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JP2016140306A - 顆粒及び有用物質の製造方法 - Google Patents

顆粒及び有用物質の製造方法 Download PDF

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JP2016140306A
JP2016140306A JP2015018106A JP2015018106A JP2016140306A JP 2016140306 A JP2016140306 A JP 2016140306A JP 2015018106 A JP2015018106 A JP 2015018106A JP 2015018106 A JP2015018106 A JP 2015018106A JP 2016140306 A JP2016140306 A JP 2016140306A
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宏一 高尾
Koichi Takao
宏一 高尾
正樹 柚賀
Masaki Yuga
正樹 柚賀
吉川　潤
Jun Yoshikawa
潤 吉川
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Godo Shusei KK
Original Assignee
Godo Shusei KK
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Abstract

【課題】 顆粒の酵素活性を向上させるとともに、反応液に十分に沈降させた顆粒を提供することを目的とする。【解決手段】 複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞を有する顆粒であって、当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の表面側に向けて存在する流路と、を有することを特徴とする顆粒。当該顆粒は微粒子を有することが好ましい。前記複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間に前記微粒子が存在するもしくは前記複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に前記微粒子が存在することが好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞を有する顆粒及び当該顆粒を用いた有用物質の製造方法に関する。
酵素もしくは細胞を固定化することによって、当該酵素もしくは細胞を繰り返し使用することが可能となる。工業的に有用物質を製造する場合、酵素もしくは細胞の固定化技術を使用することは有益である。
酵素もしくは細胞の固定化技術として様々な方法が知られている。例えば、（１）担体に酵素もしくは細胞を結合させる方法、（２）酵素もしくは細胞を架橋させる方法、（３）酵素もしくは細胞を高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する包括法などである。
特許文献１には、酵素もしくは微生物菌体の固定化方法に係る発明が開示されている。具体的には、酵素もしくは微生物菌体を水溶性蛋白質とともにカチオン性合成高分子凝集剤の水溶液中で凝集させたのち、多官能性の架橋剤と反応させることを一特徴とする。当該発明によって、保形性に優れ、酵素もしくは微生物菌体の脱離が少なく、安定で活性の高い固定化酵素もしくは固定化微生物菌体が得られると記載されている。
特開昭５８−６０９８７号公報
しかしながら、特許文献１に係る発明を使用して顆粒を製造した場合、顆粒の酵素活性が不十分であり、更なる改善が求められていた。 また、特許文献１に係る発明によって得られた顆粒を反応液中で使用する場合、当該反応液中に当該顆粒が十分に沈降しない問題を有するものであった。これによって、例えば、当該顆粒を詰めたカラムに反応液を満たして使用した後、当該顆粒を洗浄する作業を行うと、浮遊している一部の顆粒がカラムの外に流出しやすくなる結果、当該顆粒を繰り返し使用することが困難であった。
本発明は、顆粒の酵素活性を向上させるとともに、反応液に十分に沈降させた顆粒を提供することを目的とする。
本発明者らは、特許文献１に係る発明によって得られた顆粒が反応液に十分沈降しないことから、当該顆粒の内部に空隙が多数存在し、当該空隙に十分に反応液が浸透せず、結果として顆粒の酵素活性が不十分になっているのではないかと考えた。当該空隙を減少させるために鋭意検討してなされたのが本発明である。
本発明は以下の技術的構成を有することにより、本発明の課題を解決した。
（１）複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞を有する顆粒であって、当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の表面側に向けて存在する流路と、を有することを特徴とする顆粒。
