳｔＧｉｌｅｓ，ＵＫ）を１８時間かけて適用する前に、細胞をペプチドとタンパク質抗原とともに７日間培養した。

増殖アッセイに関し、２に等しいまたはそれ以上（ＳＩが２以上）の刺激指標（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）の閾値を用い、それにより、この閾値より大きい増殖応答を含むペプチドを、陽性とみなした（点線）。全てのデータを分析し、１つの方法であるＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのＴ検定を用いて、分散係数（ＣＶ）、標準偏差（ＳＤ）および有意差（ｐ＜０．０５）を決定した。２以上のＳＩを示した反応の全ては、未処置の培地コントロールに対して有意差（ｐ＜０．０５）があった。

これらの結果は、図１に示されており、これは、一連のボーダーラインまたは弱いＴ細胞エピトープに対する（ペプチド１（ＰＧＱＴＡＴＩＴＣＳＧＨＡＬＧ）、２（ＧＤＫＦＶＳＷＹＱＱＧＳＧＱＳ）、６（ＩＫＰＥＡＰＧＣＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ）、９（ＱＳＩＳＮＷＬＮＷＹＱＱＫＰＧ）、１３（ＫＧＬＥＷＬＶＶＩＷＳＤＧＳＳ）、１７（ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳＷＶ）、２０（ＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱ−ＧＴＱＶ）、２４（ＨＱＳＬＶＩＫＬＭＰＮＩＴＬＬ）、および、一対の強いＴ細胞エピトープに対する（ペプチド２５（ＰＫＹＲＮＭＱＰＬＮＳＬＫＩＡＴ）、２６（ＴＶＦＹＮＩＰＰＭＰＬ）およびＫＬＨ抗原に対して、３人のヒトドナー（４７５、４４０および４６２）からのＰＢＭＣ中のＴ細胞増殖反応を示している。これらの結果は、ＣＤ２５^ｈｉＴ細胞を除去した後、全てのペプチドに関してＴ細胞応答が上昇したことを示す。これらの結果は、ペプチド１および２などの例示的なペプチドにおいて、ＣＤ２５^ｈｉＴ細胞を除去した後のＴ細胞応答における強力な上昇を示しており、Ｔ細胞応答に関してボーダーラインまたは陰性とされたペプチドにおけるＴ細胞エピトープの検出を可能とする。

実施例２
ワイルドタイプ（ＷＴ）、および、ヒトｓＴＮＦＲ１配列由来のＴ細胞エピトープを除去したペプチド（それぞれがＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭおよびＨＡＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＣＲＫＥＭ）を合成し（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｅｙｓｔａｄ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）実施例１の方法を用いて試験し、この方法において、ＣＤ８⁺ＣＤ２５^ｈｉＴ細胞除去ＰＢＭＣを用いて２０人の健康なドナーからのＴ細胞応答を刺激する能力に対してｓＴＮＦＲ−１由来のペプチドを比較した。バルク培養液は、２４ウェルプレートの各ウェルに対してＡＩＭＶ培地中の２〜４×１０^６／ｍｌのＣＤ８^＋ＣＤ２５^ｈｉＴ細胞を除去したＰＢＭＣ１ｍｌを加えることによって作成した（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。各ドナーに対して、１０μＭのペプチド１ｍｌを各バルク培養液（バルク培養液あたり２ｍｌに関して終濃度は５μＭ）に加えることによって各ペプチドを別々に試験した。比較のために、さらなるバルク培養液を未処理のポジティブ（ＫＨＬ）コントロール用に作成した。（Ｔブラストの）複製サンプルを６〜９日でバルク培養液から除去し、増殖を９６丸底プレートで評価した。これらのデータを刺激後６、７、８および９日で、各ペプチドに対するＴ細胞応答の大きさおよび反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を評価するために使用した。さらに、時間経過的増殖アッセイに用いた２０人の健康なドナーの同一サンプルを、ＴＮＦＲ１ペプチドとともに８日間培養した後、ＩＬ−２エリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイを用いて、ＩＬ−２生成物を試験した。エリスポットプレートを、７０％エタノールで予め湿らせ、次いで、４℃で一晩、ＩＬ−２捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）でコーティングした。これらのプレートを、２回ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で洗浄し、次いで、室温で２時間、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。ＣＤ８^＋ＣＤ２５^ｈｉＴ細胞を除去したＰＢＭＣ（４×１０^５細胞／ウェル）を加える前に、これらのプレートをＰＢＳで洗浄した。３７℃／５％ＣＯ_２で７日経過後、プレートをディベロップした。まず水で洗浄した後、次に、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中のＩＬ−２検出用抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を、３７℃で２時間加えた。ＰＢＳでさらに洗浄した後、ストレプトアビジン−ＡＰ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を１．５時間加え、プレートを再度洗浄し、次いで、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ色素体（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を３０分間加えた。これらのプレートを水で洗浄し、乾燥させ、次いで、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ エリスポット分析器、ソフトウェアバージョン３（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を用いてスポット数（カウント）を分析した。

Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２エリスポットアッセイの両方に関して、ＳＩ閾値の２（点線）を超え、バックグラウンド（^＊）より有意差（ｐ＜０．０５）のある反応を、陽性とみなした。図２に示されるこれらの結果は、ＷＴペプチドは、３人の同一ヒトドナー（３、８および１１）において、増殖アッセイと、ＩＬ−２エリスポットアッセイと、の双方で応答を生じさせたことを示しており、これは、このペプチドがＴ細胞エピトープを含むことを示唆する。この時間経過的増殖が示すことは、これらの３人のドナーに関し、ペプチドを加えてから７日後にピーク増殖応答を検出し、各々の場合において、ＷＴ（ワイルドタイプ）ＴＮＦＲ１ペプチドは、増殖応答をペプチド添加後８日または９日で測定した場合、Ｔ細胞エピトープとして陰性を記録した。これらの結果は、さらに、増殖によって測定されるＴ細胞応答とＩＬ−２エリスポットとの間の強い相関関係を示す。

実施例３−時間経過による総タンパク質Ｔ細胞アッセイ
ＷＯ２００４／１１３３８７において、エピトープを除去したタンパク質が変異Ｉ１０Ｑ、Ｔ２０Ｒ、Ｈ２３Ｐ、Ｌ５６Ａ、Ｌ１０８Ｔ、Ｌ１１０ＨおよびＬ１４９Ｄを有することともに記載されるように、ワイルドタイプ（ＷＴ）および変異Ｔ細胞エピトープを除去したヒトｓＴＮＦＲ１タンパク質を、ヒトＦｃ融合タンパク質として調整した。１ｍｌのｓＴＮＦＲ１タンパク質を終濃度１０μｇ／ｍｌに加えることを除いて、実施例２と同様に増殖およびＩＬ−２エリスポットアッセイを実施した。図３に示されるこれらのデータは、増殖アッセイに関して、有意差のあるＴ細胞応答を、ＷＴに関してドナー１３および１７に関して検出したが、Ｔ細胞エピトープ除去タンパク質に関しては検出しなかったことを示唆している。ピーク応答を８日および９日で観察し、ドナー１３あるいは１７のどちらにも６日での有意差のある応答は示されなかった。ＩＬ−２エリスポットアッセイに関し、ドナー１３および１７の双方は、ＷＴに対するＴ細胞応答に関して陽性であるが、変異体エピトープ除去タンパク質に対しては陽性ではなかった。さらに、ドナー４は、このアッセイにおいてＷＴタンパク質に対して有意差のある応答を示した。実施例２にみられるように、さらに、これらの結果は、この場合の総タンパク質に対してＴ細胞応答を検出する時間経過的アッセイの有用性を示した。実施例２にみられるように、これらの結果は、増殖によって測定されたＴ細胞応答とＩＬ−２エリスポットとの間の良い相関関係を示す。

実施例４−時間経過による免疫調節性タンパク質Ｔ細胞アッセイ
この実施例は、ＨＬＡ−Ｇ（Ｍｉｔｓｄｏｅｒｆｆｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ １５９：１５５−６４）およびＢ７−１Ｈ（Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２００４ １５５：１７２−８２）などの樹状細胞の阻害分子を上方制御することで周知の免疫調節性タンパク質、ヒトインターフェロンβに対するＴ細胞応答を測定するために使用される。ＩＦＮβの配列中に生じるリニア型Ｔ細胞エピトープがインビトロでＴ細胞を刺激するかどうか試験するために、樹状細胞由来のモノサイト内に抗原を添加するための改良方法が開発され、この方法において、樹状細胞（ＤＣ）およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方におけるＩＦＮβの生物学的効果は最小化された。

