JP2010107363A - Method and reagent kit for measuring troponin i - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体試料中のトロポニンＩの測定方法、並びに該方法に用いることができる試薬キットに関するものである。 The present invention relates to a method for measuring troponin I in a biological sample, and a reagent kit that can be used in the method.
心筋梗塞などの心筋疾患を診断するために、心筋細胞に含まれる筋肉タンパク質であるトロポニンを生体試料中で検出することが行われている。
トロポニンは、心筋疾患により引き起こされる心筋細胞の破壊により、心筋細胞から放出され、血液中に放出される。トロポニンは、血液中で、トロポニンＩ、トロポニンＣ及びトロポニンＴの3つのサブユニットが単独、又は2つ若しくは3つの異なるサブユニットからなる複合体を形成して存在する。つまり、トロポニンＩは、トロポニンＣ及び／又はトロポニンＴと複合体を形成し得る。
これらの中でも、トロポニンＩは、正常なヒトの血液中にはほとんど存在せず、心筋疾患に罹患したヒトの血液中に特異的に存在するので、トロポニンＩを検出することにより、早期に心筋疾患を検出することができる。
In order to diagnose myocardial diseases such as myocardial infarction, troponin, which is a muscle protein contained in cardiomyocytes, is detected in a biological sample.
Troponin is released from cardiomyocytes and released into the blood by destruction of cardiomyocytes caused by myocardial disease. Troponin is present in blood in the form of a complex consisting of three subunits of troponin I, troponin C and troponin T alone or of two or three different subunits. That is, troponin I can form a complex with troponin C and / or troponin T.
Among these, troponin I is hardly present in normal human blood and is specifically present in the blood of human suffering from myocardial disease. Therefore, by detecting troponin I, early myocardial disease is detected. Can be detected.
トロポニンＩを検出する方法として、トロポニンＩを認識する抗体を用いるイムノアッセイ法が知られている。 As a method for detecting troponin I, an immunoassay method using an antibody that recognizes troponin I is known.
例えば、特表平９−５０３０５０号(特許文献1)は、血液中のトロポニンＩを測定するために、トロポニンＩに特異的な抗体と、トロポニンＣとを用いるサンドイッチイムノアッセイを用いることを提案している。 For example, Japanese Patent Publication No. 9-503050 (Patent Document 1) proposes to use a sandwich immunoassay using an antibody specific for troponin I and troponin C in order to measure troponin I in blood. Yes.
また、特表平１１−５０５６０５号(特許文献2)は、トロポニンの遊離のサブユニット及び／又はこれらのサブユニットの少なくとも2種からなる複合体を認識する抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイにより、血液中のトロポニンを測定する方法を開示している。
本発明は、トロポニンＩを認識する特定の抗体を用いて、生体試料中のトロポニンＩを検出する際に、より高感度にトロポニンＩを検出できるサンドイッチイムノアッセイによる方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a sandwich immunoassay method that can detect troponin I with higher sensitivity when detecting troponin I in a biological sample using a specific antibody that recognizes troponin I.
本発明者らは、トロポニンＣの存在下で、生体試料中のトロポニンＩを検出するサンドイッチイムノアッセイにおいて、所定のトロポニンＩ認識抗体を用いることにより、トロポニンＩの検出感度が向上することを見出して、本発明を完成した。 The present inventors have found that the detection sensitivity of troponin I is improved by using a predetermined troponin I-recognizing antibody in a sandwich immunoassay for detecting troponin I in a biological sample in the presence of troponin C. The present invention has been completed.
よって、本発明は、生体試料に由来するトロポニンＩを、トロポニンＣの存在下で、該トロポニンＩの41〜49番目のアミノ酸配列をエピトープとして認識し且つ標識物質で標識された第1抗体と接触させて、前記トロポニンＩと、前記トロポニンＣと、前記第1抗体との複合体を形成させ、前記複合体を形成した第1抗体の標識物質を測定することを含む、トロポニンＩを測定する方法を提供する。 Therefore, the present invention contacts troponin I derived from a biological sample with a first antibody that recognizes the 41st to 49th amino acid sequence of troponin I as an epitope and is labeled with a labeling substance in the presence of troponin C. A method of measuring troponin I, comprising forming a complex of the troponin I, the troponin C and the first antibody, and measuring a labeling substance of the first antibody which has formed the complex. I will provide a.
また、本発明は、トロポニンＣと上記の第1抗体とを含むトロポニンＩの測定用試薬キットも提供する。 The present invention also provides a reagent kit for measuring troponin I comprising troponin C and the first antibody.
本発明の方法、及び試薬キットを用いることにより、生体試料中のトロポニンＩを高感度にかつ短時間で測定することができる。 By using the method and reagent kit of the present invention, troponin I in a biological sample can be measured with high sensitivity and in a short time.
本発明の方法における生体試料は、ヒト対象から採取された心臓型トロポニンＩを含む可能性がある試料である。生体試料は、全血、血清、血漿を含む血液試料などを含む。生体試料が採取される対象は、通常、心筋梗塞、心不全などの心筋疾患を有することが疑われる患者であるが、このような患者以外の対象であってもよい。 The biological sample in the method of the present invention is a sample that may contain cardiac troponin I collected from a human subject. The biological sample includes a blood sample including whole blood, serum, and plasma. The subject from which the biological sample is collected is usually a patient suspected of having a myocardial disease such as myocardial infarction or heart failure, but may be a subject other than such a patient.
上記のトロポニンＩは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有することが知られている。このアミノ酸配列は、National Center for Biotechnology Information (NCBI)によるEntrezデータベースからP19429のアクセッション番号により入手される配列から、第1番目のメチオニンを除いた配列である。 The above troponin I is known to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. This amino acid sequence is a sequence obtained by removing the first methionine from the sequence obtained by the accession number P19429 from the Entrez database by the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
本発明において用いられるトロポニンＣは、哺乳動物に由来するものであれば特に制限されない。例えば、骨格筋型トロポニンＣや心臓型トロポニンＣが挙げられ、特に心臓型トロポニンＣが好ましい。上記の哺乳動物は、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サル、ウシ、ブタなどが挙げられ、より好ましくはヒトである。トロポニンＣは、配列番号２に示すアミノ酸配列（上記のEntrezデータベースからTPHUCCのアクセッション番号により入手される配列）を有するものが好ましい。トロポニンＣは、哺乳動物の心筋細胞から精製したもの、遺伝子工学的手法により得られた組換えトロポニンＣ、又は化学的に合成された合成トロポニンＣであり得る。また、トロポニンＣは、市販で入手可能なものを用いることもできる。 Troponin C used in the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a mammal. Examples include skeletal muscle troponin C and heart troponin C, with heart troponin C being particularly preferred. Examples of the mammal include humans, rabbits, rats, mice, dogs, monkeys, cows, pigs, and the like, more preferably humans. Troponin C preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (sequence obtained from the above-mentioned Entrez database by the accession number of TPHUCC). Troponin C can be purified from mammalian cardiomyocytes, recombinant troponin C obtained by genetic engineering techniques, or chemically synthesized synthetic troponin C. Moreover, what can be obtained commercially can also be used for troponin C.
