JP2016102121A - リゾホスファチジン酸に対するモノクローナル抗体及び抗体断片を用いた、疼痛の予防及び治療 - Google Patents

Abstract

【課題】疼痛を予防し、治療するための方法の提供。【解決手段】ヒト対象を含む対象に、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に結合する抗体又は抗体断片を投与することを含む。好ましくは、抗体は、ヒト化抗ＬＰＡモノクローナル抗体又はこのような抗体由来の抗原結合断片である。【選択図】なし

Description

本願は、本願発明と所有者が共通し、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書中に組み込まれる、２０１０年７月１４日出願の米国仮出願第６１／３６４，３６９号（代理人整理番号ＬＰＴ−３２１１−ＰＶ）に対する利益及び優先権を主張する。

配列リスト
本願発明は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出され、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる配列リストを含有する。２０１１年７月１３日に作成された配列リストのＡＳＣＩＩコピーは、ＬＰＴ３２１１ＰＣ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは４６，３７０バイトである。

技術分野
本発明は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその変異体に結合する物質、特に生理的条件下でＬＰＡに結合し、中和するモノクローナル抗体、抗体断片及び抗体誘導体を用いて、神経因性疼痛を含む疼痛を治療するための方法に関する。

ＬＰＡは、様々な細胞タイプにおける、増殖、分化、血管形成、運動性及びアポトーシスからの防御を含む複数の細胞反応に介在する生物活性脂質である。

ＬＰＡは、成長促進性の腫瘍微小環境を提供し、血管形成を促進することによって癌の確立及び進行に関与する。さらに、ＬＰＡは、線維症、黄斑変性などの眼疾患及び疼痛関連障害に関連付けられてきた。従って、ＬＰＡの中和に対する抗体に基づくアプローチによって、これらの適応症に対する現在の治療の幅が広がる可能性がある。

出願人は、ＬＰＡに対する高親和性で特異的なモノクローナル抗体のファミリーを発明しており、そのうちの１つはＬｐａｔｈｏｍａｂとして知られている。癌、線維症及び眼疾患の様々な動物モデルにおけるＬｐａｔｈｏｍａｂの効果から、例えば悪性腫瘍、血管形成及び線維症関連疾患の治療において、のこのクラスの抗ＬＰＡ抗体（及びそれら由来の分子）の有用性に注目が集まっている。

１．導入
次の記述は、本発明を理解する際に有用であり得る情報を含む。本明細書中で提供される何れの情報も、又は本明細書中で明示的もしくは暗示的に参照される何れの刊行物も、本願で主張される発明に対する先行技術であること又はとりわけ関連があることを認めるものではない。

２．背景
Ａ．生物活性シグナル伝達脂質
ある種の脂質及びそれらの誘導体は現在、細胞膜における単なる単純な構造要因として又はβ−酸化、解糖もしくはその他の代謝過程に対するエネルギー源としてだけではなく、医学研究に対する重要な標的として認識されている。特に、ある種の脂質は、動物及びヒト疾患における重要なシグナル伝達メディエーターとして機能する。原形質膜の殆どの脂質が構造的役割のみを果たすものの、脂質のごく一部は細胞への細胞外刺激を伝達することに関与する。これらの脂質は、「生物活性脂質」又はあるいは「生物活性シグナル伝達脂質」と呼ばれる。「脂質シグナル伝達」は、第二のメッセンジャーとして細胞膜脂質を使用する多くの細胞シグナル伝達経路の何れかを指し、同時にこれは脂質シグナル伝達分子のそれ自身の特異的な受容体との直接的な相互作用を指す。脂質シグナル伝達経路は、成長因子から炎症性サイトカインに及ぶ様々な細胞外刺激により活性化され、アポトーシス、分化及び増殖などの細胞運命決定を制御する。生物活性脂質シグナル伝達に対する研究は、さらに多くの生物活性脂質が同定され、それらの作用の特性が調べられているので、精力的に行われている科学研究の一領域である。

生物活性脂質の例としては、エイコサノイド（カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸及びイソエイコサノイドを含む。）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター、リン脂質及びそれらの誘導体、例えばホスファチジン酸（ＰＡ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）及びカルジオリピン、ならびにリゾリン脂質、例えばリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）及び様々なリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）などが挙げられる。生物活性シグナル伝達脂質はまた、スフィンゴ脂質、例えばスフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−ホスフェート、スフィンゴシン、スフィンゴシルホスホリルコリン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−ホスフェート（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ）及びスフィンゴシン−１−ホスフェートも含む。スフィンゴ脂質及びそれらの誘導体は、重要な細胞プロセスにおける多面的な効果を有する細胞外及び細胞内シグナル伝達分子の群に相当する。生物活性シグナル伝達脂質の他の例としては、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシド及びセレブロシドが挙げられる。

１．リゾ脂質
リゾ脂質としても知られるリゾリン脂質（ＬＰＬ）は、１個の炭化水素骨格及びリン酸基含有極性頭基を含有する、低分子量（一般的には約５００ダルトン未満）の脂質である。一部のリゾ脂質は生物活性シグナル伝達脂質である。医学的に重要な生物活性リゾ脂質の２つの特定例はＬＰＡ（グリセロール骨格）及びＳ１Ｐ（スフィンゴイド骨格）である。選択されたＬＰＡ、Ｓ１Ｐ及びジヒドロＳ１Ｐの構造を下記で示す。

ＬＰＡの構造骨格は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）又はホスファチジン酸（ＰＡ）などのグリセロールベースのリン脂質由来である。Ｓ１Ｐなどのリゾスフィンゴ脂質の場合、セラミド骨格の脂肪酸が欠けている。Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ（ＤＨＳ１Ｐ）及びスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）の構造骨格は、スフィンゴミエリン由来であるスフィンゴシンに基づく。

ＬＰＡ及びＳ１Ｐは、同じクラスの複数の膜貫通ドメインＧタンパク質共役（ＧＰＣＲ）受容体への結合によって様々な細胞シグナル伝達経路を制御する。Ｓ１Ｐ受容体は、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４及びＳ１Ｐ５と呼ばれ（以前はＥＤＧ−１、ＥＤＧ−５／ＡＧＲ１６、ＥＤＧ−３、ＥＤＧ−６及びＥＤＧ−８）、ＬＰＡ受容体は、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３と呼ばれる（以前はＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４及びＥＤＧ−７）。このファミリーの第四のＬＰＡ受容体がＬＰＡ（ＬＰＡ４）に対して同定されており、これらのリゾリン脂質に対する他の推定受容体も報告されている。

ＬＰＡ及びＳ１Ｐは、Ｔ及びＢリンパ球などの免疫関連細胞の調節を通じて免疫反応に関与することが示されている。これらの脂質は、免疫反応部位へのＴ細胞移動を促進し、Ｔ細胞の増殖ならびに様々なサイトカインの分泌を制御する。特に、Ｓ１Ｐは、末梢循環へのリンパ球の出現を調整すると考えられている。従って、ＬＰＡ及びＳ１Ｐに結合する物質は、望ましくない、過剰な又は異常な免疫反応を低下させるための、及び望ましくない、過剰な又は異常なリンパ球の関与及び又は異常な免疫反応が関連するある種の血液癌及び自己免疫疾患を含む疾患及び状態を治療するための方法において有用であると考えられる。

ａ．リゾホスファチック酸（Ｌｉｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＰＡ）
リゾホスファチジン酸（モノアシルグリセロール−３−ホスフェート、＜５００ダルトン）は、１個の炭化水素骨格及びリン酸基含有極性頭基からなる。ＬＰＡは、単一分子部分ではないが、様々な長さ及び飽和度の脂肪酸を有する内因性構造変異体の一群である。従って、本明細書中で使用される場合、「ＬＰＡ」は、別段の断りがない限り、一連の生物活性ＬＰＡ変異体を指す。生物学的に関連があるＬｐａの変異体には、１８：２、１８：１、１８：０、１６：０及び２０：４が含まれる。飽和脂肪酸（１６：０及び１８：０）及び不飽和脂肪酸（１６：１、１８：１、１８：２及び２０：４）の両方を有するＬＰＡ種が血清及び血漿中で検出されている。１６：０、１８：１、１８：２及び２０：４ＬＰＡアイソフォームは血中の主要な種である。高レベルの生物活性ＬＰＡ（＞１μＭ）が血清、唾液、卵胞液及び悪性滲出液を含む様々な体液中で検出可能である。

本発明は、その局面中で、下記で詳述するように、過剰増殖性疾患及び様々なその他の疾患を治療又は予防するのに有用である抗ＬＰＡ剤を提供する。特に、本発明のある種の実施態様は、以下に限定されないが、ＬＰＡの１８：２、１８：１、１８：０、１６：０及び２０：４変異体を含むＬｐａに標的化された抗体に関する。

ＬＰＡは、長い間、真核及び原核細胞の両方におけるリン脂質生合成の前駆体として知られてきたが、ＬＰＡは、特異的な細胞表面受容体上で作用することによって標的細胞に影響を与えるように、活性化された細胞、とりわけ血小板により迅速に産生され、放出されるシグナル伝達分子として最近浮上してきた。小胞体におけるより複雑なリン脂質への合成及び処理に加えて、ＬＰＡは、細胞活性化後、既存のリン脂質の加水分解を通じて生成され得、例えば、ｓｎ−２の位置は脱アシル化ゆえに一般に脂肪酸残基がなく、ｓｎ−３ヒドロキシルのみが脂肪酸にエステル化されている。さらに、ＬＰＡの産生におけるキーとなる酵素であるオートタキシン（リゾＰＬＤ／ＮＰＰ２）は、多くの腫瘍型がオートタキシンを上方制御しているので、癌遺伝子産物であり得る。高感度及び特異的なＬＣ／ＭＳ手順を用いて行われる測定を含め、ヒト血漿及び血清中のＬＰＡ濃度が報告されている。例えば、２５℃で１時間にわたり静置した新鮮調製ヒト血清中で、ＬＰＡ濃度は、ＬＰＡ類似体１６：０、１８：１、１８：２及び２０：４を主要な種とし、およそ１．２ｍＭであると推定される。同様に、新鮮調製ヒト血漿中２５℃で１時間にわたり静置すると、ＬＰＡ濃度は、１８：１及び１８：２ＬＰＡを主要な種とし、およそ０．７ｍＭと推定される。

ＬＰＡは、複数の膜貫通Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のクラスへの結合により、その生物学的機能を支配的に媒介する。ＬＰＡ１−５と呼ばれる５種類のＬＰＡ特異的なＧＰＣＲが現在までに同定されており、これらの示すシグナル伝達特性及び組織発現は、重複するものもあれば別個のものもある。ＬＰＡ１−３受容体は、互いに対して５０％配列類似性があるＧＰＣＲのいわゆるＥＤＧサブファミリー（ＥＧＤ２／ＬＰＡ１、ＥＤＧ４／ＬＰＡ２及びＥＤＧ７／ＬＰＡ３）に属する。それらの最も近い近縁はカンナビノイドＣＢ１受容体であり、これは生物活性脂質である２−アラキドノイル−グリセロール（２−ＡＧ）及びアラキドノイル−エタノールアミンと結合する。ＬＰＡ４（以前はＧＰＲ２３／ｐ２ｙ９）及びＬＰＡ５（以前はＧＰＲ９２）と呼ばれる２種類の新たに同定されたＬＰＡ受容体は、Ｐ２Ｙヌクレオチド受容体により近い。さらに、ＬＰＡは、細胞内受容体、ＰＰＲγを認識する。

ＬＰＡ１は、多岐にわたる組織及び器官で発現され、一方ＬＰＡ２及びＬＰＡ３は、より限定的な発現プロファイルを示す。しかし、ＬＰＡ２及びＬＰＡ３発現は、卵巣及び結腸癌及び炎症で上昇していることが示されており、このことから、ＬＰＡ２及びＬＰＡ３の主要な役割が病態生理学的状態にあることが示唆される。

これらの受容体の役割は、ある一部分において、マウスにおける受容体ノックアウト実験により明らかにされている。ＬＰＡ１−欠損マウスは、嗅覚低下の結果起こる哺乳行動の不良のために出生後部分致死を示す。ＬＰＡ１−欠損マウスはまた、ブレオマイシン誘発性肺損傷に反応した肺線維症も起こらない。さらに、ＬＰＡ１受容体遺伝子を欠くマウスでは、神経損傷誘導性の神経因性疼痛性の行動及び現象がない。
一方、ＬＰＡ２受容体を欠くマウスは正常に見える。ＬＰＡ３受容体ノックアウトマウスは、胚盤胞移入の遅延及び胚のスペーシングの変化ゆえに仔のサイズが小さくなっており、ＬＰＡ３欠失子宮はシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）発現及びプロスタグランジン合成の低下を示し；一方でＬＰＡ３欠損雌マウスへのＰＧＥ２の外因性投与により、移入不全がレスキューされることが報告されている。

ＬＰＡは、細胞増殖の誘導、細胞移動の刺激及び神経突起退縮、ギャップジャンクションの閉鎖及び粘菌化学走性をも含む多岐にわたる生物学的反応に影響を与える。ＬＰＡ反応性について益々多くの細胞系で試験されるにつれて、ＬＰＡの生物学に関する一連の知識が蓄積しつつある。Ｌｐａの主要な生理学的及び病態生理学的効果としては、例えば、以下のものが挙げられる。

創傷治癒：細胞成長及び増殖を刺激することに加えて、ＬＰＡは、創傷の修復及び再生における重要な事象である、細胞の張力及び細胞表面フィブロネクチン結合の促進は現在のところ分かっていない。

アポトーシス：近年、抗アポトーシス活性もＬＰＡに帰するとされており、ペルオキシソーム増殖受容体γがＬＰＡに対する受容体／標的であることが最近報告されている。

血管成熟：ＬＰＡ産生に関与する分泌型リゾホスホリパーゼＤであるオートタキシンは、発生中の血管形成に必須である。さらに、不飽和ＬＰＡは、血管平滑筋細胞脱分化の誘導に対する主要な寄与因子として同定された。

浮腫及び血管透過性：ＬＰＡは、マウスにおける血漿滲出及びヒスタミン放出を誘導する。

炎症：ＬＰＡは、ヒト角膜上皮細胞において炎症性メディエーターとして作用する。ＬＰＡは、角膜創傷治癒に関与し、レンズにおけるＲＯＳの放出を刺激する。ＬＰＡはまた、ウサギ角膜においてＨＳＶ−１を再活性化することもできる。

毒蜘蛛、ロクソスケレス・レクルサ（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ ｒｅｃｌｕｓａ）（ドクイトグモ）の咬み傷により、重症かつ長期間継続する組織損傷が生じ、場合によっては致死となり得る壊死性潰瘍が生じる。このクモの咬み傷から生じる創傷の病態は、ＡＡ及びプロスタグランジンが介在する強い炎症性反応からなる。Ｌ．レクルサのクモ毒の主要成分は、しばしばスフィンゴミエリナーゼＤ（ＳＭａｓｅ Ｄ）と呼ばれるホスホリパーゼＤ酵素であり、これはスフィンゴミエリンを加水分解してＣ１Ｐを生成させる。しかし、様々な頭基があるリゾリン脂質がＬ．レクルサ酵素によって加水分解され、ＬＰＡを放出することが分かっている。本発明のものなどの抗ＬＰＡ剤は、Ｌ．レクルサ毒物注入から生じる炎症を含むが限定されない様々なタイプの炎症を軽減又は治療する際に有用であろうと思われる。

線維症及び瘢痕形成：ＬＰＡは、皮膚線維芽細胞においてＥＲＫ依存性経路を介した１型コラーゲンｍＲＮＡ安定性のＴＧＦ−介在性刺激を阻害する。さらに、ＬＰＡは、コラーゲン遺伝子発現及び線維芽細胞増殖を刺激することによる、いくつかの直接的な線維形成効果を有する。

免疫反応：Ｓ１ＰのようなＬＰＡは、免疫関連細胞の調節を通じて免疫反応に関与することが示されている。これらの脂質は、免疫反応部位へのＴ細胞移動を促進し、Ｔ細胞増殖ならびに様々なサイトカインの分泌を制御する。

神経変性：血液脳関門に損傷を与える事象後、脳脊髄液内でＬＰＡ活性が向上し、ＣＮＳ内のＬＰＡレベルが最高で１０μＭまで上昇するという仮説が立てられる。通常、検出不能なＬＰＡ産生酵素オートタキシンレベルが、成体脳の創傷部に近接する星状膠細胞において上昇し、このことからＣＮＳ損傷反応におけるＬＰＡに関する役割が支持される。マウス脳へのＬＰＡ注入により、損傷部位において星状膠細胞反応性が誘導され、一方で脊髄において、ＬＰＡによって神経因性疼痛及び脱髄が誘導される。ＬＰＡは、星状膠細胞増殖を刺激し得、その濃度に依存して、アポトーシスによるか又は壊死による海馬ニューロン死を促進し得る。さらに、ＬＰＡは、ミクログリア活性化に介在し、微小神経血管内皮細胞に対して細胞毒性がある。さらに、ＬＰＡは、神経幹／前駆細胞（ＮＳ／ＰＣ）の死を誘導し、ニューロンへのそれらの分化を阻害し、影響は他の炎症性分子の添加によって抑制されない。さらに、ＬＰＡは、グリア細胞への神経幹細胞分化を維持し、ゆえにグリア新生及び炎症に関与する。文献とともに発明者らのデータは、ＬＰＡが、神経損傷の結果において及び／又は損傷後の修復において重要な役割を担うものであることを強く示唆する。ＬＰＡは、グリア細胞への神経幹細胞分化を維持し、ゆえに、グリア新生及び炎症に寄与する。文献とともに発明者らのデータは、ＬＰＡが、外傷性脳損傷、脊髄損傷及び神経変性疾患、例えば多発性硬化症、パーキンソン病及びアルツハイマー病などを含む神経損傷の結果において及び／又は損傷後の修復において重要な役割を担うものであることを強く示唆する。

疼痛：神経因性疼痛においてＬＰＡが制御不能になり得ること及びＬＰＡが疼痛反応において原因となり得、偶然に起こり得ないことを強く示唆する多様な科学的研究が増えている。その結果として、ＬＰＡ自体又はＬＰＡ経路を標的とする薬物は、神経因性疼痛を軽減する可能性を有し得る。ＬＰＡは、成長円錐などの突起及び突起退縮及び細胞生存、移動、接着及び増殖に影響を及ぼす神経系における重要なメディエーターであることが示されている。神経因性疼痛発現におけるＬＰＡの重要な役割は、様々な薬理学的及び遺伝学的アプローチを用いて確立された。従って、ＬＰＡに拮抗することは、神経因性疼痛、炎症性疼痛、化学療法誘発性の疼痛及び神経損傷又は外傷により生じる疼痛の治療に有益であり得る。

従って、Ｌｐａｔｈの抗ＬＰＡモノクローナル抗体など、ＬＰＡの有効濃度を低下させる薬剤は、望ましくない過剰な又は異常レベルのＬＰＡが関連する、創傷治癒及び線維症、アポトーシス、血管形成及び血管新生、血管透過性及び炎症を伴うものなどの、疾患及び状態の治療のための方法において有用であると考えられている。

天然起源のＬＰＡに対するポリクローナル抗体が文献で報告されているものの（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．，Ａｕｇ ７；１０（１５）：１６９１−３）、モノクローナル抗体は、ＬＰＡに対する、ヒト化モノクローナル抗体を含むいくつかのモノクローナル抗体を出願者らが開発するまで記載されたことがなかった。例えば、本願発明と所有者が共通し、その全体において本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号を参照のこと。これらの抗ＬＰＡ抗体は、様々なＬＰＡと結合し、中和し得、それらの生物学的及び薬理学的作用を緩和する。従って、抗ＬＰＡ抗体は、過剰な、望ましくない又は異常なレベルのＬＰＡが関連する様々な疾患及び状態の予防及び／又は治療において有用であると考えられる。

ＬＰＡを検出する迅速かつ特異的な方法もまた望ましい。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）とそれに続くガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及び／又は質量分析（ＭＳ）などの技術を用いた、ＬＰＡなどのリン脂質を分離し、半定量的に測定するための方法は公知である。例えば、脂質は、体液の試験試料から抽出され得る。あるいは、様々なリン脂質を分離するために薄層クロマトグラフィーを使用し得る。次に、例えば紫外線を用いて、プレート上でリン脂質及びリゾリン脂質を視覚化することができる。あるいは、リン脂質からの単離後又はリン脂質の一部として、ＮＭＲ又はＨＰＬＣによってリゾリン脂質濃度を同定することができる。ＬＰＡレベルは、培養中の真核細胞においてリゾＰＡ特異的な影響に依存するアッセイを用いて、卵巣癌患者からの腹水においても測定されている。しかし、これらの先行手順は、多大な時間を要し、高価であり、変動しやすく、一般には半定量的でしかない。例えば米国特許第６，２５５，０６３号及び同第６，２４８，５５３号において開示されるような、体液中のＬＰＡなどのリゾリン脂質を検出するための、及びリゾリン脂質レベルの変化と関連する状態と相関させ、これを検出するための酵素法も公知である。本明細書中で開示される抗体は、ＬＰＡの検出のための高感度で特異的な方法に対する基礎をもたらす。

