JP2012506240A - ジペプチジルペプチダーゼｉ活性を評価するためのハイスループットアッセイ - Google Patents

Abstract

ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）活性を調節する化合物のスクリーニング方法は、ＤＰＰＩおよび化合物を含んでなる反応混合物にＤＰＰＩのペプチド基質を添加する段階（ＤＰＰＩのペプチド基質は最低３アミノ酸を有しかつＳ_１−Ｓ_２部位に加えてＤＰＰＩの１結合部位に結合し）；ならびに基質の分子量を測定する段階（基質の分子量の変化がＤＰＰＩ活性の存在を示す）を含んでなる。

Description

関連出願の交差引用
本出願は、２００８年１０月２１日に出願された米国仮出願第６１／１０７，０４６号（その内容はそっくりそのまま本明細書に引用することにより組み込まれる）に対する利益を主張する。

１．発明の分野
本発明はハイスループット形式のジペプチジルペプチダーゼＩのアゴニストおよびアンタゴニストを同定することを提供する。該方法は、標識を含まずかつジペプチジルペプチダーゼＩの複数の基質結合部位に結合するペプチド基質を使用する。

２．従来技術
ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）すなわちカテプシンＣは、カテプシンＢ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、ＯおよびＳもまた包含するリソゾームのパパイン型システインプロテアーゼファミリーの１メンバーである（非特許文献１；非特許文献２）。このプロテアーゼファミリーは免疫および炎症細胞中のセリンプロテイナーゼを活性化する。

ＤＰＰＩの生理学的役割は、免疫および炎症細胞中のプロ酵素のＮ末端から２アミノ酸を１ジペプチジル単位として除去することにより不活性のプロ酵素を活性の酵素に転化することである（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７により総説される）。ＤＰＰＩは、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞からのキマーゼ、トリプターゼ、カテプシンＧ、エラスターゼおよび好中球エラスターゼ、グランザイムＡおよびＢ；ならびに関節リウマチプロテアーゼ（非特許文献８）を包含する多くのセリンプロテイナーゼを活性化する。ＤＰＰＩにより活性化される該酵素すなわちセリンプロテアーゼは防御反応に必要とされる。加えて、調節されないＤＰＰＩは、慢性閉塞性肺疾患、パピヨン・ルフェーブル症候群、敗血症、関節炎および他の炎症性障害を包含する疾患と関連するプロテアーゼの過剰活性化を引き起こすことが示されている。従って、ＤＰＰＩは治療的処置の潜在的標的である。

ＤＰＰＩは４個の同一の単量体からなることが提案されている。各単量体は、Ｎ末端除外ドメイン（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）、活性化ペプチドおよびパパイン様ドメインに切断される前駆体ポリペプチドから産生される。該パパイン様ドメインがＨ鎖およびＬ鎖にさらに切断される。その後、Ｎ末端除外ドメイン、ＨおよびＬ鎖が単量体にフォールディングし、これが約２００ｋＤａの成熟ＤＰＰＩに四量体化する（非特許文献９）。

ＤＰＰＩの最近の結晶化は、ジペプチジルタンパク質分解活性に関与する活性部位溝および基質結合部位を包含する数種の構造を同定した。基質結合部位はパパイン様構造の外部部分に存在しそして基質と水素結合を形成する。基質の切断される結合のＮ末端側の第一のアミノ酸に結合する部位はＳ_１結合部位と称され、Ｎ末端側の第二のアミノ酸に結合する部位がＳ_２結合部位と称される。さらに、基質の切断される結合のＣ末端側の第一のアミノ酸に結合する部位はＳ_１’結合部位と称され、また、Ｃ末端側の第二のアミノ酸に結合する部位はＳ_２’結合部位と称される、などである（非特許文献９；非特許文献１０）。ＤＰＰＩ基質中の対応する部位はＰ_１、Ｐ_２、Ｐ_１’、Ｐ_２’などと称され、ここで基質のＰ_１はＤＰＰＩのＳ_１部位に結合し、基質のＰ_２はＤＰＰＩのＳ_２に結合し、そし
て基質のＰ_１’はＤＰＰＩのＳ_１’部位に結合する、などである。ＤＰＰＩおよび６アミノ酸の基質の結合複合体の結晶学的結果に基づき、ＭｏｌｇａａｒｄらはＤＰＰＩがＳ_２−Ｓ_１およびＳ_１’−Ｓ_４’基質結合部位を含有するモデルを提案している。ＤＰＰＩはｉｎ ｖｉｖｏで２２８アミノ酸のヒトプロキマーゼのようなより大きい基質に結合するため；ＤＰＰＩの基質結合部位は、Ｓ_２−Ｓ_１−Ｓ_１’−Ｓ_１８’に至るまでのＳ_２−Ｓ_１−Ｓ_１’−Ｓ_４’より多くを含有しうる。