本発明の方法においては、トロポニンＣの存在下で、上記の生体試料に由来するトロポニンＩを、第1抗体と接触させて、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体を形成させる。
本明細書において、「生体試料に由来するトロポニンＩ」とは、生体試料中に存在しているトロポニンＩ、及び生体試料から単離されたトロポニンＩの両方を意味する。また、トロポニンＩには、遊離型のトロポニンＩ、トロポニンＣ及び／又はトロポニンＴと複合体を形成したトロポニンＩが含まれる。
In the method of the present invention, troponin I derived from the above biological sample is contacted with the first antibody in the presence of troponin C to form a complex of troponin I, troponin C, and the first antibody. Let
In the present specification, “troponin I derived from a biological sample” means both troponin I present in the biological sample and troponin I isolated from the biological sample. The troponin I includes troponin I complexed with free troponin I, troponin C and / or troponin T.
本明細書において、「トロポニンＣの存在下」とは、反応系に添加されたトロポニンＣが、生体試料に由来するトロポニンＩと結合しているか、又は反応系に添加されたトロポニンＣが遊離の状態であることを意味する。好ましくは、トロポニンＣが、トロポニンＩと結合している。生体試料中には、生体試料に由来する遊離のトロポニンＣが存在し得るが、本明細書で用いる場合、「トロポニンＣ」とは、生体試料中に元来存在し得るトロポニンＣ以外の、反応系の外部から添加するトロポニンＣを意図する。 In this specification, “in the presence of troponin C” means that troponin C added to the reaction system is bound to troponin I derived from a biological sample or troponin C added to the reaction system is free. It means a state. Preferably, troponin C is bound to troponin I. In the biological sample, free troponin C derived from the biological sample may be present. As used herein, “troponin C” means a reaction other than troponin C that may originally exist in the biological sample. Contemplates troponin C added from outside the system.
本明細書において、「トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体」とは、トロポニンＩ、トロポニンＣ及び第1抗体を少なくとも含む複合体であり、その他の成分、例えば、トロポニンＴ、並びに下記の第2抗体及び固相がさらに結合していてもよい。 In the present specification, the “complex of troponin I, troponin C and the first antibody” is a complex including at least troponin I, troponin C and the first antibody, and other components such as troponin T In addition, the following second antibody and solid phase may be further bound.
上記の複合体の形成は、生体試料に由来するトロポニンＩ、第1抗体及びトロポニンＣを同時に接触させるか、又は該トロポニンＩ及びトロポニンＣを接触させた後に、第1抗体を接触させることにより行うのが好ましい。このような順序で各成分を接触させることにより、生体試料に含まれ得る遊離のトロポニンＩと、混合されたトロポニンＣとがＩ／Ｃ複合体を形成し、該Ｉ／Ｃ複合体のトロポニンＩ部分に第1抗体が結合して、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成される。 The formation of the complex is carried out by contacting troponin I, the first antibody and troponin C derived from a biological sample at the same time, or contacting the first antibody after contacting troponin I and troponin C. Is preferred. By contacting each component in this order, free troponin I that can be contained in the biological sample and mixed troponin C form an I / C complex, and troponin I of the I / C complex is formed. The first antibody binds to the portion to form a complex of troponin I, troponin C, and the first antibody.
本発明において用いられる第1抗体は、配列番号１で表されるトロポニンＩの41〜49番目のアミノ酸配列をエピトープとして認識し且つ標識物質で標識されている。第1抗体は、上記のエピトープを認識するものであれば、抗体フラグメント（Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab'フラグメント、sFvフラグメントなど）であってもよい。
上記のエピトープを認識する抗体は、市販で入手可能であり、Hytest社からの１９Ｃ７抗体が好ましい。
The first antibody used in the present invention recognizes the 41st to 49th amino acid sequence of troponin I represented by SEQ ID NO: 1 as an epitope and is labeled with a labeling substance. The first antibody may be an antibody fragment (Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, Fab ′ fragment, sFv fragment, etc.) as long as it recognizes the above epitope.
Antibodies that recognize the above epitopes are commercially available and the 19C7 antibody from Hytest is preferred.
標識物質は、通常のイムノアッセイにおいて用い得る標識物質であれば特に限定されない。例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素、不溶性粒状物質などが挙げられる。
酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。
蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。
放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。
The labeling substance is not particularly limited as long as it can be used in a normal immunoassay. For example, an enzyme, a fluorescent substance, a radioisotope, an insoluble granular substance, etc. are mentioned.
Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, tyrosinase, and acid phosphatase.
Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC), green fluorescent protein (GFP), and luciferin.
Examples of the radioisotope include 125 I, 14 C, and 32 P.
上記の標識可能な物質で抗体を標識する方法は、当該技術において公知である。 Methods for labeling antibodies with the aforementioned labelable substances are known in the art.
本発明の方法において、トロポニンＣは、生体試料中に含まれると考えられる遊離のトロポニンＩに対して、１〜１０倍(モル)量で存在させることが好ましく、より好ましくは、２〜５倍(モル)量で存在させる。
第1抗体は、抗体の種類にもよるが、生体試料中に含まれると考えられる遊離のトロポニンＩに対して、過剰量で用いることが好ましい。より好ましくは、該トロポニンＩに対して、２〜１０倍(モル)量程度で用いることができる。
上記の「生体試料中に含まれると考えられる遊離のトロポニンＩ」は、心筋疾患を発症していると考えられるヒトに由来する生体試料に含まれ得るトロポニンＩの量であればよく、通常、0.01〜200 ng/ml程度であることが知られている。
In the method of the present invention, troponin C is preferably present in an amount of 1 to 10 times (mole), more preferably 2 to 5 times that of free troponin I which is considered to be contained in the biological sample. Present in (molar) amounts.
The first antibody is preferably used in an excess amount relative to free troponin I which is considered to be contained in the biological sample, although it depends on the type of antibody. More preferably, the troponin I can be used in an amount of about 2 to 10 times (mole).
The above-mentioned “free troponin I considered to be contained in a biological sample” may be an amount of troponin I that can be contained in a biological sample derived from a human that is thought to develop myocardial disease. It is known to be about 0.01 to 200 ng / ml.