３．定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明の内容において使用される一部の用語を定義する。これらの用語に加えて、他の用語は必要に応じて明細書中の他所で定義する。本明細書中で別段の明確な定義がない限り、本明細書で使用される技術用語は、それらの技術分野で認識される意味を有する。

「異常な」という用語は、例えば、タンパク質又は生物活性脂質などの細胞標的のレベル又は有効濃度に関して、過剰であるか又は望ましくないことを意味する。

「抗体」（「Ａｂ」）又は「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、抗原又はエピトープに結合可能な、免疫グロブリン遺伝子由来であるか、それをモデルとするか又はそれによりコードされる、ペプチド、ポリペプチド又はそれらの断片の何らかの形態を指す。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｍ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．Ｊ．Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｄ．，ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１）を参照のこと。「抗体」という用語は、本明細書中で最も広い意味で使用され、モノクローナル、ポリクローナル又は多特異性抗体、ミニボディー、ヘテロ複合体、ダイアボディー、トリアボディー、キメラ、抗体、合成抗体、抗体断片及び、親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を使用する結合物質（又は抗原結合活性を保持するその変異体）を包含する。抗体は、本明細書中で、親抗体の少なくとも１つの望ましい活性を保持するものとして定義される。望ましい活性は、抗原への特異的な結合能、インビトロでのプロレレーション（ｐｒｏｌｅｒａｔｉｏｎ）阻害能、インビボでの血管形成阻害能及びインビトロでのサイトカインプロファイル変更能を含み得る。本明細書中で、抗体及び抗体断片、変異体及び誘導体はまた、「免疫由来部分」とも呼ばれ、即ち、このような分子又はその少なくとも抗原−結合部分は、抗ＬＰＡ抗体に由来するものである。

ネイティブ抗体（ネイティブ免疫グロブリン）は通常、一般には２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一般的に１個の共有ジスルフィド結合により重鎖に連結され、一方でジスルフィド結合の数は、様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重及び軽鎖は、規則的に間隔があいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に、可変ドメインとも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと直線的に並び、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと直線的に並ぶ。特定のアミノ酸残基が、軽及び重鎖可変ドメイン間の境界面を形成する。「可変ドメイン」及び「可変領域」という用語は、交換可能に使用される。「定常ドメイン」及び「定常領域」という用語も互いに交換可能である。

ＶＨ及びＶＬ領域のそれぞれにおける３個の超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲとしても知られる。）は、その分子のユニークな抗原結合部位を形成する。抗体分子におけるアミノ酸配列変化の殆どは、抗体にその抗原に対する特異性を与えるＣＤＲ内である。

何れかの脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の明確に別個であるタイプのうち１つに割り当てられ得る。

その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを様々なクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの一部はサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びｌｇＡ２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造及び三次元配置は周知である。

「抗体誘導体」は、免疫由来部分、即ち抗体に由来する分子である。これは、例えば、抗原に対する望ましいレベルの結合活性を保持する、抗体変異体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、多価抗体、抗体複合体などを含む。

本明細書中で使用される場合、「抗体断片」は、インタクトな抗体の抗原結合部位又は可変ドメインを含む、インタクトな抗体の一部分を指し、この場合、この部分は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（例えばＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）がないものであり得る。あるいは、定常重鎖ドメイン（例えばＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）の一部が「抗体断片」に含まれ得る。抗体断片は、抗原−結合を保持し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片；ダイアボディー；トリアボディー；１本鎖抗体分子（ｓｃ−Ｆｖ）；ミニボディー、ナノボディー及び抗体断片から形成される多特異性抗体を含む。抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２個の同一の抗原結合断片が生成され、それぞれが１個の抗原結合部位及び残余「Ｆｃ」断片を有するが、このＦｃという名称は、その易結晶化能を反映する。ペプシン処理によって、２個の抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋可能であるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。例として、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、密着非共有結合における１個の重鎖及び１個の軽鎖可変ドメインの２量体から構成される。この配置において、各可変ドメインの３個の超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原−結合部位が定められる。まとめると、６個の超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、１個の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３個の超可変領域のみを含むＦｖの半分）さえも、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識し、結合する能力を有する。「１本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、１本のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりｓＦｖが抗原結合に対する望ましい構造を形成できるようになる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。

Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端において数個の残基が付加されているという点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中で、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’を指す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして生成される。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。

「抗体変異体」とは、この場合は抗ＬＰＡ抗体変異体とは、本明細書中で、抗体配列における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換のためにネイティブ抗ＬＰＡ抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なり、親抗結合抗体の少なくとも１つの望ましい活性を保持する分子を指す。望ましい活性には、抗原への特異的な結合能、インビトロでの増殖阻害能、インビボでの血管形成阻害能及びインビトロでのサイトカインプロファイル変更能が含まれ得る。抗体変異体におけるアミノ酸変化は、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む、軽鎖及び／又は重鎖の可変ドメイン又は定常領域内であり得る。ある実施態様において、変異体は、親抗体の１以上の超可変領域において１以上のアミノ酸置換を含む。例えば、変異体は、親抗体の１以上の超可変領域における、少なくとも１つの、例えば約１から約１０及び好ましくは約２から約５個の置換を含み得る。通常、変異体は、親抗体重又は軽鎖可変ドメイン配列と、少なくとも６５％のアミノ酸配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する。いくつかの状況において、少なくとも５０％の配列同一性が好ましく、この分子の他の特徴は結合及び特異性などの望ましい属性をもたらす。この配列に関する同一性又はホモロジーは、本明細書中で、配列をアラインし、必要に応じて最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、親抗体残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。Ｎ末端、Ｃ末端もしくは内部伸長、欠失又は抗体配列への挿入の何れも、配列同一性又はホモロジーに影響を与えるものとして解釈されるものではない。変異体は、ＬＰＡへの結合能を保持し、好ましくは、親抗体の活性を凌ぐ望ましい活性を有する。例えば、変異体は、より強い結合親和性を有し得、血管形成抑制能及び／又は腫瘍進行阻止能が向上している。例えば、抗スフィンゴ脂質抗体の形式は、本明細書中で開示される生物学的活性アッセイにおいてその活性に影響を与えることが分かっているので、このような望ましい特性（例えば免疫原性低下、半減期延長、安定性向上、効力向上）を分析するために、変異体のＦａｂ形態を親抗体のＦａｂ形態と比較するか又は変異体の全長を親抗体の全長と比較すべきである。本明細書中の特に関心のある変異体抗体は、少なくとも１つの所望の活性の少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約％５、２５、５９以上を示すものであり得る。好ましい変異体は、親抗体と比較して、インビトロで測定した場合に優れた生物物理学的特性を有するか又はインビトロもしくはインビボで測定した場合に優れた生物学的活性を有するものである。

「抗ＬＰＡ剤」とは、ＬＰＡに結合する何らかの治療剤を指し、ＬＰＡ及びその変異体に結合する、抗体、抗体変異体、抗体由来分子又は非抗体由来部分を含む。

「生物活性脂質」は、脂質シグナル伝達分子を指す。生物活性脂質は、構造脂質（例えば膜結合リン脂質）とは区別され、即ちこれらは細胞外及び／又は細胞内シグナル伝達に介在し、従って分化、移動、増殖、分泌、生存及び他の過程を調節することによって、多くのタイプの細胞の機能を調整することに関与する。インビボで、生物活性脂質が細胞外液中で見いだされ、そこでこれらは他の分子、例えばアルブミン及びリポタンパク質などの血清タンパク質と複合体化し得るか又は「遊離」、即ち別の分子種と複合体化していない形態であり得る。細胞外メディエーターとして、一部の生物活性脂質は、膜結合イオンチャネル又はＧＰＣＲ又は酵素又は因子を活性化することによって細胞シグナル伝達を変化させるが、この活性化によって同様に複合シグナル伝達系が活性化され、その結果、細胞機能又は生存に変化がもたらされる。細胞内メディエーターとして、生物活性脂質は、酵素、イオンチャネル又はアクチンなどの構造エレメントといった細胞内成分と直接的に相互作用することによってその作用を発揮し得る。

生物活性脂質の例としては、スフィンゴ脂質、例えばセラミド、セラミド−１−ホスフェート（Ｃ１Ｐ）、スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）及びスフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）などが挙げられる。スフィンゴ脂質及びそれらの誘導体及び代謝物は、スフィンゴイド骨格（スフィンゴミエリン由来）を特徴とする。スフィンゴ脂質及びそれらの誘導体及び代謝物は、重要な細胞過程における多面的な効果を有する細胞外及び細胞内シグナル伝達分子の群に相当する。これらは、スルファチド、ガングリオシド及びセレブロシドを含む。他の生物活性脂質は、グリセロールに基づく骨格；例えば、リゾリン脂質、例えばリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）及び様々なリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）など、ならびにホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ホスファチジン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）及びジアシルグリセリド（ＤＧ）を特徴とする。さらに他の生物活性脂質はアラキドン酸由来であり；これらには、エイコサノイド（エイコサノイド代謝物、例えばＨＥＴＥ、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸及びイソエイコサノイドを含む。）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーターが含まれる。他のリン脂質及びそれらの誘導体を含む他の生物活性脂質も本発明に従い使用され得る。

本発明のいくつかの実施態様において、抗体産生に対して、スフィンゴシンに基づく生物活性脂質（スフィンゴシン及びＳ１Ｐなどのスフィンゴイド骨格を有するもの）とは対照的に、グリセロールに基づく生物活性脂質（ＬＰＡなどのグリセロール由来骨格を有するもの）を標的とすることが好ましいものであり得る。その他の実施態様において、抗体産生に対して、アラキドン酸由来の生物活性脂質を標的とすることが好ましいものであり得、その他の実施態様において、スフィンゴイド由来生物活性脂質ではない、アラキドン酸由来及びグリセロール由来生物活性脂質が好ましい。アラキドン酸由来及びグリセロール由来生物活性脂質を合わせて、本明細書中で「非スフィンゴイド生物活性脂質」と呼ぶことがある。

具体的に、本発明による生物活性脂質のクラスから、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン、ならびに、細胞膜の内側及び／又は外側リーフレットの構造メンバーとして主に機能するそれらの代謝物及び誘導体は除外される。

「生物学的に活性のある」という用語は、抗体又は抗体断片又は変異体の内容において、所望のエピトープに結合可能であり、いくつかの点で生物学的効果を発揮する、抗体又は抗体断片又は抗体変異体を指す。生物学的効果としては、増殖シグナルの調節、抗アポトーシスシグナルの調節、アポトーシスシグナルの調節、エフェクター機能カスケードの調節及び他のリガンド相互作用の調節が挙げられるがこれらに限定されない。

「バイオマーカー」は、疾患の進行又は治療効果を測定する際に有用となる特定の分子特性を有する身体中の特異的な生化学的物質である。例えば、Ｓ１Ｐは、ある種の過剰増殖性及び／又は心血管系状態に対するバイオマーカーである。

「心血管系治療」は、心臓治療（心筋虚血及び心不全の治療）ならびに心疾患など、心血管系に関連する他の疾患の予防及び／又は治療を包含する。「心疾患」という用語は、心臓又は心筋組織を含む何らかのタイプの疾患、障害、外傷又は外科治療を包含する。特に興味深いものは、組織リモデリングに関連する状態である。「心臓治療剤」とは、心臓及び心筋疾患及び障害により引き起こされるか又はこれらが関連する疾患及び疾患に対して治療効果がある薬剤を指す。

「担体」とは、ハプテンに対する複合に適しており、それによりハプテン免疫原性を付与する部分を指す。担体の代表的な非限定クラスはタンパク質であり、その例としては、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルタニン（ｈｅｍａｇｌｕｔａｎｉｎ）、破傷風及びジフテリアトキソイドが挙げられる。本発明に従う使用に適切な担体の他のクラス及び例は当技術分野で公知である。これらならびに後に発見されるか又は発明される天然又は合成担体を本発明に従う適用に適応させることができる。

本明細書中で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」という表現は、交換可能に使用され、このような名称は全て子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、最初の対象細胞及び形質転換数にかかわらずそれらに由来する培養物を含む。意図的な又は想定外の突然変異により全ての子孫がＤＮＡ内容物において正確に同一ではない場合があるということも理解される。最初に形質転換した細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体の子孫が含まれる。個別に指定することが意図される場合、これは内容から明らかとなろう。

「化学療法剤」という用語は、抗癌及び他の抗過剰増殖剤を意味する。従って、化学療法剤は、一般に治療剤のサブセットである。化学療法剤としては、ＤＮＡ損傷剤及びＤＮＡ合成を阻害する薬剤：アントラサイクリン（ドキソルビシン、ドノルビシン、エピルビシン）、アルキル化剤（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパ及びトリエチレンメラミン）、白金誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、シスジアミン−ジクロロ白金）及びトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトサール）；代謝拮抗剤、例えばカペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（及びその活性型、ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、５−ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、６−チオグアニン）；抗血管形成剤（ベバシズマブ、サリドマイド、スニチニブ、レナリドミド、ＴＮＰ−４７０、２−メトキシエストラジオール、ラニビズマブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ペガプタニブ、エンドスタチン）；血管破壊剤（フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、コンブレタスタチン誘導体、例えばＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａなど）；抗体などの生物製剤（ハーセプチン、アバスチン、パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、リツキシン、ゼバリン、マイロターグ、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベキサール、アービタックス）；内分泌治療剤：アロマターゼ阻害剤（４−ヒドロアンドロステンジオン（４−ｈｙｄｒｏａｎｄｒｏｓｔｅｎｄｉｏｎｅ）、エキセメスタン、アミノグルテヒミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｈｉｍｉｄｅ）、アナストラゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、レトゾール（ｌｅｔｏｚｏｌｅ））、抗エストロゲン作用薬（タモキシフェン、トレミフィン（Ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ）、ラオキシフェン（Ｒａｏｘｉｆｅｎｅ）、ファスロデックス）、ステロイド、例えばデキサメタゾンなど；免疫調節剤：サイトカイン、例えばＩＦＮ−β及びＩＬ２など、インテグリン、他の接着タンパク質及びマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害剤）；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸；シグナル伝達阻害剤、例えばイマチニブ（グリベック）のようなチロシンキナーゼ阻害剤；熱ショックタンパク質阻害剤、例えば１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；レチノイド、例えば全トランスレチノイン酸；成長因子受容体又は成長因子自体の阻害剤；抗有糸分裂化合物及び／又はチューブリン脱重合剤、例えばタキソイド（パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール、ＢＡＹ５９−８８６２）、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンなど；ＣＯＸ阻害剤などの抗炎症薬及び細胞周期調節剤、例えば、チェックポイント調節剤及びテロメラーゼ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。

「キメラ」抗体（又は免疫グロブリン）という用語は、特定の種由来であるか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか又は相同である重及び／又は軽鎖を含み、一方で、その鎖の残りの部分が、別の種由来であるか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか又は相同である分子ならびに、望ましい生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片を指す（Ｃａｂｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎｆｒａ；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．８１：６８５１（１９８４））。キメラ抗体の一例は、マウス可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）及びヒト定常ドメインを含有する抗体である。しかし、抗体配列は、脊椎動物由来であるか又は無脊椎動物起源、例えば、軟骨魚類、げっ歯類、イヌ、ネコ、有蹄動物及びヒトを含む霊長類を含む、哺乳動物、鳥類又は魚類由来であり得る。

「併用療法」という用語は、指定の治療効果を達成するために少なくとも２つの個別の治療薬の提供を含む治療計画を指す。例えば、併用療法は、例えば即効性の化学療法剤及び抗脂質抗体などの２以上の化学的に別個の活性成分の投与を含み得る。あるいは、併用療法は、単独で又は放射線療法及び／又は外科手術など別の治療の送達と併用した、抗脂質抗体及び／又は１以上の化学療法剤の投与を含み得る。２以上の化学的に別個の活性成分の投与の内容において、同じ組成物の一部として又は異なる組成物として活性成分が投与され得ることが理解される。個々の組成物として投与する場合、異なる活性成分を含む組成物は、同じ又は異なる投与計画を用いて、同じ又は異なる経路によって、同時に又は異なる時間に投与され得るが、これらは全て、特定の内容の必要に応じて、また、担当医の判断に従い行われる。同様に、単独又は１以上の化学療法剤と組み合わせた１以上の抗脂質抗体種、例えば抗ＬＰＡ抗体を、例えば放射線及び／又は外科手術と併用する場合、薬物は外科手術又は放射線処置の前又は後に送達され得る。

「調節配列」という表現は、特定の宿主生物において操作可能に連結されるコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な調節配列としては、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを使用することが知られている。

「誘導体化生物活性脂質」は、生物活性脂質、例えばＬＰＡであり、これは、極性頭基及び少なくとも１個の炭化水素鎖を有し、炭化水素鎖内の炭素原子が、保護されていても保護されていなくてもよい、ペンダント反応基（例えばスルフィドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシ基、アルケン、アルキン、酸塩化物基又はハロゲン原子）で誘導体化されている。この誘導体化は、分子との反応のために、例えば担体への複合のために、生物活性脂質を活性化するように作用する。

「誘導体化生物活性脂質複合体」とは、担体に対して共有結合により複合化される誘導体化生物活性脂質を指す。本担体はタンパク質分子であってもよいし又はポリエチレングリコール、金コロイド、アジュバント又はシリコンビーズなどの部分であってもよい。誘導体化生物活性脂質複合体は、本発明による抗体反応を生じさせるために免疫原として使用され得、このようにして作製される抗体を検出するための検出試薬として同じ又は異なる生物活性脂質複合体を使用し得る。いくつかの実施態様において、検出に対して使用される場合、誘導体化生物活性脂質複合体を固体支持体に連結する。

「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原−結合部位がある小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成できないリンカーを用いることによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原−結合部位が生成される。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）でより詳細に記載されている。

「有効濃度」とは、例えばある種の不要な生物活性脂質の、絶対的、相対的及び／又は利用可能な濃度及び／又は活性を指す。言い換えると、生物活性脂質の有効濃度は、利用可能であり、その生物学的機能を発揮することができる脂質の量である。本発明において、例えば、生物活性脂質（例えばＣ１Ｐなど）に対するモノクローナル抗体などの免疫由来部分は、脂質への結合によって、脂質の有効濃度を低下させ、その生物学的機能を発揮できないようにすることができる。この例において、脂質そのものは依然として存在するが（言い換えると抗体によって分解されない。）、その受容体又は他の標的に結合して、下流の効果を生じさせることはできないので、絶対濃度ではなく「有効濃度」が適切な尺度である。生物活性脂質の有効濃度の低下は、下流の効果を含め、標的脂質又はその望ましくない効果の「中和」とも呼ばれる。直接及び／又は間接的に生物活性脂質の有効濃度を測定するための方法及びアッセイがある。

「エピトープ」又は「抗原決定基」とは、抗体由来の抗体抗原結合部分と反応する抗原の一部を指す。

「発現カセット」という用語は、当該配列に適合する宿主において構造遺伝子（即ち、タンパク質コード配列、例えば本発明の抗体など）の発現に影響を及ぼすことが可能なヌクレオチド分子を指す。発現カセットは、少なくとも、ポリペプチドコード配列及び、場合によっては他の配列、例えば転写終結シグナルに操作可能に連結されるプロモーターを含む。発現を達成することにおいて必要又は有用なさらなる制御エレメント、例えばエンハンサーも使用し得る。従って、発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組み換えウイルス、組み換え「ネイキッドＤＮＡ」ベクターの何らかの形態などを含む。

「完全ヒト抗体」は、適切な免疫原が提示される場合、必ずしもＣＤＲ移植を必要としないヒト抗体を作製し得る、遺伝子改変（即ちトランスジェニック）動物、一般的には哺乳動物、通常はマウス（例えばＭｅｄａｒｅｘから入手し得るようなもの）において作製される抗体を指し得る。これらの抗体は、完全に「ヒト」であり、即ち、非ヒト抗体遺伝子が、置換されるか又は抑制され、ヒト免疫グロブリン遺伝子の一部又は全てで置換されている動物（例えばトランスジェニックマウス）から産生される抗体である。言い換えると、本発明の抗体は、関連ＣＤＲに対するヒトフレームワークを生成するように遺伝子改変されたマウス又は他の動物に免疫原性形態で提示される場合に、生物活性脂質、具体的にはＬＰＡに対して産生されるものを含む。

