JP2015031538A

JP2015031538A - Separation method of fat-soluble material by pseudo-moving bed chromatography using normal phase column, and device therefor

Info

Publication number: JP2015031538A
Application number: JP2013159634A
Authority: JP
Inventors: 芳雄清水; Yoshio Shimizu; 宏田畑; Hiroshi Tabata; 万倉　三正; Mitsumasa Manso; 三正万倉
Original assignee: Bizen Chemical Co Ltd
Current assignee: Bizen Chemical Co Ltd
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-02-16

Abstract

【課題】既存の不飽和脂肪酸精製法における課題を解決し、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置を提供すること。
【解決手段】シリカゲル、硝酸銀含浸ゲル、および、ポリマーゲルからなる群から選択される少なくとも２種類のゲルを充填したカラム、好ましくは、少なくとも３本の硝酸銀含浸ゲルカラムおよび少なくとも１本のシリカゲルカラムを備えるＳＭＢクロマトグラフィーを用いる分離法および装置を提供することによって、上記課題は、解決された。
【選択図】なしAn object of the present invention is to provide a highly efficient unsaturated fatty acid purification method and apparatus for solving the problems in the existing unsaturated fatty acid purification method.
A column packed with at least two kinds of gels selected from the group consisting of silica gel, silver nitrate-impregnated gel, and polymer gel, preferably, at least three silver nitrate-impregnated gel columns and at least one silica gel column are provided. The above problems have been solved by providing a separation method and apparatus using SMB chromatography.
[Selection figure] None

Description

本発明は、シリカゲルカラムを用いる擬似移動層クロマトグラフィーによる分離精製法ならびにそのための装置に関する。より具体的には、シリカゲルカラムおよび硝酸銀含浸ゲルカラムを用いる擬似移動層による分離精製法ならびにそのための装置に関する。 The present invention relates to a separation and purification method by simulated moving bed chromatography using a silica gel column and an apparatus therefor. More specifically, the present invention relates to a separation and purification method using a pseudo moving bed using a silica gel column and a silver nitrate-impregnated gel column, and an apparatus therefor.

不飽和脂肪酸類は、分子量、化学的性質が類似するため、相互に分離・精製することが難しい。従来より脂肪酸あるいはモノエステルの混合物から特定の脂肪酸を分離する方法としては、主として沸点の差、分子量の差、溶解度の差が利用されてきた。例えば、蒸留、分子ふるい、および、超臨界流体抽出が知られている。また二重結合数による分離法としては、ウインタリング、尿素付加、銀錯体形成、および、溶剤分別が挙げられる。 Unsaturated fatty acids are difficult to separate and purify from each other because of their similar molecular weight and chemical properties. Conventionally, as a method for separating a specific fatty acid from a mixture of fatty acids or monoesters, a difference in boiling point, a difference in molecular weight, and a difference in solubility have been mainly used. For example, distillation, molecular sieving, and supercritical fluid extraction are known. Examples of the separation method based on the number of double bonds include wintering, urea addition, silver complex formation, and solvent fractionation.

さらに銀イオン処理樹脂（非特許文献１）やＣ１８充填剤を用いたクロマト法などがあるが、簡便である一方で分離が不十分であったり、高度精製は可能であるものの、工業的な大量処理には不向きであるなど、それぞれ一長一短がある。以下にこれまで不飽和脂肪酸およびその誘導体の精製に用いられてきた技術の課題について記載する。代表的な分離・精製法としては、例えば、（１）真空精密蒸留法、（２）分子蒸留法、（３）尿素付加法、（４）硝酸銀処理法、（５）固定層方式クロマトグラフィー、および、（６）擬似移動層クロマトグラフィーが挙げられる。各方法の特徴と課題は、以下のとおりである。
（１）真空精密蒸留法
特徴：各成分の沸点差を利用して分離する方法である。
課題：熱変性が有りうる。高純度品を精製する際に長時間がかかる。
（２）分子蒸留法
特徴：蒸留の際に熱的影響が少ない。
課題：分離能が低い。
（３）尿素付加法
特徴：溶解した尿素が結晶化する際に直鎖の分子を取り込みながら、六角柱状の付加物結晶を形成する性質を利用。
課題：選択性が低い。尿素付加物の派生による廃棄物処理。
（４）硝酸銀処理法
特徴：脂肪酸の二重結合に対して硝酸銀溶液が錯体を形成する性質を利用。
課題：銀の価格が不安定。夾雑物を抱き込む。
（５）固定層クロマトグラフィー
特徴：熱的影響が少ない。高精度な分離が可能。
課題：溶離液の使用量が多い。工業的な製造には向かない。
（６）擬似移動層クロマトグラフィー
特徴：溶離液の使用量が少なく、連続操作のため工業化に向いている。
課題：不飽和脂肪酸の分離によく用いられるＣ１８充填剤が高価である。単一溶媒しか使用できないので、グラジエントで分離ができない。 Further, there are a chromatographic method using a silver ion-treated resin (Non-patent Document 1) or a C18 filler, but although it is simple and insufficiently separated or highly purified, it is industrially large There are merits and demerits, such as being unsuitable for processing. The technical problems that have been used to purify unsaturated fatty acids and their derivatives are described below. Representative separation / purification methods include, for example, (1) vacuum precision distillation method, (2) molecular distillation method, (3) urea addition method, (4) silver nitrate treatment method, (5) fixed bed chromatography. And (6) simulated moving bed chromatography. The features and problems of each method are as follows.
(1) Features of vacuum precision distillation method: A method of separation utilizing the difference in boiling point of each component.
Problem: There may be heat denaturation. It takes a long time to purify high purity products.
(2) Features of molecular distillation method: There is little thermal influence during distillation.
Challenge: Low resolution.
(3) Urea addition method features: Utilizes the property of forming hexagonal columnar adduct crystals while taking in linear molecules when dissolved urea crystallizes.
Challenge: Low selectivity. Waste treatment by derivation of urea adducts.
(4) Silver nitrate treatment method characteristics: Utilizes the property that a silver nitrate solution forms a complex with respect to a double bond of a fatty acid.
Challenge: Silver prices are unstable. Embrace foreign objects.
(5) Fixed-layer chromatography Features: Little thermal influence. High precision separation is possible.
Problem: A large amount of eluent is used. Not suitable for industrial production.
(6) Pseudo moving bed chromatography characteristics: The amount of eluent used is small and suitable for industrialization because of continuous operation.
Problem: C18 fillers often used to separate unsaturated fatty acids are expensive. Since only a single solvent can be used, it cannot be separated by a gradient.

擬似移動層（以下「ＳＭＢ」ともいう）クロマトグラフィーは、従来の固定層カラム方式と異なり溶離液の使用量が少なく、連続操作が可能であることから工業的なクロマト精製によく利用されている。例えば、ｐ−キシレンはＳＭＢにより５０万ｔ／年製造されている。 Simulated moving bed (hereinafter also referred to as “SMB”) chromatography is often used for industrial chromatographic purification because it uses a small amount of eluent and can be operated continuously unlike the conventional fixed bed column method. . For example, p-xylene is produced by SMB at 500,000 t / year.