次いで、上記のトロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体を形成した第1抗体の標識物質を測定する。
このために、上記の複合体を形成した第1抗体を、複合体を形成していない第1抗体から分離する方法は、当業者に公知である。好ましくは、固相と、第1抗体が認識するエピトープとは異なるトロポニンＩのエピトープを認識し且つ該固相に結合可能にされた第2抗体とを用いることにより、上記の複合体を分離する。例えば、固相が磁性粒子の場合、トロポニンIと、トロポニンＣと、第1抗体と、第２抗体と、磁性粒子との複合体を形成させる。そして、この複合体を磁石により集積した状態で、洗浄する。また、例えば、固相がマイクロタイタープレートの場合、マイクロタイタープレート上に第２抗体を介して、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体を結合させる。そして、この複合体が結合したマイクロタイタープレートを洗浄する。これらの操作により、固相に結合していない、複合体を形成していない第１抗体から、複合体を形成した第1抗体を分離することができる。これにより、複合体を形成していない第１抗体の標識物質による影響を抑え、複合体を形成した第1抗体の標識物質を正確に測定することができる。
Next, the labeling substance of the first antibody that forms a complex of the above troponin I, troponin C, and the first antibody is measured.
For this purpose, a method for separating the first antibody that has formed the complex from the first antibody that has not formed the complex is known to those skilled in the art. Preferably, the complex is separated by using a solid phase and a second antibody that recognizes an epitope of troponin I different from the epitope recognized by the first antibody and is capable of binding to the solid phase. . For example, when the solid phase is a magnetic particle, a complex of troponin I, troponin C, the first antibody, the second antibody, and the magnetic particle is formed. And it wash | cleans in the state which accumulated this composite_body | complex with the magnet. For example, when the solid phase is a microtiter plate, a complex of troponin I, troponin C, and the first antibody is bound to the microtiter plate via the second antibody. Then, the microtiter plate to which the complex is bound is washed. By these operations, the first antibody that has formed a complex can be separated from the first antibody that has not bound to the solid phase and has not formed a complex. Thereby, the influence of the labeling substance of the first antibody not forming the complex can be suppressed, and the labeling substance of the first antibody forming the complex can be accurately measured.
上記の固相は、当該技術において通常用いられるものを用いることができる。固相の材料としては、例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーンなどのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；赤血球；シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。
また、固相の形状としては、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、粒子、ナノ粒子などが挙げられる。粒子としては、磁性粒子、ポリスチレンラテックスのような疎水性粒子、粒子表面にアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有する共重合ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。
As the solid phase, those commonly used in the art can be used. Examples of the solid phase material include latex, rubber, polyethylene, polypropylene, polystyrene, styrene-butadiene copolymer, polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, polyacrylamide, polymethacrylate, styrene-methacrylate copolymer, and polyglycidyl methacrylate. , Polymer materials such as acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer, polyvinylidene difluoride (PVDF), silicone; agarose; gelatin; erythrocytes; inorganic materials such as silica gel, glass, inert alumina, and magnetic materials . You may combine these 1 type, or 2 or more types.
Examples of the shape of the solid phase include a microtiter plate, a test tube, beads, particles, and nanoparticles. Examples of the particles include magnetic particles, hydrophobic particles such as polystyrene latex, copolymer latex particles having hydrophilic groups such as amino groups and carboxyl groups on the particle surface, erythrocytes, and gelatin particles.
より好ましくは、固相は、磁性粒子である。
磁性粒子は、磁性を有する材料を基材として含む粒子である。このような磁性粒子は当該技術において公知であり、基材として例えばＦｅ2Ｏ3及び／又はＦｅ3Ｏ4、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。磁性粒子の表面へのタンパク質などの結合を目的として、基材の表面をポリマーなどで被覆したものなどがより好ましい。
More preferably, the solid phase is a magnetic particle.
The magnetic particles are particles containing a magnetic material as a base material. Such magnetic particles are known in the art, and those using, for example, Fe 2 O 3 and / or Fe 3 O 4 , cobalt, nickel, ferrite, magnetite or the like as a substrate are known. For the purpose of binding proteins or the like to the surface of the magnetic particles, a substrate whose surface is coated with a polymer or the like is more preferable.
上記の第2抗体は、第1抗体が認識するエピトープとは異なるトロポニンＩのエピトープを認識する。すなわち、第2抗体が認識するトロポニンＩのエピトープは、配列番号１の41〜49番目のアミノ酸配列以外のエピトープである。
第1抗体が認識するエピトープとは異なるトロポニンＩのエピトープは、従来公知である。第2抗体は、好ましくは、配列番号１の15〜25番目、16〜20番目、18〜28番目、23〜29番目、25〜40番目、26〜35番目、31〜34番目、56〜61番目、83〜93番目、85〜92番目、87〜91番目、88〜94番目、117〜126番目、122〜139番目、130〜145番目、143〜152番目、148〜158番目、169〜178番目、186〜192番目、又は190〜196番目のアミノ酸配列をエピトープとして認識する。
The second antibody recognizes an epitope of troponin I that is different from the epitope recognized by the first antibody. That is, the troponin I epitope recognized by the second antibody is an epitope other than the 41st to 49th amino acid sequences of SEQ ID NO: 1.
An epitope of troponin I different from the epitope recognized by the first antibody is conventionally known. The second antibody is preferably the 15-25th, 16-20th, 18-28th, 23-29th, 25-40th, 26-35th, 31-34th, 56-61 of SEQ ID NO: 1. , 83-93, 85-92, 87-91, 88-94, 117-126, 122-139, 130-145, 143-152, 148-158, 169-178 The amino acid sequence of the 1st, 186-192, or 190-196th is recognized as an epitope.
上記の第2抗体も、第1抗体と同様に、上記のエピトープを認識するものであれば、抗体フラグメントであってもよい。
また、第2抗体も市販で入手可能な抗体を用いることができる。例えば、Hytest社から市販されている、23C6抗体、10B11抗体、M18抗体、4C2抗体、3C7抗体、228抗体、414抗体、560抗体、16A12抗体、8E10抗体、16A11抗体、84抗体、415抗体、M46抗体、581抗体、441抗体、625抗体、458抗体、596抗体、267抗体、C5抗体及びMF4抗体などが挙げられる。
Similarly to the first antibody, the second antibody may be an antibody fragment as long as it recognizes the epitope.
As the second antibody, a commercially available antibody can be used. For example, commercially available from Hytest, 23C6 antibody, 10B11 antibody, M18 antibody, 4C2 antibody, 3C7 antibody, 228 antibody, 414 antibody, 560 antibody, 16A12 antibody, 8E10 antibody, 16A11 antibody, 84 antibody, 415 antibody, M46 Examples thereof include antibody, 581 antibody, 441 antibody, 625 antibody, 458 antibody, 596 antibody, 267 antibody, C5 antibody and MF4 antibody.