（２）微粒子を有することを特徴とする前記（１）に記載の顆粒。
（３）前記複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間に前記微粒子が存在するもしくは前記複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に前記微粒子が存在することを特徴とする前記（２）に記載の顆粒。
（４）前記顆粒を反応液に浸したときにおいて、当該顆粒の表面側から前記間隙の少なくとも一部に反応液が浸透することを特徴とする前記（３）に記載の顆粒。
（５）前記微粒子が１つの凝集酵素もしくは１つの凝集細胞よりも小さいことを特徴とする前記（２）又は前記（３）に記載の顆粒。
（６）前記微粒子が前記凝集酵素を構成する個々の酵素もしくは前記凝集細胞を構成する個々の細胞よりも大きいことを特徴とする前記（２）、（３）又は（５）に記載の顆粒。
（７）前記微粒子を０．１％〜２０質量％含有することを特徴とする前記（２）、（３）、（５）又は６に記載の顆粒。
（８）隣接する凝集酵素もしくは隣接する凝集細胞が架橋していることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の顆粒。
（９）前記顆粒の浮遊度が０〜３０の範囲内にあることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載の顆粒。
（１０）複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞と、当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、該間隙から当該顆粒の内部もしくは外部の少なくとも一方に向けて存在する流路と、を有する顆粒に反応液を加え、有用物質を得ることを特徴とする有用物質の製造方法。
本発明の顆粒によれば、顆粒の酵素活性を向上させるとともに、反応液に十分に沈降させた顆粒を提供することができる。
本発明の有用物質の製造方法によれば、使用する顆粒が反応液に十分に沈降するため、当該顆粒を繰り返し使用することが可能であり、有用物質を連続的に製造することができる。
＜顆粒＞
本発明に係る顆粒は、複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞もしくはその両方を有する顆粒であって、当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の表面側に向けて存在する流路と、を有することを特徴とする。
本発明に係る顆粒内部において、間隙は複数形成される。本発明において、間隙とは顆粒内部に存在する、閉じられた空間及び開放された空間を意味する。閉じられた空間には、顆粒を反応液に浸したときに反応液が浸透しない。すなわち、閉じられた空間は、閉鎖系に相当する部分であって、上記特許文献１によって得られた顆粒における空隙に相当する。これに対して、開放された空間は、顆粒を反応液に浸した時に反応液が浸透する。すなわち、開放された空間は、開放系に相当する部分である。この開放系に相当する部分のことを本発明では流路という。顆粒内部に形成された流路は、少なくとも顆粒の最表面から顆粒内部の解放された空間の間に存在する。流路の少なくとも一部は、顆粒内部を縦断あるいは横断するように形成されていることが好ましい。顆粒内部を縦断あるいは横断するように形成されている流路としては、例えば、顆粒の最表面Ａ、開放された空間及び顆粒の最表面Ｂ（顆粒の最表面Ａと異なる部分）に形成されたものが挙げられる。
顆粒内部に形成された複数の間隙は、互いにつながっていてもよい。複数の間隙にわたって流路を形成することも可能である。
本発明に係る顆粒は、さらに微粒子を有させることが好ましい。
顆粒に微粒子を含有させると、当該顆粒に含まれる凝集酵素もしくは凝集細胞の固形分比率が下がることになる。当該微粒子自体には酵素活性がないため、顆粒に微粒子を含有させることによって酵素活性が減少すると考えるのが通常である。驚くべきことに、当該顆粒に微粒子を含有させることによって、酵素活性が向上するとともに、当該顆粒が反応液に十分に沈降することを見出した。酵素活性が向上する理由及び顆粒が反応液に十分に沈降する理由は以下のとおりである。
（１）顆粒内において、複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間に微粒子が存在するもしくは前記複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に微粒子が存在する。（２）隣接する凝集酵素の間もしくは前記隣接する凝集細胞の間に間隙が形成される。（３）当該間隙を有する顆粒を反応液に浸すと、当該顆粒の表面側から前記間隙の少なくとも一部（解放された空間）に反応液が浸透する。（４）顆粒内の酵素反応が生じる部分が増えるとともに、顆粒内に存在していた空気が追い出される。
顆粒の浮遊度は０〜３０の範囲内にあることが好ましい。０に近くなるほど好ましい。
上限値超であると、カラムに充填した顆粒が流出しやすくなる傾向にある。