ＤＰＰＩは潜在的治療標的であるため、ＤＰＰＩ活性を分析するための数種のアッセイが一般に使用されている（非特許文献１１；（非特許文献１２）。Ｇｅｌｍａｎらは、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−β−ナフチルアミドという標識ジペプチドを基質として使用し、そして分光蛍光光度計を用いて遊離β−ナフチルアミドの濃度を測定することによりＤＰＰＩ活性を測定した。同様に、Ｔｒａｎらは７−アミノ−４−メチルクマリンで標識した数種のジペプチドをＤＰＰＩ基質として使用し、そして分光蛍光光度計を用いて遊離メチルクマリンの濃度を測定することによりＤＰＰＩ活性を測定した。Ｔｒａｎらは、Ａｌａ−Ｈｐｈ−７−アミノ−４−メチルクマリンというジペプチド基質が、該基質が生理学的でない残基Ｈｐｈ（ホモフェニルアラニン）を含有するとしてもＤＰＰＩの最良の基質であることを示している。

蛍光標識をもつこれらの一般に使用されるペプチド基質はいくつかの問題を有する。第一に、該ジペプチド基質はＳ_１およびＳ_２部位にのみ結合する。これは、Ｓ_１およびＳ_２部位に加えて１結合部位に結合するｉｎ ｖｉｖｏの生物学的基質と比較して部分的すなわち不完全である。該不完全すなわち部分的結合は非特異的であることができ、そしてこれゆえに偽陽性若しくは陰性の化合物の同定につながりうる。また、付加的な蛍光検出段階がＤＰＰＩ活性を検出するのに必要とされる。この付加的な段階は、該アッセイがハイスループット形式での使用に適合されることを困難にする。

従って、ＤＰＰＩ活性を分析するための標識を含まずかつ生物学的に関連した基質を使用するアッセイを開発する必要性がなお存在する。また、薬物開発のための多数の化合物若しくは剤の効率的スクリーニングを可能にするためのハイスループット形式での使用に適するＤＰＰＩアッセイを開発する必要性も存在する。

標識を含まない技術が、酵素反応を分析するために質量分析系と組合せられている。Ｑｕｅｒｃｉａら（非特許文献１３）は、複数反応のモニタリングで質量分析を使用してキナーゼＡＫＴＩ／ＰＫＢα阻害剤を同定している。同様に、Ｆｏｒｂｅｓら（非特許文献１４）は、複数反応のモニタリングで質量分析を使用して９６ウェルプレートでホスホルチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）デカルボキシラーゼを評価している。ハイスループット形式での質量分析検出系はＤＰＰＩ活性を分析するのに応用されていない。

本出願はＤＰＰＩ活性のアッセイ方法を提供する。該方法は、生物学的に関連するアミノ酸配列および結合特異性を含んでなる標識を含まないペプチド基質を利用する。該アッセイは質量分析系を使用して検出することができ、また、処理時間を短縮しかつ化合物をスクリーニングするために望ましいスループットを増大させるハイスループット形式で操作しうる。該方法は、薬物開発のためのフラグメントに基づく化合物の示差的追跡（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｒａｃｋｉｎｇ）、および機能研究のため他のジペプチジルタンパク質分解反応を評価するのにもまた有用である。