本発明の第1抗体及び第2抗体は、市販で入手可能な抗体を用いることができるが、従来公知の方法に従って作製することもできる。具体的には、これらの抗体は、それ自体公知の方法を用いて作製したハイブリドーマから得ることができる。すなわち、所望により適切なアジュバントと混合したトロポニンＩで適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）を免疫する。そして、該動物の脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球などの抗体産生細胞を、適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）由来の骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを得ることができる。通常、抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、同種の動物に由来する。
細胞融合は、例えば適切な培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールなどの存在下で融合させるＰＥＧ法などにより行うことができる。細胞融合後、ＨＡＴ培地などの選択培地でハイブリドーマを選択し、ハイブリドーマのトロポニンＩを認識する抗体を産生する能力について、常法（例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ））に従ってスクリーニングを行う。次いで、適切な抗体を産生するハイブリドーマを常法（例えば限界希釈法）に従ってクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
得られたモノクローナル抗体がトロポニンＩのどのエピトープを認識するかは、常法（エピトープマッピング）により行うことができる。
As the first antibody and the second antibody of the present invention, commercially available antibodies can be used, but they can also be prepared according to conventionally known methods. Specifically, these antibodies can be obtained from hybridomas prepared using a method known per se. That is, an appropriate mammal (eg, mouse, rat, etc.) is immunized with troponin I mixed with an appropriate adjuvant as desired. A hybridoma can be obtained by fusing antibody-producing cells such as spleen cells, lymph node cells, and B lymphocytes of the animal with myeloma cells derived from an appropriate mammal (eg, mouse, rat, etc.). . Usually, antibody-producing cells and myeloma cells are derived from the same animal species.
Cell fusion can be performed by, for example, the PEG method in which antibody-producing cells and myeloma cells are fused in the presence of polyethylene glycol or the like in an appropriate medium. After cell fusion, a hybridoma is selected in a selective medium such as HAT medium, and screening is performed according to a conventional method (for example, enzyme immunoassay (EIA)) for the ability of the hybridoma to produce an antibody that recognizes troponin I. Subsequently, a hybridoma producing an appropriate antibody is cloned according to a conventional method (for example, limiting dilution method), and a hybridoma producing a monoclonal antibody is selected.
Which epitope of troponin I is recognized by the obtained monoclonal antibody can be performed by an ordinary method (epitope mapping).
上記の第2抗体は、上記の固相に結合可能である。第2抗体を固相に結合可能にする様式としては、当該技術において公知の様式を用いることができる。好ましくは、第2抗体に固相結合部位を結合させ、固相に該固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化し、該固相結合部位と結合物質との結合により、第2抗体が固相に結合可能となる。 The second antibody can bind to the solid phase. As a mode for allowing the second antibody to bind to the solid phase, a mode known in the art can be used. Preferably, a solid phase binding site is bound to the second antibody, a binding substance capable of binding to the solid phase binding site is immobilized on the solid phase, and the second antibody is bound by binding between the solid phase binding site and the binding substance. It becomes possible to bind to the solid phase.
上記の固相結合部位と結合物質は、本発明の方法の反応条件下で特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせは、例えばビオチンとアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。
ハプテンと抗ハプテン抗体としては、例えば、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体が挙げられる。好ましくは、ビオチンとアビジン類との組み合わせである。より好ましくは、固相結合部位がビオチンを含み、結合物質がアビジン類である。固相結合部位と結合物質との組み合わせの各々の物質は、どちらを第2抗体又は固相に結合させてもよく、特に限定されない。なお、本明細書において「アビジン類」は、アビジン及びストレプトアビジンを含むことを意味する。
The solid-phase binding site and the binding substance are not particularly limited as long as they are a combination of substances that can specifically bind under the reaction conditions of the method of the present invention. Examples of these combinations include biotin and avidin, hapten and anti-hapten antibody, nickel and histidine tag, glutathione and glutathione-S-transferase, and the like.
Examples of the hapten and anti-hapten antibody include DNP and anti-DNP antibody. Preferably, it is a combination of biotin and avidins. More preferably, the solid phase binding site contains biotin and the binding substance is avidin. Each substance of the combination of the solid phase binding site and the binding substance may be bound to the second antibody or the solid phase, and is not particularly limited. In the present specification, “avidins” means including avidin and streptavidin.
固相結合部位を第2抗体に結合させる方法は、当該技術において公知である。例えば、固相結合部位がビオチンを含む場合、例えば、抗体中のアミノ基やチオール基などと反応性を有する基を介してビオチンを抗体に結合させることができる。アミノ基と反応性を有する基としてはNHS基が挙げられ、チオール基と反応性を有する基としてはマレイミド基などが挙げられる。 Methods for binding a solid phase binding site to a second antibody are known in the art. For example, when the solid-phase binding site contains biotin, for example, biotin can be bound to the antibody via a group reactive with an amino group or thiol group in the antibody. Examples of the group reactive with an amino group include an NHS group, and examples of the group reactive with a thiol group include a maleimide group.
上記の結合物質を固相に固定化する方法は、当該技術において公知である。該固定化は、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。
結合物質がアビジン類である場合、例えば、物理的吸着によりアビジンを固相に直接固定化することができる。また、アビジン類と結合可能な物質、例えばビオチンが結合した固相にアビジン類を結合させる方法により、アビジン類を固相に固定化することができる。また、特開2006−226689号公報に記載の方法により、アビジン類を固相に固定化することも可能である。
また、アビジン類を結合させた固相は、例えばＪＳＲ株式会社やダイナルバイオテック社などから購入することもできる。
Methods for immobilizing the above binding substance on a solid phase are known in the art. The immobilization can be performed by, for example, a physical adsorption method, a covalent bond method, an ionic bond method, or a combination thereof.
When the binding substance is avidin, for example, avidin can be directly immobilized on the solid phase by physical adsorption. Alternatively, the avidin can be immobilized on the solid phase by a method of binding the avidin to a solid phase to which avidin can be bound, for example, biotin. Avidins can also be immobilized on a solid phase by the method described in JP-A-2006-226689.
Further, the solid phase to which avidins are bound can be purchased from, for example, JSR Corporation or Dynal Biotech.
上記の第2抗体を、トロポニンＩ、トロポニンＣ及び第1抗体と接触させる順序としては、特に限定されない。すなわち、第2抗体は、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成される前、又は形成された後にトロポニンＩと接触し得る。 The order in which the second antibody is contacted with troponin I, troponin C and the first antibody is not particularly limited. That is, the second antibody can contact troponin I before or after the complex of troponin I, troponin C, and the first antibody is formed.
すなわち、本発明の方法における好ましい反応順序は、次のものを含む。
（１）まず、トロポニンＩを含む生体試料と、トロポニンＣと、第2抗体とを接触させる。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分後に、固相を加える。インキュベーション後に固相を洗浄して、固相に結合していない成分を除去する。次いで、第1抗体を加える。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分の間に、固相表面に結合した第2抗体に結合したＩ／Ｃ複合体に第1抗体が結合し、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成される。そして、再度固相を洗浄して、固相に結合していない第1抗体を除去する。次に、該第1抗体の標識物質を測定する。
That is, the preferred reaction sequence in the method of the present invention includes the following.