浮遊度の測定方法は、５０℃に保温した５０ ％(ｗ／ｗ)グルコース水溶液に顆粒を加え、６０分間静置状態で保温後、３回撹拌を行った後、別容器に移して１５分間静置したときの全顆粒容量の内、浮遊する顆粒の割合を意味する。
顆粒の大きさは、１０μｍ〜３０ｍｍの範囲内であることが好ましく、５０μｍ〜２０ｍｍの範囲内であることがより好ましく、１００μｍ〜１０ｍｍの範囲内であることがさらに好ましい。顆粒が小さくなるにつれカラムに充填した顆粒が流出しやすくなる傾向にあり、顆粒が大きくなるにつれ顆粒に含まれる酵素の反応性が減少しやすくなる傾向にある。顆粒の大きさは、使用する酵素又は細胞の種類、目的に応じて決定することができる。
顆粒の形状は特に限定されない。球状、楕円状、不定形状等、種々の形状を採用することができる。
以下、本発明に係る顆粒を構成する材料について説明する。
（微粒子）
微粒子としては、有機微粒子や無機微粒子を使用することができる。有機微粒子と無機微粒子を組み合わせて使用してもよい。有機微粒子あるいは無機微粒子として、単独あるいは複数種類の微粒子を使用してもよい。
本発明においては、無機微粒子を使用することが好ましい。無機微粒子は有機微粒子に比べ比重（真比重）が大きいため、顆粒の浮遊度を減少させやすいからである。
微粒子の比重（真比重）は、反応液の比重以上であることが好ましい。微粒子の比重が反応液の比重未満であると、反応液に微粒子が沈降しにくいからである。反応液として水（比重は１）を使用することが多いため、微粒子の比重は１．０以上であることが好ましく、１．５以上であることがより好ましく、２．０以上であることがさらに好ましい。上限は特に限定されないが、例えば１０である。
有機微粒子を形成する材料としては、例えば、アクリル樹脂、ポリスチレン樹脂、スチレン−アクリル共重合樹脂、ポリエチレン樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリフッ化ビニリデン樹脂、ポリフッ化エチレン樹脂、活性炭、セルロース粉末、キチン粉末及びキトサン粉末等が挙げられる。
無機微粒子を形成する材料としては、例えば、炭酸カルシウム、硫酸バリウム、酸化チタン、水酸化アルミニウム、シリカ、ガラスビーズ、タルク、マイカ、ホワイトカーボン、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、珪藻土、パーライト、ゼオライト、活性白土及び酸性白土等が挙げられる。
微粒子の形状としては、例えば、球状、楕円形状、多角形状、不定形状等、種々の形状をとることができる。微粒子の形状として多角形状あるいは不定形状のような表面積が大きいものを使用することが好ましい。これによって、凝集酵素と微粒子間あるいは凝集細胞と微粒子間、さらには微粒子と微粒子の間に間隙が生じやすくなることから、顆粒内部に反応液が浸透しやすくなる。
微粒子の大きさは、凝集酵素を構成する個々の酵素もしくは凝集細胞を構成する個々の細胞よりも大きく、１つの凝集酵素もしくは１つの凝集細胞よりも小さいことが好ましい。これによって隣接する凝集酵素同士の間もしくは隣接する凝集細胞同士の間に、微粒子が存在しやすくなる。
凝集酵素を使用する場合の微粒子の平均粒径は、１ｎｍ以上２００μｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上１５０μｍ以下であることがより好ましく、０．１μｍ以上１００μｍ以下であることがさらに好ましい。
下限値未満であると、隣接する凝集酵素同士の間に微粒子が存在した場合であっても、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、隣接する凝集酵素同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
凝集細胞を使用する場合の微粒子の平均粒径は、０．１μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましく、０．５μｍ以上１５０μｍ以下であることがより好ましく、１．０μｍ以上１００μｍ以下であることがさらに好ましい。
下限値未満であると、隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在した場合であっても、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
微粒子の含有量は、顆粒に含まれる固形分を１００質量％とした場合、０．１質量％〜２０質量％の範囲内にすることが好ましく、０．５質量％〜１５質量％の範囲内にすることがより好ましく、１．０質量％〜１０質量％の範囲内にすることがさらに好ましい。
微粒子の含有量が下限値未満であると、隣接する凝集酵素同士あるいは隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
微粒子の含有量が上限値超であると、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
ここで、本発明における顆粒に含まれる固形分は、顆粒を１０５℃で５時間乾燥させたものを１００質量％とした値を基準とする。