一般的に、グラジエントを利用することによって、経時的に溶出条件を変化させることが可能であり、その結果、各成分間の分離が改善され、かつ、溶出までの時間が短縮される。しかしながらＳＭＢクロマトグラフィーでは、単一のカラムクロマトグラフィーにおいて行われるような異なる溶媒の割合を一定時間で変化させるグラジエントを利用することができず、単一の溶離液しか利用できない。 In general, by using a gradient, it is possible to change elution conditions over time. As a result, separation between components is improved and time until elution is shortened. However, in SMB chromatography, it is not possible to use a gradient that changes the proportion of different solvents over a period of time as is done in single column chromatography, and only a single eluent can be used.

エイコサペンタエン酸エチルエステル（以下ＥＰＡエチル）の精製技術として、例えば特許文献１及び２では、不飽和脂肪酸およびその誘導体の工業的に優れた精製技術としてＳＭＢクロマトグラフィーが挙げられている。ＳＭＢクロマトグラフィーは、原料を連続的に供給しながらカラム吸着剤の層に形成される各画分の分布を定常状態に保つことにより目的成分である高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を連続的に取り出すことができる。 As a purification technique of eicosapentaenoic acid ethyl ester (hereinafter, EPA ethyl), for example, Patent Documents 1 and 2 mention SMB chromatography as an industrially excellent purification technique for unsaturated fatty acids and derivatives thereof. SMB chromatography continuously removes polyunsaturated fatty acids and their derivatives, which are target components, by keeping the distribution of each fraction formed in the column adsorbent layer in a steady state while continuously supplying raw materials. be able to.

高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を分離する際に、カラム充填剤はＣ１８シリカゲルを使用することが多いが分離性能に対して高価であり工業化において更なる性能の向上が課題となる。 When separating highly unsaturated fatty acids and derivatives thereof, C18 silica gel is often used as the column filler, but it is expensive for separation performance, and further improvement in performance becomes a problem in industrialization.

そこで、既存の不飽和脂肪酸精製法における課題を解決し、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置が求められている。 Therefore, there is a need for a highly efficient method for purifying unsaturated fatty acids and an apparatus therefor that solve the problems in existing methods for purifying unsaturated fatty acids.

また、近年、不飽和脂肪酸は必須脂肪酸としてサプリメントで注目されているだけでなく、特にＥＰＡエチルがスイッチＯＴＣとして閉塞性動脈硬化症、高脂血症治療薬として認可を受けたため、医薬品グレードのＥＰＡエチルの市場が拡大している。 In recent years, unsaturated fatty acids are not only attracting attention as supplements as essential fatty acids, but also because EPA ethyl has been approved as a therapeutic agent for obstructive arteriosclerosis and hyperlipidemia as a switch OTC. The ethyl market is expanding.

特表２０１３−５１６３９８Special table 2013-516398 特開平８−２１８０９１JP-A-8-218091

大瀧伸行：The Chemical Times, No.3(通巻213号)(2009)Nobuyuki Otsuki: The Chemical Times, No.3 (Vol.213) (2009)

既存の不飽和脂肪酸精製法における課題を解決し、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置を提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to provide a highly efficient unsaturated fatty acid purification method and an apparatus therefor by solving the problems in existing unsaturated fatty acid purification methods.

また、高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を分離する際に、カラム充填剤はＯＤＳシリカゲルを使用することが多いが分離性能に対して高価であることから、比較的安価な不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置を提供すること、並びに、分離性能の向上を課題とする。 In addition, when separating highly unsaturated fatty acids and derivatives thereof, ODS silica gel is often used as a column filler, but it is expensive for separation performance. It is an object of the present invention to provide an apparatus and to improve separation performance.

本発明は、魚油、藻類の抽出油、遺伝子組み換え植物からの抽出油などの動植物および微生物油脂由来の高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からの精製技術、特に医薬品グレードの製品を工業的に安価に製造する方法を提供する。 INDUSTRIAL APPLICABILITY INDUSTRIALLY PRODUCING PURIFICATION TECHNIQUES FROM POLY-UNSATURATED FATTY ACIDS AND DERIVATIVES DERIVED FROM AN ANIMALS AND PLANTS AND MICROBIO FATS AND ITS such as Fish Oil, Algal Extract Oils, Extract Oils From Genetically Modified Plants Provide a way to do it.

本発明では、ＳＭＢクロマトグラフィーにおいて、複数種類のカラムを同時に用いることによって、上記課題が解決された。 In the present invention, the above-mentioned problems have been solved by using a plurality of types of columns simultaneously in SMB chromatography.

例えば、本発明では、ＳＭＢクロマトグラフィーにおいて、複数のシリカゲルカラムと、１本以上の硝酸銀含浸担体を含むカラムとを用いる。溶離液としては、例えば、順相系（ｎ−ヘキサン）を用いることができるが、これに限定されない。 For example, in the present invention, a plurality of silica gel columns and a column containing one or more silver nitrate impregnated carriers are used in SMB chromatography. As the eluent, for example, a normal phase system (n-hexane) can be used, but is not limited thereto.