(1) First, a biological sample containing troponin I is brought into contact with troponin C and a second antibody. After a suitable incubation time, eg 1-5 minutes, the solid phase is added. After incubation, the solid phase is washed to remove components not bound to the solid phase. The first antibody is then added. The first antibody binds to the I / C complex bound to the second antibody bound to the solid surface during an appropriate incubation time, for example 1 to 5 minutes, and troponin I, troponin C, and the first antibody And a complex is formed. Then, the solid phase is washed again to remove the first antibody not bound to the solid phase. Next, the labeling substance of the first antibody is measured.
（２）まず、トロポニンＩを含む生体試料と、第2抗体とを接触させる。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分後に、固相を加える。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分後に固相を洗浄して、固相に結合していない成分を除去する。洗浄後、トロポニンＣ及び第1抗体を加える。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分の間に、固相表面に結合した第2抗体に結合したトロポニンＩに、トロポニンＣ及び第1抗体が結合し、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成される。そして、再度固相を洗浄して、固相に結合していない第1抗体及びトロポニンＣを除去する。次いで、該第1抗体の標識物質を測定する。 (2) First, a biological sample containing troponin I is brought into contact with the second antibody. After a suitable incubation time, eg 1-5 minutes, the solid phase is added. After a suitable incubation time, eg 1-5 minutes, the solid phase is washed to remove components not bound to the solid phase. After washing, troponin C and the first antibody are added. During an appropriate incubation time, for example 1 to 5 minutes, troponin C and the first antibody bind to troponin I bound to the second antibody bound to the solid surface, and troponin I, troponin C, and first A complex with the antibody is formed. Then, the solid phase is washed again to remove the first antibody and troponin C that are not bound to the solid phase. Next, the labeling substance of the first antibody is measured.
（３）まず、トロポニンＩを含む生体試料と、トロポニンＣと、第1抗体とを接触させて、適切な時間、例えば１〜５分間インキュベーションする。この間に、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成される。次いで、固相及び第2抗体を混合する。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分の間に、固相と、第2抗体と、上記の複合体とが結合する。次いで、固相を洗浄して固相に結合していない成分を除去し、該第1抗体の標識物質を測定する。 (3) First, a biological sample containing troponin I, troponin C, and the first antibody are brought into contact with each other and incubated for an appropriate time, for example, 1 to 5 minutes. During this time, a complex of troponin I, troponin C, and the first antibody is formed. Next, the solid phase and the second antibody are mixed. The solid phase, the second antibody, and the complex are bound within a suitable incubation time, for example 1-5 minutes. Next, the solid phase is washed to remove components not bound to the solid phase, and the labeling substance of the first antibody is measured.
なお、固相及び第2抗体は、固相と第2抗体との複合体の状態で、上述の反応に用いることもできる。すなわち、
（４）まず、トロポニンＩを含む生体試料と、トロポニンＣと、固相と第2抗体との複合体とを接触させる。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分後に固相を洗浄して、固相に結合していない成分を除去する。次いで、第1抗体を加える。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分の間に、固相表面に結合した第2抗体に結合したＩ／Ｃ複合体に第1抗体が結合し、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成される。そして、再度固相を洗浄して、固相に結合していない第1抗体を除去する。次に、該第1抗体の標識物質を測定する。
The solid phase and the second antibody can also be used in the above-described reaction in the state of a complex of the solid phase and the second antibody. That is,
(4) First, a biological sample containing troponin I, troponin C, and a complex of a solid phase and a second antibody are brought into contact. After a suitable incubation time, eg 1-5 minutes, the solid phase is washed to remove components not bound to the solid phase. The first antibody is then added. The first antibody binds to the I / C complex bound to the second antibody bound to the solid surface during an appropriate incubation time, for example 1 to 5 minutes, and troponin I, troponin C, and the first antibody And a complex is formed. Then, the solid phase is washed again to remove the first antibody not bound to the solid phase. Next, the labeling substance of the first antibody is measured.
また、（５）まず、トロポニンＩを含む生体試料と、固相と第2抗体との複合体とを接触させる。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分後に固相を洗浄して、固相に結合していない成分を除去する。洗浄後、トロポニンＣ及び第1抗体を加える。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分の間に、固相表面に結合した第2抗体に結合したトロポニンＩに、トロポニンＣ及び第1抗体が結合し、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成される。そして、再度固相を洗浄して、固相に結合していない第1抗体及びトロポニンＣを除去する。次いで、該第1抗体の標識物質を測定する。 (5) First, a biological sample containing troponin I is brought into contact with a complex of the solid phase and the second antibody. After a suitable incubation time, eg 1-5 minutes, the solid phase is washed to remove components not bound to the solid phase. After washing, troponin C and the first antibody are added. During an appropriate incubation time, for example 1 to 5 minutes, troponin C and the first antibody bind to troponin I bound to the second antibody bound to the solid surface, and troponin I, troponin C, and first A complex with the antibody is formed. Then, the solid phase is washed again to remove the first antibody and troponin C that are not bound to the solid phase. Next, the labeling substance of the first antibody is measured.
また、（６）まず、トロポニンＩを含む生体試料と、トロポニンＣと、第1抗体とを接触させて、適切な時間、例えば１〜５分間インキュベーションする。この間に、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成される。次いで、固相と第2抗体との複合体を混合する。適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分の間に、固相と第2抗体との複合体、及びトロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体とが結合する。次いで、固相を洗浄して固相に結合していない成分を除去し、該第1抗体の標識物質を測定する。 (6) First, a biological sample containing troponin I, troponin C, and the first antibody are brought into contact with each other and incubated for an appropriate time, for example, 1 to 5 minutes. During this time, a complex of troponin I, troponin C, and the first antibody is formed. Next, the complex of the solid phase and the second antibody is mixed. During an appropriate incubation time, for example, 1 to 5 minutes, the complex of the solid phase and the second antibody, and the complex of troponin I, troponin C, and the first antibody bind. Next, the solid phase is washed to remove components not bound to the solid phase, and the labeling substance of the first antibody is measured.
さらに、上記の反応順序において、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体と、第2抗体と、固相との複合体を形成し、固相を洗浄して固相に結合していない成分を除去した後に、再度第１抗体を混合することもできる。そして、適切なインキュベーション時間、例えば１〜５分後に固相を洗浄して、固相に結合していない第１抗体を除去する。これにより、固相上に存在する可能性がある、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第２抗体と、固相との複合体に、第１抗体を結合させることが可能となる。結果として、より高感度に、生体試料に含まれるトロポニンIを測定することができる。なお、再度第１抗体を混合する際に、トロポニンＣも混合することもできる。 Furthermore, in the above reaction sequence, a component that forms a complex of troponin I, troponin C, the first antibody, the second antibody, and the solid phase and is not bound to the solid phase by washing the solid phase After removing the first antibody, the first antibody can be mixed again. Then, after a suitable incubation time, for example, 1 to 5 minutes, the solid phase is washed to remove the first antibody not bound to the solid phase. As a result, the first antibody can be bound to a complex of troponin I, troponin C, the second antibody, and the solid phase that may exist on the solid phase. As a result, troponin I contained in the biological sample can be measured with higher sensitivity. When the first antibody is mixed again, troponin C can also be mixed.