（凝集酵素、凝集細胞）
個々の酵素を２個以上凝集させて得られたものが凝集酵素であり、個々の細胞を２個以上凝集させて得られたものが凝集細胞である。個々の酵素あるいは個々の細胞であると捕捉・収集が困難である場合が多いが、凝集酵素あるいは凝集細胞とすることによって、捕捉・収集が可能になる。凝集酵素あるいは凝集細胞を得る方法として、個々の酵素あるいは個々の細胞の表面における帯電状態を調節する方法が挙げられる。
個々の細胞は通常負に荷電しているため、カチオン系凝集剤を添加することによって凝集細胞を得ることができる。
個々の酵素は、個々の酵素を溶解した溶液のｐＨに依存して正や負に帯電している。酵素は、アミノ酸に由来するアミノ基やカルボキシル基等のイオン性の官能基を多数持っているためである。酵素が負に帯電している場合はカチオン系凝集剤、正に帯電している場合はアニオン系凝集剤を添加することによって、凝集酵素を得ることができる。両性凝集剤を使用することも可能である。
凝集酵素を構成する酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、インベルターゼ、グルコースイソメラーゼ、ガラクトースイソメラーゼ、キモトリプシン、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ペプシン、パパイン、ウロキナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、アミノアシラーゼ、ペニシリンアミダーゼ、その他の各種グリコシダーゼ等を使用することができる。
凝集細胞を構成する細胞としては、例えば、細菌類、放線菌類、カビ類、酵母類等の微生物に加え、動物類、植物類の細胞を使用することができる。細胞の表面の荷電状態が重要であることから、細胞の形状は限定されない。いずれの形状であっても凝集細胞を得ることが可能である。例えば、球菌、桿菌、糸状菌を使用することができる。放線菌にカチオン系凝集剤を添加すると、フロック状となった凝集細胞を得ることができる。
個々の凝集酵素の大きさは、０．０１μｍ〜１０ｍｍの範囲内にあることが好ましい。
下限値未満であると、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、顆粒内部に間隙が多くなり、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
個々の凝集細胞の平均径は、０．０１μｍ〜１０ｍｍの範囲内にあることが好ましい。
下限値未満であると、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、顆粒内部に間隙が多くなり、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
個々の酵素あるいは個々の細胞の含有量の合計は、顆粒に含まれる固形分を１００質量％とした場合、１０質量％〜９９．９質量％の範囲内にすることが好ましく、１５〜９９．８質量％の範囲内にすることがより好ましく、３０質量％〜９９．５質量％の範囲内にすることがさらに好ましく、５０質量％〜９９質量％の範囲内にすることが特に好ましい。
個々の酵素あるいは個々の細胞の合計の含有量が下限値未満であると、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。これは個々の酵素あるいは個々の細胞が、顆粒を構成する各種材料のバインダーとして作用する側面があるからである。
個々の酵素あるいは個々の細胞の合計の含有量が上限値超であると、隣接する凝集酵素同士あるいは隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
個々の酵素あるいは個々の細胞の含有量の合計に対する微粒子の含有量の比は、１：０．００１〜１：０．４の範囲内にあることが好ましい。
下限値未満であると、隣接する凝集酵素同士あるいは隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
凝集細胞を使用する場合、凝集細胞を形成する個々の細胞内あるいは細胞表面に存在する酵素が活性を有する状態であればよく、細胞の生死に制限はない。
カチオン系凝集剤としては、ポリカチオン系凝集剤であれば種類を選ばず、例えばポリエチレンイミン、ポリリジン、エチレンジアミンエピクロルヒドリン重縮合物、ポリアルキレンポリアミン、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドやジメチルアミノエチル（メタ）アクリレートの四級アンモニウム塩を構成モノマーとする重合体、キトサン等を使用することができる。
アニオン系凝集剤としては、ポリアニオン系凝集剤であれば種類を選ばず、例えばポリ（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸と（メタ）アクリルアミドの共重合物、（メタ）アクリルアミド・２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸共重合体、及びそれらのアルカリ金属塩等を使用することができる。