本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）第１の担体を充填した順相カラム、および、第１の担体とは異なる第２の担体を充填した順相カラムを含む少なくとも４本のカラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン；
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
（項目２）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）第１の担体を充填したカラム、および、第１の担体とは異なる第２の担体を充填したカラムを含む少なくとも４本のカラムであって、ここで、第１の担体および第２の担体が、シリカゲル、硝酸銀含浸ゲル、および、ポリマーゲルからなる群から選択される、カラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン；
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
（項目３）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）硝酸銀含浸ゲルを担体として充填した少なくとも１本のカラム、および、シリカゲルを担体として充填した少なくとも１本のカラムを含む、少なくとも４本のカラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン；
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
（項目４）
前記ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、少なくとも２本の硝酸銀含浸ゲルを担体として充填したカラム、および、少なくとも２本のシリカゲルを担体として充填したカラムを備える、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、少なくとも１本の硝酸銀含浸ゲルを担体として充填したカラム、および、少なくとも３本のシリカゲルを担体として充填したカラムを備える、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記試料が、蒸留した試料である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記脂溶性物質が、脂肪酸または脂肪酸誘導体である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記脂溶性物質が、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールエステルからなる群から選択される、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）第１の担体を充填した順相カラム、および、第１の担体とは異なる第２の担体を充填した順相カラムを含む少なくとも４本のカラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
（項目１０）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）第１の担体を充填したカラム、および、第１の担体とは異なる第２の担体を充填したカラムを含む少なくとも４本のカラムであって、ここで、第１の担体および第２の担体が、シリカゲル、硝酸銀含浸ゲル、および、ポリマーゲルからなる群から選択される、カラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
（項目１１）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）硝酸銀含浸ゲルを担体として充填した少なくとも１本のカラム、および、シリカゲルを担体として充填した少なくとも１本のカラムを含む、少なくとも４本のカラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン；
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
（項目１２）
前記装置が、少なくとも２本の硝酸銀含浸ゲルを担体として充填したカラム、および、少なくとも２本のシリカゲルを担体として充填したカラムを備える、項目１１に記載の装置。
（項目１３）
前記装置が、少なくとも１本の硝酸銀含浸ゲルを担体として充填したカラム、および、少なくとも３本のシリカゲルを担体として充填したカラムを備える、項目１１に記載の装置。 The present invention provides, for example:
(Item 1)
A method for separating a fat-soluble substance using SMB chromatography,
Here, an apparatus for performing separation by the SMB chromatography is as follows:
(1) a normal phase column packed with a first carrier, and at least four columns including a normal phase column packed with a second carrier different from the first carrier; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting the columns;
Prepared,
Here, the method is as follows:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Where the first to fourth circulation lines are downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and A method of arranging in order of the fourth circulation line.
(Item 2)
A method for separating a fat-soluble substance using SMB chromatography,
Here, an apparatus for performing separation by the SMB chromatography is as follows:
(1) At least four columns including a column packed with a first carrier and a column packed with a second carrier different from the first carrier, wherein the first carrier and the second column The column is selected from the group consisting of silica gel, silver nitrate impregnated gel, and polymer gel; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting the columns;
Prepared,
Here, the method is as follows:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Where the first to fourth circulation lines are downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and A method of arranging in order of the fourth circulation line.
(Item 3)
A method for separating a fat-soluble substance using SMB chromatography,
Here, an apparatus for performing separation by the SMB chromatography is as follows:
(1) at least four columns comprising at least one column packed with a silver nitrate impregnated gel as a carrier and at least one column packed with silica gel as a carrier; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting the columns;
Prepared,
Here, the method is as follows:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Where the first to fourth circulation lines are downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and A method of arranging in order of the fourth circulation line.
(Item 4)
Item 4. The method according to Item 3, wherein the apparatus for performing separation by SMB chromatography comprises a column packed with at least two silver nitrate-impregnated gels as a carrier and a column packed with at least two silica gels as a carrier.
(Item 5)
Item 4. The method according to Item 3, wherein the apparatus for performing separation by SMB chromatography comprises a column packed with at least one silver nitrate-impregnated gel as a carrier and a column packed with at least three silica gels as a carrier.
(Item 6)
The method according to any one of items 1 to 3, wherein the sample is a distilled sample.
(Item 7)
Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the fat-soluble substance is a fatty acid or a fatty acid derivative.
(Item 8)
Any one of Items 1 to 3, wherein the fat-soluble substance is selected from the group consisting of α-linolenic acid, stearidonic acid, docosapentaenoic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, and lower alcohol esters thereof. The method according to one item.
(Item 9)
Separation apparatus for fat-soluble substances using SMB chromatography, comprising:
(1) a normal phase column packed with a first carrier, and at least four columns including a normal phase column packed with a second carrier different from the first carrier; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting between columns are provided,
Where the device is:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Wherein the first circulation line to the fourth circulation line are arranged downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the A device arranged in the order of the third circulation line and the fourth circulation line.
(Item 10)
Separation apparatus for fat-soluble substances using SMB chromatography, comprising:
(1) At least four columns including a column packed with a first carrier and a column packed with a second carrier different from the first carrier, wherein the first carrier and the second column The column is selected from the group consisting of silica gel, silver nitrate impregnated gel, and polymer gel; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting between columns are provided,
Where the device is:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Wherein the first circulation line to the fourth circulation line are arranged downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the A device arranged in the order of the third circulation line and the fourth circulation line.
(Item 11)
Separation apparatus for fat-soluble substances using SMB chromatography, comprising:
(1) at least four columns comprising at least one column packed with a silver nitrate impregnated gel as a carrier and at least one column packed with silica gel as a carrier; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting the columns;
Prepared,
Where the device is:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Wherein the first circulation line to the fourth circulation line are arranged downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the A device arranged in the order of the third circulation line and the fourth circulation line.
(Item 12)
12. The apparatus according to item 11, wherein the apparatus comprises a column packed with at least two silver nitrate-impregnated gels as a carrier and a column packed with at least two silica gels as a carrier.
(Item 13)
12. The apparatus according to item 11, wherein the apparatus comprises a column packed with at least one silver nitrate-impregnated gel as a carrier and a column packed with at least three silica gels as a carrier.

本発明にしたがって、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置が提供される。 In accordance with the present invention, a highly efficient unsaturated fatty acid purification process and apparatus therefor are provided.

図１は、ＳＭＢクロマトグラフィーの模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram of SMB chromatography.

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。 The present invention will be described below. Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。 (Definition of terms)
Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.

本明細書において使用される用語「ＳＭＢクロマトグラフィー」とは、クロマトグラフィーの原理を利用する分離法であって、原料中の特定の成分と、別の特定の成分に対して異なる選択的吸着能力を有する吸着剤が充填された複数の単位充填層を直列に連結するとともに、最下流部の単位充填層と最上流部の単位充填層とを連結し、無端状の循環系を形成した移動層をいう。 As used herein, the term “SMB chromatography” refers to a separation method that utilizes the principle of chromatography and that has different selective adsorption capacities for a particular component in a feed and another particular component. A plurality of unit packed beds filled with an adsorbent having a flow rate are connected in series, and the most downstream unit packed bed and the most upstream unit packed bed are connected to form an endless circulation system. Say.

本明細書において使用される用語「原料の供給口」とは、ＳＭＢクロマトグラフィーに供される原料の供給口をいう。本明細書において使用される用語「成分抜き出し位置」とは、ＳＭＢクロマトグラフィーに供された溶液のカラムからの出口をいう。 The term “raw material supply port” used herein refers to a raw material supply port used for SMB chromatography. As used herein, the term “component extraction position” refers to an outlet from a column of a solution subjected to SMB chromatography.

本明細書において使用される用語「上流」とは、溶離液が流れ込む側をいい、用語「下流」とは、溶離液が流れ出す側をいう。 As used herein, the term “upstream” refers to the side from which the eluent flows, and the term “downstream” refers to the side from which the eluent flows.

本明細書において使用される用語「循環ライン」とは、隣接するカラムを連結する部分をいう。循環ラインは、上流の成分抜き出し位置と下流の原料の供給口とを連結するか、あるいは、最下流の成分抜き出し位置と最上流の原料の供給口とを連結する。 As used herein, the term “circulation line” refers to a portion connecting adjacent columns. The circulation line connects the upstream component extraction position and the downstream raw material supply port, or connects the most downstream component extraction position and the upstream raw material supply port.

本明細書において使用される用語「循環ラインを切り替える」とは、上流から下流にカラムＡ−カラムＢ−カラムＣ−カラムＤの順番で隣接する一連のカラムにおいて、カラムＢの出口とカラムＣの入口を連結する循環ラインを、（ｉ）カラムＡの出口とカラムＢの入口を連結する循環ラインとするか、または、（ｉｉ）カラムＣの出口とカラムＤの入口を連結する循環ラインとするかのいずれかをいう。 As used herein, the term “switching the circulation line” refers to the column B, the column B, the column C, and the column D adjacent to each other in the order of column A-column B-column C-column D. The circulation line connecting the inlets is (i) a circulation line connecting the outlet of the column A and the inlet of the column B, or (ii) a circulation line connecting the outlet of the column C and the inlet of the column D. Any one of them.

本明細書において使用される用語「順相カラム」とは、固定相の極性が移動相の極性より高い分離系で使用されるカラムをいう。代表的な順相カラムとしては、シリカゲルカラムが挙げられるがこれらに限定されない。 As used herein, the term “normal phase column” refers to a column used in a separation system where the polarity of the stationary phase is higher than the polarity of the mobile phase. A typical normal phase column includes, but is not limited to, a silica gel column.