ＢｏｕｍａとＧｒｕｂｅｒ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３：３５０−３５８ Ｔｕｒｋら、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７７：９８−１１１ Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｇ．Ｈ．、２００２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３８：１３５３−１３５７ Ｗｏｌｔｅｒｓら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１８５５１−１８５５６ ＭｃＧｕｉｒｅら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４５８−２４６７ ＰｈａｍとＬｅｙ、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：８６２７−８６３２ Ｐｈａｍら、２００４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：７２７７−７２８１ Ａｄｋｉｓｏｎら、２００２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：３６３−３７１ Ｔｕｒｋら、２００１ ＥＭＢＯ Ｊ．、２０：６５７０−６５８２ Ｍｏｌｇａａｒｄら、２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、４０１：６４５−６５０ Ｇｅｌｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８０、６５：１３９８−１４０６ Ｔｒａｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００２、４０３：１６０−１７０ Ｑｕｅｒｃｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１２：４７３−４８０、２００７ Ｆｏｒｂｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１１：６２８−６３４、２００７

［発明の要約］
本出願の一目的はＤＰＰＩ活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供することである。該方法は、ＤＰＰＩおよび化合物を含んでなる反応混合物にＤＰＰＩの基質を添加する段階（該基質は３ないし１００アミノ酸を有しかつＳ_１−Ｓ_２部位に加えてＤＰＰＩの１結合部位に結合し）、ならびに基質の分子量の変化ならびに／若しくは基質および生成物の質量比の変化を測定する段階（基質の分子量若しくは質量比の変化はＤＰＰＩ活性の存在を示す）を含んでなる。

本発明の一態様によれば、化合物は２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）フェノール若しくは２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）アニリンでありうる。

別の目的は、ＤＰＰＩ活性を調節する化合物をスクリーニングするのに有用な標識を含まないＤＰＰＩ基質を提供することである。例示的ＤＰＰＩ基質は配列番号１〜７より成る群から選択されうる。ＤＰＰＩ基質は好ましくは２０アミノ酸を有するペプチドを含みうる。ＤＰＰＩ基質は好ましくは標識を含まない。

本発明の他の目的および特徴は、付随する図面とともに考慮される以下の詳細な記述から明らかになるであろう。しかしながら、該図面は単に具体的説明の目的上設計され、そして本発明の制限の定義として設計されておらず、そのために付属される請求の範囲に言及がなされるべきであることが理解されるべきである。該図面は必ずしも原寸に比例して描かれていないこと、ならびに、別の方法で示されない限り、それらは本明細書に記述さ
れる構造および手順を概念的に具体的に説明することのみを意図していることがさらに理解されるべきである。

［発明の詳細な記述］
ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）のアゴニスト若しくはアンタゴニストの存在下でＤＰＰＩの活性を検出するため、ＤＰＰＩの基質として使用するペプチドを、反応混合物が反応緩衝液、ＤＰＰＩのアゴニスト若しくはアンタゴニスト、ＤＰＰＩおよび基質を含有するような反応混合物に添加する。ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸ナトリウムの緩衝系、若しくはｐＫａが約７．０であるいずれかの緩衝系をＤＰＰＩアッセイに使用し得る。ＨＥＰＥＳ緩衝系が好ましい。例えば、１０×反応緩衝液はｐＨ７．０の５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０である。当業者に公知の他の緩衝系もまた使用しうる。反応前に、ＤＴＴ若しくはグルタチオンを１×反応緩衝液に２ｍＭの最終濃度まで添加する。

ＤＰＰＩは、商業的供給源から得ることができるか、組換えＤＮＡ技術により製造しうるか、または当業者に公知の方法により細胞から単離若しくは精製しうる。

ＤＰＰＩのＳ_１−Ｓ_２基質結合部位より多くに結合する最低３アミノ酸、好ましくは５ないし１００アミノ酸および最も好ましくは１０ないし５０アミノ酸のいかなるペプチドも、ＤＰＰＩのタンパク質分解活性を検出するための基質として使用しうる。該ペプチド基質の基質結合部位の数は３ないし１００、好ましくは５ないし５０および最も好ましくは６ないし２０でありうる。従って、該ペプチド基質は、Ｓ_１−Ｓ_２基質結合部位、ならびにＳ_１’−Ｓ_９８’、好ましくはＳ_１’−Ｓ_４８’および最も好ましくはＳ_１’−Ｓ_４’の最低１個の付加的な基質結合部位でＤＰＰＩに結合する。