これらの反応は、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体との複合体が形成され得る条件下で行うことができる。このような条件は、好ましくは、ｐＨ６〜10、30〜45℃の温度である。 These reactions can be performed under conditions where a complex of troponin I, troponin C, and the first antibody can be formed. Such conditions are preferably pH 6 to 10 and 30 to 45 ° C.
本発明の方法において、第2抗体の量は、用いる抗体の種類や、磁性粒子の種類及び量に応じて適宜設定することができる。より具体的には、第1抗体の量：第2抗体の量（重量比）は、１：１〜１：１００であり、特に１：５〜１：２０程度が好ましい。 In the method of the present invention, the amount of the second antibody can be appropriately set according to the type of antibody used and the type and amount of magnetic particles. More specifically, the amount of first antibody: second antibody (weight ratio) is 1: 1 to 1: 100, and is preferably about 1: 5 to 1:20.
本発明の方法において、上記の標識物質を測定する方法は、当該技術において公知であり、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。
例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を用いて発色又は発光反応を行うことにより、標識物質を測定できる。例えば、酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質としては、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発色基質を用いることができる。
これらの基質による発光又は発色を、ルミノメータ又は分光光度計により測定できる。
In the method of the present invention, the method for measuring the labeling substance is known in the art, and can be appropriately selected depending on the type of the labeling substance.
For example, when the labeling substance is an enzyme, the labeling substance can be measured by performing color development or luminescence reaction using a substrate for the enzyme. For example, if the enzyme is alkaline phosphatase, the substrate may be CDP-star® (4-chloro-3- (methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2 ′-(5′-chloro) tricyclo). [3.3.1.1 3,7 ] decan} -4-yl) phenyl phosphate disodium), CSPD® (3- (4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2- Chemiluminescent substrates such as (5′-chloro) tricyclo [3.3.1.1 3,7 ] decan} -4-yl) phenyl phosphate disodium); p-nitrophenyl phosphate, 5-bromo-4- A chromogenic substrate such as chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP), 4-nitroblue tetrazolium chloride (NBT), iodonitrotetrazolium (INT) can be used.
Luminescence or color development by these substrates can be measured with a luminometer or spectrophotometer.
本発明は、さらに、上記のトロポニンＩの測定方法に用いることができる、トロポニンＣと、第1抗体とを含む、トロポニンＩの測定用試薬キットも提供する。
トロポニンＣと、第1抗体とは、同じ試薬に含まれていてもよいし、別々の試薬に含まれていてもよい。より好ましくは、トロポニンＣと第1抗体とは、同じ試薬に含まれている。
The present invention further provides a reagent kit for measuring troponin I, which includes troponin C and the first antibody, which can be used in the above-described method for measuring troponin I.
Troponin C and the first antibody may be contained in the same reagent, or may be contained in separate reagents. More preferably, troponin C and the first antibody are contained in the same reagent.
上記の試薬キットは、上記の固相と、上記の第2抗体とをさらに含むことが好ましい。固相と第2抗体とは、同じ試薬に含まれていてもよいし、別々の試薬に含まれていてもよいが、好ましくは、別々の試薬に含まれている。また、固相及び第2抗体は、それぞれ、トロポニンＣ及び第1抗体のいずれか又は両方と同じ試薬中に含まれていてもよいし、別々の試薬に含まれていてもよい。 It is preferable that the reagent kit further includes the solid phase and the second antibody. The solid phase and the second antibody may be contained in the same reagent or may be contained in separate reagents, but are preferably contained in separate reagents. Further, the solid phase and the second antibody may be contained in the same reagent as either or both of troponin C and the first antibody, or may be contained in separate reagents.
また、固相及び第2抗体は、固相と第2抗体との複合体として、試薬に含まれていてもよい。この場合も、固相と第2抗体との複合体は、トロポニンＣ及び第1抗体のいずれか又は両方と同じ試薬中に含まれていてもよいし、別々の試薬に含まれていてもよい。 The solid phase and the second antibody may be contained in the reagent as a complex of the solid phase and the second antibody. Also in this case, the complex of the solid phase and the second antibody may be contained in the same reagent as either or both of troponin C and the first antibody, or may be contained in a separate reagent. .
より具体的には、上記の（１）の反応順序における試薬キットとしては、トロポニンＣと、第2抗体とを含む第１試薬と、固相を含む第２試薬と、第１抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットが挙げられる。 More specifically, the reagent kit in the reaction sequence of (1) above includes a first reagent containing troponin C and a second antibody, a second reagent containing a solid phase, and a first reagent containing a first antibody. And a reagent kit containing three reagents.
また、上記の（２）の反応順序における試薬キットとしては、第2抗体を含む第１試薬と、固相を含む第２試薬と、トロポニンＣと、第１抗体とを含む第３試薬とを含む試薬キットが挙げられる。 The reagent kit in the reaction sequence of (2) above includes a first reagent containing a second antibody, a second reagent containing a solid phase, a troponin C, and a third reagent containing a first antibody. And reagent kits containing.
また、上記の（３）の反応順序における試薬キットとしては、トロポニンＣと、第１抗体とを含む第１試薬と、固相と、第2抗体とを含む第２試薬を含む試薬キットが挙げられる。 In addition, the reagent kit in the reaction sequence of (3) above includes a reagent kit including a second reagent including a first reagent including troponin C and a first antibody, a solid phase, and a second antibody. It is done.
また、上記の（４）の反応順序における試薬キットとしては、トロポニンＣと、固相と第2抗体との複合体とを含む第１試薬と、第１抗体を含む第２試薬とを含む試薬キットが挙げられる。 In addition, as a reagent kit in the reaction sequence of (4) above, a reagent comprising a first reagent containing troponin C, a complex of a solid phase and a second antibody, and a second reagent containing the first antibody Kits.
また、上記の（５）の反応順序における試薬キットとしては、固相と第2抗体との複合体とを含む第１試薬と、トロポニンＣと、第１抗体とを含む第２試薬とを含む試薬キットが挙げられる。 The reagent kit in the reaction sequence of (5) above includes a first reagent containing a complex of a solid phase and a second antibody, troponin C, and a second reagent containing the first antibody. A reagent kit.