本明細書において使用される用語「シリカゲルカラム」とは、シリカゲルを担体とするクロマトグラフィーカラムをいう。シリカゲルカラムは安価であり、溶離液に極性の低い溶媒を用いるため、魚油を原料とする場合には、溶離液を回収して繰り返し使用する際に、魚油から発生する匂いの原因となる極性の高い物質を回収時に取り込まないため、溶離液として品質の劣化が少なく長期に渡って使用できる。 As used herein, the term “silica gel column” refers to a chromatography column using silica gel as a carrier. Silica gel columns are inexpensive and use a low-polarity solvent as the eluent, so when fish oil is used as a raw material, the polarity of the oil that causes odors generated from fish oil when the eluate is recovered and used repeatedly Since high substances are not taken in at the time of recovery, it can be used as an eluent for a long time with little deterioration in quality.

本明細書において使用される用語「硝酸銀含浸ゲル」とは、「硝酸銀含浸担体」と互換可能に使用され、硝酸銀を吸着させたゲルをいう。硝酸銀含浸ゲルは、代表的には、硝酸銀を含浸させたシリカゲルである。本発明において使用する硝酸銀含浸ゲルの担体としては、シリカゲル、ポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。硝酸銀含浸ゲルは担持された銀イオンが、二重結合を持つ分子と錯体を形成することで、ゲルに保持される。保持される強さは二重結合の数に依存するため、不飽和脂肪酸を吸着またはクロマトグラフィーにて分離精製する際に効果的なゲルである。 As used herein, the term “silver nitrate-impregnated gel” is used interchangeably with “silver nitrate-impregnated carrier” and refers to a gel on which silver nitrate is adsorbed. The silver nitrate-impregnated gel is typically silica gel impregnated with silver nitrate. Examples of the carrier of the silver nitrate-impregnated gel used in the present invention include, but are not limited to, silica gel and polymer. In the silver nitrate-impregnated gel, the supported silver ions form a complex with a molecule having a double bond, so that the gel is held in the gel. Since the strength to be retained depends on the number of double bonds, it is an effective gel for separating and purifying unsaturated fatty acids by adsorption or chromatography.

本発明において使用するＳＭＢクロマトグラフィーは、好ましくは、１本以上の硝酸銀含浸ゲル、および、１本以上のシリカゲルカラムを含む。両者の好ましい組み合わせの比率として硝酸銀含浸カラム：シリカゲルカラム＝３：１〜１２が挙げられる。 The SMB chromatography used in the present invention preferably comprises one or more silver nitrate impregnated gels and one or more silica gel columns. As a ratio of a preferable combination of both, silver nitrate impregnated column: silica gel column = 3: 1 to 12 can be mentioned.

本発明のＳＭＢクロマトグラフィーに供する原料に用いる溶媒は、カラムクロマトグラフィーに供することができる液体である限り、あらゆる純度の液体を使用してもよい。例えば、原料から抽出した液体について、真空精密蒸留、ろ過、尿素処理、硝酸銀処理、および、固定層クロマトグラフィーからなる群から選択される方法によって目的脂肪酸を一部濃縮した液体を原料として使用することができる。用いる原料は遊離型脂肪酸又はエタノールやメタノールなどの低級アルコールエステルであることが望ましい。原料が固体の場合はメタノール、エタノール、ヘキサンなどの溶媒で溶解して用いる。 As long as the solvent used for the raw material used for the SMB chromatography of the present invention is a liquid that can be used for column chromatography, a liquid of any purity may be used. For example, for a liquid extracted from a raw material, a liquid obtained by partially concentrating the target fatty acid by a method selected from the group consisting of vacuum precision distillation, filtration, urea treatment, silver nitrate treatment, and fixed bed chromatography is used as the raw material. Can do. The raw material used is preferably a free fatty acid or a lower alcohol ester such as ethanol or methanol. When the raw material is a solid, it is dissolved in a solvent such as methanol, ethanol or hexane.

本願明細書で使用する場合、「真空精密蒸留」とは、ＥＰＡの場合、ＥＰＡを含む炭素数が２０の成分は魚油脂肪酸の中でほぼ中間の沸点に位置しており、バッチ式の場合、単塔式蒸留装置を用いる事が、連続蒸留の場合、二塔式装置ないしは四塔式装置が必要となる。二塔式であればＣ１９以下の成分（初留）を留出させ、その残留分を第二塔に送りＣ２０成分を（主留）を分取することをいう。 As used herein, “vacuum precision distillation” means that, in the case of EPA, the component having 20 carbon atoms including EPA is located at an approximately boiling point in the fish oil fatty acid. In the case of continuous distillation using a single tower distillation apparatus, a two tower apparatus or a four tower apparatus is required. In the case of the two-column system, this means that the component (first fraction) of C19 or less is distilled, the residue is sent to the second column, and the component C20 (main fraction) is fractionated.

本願明細書で使用する場合、「ろ過」とは、フィルターおよび／または吸着剤による原料の脱色や、過酸化物の除去をする方法をいう。代表的には、窒素雰囲気下で原料と吸着剤を混合・撹拌し、フィルタープレスにより吸着剤を除く方法をいう。本発明の方法においては、好ましい吸着剤としてシリカゲル、活性白土、活性炭、ゼオライトが挙げられるがこの限りではない。 As used herein, “filtration” refers to a method of decolorizing a raw material with a filter and / or an adsorbent and removing a peroxide. Typically, it refers to a method in which a raw material and an adsorbent are mixed and stirred in a nitrogen atmosphere and the adsorbent is removed by a filter press. In the method of the present invention, preferred adsorbents include, but are not limited to, silica gel, activated clay, activated carbon, and zeolite.

本願明細書で使用する場合、「尿素処理」とは、原料と尿素メタノール溶液を混合し冷却、飽和脂肪酸やモノ不飽和脂肪酸を取り込んだ尿素付加物を形成させ、これをろ別する方法をいう。代表的には、尿素付加物からｎ−ヘキサンにて抽出し、シリカゲル処理の後、ｎ−ヘキサンを留去して目的の不飽和脂肪酸を得る方法をいう。 As used herein, “urea treatment” refers to a method in which a raw material and a urea methanol solution are mixed and cooled to form a urea adduct incorporating saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids, and this is filtered. . Typically, it refers to a method of extracting the urea adduct with n-hexane, treating with silica gel, and then distilling off n-hexane to obtain the desired unsaturated fatty acid.

本願明細書で使用する場合、「硝酸銀処理」とは、高度不飽和脂肪酸エチルの場合、原料と硝酸銀溶液を撹拌し、未反応エステルを例えばｎ−ヘキサン抽出した後水層を希釈または加温、遊離したエステルを再度ｎ−ヘキサン抽出することにより目的の高度不飽和脂肪酸エチルの濃縮を行う方法をいう。 As used herein, “silver nitrate treatment” means, in the case of highly unsaturated fatty acid ethyl, the raw material and the silver nitrate solution are stirred and the unreacted ester is extracted, for example, by n-hexane, and then the aqueous layer is diluted or heated. It refers to a method of concentrating the target highly unsaturated fatty acid ethyl by extracting the liberated ester again with n-hexane.