本出願のペプチド基質はいずれかの蛍光発生若しくは色素産生剤で標識若しくは修飾されていない。該ペプチド基質は、化学的に合成しうるか、組換えＤＮＡ技術を使用して発現させうるか、または当業者に公知の方法により細胞から単離若しくは精製しうる。
本明細書で使用されるところのポリペプチドという用語は、ペプチド結合若しくは改変されたペプチド結合すなわちペプチドアイソスターにより相互に結合された３個若しくはそれ以上のアミノ酸を指す。ポリペプチドは、一般にペプチド、オリゴペプチド若しくはオリゴマーと称される短い鎖および一般にタンパク質と称されるより長い鎖の双方を指す。ポリペプチドは２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸を含有しうる。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然の過程、若しくは当該技術分野で公知である化学修飾技術のいずれかにより改変されたアミノ酸配列を包含する。こうした改変は研究論文に十分に記述されている。改変は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノ若しくはカルボキシル末端を包含するポリペプチド中のどこにも存在しうる。

５〜５０μｌ、好ましくは１０若しくは２０μｌの反応容量を、実験室で一般に使用されるチューブ若しくはプレートに分注し、そして基質ターンオーバーを測定することによりＤＰＰＩ活性についてアッセイする。本明細書で使用されるところの基質ターンオーバーは、基質の量の減少および生成物の量のその後の増加を指す。基質ターンオーバーは基質および生成物の分子質量をモニターすることにより測定しうる。質量分析系が好ましい。例として、基質および生成物の濃度は、当業者に既知のＡｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウエアを伴うＡｇｉｌｅｎｔ ＭＳＤなどを使用する単一イオンモニタリング（ｓｉｎｇｌｅ ｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（ＳＩＭ）技術により測定し得る。データをＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎおよびＢｉｏＴｒｏｖｅ Ｒａｐｉｄｆｉｒｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒを使用して解析した。該アッセイは化合物試験について１０％未満の基質ターンオーバーを許容するよう設計した。

一般的な酵素反応の平衡を下に具体的に説明する。すなわち

ここでＥは酵素であり、Ｓは該酵素の基質であり、そしてＰは該反応の生成物である。

該平衡は、本出願のペプチド基質を用いるＤＰＰＩアッセイにおけるジペプチジルタンパク質分解反応を具体的に説明するように改変される。すなわち

開始される場合、ＤＰＰＩは、２０アミノ酸Ｇ−Ｅ−Ｉ−Ｉ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｅ−Ｃ−Ｋ−Ｐ−Ｈ−Ｓ−Ｒ−Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ａ−Ｙ−Ｌを有するペプチド基質のＮ末端から２アミノ酸Ｇ−ＥすなわちＧｌｙ−Ｇｌｕを切断かつ除去する。これは１８７Ｄａの差違を伴う２，２２４Ｄａから２，０３７へのペプチド基質の分子量若しくは質量の変化をもたらす。該反応におけるペプチド基質の分子量若しくは質量は単一イオンモニタリングを使用する質量分析により検出しうる。ＳＩＭにより検出されるペプチド基質の変化すなわち差違は１，１１２ａｍｕ（原子質量単位）から１，０１８．５ａｍｕまでである。これを使用して基質ターンオーバーの値を決定しうる。

初期速度条件下での基質ターンオーバーの速度の時点で、ＤＰＰＩおよびペプチド基質の反応速度定数は、以下の式（Ｉ）、すなわち

Ｙ＝Ｖ_ＭＡＸ（（Ｘ＋Ｅｔ＋Ｋ_Ｍ）−（（（（Ｅｔ＋Ｘ＋Ｋ_Ｍ）^２）−（４ＸＥｔ））^０．５））／（２Ｅｔ）

ここで
Ｙは基質ターンオーバーの濃度であり
Ｘは基質濃度であり
ＥｔはＤＰＰＩ濃度であり
Ｋ_Ｍは１／２Ｖ_ＭＡＸでの基質濃度であり
Ｖ_ＭＡＸは基質飽和での基質ターンオーバーである、
を使用して計算される。