「ハプテン」は、非免疫原性であるが、抗体由来の抗体又は抗原−結合部分と反応することができる物質である。言い換えると、ハプテンは、抗原性の特性を有するが免疫原性はない。ハプテンは、一般に、殆どの状況下で、担体、例えばタンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金コロイド、シリコーンビーズと結合された場合にのみ免疫反応を惹起することができる（即ち抗原として作用する）低分子である。本担体はまた、それ自身により免疫反応を惹起しないものでもあり得る。

「ヘテロ複合抗体」という用語は、２つの共有結合的に連結された抗体を指し得る。このような抗体は、架橋剤の使用を含む合成タンパク質化学における公知の方法を用いて作製することができる。本明細書中で使用される場合、「複合体」という用語は、１以上の抗体断片又は結合部分と１以上のポリマー分子の共有結合によって形成された分子を指す。

非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。又は見方を変えると、ヒト化抗対は、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えばマウス）抗体からの選択配列も含有するヒト抗体である。ヒト化抗体は、その結合及び／又は生物学的活性を顕著に変化させない、同じ又は異なる種からの保存的アミノ酸置換又は非天然の残基を含み得る。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。殆どの部分に対して、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望ましい特性を有する、マウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギ又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。

さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも輸入ＣＤＲ又はフレームワーク配列でも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良し、最良化するために行われる。従って、一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個及びある局面において２個の可変ドメインの全てを含み、全て又は超可変ループの全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部又はヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含む。例えばＣａｂｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号；Ｂｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号；Ｐａｄｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願第０，５１９，５９６ Ａ１号；Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８６：１００２９−１００３３）を参照のこと。さらなる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）及びＨａｎｓｅｎ，ＷＯ２００６１０５０６２を参照のこと。

「過剰増殖性疾患」という用語は、癌及び良性腫瘍を引き起こす器官及び組織細胞の制御不能増殖を含むが限定されない、制御不能の細胞増殖が関連する疾患及び障害を指す。内皮細胞が関連する過剰増殖性疾患の結果、血管腫、子宮内膜症、肥満、加齢性黄斑変性及び様々なの網膜症などの血管形成疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症の処置におけるステント留置の結果として再狭窄を引き起こす内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖が起こり得る。線維芽細胞を含む過剰増殖性疾患（例えば線維形成）としては、加齢性黄斑変性、心筋梗塞に関連する心臓のリモデリング及び不全などの過剰な瘢痕化（例えば線維症）の障害、外科手術又は損傷、ケロイド及び線維性腫瘍及びステント留置の結果として一般に起こるものなどの過剰な創傷治癒も挙げられるがこれらに限定されない。

「免疫原」は、免疫原が投与された動物において、特異的な免疫反応、特に抗体反応を誘導することが可能な分子である。本発明において、免疫原は、担体に対して複合体化されている誘導体化生物活性脂質、即ち「誘導体化生物活性脂質複合体」である。免疫原として使用される誘導体化生物活性脂質複合体は、免疫原に反応して生成される抗体の検出のための捕捉物質として使用され得る。従って、免疫原はまた、検出試薬としても使用され得る。あるいは、捕捉物質として使用される誘導体化生物活性脂質複合体は、免疫原におけるものとは異なるリンカー及び／又は担体部分を有し得る。

特に生物学的現象の内容において、「阻害する」とは、減少、抑制又は遅延させることを意味する。例えば、「腫瘍形成の阻害」をもたらす治療は、腫瘍が全く生成しないこと又はこれらの形成がより遅いこと又は未処置の対照よりも数が少ないことを意味し得る。

「単離される」組成物は、その天然環境の成分から同定され、分離され、及び／又は回収されるものである。その天然環境の混入成分は、抗体に対する診断又は治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及びその他のタンパク性又は非タンパク性溶質が含まれ得る。好ましい実施態様において、本組成物は抗体であり、（１）ローリー法により測定される場合に抗体が９５重量％超になるように、最も好ましくは９９重量％超になるように、（２）スピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一となるまで、精製される。組み換え細胞内でのインシトゥ抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離抗体に含まれる。しかし通常は、少なくとも１つの精製段階によって単離抗体を調製する。

「標識」という語は、本明細書中で使用される場合、直接又は間接的に抗体に連結されるものなど、検出可能な化合物又は組成物を指す。標識それ自体、それ自身によって検出可能であり得るか（例えば放射性同位元素標識又は蛍光ラベル）又は酵素性標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒し得る。

「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（本明細書中で開示される抗スフィンゴ脂質抗体及び、場合によっては化学療法剤など）の送達に有用な様々なタイプの脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から構成される小型の小胞である。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質配置と同様に二重層形態で配置される。「単離される」核酸分子は、この抗体核酸の天然起源において通常は会合している少なくとも１つの混入核酸分子から、同定され、分離される核酸分子である。単離核酸分子は、天然でそれが見出される形態又は設定以外にある。従って、単離核酸分子は、天然の細胞に存在するときの核酸分子とは区別される。しかし、単離核酸分子は、通常、例えばその核酸分子が非改変細胞の場合とは異なる染色体上の位置にある抗体発現細胞中に含有される、核酸分子を含む。

本発明の内容において、「液体組成物」は、製造者からエンドユーザー（例えば医師又は看護師）に提供されるようなその充填及び最終形態の、固体とは対照的な、液体又は溶液であるものを指す。ここで、「固体」は、液体又は溶液ではない組成物を指す。例えば、固体には、凍結乾燥、フリーズドライ処理、沈殿及び同様の手順により調製される乾燥組成物が含まれる。

「直鎖抗体」という表現は、本願を通じて使用される場合、Ｚａｐａｔａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載の抗体を指す。簡潔に述べると、これらの抗体は、抗原結合領域のペアを形成する、タンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）のペアを含む。直鎖抗体は二特異性又は単一特異性であり得る。

「代謝物」という用語は、ＬＰＡが生成される化合物ならびにＬＰＡの分解の結果生じるものを指し、即ち、リゾリン脂質代謝経路に関与する化合物である。「代謝前駆体」という用語は、スフィンゴ脂質が生成される化合物を指すために使用され得る。

「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、本明細書中で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体又はこの抗体集団を指す。集団を含む個々の抗体は、微量に存在し得る可能性のある天然の突然変異を除き、基本的に同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、一般的に様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるような抗体の特徴を指し、何らかの特定の方法による抗体の作製を必要とするものと解釈すべきものではない。例えば、本発明に従い使用されるべきモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により記載されるハイブリドーマ法により作製され得るか又は組み換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）により作製され得る。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術又は当技術分野で公知のその他の方法を用いてファージ抗体ライブラリから単離され得る。本明細書中で、モノクローナル抗体は、具体的に、重及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか又は相同であり、一方でこの鎖の残りの部分は、別の種由来であるか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか又は相同であるキメラ抗体ならびに、所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。

「単剤療法」は、単回投与として投与されるものであれ又は長時間にわたり数回の投与として投与されるものであれ、１つの治療的有効化合物の送達に基づく治療計画を指す。

「多特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特性を有する抗体又はモノクローナル抗体を指し得る。ある実施態様において、このエピトープは同じ抗原由来である。別の実施態様において、このエピトープは２以上の異なる抗原由来である。多特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。多特異性抗体は、二特異性抗体（２種類のエピトープに対して結合特性を有する。）、三特異性抗体（３種類のエピトープ）などを含む。例えば、２以上の免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの同時発現を用いて、多特異性抗体を組み換えにより作製し得る。あるいは、化学的連結を用いて多特異性抗体を調製し得る。当業者は、これら又は当技術分野で公知であり得るその他の方法を用いて多特異性抗体を作製し得る。多特異性抗体は多特異性抗体断片を含む。本発明により包含される多特異性（この場合、二特異的）抗体の一例は、Ｓ１Ｐエピトープ及びＣ１Ｐエピトープに対する結合特性を有する抗体であり、従って、これはＳ１Ｐ及びＣ１Ｐの両方を認識し、これらに結合可能である。本発明により包含される二特異性抗体の別の例は、生物活性脂質からのエピトープ及び細胞表面抗原からのエピトープに対する結合特性を有する抗体である。従って、本抗体は、生物活性脂質を認識し、これに結合することができ、例えば標的化目的で、細胞を認識し、これに結合することができる。

「新生物」又は「癌」とは、異常であり制御不能の細胞成長を指す。「新生物」又は腫瘍又は癌は、異常で制御されず、無秩序な細胞成長の増殖であり、一般に癌と呼ばれる。新生物は、良性又は悪性であり得る。破壊的な増殖、浸潤性及び転移の特性を有する場合、新生物は悪性又は癌性である。浸潤性とは、一般に組織の境界を規定している基底膜を突破し、それによりしばしば身体の循環系に侵入する、周囲組織の浸潤又は破壊による新生物の局所的拡散を指す。転移は、一般に、リンパ管又は血管による腫瘍細胞の伝播を指す。転移はまた、漿液腔又はくも膜下もしくは他の空間を通じた直接的拡大による腫瘍細胞の移動を指す。転移の過程を通じて、身体の他の領域への腫瘍細胞移動によって、最初の出現部位とは離れた領域で新生物が確立される。

「神経因性疼痛」は、神経系における病理学的変化により引き起こされる慢性痛状態である。

核酸が、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、この核酸は、「操作可能に連結される」。例えば、プレ配列又は分泌リーダーに対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに操作可能に連結されるか；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に操作可能に連結されるか；又はリボソーム結合部位が、翻訳を促進するように置かれる場合、コード配列に操作可能に連結される。一般に「操作可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は近接しており、リーディングフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位でのライゲーションにより遂行される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、従来の実施に従い使用される。

「親」抗体は、本明細書中で、変異体の調製に対して使用されるアミノ酸配列によりコードされるものである。親抗体は、ネイティブ抗体であり得るか又は既に変異体、例えばキメラ抗体であり得る。例えば、この親抗体はヒト化又はヒト抗体であり得る。

本発明による「特許性のある」組成物、過程、機械又は製品は、これらの対象が分析が実施される時点で特許性に関する全ての法定要件を満たすことを意味する。例えば、新規性、非自明性などに関して、後の調査によって１以上のクレイムが新規性、非自明性などを否定する１以上の実施態様を包含することが明らかとなる場合、定義により「特許性のある」実施態様に限定されるクレイムは、特許性のない実施態様を明確に排除する。また、本明細書に添付されるクレイムは、最も広い妥当な範囲を提供すると同時に、それらの妥当性を保持すると解釈すべきである。さらに、特許性に関する１以上の法定要件が訂正されるか又は本願が特許として出願又は発行される時から、１以上の添付クレイムの妥当性が疑わしくなる時まで、特許性に関する特定の法定要件を満たすか否かを評価するための基準が変化する場合には、クレイムは、（１）それらの妥当性を保持し、（２）その状況下で最も広い妥当な解釈を提供するように解釈すべきである。

「医薬的に許容可能な塩」という用語は、本発明の薬剤及び化合物の生物学的有効性及び特性を保持し、生物学的に又はその他の点で望ましくない処方において使用されるものなどの、塩を指す。多くの場合、本発明の薬剤及び化合物は、荷電基、例えば、荷電アミノ及び／又はカルボキシル基又はそれらと類似の基が存在することにより、酸性及び／又は塩基性塩を形成することができる。医薬的に許容可能な酸付加塩は、無機酸及び有機酸から調製され得、一方で医薬的に許容可能な塩基付加塩は、無機塩基及び有機塩基から調製され得る。医薬的に許容可能な塩の概説については（Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．（１９７７），Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．６６，１−１９参照）。

「複数」とは、１より大きいことを意味する。

「プロモーター」という用語は、細胞においてコード配列の転写を支配することができる全ての配列を含む。従って、本発明のコンストラクトにおいて使用されるプロモーターは、遺伝子の転写のタイミング及び／又は効率を制御又は調節することに関与する、ｃｉｓ−作用転写調節エレメント及び制御配列を含む。例えば、プロモーターは、転写制御に関与する、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組み込み配列、５’及び３’非翻訳領域又はイントロン配列を含む、ｃｉｓ−作用転写調節エレメントであり得る。本発明における使用に適切な転写制御領域としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、Ｅ．コリ（大腸菌）ｌａｃ又はｔｒｐプロモーター及び原核又は真核細胞又はそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を調節することが知られているその他のプロモーターが挙げられるが限定されない。

「組み換えＤＮＡ」という用語は、人間により改変されるか、作製されるか又は修飾された、それらから発現される核酸及び遺伝子産物を指す。「組み換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組み換えＤＮＡ技術によって、例えば所望のポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞から作製される、ポリペプチド又はタンパク質である。「合成」ポリペプチド又はタンパク質は、化学合成により調製されるものである。

「分離される」、「精製される」、「単離される」などの用語は、試料保持容器中に含有される試料の１以上の成分が、物理的に除去されるか又は除去されているか又は容器中に存在する１以上の他の試料成分の存在下で希釈されていることを意味する。分離又は精製段階中に除去されるか又は希釈され得る試料成分としては、化学反応産物、未反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質及び未結合分子が挙げられる。

「固相」とは、本発明の抗体が接着可能であるものなどの非水性マトリクスを意味する。本明細書中に包含される固相の例としては、部分的又は完全に、ガラス（例えばコントロールドポア（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ）ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されるものが挙げられる。ある種の実施態様において、内容に依存して、固相には、アッセイプレートのウェルが含まれ得；その他において、これは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載のものなど、別個の粒子の非連続固相も含む。

「種」という用語は、本明細書中で、例えば化学療法剤の特定の種など、様々な内容において用いられる。それぞれの内容において、この用語は、特定の内容において言及される種類の化学的に区別できない分子の集団を指す。

「特異的な」又は「特異性」という用語は、抗体−抗原相互作用の内容において、抗体とその標的エピトープ間の選択的で無作為ではない相互作用を指す。ここで、「抗原」という用語は、抗体分子又はその他の免疫由来部分を認識し、これにより結合される分子を指す。抗体が結合する抗原の特異的な部分は、「エピトープ」と呼ばれる。この相互作用は、分子間の適切な化学的又は分子的相互作用を可能にする、構造的、疎水性／親水性及び／又は静電気特性の存在に依存する。従って、抗体は、一般に、その標的抗原のエピトープに対して、「結合する」（もしくは「特異的に結合する」）又はその標的抗原のエピトープ「と反応性がある」（もしくは「特異的な反応性がある」）又は同様に、その標的抗原のエピトープ「に対して反応性がある」（もしくは「に対して特異的な活性がある」）と言われる。抗体は、一般に、抗原への抗体結合に対する省略表現として、それらの抗原「に対して」又はそれらの抗原「に」として当技術分野で記載される。従って、「Ｃ１Ｐに結合する抗体」、「Ｃ１Ｐに対して反応性がある抗体」、「Ｃ１Ｐと反応性がある抗体」、「Ｃ１Ｐに対する抗体」及び「抗Ｃ１Ｐ抗体」は全て、当技術分野で同じ意味を有する。ある一定の条件設定下で未処理抗原又は類似抗原又は抗原混合物への結合と、所望の抗原に対する結合を比較することによって、結合の特異性について抗体分子を試験することができる。好ましくは、本発明による抗体は、非関連抗原又は標的抗原の類似体へも顕著な結合がない。

本明細書中で、「安定な」とは、分子が所望の目的又は操作に対して維持され得るよう十分に安定である２つの分子（例えばペプチド及びＴＬＲ分子）間の相互作用を指す。例えば、ペプチドとＴＬＲ分子との間の「安定な」相互作用は、そのペプチドがＴＬＲ分子と会合するようになり、所望の効果を達成するのに十分な時間にわたり会合したままであるものを指す。

「対象」又は「患者」は、本発明の分子により達成され得る治療を必要とする動物を指す。本発明に従い治療され得る動物としては、脊椎動物が挙げられるが、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類を含む）などの哺乳動物が特に好ましい例である。

「代用マーカー」とは、疾患状態における治療効果を間接的に示す体内の生物学的活性の実験室測定手段を指す。過剰増殖性及び／又は心血管系状態に対する代用マーカーの例としてはＳＰＨＫ及び／又はＳ１ＰＲが挙げられる。

「治療薬」とは、ＣＯＸ阻害剤及びその他のＮＳＡＩＤＳを含む抗炎症薬、抗血管新生薬、上記で定義されるとおりの化学療法剤、心血管系薬、免疫調節薬、神経変性疾患を治療するために使用される薬物、眼科用剤などを含むが限定されない、治療効果を提供することが意図される薬物又は化合物を指す。

「治療的有効量」（又は「有効量」）とは、当該治療を必要とする対象に投与される場合に治療を達成するのに十分な、活性成分、例えば本発明による薬剤の量を指す。従って、本発明による組成物の治療的有効量を構成するものは、当業者により容易に決定され得る。癌治療の内容において、「治療的有効量」とは、特定の癌に相関する１以上の遺伝子の発現の増減、全身腫瘍組織量の減少、癌細胞溶解、生体試料（例えば生検及び全血、血漿、血清、尿などの体液のアリコートなど）中の１以上の癌細胞死マーカーの検出、誘導アポトーシスの誘導又は他の細胞死経路などを含む、癌細胞生存又は代謝に関連する１以上のパラメーターにおける客観的に測定される変化を生じさせるものである。言うまでもなく、治療的有効量は、治療される特定の対象及び状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、選択される特定の化合物、従うべき投与計画、投与のタイミング、投与方式などに依存して変動するが、これらは全て、当業者により容易に決定され得る。当然のことながら、併用療法の内容において、特定の活性成分の治療的有効量を構成するものは、単剤療法（即ち、活性成分として１種類の化学物質のみを使用する治療計画）として投与される場合の活性成分の治療的有効量を構成するものとは異なり得る。

本発明の組成物は、生物活性脂質に基づく治療の方法において使用される。本明細書中で使用される場合、「治療」及び「治療用」という用語は、疾患、障害又は身体外傷に対する予防及び／又は治療の全範囲を包含する。本発明の「治療用」薬剤は、リスクがあると判定され得る個体を標的とするために設計される手順を組み込むものを含め、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｔｉｃ又はｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）である方式で；又は事実上改善させるか又は治癒させるように作用し得るか；又は治療される疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状の進行速度もしくは程度を遅延させるように作用し得るか；又は疾患、障害もしくは身体外傷からの回復に伴う、必要とされる時間にわたり、何らかの不快感もしくは疼痛の発生もしくはその程度もしくは身体活動の制限を最小化するために作用し得るか；又は他の治療法及び治療に対するアジュバントとして使用し得る。

「治療」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患又は障害に対する予防又は防御（即ち、臨床症状を発現させない）；疾患又は障害の阻害（即ち臨床症状の発現を停止、遅延又は抑制すること）；及び／又は疾患又は障害の緩和（即ち臨床症状を軽減すること）を含む、疾患又は障害の何らかの治療を意味する。認識されるであろうように、最終的な誘導的事象は不明又は潜在的であり得るので、疾患又は障害を「予防すること」と「抑制すること」とを区別することは必ずしも可能ではない。「治療を必要とする」者には、既に障害がある者ならびに障害を予防しようとする者が含まれる。従って、「予防」という用語は、「予防」及び「抑制」の両方を包含する「治療」のタイプを構成すると理解される。従って、「防御」という用語は、「予防」を含む。

「治療計画」という用語は、化学療法及び細胞毒性剤、放射線療法、外科手術、遺伝子治療、ＤＮＡワクチン及び治療、ｓｉＲＮＡ療法、抗血管形成療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマー及び抗体及び抗体変異体、受容体デコイ及びその他のタンパク質に基づく治療薬などのその他の生物療法剤を用いた疾患又は障害の何らかの治療を意味する。

抗体の「可変」領域は、フレームワーク及び相補性決定領域（ＣＤＲ、あるいは超可変領域として知られる。）を含む。可変性は、抗体の可変ドメイン全体で均一に分布してはいない。これは６個のＣＤＲセグメントに集中しており、軽鎖及び重鎖可変ドメインそれぞれに３個ずつある。可変ドメインのより高度に保存される部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ重及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４個のＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含み、概して、３個の超可変領域が連結するβ−シート構造をとり、この３個の超可変領域は、βシート構造に連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３））；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））及び／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

各鎖の超可変領域は、ＦＲにより近接近して一緒に保持されており、他方の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原−結合部位の形成に関与する（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），６４７−６６９頁参照）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。

「ベクター」又は「プラスミド」又は「発現ベクター」は、１以上の組み換え遺伝子の発現を達成するために細胞中で一過性に又は安定的に維持され得る核酸を指す。ベクターは、単独で又は他の化合物と複合化して、核酸を含み得る。ベクターは、場合によっては、ウイルス性又は細菌性核酸及び／又はタンパク質、及び／又は膜を含む。ベクターとしては、ＤＮＡ断片に接着し、ＤＮＡが複製されるようになり得るレプリコン（例えばＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）が挙げられるがこれらに限定されない。従って、ベクターとしては、ＲＮＡ、自律性の自己複製環状又は直鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されず、発現及び非発現プラスミドの両方が含まれる。プラスミドは市販され得るか、無制限に一般に入手可能であるか又は公開されているプロトコールにより報告されるように入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに発現ベクターは、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性など又はＥ．コリにおけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性など、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための遺伝子も含有し得る。