本願明細書で使用する場合、「固定層クロマトグラフィー」とは、カラムに充填剤を詰め、原料を溶離液で通過させることにより目的の成分を含む画分を取り出し、濃縮する方法をいう。本発明の方法においては、好ましい充填剤としてシリカゲル、逆層シリカゲル、硝酸銀含浸シリカゲルが挙げられるがこの限りではない。 As used herein, “fixed bed chromatography” refers to a method in which a column is filled with a packing material, a raw material is passed through an eluent, and a fraction containing a target component is taken out and concentrated. In the method of the present invention, preferred fillers include, but are not limited to, silica gel, reverse layer silica gel, and silver nitrate impregnated silica gel.

本明細書において使用される用語「溶離液」とは、溶離液供給口Ｄを通じて供給される溶液である。使用するゲルおよび分離対象である物質に応じて、当業者は、容易に溶離液を決定することが可能である。シリカゲルカラムを用いて脂溶性物質を分離する場合に使用可能な溶離液としては、極性の低い溶媒が一般的に用いられ、代表的には、ｎ−ヘキサン、塩化メチレン、ベンゼン、シクロヘキサン、トルエンが挙げられるがこれらに限定されない。 As used herein, the term “eluent” is a solution supplied through an eluent supply port D. Depending on the gel to be used and the substance to be separated, those skilled in the art can easily determine the eluent. As an eluent that can be used when a fat-soluble substance is separated using a silica gel column, a solvent having a low polarity is generally used. Typically, n-hexane, methylene chloride, benzene, cyclohexane, and toluene are used. Although it is mentioned, it is not limited to these.

本明細書において使用される用語「脂溶性物質」とは、ｎ−ヘキサン又はエタノールなどの有機溶媒に溶解する化合物をいう。脂溶性物質としては、例えば、脂肪酸またはその誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明における「脂溶性物質」としては、例えば、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸等のω３系脂肪酸類またはそれらのメタノールやエタノールの低級アルコールエステル、並びにγ−リノレン酸、アラキドン酸等のω６系脂肪酸またはそれらのメタノールやエタノールの低級アルコールエステルが挙げられるがこれらに限定されない。 The term “fat-soluble substance” as used herein refers to a compound that is soluble in an organic solvent such as n-hexane or ethanol. Examples of the fat-soluble substance include, but are not limited to, fatty acids or derivatives thereof. Examples of the “fat-soluble substance” in the present invention include α-linolenic acid, stearidonic acid, docosapentaenoic acid, eicosapentaenoic acid, and ω3 fatty acids such as docosahexaenoic acid or their lower alcohol esters of methanol or ethanol. And ω6 fatty acids such as γ-linolenic acid and arachidonic acid or their lower alcohol esters of methanol or ethanol, but are not limited thereto.

本明細書において使用される用語「低級アルコールエステル」とは、脂肪酸またはその誘導体と低級アルコールとのエステルをいう。本明細書において使用される用語「低級アルコール」とは、炭素数１０以下の直鎖または分岐の任意のアルコールをいう。 As used herein, the term “lower alcohol ester” refers to an ester of a fatty acid or derivative thereof and a lower alcohol. As used herein, the term “lower alcohol” refers to any linear or branched alcohol having 10 or less carbon atoms.

（ＳＭＢクロマトグラフィー）
ＳＭＢクロマトグラフィーでは、無端状の循環系に対して原料と溶離液とを供給し、カラム内（単位充填層）を高速で移動するＸ成分（すなわち、弱親和性成分）と、カラム内を低速で移動するＹ成分（すなわち、親和性成分）とをそれぞれ異なる位置から抜き出す。そして、ＳＭＢクロマトグラフィーは、原料供給位置、溶離液供給位置、Ｘ成分抜き出し位置、およびＹ成分抜き出し位置を、一定の位置関係に保ちながら流体循環方向下流側に順次移動させることで、原料供給を連続的に行う処理操作を擬似的に実現する。その結果、層内での各成分の分布状態はほぼ一定の幅で移動し、各成分の抜き出し位置も、純度・濃度ともに高い部分を取り続けることが可能な操作方式である。 (SMB chromatography)
In SMB chromatography, raw materials and eluent are supplied to an endless circulation system, and the X component (that is, the weak affinity component) that moves at high speed in the column (unit packed bed) and the column within the column at low speed The Y component (that is, the affinity component) that moves is extracted from different positions. The SMB chromatography sequentially moves the raw material supply position, the eluent supply position, the X component extraction position, and the Y component extraction position downstream in the fluid circulation direction while maintaining a fixed positional relationship. A processing operation performed continuously is realized in a pseudo manner. As a result, the distribution state of each component in the layer moves with a substantially constant width, and the extraction position of each component is an operation method that can continue to take a portion with high purity and concentration.

例示的なＳＭＢクロマトグラフィーを図１に示す。カラム１〜４を循環ラインで接続し、各カラム間の循環ラインに原料供給口Ｆ、溶離液供給口Ｄ、親和性成分の抜き出し口Ａ、弱親和性成分の抜き出し口Ｂを設け、循環する流れの方向に一定時間ごとに順次バルブを切り替えていく（すなわち、循環ラインを切り替えていく）。 An exemplary SMB chromatography is shown in FIG. Columns 1 to 4 are connected by a circulation line, and a raw material supply port F, an eluent supply port D, an affinity component extraction port A, and a weak affinity component extraction port B are provided in the circulation line between the columns to circulate. The valves are sequentially switched in the flow direction at regular intervals (that is, the circulation line is switched).