また、上記の（６）の反応順序における試薬キットとしては、トロポニンＣと、第１抗体とを含む第１試薬と、固相と第2抗体との複合体を含む第２試薬を含む試薬キットが挙げられる。 In addition, as a reagent kit in the reaction sequence of (6) above, a reagent kit including a first reagent including troponin C and the first antibody, and a second reagent including a complex of the solid phase and the second antibody. Is mentioned.
なお、上記の（１）〜（６）の反応順序において、トロポニンＩと、トロポニンＣと、第1抗体と、第２抗体と、固相との複合体を形成し、固相を洗浄して固相に結合していない成分を除去した後に、再度第１抗体を混合する場合、上記の試薬キットは、第１抗体を含む別試薬をさらに含むことができる。この別試薬は、トロポニンＣをさらに含むことができる。 In the above reaction sequence (1) to (6), a complex of troponin I, troponin C, first antibody, second antibody and solid phase is formed, and the solid phase is washed. When the first antibody is mixed again after removing the component not bound to the solid phase, the reagent kit can further include another reagent containing the first antibody. This separate reagent can further comprise troponin C.
本発明の試薬キットに含まれる各試薬は、液体であってもよいし、用時に水などを加えて用いるための固体であってもよい。 Each reagent contained in the reagent kit of the present invention may be a liquid, or may be a solid for use with water added at the time of use.
液体の形態の試薬は、適切な溶媒中に、少なくとも上記の各成分を溶解したものであればよい。適切な溶媒としては、水、ｐＨ６〜10の緩衝液などが挙げられる。該緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）などを用いることができる。該緩衝液は、界面活性剤、保存剤、血清タンパク質などの公知の添加剤を含んでいてもよい。 The reagent in the liquid form may be any reagent in which at least each of the above components is dissolved in an appropriate solvent. Suitable solvents include water, pH 6-10 buffer and the like. As the buffer, phosphate buffered saline (PBS), triethanolamine hydrochloride buffer (TEA), Tris-HCl buffer (Tris-HCl), 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), etc. should be used. Can do. The buffer may contain a known additive such as a surfactant, a preservative, and serum protein.
上記の固体の形態の試薬は、上記の成分が溶解された適切な溶媒を、凍結乾燥などに付すことにより得ることができる。 The reagent in the above solid form can be obtained by subjecting an appropriate solvent in which the above components are dissolved to lyophilization or the like.
本発明の試薬キットの試薬に含まれるトロポニンＣ、第1抗体及び第2抗体の量は、生体試料に含まれると考えられる遊離のトロポニンＩに対して、大過剰量であればよく、好ましくは、該トロポニンＩに対して２〜１０倍(モル)量である。 The amount of troponin C, the first antibody, and the second antibody contained in the reagent of the reagent kit of the present invention may be a large excess with respect to free troponin I considered to be contained in the biological sample, preferably The amount is 2 to 10 times (mole) of the troponin I.
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
実施例１
心臓型トロポニンＣを生体試料に添加することによる、遊離型の心臓型トロポニンＩ及び心臓型トロポニンＩと心臓型トロポニンＣと心臓型トロポニンTの複合体（TnI-C-T複合体）における、心臓型トロポニンＩの測定に対する効果を確認する実験を、以下の条件で行った。
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Cardiac troponin in free cardiac troponin I and cardiac troponin I, cardiac troponin C and cardiac troponin T complex (TnI-CT complex) by adding cardiac troponin C to a biological sample An experiment for confirming the effect on the measurement of I was performed under the following conditions.
以下の手順において、抗体は、抗体緩衝液(pH 6.0、0.1M ２−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、1mM MgCl2・6H2O、0.1mM ZnCl2、0.1％ウシ血清アルブミン、0.15M NaCl、0.1％サンアイバック（三愛石油社製）)を用いて希釈した。
生体試料の代わりに、コンセーラ ニッスイ(日水製薬社製)に、心臓型トロポニンＩ(Fitzgerald社製) １及び10 ng/ml、並びにTnI-C-T複合体(Hytest社製) 10 ng/mlをそれぞれ溶解したものを用いた。また、コントロールとして、心臓型トロポニンＩ及びTnI-C-T複合体のいずれも含まないものを用いた。
ここに、第1抗体として、アルカリホスファターゼ（ALP）活性を基準にして0.１U/ｍl のALP標識抗トロポニンＩモノクローナル抗体（19C7抗体のIgG抗体；Hytest社製）及び100ng/mlの心臓型トロポニンＣ(Hytest社製)を含む混合液100μlを加え、37℃にて2.5分間インキュベートした。
In the following procedure, the antibody was antibody buffer (pH 6.0, 0.1 M 2 -morpholinoethanesulfonic acid (MES), 1 mM MgCl 2 .6H 2 O, 0.1 mM ZnCl 2 , 0.1% bovine serum albumin, 0.15 M NaCl, Dilution was performed using 0.1% sun eye bag (manufactured by Sanai Oil Co., Ltd.).
Instead of a biological sample, Consera Nissui (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), cardiac troponin I (Fitzgerald Co., Ltd.) 1 and 10 ng / ml, and TnI-CT complex (Hytest Co., Ltd.) 10 ng / ml, respectively The dissolved one was used. Further, as a control, one containing neither cardiac troponin I nor TnI-CT complex was used.
As the first antibody, 0.1 U / ml ALP-labeled anti-troponin I monoclonal antibody (19C7 antibody IgG antibody; Hytest) based on alkaline phosphatase (ALP) activity and 100 ng / ml heart-type troponin 100 μl of a mixed solution containing C (Hytest) was added and incubated at 37 ° C. for 2.5 minutes.
次いで、ストレプトアビジン磁性粒子(平均粒子径2μm、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ7.5)中に10 mg/ml) 30μlを加え、42℃にて3.5分間反応させた。
第2抗体として、トロポニンＩの87〜91番目のアミノ酸配列をエピトープとして認識するビオチン標識抗トロポニンＩモノクローナル抗体（16A11抗体のFab'フラグメント、Hytest社製）を5μg/ml含む第2抗体溶液30μlを加え、42℃にて3.5分間インキュベートした。
Next, 30 μl of streptavidin magnetic particles (average particle size: 2 μm, 10 mg / ml in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5)) was added and reacted at 42 ° C. for 3.5 minutes.
As a second antibody, 30 μl of a second antibody solution containing 5 μg / ml of a biotin-labeled anti-troponin I monoclonal antibody (Fab ′ fragment of 16A11 antibody, manufactured by Hytest) that recognizes the 87th to 91st amino acid sequence of troponin I as an epitope In addition, it was incubated at 42 ° C. for 3.5 minutes.
磁気分離を行って、固相に結合した第2抗体に結合したトロポニンＩとトロポニンＣと第1抗体との複合体を分離した。
洗浄液(0.01M MES、pH 6.5、0.1％アジ化ナトリウム) 100〜700μlを加えて撹拌し、磁気分離を行った。この洗浄操作を、計4回行った。
Magnetic separation was performed to separate the complex of troponin I, troponin C and the first antibody bound to the second antibody bound to the solid phase.