本願は、疼痛を治療又は予防する方法を記載する。本発明の方法は、ＬＰＡに結合し、中和するのに有効である量で、ＬＰＡに結合する抗体又は抗体断片を、ヒト対象を含む対象に投与することを含む。本抗体は、ＬＰＡ結合活性を保持するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体又はこのような抗体の抗原結合断片であり得る。好ましくは、ＬＰＡに結合するヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体又はそれらの断片である。特に好ましい例としては、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＫＴＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号４）、ＴＳＧＱＳＬＶＨＩＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号１１）、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号１５）又はＳＡＳＳＳＬＳＹＭＨ（配列番号２０）を有するＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）、ＫＶＳＮＬＦＳ（配列番号１２）又はＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号２１）を有するＣＤＲＬ２及びアミノ酸配列ＳＱＳＴＨＦＰＦＴ（配列番号６）又はＨＲＲＳＳＹＴ（配列番号２２）を有するＣＤＲＬ３を含む少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（全長軽鎖ポリペプチド以下のもの及びこれを含むもの）ならびに、アミノ酸配列ＮＹＬＩＥ（配列番号７）又はＳＧＹＹＷＴ（配列番号２３）を有するＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＬＩＹＰＤＳＧＹＩＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号２）、ＬＩＮＰＧＳＤＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号９）、ＬＩＩＰＧＴＧＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号１３）、ＹＩＧＹＤＧＳＮＤＳＮＰＳＬＫＮ（配列番号１８）又はＡＩＮＰＧＳＤＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号３４）を有するＣＤＲＨ２及びアミノ酸配列ＲＦＡＹＹＧＳＧＹＹＦＤＹ（配列番号３）、ＲＦＧＹＹＧＳＧＮＹＦＤＹ（配列番号１０）、ＲＦＧＹＹＧＳＳＮＹＦＤＹ（配列番号１４）、ＲＦＧＹＹＧＳＧＹＹＦＤＹ（配列番号１６）又はＡＭＬＲＲＧＦＤＹ（配列番号１９）を有するＣＤＲＨ３を含む、少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（全長重鎖ポリペプチド以下のもの及びこれを含むもの）を有するものが挙げられる。モノクローナル抗体（又はそれらの断片）は、配列番号２７、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２又は４３を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドと、配列番号２６、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１又は６２を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む少なくとも１つの重鎖ポリペプチドと、を有し得る。

本発明に従い治療される疼痛は、急性又は慢性痛であり得る。本方法は、特に、神経因性疼痛及び、中枢もしくは末梢神経系に対する損傷、外傷又は傷害、炎症、薬物への曝露、糖尿病、ウイルス性疾患、代謝疾患、虚血性障害、栄養不足、毒物への曝露、癌又は癌治療などによる疼痛（神経因性疼痛を含む。）を治療又は予防するために有用である。

本発明の先行する及びその他の局面及び実施態様は、次の詳細な説明、付随する図面及びクレイムから、より明らかとなろう。別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が関連する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと同様又は類似の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下で述べる。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。不一致がある場合、定義を含め本明細書が優先する。さらに、本材料、方法及び実施例は単に説明のためであり、限定するものではない。

図面の簡単な要約を下記で提供する。

図１は、３つの部分を含有し、図１ａ、１ｂ及び１ｃは、ＥＬＩＳＡに基づく競合結合アッセイで測定した場合の、それぞれヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４及びマウスｍＡｂ、Ｂ３の結合特異性を示す線グラフである。 図１は、３つの部分を含有し、図１ａ、１ｂ及び１ｃは、ＥＬＩＳＡに基づく競合結合アッセイで測定した場合の、それぞれヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４及びマウスｍＡｂ、Ｂ３の結合特異性を示す線グラフである。 図１は、３つの部分を含有し、図１ａ、１ｂ及び１ｃは、ＥＬＩＳＡに基づく競合結合アッセイで測定した場合の、それぞれヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４及びマウスｍＡｂ、Ｂ３の結合特異性を示す線グラフである。 図２は、３つの部分を含有し、図２ａ、２ｂ及び２ｃは、ＥＬＩＳＡに基づく競合結合アッセイで測定した場合の、様々なＬＰＡアイソフォームに対する、それぞれヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４及びマウス抗ＬＰＡ ｍＡｂ、Ｂ３の結合親和性を示す線グラフである。 図２は、３つの部分を含有し、図２ａ、２ｂ及び２ｃは、ＥＬＩＳＡに基づく競合結合アッセイで測定した場合の、様々なＬＰＡアイソフォームに対する、それぞれヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４及びマウス抗ＬＰＡ ｍＡｂ、Ｂ３の結合親和性を示す線グラフである。 図２は、３つの部分を含有し、図２ａ、２ｂ及び２ｃは、ＥＬＩＳＡに基づく競合結合アッセイで測定した場合の、様々なＬＰＡアイソフォームに対する、それぞれヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４及びマウス抗ＬＰＡ ｍＡｂ、Ｂ３の結合親和性を示す線グラフである。 図３は、対照又は糖尿病ラットに対する肢逃避閾値（ＰＷＴ）を示す棒グラフである。対照ラットにはビヒクル（Ｖｅｈ）を髄腔内及び静脈内注射により投与した。糖尿病（Ｄ）ラットを次の群に無作為に分けた：Ｖｅｈ＋Ｄ、ビヒクルの髄腔内及び静脈内注射、低用量＋Ｄ、静脈内注射抗ＬＰＡ−ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＬＰＡ−ｍＡｂ（２μｇ／１０μＬ）の髄腔内注射及び高用量＋Ｄ、静脈内注射抗ＬＰＡ−ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＬＰＡ−ｍＡｂ（１０μｇ／１０μＬ）の髄腔内注射。 図４は、糖尿病ラットでの介入研究における疼痛の尺度である肢逃避潜時における抗ＬＰＡ抗体の効果を示す、２つの部分からなる図面である。図４Ａは、疼痛の尺度である肢逃避潜時（ＰＷＬ）における抗ＬＰＡ抗体治療効果を示す時間的経過の線グラフである。図４Ｂは、肢逃避閾値に対する曲線下面積を示す棒グラフである。ガバペンチンを陽性対照として使用する。 図４は、糖尿病ラットでの介入研究における疼痛の尺度である肢逃避潜時における抗ＬＰＡ抗体の効果を示す、２つの部分からなる図面である。図４Ａは、疼痛の尺度である肢逃避潜時（ＰＷＬ）における抗ＬＰＡ抗体治療効果を示す時間的経過の線グラフである。図４Ｂは、肢逃避閾値に対する曲線下面積を示す棒グラフである。ガバペンチンを陽性対照として使用する。 図５は、疼痛の尺度である肢逃避潜時における抗ＬＰＡ抗体の効果を示す、２つの部分からなる図面である。図５Ａは、疼痛の尺度である肢逃避潜時（ＰＷＬ）における予防的抗ＬＰＡ抗体治療の効果を示す時系列である。図５Ｂは、ＰＷＬにおける介入的抗ＬＰＡ抗体治療の効果を示す棒グラフである。予防的及び介入的処置の両方によって、このモデルにおいて疼痛が軽減した。 図５は、疼痛の尺度である肢逃避潜時における抗ＬＰＡ抗体の効果を示す、２つの部分からなる図面である。図５Ａは、疼痛の尺度である肢逃避潜時（ＰＷＬ）における予防的抗ＬＰＡ抗体治療の効果を示す時系列である。図５Ｂは、ＰＷＬにおける介入的抗ＬＰＡ抗体治療の効果を示す棒グラフである。予防的及び介入的処置の両方によって、このモデルにおいて疼痛が軽減した。 図６は、経時的な疼痛の２つの尺度における抗ＬＰＡ抗体の効果を示す、２つの部分からなる線グラフである。図６ａは、１４日間にわたる、熱痛逃避（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓアッセイ）における３種類の用量の抗ＬＰＡ抗体の効果を示す。図６ｂは、１４日間にわたる、肢への加圧における３種類の用量の抗ＬＰＡ抗体の効果を示す。 図６は、経時的な疼痛の２つの尺度における抗ＬＰＡ抗体の効果を示す、２つの部分からなる線グラフである。図６ａは、１４日間にわたる、熱痛逃避（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓアッセイ）における３種類の用量の抗ＬＰＡ抗体の効果を示す。図６ｂは、１４日間にわたる、肢への加圧における３種類の用量の抗ＬＰＡ抗体の効果を示す。 図７は、ヒト化抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５での治療後の、関節炎ラットにおける疼痛発声の抑制を示す棒グラフである。この予備実験において本抗体を３段階の用量で与えた（１．６、８及び４０ｍｇ／ｋｇ）。上位２段階の用量によって、陽性対照であるナプロキセンでの治療後に見られるレベルまで疼痛発声が軽減した。最低用量（１．６ｍｇ／ｋｇ）の効果は中間的であり、非特異的抗体の疼痛発声への効果は僅かであった。 図８は、パクリタキセル誘発性神経因性疼痛におけるマウス抗ＬＰＡ抗体Ｂ３（このグラフで５０４Ｂ３として示す。）及びＬＴ１０１５の効果を示す線グラフである。ビヒクル群（□）と比較した場合、パクリタキセル（●）の投与によって、機械的アロディニアの時間依存的発現が引き起こされ、これは５０４Ｂ３（▲）の静脈内送達により１６時間の時点で顕著に減弱したが、ＬＴ１０１５（▼）によっては減弱しなかった。結果を平均±ＳＥＭとして表す。パクリタキセル群に対するボンフェローニの事後比較とともに両側、２要因ＡＮＯＶＡによって３匹の動物に対する行動データを解析し、パクリタキセル対ビヒクルに対しては^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊Ｐ＜０．００１、パクリタキセル＋５０４Ｂ３対パクリタキセルに対しては†Ｐ＜０．０５であった。

抗ＬＰＡ抗体を含む抗ＬＰＡ剤
１．導入
様々な疾患及び障害に対する治療処置剤としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（又は抗原結合活性を保持するその断片、例えばＦａｂ断片）は、安全で効果的な治療剤であることが示されるにつれて、その使用が急速に増加している。認可済み治療用モノクローナル抗体としてはＡｖａｓｔｉｎ（商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）及びＲｉｔｕｘａｎ（商標）が挙げられる。さらなるモノクローナル抗体は、様々な疾患に対する臨床開発の様々なフェーズにあり、殆どが様々な形態の癌を標的とする。一般に、モノクローナル抗体は非ヒト哺乳動物において産生される。マウスモノクローナル抗体の治療的有用性は、非ヒト哺乳動物抗体のキメラ化又はヒト化により改善され得る。ヒト化によって、投与される治療用モノクローナル抗体に対する免疫反応の発現が大きく抑制され、それにより半減期の短縮及びこのような反応における結果である治療効果の低下が回避される。殆どの部分に対して、ヒト化過程は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）にマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植することから構成される。最初の移植コンストラクトにおいて喪失される親和性を改善するか又は取り戻すために、ＦＲにおける選択残基のマウスアミノ酸残基への復帰突然変異を必要とすることが多い。

モノクローナル抗体の製造は、免疫グロブリンタンパク質そのものの多様性が原因となる複雑な過程である。異種性は、選択的なジスルフィド対形成の形成、脱アミド化及びイソアスパルチル残基の形成、メチオニン及びシステイン酸化、ピログルタミン酸に対するＮ末端グルタミン残基の環状化及び哺乳動物カルボキシペプチダーゼによるＣ末端リジンの部分的酵素性切断に起因し得る。安定性向上、プロテアーゼに対する耐性、凝集挙動及び異種系での発現レベル向上など、抗体分子の特性を改善するために、通常、抗体分子に対して改変が行われる。

２．ＬＰＡの疾患関連性及び抗ＬＰＡ剤に対する治療的使用
ＬＰＡは、多くの疾患及び障害と関連付けられている。概説としては、Ｇａｒｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２（２）：６５−７５及びＣｈｕｎ Ｊ．ａｎｄ Ｒｏｓｅｎ，Ｈ．，（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａ．Ｄｅｓｉｇｎ １２：１６１−１７１を参照のこと。これらには、自己免疾患、例えば糖尿病、多発性硬化症及び強皮症など；癌を含む過剰増殖性疾患；疼痛、血管形成及び血管新生が関連する疾患；肥満；アルツハイマー病を含む神経変性疾患；統合失調症、免疫関連障害、例えば移植拒絶及び移植片対宿主病など及びその他が含まれる。多くの疾患及び障害におけるＬＰＡの役割は、例えば本願発明と所有者が共通し、その全体において及び全ての目的に対して本願発明及びその全体において本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号（ＵＳＳＮ１２／４０６，８７４）でさらに記載されている。ＬＰＡの異常なレベルが関連する、下記で列挙されるものなどの疼痛を含む疾患は、ＬＰＡに結合し、中和する抗体又は抗体断片での治療に対して特に適切である。

疼痛は、米国において医師の診察を受けるための最も一般的な理由であり、広範囲の疾患、障害及び状態の一部として存在する。疼痛は、急性又は慢性であり得、身体の場所に従い及び／又は病因によって分類され得るが、多くの場合、疼痛の病因は不明であるか又は重複し得るいくつかの可能性のある原因によるものであり得る。疼痛はまた例えばアロディニア（疼痛の異常知覚）又は痛覚過敏（疼痛感覚過剰）として質的にも記載され得る。

神経因性疼痛は、複雑で、しばしば慢性タイプの、神経系の損傷又は機能不全が関連する疼痛である。簡単に述べると、神経因性疼痛は、神経系における病理学的変化により引き起こされる慢性痛状態である。Ｍｙｅｒｓ，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ １１：８−２０。急性及び／又は慢性神経因性疼痛の原因としては、中枢又は末梢神経系に対する損傷、外傷又は傷害（例えば脊髄損傷、椎間板ヘルニア、多発性硬化症又はその他の変性又は神経変性疾患）、炎症、薬物への曝露（例えば、細胞毒性剤、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、シスプラチン及びその他の化学療法剤など）、糖尿病、ウイルス性疾患（例えば、ＨＩＶ及び帯状疱疹など）、代謝性疾患、重篤な虚血侵襲、栄養不足、毒物への曝露及び癌が挙げられるがこれらに限定されない。癌神経因性疼痛は、神経における腫瘍インピンジメントからの直接的な又は放射線、外科手術もしくは薬物治療などからの間接的な結果であり得る。神経因性疼痛には、最初の損傷に対する炎症反応により制御され、神経系組織に影響を与える神経炎症の機構が介在する。Ｍｙｅｒｓ，ｅｔ ａｌ（２００６），Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ １１：８−２０。ＴＮＦαなどの多くの炎症性メディエーターは、神経因性疼痛において極めて重要であることが分かっている。Ｌｅｕｎｇ Ｌ，Ｃａｈｉｌｌ ＣＭ．（２０１０）Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍ．，７：２７。神経因性疼痛は最も一般的な鎮痛剤には反応しない。

炎症性メディエーターは、疼痛の発生、持続及び重症度に関与する。ＩＬ−６は強力な疼痛発生炎症性メディエーターである。ＩＬ−６は、末梢神経損傷後、ラット脊髄で産生され、ＩＬ−６レベルはアロディニアの強度と正の相関がある。Ａｒｒｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８７９：２１６−２５。ＩＬ−６レベルはストレス又は炎症中に向上し、関節リウマチには滑液中のＩＬ−６レベル向上が関連する。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ（２００６），Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．２６：１０９６−１１００；Ｄｅｓｇｅｏｒｇｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：１５１０−１５１６。神経因性疼痛はＩＬ−６ノックアウトマウスにおいて阻止される。Ｘｕ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９：１０２８−１０３３。

ＩＬ−８は、疼痛発生炎症性メディエーターである。ヘルペス後神経痛の薬物治療によってＩＬ−８濃度の５０％の低下が示され、これは疼痛緩和と相関して低下する。Ｋｏｔａｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５１４−１５１９。

ＴＮＦ−αは、軸索損傷、マクロファージの動員及び末梢神経線維における異所性活性を誘発し、痛覚過敏の発生に関与する。ＴＮＦ−αは、末梢神経病変の部位で及び神経因性疼痛のある患者において上方制御される。ＴＮＦ産生の選択的ブロッカーであるサリドマイドは、神経因性疼痛（慢性絞扼性損傷）の動物モデルにおいて痛覚過敏を軽減する。Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｐａｉｎ ８８：２６７−２７５。

様々な薬理学的及び遺伝学的アプローチを使用することによって、神経因性疼痛の発現におけるＬＰＡの顕著な役割が確立された。ＬＰＡは、持続性の機械的アロディニア及び温熱性痛覚過敏ならびに脱髄及びＬＰＡ１受容体を通じた疼痛関連タンパク質の上方制御に関与する。さらに、ＬＰＡの髄腔内注射は、神経結紮後に観察されるものと同様の、後根の脱髄に伴う疼痛刺激に対する感受性延長など、行動的、形態的及び生化学的変化を誘導する。Ｆｕｊｉｔａ，Ｒ．，Ｋｉｇｕｃｈｉ，Ｎ．＆ Ｕｅｄａ，Ｈ．（２００７），Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ ５０，３５１−５。神経損傷がある野生型動物は、後根における脱髄及び脊髄後角内のタンパク質キナーゼＣアイソフォーム及び後根神経節における２１カルシウムチャネルサブユニットの両方の発現上昇に並行して行動性アロディニア及び痛覚過敏を発現する。ＬＰＡ１受容体遺伝子を欠くマウス（ｌｐａ１−／−マウス）は、神経損傷誘導性の神経因性疼痛性行動及び現象がないことが明らかになっている。Ｉｎｏｕｅ，ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎａｔ Ｍｅｄ １０，７１２−８。オートタキシン遺伝子に対するヘテロ接合性突然変異体マウス（ａｔｘ＋／−）は、神経損傷誘導性神経因性疼痛のおよそ５０％の回復を示した。ｌｐａ１−／−及びａｔｘ＋／−マウスの両方で痛覚過敏が完全に消失した。さらに、Ｒｈｏ及びＲｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤も神経因性疼痛を阻止した。Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｂ．Ｋ．，Ｍａｃｋ，Ｈ．＆ Ｔｅｕｓｃｈ，Ｎ．（２００５），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ４，３８７−９８。従って、ＬＰＡ生合成及び／又はＬＰＡ１受容体を標的とすることは、神経損傷誘導性神経因性疼痛を緩和するための、新規の特許性のあるアプローチに相当する。

ヒト及び動物モデルの両方における１型及び２型糖尿病の糖尿病性神経障害は、末梢神経系の全成分（感覚、運動及び自律）の病態生理学変化を特徴とする。一次求心性神経の変化に加えて、中枢性感作は、神経因性及び炎症性疼痛を含む持続性の疼痛の基礎となる重要な機構であると考えられる。Ｇ．Ｂａｒａｎａｕｓｋａｓ，Ａ．Ｎｉｓｔｒｉ（１９９８）Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ５４，３４９；Ｔ．Ｊ．Ｃｏｄｅｒｒｅ，Ｒ．Ｍｅｌｚａｃｋ（１９９２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １２，３６６５；Ｒ．Ｄｕｂｎｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｒｕｄａ（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １５，９６；Ｍ．Ｊ．Ｍｉｌｌａｎ（１９９９）Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ５７，１；Ｃ．Ｊ．Ｗｏｏｌｆ，Ｓ．Ｗ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（１９９１）Ｐａｉｎ ４４，２９３。

最近、持続性疼痛での中枢性感作において、ＬＰＡに対する役割が提案された。具体的には、一次求心性神経線維の刺激によって脊髄におけるＬＰＡの産生が引き起こされることが明らかとなった。Ｍ．Ｉｎｏｕｅ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ １０７，１５５６。ＡＴＸによるＬＰＡへのＬＰＣの変換が、神経因性疼痛に関与するＣＮＳにおけるＬＰＡの主要な供給源であることが提案された。Ｌ．Ｍａ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３３３，５４０。

細胞レベルにおいて、ＬＰＡは、神経及びグリア細胞における形態変化の強力な誘導因子である。Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ６，１２９２−９；Ｊａｌｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ４，２４７−５５；Ｔｉｇｙｉ，Ｇ．＆ Ｍｉｌｅｄｉ，Ｒ．（１９９２），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７，２１３６０−７（１９９２）；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２２８，６−１８；Ｙｕａｎ，Ｘ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５，３８−４５；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ ５０，３０２−７。