組織培養プラスチック（＞９０％ＣＤ１４^＋）に付着することでＰＢＭＣからモノサイトを単離し、１ウェルあたり１×１０^６（２４ウェル）のおおよその密度で５％の熱不活化ヒトＡＢ血清（Ａｕｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｃｌｅａｒ，Ｃａｌｎｅ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）（増殖培地）を伴うＡＩＭ Ｖ培地中の２４ウェルプレートで培養した。モノサイトをヒトＩＬ−４含有増殖培地（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）およびＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）中で３日間培養した。３日目で、４４μｇ／ｍｌのベータフェロン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、３％熱不活性化ヒトＡＢ血清および２５ｍＭ（終濃度）のＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）を加えた０．５ｍｌのテストバッファに、添加した。５０μｇ／ｍｌＫＬＨを含むコントロールウェルまたは抗原を含まないコントロールウェル（未処置細胞）を、３％熱不活性化ヒトＡＢ血清（標準バッファ）を加えた１ｍｌのＰＢＳと０．０１％のＴｗｅｅｎ２０中で培養した。樹状細胞（ＤＣ）を抗原と６時間培養し、その後、ＤＣを６回洗浄し外来性ＩＦＮβを取り除いた。次いで、細胞をＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む増殖培地に一晩再懸濁した。

４日目、自己のＣＤ８^＋ＣＤ２５^ｈｉ除去ＣＤ４^＋細胞を、ＰＢＭＣ（Ｄｙｎａｌ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋陰性単離キット、Ｗｉｒｒａｌ、ＵＫ）からネガティブセレクションによって単離し、次いで、増殖プレートおよびエリスポットプレートの双方に１×１０^５／ウェルでＤＣに加えた。（実施例２のように）ディベロップする前にエリスポットプレートを６日間培養し、増殖を３ＨＴｄＲ（１μＣｉ／ウェルで６時間適用（パルス））を組み込むことによって測定する前に増殖プレートを６日間培養した。

実施例２と同様に、増殖およびエリスポットアッセイに関しては、刺激指数が２以上の実験上の閾値を選択し、この場合、前記閾値より上の応答を陽性とみなした。さらに、応答が未処理のコントロール（^＊）から有意差（ｐ＜０．０５）があるかどうか統計分析を行った。アッセイ間のばらつきの度合を決定するためにさらなる分析は、分散係数（ＣＶ）を含んだ。

図４に示されるようにこれらの結果は、増殖アッセイに対する２９ドナー中の４ドナーと、ＩＬ−２エリスポットアッセイに対する２９ドナー中の同一の４ドナーとで有意差があったことを示す。このデータは、Ｔ細胞応答は、免疫原性タンパク質でも再現性を示すことを示唆している。

実施例５−時間経過による低分子Ｔ細胞アッセイ
カルバマゼピン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＵＫ）およびＮ−アセチルイミノスチルベン（カルバマゼピンの類似体、Ｙｉｎｇら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００６；１１８：２２３−２４１にしたがって合成）を、健康なドナーの一団におけるＴ細胞応答を刺激する能力と比較した。両方の化合物を、実施例２の方法に従って、各ドナーに対する個別のバルク培養液において２５μｇ／ｍｌで試験した。すなわち、バルク培養液を、２４ウェルプレートの各ウェルで２〜４×１０６ＣＤ８^＋ＣＤ２５^ｈｉＴ細胞除去ＰＢＭＣを用いて作成した。（Ｔブラストの）複製サンプルを、５〜８日でバルク培養液から除去し、９６ウェルプレートで増殖を評価した。これらのデータを、各化合物に対するＴ細胞応答の大きさおよび反応速度を評価するために用いた。

実施例２に関して、陽性反応の閾値として２以上のＳＩを用い、データをさらに分析し、パラメータ性および非パラメータ性統計分析を用いて、分散係数（ＣＶ）、標準偏差（ＳＤ）および有意差（ｐ＜０．０５）を決定した。Ｔ細胞応答が統計的有意差（ｐ＜０．０５）で、ＳＩが２以上の場合にのみ、化合物を免疫原性があるとみなした。

これらの結果は、時間経過によるＴ細胞アッセイ方法を用いてある濃度範囲で試験した場合、カルバマゼピン代謝物、Ｎアセチルイミノスチルベンは、カルバマゼピン（患者のアレルギ反応を遅らせる潜在的誘導因子として周知である）よりも刺激されたドナーは少なかったことを示した。単一のタイムポイントを用いて、多数のＴ細胞応答におけるＴ細胞アッセイは、検出されない。実際、カルバマゼピンに対するＴ細胞応答の大半は、５日目に誘導され、６日および７日に一回だけさらなる応答が検出される。６、７または８日で単一タイムポイントＴ細胞アッセイを用いて、Ｎアセチルおよびカルバマゼピンに対してＴ細胞応答を評価することは、これらの２つの化合物間の免疫原性のレベルを区別しなかった。