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量は、顆粒に含まれる固形分を１００質量％とした場合、０．１質量％〜３０質量％の範囲内にすることが好ましく、０．５質量％〜２５質量％の範囲内にすることがより好ましく、１質量％〜２０質量％の範囲内にすることがさらに好ましい。
下限値未満であると、十分な数量の凝集酵素あるいは凝集細胞を得られにくい。顆粒の酵素活性を高めにくい問題もある。
上限値超であると、得られる凝集酵素あるいは凝集細胞の数量はほとんど変わらないため不経済である。また、顆粒内部に間隙が多くなり、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
個々の酵素あるいは個々の細胞の含有量の合計に対するカチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量の比は、１：０・００１〜１：０．６の範囲内にあることが好ましく、１：０．００４〜１：０．１５の範囲内にあることがより好ましい。
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤が下限値未満であると、十分な数量の凝集酵素あるいは凝集細胞を得られにくい。顆粒の酵素活性を高めにくい問題もある。
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤が上限値超であると、得られる凝集酵素あるいは凝集細胞の数量はほとんど変わらないため不経済である。また、顆粒内部に間隙が多くなり、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を増やすにつれて、得られる凝集酵素あるいは凝集細胞の大きさが大きくなる傾向にある。
（任意成分）
本発明の構成及び作用効果を妨げない範囲で、本発明に係る顆粒に任意成分を含有させることができる。任意成分としては、例えば、陰性高分子、陽性高分子、塩類、架橋剤等を使用することができる。
カチオン系凝集剤によって凝集酵素もしくは凝集細胞を生成させると、顆粒内、もしくは顆粒表面に過剰にカチオン性の官能基が存在する場合がある。これによって、酵素活性が減少する場合がある。この問題を改善するために、ポリアニオンを添加することで、酵素活性を向上させることができる。さらに、顆粒の凝集性を向上させることもできる。
前記ポリアニオンとしては、アクリル酸、スルホン酸、硫酸、カルボン酸、リン酸、など負電荷を帯びることができる官能基を有する高分子である。
アニオン系凝集剤によって凝集酵素もしくは凝集細胞を生成させると、顆粒内、もしくは顆粒表面に過剰にアニオン性の官能基が存在する場合がある。これによって、酵素活性が減少する場合がある。この問題を改善するために、ポリカチオンを添加することで、酵素活性を向上させることができる。さらに、顆粒の凝集性を向上させることもできる。
ポリカチオンとしては、ピリジニウム基、アンモニウム基、４級アンモニウム基、アミノ基などの正荷電を帯びることのできる官能基を有する高分子である。
顆粒の形成工程あるいは顆粒形成後の工程において、塩類を添加することで酵素活性を向上させることができる場合がある。
顆粒の形成工程あるいは顆粒形成後の工程において、架橋剤を添加することで、凝集酵素を構成する酵素間あるいは凝集細胞を構成する細胞間を架橋させることが可能になる。これによって顆粒の強度を向上させることができる。
架橋剤としては、例えば、ジアゾニウム基、アジド基、イソシアネート基、酸クロライド基、酸無水物基、イミノカーボネート基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボジイミド基、又はアジリジン基を含むものが挙げられる。
微粒子と酵素、微粒子と細胞間を結合させる場合は、シランカップリング剤を使用することも可能である。アミノ基を有する微粒子を使用し、アルデヒド基を有する架橋剤を使用することにより、微粒子と酵素、微粒子と細胞間を架橋させることもできる。
任意成分の含有量は、顆粒に含まれる固形分を１００質量％とした場合、０.０１質量％〜０．５質量％の範囲内にすることが好ましい。
＜顆粒の製造方法＞
細胞を使用する場合、例えば、以下の工程を経ることで顆粒を製造することができる。
（１）細胞を培養する工程
（２）凝集細胞に微粒子を添加し、必要に応じて任意成分を添加する工程
（３）細胞に凝集剤を添加し、凝集細胞を生じさせる工程
（４）固液分離
（５）得られた固体部分を乾燥させる工程
（６）顆粒への成型工程
細胞の代わりに酵素を使用する場合は、市販の酵素を使用し、上記（２）の工程以降を行えばよい。
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を増やすにつれて、得られる凝集酵素あるいは凝集細胞の大きさが大きくなる傾向にある。凝集酵素あるいは凝集細胞が大きいものを使用して顆粒を作成すると、間隙が生じやすくなるとともに流路を形成しやすくなる。この結果、顆粒内部の流路に反応液が浸透しやすくなるため、活性が上昇するとともに顆粒が反応液に沈降しやすくなる。すなわち、凝集酵素あるいは凝集細胞の大きさを大きくすることによって、複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の内部もしくは外部の少なくとも一方に向けて存在する流路と、を形成することが可能である。