初代星状膠細胞ならびに神経膠腫由来細胞株において、ＬＰＡは、活性のあるＲｈｏＡにより支配され、接着斑タンパク質の再編成及び活性化が関連する過程である、突起伸長（「星型化（ｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ）」）の逆転を引き起こす。Ｒａｍａｋｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．＆ Ｍｏｏｌｅｎａａｒ，Ｗ．Ｈ．（１９９８），Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２４５：２５２−６２。ミエリン化におけるＬＰＡに対する役割は、ＬＰＡがシュワン細胞における細胞−細胞接着及び生存を促進するという知見によっても示唆される。Ｗｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：７０６９−７８；Ｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ（２００４），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１０７９６−８０５。

３．抗体作製及び特徴評価
本発明は、疼痛の治療における抗ＬＰＡ抗体及び抗体断片の使用に関する。ＬＰＡに対するマウス及びヒト化モノクローナル抗体の作製、特徴評価及び組み換え作製は、本願発明と所有者が共通し、その全体において本明細書中に組み込まれる上記米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号を含むいくつかの特許出願に記載されている。

４．製剤処方、投与及び投与経路
患者において望ましくないＬＰＡの量を調節するための１つの方法は、１以上のＬＰＡ種に結合し、従ってこれを中和し、それによって、望ましくない遊離ＬＰＡレベルを低下させる治療用「スポンジ」として作用するための１以上の抗ＬＰＡ抗体又は（それらの断片）を含む組成物を提供することによる。化合物が「遊離している」と言われる場合、化合物は、その望ましくない効果をそれが発揮する部位への到達を何ら制限されない。一般に、遊離化合物は、その遊離化合物の作用部位であるか又はそれを含有する、又は化合物がその作用部位に自由に移動できる、血液及び組織に存在する。遊離化合物はまた、化合物を望ましくない化合物へと変換する何らかの酵素による作用に対して利用可能でもあり得る。

抗ＬＰＡ抗体及び抗体断片は、疾患、障害又は身体外傷の治療を含む様々な目的のために有用である医薬組成物中で処方され得る。生物活性脂質に対する抗体に適切な医薬組成物は、上記の米国特許出願公開第ＵＳ２０１０００９８７００号で開示される。

本発明の１以上の抗ＬＰＡ抗体及び／又は抗体断片種を含む医薬組成物は、当該治療のためのキット及び医療装置に組み込まれ得る。本発明の医薬組成物の投与を必要とする患者に、本発明のある実施態様に従い本発明の医薬組成物を投与するために、医療装置を使用し得、このような装置を含むキットが提供される。このような装置及びキットは、本発明の医薬組成物の自己投与を含む通例の投与のために設計され得る。このような装置及びキットは、緊急使用に対して、例えば救急車もしくは救急治療室でもしくは外科手術中において又は創傷が起こり得るが完全な医療的配慮がすぐに用意され得ない活動（例えばハイキング及びキャンプ又は戦闘状態）での使用に対しても設計され得る。

保管のために、所望の程度の純度を有する抗体を任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で抗体（及び／又は抗体断片）の治療製剤を調製する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される投与量及び濃度で受容者に対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなど；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含む。

本明細書中の処方物はまた、治療する特定の適応に対して必要に応じて複数の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補足的活性を有するものも含有し得る。このような分子は、意図する目的に対して有効である量の組み合わせで適切に存在する。

活性成分は、例えば従来技術により又は界面重合により調製されるマイクロカプセル中、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中でも封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）で開示される。

インビボ投与に対して使用しようとする処方物は無菌でなければならない。これは、例えば滅菌ろ過膜を通じたろ過によって容易に達成される。

持続放出製剤が調製され得る。持続放出製剤の適切な例としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられるが、この場合、マトリクスは例えばフィルム又はマイクロカプセルなどの成型品の形態である。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸グリコール酸などのポリマーが１００日以上にわたり分子を放出することができる一方、ある種のヒドロゲルは、タンパク質を放出する時間がより短い。封入抗体が長時間にわたり身体に残存する場合、これらは、３７℃で湿気に曝露される結果として変性又は凝集し得、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与する機構に依存して、安定化のために合理的ストラテジーが考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−−Ｓ結合形成であることが発見される場合、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を調節し、適切な添加物を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって、安定化が達成され得る。

治療への応用のために、非経口的に（静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは点滴を含む。）又は頭蓋内、髄腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、経口、局所、気管内又は吸入経路によりヒトに投与され得るものを含む上記で論じたものなどの医薬的に許容可能な剤形で、抗ＬＰＡ剤、例えば本発明の抗体（その抗原結合断片）が、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。

疾患の予防又は治療に対して、抗体又は抗体断片の適切な投与量は、上記で定義されるような治療しようとする疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で又は治療目的で投与されるか、薬歴、患者の病歴及び抗体への反応ならびに担当医師の裁量に依存する。本抗体（又は抗体断片）は、１回又は一連の治療にわたり患者に適切に投与される。

例えば１回以上の個別投与によるものであれ又は連続点滴によるものであれ、疾患のタイプ及び重症度に依存して、約１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体及び／又は抗体断片が、患者への投与に対する第一の候補投与量である。典型的な１日又は週間投与量は、上述の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、疾患症候の所望の抑制が起こるまで治療が反復される。しかし、他の投与計画が有用であり得る。この治療の進行は、例えば放射線画像を含む従来技術及びアッセイによって容易に監視される。治療用抗ＬＰＡ抗体及び／又は抗体断片への患者の曝露を最適化するため、体液又は組織中のＬＰＡレベルを調べるために抗体を使用する検出方法を使用し得る。

本発明の別の実施態様に従い、ＬＰＡ活性を阻害する薬剤、例えば抗ＬＰＡ ｍＡｂ又はＦａｂを含む組成物は単剤療法剤として投与され、一方で他の好ましい実施態様において、ＬＰＡ活性を阻害する薬剤を含む組成物は、併用療法の一部として投与される。ある場合において、連続的に又は、癌治療用の化学療法剤又は従来の鎮痛剤など、このような目的に有効である別の薬剤と組み合わせて本抗体を投与することによって、疾患を予防又は治療することにおける抗体の有効性を向上させ得る。

このような他の薬剤は、投与される組成物中に存在し得るか又は個別に投与され得る。また、本抗体は、連続的に又は他の薬剤もしくは方式と組み合わせて適切に投与される。

５．キット及び製品
本発明の別の局面において、疼痛の治療に有用な物質を含有する製品が提供される。本製品又はキットは容器及びラベルを含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ及び試験管が挙げられる。これらの容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。本容器は、症状を処置するのに有効な組成物を収容し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、本容器は、静注液バッグ又は皮下注射針が貫通可能なストッパー付きのバイアルであり得る）。本組成物中の活性物質は、抗ＬＰＡ抗体又は抗体断片である。本容器上の又はこれに付随するラベルは、選択される状態を治療するために本組成物が使用されることを示す。本製品は、医薬的に許容可能な緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などを含む第二の容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用のための説明がある添付文書を含め、商業的見地及び使用者の見地から所望される他の物質をさらに含み得る。

本発明の実施に対して知られる現時点での最良の形態を単に説明するものである次の実施例を参照することによって、本発明がより詳細に理解されよう。本発明の範囲は、それに限定されるとみなされるべきものではない。

実施例
次の詳細な例を参照することにより本発明をさらに説明する。これらの実施例は、何ら本発明の範囲を限定するものとみなされるものではない。

実施例１：ＬＰＡに対するモノクローナル抗体
上述の米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号に記載のとおり、ＬＰＡに対するマウスモノクローナル抗体を作製した。その優れた生化学的及び生物学的特性に基づく特徴評価に対して６種類のハイブリドーマクローンが選択された。ＬＰａｔｈ Ｉｎｃ．の代理として特許寄託のためにマウスハイブリドーマ細胞株５０４Ｂ３−６Ｃ２、５０４Ｂ７．１、５０４Ｂ５８／３Ｆ８、５０４Ａ６３．１及び５０４Ｂ３Ａ６（本明細書中でそれぞれＢ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３及びＢ３Ａ６と呼ぶクローンに対応）は、２００７年５月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０）により受託され、寄託番号ＰＴＡ−８４１７、ＰＴＡ−８４２０、ＰＴＡ−８４１８、ＰＴＡ−８４１９及びＰＴＡ−８４１６がそれぞれ付与された。本命明細書中で言及される全ての抗ＬＰＡ抗体及びそれらの一部はこれらの細胞株由来であった。

直接的結合カイネティクス
１２：０及び１８：１ ＬＰＡ（０．１μＭ）に対する６種類の抗ＬＰＡ ｍＡｂ（Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３、Ｂ３Ａ６、Ｄ２２）の結合をＥＬＩＳＡによって測定した。精製ｍＡｂの６種類の漸増濃度（０から０．４μｇ／ｍＬ）を用いて、力価曲線からＥＣ_５０値を計算した。ＥＣ_５０は、最大結合の５０％となる有効抗体濃度に相当する。「Ｍａｘ」は最大結合を示す（ＯＤ_４５０として表される。）。結果を下記表１で示す。

ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｍａｃｈｉｎｅを用いて６種類のリード候補物に対してカイネティクスパラメーターｋ_ａ（結合速度定数）、ｋ_ｄ（解離速度定数）及びＫＤ（結合平衡定数）を求めた。この実験において、センサー面上にＬＰＡを固定し、抗ＬＰＡ ｍＡｂを表面全体の溶液中で流した。示されるように、全６種類のｍＡｂが、０．３４から３．８ｐＭの範囲の同様のＫ_Ｄ値及び同様のカイネティックパラメーターでＬＰＡに結合した。

抗ＬＰＡマウスｍＡｂはＬＰＡに対して高い親和性を示す。
１５０共鳴単位の範囲の密度でＬＰＡをセンサーチップ上に固定化した。各ｍＡｂの希釈液を固定化ＬＰＡに流し、結合／解離相の非線形回帰によってカイネティック定数を得た。２つ組の実験操作において少なくとも３種類の決定因子を使用して、標準偏差として誤差を与える。結果を下記の表２で示す。Ｋ_Ｄ＝ｋ_ａ／ｋ_ｄによりみかけの親和性を求めた。

ｋ_ａ＝Ｍ^−１ｓ^−１での結合速度定数
ｋ_ｄ＝ｓ^−１での解離速度定数
６種類の抗ＬＰＡ ｍＡｂの特異性プロファイル

ＬＰＡの多くのアイソフォームが生物学的に活性があることが同定されており、ｍＡｂは、それらの全てを治療的に関連のある程度まで認識することが好ましい。競合脂質を抗体固定化脂質混合物に添加する競合アッセイを用いて、抗ＬＰＡ ｍＡｂの特異性を評価した。

抗体の特異性を評価するために抗ＬＰＡ ｍＡｂを用いて競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。１８：１ ＬＰＡをＥＬＩＳＡプレート上で捕捉した。ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）−ＰＢＳ中で各競合脂質（１０μＭ以下）を連続希釈し、次いでｍＡｂ（３ｎＭ）とともに温置した。次に、ＬＰＡ被覆ウェルに混合物を移し、二次抗体を用いて抗体結合量を測定した。シグナル（Ａ_４５０）を最大化するためにデータを正規化し、パーセント阻害として表す。３つ組でアッセイを行った。ＩＣ_５０：最大半量阻害濃度；ＭＩ：最大阻害（阻害剤非存在下での結合％）；‐‐‐：阻害が弱いため推定しない。高い阻害の結果から、抗体による競合脂質の認識が示される。下記表３で示されるように、全抗ＬＰＡ ｍＡｂが様々なＬＰＡアイソフォームを認識した。

興味深いことに、抗ＬＰＡ ｍＡｂは、１２：０（ラウロイル）、１４：０（ミリストイル）、１６：０（パルミトイル）、１８：１（オレオイル）、１８：２（リノレオイル）及び２０：４（アラキドノイル）ＬＰＡを区別することができた。最終的薬物開発に対する所望のＥＣ_５０順位は、特異性が高いこととともに、不飽和脂質に対しては１８：２＞１８：１＞２０：４であり、飽和脂質に対しては１４：０＞１６：０＞１８：０である。抗ＬＰＡ ｍＡｂの特異性をジステアロイル−ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、Ｓ１Ｐ、セラミド及びセラミド−１−ホスフェートなどのＬＰＡ関連生体脂質へのそれらの結合について評価した。ジステアロイルＰＡ及びＬＰＣ、ＬＰＡの直接的代謝前駆体に対して交差反応性を示した抗体はなかった。

実施例２：マウス抗ＬＰＡ抗体のクローニング−概要
ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域を有するハイブリドーマからの３種類のマウス抗体の１つの活性ＬＰＡ結合領域を含有する可変ドメイン（Ｆｖ）を用いて、ＬＰＡに対するキメラ抗体を作製した。当業者が認識するように、ＩｇＧ１のフレームワーク領域などのヒト抗体フレームワーク領域（例えばＦｒ１、Ｆｒ４など）とともにマウス抗ＬＰＡ ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ、例えばＣＤＲ１−４）を移植することによって、「ヒト化」抗体を作製することができる。

ＬＰＡに対するマウスｍＡｂのクローニングのための全体的なストラテジーは、各抗体からの軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）両方のマウス可変ドメインをクローニングすることからなる。この遺伝子のコンセンサス配列は、定常領域断片がγアイソタイプと一致し、軽鎖がκアイソタイプと一致することを示す。ヒト抗体軽鎖（ＣＬ）の定常ドメインと一緒に及びヒト重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とともにマウス可変ドメインをクローニングし、その結果、キメラ抗体コンストラクトが得られる。この過程及び結果として得られるキメラ抗体は、共同所有の上記米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号でさらに詳細に記載されている。上述の’８１４刊行物に記載されるような標準的方法を用いてマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインをクローニングし、配列決定を行った。

下記表４−８は、５種類のマウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体クローンに対する可変（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ）ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対するアミノ酸配列を示す。各ＣＤＲＨ１アミノ酸配列の場合、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲは、示される１０アミノ酸配列である。太字で示されるＫａｂａｔ配列の５アミノ酸の部分は、カノニカルなＣＤＲＨ１配列である。対応する核酸配列は米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号で見出される。

^＊Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭに従い定義されるＣＤＲＨ１配列は、示される１０アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の５アミノ酸部分（ＮＹＬＩＥ；配列番号７）は、Ｋａｂａｔに従い定義されるＣＤＲＨ１配列である。

^＊Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭに従い定義されるＣＤＲＨ１配列は、示される１０アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の５アミノ酸部分（ＮＹＬＩＥ；配列番号７）は、Ｋａｂａｔに従い定義されるＣＤＲＨ１配列である。

^＊Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭに従い定義されるＣＤＲＨ１配列は、示される１０アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の５アミノ酸部分（ＮＹＬＩＥ；配列番号７）は、Ｋａｂａｔに従い定義されるＣＤＲＨ１配列である。

^＊Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭに従い定義されるＣＤＲＨ１配列は、示される１０アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の５アミノ酸部分（ＮＹＬＩＥ；配列番号７）は、Ｋａｂａｔに従い定義されるＣＤＲＨ１配列である。

^＊Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭに従い定義されるＣＤＲＨ１配列は、示される１１アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の６アミノ酸部分（ＳＧＹＹＷＴ；配列番号２３）は、Ｋａｂａｔに従い定義されるＣＤＲＨ１配列である。

下記表９−１３は、マウス抗ＬＰＡ抗体可変ドメインのアミノ酸配列を示す。

表１３：リーダー配列及び切断部位がないクローンＡ６３可変ドメインアミノ酸配列

実施例３：マウス抗体Ｂ７
マウス抗体クローンＢ７は、シグナル伝達脂質ＬＰＡに対する高い親和性を有し（ＢｉａＣｏｒｅアッセイにおいて及び直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて表面プラズモン共鳴により明らかにされる場合１−５０ｐＭのＫ_Ｄ）；さらに、Ｂ７は、ＬＰＡに対して高い特異性を示し、一部がＬＰＡと構造的に類似する２０種類以上の生物活性脂質を含む、１００以上の様々な生物活性脂質及びタンパク質に対しては結合親和性を示さない。マウス抗体は、総分子量１５５．５ｋＤａの２本の同一の軽鎖及び２本の同一の重鎖から構成される全長ＩｇＧ１ｋアイソタイプ抗体である。生物物理学的特性は下記表１４でまとめる。

Ｂ７は、サイトカイン放出、移動及び浸潤など予備的な細胞に基づくアッセイにおいても生物学的活性を示し；これらは、ＬＰＡアイソフォーム及びその他の生物活性脂質に対するＢ７の特異性及びインビトロでの生物学的効果を示すデータとともに下記表１５でまとめる。

ＬＰＡに対するＢ７／ＬＴ３０００の強力かつ特異的な結合の結果、細胞外ＬＰＡの利用可能性が低下し（ＬＰＡの有効濃度の低下）、これは治療上有効である可能性がある。

第二のマウス抗ＬＰＡ抗体であるＢ３も下記表１６で示されるような結合分析に供した。

実施例４：Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（Ｂ７、ＬＴ３０００）のヒト化
本願発明と同一出願人によるものであり、それらの全体において本明細書中にその内容が組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０００３４８１４及び米国特許出願第１２／７６１，５８４号及び対応外国出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３１３３９において完全に記載されるように、ＬＰＡに対する高い親和性、特異性及び結合能を保持する抗体を作製することを目的として、マウスＣＤＲをヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することによってマウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体Ｂ７の可変ドメインをヒト化した。

ヒト化変異体の改変
ＬＴ３０００Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬからのＫａｂａｔ ＣＤＲを受容側のヒトフレームワークに移植することによって、マウス抗ＬＰＡ抗体をヒト化した。血清不含条件下で７種類のヒト化変異体をＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させ、精製し、次いでアッセイパネルにおいて特徴を調べた。作製のために各軽鎖及び重鎖の配列を含有するプラスミドを哺乳動物細胞に形質移入した。培養５日後、定量的ＥＬＩＳＡを用いてｍＡｂタイターを測定した。重及び軽鎖の全ての組み合わせから、細胞培養物１ｍＬあたり２から１２μｇのｍＡｂが得られた。

ＣＤＲを形成する残基に対して並置されるＦＲ残基を同定するためにヒト化ＶＬ及びＶＨ配列を含有する三次元（３Ｄ）モデルを構築した。これらのＦＲ残基は、ＣＤＲループ構造及び抗体が抗原に対する高い親和性及び特異性を保持する能力に影響を及ぼす可能性がある。この分析に基づき、ＬＴ３０００とは顕著に異なるとみなされる、ＡＪ００２７７３中の６残基及びＤＱ１８７６７９中の３残基を同定し、マウス配列に戻す突然変異について検討した。フレームワーク選択及び復帰突然変異の同定は、ＤａｔａＭａｂｓ，ＬＬＰ，Ｒａｄｌｅｔｔ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫにより行われた。ヒト化変異体の一覧を下記表１７でまとめる。調べた全ての変異体の軽鎖内に存在するＩ２Ｖ突然変異は、ＣＤＲＬ３における残基の提示を支持する。他の軽鎖復帰突然変異には、溶媒曝露状態であるＱ４５Ｋ及び、ＣＤＲの反対側の可変ドメイン側に位置する保存的Ｙ８７Ｆ突然変異が含まれる。それらの位置に基づき、重鎖復帰突然変異は、ｍＡｂの安定性及びＬＰＡ−結合特性に影響を及ぼす可能性がより大きいと思われる。Ｉ２４Ａ及びＶ２８Ｇは、ＣＤＲＨ１を形成する残基を支持し、一群の復帰突然変異（Ｉ３７Ｖ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ及びＩ６９Ｌ）は、折りたたまれている可変ドメインの安定性及びＣＤＲＨ２の位置に影響を与えると思われる疎水性相互作用の複雑なネットワークを形成する。完全ヒト化、抗ＬＰＡモノクローナル抗体の開発に対するリード候補を同定するために、ＬＰＡ結合、温度安定性及び放出サイトカインにおけるこれらの復帰突然変異の役割を調べた。

ヒト化変異体の発現
血清不含条件下、ＨＥＫ２９３細胞中で、上記の表で示されるヒト化変異体を一過性に発現させ、精製し、次いでアッセイパネルにおいて特徴を調べた。作製のために各軽鎖（ｐＡＴＨ５００シリーズ）及び重鎖（ｐＡＴＨ６００シリーズ）の配列を含有するプラスミドを哺乳動物細胞に形質移入した。培養５日後、定量的ＥＬＩＳＡを用いてｍＡｂタイターを測定した。重及び軽鎖の全ての組み合わせから、細胞培養物１ｍＬあたり２から１２μｇの抗体が得られた。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥから、軽及び重鎖の予想質量と適合する２５ｋＤａ及び５０ｋＤａの高い純度（＞９８％）の２本のバンドが明らかになった。非還元条件下で〜１５０ＫＤａの予想質量の１本のバンドが観察された。