Washing solution (0.01 M MES, pH 6.5, 0.1% sodium azide) 100-700 μl was added and stirred to perform magnetic separation. This washing operation was performed 4 times in total.
分散液(0.01M MES、pH 6.5、0.1％アジ化ナトリウム) 50μlを加えて撹拌し、固相を分散させた。
発光基質液(CDP-Star、Applied Biosystems社製) 100μlを加えて撹拌し、42℃にて5分間反応させ、ルミノメータで発光強度を測定した。得られた発光強度のカウントを、表1に示す。
50 μl of dispersion (0.01 M MES, pH 6.5, 0.1% sodium azide) was added and stirred to disperse the solid phase.
100 μl of luminescent substrate solution (CDP-Star, Applied Biosystems) was added and stirred, reacted at 42 ° C. for 5 minutes, and luminescence intensity was measured with a luminometer. The obtained emission intensity counts are shown in Table 1.
比較例１
実施例１において、トロポニンＣを加えずに実施例１と同じ手順を繰り返して、発光強度を測定した。得られた発光強度のカウントを、表1に示す。
Comparative Example 1
In Example 1, the same procedure as Example 1 was repeated without adding troponin C, and the luminescence intensity was measured. The obtained emission intensity counts are shown in Table 1.
なお、表１における上昇率は、心臓型トロポニンＣを添加した場合の特異的発光強度のカウントを、心臓型トロポニンＣを添加しない場合の特異的発光強度のカウントで除した値を示す。 In addition, the increase rate in Table 1 shows a value obtained by dividing the count of specific luminescence intensity when heart-type troponin C is added by the count of specific luminescence intensity when no heart-type troponin C is added.
表1の結果から、トロポニンＣの存在下で、トロポニンＩを第1抗体と接触させる本発明の方法によると、トロポニンＣの非存在下で測定する場合に比較して、発光強度のカウントが、遊離型の心臓型トロポニンＩで約10倍、TnI-C-T複合体で約２倍上昇したことがわかる。ここで、TnI-C-T複合体の発光強度のカウントが上昇した理由は、トロポニンＣの添加により、TnI-C-T複合体に含まれるトロポニンＩが遊離型の心臓型トロポニンＩとなった場合でも、すぐにトロポニンＣと複合体を形成することが可能となったためと考えられる。 From the results shown in Table 1, according to the method of the present invention in which troponin I is contacted with the first antibody in the presence of troponin C, the luminescence intensity is counted as compared with the measurement in the absence of troponin C. It can be seen that free heart-type troponin I increased about 10-fold and TnI-CT complex increased about 2-fold. Here, the reason for the increase in the luminescence intensity count of the TnI-CT complex is that even when troponin I contained in the TnI-CT complex becomes free cardiac troponin I due to the addition of troponin C, This is probably because a complex with troponin C can be formed.
実施例２
固相に結合する第２抗体の違いによる、心臓型トロポニンＩの測定に対する影響を確認する実験を、以下の条件で行った。
Example 2
An experiment for confirming the influence of the difference in the second antibody bound to the solid phase on the measurement of cardiac troponin I was performed under the following conditions.
第２抗体である、ビオチン標識抗トロポニンＩモノクローナル抗体として、16A11抗体のFab'フラグメントの代わりに
（１）560抗体のIgG抗体（5μg/ml）
（２）M18抗体のIgG抗体（5μg/ml）
（３）MF4抗体のIgG抗体（5μg/ml）
を用いた。なお、560抗体は、トロポニンＩの83〜93番目のアミノ酸配列を、M18抗体は、18〜28番目のアミノ酸配列を、MF4抗体は、190〜196番目のアミノ酸配列を、それぞれエピトープとして認識する。
As a second antibody, biotin-labeled anti-troponin I monoclonal antibody, instead of FabA fragment of 16A11 antibody (1) IgG antibody of 560 antibody (5 μg / ml)
(2) IgG antibody of M18 antibody (5μg / ml)
(3) IgG antibody of MF4 antibody (5μg / ml)
Was used. The 560 antibody recognizes the 83-93th amino acid sequence of troponin I, the M18 antibody recognizes the 18-28th amino acid sequence, and the MF4 antibody recognizes the 190-196th amino acid sequence as an epitope.
上記の第2抗体を用いた以外は、実施例１と同様の操作で得られた結果を表２に示す。なお、表２における上昇率は、心臓型トロポニンＣを添加した場合の特異的発光強度のカウントを、心臓型トロポニンＣを添加しない場合の発光強度のカウントで除した値を示す。 Table 2 shows the results obtained in the same manner as in Example 1 except that the second antibody was used. In addition, the increase rate in Table 2 shows a value obtained by dividing the count of specific luminescence intensity when heart-type troponin C is added by the count of luminescence intensity when no heart-type troponin C is added.
表２から、第2抗体は、第1抗体がエピトープとして認識する41〜49番目のアミノ酸配列とは異なるエピトープを認識する抗体であれば、16A11抗体に限らず利用できることが分かる。また、第2抗体として、Fab'フラグメントに限らず、IgG抗体も利用できることがわかる。 From Table 2, it can be seen that the second antibody can be used without being limited to the 16A11 antibody as long as it recognizes an epitope different from the 41st to 49th amino acid sequences recognized by the first antibody as an epitope. Further, it can be seen that not only the Fab ′ fragment but also an IgG antibody can be used as the second antibody.
Claims (8)
前記複合体を形成した第1抗体の標識物質を測定する
ことを含む、トロポニンＩを測定する方法。 In the presence of troponin C, troponin I derived from a biological sample is contacted with a first antibody that recognizes the 41st to 49th amino acid sequence of troponin I as an epitope and is labeled with a labeling substance. And forming a complex of the troponin C and the first antibody,
A method for measuring troponin I, comprising measuring a labeling substance of the first antibody forming the complex.
配列番号１で表されるトロポニンＩの41〜49番目のアミノ酸配列をエピトープとして認識し且つ標識物質で標識された第1抗体と
を含む、トロポニンＩの測定用試薬キット。 Troponin C,
A reagent kit for measuring troponin I, comprising a first antibody that recognizes the 41st to 49th amino acid sequence of troponin I represented by SEQ ID NO: 1 as an epitope and is labeled with a labeling substance.
第1抗体が認識するエピトープとは異なるトロポニンＩのエピトープを認識し且つ前記固相に結合可能にされた第2抗体と
をさらに含む、請求項７に記載のキット。 A solid phase;
The kit according to claim 7, further comprising a second antibody that recognizes an epitope of troponin I different from the epitope recognized by the first antibody and is capable of binding to the solid phase.
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