ＤＰＰＩ活性を調節する試験化合物をスクリーニングするため、ＤＰＰＩ活性の阻害を、以下の式、すなわち

陽性対照中の基質ターンオーバーの量：

試験化合物を含有するサンプル中の基質ターンオーバーの量：

阻害パーセント＝

若しくは
（１−（（サンプルの基質ターンオーバー（μＭ））×（陽性対照の基質ターンオーバー（μＭ））^−１）×１００
ここで
［Ｓ］は基質の濃度（μＭ）であり
ＳＩＭ_Ｓはサンプル中の基質のＳＩＭ（ａｍｕからの曲線下面積）であり
ＳＩＭ_ＳＰＣは陽性対照サンプル中の基質のＳＩＭ（ａｍｕからの曲線下面積）であり
ＳＩＭ_Ｐはサンプル中の生成物のＳＩＭ（ａｍｕからの曲線下面積）であり
ＳＩＭ_ＰＣは陽性対照の生成物のＳＩＭ（ａｍｕからの曲線下面積）であり
ＳＩＭ_ＳＰＣは陽性対照サンプル中の基質のＳＩＭ（ａｍｕからの曲線下面積）であり
ＳＩＭ_ＮＣは陰性対照の生成物のＳＩＭ（ａｍｕからの曲線下面積）であり
ＳＩＭ_ＳＮＣは陰性対照の基質のＳＩＭ（ａｍｕからの曲線下面積）であり、
ここで、陽性対照はいかなる試験化合物も含まない反応であり、陰性対照はＤＰＰＩ若しくは基質を含まない反応であり、サンプルは試験化合物を含有する反応である、
を使用して計算しうる。

候補化合物が同定される場合、該候補化合物によるＤＰＰＩ阻害のＩＣ_５０を、式（ＩＩ）、すなわち

ここで
Ｓ_ｉはサンプルの正味の基質ターンオーバー信号であり
Ｓ_Ｏは陽性対照の正味の基質ターンオーバー信号であり
Ｓ_ｍｉｎは陰性対照の正味のＳＩＭ信号であり、
Ｉは候補化合物の濃度であり、
ここで、陽性対照はいかなる試験化合物も含まない反応であり、かつ、陰性対照はＤＰＰＩ若しくは基質を含まない反応である、
を使用して計算する。

上述されたアッセイは、試験化合物をスクリーニングし、およびＤＰＰＩの活性を調節する候補化合物を同定するためのハイスループット形式で使用しうる。こうした場合、反
応混合物を最初に９６若しくは３８６ウェルプレートのような複数のウェルを含有するマイクロタイタープレートに分注し、その後、該プレートを、各プレートの各ウェル中の反応を読み取って数値データを生成する質量分析などのような検出系に負荷する。

従って、その好ましい一態様に適用されるところの本発明の基礎的な新規の特徴が示されかつ記述されかつ指摘された一方、具体的に説明される化合物、方法および装置の形式および詳細ならびにそれらの操作における多様な省略および置換ならびに変更が、本発明の技術思想から離れることなく当業者によりなされうることが理解されるであろう。例えば、同一の結果を達成するために実質的に同一の方法で実質的に同一の機能を果たす要素および／若しくは方法段階の全部の組合せが本発明の範囲内にあることを明らかに意図している。さらに、本発明のいずれかの開示される形式若しくは態様とともに示されかつ／若しくは記述される構造および／若しくは要素および／若しくは方法段階が、設計の選択の一般的問題として、いかなる他の開示若しくは記述若しくは示唆される形式若しくは態様にも取り込まれうることが認識されるべきである。従って、それに付属する請求の範囲の範囲により示されるとおりにのみ制限されることを意図している。