ヒト化変異体の特徴評価
ヒト化変異体の結合親和性、結合能、回収率、効力及び安定性について、それらの生物物理学的特性の特徴評価を行った。ヒト化抗ＬＰＡ ｍＡｂ変異体全てが、キメラ抗ＬＰＡ抗体（ＬＴ３０１０としても知られる。）及びマウス抗体（ＬＴ３０００）と同等の低ピコモル範囲の結合親和性を示した。ヒト化変異体の全てが、ＬＴ３０００と同等であるか又はより高いＴ_Ｍを示し、殆どがおよそ７１℃のＴｍを有した。特異性に関して、ヒト化変異体は、ＬＴ３０００と同等の特異性プロファイルを示した。例えば、ＬＴ３０００は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、リゾホスファチジン酸の様々なアイソフォーム（１４：０及び１８：１ＬＰＡ、環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）及びホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して交差反応性を示さなかった。

哺乳動物細胞における抗体発現及び産生
ハイブリドーマからマウス抗体遺伝子をクローニングした。ヒトフレームワーク配列及びマウスＣＤＲを含有する合成遺伝子を合成オリゴヌクレオチドから組み立て、平滑末端制限部位を用いてｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングした。配列決定を行い、１００％配列調和を観察した後、重及び軽鎖をクローニングし、重鎖遺伝子に対してｐＣｏｎＧａｍｍａベクターを、軽鎖遺伝子に対してｐＣｏｎＫａｐｐａベクターを用いて全長ＩｇＧ１キメラ抗体として発現させた（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ ＮＨ）。これらの遺伝子のそれぞれに対する発現カセットは、プロモーター、Ｋｏｚａｋ配列及びターミネーターを含有した。これらのプラスミドをＥ．コリに形質転換し（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ １０ 化学的コンピーテントＥ．コリ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ４０４０−１０）、ＬＢ培地中で増殖させ、グリセロール中で保存した。製造者（Ｑｉａｇｅｎ、エンドトキシン不含ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）キット、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３６２）により記載のようにして大量のプラスミドＤＮＡを調製した。２９３フェクチンを用い、培養のために２９３Ｆ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍｅｄｉａを用いて、ヒト胎児腎臓細胞株２９３Ｆにプラスミドを形質移入した。形質移入培養物は、およそ２−１２ｍｇ／Ｌのヒト化抗体を発現した。

抗体精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて培養上清からモノクローナル抗体を精製した。０．５ｍＬのＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ−Ｕｌｔｒａレジン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ １１５１１５８２７）を含有するアリコートを自然落下型（ｇｒａｖｉｔｙ−ｆｌｏｗ）使い捨てカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ ２９９２４）に添加し、１０から１５ｍＬの結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ ２１００１）で平衡化した。一過性発現ヒト化抗体を含有する培養上清を結合緩衝液で１：１希釈し、レジンに通した。カラム上に保持された抗体を１５ｍＬの結合緩衝液で洗浄し、低ｐＨ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ ２１００４）で溶出し、ｐＨを中和するために１００μＬの結合緩衝液を含有する１ｍＬ分画中で回収した。１ＬのＰＢＳ緩衝液（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ ０２１−０３０）に対して、吸収（２８０ｎｍ）が＞０．１である分画を一晩透析した（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット、３５００ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ ６６３８２）。セントリコン−ＹＭ５０（Ａｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ ４２２５）濃縮装置を用いて透析済み試料を濃縮し、０．２２μＭ 酢酸セルロース膜（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８１６０）を通じてろ過した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて各標品の純度をアクセスした。

定量的ＥＬＩＳＡ
定量的ＥＬＩＳＡを用いて抗体タイターを調べた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ａ８０−１０４Ａ、１ｍｇ／ｍＬ）を炭酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、３３．６ ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、ｐＨ９．５）中で１：１００希釈した。１００μＬ／ウェルの被覆溶液を３７℃で１時間温置することによってプレートを被覆した。このプレートをＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）で４回洗浄し、３７℃で１時間、２００μＬ／ウェルのＴＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、ｐＨ８．０）でブロッキング処理した。２つ組で操作を行うのに十分な量の試料及び標準物質を非結合プレート上で調製した。次の濃度：５００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、３１．２５ｎｇ／ｍＬ、１５．６２５ｎｇ／ｍＬ、７．８１２５ｎｇ／ｍＬ及び０．０ｎｇ／ｍＬに、ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１４ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）中でヒト参照血清（Ｂｅｔｈｙｌ ＲＳ１０−１１０；４ｍｇ／ｍＬ）を希釈することによって、標準物質を調製した。ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中で適切な希釈液を調製することによって試料を調製し、試料の光学密度（ＯＤ）が標準物質の範囲内に入るようにし、最も直線的な範囲は１２５ｎｇ／ｍＬ １５．６２５ｎｇ／ｍＬであった。このプレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１００μＬの標準物質／試料標品を各ウェルに添加し、３７℃で１時間温置した。次に、このプレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、３７℃で１時間、ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中で１：１５０，０００希釈した１００μＬ／ウェルのＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ａ８０−１０４Ｐ、１ｍｇ／ｍＬ）とともに温置した。このプレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、４℃に冷却した１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて発色させた。７分後、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４（１００μＬ／ウェル）で反応を停止させた。４５０ｎｍでＯＤを測定し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトウェアを用いてデータを解析した。４パラメーター方程式を用いて標準曲線をフィットさせ、試料中のヒトＩｇＧ含量を計算するために使用した。

直接結合ＥＬＩＳＡ
直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いてヒト化抗体のＬＰＡ−結合親和性を調べた。３７℃で１時間、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中で希釈したＩｍｊｅｃｔマリエイミド（ｍａｌｉｅｉｍｉｄｅ）活性化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．）に結合させた１．０μｇ／ｍＬ Ｃ１２：０ ＬＰＡで、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を一晩被覆した。ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１０．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．７６ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４；ｐＨ７．４）でプレートを洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ｔｗｅｅｎ−２０で室温にて１時間又は４℃で一晩、ブロッキング処理した。最初の温置（室温で一時間）に対して、抗ＬＰＡ抗体の希釈系列（０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ及び０μｇ／ｍＬ）をマイクロプレートに添加した（１００ｍＬ／ウェル）。プレートを洗浄し、１：２０，０００希釈した１００μＬ／ウェルのＨＲＰ結合ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｃａｔ＃１０９−０３５−００３）とともに室温で１時間温置した。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ Ｎｏ Ｔ０４４０）を用いてペルオキシダーゼを発色させ、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸを用いて４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用い、４パラメーター方程式を用いて用量反応曲線の最小二乗法フィットによってＥＣ_５０（最大半量結合濃度）を調べた。

ヒト化抗体、ＬＴ３０１５のＥＣ_５０を調べたところ、７５．６ｎｇ／ｍＬであり、一方でマウス抗体、ＬＴ３０００のＥＣ_５０は６５．３ｎｇ／ｍＬであった。

ＬＰＡ競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡによってヒト化抗体の特異性を調べた。炭酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、３３．６ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、ｐＨ９．５）でＣ１８：０ ＬＰＡ被覆物質を０．３３μｇ／ｍＬに希釈した。プレートを１００μＬ／ウェルの被覆溶液で被覆し、３７℃で１時間温置した。このプレートをＰＢＳ（１００ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２７ｍＭ ＫＣｌ、１．３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で４回洗浄し、１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０で室温にて１時間ブロッキング処理した。５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ及び０．０μＭで脂質競合物質（１４：０ ＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８５７１２０）、１８：１ ＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８５７１３０）、１８：１ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８４５８７５）、ｃＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８５７３２８）、１８：１ ＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８４０８７５）、ＰＣ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８５０４５４）に対して、ヒト化抗ＬＰＡ抗体を試験した。この抗体をＰＢＳ、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０中で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、非結合プレート中で、抗体と試料との１：３比で脂質試料と合わせた。このプレートをＰＢＳで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルの一次抗体／脂質複合体とともに室温で１時間温置した。次に、このプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０中で１：２０，０００希釈した１００μＬ／ウェルのＨＲＰ結合ヤギ抗ヒト抗体とともに室温で１時間温置した。再びプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ＴＭＢ基質（１００μＬ／ウェル）を用いて４℃で発色させた。８分後、１００μＬ／ウェルの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４により反応を停止させた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸを用いて光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。生データを解析のためにＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに移した。

ヒト化ｍＡｂ ＬＴ３０１５に対するＩＣ_５０を調べたところ、０．０８μＭであり、一方で、対応するマウス抗体、ＬＴ３０００に対するＩＣ_５０は０．２８μＭであった。

温度安定性
直接結合ＥＬＩＳＡを用いて、加熱後ＬＰＡ−結合親和性（ＥＣ_５０）を測定することによって、ヒト化抗体の温度安定性を調べた。ＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ ０２１−０４０）中で溶解させた抗体を２５μｇ／ｍＬに希釈し、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃及び８０℃で１０分間温置した。温度を上昇させる前に、各試料を１０μＬ採取し、９０μＬのＰＢＳで希釈し、氷上で保存した。次に、試料を短時間、ボルテックスにより混合し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心することにより不溶性物質を除去した。直接的ＬＰＡ−結合ＥＬＩＳＡを用いて上清の結合活性を調べ、加熱処理以外は同じ試料からなる対照と比較した。

ヒト化抗体、ＬＴ３０１５に対するＴｍを調べたところ、７１．５℃となり、Ｔｍが６７℃であったマウス親抗体、ＬＴ３０００よりも高かった。

表面プラズモン共鳴
全結合データをＰｒｏｔｅＯｎ光学バイオセンサー（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）上で回収した。１２：０ ＬＰＡ−チオール及び１８：０ ＬＰＡ−チオールをマレイミド修飾ＧＬＣセンサーチップ（Ｃａｔ．Ｎｏ １７６−５０１１）に連結させた。最初に、スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣの等量混合物で７分間、ＧＬＣチップを活性化し、続いてエチルジアミンを用いて７分間、ブロッキング処理段階を行った。次に、ＨＢＳランニング緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中０．５ｍＭの濃度で、スルホ−ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ｃａｔ＃２２３１２）を表面全体に行き渡らせた。ＬＰＡ−チオールをＨＢＳランニング緩衝液に入れて１０、１及び０．１μＭの濃度に希釈し、７分間注入し、３種類の密度が異なるＬＰＡ表面を生成させた（−１００、−３００及び−１４００ＲＵ）。次に、最大濃度として２５ｎＭから始まる３倍希釈系列を用いてヒト化抗体に対する結合データを回収した（オリジナル保存液をそれぞれ１から１００に希釈）。１０秒間の１００ｍＭ ＨＣｌパルスにより表面を再生した。全データを２５℃で回収した。参照表面ならびにブランク注入を用いて対照を処理した。各表面からの反応データから、様々な程度の多価結合により引き起こされたと思われる複雑な結合挙動が示された。結合定数の推定を抽出するために、１サイト及び２サイトモデルを用いて様々な抗体濃度からのデータを全体的にフィットさせた。これにより、２価（サイト１）及び１価サイト（サイト２）に対する親和性の推定値が得られた。

ＬＰＡモル結合能
置換アッセイを用いてＬＰＡ：ｍＡｂのモル比を調べた。乾燥窒素気流を用いて５ナノモルのビオチン化ＬＰＡ（脂質５０μｇ（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ Ｌ−０１２Ｂ、Ｌｏｔ Ｎｏ Ｆ−６６−１３６を７０５μＬの１：１クロロホルム：メタノール中で懸濁し、１００μＭ溶液を得た。）でホウケイ酸チューブ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ １４−９６１−２６）を被覆した。ＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ ０２１−０３０）中で溶解した７５μＬ（１２５ｐモル）の抗体とともに室温で被覆チューブを温置した。温置３時間後、タンパク質脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８９８４９）を用いてＬＰＡ：ｍＡｂ複合体を遊離脂質から分離し、製造者の説明書に従い、ＨＡＢＡ／アビジン置換アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ ２８０１０）を用いて結合ビオチン化ＬＰＡのモル濃度を測定した。

ＳＫＯＶ３細胞におけるＬＰＡ−誘導性ＩＬ−６及びＩＬ−８放出の測定
抗ＬＰＡ抗体は、ＳＫＯＶ３卵巣細胞の馴化培地中でヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８のＬＰＡ依存性放出を阻害し、このことから、これらの抗体が生物学的に活性であることが示唆される。２ｍＬの１ｘトリプシンＥＤＴＡ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ ２５−０５３−ＣＶ）を用いてＳＫＯＶ３細胞（Ｌｏｔ Ｎｏ ４２５５５５８、継代数１４）を回収し、８ｍＬの完全培地（１０％ＦＢＳ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．Ｃａｔ．ｎｏ ３５−０１１−ＣＶ）中で再懸濁した。この細胞を５分間（１１，０００ｒｐｍ）遠心し、５ｍＬの完全培地中で再懸濁した。０．４％トリパンブルー（１０μＬ細胞＋９０μＬトリパンブルー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ １５２５０−０６１）を用いて血球計算盤を使用し、２つ組みで細胞数を数えた。９６ウェルプレート中で、細胞１ｘ１０^５個／ウェルを播種した（最終体積１００μＬ／ウェル）。３７℃で一晩温置することにより細胞を接着させ、コンフルエントの単層を形成させた。翌日、最小培地（Ｌ−グルタミン含有のマッコイ培地中１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ １０−０５０−ＣＶ）で細胞を穏やかに２回洗浄した。この培地を１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ ３０−００２ ＣＩ）及び２．２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ ２５−０３５−ＣＩ）に調整した。次に、細胞を３７℃で正確に２４時間、血清飢餓状態にし、続いてヒト化ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５（１５０、３００又は６００μｇ／ｍＬ）存在下又は非存在下で、１時間にわたり予め温置した１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ／ＰＢＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ １２６５７５）中で溶解させた１μＭ Ｃ１８：１ ＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ ８５７１３０）によりサイトカイン刺激を行った。次に、細胞に対してトリートメント（ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）を添加した。サイトカイン刺激２２時間後、細胞を４℃で５分間遠心し（１３，５００ｒｐｍ）、上清（細胞−馴化培地）を回収した。販売者の説明書（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ Ｄ８０００Ｃ）に従い、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８ ＥＬＩＳＡキットを用いて、各上清中のＣＸＣＬ８／ＩＬ−８レベルを測定した。ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＩＬ−６免疫アッセイキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ６０５０）を用いてＥＬＩＳＡによってＩＬ−６レベルを測定した。片側ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニの事後検定によりデータを解析し、ヒトＩＬ−８又はヒトＩＬ−６の倍単位での増加として表した。データは下記表１８及び表１９で示す。

（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．００１及び＃＃ｐ＜０．００１、ｎ＝３）

（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．００１及び＃＃ｐ＜０．００１、ｎ＝３）

疾患モデルでのＬＴ３０１５の活性
ＬＴ３０１５は、スクラッチアッセイにおいて卵巣腫瘍細胞移動を阻止することが示されており、さらに、卵巣腫瘍ＳＫＯＶ３の進行を抑制し、マウス体液中の循環サイトカインを減少させることが示された。さらなる詳細については、本願発明と所有者が共通し、その全体において参照において本明細書中に組み込まれる２０１０年４月１６日出願の米国特許出願第１２／７６１，５８４号（代理人整理番号ＬＰＴ−３２１０−ＵＴ）を参照のこと。

実施例５：ヒト化抗ＬＰＡ可変領域配列
マウス抗体Ｂ７及びマウス抗体Ｂ３重鎖の及びＢ３重鎖の、さらなるヒト化抗ＬＰＡ変異体を上述のように作製した。ヒト化抗ＬＰＡモノクローナル抗体変異体の可変領域のアミノ酸配列を下記表２０及び２２で示す。対応するヌクレオチド配列情報は本願発明と所有者が共通し、その全体において本明細書中に組み込まれる２０１０年４月１６日出願の米国特許出願第１２／７６１，５８４号（代理人整理番号、ＬＰＴ−３２１０−ＵＴ）で見出され得る。

表２０及び２２において、復帰突然変異は太字で示す。ＣＤＲ配列は灰色で示す。カノニカルな残基は、それらが関連するＣＤＲ（１、２又は３）に従い付番する。表２１及び２３において、復帰突然変異の種類及び位置を提供する。注目すべきは、ヒト化重鎖変異体Ｂ７−６０８（ベクター名：ｐＡＴＨ６０８）が、マウスＢ７抗体に存在しないＣＤＲＨ２（突然変異Ｌ５０Ａ）の最初の位置においてロイシンからアラニンへの突然変異を含有することである。従って、この変異体のＣＤＲＨ２配列は、配列ＡＩＮＰＧＳＤＹＴＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号３４）を有する。

実施例６：細胞株開発のためのベクターｐＡＴＨ３０１５の作製
ＬＴ３０１５は、高親和性で生物活性脂質リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に結合する組み換えヒト化モノクローナル抗体である。ＬＴ３０１５は、総分子量が１５０ｋＤａの、２本の同一の軽鎖及び２本の同一の重鎖からなる全長ＩｇＧ１ｋアイソタイプ抗体である。重鎖はＮ結合型グリコシル化部位を含有する。２本の重鎖は、ヒトＩｇＧ１の構造と調和する２つの分子間ジスルフィド結合を通じて互いに共有結合される。

ＬＴ３０１５は元来、ＬＰＡで免疫付与されたマウスから作製されたハイブリドーマを用いて産生されたマウスモノクローナル抗体由来であった。マウス抗体のヒト化は、マウス親抗体に対するその構造類似性について選択されたヒト抗体フレームワークの相補性決定領域（ＣＤＲ）の代わりに、６個のマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）を挿入することを含む。ヒト化抗体を改変するためにフレームワークにおいて一連の置換を行った。これらの置換は復帰突然変異と呼ばれ、抗原との相互作用に関与するマウス残基でヒト残基を置き換える。最終的なヒト化抗体は、重鎖の可変ドメインのヒトフレームワークにおける６個のマウス復帰突然変異（ｐＡＴＨ６０２）及び軽鎖の可変ドメインのヒトフレームワークにおける３個のマウス復帰突然変異（ｐＡＴＨ５０２）を含有する。

ベクターｐＡＴＨ３０１５を作製するために、Ｌｏｎｚａ ＢｉｏｌｏｇｉｅｓのＧＳ遺伝子発現系のベクターＩｇＧ１ｋにヒト化抗ＬＰＡモノクローナル抗体の可変ドメインをクローニングした。この発現系は、抗体遺伝子の定常ドメイン及び選択可能マーカー、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を保有する発現ベクターからなる。ＧＳは、グルタミン酸及びアンモニアからのグルタミンの生合成に関与する酵素である。細胞が外からのグルタミンなしで生存するために十分なグルタミンを与えるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯＫ１ＳＶ）細胞株に、抗体遺伝子及び選択可能マーカーの両方を保有するベクターを形質移入した。さらに、内因性ＧＳ活性を阻害するために、特異的なＧＳ阻害剤、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を培地中に補給し、ベクターにより提供されるＧＳ活性がある細胞のみが生存し得るようにした。ＭＳＸ存在下でのグルタミン不含培地中での増殖能に関して、形質移入細胞を選択した。

ｐＡＴＨ３０１５を作製するための、Ｌｏｎｚａ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓのＧＳ遺伝子発現系の二重遺伝子ベクターＩｇＧｌκへのヒト化抗ＬＰＡモノクローナル抗体の可変ドメインのクローニング段階のさらなる詳細は、本願発明と所有者が共通し、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、２０１０年４月１６日出願の米国特許出願第１２／７６１，５８４号（代理人整理番号ＬＰＴ−３２１０−ＵＴ）で見出され得る。

血清不含培地中での増殖に馴化させたＬｏｎｚａ特許チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯＫ１ＳＶ）宿主細胞株へ、エレクトロポレーションによりｐＡＴＨ３０１５を導入した。この形質移入由来の細胞株をＬＨ２と名付け、製剤原料を調製するために使用する。発現された薬物ＬＴ３０１５は次の特徴を有する：

ｐＡＴＨ３０１５と同様にｐＡＴＨ３０１６を作製した。上述のように、ｐＡＴＨ３０１５及び３０１６の重鎖は同一であるが（ｐＡＴＨ６０２由来、６個の復帰突然変異を有する。）、ｐＡＴＨ３０１６軽鎖（ｐＡＴＨ５０６由来）が含有する復帰突然変異は、Ｉ２Ｖの僅か１個のみである。ｐＡＴＨ３０１６から作製されるヒト化モノクローナル抗体はＬＴ３０１６である。ｐＡＴＨ３０１５及びｐＡＴＨ３０１６の両者ともＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）に寄託し、それぞれＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９２１９及びＰＴＡ−９２２０を有する。