例えば、原料供給口Ｆから供給された原料は、溶離液供給口Ｄから供給された溶離液のために、カラム３からカラム２に向かって移動する。その際、弱親和性成分であるＸ成分は、カラムに対する親和性が弱いため、より高速でカラムを移動する。逆に、親和性成分であるＹ成分は、カラムに対する親和性が強いため、より低速でカラムを移動する。その結果、Ｘ成分およびＹ成分の両者は異なる速度で移動し、その結果、これら両者は分離されていく。Ｘ成分とＹ成分を連続して分離するためには、これら両者の間の位置に原料供給口Ｆを提供する必要がある。Ｙ成分は、Ｘ成分よりも低速でカラムを移動するものの、溶離液供給口Ｄから供給された溶離液のために移動し続けるため、循環する流れの方向に一定時間ごとに順次バルブを切り替え、原料供給口ＦをＸ成分とＹ成分との間に維持する必要がある。すなわち、図１において一定時間経過後に、カラム４をカラム３の位置に移動させ、カラム３をカラム２の位置に移動させ、カラム２をカラム１の位置に移動させ、カラム１をカラム４の位置に移動させる（言い換えると、カラム１とカラム２を連結する循環ラインをカラム２とカラム３を連結する循環ラインに切り替え、カラム２とカラム３を連結する循環ラインをカラム３とカラム４を連結する循環ラインに切り替え、カラム３とカラム４を連結する循環ラインをカラム４とカラム１を連結する循環ラインに切り替え、カラム４とカラム１を連結する循環ラインをカラム１とカラム２を連結する循環ラインに切り替える。）。その結果、原料供給口Ｆは、カラム４とカラム３の間に移動し、弱親和性成分の抜き出し口Ｂは、カラム３とカラム２の間に移動し、溶離液供給口Ｄは、カラム２とカラム１の間に移動し、親和性成分の抜き出し口Ａは、カラム１とカラム４の間に移動する。 For example, the raw material supplied from the raw material supply port F moves from the column 3 toward the column 2 due to the eluent supplied from the eluent supply port D. At that time, the X component, which is a weak affinity component, moves through the column at a higher speed because the affinity for the column is weak. Conversely, the Y component, which is an affinity component, has a strong affinity for the column and therefore moves through the column at a lower speed. As a result, both the X component and the Y component move at different speeds, and as a result, both of them are separated. In order to continuously separate the X component and the Y component, it is necessary to provide the raw material supply port F at a position between them. The Y component moves through the column at a lower speed than the X component, but continues to move for the eluent supplied from the eluent supply port D. Therefore, the valve is sequentially switched every predetermined time in the direction of the circulating flow, It is necessary to maintain the raw material supply port F between the X component and the Y component. That is, after a certain period of time in FIG. 1, the column 4 is moved to the column 3 position, the column 3 is moved to the column 2 position, the column 2 is moved to the column 1 position, and the column 1 is moved to the column 4 position. (In other words, the circulation line connecting column 1 and column 2 is switched to the circulation line connecting column 2 and column 3, and the circulation line connecting column 2 and column 3 is connected to column 3 and column 4. Switch to the circulation line, switch the circulation line that connects column 3 and column 4 to the circulation line that connects column 4 and column 1, and the circulation line that connects column 4 and column 1 to the circulation line that connects column 1 and column 2 Switch to.) As a result, the raw material supply port F moves between the column 4 and the column 3, the weak affinity component extraction port B moves between the column 3 and the column 2, and the eluent supply port D is connected to the column 2. The column A for the affinity component is moved between the column 1 and the column 4.

本発明のＳＭＢクロマトグラフィーでは、４本以上のカラムを用いるが。カラムの本数は特に限定されない。好ましくは、カラムの本数は、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、１２本、１３本、１４本、１５本、１６本、１７本、１８本、１９本、２０本であるが、これらに限定されない。カラム本数を４本よりも多くする場合、原料供給口Ｆと弱親和性成分の抜き出し口Ｂとの間、弱親和性成分の抜き出し口Ｂと溶離液供給口Ｄとの間、溶離液供給口Ｄと親和性成分の抜き出し口Ａとの間、および／または、親和性成分の抜き出し口Ａと原料供給口Ｆとの間に複数本のカラムを備えてもよい。 In the SMB chromatography of the present invention, four or more columns are used. The number of columns is not particularly limited. Preferably, the number of columns is 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 13, 15, 15, 16, 17, Although it is 18, 19, and 20, it is not limited to these. When the number of columns is more than four, between the raw material supply port F and the weak affinity component extraction port B, between the weak affinity component extraction port B and the eluent supply port D, the eluent supply port A plurality of columns may be provided between D and the affinity component extraction port A and / or between the affinity component extraction port A and the raw material supply port F.

（シリカゲルについて）
順相クロマトグラフの担体としてよく利用される。順相クロマトグラフィーとは各成分が充填剤表面において、溶離液の分子と競合しながら吸着され、その内極性の小さいものから溶出させ分離する方式である。よって成分の保持の強さには以下のような傾向がある。またカラム充填剤の中でも最も安価である。
（１）試料分子の二重結合が多いほど保持が強い。
（２）試料分子の分子量が大きいものほど保持が強い。 (About silica gel)
It is often used as a carrier for normal phase chromatography. Normal phase chromatography is a method in which each component is adsorbed on the surface of the filler while competing with the molecules of the eluent, and is eluted and separated from those having a small inner polarity. Therefore, the strength of component retention has the following tendency. It is the cheapest of the column packing materials.
(1) The retention increases as the number of double bonds in the sample molecule increases.
(2) The larger the molecular weight of the sample molecule, the stronger the retention.

（硝酸銀含浸シリカゲルについて）
硝酸銀溶液を通液し、シリカゲル表面に銀イオンを担持させている。この銀イオンと不飽和有機化合物の間に弱い電化移動型錯体を形成する。成分の保持の強さには以下のような傾向がある。
（１）試料分子の二重結合数が多いほど保持が強い。
（２）脂肪酸（およびそのエステル）では、二重結合とカルボニル炭素が近い方が保持が強い。 (About silver nitrate impregnated silica gel)
A silver nitrate solution is passed, and silver ions are supported on the silica gel surface. A weak charge transfer complex is formed between the silver ion and the unsaturated organic compound. The strength of component retention has the following tendency.
(1) The retention increases as the number of double bonds in the sample molecule increases.
(2) In fatty acids (and their esters), the closer the double bond to the carbonyl carbon, the stronger the retention.

以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples and the like, but the present invention is not limited thereto.

（比較例１）
比較例として硝酸銀含浸シリカゲルのみを用いた系について記載する。 (Comparative Example 1)
As a comparative example, a system using only silver nitrate-impregnated silica gel is described.

出発原料として、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂を用いた。原料濃度は２００ｇ／Ｌ（ｎ−ヘキサン溶液）であり、原料供給量は１時間当り充填剤１Ｌ当り１０．５ｍＬ（１０．５ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）であった。カラムとして硝酸銀含浸シリカゲルカラム４本を用いた（カラムサイズ：直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍ）。溶離液としてのn-ヘキサンを、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で用いた。 As a starting material, an oil containing 75% EPA ethyl ester was used. The raw material concentration was 200 g / L (n-hexane solution), and the raw material supply amount was 10.5 mL (10.5 mL / LR / h) per 1 L of filler per hour. Four silver nitrate impregnated silica gel columns were used as columns (column size: diameter 10 mm × height 500 mm). N-Hexane as an eluent was used in an amount of eluent: 400 mL per liter of filler per hour (0.40 L / LR / h).

その結果、純度９６．５％のＥＰＡエチルが得られた。類縁物質として、以下を含んでいた：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．６１％
アラキドン酸エチル：０．７０％
イコサテトラエン酸エチル：０．８６％
その他の不純物：１．３３％
ＥＰＡエチルの回収率は７９％であり、ＰＯＶ（過酸化物価）は１．９であり、ＡＶ（酸価）は０．０３であり、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．５であった。 As a result, EPA ethyl having a purity of 96.5% was obtained. Related substances included the following:
Ethyl octadecatetraenoate: 0.61%
Ethyl arachidonate: 0.70%
Ethicosatetraenoic acid ethyl: 0.86%
Other impurities: 1.33%
The recovery rate of EPA ethyl was 79%, POV (peroxide value) was 1.9, AV (acid value) was 0.03, and AnV (anisidine value) was 0.5.

（実施例１）
硝酸銀含浸シリカゲルカラムとシリカゲルカラムを組み合せて用いた。 Example 1
A combination of a silver nitrate impregnated silica gel column and a silica gel column was used.