顆粒内部に間隙及び流路を形成するために、カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を変えることも好ましい。例えば、カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を多くして凝集酵素あるいは凝集細胞を作成したものと、カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を少なくして凝集酵素あるいは凝集細胞を作成したものと、を混合して顆粒を作成することによって、顆粒内部に間隙及び流路を形成させることもできる。
＜顆粒の使用方法＞
得られた顆粒をカラムなどの担体・容器に充填した後、反応液を添加すればよい。反応は連続で行ってもよいし、バッチで行ってもよい。
反応液は目的とする生産物が得られるような基質を含み、顆粒を構成する酵素あるいは細胞に含まれる酵素が失活しにくいようなｐＨ条件となるような緩衝液を採用すればよい。基質濃度、ｐＨ条件は適宜決定すればよい。反応液は通常水を溶媒とするが、これに限られるものではなく、混合溶媒を使用してもよい。
以下、本発明を実施例を用いて説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
＜実施例１：微粒子を添加した酵素固定化顆粒の調製＞
放線菌であるストレプトマイセス ムリナス ＮＢＲＣ１４８０２の培養液を用いて酵素固定化顆粒の取得を実施した。
コーンスティープ・リカー１．５％、グルコース１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％、ＣｏＣｌ2 １×１０-3Ｍからなる培地（ｐＨ６）４ｍｌを計１８ｍｍの試験管に入れ、常法により殺菌後、放線菌であるストレプトマイセス ムリナス ＮＢＲＣ１４８０２を接種し、３０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液をｐＨ８．５に調整後、顆粒に含まれる固形分に対して１．５質量％になるように添加した。微粒子として昭和化学工業製株式会社製のラヂオライト＃３０００(平均微粒子径 ７４．９ μｍ；シリカを主成分とする珪藻土；比重２．２)、ラヂオライト＃１００(平均粒径 １２．８ μｍ；シリカを主成分とする珪藻土；比重２．２)、中央シリカ株式会社製シリカ６００Ｈ(平均粒径 ３３．９μｍ；シリカが主成分；比重２．２)又は日本製紙株式会社製ＫＣフロックＷ−３００Ｇ(平均粒径 約２８μｍ；セルロース粉末が主成分；比重１．０６６)の４種類を用いた。微粒子を添加した培養液に対して、ポリカチオン凝集剤としてポリエチレンイミン溶液（日本触媒社製 商品名ＳＰ−００３）を添加し、３０分間撹拌した。その後、ポリアニオンとしてポリアクリル酸ナトリウム溶液（日本触媒社製 商品名ＬシリーズＤＬ）を添加し、３０分間撹拌を行い、菌体を凝集させ、当該液を濾過することで湿潤菌体を得た。顆粒に含まれる固形分に対して、ポリカチオン凝集剤は１０％、ポリアニオンは３．５％となるように添加した（いずれも固形分）。この湿潤状態の凝集菌体を１．５ｍｍ径の穴から押し出し、得られた成形物を略均一な大きさ（１．５ｍｍ×１．５ｍｍ×２．０ｍｍ）になるまで解して顆粒状にした。その後、その顆粒を１１０℃で１５分間乾燥させ、酵素固定化顆粒として取得した。
実施例１で得られた酵素固定化顆粒のグルコースイソメラーゼ活性を測定した。活性測定に関しては（１）グルコース異性化反応と（２）フラクトースの定量の二段階で実施した。（１）のグルコース異性化反応においては酵素固定化顆粒を約４０ ｍｇを５０ ｍｌの共栓付三角フラスコに量り取り、２５０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）２ ｍｌを添加し、1時間室温にて膨潤を行った。６０℃で３分間の保温の後、基質を含む反応液（２ Ｍグルコース、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ８．０）を８ｍｌ添加し、振幅３ｃｍ、１２０ｒｐｍ、３０分間の条件で振とうを行い、異性化反応を実施した。反応を停止させるため、３０分経過時点で０．５Ｍ過塩素酸水溶液を２０ｍｌ添加した。ブランクについては顆粒を量り取っていないものを同操作で処理したものを使用した。その後、得られた溶液１２０μｌを水１０．１２ｍｌに希釈したものをサンプルとしてフラクトースの定量を行った。（２）のフラクトース定量に関しては、サンプル液０．５ｍｌ、フラクトースの発色度合を測るためのフラクトース標準液（１００μｇフラクトース／ｍｌ）をそれぞれ試験管にとり，水０．５ｍｌをそれぞれ加えて混和し、氷水中で７０％硫酸試液６ｍｌを加えよく振り混ぜ，更に氷水中で２０％ Ｌ−システイン塩酸塩溶液０．１ｍｌを加えて混和した後，５０℃で１０分間加温し，室温まで冷却し，検液とする。検液について４１０nmにおける吸光度を測定し、フラクトースの定量を行った。グルコースイソメラーゼの活性値を示す IGIUは、６０℃、ｐＨ８．０で１分間に１μmoleのグルコースをフラクトースに変換する酵素量を意味する。計算式としては、（サンプルＯＤ−ブランクＯＤ）／（フラクトース標準液）×４７４０７．４１×１００／｛酵素量（ｍｇ）×固形分｝によって算出される。尚、コントロールには同操作において微粒子非添加のものを採用し、コントロールの活性値を１００％としたときの相対値を示した。結果は表１の通りであった。