２０−ｍｅｒ基質（Ａ）およびジペプチド基質（Ｂ）との反応のＤＰＰＩの反応速度定数の初期速度分析。（Ａ）約２ｎＭのＤＰＰＩをＧＥＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＬという２０−ｍｅｒ基質との反応で使用し、そして、質量分析系を使用して該反応をモニターした。（Ｂ）約０．４ｎＭのＤＰＰＩをＧＲ−α−メチルクマリンのジペプチド基質との反応で使用し、そして、Ｅ_Ｍ＝４６０ｎｍおよびＥ_Ｘ＝３８０ｎｍでの蛍光をモニターする速度に基づく形式を使用して該反応をモニターした。初期速度は、７％未満の基質ターンオーバーが達成された反応速度データから採用する。 ジペプチド基質（Ａ）および２０−ｍｅｒペプチド基質（Ｂ）を使用する２種の試験化合物を用いるＤＰＰＩ調節活性の評価。（Ａ）約０．４ｎＭのＤＰＰＩおよび約１０μＭのジペプチド基質ＧＲ−α−メチルクマリンを速度に基づく形式で使用し、そしてＥ_Ｍ＝４６０ｎｍおよびＥ_Ｘ＝３８０ｎｍでの蛍光でモニターした。（Ｂ）約２ｎＭのＤＰＰＩおよび２０μＭの２０−ｍｅｒペプチド基質ＧＥＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＬを反応で使用し、そして質量分析系でモニターした。２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）フェノールを黒四角により表し、また、２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）アニリンを黒丸で表す。Ｒ^２値は≧０．９５である。

１０×ＨＥＰＥＳ緩衝系およびジペプチジルプロテイナーゼＩの調製
ｐＨ７．０の５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０の１０×反応緩衝液を調製した。反応前に、ＤＴＴ若しくは他の適する還元剤を、ｐＨ７の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０の１×反応緩衝液に２ｍＭの最終濃度まで添加した。１０若しくは２０μｌの反応容量を、ＤＰＰ−１活性のため３８４ウェルのポリプロピレン製プレートに分注した。

ＤＰＰＩはＬａｕｒｉｔｚｅｎら（１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ
１４、４３４−４４２）（その内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）によるＨｉ５昆虫細胞中のバキュロウイルス系を使用して過剰発現させかつ精製した。ＤＰＰＩ前駆体をコードする組換えバキュロウイルスをバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）の説明書に従って製造した。簡潔には、ヒトおよびマウスＤＤＰ前駆体のｃＤＮＡを含有する組換えバキュロウイルスをＨｉ５昆虫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後約４〜５日後
に培地を収集し、そしてブチル−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーをｐＨ４．５で使用してＤＰＰＩ前駆体を精製した。ＤＰＰＩを含有する画分を合わせ、そして完全な活性化までｐＨ７．０で２日間透析した。分泌および活性化の間にシグナル配列および活性化ペプチドが切断分離され、そして完全に活性化された酵素をもたらした。透析されたヘテロ三量体かつ活性のＤＰＰＩをＱ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製し、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕｌｔｒａ−１５、１００００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮し、そして２０ｍＭビス−トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴおよび２ｍＭ ＥＤＴＡの最終緩衝液中で透析した。全部の精製および透析段階は４℃で実施した。ＤＰＰＩを分注し、液体窒素中で急速凍結しかつ−８０℃で保存した。３種の鎖の正しいＮ末端をＮ末端配列決定により確認した。

ＤＰＰＩの複数の基質結合部位に結合するペプチド基質の設計
ヒトキマーゼ、カテプシンＧ、エラスターゼおよびトリプターゼのＮ末端ペプチド配列を下のとおり整列した。

ＧＥＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＬ（配列番号１）、ＮＨ_２−ＧＥＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＫ−ＣＯＯＨ（配列番号２）、ＮＨ_２−ＧＥＩＩＧＧ−ＣＯＯＨ（配列番号３）およびＮＨ_２−ＧＥＩＩＧＧＴＥ−ＣＯＯＨ（配列番号４）のペプチドをＤＰＰＩ基質として選択した。該基質、およびＮＨ_２−ＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＬ−ＣＯＯＨ（配列番号８）、ＮＨ_２−ＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＫ−ＣＯＯＨ（配列番号９）、ＮＨ_２−ＩＩＧＧ−ＣＯＯＨ（配列番号１０）およびＮＨ_２−ＩＩＧＧＴＥ−ＣＯＯＨ（配列番号１１）の対応する生成物ペプチドを合成し（ＡｎａＳｐｅｃ、カリフォルニア州サンノゼ）そしてＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した。ペプチド基質およびそれらの生成物の単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）を表１に記述した。