出発原料として、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂を用いた。原料濃度は２００ｇ／Ｌ（ｎ−ヘキサン溶液）（すなわち、２５ｗｔ％）であり、原料供給量は１時間当り充填剤１Ｌ当り１６．４ｍＬ（１６．４ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）であった。カラムとして、硝酸銀含浸シリカゲルカラム２本と、シリカゲルカラム４本を用いた（カラムサイズ：直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍ）。溶離液としてのｎ−ヘキサンを、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で用いた。 As a starting material, an oil containing 75% EPA ethyl ester was used. The raw material concentration was 200 g / L (n-hexane solution) (ie, 25 wt%), and the raw material supply amount was 16.4 mL (16.4 mL / L-R / h) per liter of filler per hour. It was. As the column, two silver nitrate impregnated silica gel columns and four silica gel columns were used (column size: diameter 10 mm × height 500 mm). N-Hexane as the eluent was used at a volume of eluent: 400 mL per liter of filler per hour (0.40 L / LR / h).

その結果、純度９８．５％のＥＰＡエチルが得られた。混入類縁物質は、以下のとおりである：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．３０％
アラキドン酸エチル：０．３６％
イコサテトラエン酸エチル：０．５１％
その他の不純物：０．３３％
ＥＰＡエチルの回収率は８９％、ＰＯＶ（過酸化物価）は２．０、ＡＶ（酸価）は０．０４、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．７であった。 As a result, EPA ethyl having a purity of 98.5% was obtained. Contaminating related substances are as follows:
Ethyl octadecatetraenoate: 0.30%
Ethyl arachidonate: 0.36%
Ethicosatetraenoic acid ethyl: 0.51%
Other impurities: 0.33%
The recovery rate of EPA ethyl was 89%, POV (peroxide number) was 2.0, AV (acid number) was 0.04, and AnV (anisidine number) was 0.7.

以上の結果から硝酸銀含浸シリカゲルカラムのみ用いた疑似移動層式クロマトグラフィーと比較すると、原料供給量は約１．５倍以上まで処理可能となった。また分析値から医薬、化粧品、食品分野で利用可能である。よって従来と比較し少ない硝酸銀含浸シリカゲルの充填剤量で医薬品グレードのＥＰＡエチルを製造できることが明らかになった。 From the above results, it was possible to process the raw material supply amount up to about 1.5 times or more compared with the pseudo moving bed chromatography using only the silver nitrate impregnated silica gel column. In addition, it can be used in the fields of medicine, cosmetics and food from the analysis value. Therefore, it was revealed that pharmaceutical grade EPA ethyl can be produced with a smaller amount of filler of silica gel impregnated with silver nitrate than in the past.

（実施例２）
硝酸銀含浸シリカゲルカラムとシリカゲルカラムを実施例１と異なる組み合せで用いた。 (Example 2)
A silver nitrate-impregnated silica gel column and a silica gel column were used in a different combination from Example 1.

出発原料として、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂を用いた。原料濃度は２００ｇ／Ｌ（ｎ−ヘキサン溶液）（すなわち、２５ｗｔ％）であり、原料供給量は１時間当り充填剤１Ｌ当り１６．４ｍＬ（１６．４ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）であった。カラムとして、硝酸銀含浸シリカゲルカラム２本と、シリカゲルカラム２本を用いた（カラムサイズ：直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍ）。溶離液としてのｎ−ヘキサンを、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で用いた。 As a starting material, an oil containing 75% EPA ethyl ester was used. The raw material concentration was 200 g / L (n-hexane solution) (ie, 25 wt%), and the raw material supply amount was 16.4 mL (16.4 mL / L-R / h) per liter of filler per hour. It was. As the columns, two silver nitrate-impregnated silica gel columns and two silica gel columns were used (column size: diameter 10 mm × height 500 mm). N-Hexane as the eluent was used at a volume of eluent: 400 mL per liter of filler per hour (0.40 L / LR / h).

その結果、純度９７．１％のＥＰＡエチルが得られた。混入類縁物質は、以下のとおりである：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．６０％
アラキドン酸エチル：０．５５％
イコサテトラエン酸エチル：０．８９％
その他の不純物：０．８６％
ＥＰＡエチルの回収率は７８％、ＰＯＶ（過酸化物価）は１．８、ＡＶ（酸価）は０．０４、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．７であった。 As a result, EPA ethyl having a purity of 97.1% was obtained. Contaminating related substances are as follows:
Ethyl octadecatetraenoate: 0.60%
Ethyl arachidonate: 0.55%
Ethicosatetraenoic acid ethyl: 0.89%
Other impurities: 0.86%
The recovery rate of EPA ethyl was 78%, POV (peroxide number) was 1.8, AV (acid number) was 0.04, and AnV (anisidine number) was 0.7.

以上の結果から硝酸銀含浸シリカゲルカラムのみ用いた疑似移動層式クロマトグラフィーと比較すると、原料供給量は約１．５倍以上まで処理可能となった。 From the above results, it was possible to process the raw material supply amount up to about 1.5 times or more compared with the pseudo moving bed chromatography using only the silver nitrate impregnated silica gel column.

（実施例３）
硝酸銀含浸シリカゲルカラムとシリカゲルカラムを実施例１と異なる組み合せで用いた。 Example 3
A silver nitrate-impregnated silica gel column and a silica gel column were used in a different combination from Example 1.

出発原料として、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂を用いた。原料濃度は２００ｇ／Ｌ（ｎ−ヘキサン溶液）（すなわち、２５ｗｔ％）であり、原料供給量は１時間当り充填剤１Ｌ当り１３．５ｍＬ（１３．５ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）であった。カラムとして、硝酸銀含浸シリカゲルカラム１本と、シリカゲルカラム３本を用いた（カラムサイズ：直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍ）。溶離液としてのｎ−ヘキサンを、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で用いた。 As a starting material, an oil containing 75% EPA ethyl ester was used. The raw material concentration was 200 g / L (n-hexane solution) (that is, 25 wt%), and the raw material supply amount was 13.5 mL (13.5 mL / L-R / h) per liter of filler per hour. It was. As the column, one silver nitrate impregnated silica gel column and three silica gel columns were used (column size: diameter 10 mm × height 500 mm). N-Hexane as the eluent was used at a volume of eluent: 400 mL per liter of filler per hour (0.40 L / LR / h).

その結果、純度９７．９％のＥＰＡエチルが得られた。混入類縁物質は、以下のとおりである：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．３８％
アラキドン酸エチル：０．４０％
イコサテトラエン酸エチル：０．６７％
その他の不純物：０．６５％
ＥＰＡエチルの回収率は８９％、ＰＯＶ（過酸化物価）は１．７、ＡＶ（酸価）は０．０３、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．７であった。 As a result, EPA ethyl having a purity of 97.9% was obtained. Contaminating related substances are as follows:
Ethyl octadecatetraenoate: 0.38%
Ethyl arachidonate: 0.40%
Ethicosatetraenoate: 0.67%
Other impurities: 0.65%
The recovery rate of EPA ethyl was 89%, POV (peroxide number) was 1.7, AV (acid number) was 0.03, and AnV (anisidine number) was 0.7.

以上の結果から硝酸銀含浸シリカゲルカラムのみ用いた疑似移動層式クロマトグラフィーと比較すると、原料供給量は約１．３倍以上まで処理可能となった。また分析値から医薬、化粧品、食品分野で利用可能である。 From the above results, it was possible to treat the raw material supply amount up to about 1.3 times or more compared with the pseudo moving bed chromatography using only the silver nitrate impregnated silica gel column. In addition, it can be used in the fields of medicine, cosmetics and food from the analysis value.