表１の結果より、非添加の場合よりも微粒子添加時に最大で１５％程活性が増大したことが観察された。また、微粒子を添加したものはいずれも流路を形成していることを確認した。
Figure 2016140306
＜実施例２：微粒子の添加濃度の検討＞
添加する微粒子濃度を顆粒に含まれる固形分に対して０、１、２、３、４、５％と変化させた以外は実施例１と同様にして、酵素固定化顆粒を取得し、その活性値を比較した。尚、微粒子としてはラヂオライト＃１００を用いて実施した。
実施例２で得られた６種類の酵素固定化顆粒のグルコースイソメラーゼ活性を測定した。コントロールには微粒子非添加のものを採用し、コントロールの活性値を１００％としたときの相対値を示した。結果は図２の通りであった。
Figure 2016140306
図２の結果より、０〜２％の間で濃度依存的な活性増大が認められた。２％以上ではそれ以上の活性増大は認められず、同様の結果を示した。また、微粒子を添加したものはいずれも流路を形成していることを確認した。
実施例２で得られた６種類の酵素固定化顆粒について浮遊度を測定した。６種類の顆粒それぞれを７ｇ量り取り、５０℃に保温した５０ ％(ｗ／ｗ)グルコース水溶液５０ｍｌをそれぞれの顆粒に添加し、６０分間５０℃の湯浴にて静置状態で保温した。３回撹拌を行った後、メスシリンダーに移して１５分間静置したときの全顆粒容量の内、浮遊する顆粒の割合を算出した。結果は表３の通りであった。
Figure 2016140306
表３に示すように、顆粒内に微粒子を含有させることによって、当該顆粒の沈降性を改善することができた。
本実施例においては、特定の微生物由来の細胞を使用して顆粒を作成することで、酵素活性の向上及び沈降性が改善したことが示された。これは、他の細胞を使用した場合においても同様である。すなわち、他の細胞を使用して本発明の顆粒を形成した場合においても、顆粒内部に流路が形成され、細胞の表面積が増えるからである。 また、微生物由来の細胞の代わりに酵素を使用した場合も同様である。すなわち、酵素を使用して本発明の顆粒を形成した場合においても、顆粒内部に流路が形成され、酵素の表面積が増えるからである。

Claims (10)

  1. 複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞を有する顆粒であって、
    当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の表面側に向けて存在する流路と、を有することを特徴とする顆粒。
  2. 微粒子を有することを特徴とする請求項１に記載の顆粒。
  3. 前記複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間に前記微粒子が存在するもしくは前記複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に前記微粒子が存在することを特徴とする請求項２に記載の顆粒。
  4. 前記顆粒を反応液に浸したときにおいて、当該顆粒の表面側から前記間隙の少なくとも一部に反応液が浸透することを特徴とする請求項３に記載の顆粒。
  5. 前記微粒子が１つの凝集酵素もしくは１つの凝集細胞よりも小さいことを特徴とする請求項２又は３に記載の顆粒。
  6. 前記微粒子が前記凝集酵素を構成する個々の酵素もしくは前記凝集細胞を構成する個々の細胞よりも大きいことを特徴とする請求項２、３又は５に記載の顆粒。
  7. 前記微粒子を０．１％〜２０質量％含有することを特徴とする請求項２、３、５又は６に記載の顆粒。
  8. 隣接する凝集酵素もしくは隣接する凝集細胞が架橋していることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の顆粒。
  9. 前記顆粒の浮遊度が０〜３０の範囲内にあることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の顆粒。
  10. 複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞と、当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、該間隙から当該顆粒の内部もしくは外部の少なくとも一方に向けて存在する流路と、を有する顆粒に反応液を加え、有用物質を得ることを特徴とする有用物質の製造方法。

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