当業者は、他のペプチド配列、例えばＮＨ_２−ＧＥＩＩＧＧＴＥＣＫ−ＣＯＯＨ（配列番号５）、ＮＨ_２−ＧＥＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨ−ＣＯＯＨ（配列番号６）およびＮＨ_２−
ＧＥＩＩＧＧＸＥＡＫＰＨＳＲＰＹＭＶ−ＹＬ−ＣＯＯＨ（配列番号７）（ここでＸはいずれかの天然の若しくは改変アミノ酸である）のペプチドを、本明細書に記述される方法の基質として使用し得ることを認識するであろう。

ペプチド基質を用いるＤＰＰＩアッセイ
ＮＨ２−ＧＥＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＬ−ＣＯＯＨ（配列番号１）の２０−ｍｅｒ基質ペプチドおよび１８−ｍｅｒ生成物ペプチド（ＮＨ２−ＩＩＧＧＴＥＣＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＬ−ＣＯＯＨ（配列番号８）の標準曲線を、単一イオンモニタリング検出を使用する質量分析系により生成した。

約２ｎＭのＤＰＰＩを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０および２ｍＭのＤＴＴ若しくはＧＳＨの反応緩衝液中約０．５、１、２、４、８、１６、３２、６４、９０、１２８、１５０μＭの２０−ｍｅｒ基質とインキュベートした。該反応を約２７℃でインキュベートし、そして０、２、５、１０、２０、３０、４５、６０、７５、９０および１２０分の複数の時点で約１／１０容量の２％トリフルオロ酢酸で終結させた。クエンチした反応の約１０μｌのアリコートを、Ｃ_４カートリッジを用いるＲａｐｉｄＦｉｒｅ（ＢｉｏＴｒｏｖｅ、マサチューセッツ州ウォバーン）により基質ターンオーバーを検出するのに使用した。反応をカートリッジに負荷し、これを０．１％ギ酸＋０．０２％ＴＦＡの固定相で平衡化し、そして９０％ＭｅＣＮ＋０．１％ギ酸＋０．０２％ＴＦＡの移動相で１分あたり約１ｍｌで展開した。ＳＩＭ １１１２ａｍｕ（原子質量単位）の２０−ｍｅｒ基質およびＳＩＭ １０１９の対応する１８−ｍｅｒ生成物を陽イオンモードモニタリングのＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＬＣＭＳＤ（カリフォルニア州サンタクララ）を使用してモニターした。

初期反応速度は７％未満の基質ターンオーバーが達成された反応速度データから採用した。図１に示されるところの結果は、基質ターンオーバーが双曲線として表されうることを示した。Ｋ_Ｍ、Ｋ_ｃａｔおよび二次速度定数の値はそれぞれ約６２μＭ、１．１５ｓｅｃ^−１および１．９５×１０^４Ｍ^−１ｓｅｃ^−１であることが計算された（表２）。これらの値が、ＤＰＰＩアッセイで試験化合物を評価するための設定条件となった。

ジペプチドおよびペプチド基質を使用する速度に基づくＤＰＰＩアッセイ
ＤＰＰＩの活性を、α−メチルクマリン（ＡＭＣ）で標識したジペプチド基質Ｇｌｙ−Ａｒｇ若しくは配列番号１の２０−ｍｅｒペプチド基質いずれかを用いて分析した。ジペプチド基質について、約０．４ｎＭのＤＰＰＩを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０および２ｍＭのＤＴＴ若しくはＧＳＨの１０μｌの反応緩衝液中で約１、２、５、１０、２５、５０、１００、１５０、３００、６００μＭのジペプチド基質とインキュベートした。蛍光（Ｅ_Ｘ＝３８０ｎｍ、Ｅ_Ｍ＝４６０ｎｍ）を、Ｓａｆｉｒｅ ＩＩ（Ｔｅｃａｎ、スイス）を使用して約０から１０分まで連続してモニターしてＤＰＰＩ活性を測定した。２０−ｍｅｒペプチド基質の条件は上述されたと同一であった。