（シリカゲルと硝酸銀含浸シリカゲルの組み合わせ）
本発明ではＳＭＢクロマトグラフィーに２種類以上の分離性能の異なるカラム充填剤を用いること、特に、シリカゲルカラムと硝酸銀塩含浸シリカゲルカラムとの組み合わせを用いることによって、単一種類のカラム充填剤の使用によっては分離が困難である複数の物質についても、容易かつ簡便に分離が可能となった。また、本発明では、従来のＳＭＢクロマトグラフィーよりも高精度かつ大量に分離（例えば、医薬品グレードまで精製）を行うことを可能とする。また、本発明の一つの局面においては、高精度の分離を短時間で、かつ、安価に終了することも可能である。 (Combination of silica gel and silver nitrate impregnated silica gel)
In the present invention, by using two or more kinds of column fillers having different separation performances in SMB chromatography, in particular, by using a combination of a silica gel column and a silver nitrate-impregnated silica gel column, by using a single kind of column filler. Can easily and easily separate a plurality of substances that are difficult to separate. Moreover, in the present invention, it is possible to perform separation (for example, purification to a pharmaceutical grade) with higher accuracy and in a larger amount than conventional SMB chromatography. In one aspect of the present invention, high-precision separation can be completed in a short time and at a low cost.

理論に拘束されることは望まないが、脂肪酸エステルの保持の強さに関して、シリカゲルよりも硝酸銀含浸シリカゲルの方が強い。そのため分離能力は高いが、その反面各成分が画分として抜け出すまで時間がかかる。よってＳＭＢクロマトグラフィーの全てのカラム充填剤を硝酸銀含浸シリカゲルで行うと、処理能力が課題となる。そのため分離能力は低いが安価で、成分の抜き出しまで時間の短いシリカゲルを併用した。これによりＳＭＢクロマトグラフィーのカラム充填剤として分離能と処理能力の最適な組み合わせを行うことで、従来のシリカゲルのみでは達成できなかった医薬品グレードのＥＰＡエチルの精製と、硝酸銀含浸シリカゲルのみでは課題となる処理能力を向上させ、製造コストの低減に貢献できた。 Although not wishing to be bound by theory, silver nitrate impregnated silica gel is stronger than silica gel in terms of retention of fatty acid esters. Therefore, although the separation ability is high, it takes time until each component comes out as a fraction. Therefore, when all the column packing materials for SMB chromatography are performed with silver nitrate impregnated silica gel, the processing capability becomes a problem. For this reason, silica gel was used in combination with a low separation cost but a low cost and a short time to extract the components. As a result, the optimal combination of separation ability and processing ability as a column packing material for SMB chromatography makes it possible to purify pharmaceutical grade EPA ethyl, which could not be achieved with conventional silica gel alone, and with silver nitrate impregnated silica gel alone. It was possible to improve processing capacity and reduce manufacturing costs.

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ、その範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。 As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, this invention should not be limited and limited to this embodiment. It is understood that the scope of the present invention should be construed only by the claims. It is understood that those skilled in the art can implement an equivalent range based on the description of the present invention and the common general technical knowledge from the description of specific preferred embodiments of the present invention. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.

Claims

A method for separating a fat-soluble substance using SMB chromatography,
Here, an apparatus for performing separation by the SMB chromatography is as follows:
(1) a normal phase column packed with a first carrier, and at least four columns including a normal phase column packed with a second carrier different from the first carrier; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting the columns;
Prepared,
Here, the method is as follows:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Where the first to fourth circulation lines are downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and A method of arranging in order of the fourth circulation line.

A method for separating a fat-soluble substance using SMB chromatography,
Here, an apparatus for performing separation by the SMB chromatography is as follows:
(1) At least four columns including a column packed with a first carrier and a column packed with a second carrier different from the first carrier, wherein the first carrier and the second column The column is selected from the group consisting of silica gel, silver nitrate impregnated gel, and polymer gel; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting the columns;
Prepared,
Here, the method is as follows:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Where the first to fourth circulation lines are downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and A method of arranging in order of the fourth circulation line.

A method for separating a fat-soluble substance using SMB chromatography,
Here, an apparatus for performing separation by the SMB chromatography is as follows:
(1) at least four columns comprising at least one column packed with a silver nitrate impregnated gel as a carrier and at least one column packed with silica gel as a carrier; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting the columns;
Prepared,
Here, the method is as follows:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Where the first to fourth circulation lines are downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and A method of arranging in order of the fourth circulation line.

The method according to claim 3, wherein the apparatus for performing separation by SMB chromatography comprises a column packed with at least two silver nitrate-impregnated gels as a carrier and a column packed with at least two silica gels as a carrier.

The method according to claim 3, wherein the apparatus for performing separation by SMB chromatography comprises a column packed with at least one silver nitrate-impregnated gel as a carrier and a column packed with at least three silica gels as a carrier.

The method according to claim 1, wherein the sample is a distilled sample.

The method according to claim 1, wherein the fat-soluble substance is a fatty acid or a fatty acid derivative.

The fat-soluble substance is selected from the group consisting of α-linolenic acid, stearidonic acid, docosapentaenoic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, and lower alcohol esters thereof. The method according to claim 1.

Separation apparatus for fat-soluble substances using SMB chromatography, comprising:
(1) a normal phase column packed with a first carrier, and at least four columns including a normal phase column packed with a second carrier different from the first carrier; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting between columns are provided,
Where the device is:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Wherein the first circulation line to the fourth circulation line are arranged downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the A device arranged in the order of the third circulation line and the fourth circulation line.

Separation apparatus for fat-soluble substances using SMB chromatography, comprising:
(1) At least four columns including a column packed with a first carrier and a column packed with a second carrier different from the first carrier, wherein the first carrier and the second column The column is selected from the group consisting of silica gel, silver nitrate impregnated gel, and polymer gel; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting between columns are provided,
Where the device is:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Wherein the first circulation line to the fourth circulation line are arranged downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the A device arranged in the order of the third circulation line and the fourth circulation line.

Separation apparatus for fat-soluble substances using SMB chromatography, comprising:
(1) at least four columns comprising at least one column packed with a silver nitrate impregnated gel as a carrier and at least one column packed with silica gel as a carrier; and
(2) The same number of circulation lines as the number of columns connecting the columns;
Prepared,
Where the device is:
(A) supplying the eluent to the first circulation line;
(A) supplying the sample to the third circulation line;
(C) extracting the separation solution from the second circulation line and the fourth circulation line; and
(D) switching the first circulation line, the second circulation line, the third circulation line, and the fourth circulation line;
Wherein the first circulation line to the fourth circulation line are arranged downstream from the upstream, the first circulation line, the second circulation line, the A device arranged in the order of the third circulation line and the fourth circulation line.

The apparatus according to claim 11, wherein the apparatus comprises a column packed with at least two silver nitrate-impregnated gels as a carrier and a column packed with at least two silica gels as a carrier.

12. The apparatus according to claim 11, wherein the apparatus comprises a column packed with at least one silver nitrate-impregnated gel as a carrier and a column packed with at least three silica gels as a carrier.