ヒト化変異体の活性
５種類のヒト化変異体（ＬＴ３０１１、ＬＴ３０１３、ＬＴ３０１４、ＬＴ３０１５及びＬＴ３０１６）をインビトロ細胞アッセイにおいてさらに評価した。ＬＰＡは、癌細胞からのインターロイキン−８（ＩＬ−８）の放出を誘発することにおいて重要な役割を果たすことが知られている。ＬＴ３０００は、濃度依存的に卵巣癌細胞からのＩＬ−８放出を低下させた。これらのヒト化変異体は、ＬＴ３０００と比較して、同等なＩＬ−８放出低下を示した。

一部のヒト化変異体については、血管新生に対するマトリゲル管腔形成アッセイにおいて、それらの微小血管密度（ＭＶＤ）への影響に関しても試験した。両者とも、ＭＶＤ形成を減少させることが示された。

ヒト化抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５（「Ｌｐａｔｈｏｍａｂ」とも呼ばれる。）をさらなる特徴評価のために選択した。本ヒト化ｍＡｂは、マウス親抗体、Ｂ７の結合、特異性及び温度安定性を保持する。

別のヒト化抗ＬＰＡ変異体、ＬＴ３１１４も、さらなる特徴評価及びＬＴ３０１５との比較のために選択した。マウスモノクローナル抗体Ｂ３に基づき、ＬＴ３１１４をヒト化したが、これは２本のｐＡＴＨ７０２軽鎖及び２本のｐＡＴＨ８０４重鎖を有する（これらの配列及び復帰突然変異の位置及び種類は上記表２０−２３で示す。）。

ＬＴ３１１４及びＬＴ３０１５の開発及び特徴評価
結合ＬＰＡに対する高親和性及び特異性を保持するヒト化抗体を作製することを目的とし、Ｌｐａｔｈｏｍａｂをヒト化した。選択されたヒト抗体フレームワークのＩｇＧｋ１重及び軽鎖可変ドメインの６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、マウス抗ＬＰＡ ｍＡｂ、Ｌｐａｔｈｏｍａｂ由来のＫａｂａｔで定義されるＣＤＲで置換することによって、マウス抗体のヒト化を達成した。ヒト化抗体の抗原との相互作用を最大化するために、フレームワークにおいて一連の復帰突然変異を行った。いくつかのヒト化変異体を改変し、哺乳動物細胞で発現させ、マウスＬｐａｔｈｏｍａｂと殆ど同じようにＬＰＡに結合することが示された。ＬＰＡに対するヒト化変異体の結合親和性及び関連脂質に対するそれらの交差反応性について、ヒト化変異体の特徴評価を行った。ＥＬＩＳＡに基づく競合−結合アッセイにおいて、ヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４及びマウスｍＡｂ、Ｂ３の特異性を測定した。簡潔に述べると、ヤギ−抗ヒト又はマウスＩｇＧで予め被覆したＥＬＩＳＡプレート上で抗体を捕捉させた。競合脂質の一連の希釈液を固定量のビオチン標識化１８：０ ＬＰＡの存在下で結合させた。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて、結合した標識化ＬＰＡを検出した。

特異性に関して、本ヒト化変異体は、競合ＥＬＩＳＡにより、ＬＰＣ、ＰＡ、ＰＣ、血小板活性化因子（ＰＡＦ）又はリゾ−ＰＡＦへの交差反応性がないこと及び環状ＬＰＡ（ｃＬＰＡ）との交差反応性が最小限であることを含め、Ｌｐａｔｈｏｍａｂと同様の特異性プロファイルを示した（図１）。

ＬＰＡの異なるアイソフォームに対する異なる抗体の親和性を比較するために、競合結合ＥＬＩＳＡも使用した。ＥＬＩＳＡに基づく競合−結合アッセイにおいて、ネイティブ１８：１及び１８：２ＬＰＡに対する抗体の親和性を測定した。簡潔に述べると、ヤギ−抗ヒト又はマウスＩｇＧで予め被覆したＥＬＩＳＡプレート上で抗体を捕捉させた。ネイティブ脂質の一連の希釈液を固定量のビオチン標識化１８：０ ＬＰＡの存在下で結合させた。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて、結合した標識化ＬＰＡを検出した。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍソフトウェアにおいてＣｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆの式を用いて、競合結合データをフィットさせることによって、ネイティブ脂質への各抗体結合に対するＫｉを調べ、別個の飽和結合ＥＬＩＳＡ実験において、ビオチン−標識化ＬＰＡに対する各抗体のＫｄを調べた。この２種類のヒト化抗体候補ＬＴ３１１４及びＬＴ３０１５及び元のマウス抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３と呼ばれる。）に対する代表的データを図２で示す。これらのデータから、１８：１及び１８：２ ＬＰＡに対する競合結合曲線が示される。ヒト化抗体変異体、ＬＴ３１１４及びＬＴ３１１４ ＣＤＲが由来したマウス抗体Ｂ３は、ネイティブ脂質に対して基本的に同一の結合特徴を有し、Ｋｉは、１８：２ ＬＰＡに対して１５ｎＭであり、１８：１ＬＰＡに対して３６０ｎＭであった。２種類のＬＰＡアイソフォームに対するＬＴ３０１５ヒト化抗体変異体のＫｉは幾分低く、１８：２に対して２００ｎＭであり、１８：１ ＬＰＡに対して６００ｎＭであった。１６：０、１８：０及び２０：４ ＬＰＡアイソフォームに対する結合も調べた。各場合において、ヒト化抗体ＬＴ３１１４による結合は、元のマウスＢ３抗体により得られたものと同一であった。

Ｌｐａｔｈｏｍａｂは、ＬＰＡ１受容体へのＬＰＡの結合を阻止し、細胞活性化を妨げることができることが明らかになっている。ヒト化ｍＡｂ、ＬＴ３１１４及びＬＴ３０１５の、ＬＰＡ１過剰発現細胞におけるＬＰＡによる刺激の阻害能を試験した。ＬＰＡ１受容体形質移入細胞に、１８：０、１８：１、１８：２又は２０：４ ＬＰＡとともにマウス抗体Ｂ３及びヒト化抗体ＬＴ３１１４及びＬＴ３０１５の漸増濃度（０−１、５００μｇ／ｍＬ）を添加し、それらの受容体シグナル伝達阻止能について試験した。全３種類の抗体が、各被験脂質に反応したＬＰＡ１受容体シグナル伝達を効果的に阻害した。

実施例７：Ｌｐａｔｈｏｍａｂの動物薬物動態予備試験
Ｌｐａｔｈｏｍａｂを用いてＰＫ予備試験を行った。ＩＶ投与群の場合、単回３０ｍｇ／ｋｇ用量をマウスに注射し、１５日後までに屠殺した。抗体はｉ．ｐ．でも投与し、最初の２４時間内に動物を屠殺し、この時間内で様々な送達経路に対して血中ｍＡｂレベルを比較した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎによって薬物動態パラメーターを評価した。３匹のマウスを各時点で屠殺し、血漿試料を回収し、ＥＬＩＳＡによってｍＡｂレベルについて分析した。マウスにおけるＬｐａｔｈｏｍａｂの半減期を調べたところ、ｉ．ｖ．投与では１０２時間（４．２５日）であった。さらに、ｉ．ｐ．で投与した場合、６−１２時間以内に本抗体が血液に完全に分布し、このことから、ｉ．ｐ．投与が適切であることが示唆された。

パラメーターを計算するために使用したソフトウェア：ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ｖ１．１
ＡＵＣ 曲線下面積
Ｋ１０−ＨＬ 排泄半減期
Ｃｍａｘ 用量関連ピーク値
Ｃｌ クリアランス
ＡＵＭＣ 一次モーメント曲線下の面積
ＭＲＴ 平均滞留時間
Ｖｓｓ みかけの分布体積、定常状態

実施例８：抗ＬＰＡ ｍＡｂはＬＰＡ誘発性ＩＬ−６放出を阻害する。
ＩＬ−６は、強力な疼痛発生炎症性メディエーターである。ＩＬ−６は、末梢神経損傷後、ラット脊髄で産生され、ＩＬ−６レベルのレベルはアロディニアの強度と直接相関がある。Ａｒｒｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８７９：２１６−２５。ＩＬ−６レベルはストレス又は炎症の最中に上昇し、関節リウマチは、滑液中のＩＬ−６レベルの上昇を伴う。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ（２００６），Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．２６：１０９６−１１００；Ｄｅｓｇｅｏｒｇｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：１５１０−１５１６。神経因性疼痛はＩＬ−６ノックアウトマウスにおいて阻止される。Ｘｕ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９：１０２８−１０３３。初代星状膠細胞において、ＬＰＡ（１μＭ）での処理によって、ＩＬ−６放出が起こる。初代星状膠細胞でのＩＬ−６放出における抗ＬＰＡ抗体の影響を評価するために実験を行った。

Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ、ＩＡ）からラット初代星状膠細胞を購入し、販売者の説明書に従い培養した。ＩＬ−６放出アッセイに対して、細胞１ｘ１０^４個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに細胞を播種し、血清不含培地中で２４時間にわたり血清飢餓状態にした。血清飢餓後、マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体Ｂ３（１５０又は３００ｍｇ／ｍＬ抗体（１：１又は１：２モル比、ｍＡｂ：ＬＰＡ；５％ＣＯ_２湿潤恒温槽中、３７℃で１時間）の存在下又は非存在下で予め温置した１ｍＭ ＬＰＡ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ脂肪酸不含ＢＳＡで可溶化）により初代星状膠細胞を処理した。２４時間後、馴化培地を回収し、販売者の説明書に従い、ヒトＩＬ−６ＥＬＩＳＡ（Ｒａｔ ＩＬ−６ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）により試験した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を用いてＩＬ−６値（ｐｇ／ｍＬ）を計算した。

Ｂ３抗体（１：１又は１：２、ｍＡｂ：ＬＰＡ）のモル比濃度の存在下又は非存在下で１ｍＭ ＬＰＡとともに２４時間温置した後、ヒト初代星状膠細胞からの細胞馴化培地をＩＬ−６レベルについて試験した。比が２：１である、ＬＰＡ＋ＬＰＡに対する抗体（マウス抗体Ｂ３）での処理によって、ＩＬ−６放出が阻止されただけでなく、ＩＬ−６レベルが対照レベルのおよそ半分に低下した。１：１の比のＬＰＡ＋抗体によって、ＩＬ−６レベルがほぼ同程度に低下した。従って、抗ＬＰＡ ｍＡｂは、ＬＰＡによる星状膠細胞処理に反応して起こるＩＬ−６放出を阻止する。

実施例９：ＬＰＡに対する抗体は、糖尿病誘発性神経因性疼痛モデルにおけるアロディニアを軽減する。
糖尿病誘発性神経因性疼痛の行動指標としてホルマリン試験中の触覚アロディニア及び痛覚過敏を用いて、ストレプトゾトシン誘発性１型（インスリン欠損）糖尿病のラットモデルにおいて試験を行った。実験手順は全て公開されている。Ｃａｌｃｕｔｔ ＮＡ，Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ＪＤ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＪＳ（２０００），Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ９３：１２７１−１２７８；Ｊｏｌｉｖａｌｔ ＣＧ，Ｒａｍｏｓ ＫＭ，Ｈｅｒｂｅｔｓｓｏｎ Ｋ，Ｅｓｃｈ ＦＳ，Ｃａｌｃｕｔｔ ＮＡ（２００６），Ｐａｉｎ １２１：１４−２１。

体重２２５−２５０グラムの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）をそれぞれ３０から７０％の相対湿度、６５から８２^ｏＦの室温で維持した。飼育室は、毎日１２時間の明／暗サイクルで蛍光灯により照明を点灯した。全動物をケージあたり２匹ずつ、乾燥餌及び水道水を自由に摂取できるようにして維持した。

一晩絶食させた後、０．９％滅菌生理食塩水中で溶解させたストレプトゾトシン（５５ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＰ注射によってインスリン欠損糖尿病を誘発した。４日後及びまた行動試験前にも、ストリップオペレーテッド（ｓｔｒｉｐ ｏｐｅｒａｔｅｄ）反射率計を用いて、尾部突き刺しにより得た血液試料中で高血糖を確認した。全動物を毎日観察し、試験期間中、定期的に体重測定を行った。

触覚応答閾値：底部がメッシュ状の試験ケージにラットを移し、順応させた。肢逃避（ｆｏｏｔ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）に対する５０％機械的閾値を調べるために、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ ＩＬ）を使用した。フィラメントが曲がる圧力で、２．０ｇのバックリング重量を有するものから始まる一連のフィラメントを、右後肢の足底面に順に適用した当てた。肢の持ち上げを陽性応答として記録し、次に軽いフィラメントを次の測定に選択した。５秒後に応答がない場合、より重い次のフィラメントを使用するものとした。行動の最初の変化後４回の測定が行われるまで又は５回連続して陰性（スコアを１５ｇとする。）もしくは４回陽性（スコアを０．２５ｇとする。）スコアが生じるまで、このパラダイムを継続した。５０％応答閾値を挿入するために、得られた一連の陽性及び陰性スコアを使用した。５０％触覚応答閾値が６ｇを下回るラットのみをアロディニア性であるとみなし、薬物試験に進めた。

ホルマリン試験：ラットを手で拘束し、ホルマリン（０．２％又は０．５％溶液５０μＬ）を後肢背面に皮下注射した。次に、ラットを観察用チャンバーに入れ、５分ごとに１分間のブロックで、１時間にわたり、フリンチング（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ）行動の回数を数えた。

組織回収：拘束したラットから尾部突き刺しにより血液を採取し、ストリップオペレーテッド（ｓｔｒｉｐ ｏｐｅｒａｔｅｄ）反射率計を用いて糖尿病ラットにおいて高血糖を確認した。血液（試料あたり０．３−０．５ｍＬ）は、氷上に置いたヘパリン被覆チューブに採取し、遠心し（１５００ｇ、２℃、１０分間）、その後のアッセイのために血漿を−７０℃で保存することもできる。ＣＳＦ（２０−５０μＬ）を回収し、−７０℃で保存した。末梢中枢神経軸及び脊髄の一部を採取して固定液に入れるか又はその後のアッセイのために解剖時に−７０℃で保存した。

実験計画
４群の糖尿病ラット及び１群の対照ラットを確立し、高血糖１週間後にアロディニアについて試験した。ラットにＩＴカテーテルを埋め込み、ＩＶ（尾部静脈）及びＩＴ注射の両方により処置した。ラットは、第２週及び第３週の間、各経路により週に２回の処置を受けた（月曜／木曜はＩＴ、火曜／金曜はＩＶ）。ＩＴ（月）及びＩＶ（火）の処置から１、３及び６時間後に処置ラットにおいて触覚アロディナ（ａｌｌｏｄｙｎａ）がある場合、第４週の初め（最終処置から３−４日後）及びその後に触覚アロディニアについて試験した。それ以外は、未処置の糖尿病ラットにはガバペンチンによる単回処置を行い、次いで薬物投与から１、３及び６時間後に触覚アロディニアの測定を行い、陽性処置対照とした。この試験の終わりに、全ラットに対して、選択された時間に抗ＬＰＡ抗体（ＩＶ及び／又はＩＴ経路、触覚試験データに基づき決定）又はガバペンチンの最終注射を行った後に肢ホルマリン注射（０．２％）を行い、誘発されたフリンチングを最長で１時間観察した。ホルマリン試験の最後に動物を安楽死させ、上述のように保存用に組織を回収した。

予備実験
糖尿病発症から４週間後、マウス抗ＬＰＡ抗体Ｂ３で２週間にわたりラットを処置し、疼痛逃避閾値を測定するという予備実験を行った。非糖尿病マウスを対照として使用した。この予備実験において、抗ＬＰＡ抗体Ｂ３によって、糖尿病ラットにおいて肢逃避閾値が上昇し、このことから、糖尿病誘発性神経因性疼痛があるラットのアロディニアの軽減が示された。これらの好ましい結果に基づき、糖尿病性神経障害の予防実験を計画し、下記のように行った。

糖尿病性神経障害予防実験
糖尿病誘発性神経因性疼痛の発現予防におけるマウス抗体Ｂ３の有効性を調べるために、ＳＴＺでの処置によって３群の糖尿病ラットを確立した。糖尿病発症から２週間後であるが触覚アロディニアの兆候が現れる前に開始し、末梢及び中枢神経系のどちらが又は両区画が制御不能のＬＰＡレベルを示すかに関する文献が不明なので、末梢及び中枢神経系区画の両方に抗体が確実に到達できるようにするために動物に静脈内及び髄腔内の両方で投与した。治療群に対する投与計画は、２群の試験動物に週に２回、抗体１０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与するというものであった。静脈内投与抗体に加えて、髄腔内カテーテルを介して動物に抗体を週に２回投与した。１群の動物（「低用量＋Ｄ」）には２μｇの抗体を投与し、１群の動物（「高用量＋Ｄ」）には１０μｇの抗体を髄腔内投与した。１群の糖尿病動物にはビヒクルのみを投与した（「Ｖｅｈ＋Ｄ」）。非糖尿病ラットを対照として使用した（「Ｖｅｈ＋Ｃ」）。第３週の初め、最終処置から４日後に、触覚応答閾値を測定した。測定結果を図３で示す。抗ＬＰＡ抗体Ｂ３によって、糖尿病ラットにおいて非糖尿病ラットで観察されるものと同様のレベルまで肢逃避閾値（ＰＷＴ）が上昇し、これにより、糖尿病誘発性神経因性疼痛があるラットにおいてアロディニアが顕著に軽減したことが示された。

糖尿病性神経障害介入試験
予防実験における有望な結果に基づき、次に、既存の糖尿病誘発性神経因性疼痛の可逆性を評価するために及び抗ＬＰＡ抗体Ｂ３の静脈内投与と髄腔内投与とを差別化するために、その実験からの９匹の対照糖尿病ラットを使用した。これらのラットは様々な日に次の処置を受けた：第１日に対照薬としてガバペンチン（腹腔内）、第３日にＬｐａｔｈｏｍａｂ ｉ．ｔ．、第６日にＬｐａｔｈｏｍａｂ ｉ．ｖ．及び第１２日に組み合わせ（ｉ．ｔ．＋ｉ．ｖ．）。各投与後、１、３及び６時間での触覚アロディニア（ＰＷ応答）のその後の測定を予防実験に対して前に述べたように記録した。実験終了時に全動物を安楽死させ、組織を回収し、さらなる分析のために保存した。

この実験の結果を図４で示す。肢逃避閾値に対する経時グラフ（図４ａ）及び曲線下面積（ＡＵＣ）グラフ（図４ｂ）の両方を提供する。この介入試験は、抗体の単回投与が、既存の糖尿病誘発性神経因性疼痛の改善においてガバペンチンと同程度有効であったことを示す。ビヒクルと比較した場合、静脈内抗体投与及び髄腔内投与の両方とも効果的であった。静脈内投与後の有効性は一般に、末梢神経系機構の関与を示し、一方でｉ．ｔ．投与後に見られる応答は中枢神経系の関与を示唆するものと考えられる。両投与経路からのＬｐａｔｈｏｍａｂの疼痛応答緩和能から、痛覚伝達の末梢及び中枢機構の双方にＬＰＡが介在することが示される。これは、両投与経路を組み合わせて動物にＬｐａｔｈｏｍａｂを投与した際にさらなる効果が認められることにより支持される。

実施例１０：神経因性疼痛の坐骨神経損傷モデルにおける抗ＬＰＡ抗体
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、様々な細胞タイプにおける、増殖、分化、血管形成、運動性及びアポトーシスの防御を含む複数の細胞反応に介在する内因性生物活性物質である。ＬＰＡは、坐骨神経損傷があるマウスにおいて、神経因性疼痛及び、ＬＰＡ１受容体シグナル伝達を通じた基礎となる機構を開始させる（Ｕｅｄａ ａｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１０（７）：７１２−８ ２００４）。実際に、ＬＰＡ１−ヌルマウスは、様々な神経損傷誘発性神経因性疼痛及び脱髄、ミエリンタンパク質の下方制御及びＣａ_ｖａ２ｄ−１及び脊髄ＰＫＣｇの上方制御などのその基礎となる機構を欠く。坐骨神経（ＳＣＮ）及び後根（ＤＲ）において坐骨神経損傷誘発性脱髄が観察されたが、脊髄神経（ＳＮ）では観察されず、ＬＰＡ１受容体ノックアウトマウスにおいては、ＤＲでは脱髄が消失していたが、ＳＣＮでは消失していなかった。何れか一方による刺激ではなくサブスタンスＰ＋ＮＭＤＡによって脊髄スライスを刺激した場合、ＬＰＡレベルの顕著な時間依存的上昇があるが、これはオートタキシンの作用を通じて新たに産生されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）から変換されたものである（Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，１０７（６）：１５５６−６５）。従って、知覚線維の激しい刺激によりＬＰＡ産生が導かれ、次に後根線維の脱髄が起こることが明らかとなる。末梢神経因性疼痛の坐骨神経損傷誘発性モデルに加えて、脊髄損傷誘発性中枢神経因性疼痛及び中枢ストレス誘発慢性痛モデルも開発した。