図１は、各ペプチドに対するドナーのＴ細胞増殖応答を示す。 図２は、３人の同一ヒトドナー（３、８および１１）において、増殖アッセイおよびＩＬ−２エリスポットアッセイの双方でＷＴペプチドが応答を生じさせたことを示す。 図３は、増殖アッセイに関して、ＷＴに関してドナー１３および１７に関して有意差のあるＴ細胞応答を検出したが、Ｔ細胞エピトープ除去タンパク質に関してＴ細胞応答は検出しなかったことを示す。 図４は、増殖アッセイに対する２９ドナー中の４ドナーと、ＩＬ−２エリスポットアッセイに対する２９ドナー中の同一の４ドナーと、で有意差があったことを示す。 図５−１は、健康なドナーのＴ細胞応答を刺激する能力に対してカルバマゼピンとＮ−アセチルイミノスチルベンとを比較した結果を示す。 図５−２は、健康なドナーのＴ細胞応答を刺激する能力に対してカルバマゼピンとＮ−アセチルイミノスチルベンとを比較した結果を示す。 図５−３は、健康なドナーのＴ細胞応答を刺激する能力に対してカルバマゼピンとＮ−アセチルイミノスチルベンとを比較した結果を示す。

Claims (30)

1. テスト物質に対するヘルパーＴ細胞応答を測定する方法であって、
   （ａ）組織から得たサンプルから抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞を単離するステップと、
   （ｂ）これらの単離した細胞から制御性Ｔ細胞を除去するステップと、
   （ｃ）前記ＡＰＣおよびステップ（ｂ）で得られた制御性Ｔ細胞を除去した細胞をテスト物質とともに培養するステップと、
   （ｄ）前記テスト物質に対するＴ細胞応答をアッセイするステップと、
   を具えることを特徴とする方法。
2. （ａｉ）他の細胞から抗原提示細胞（ＡＰＣ）を分離するステップをさらに具え、ステップ（ｃ）は、制御性Ｔ細胞を除去した細胞を加える前に、分離したＡＰＣと前記テスト物質を培養することを具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ＡＰＣをテスト物質を付加する前にサイトカインで処理することを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. ＡＰＣおよびＴ細胞が、末梢血液単核球細胞（ＰＢＭＣ）由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＡＰＣおよびＴ細胞がヒト由来であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５ｈｉ^＋Ｔ細胞を除去することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を除去することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記Ｔ細胞応答が、１又はそれ以上のＴ細胞増殖、サイトカイン放出、Ｔ細胞転写変化、および／またはＴ細胞活性に関連する他のマーカーを測定することによってアッセイすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. Ｔ細胞応答が、トリチウム化チミジンの取り込みによって測定されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. サイトカイン放出が、ＩＬ−２および／またはＩＦＮγによって測定されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
11. 培養中にＴ細胞応答を１又はそれ以上のタイムポイントでアッセイすることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ＡＰＣを前記Ｔ細胞を除去した細胞を加える前に、ある時間長以上でテスト物質を培養することを特徴とする請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記テスト物質をある濃度以上でアッセイすることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 最適化物質をアッセイして、テスト物質アッセイとしての最適時間および／または濃度を決定することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記テスト物質はタンパク質であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記テスト物質はペプチドであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記テスト物質は非タンパク質であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記テスト物質が、有機分子、脂質、炭化水素、あるいは、複合体、混合物および製剤を含む２又はそれ以上の部分からなる分子であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 前記テスト物質は、Ｔ細胞および／またはＡＰＣに対する免疫調節性または毒性があることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
20. 世界人口または研究対象において８０％以上のＨＬＡアロタイプを発現するドナーのＰＢＭＣを使用することを特徴とする請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
21. 研究中の病気と関連した特定のＨＬＡアロタイプを発現させるためにドナーのＰＢＭＣを使用することを特徴とする請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
22. タンパク質配列と重なったペプチドを試験し、前記タンパク質配列中のＴ細胞エピトープを同定することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
23. 各々の一連の分子を相対的免疫原性を評価するために試験することを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
24. さらなる開発のためにリード医薬品を選択する基準として相対的Ｔ細胞応答を使用することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. テスト物質を潜在的免疫原性を評価するために分析することを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
26. テスト物質の様々な製剤を分析して、相対的免疫原性を評価することを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
27. テスト物質の様々な製造バッチを分析して、潜在的免疫原性を評価することを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
28. Ｔ細胞源として患者の血液を用いてテスト物質を分析して、前記テスト物質の免疫原性を評価することを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
29. タンパク質配列におけるＴ細胞エピトープを同定することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法の使用。
30. テスト物質の免疫原性を評価することを特徴とする請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法の使用。

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