いずれかの基質を用いるＤＰＰＩアッセイの反応速度定数を表２に示した。２０−ｍｅｒ基質ペプチドを含有する反応のｋ_ｃａｔおよび二次速度定数双方の値は、標識ジペプチドを含有する反応のものと比較して低下した。該結果は、２０−ｍｅｒ基質が、律速段階である生成物解離によることがありそうである異なる反応速度機構を有することを示す。２０−ｍｅｒ基質を用いる反応の生成物はＮ末端の２−ｍｅｒペプチドおよびＣ末端の１８−ｍｅｒペプチドを包含する。該１８−ｍｅｒ生成物ペプチドはジペプチド基質を使用して検査し得ないＤＰＰＩ結合部位に結合する。これは、ジペプチド基質を使用するＤＰ
ＰＩアッセイが、試験される化合物の効力についての十分な情報を提供しないかもしれないことを示唆する。

ＤＰＰＩ活性を調節する試験化合物のスクリーニング
２種のフラグメント化合物すなわち２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）フェノールおよび２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）アニリンを、ＤＰＰＩを調節するそれらの活性について評価した。約０．１ｍＭないし約１００ｍＭの化合物の希釈系列を１００％ＤＭＳＯ中で作成した。約１μｌの試験化合物および約８μｌの約３．７５ｎＭのＤＰＰ−１を３８４ウェルのポリプロピレン製プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ
Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州モンロー）に添加した。タンパク質分解反応を約１μｌの２００μＭ基質の添加により開始した。該反応を２７℃で６０分間インキュベートし、そして約２５μｌの０．１％ギ酸＋０．０２％ＴＦＡの添加で終結させた。クエンチした反応の約１０μｌのアリコートを、実施例３および４に記述されるとおりＲａｐｉｄＦｉｒｅ^ＴＭにより分析した。

実験５の結果を図２に要約した。ジペプチド基質との反応において、いずれの化合物も１０ｍＭという高濃度ででさえＤＰＰＩ活性に影響を及ぼさなかった。しかしながら、２０−ｍｅｒ基質との反応において双方の化合物がＤＰＰＩ活性を濃度依存性の様式で調節した。片対数プロット分析は、２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）フェノールおよび２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）アニリンのＩＣ_５０値がそれぞれ約０．１ｍＭおよび約１ｍＭであったことを示した。以前に、これらの化合物はＤＰＰＩ活性を調節することが示されていない。

本出願は、ＤＰＰＩ基質として標識を含まないペプチドを好ましく使用するＤＰＰＩ活性のアッセイ方法を提供する。該方法は、一般に使用される標識ジペプチド基質と比較していくつかの利点を有する。例えば、標識を含まない基質は改変されない化合物の直接検出を提供し、ならびに標識および二次検出系による制限を排除する。また、標識を含まない基質はハイスループット形式に容易に適合される。加えて、該ペプチド基質は細胞中の生理学的標的のものと類似の、ＤＰＰＩ活性部位に対する結合特異性を有する。さらに、増大される結合特異性は、活性部位のＳ_１−Ｓ_２領域の外側を結合する化合物を評価若しくは同定することを見込む。該化合物はＳ_１−Ｓ_２に加えてＳ_１’ないしＳ_４’のような活性部位に結合し、対数的におよび特異性を増大する。

Claims (10)

1. ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）活性を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
   ａ．ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）および前記化合物を含んでなる反応混合物にＤＰＰＩの基質を添加する段階であって、ＤＰＰＩの前記基質は最低３アミノ酸を含んでなりかつＳ_１−Ｓ_２部位に加えてＤＰＰＩの１結合部位に結合し；ならびに
   ｂ．前記基質および生成物の分子量および／若しくは質量比の変化を測定する段階
   を含んでなり、
   前記基質の分子量の減少が前記ＤＰＰＩ活性の存在を示す、上記方法。
2. 前記基質が標識を含まない、請求項１に記載の方法。
3. 前記基質が３から１００までのアミノ酸を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記基質が約１０から約５０までのアミノ酸を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記基質が配列番号１〜７より成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記基質が配列番号１である、請求項１に記載の方法。
7. 前記化合物が２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）フェノールである、請求項１に記載の方法。
8. 前記化合物が２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）アニリンである、請求項１に記載の方法。
9. 配列番号１〜７より成る群から選択されるＤＰＰＩ基質。
10. 配列番号１のＤＰＰＩ基質。

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