末梢神経因性疼痛の坐骨神経損傷誘発性モデルにおいて、抗ＬＰＡ抗体を評価し（Ｓｅｌｔｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｐａｉｎ，４３（２），２０５−２１８）、脊髄損傷誘発性中枢神経因性疼痛及び中枢ストレス誘発慢性痛のモデルにおいても評価することができた。この実験は、長崎大学の植田弘師博士の研究室において行われた。

インビボ実験
体重１８−２２ｇの６週齢雄及び雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。使用前に、２４±２℃、湿度６０±５％に維持した飼育室で、標準的な実験動物用餌及び水道水を自由摂取できるようにしてこれらのマウスを個別に維持した。

１）部分的坐骨神経損傷（ＰＳＮＩ）モデル
マウスに５０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールで深麻酔をかけた。右（又は左）後肢の総坐骨神経を小さな切開部を通じて大腿のレベルで露出させ、神経厚の背側半分を絹糸できつく結紮した。

２）脊髄損傷（ＳＣＩ）モデル
ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）麻酔下で、第９胸椎でのマウスの椎弓切除後、硬膜の背面を露出させる。市販のＳＣＩ装置（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ ｉｍｐａｃｔｏｒ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｆａｉｒｆａｘ Ｓｔａｔｉｏｎ ＶＡを用いて４０ｋｄｙｎ）を用いて、Ｔ９の脊髄分節で脊髄損傷を生成させる。

３）間欠的寒冷負荷（ＩＣＳ）モデル
第１日の午後４：３０に１群あたり２匹のマウスを４±２℃の寒冷室で維持し、餌を与え、水の代わりに寒天を与える。マウスをステンレス鋼メッシュ上に置き、プレキシガラスケージで被覆した。翌朝午前１０：００に、２４±２℃の常温の部屋にマウスを移す。これらを常温に３０分間置いた後、マウスを再び寒冷室に３０分間入れる。午後４：３０までこれらの過程を繰り返す。次に、マウスを寒冷室に一晩入れる。翌日同じ処置を行った後、最終的に午前１０：００にマウスを寒冷室から出す。

１２５ｍＭ ＮａＣｌ、３．８ｍＭ ＫＣｌ、２．０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ_３及び１０ｍＭ Ｄ−グルコース（ｐＨ７．４）を含む人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中で希釈した０．２μｇ／μＬの最低濃度で抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３）を供給した。

１）ＰＳＮＩモデル
抗ＬＰＡ抗体注射：脊髄Ｌ５とＬ６セグメント間でフリーハンドで抗ＬＰＡ抗体の髄腔内（ｉ．ｃ．ｖ．又はｉ．ｔ．）注射を行った。５μＬ（１μｇ）の体積でｉ．ｃ．ｖ．又はｉ．ｔ．注射を行った。

侵害受容試験。デジタルｖｏｎ Ｆｒｅｙ装置試験（Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ、ＩＩＴＣ Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＵＳＡ）を用いて肢加圧試験（ｐａｗ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔｅｓｔ）を行った。この実験において、マウスの肢逃避行動を引き起こすための所定の圧力閾値（グラム単位）を評価した。熱性刺激を用いて、熱性刺激肢逃避試験［Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，ａｌ．（１９８８），Ｐａｉｎ ３２：７７−８８］を行った（ＩＩＴＣ Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）。これらの行動実験は、マウスにおいて結紮から１、３、７及び１４日後に行った。

タンパク質キナーゼＣγ及びＣａα２δ１に対する免疫組織化学：侵害受容試験（第１４日）後、ｉ．ｐ．ペントバルビタールでマウスに深麻酔をかけ、Ｋ＋不含ＰＢＳと続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心的にかん流させた。Ｌ４−Ｌ５分節間の後根神経節（ＤＲＧ）及び脊髄を除去し、４％ＰＦＡ中で後固定した。次に、タンパク質キナーゼＣのγアイソフォーム（ＰＫＣγ）及びＣａα２δ１の免疫染色のために、切片をウサギポリクローナル抗体と反応させる。次いで、この切片をＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧとともに温置する。

脱髄のためのトルイジンブルー染色及び透過型電子顕微鏡：２．５％グルタルアルデヒドでＤＲ線維を固定する。固定したＤＲ線維を２％四酸化オスミウムで後固定し、段階的なアルコールシリーズ中で脱水し、Ｅｐｏｎ８１２中に包埋する。この切片（１μｍ）を各ブロックから切り出し、アルカリ性トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡により調べる。超薄切片（８０ｎｍ厚）をＵｌｔｒａｃｕｔ Ｓ（Ｌｅｉｃａ、Ａｕｓｔｒｉａ）で切り出し、次いで酢酸ウラニル及びクエン酸鉛でそれぞれ染色する。染色した切片を電子顕微鏡下で観察する（ＪＥＭ−１２００ＥＸ；ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）。

２）ＳＣＩモデル
抗ＬＰＡ抗体注射：マウスの右側脳室に抗ＬＰＡ抗体の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．又はｉ．ｔ．）注射を行う。ｉ．ｃ．ｖ．又はｉ．ｔ．注射は５μＬ（１μｇ）の体積で１−５回行う。

侵害受容試験。ＳＣＩから２、４、８及び１２週間後に、肢加圧試験及び熱性刺激肢逃避試験を行う。

３）ＩＣＳモデル
抗ＬＰＡ抗体注射：抗ＬＰＡ抗体のｉ．ｃ．ｖ．又はｉ．ｔ．注射を５μＬ（１μｇ）の体積で１−５回行う。

侵害受容試験。ＩＣＳから１、３、５、１２及び１９日後に肢加圧試験及び熱性刺激肢逃避試験を行う。

ＰＳＮＩ予備試験の結果を図５で示す。

１．予防実験（図５Ａ）：末梢神経因性疼痛を誘発する部分的坐骨神経損傷の１時間前にＬＰＡ（Ｂ３）に対する抗体をマウスに注射した（１μｇ、髄腔内）［Ｓｅｌｔｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｐａｉｎ，４３（２），２０５−２１８］。動物ごとに一方の後肢にのみ損傷付与を行い、損傷（同側）及び非損傷（反対側）側で疼痛応答を測定した。熱性刺激肢逃避潜時（ＰＷＬ）試験（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８８）を使用して、疼痛反応を定量した。簡潔に述べると、ガラス面上に置いたマウスの後肢の肉趾に温熱ビームを当て、逃避応答潜時を測定した（秒単位）。従って、より高い（より長い時間）応答は疼痛が少ないことを示し、より低い（より短い時間）応答は疼痛がより大きいことを示す。

図５Ａは、部分的坐骨神経損傷により、抗体処置の非存在下では、非損傷側（「逆側」）と比較して、損傷側（「ｉｐｓｉ」）の疼痛応答が劇的に上昇する（ＰＷＬ時間の短縮）ことを示す（白色のバーの比較）。この影響は、抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３）での処置により予防される（黒色のバー）。

２．介入実験（図５Ｂ）：マウスにＬＰＡに対する抗体（Ｂ３）（３μｇ、髄腔内）を部分的坐骨神経損傷（前記）から３時間後に注射した。図５Ｂは、上述のように、部分的坐骨神経損傷により、抗体処置の非存在下では、非損傷側（「逆側」）と比較して、損傷側（「ｉｐｓｉ」）で疼痛応答が劇的に上昇する（ＰＷＬ時間の短縮）ことが示される（白色のバーの比較）。この影響は、抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３）での損傷後処置によって少なくとも部分的に逆転される（黒色のバー）。

これらの実験により、ＬＰＡが神経損傷誘発性神経因性疼痛に対する標的として立証され、神経因性疼痛の緩和においてＬＰＡの有効濃度を低下させる抗体などのＬＰＡの阻害剤が治療上有用であることが示唆される。

事後の経時変化実験において、５０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールでマウスに深麻酔をかけた。小さな切開部を通じて右（又は左）後肢の総坐骨神経を大腿のレベルで露出させ、神経厚の背側半分を絹糸できつく結紮した。損傷１時間前に抗ＬＰＡ抗体を髄腔内（ｉ．ｔ．）注射し、脊髄Ｌ５とＬ６セグメント間でフリーハンドで行った。５μＬ（１μｇ）の体積でｉ．ｔ．注射を行った。結紮から最長で１４日後に、侵害受容行動に対する熱性刺激肢逃避（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）及び肢加圧試験を行った。坐骨神経損傷誘発性末梢神経障害において、Ｌｐａｔｈｏｍａｂが１週間以上、神経因性疼痛を軽減することが分かった（図６）。

実施例１１：アジュバント誘発性関節炎（ＡＩＡ）のラットモデルにおける抗ＬＰＡ抗体の効果
雌Ｌｅｗｉｓラット（１５０−２００ｇ）において炎症を確立した。パラフィンオイル中で懸濁した３ｍｇの熱殺菌ミコバクテリウム・ブチリクム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｙｔｒｉｃｕｍ）（３ｍｇ／０．１５０ｍＬ）を第０日に投与群あたり１０匹の動物の尾部に皮下注射した。対照動物にはパラフィンオイルのみを注射した。ラットに番号を割り当て、体重を毎週調べた。第９−１０日までに、ラットは疾患の兆候を現し、プレシスモメーター（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）で肢浮腫（体積）を測定することによってベースラインを取った。疾患ラットにおいて、この実験に組み込むための要件は、対照ラットの肢体積（１．２ｍＬ）より肢体積が０．２００ｍＬ大きいこととした。肢浮腫に基づいて動物を無作為に分け、次いでビヒクル、アイソタイプ対照又はヒト化抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５を投与した。抗体投与から７日及び１１日後に肢体積を測定した。投与から１１日後のデータに基づき、ＥＤ_５０及びＥＤ_８０データを計算した。本実験の最終日に、被験ラットにおいて疼痛の尺度として発声を評価した。最終的血液回収を行った。血漿試料を抗体濃度について分析した。血漿及び肢の体液（ｐａｗ ｆｌｕｉｄ）試料をサイトカイン、エイコサノイド又は関心のあるその他の炎症性メディエーターについて分析した。組織学的評価を行う可能性があるので最後に肢を回収した。

投与：疾患が発現したら（およそ第１１−２５日）投与を開始した。投与は、３日ごとに腹腔内におよそ５回行った。
群：４群＝次の通りの全部で３２匹のラット：
１．陰性対照−パラフィンオイルのみ−ビヒクル
２．陽性対照−ナプロキセン１０ｍｇ／ｋｇ、毎日経口投与
３．アイソタイプ対照−４０ｍｇ／ｋｇ非関連抗体、３日ごと
４．抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５−４０ｍｇ／ｋｇ、３日ごと
５．抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５−８ｍｇ／ｋｇ、３日ごと
６．抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５−１．６ｍｇ／ｋｇ、３日ごと。

この実験において、ヒト化抗ＬＰＡ抗体（ＬＴ３０１５）による治療が、関節炎のラットＡＩＡモデルにおいて疼痛による発声応答を緩和することが分かった。これは図７で示される。バーは、発声の軽減を示す。ビヒクルのみ及びアイソフォーム対照で発声は軽減せず；抗ＬＰＡ抗体の中（８ｍｇ／ｋｇ）及び高（４０ｍｇ／ｋｇ）用量により、陽性対照であるナプロキセンのように、７０−７５％発声が軽減した。ＬＴ３０１５の低用量（１．６ｍｇ／ｋｇ）により発声はおよそ３０％軽減し、このことから、用量依存的効果が示された。

実施例１２：パクリタキセル誘発性神経因性疼痛における抗ＬＰＡ抗体の評価
神経因性疼痛は、癌に対するパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）治療の、問題となり、用量を制限することが多い副作用である。パクリタキセル誘発性神経因性疼痛におけるＬＰＡの役割及びこの疼痛に対する抗ＬＰＡ抗体Ｂ３の緩和能を評価した。この実験は、Ｄｒ Ｄａｎｉｅｌａ Ｓａｌｖｅｍｉｎｉ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの研究室で行われた。

材料及び方法：
実験動物：Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）からの雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（開始体重２００−２１０ｇ）を制御環境下（１２時間明／暗サイクル）でケージあたり３−４匹ずつ収容し、自由に餌及び水を摂取できるようにした。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐａｉｎ及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの実験動物福祉におけるガイドライン及びＳａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる推奨に従い、全実験を行った。実験者に対して治療条件が分からないようにして全実験を行った。

パクリタキセル誘発性神経因性疼痛及び薬物投与：これは、Ｂｅｎｎｅｔｔにより開発された、全身毒性又は運動障害が僅かである、低用量パクリタキセルの反復腹腔内（ｉ．ｐ）注射により神経因性疼痛（機械的アロディニア）が誘発される、特徴がよく分かっているラットモデルである。行動応答は数週間から数ヶ月にわたり継続し、従って、患者における有痛性神経障害をモデル化する。Ｆｌａｔｔｅｒｓ，Ｓ．Ｊ．＆ Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｇ．Ｊ．（２００６）．Ｐａｉｎ １２２，２４５−２５７；Ｊｉｎ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２１０，２２９−２３７；Ｐｏｌｏｍａｎｏ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐａｉｎ ９４，２９３−３０４。４ｍｇ／ｋｇの最終累積用量となるように１ｍｇ／ｋｇで１日おきに４回、即ち第（Ｄ）０、２、４及び６日に、ラットにおいてパクリタキセル又はそのビヒクル（１：１比のＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ及び９５％無水エタノール）をｉ．ｐ注射した。１−３次の実験被験物質：マウス抗ＬＰＡ抗体Ｂ３及びアイソタイプ対照抗体、ＬＴ１０１５を使用し、これらを生理食塩水中で溶解し、個別のバイアル中でＬｐａｔｈにより提供した。次のようにＬｐａｔｈにより設計される投与計画に従い（及び、実験計画、パワーポイント方式の図表を参照）、実験被験物質を２５ｍｇ／ｋｇで静脈内（ｉ．ｖ）投与した。最初のパクリタキセル注射の１日前（Ｄ−１）及び続いて最初のパクリタキセル注射後のＤ２、Ｄ５、Ｄ８、Ｄ１１及びＤ１４に実験被験物質を投与した。パクリタキセル処置群又はその個々のビヒクルにおいて、試験物質を溶解するために使用されたビヒクル（生理食塩水）を同じ投与パラダイムに従い注射した。実験被験物質の注射がパクリタキセル注射と一致した場合（即ちＤ２）、パクリタキセルの１５分前に実験被験物質を送達した。実験被験物質注射前のＤ−１、パクリタキセルの最初のｉ．ｐ．注射後（Ｄ０）及び前及び続いてＤ１２及びＤ１６に、電気的なｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験（ダイナミックプランター・エステシオメータ（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｌａｎｔａｒ ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ）、モデル３７４５０；Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を用いて、機械的逃避閾値を評価した。この目的を達成するために、各ラットをプレキシガラスチャンバー（２８ｘ４０ｘ３５−ｃｍ、ワイヤーメッシュ床）に置き、１５分間順応させた。順応後、サーボ制御機械刺激（鋭い金属フィラメント）を足底面に当て、点状圧力を徐々に増大させて１０秒以内に５０ｇまで到達させた。明確な自発的後肢逃避応答を誘発する圧力を自動的に記録し、機械的閾値指標とした。各時点で機械的閾値を３回評価し、平均値を得て、これを平均絶対閾値（グラム、ｇ）として報告する。機械的アロディニアの発現は、パクリタキセル処置前（ベースライン）に逃避応答を誘発できなかった力で機械的な平均絶対肢逃避閾値（グラム、ｇ）が有意に（Ｐ＜０．０５）低下することにより証明された。パクリタキセル処置の結果、両側性アロディニアが起こり、何れの時点でも何れの群でも左右の後肢間で閾値が異ならなかったので、さらなる分析及びデータ提示のために両肢からの値の平均値を求めた。ラットｎ＝３匹／群で全部で４群を使用した。
群１：パクリタキセル＋生理食塩水の代わりのビヒクル
群２：パクリタキセル＋生理食塩水
群３：パクリタキセル＋５０４Ｂ３
群４：パクリタキセル＋ＬＴ１０１５
（Ｄ−１）及び実験被験物質又はそれらのビヒクル（生理食塩水）のｉ．ｖ注射前の肢逃避閾値（ｇ）は、それぞれ（平均＋／ｓ．ｅｍ）：４３．６±０．２９６、４３．３±０．３７６、４２．８±０．１２０及び４２．７±０．２０３であった。

統計解析
データは、１群あたり３匹の動物に対して平均±ＳＥＭとして表し、パクリタキセル群に対するボンフェローニの事後比較とともに両側、２要因ＡＮＯＶＡによって解析した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００１パクリタキセルｖｓ．ビヒクル群。

結果
パクリタキセル誘発性神経因性疼痛における抗ＬＰＡ抗体Ｂ３及び対照抗体の効果：ビヒクル処置群と比較した場合、パクリタキセルの投与により、機械的アロディニアの発現が導かれた（）。１６時間での機械的アロディニアの発現は、抗ＬＰＡ抗体Ｂ３により有意に減弱したが、アイソタイプ対照ＬＴ１０１５では減弱しなかった（図８）。

本明細書中に記載され主張される組成物及び方法は全て、本開示に照らして、不要な実験を行うことなく為され、実施され得る。本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様に関して記載してきたが、この組成物及び方法に対して変更が適用され得ることは当業者にとって明白であろう。当業者にとって明白なこのような同様の代替物及び変更は全て、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の精神及び範囲内にあるものとみなされる。

本願で言及される特許明細書及び刊行物は全て、本発明が関連する当業者のレベルを示すものである。優先権又は別の利益が主張されるものを含め、全ての特許、特許明細書及び刊行物は、個々の刊行物が具体的に及び個別に参照により組み込まれることが示される場合と同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。

本明細書中で適切に例示的に記載される本発明は、本明細書中で具体的に開示されない要素なく、実施され得る。従って、例えば、本明細書中の各例において、「を含む」、「基本的に〜からなる」及び「からなる」という用語は何れも、他の２つの語と互いに置き換えられ得る。使用してきた用語及び表現は、説明を目的とする用語であり、限定を目的とする用語ではないものとして使用され、このような用語及び表現の使用において、示され、記載される特性又はそれらの一部の何れの同等物も排除するものではないが、様々な変更が主張される本発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、好ましい実施態様及び任意の特性によって本発明が具体的に開示されるものの、本明細書中で開示される内容の変更及び改変物が当業者により再分類され得ること及びこのような変更及び改変物が、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。

Claims (6)

1. 疼痛を有するか又は疼痛を有するリスクがあると思われる対象において疼痛を治療又は予防するための、
   アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＫＴＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号４）を含む第一の軽鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）を含む第二の軽鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列ＳＱＳＴＨＦＰＦＴ（配列番号６）を含む第三の軽鎖相補性決定領域と、を含む、少なくとも１つの軽鎖可変ドメインと、
   アミノ酸配列ＮＹＬＩＥ（配列番号７）を含む第一の重鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列ＬＩＹＰＤＳＧＹＩＮＹＮＥＮＦＫＧ（配列番号２）を含む第二の重鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列ＲＦＡＹＹＧＳＧＹＹＦＤＹ（配列番号３）を含む第三の重鎖相補性決定領域と、を含む、少なくとも１つの重鎖可変ドメインと、
   を含む、ヒト化モノクローナル抗体又は抗原結合活性を保持するその抗体断片。
2. 前記疼痛が、糖尿病誘発性神経因性疼痛、アロディニア、パクリタキセル誘発性神経因性疼痛、又は、坐骨神経損傷、脊髄損傷、間欠的寒冷負荷、若しくは関節炎に起因する神経因性疼痛である、請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体又は抗原結合活性を保持するその抗体断片。
3. 前記対象がヒト対象である、請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体又は抗原結合活性を保持するその抗体断片。
4. 前記軽鎖可変領域ドメインが、アミノ酸配列ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＫＴＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＦＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＦＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号４３）を含み；および前記重鎖可変領域ドメインが、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＡＦＧＤＡＦＴＮＹＬＩＥＷＶＲＱＭＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＹＰＤＳＧＹＩＮＹＮＥＮＦＫＧＱＡＴＬＳＡＤＲＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＦＣＡＲＲＦＡＹＹＧＳＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号６２）む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又は抗原結合活性を保持するその抗体断片。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又は抗原結合活性を保持するその抗体断片を含有することを特徴とする、疼痛を有するか又は疼痛を有するリスクがあると思われる対象において疼痛を治療又は予防するための組成物。
6. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体又は抗原結合活性を保持するその抗体断片を含有することを特徴とする、疼痛を有するか又は疼痛を有するリスクがあると思われる対象において疼痛を治療又は予防するための医薬組成物。

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