JP2016503650A - Ｄｌ−アラニンを生産する遺伝子操作細菌、及び前記遺伝子操作細菌を用いることによってｄｌ−アラニンを生産する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌を開示する。このＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌自体の乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、フマル酸レダクターゼ、アラニンラセマーゼ、及びメチルグリオキサールシンターゼを不活化し、更に、その染色体に外因性Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子及び外因性アラニンラセマーゼ遺伝子を組み込む。本願では、遺伝子操作細菌の染色体に外因性Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を組み込むことによって、解糖系の中間体であるピルビン酸をＬ−アラニンに変換し、外因性アラニンラセマーゼ遺伝子を更に組み込むことによって、一部のＬ−アラニンをＤ−アラニンに変換して、原材料多糖類からＤＬ−アラニンを直接生産する。これにより、ＤＬ−アラニンの生産サイクルを短縮し、ＤＬ−アラニンの収量を増加させる。【選択図】なし

Description

本発明は、ＤＬ−アラニン生産分野、具体的には、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌及び前記遺伝子操作細菌を用いてＤＬ−アラニンを生産する方法に関する。

ＤＬ−アラニンは、調味料の調味効果を強化する好味を有するので、栄養補助食品及び調味料として食品加工業界で主に用いられている。また、幾つかのペプチド、医薬、及び医薬中間体を合成するために、医薬業界でも用いられている。

現在、ＤＬ−アラニンは、酵素的触媒技術（アラニンラセマーゼ）又は化学的ラセミ化法を用いて主に生産されているが、化学的ラセミ化法は、溶媒として有機酸を必要とするため環境汚染及び低収量等の問題点が生じるので、徐々に用いられなくなっている。酵素的触媒技術では、第１に、グルコースを発酵させてＬ−アラニンを生産し、次いで、酵素的触媒を用いて前記Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変換する。前記Ｄ−アラニンは、この手順中に３０ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌ蓄積し、収量は低いが、生産サイクルは長い。第２に、ＤＬ−アラニンを生産するのに必要なアラニンラセマーゼを分泌するように、菌株を高密度培養しなければならず、このプロセス中の酸素要求量が高い。更に、高レベルで発現させるためにアラニンラセマーゼ遺伝子をプラスミドにクローニングするので、菌株の培養中、前記プラスミドの安定な遺伝子複製を維持するために抗生物質を添加しなければならない。したがって、この解決策は、産業化が容易ではない。

本発明の主な目的は、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌であって、高収量及び短い生産サイクルでグルコースを用いてＤＬ−アラニンを直接生産することができる遺伝子操作細菌を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決策を採用する：元の細菌の染色体における乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酢酸キナーゼ遺伝子、フマル酸レダクターゼ遺伝子、アラニンラセマーゼ遺伝子、及びメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子を不活化し、その染色体に外因性Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子及び外因性アラニンラセマーゼ遺伝子を組み込み、スクリーニングを行って、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌を得る。前記不活化の方法としては、ノックアウト、挿入突然変異、又はスモールＲＮＡを用いて前記遺伝子の発現に干渉する等が挙げられる。

図１は、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌の代謝経路を示す。 図２は、プラスミドｐＸＺ−Ａ１９の模式図を示す。 図３は、プラスミドｐＸＺ−Ａ２０の模式図を示す。 図４は、プラスミドｐＸＺ−Ａ２１の模式図を示す。 図５は、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した、ＸＺ−Ａ３０株の発酵ブロスの成分スペクトルを示す。

細菌は、代謝においてＬ−アラニンの同化を行うので、上に定義した解決策は、全ての従来の細菌において実現可能である。本願は、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌を構築するための細菌として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を選択することが好ましい。

前記外因性Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来し、前記外因性アラニンラセマーゼ遺伝子は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、好ましくは枯草菌１６８に由来し、前記アラニンラセマーゼの不活化は、主に、大腸菌自体のアラニンラセマーゼ（ＤａｄＸ）遺伝子をノックアウトすることを指す。

上述の解決策では、Ｌ−アラニンを生産する大腸菌ＸＺ−Ａ２６株（中国特許出願公開第１０２３２９７６５号明細書）にａｌａＲ遺伝子を直接組み込む。ＸＺ−Ａ２６株は、２０１０年７月２６日にアクセッション番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０３６で中国科学院微生物研究所の中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託された。ＸＺ−Ａ２６株は、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、フマル酸レダクターゼ、及びアラニンラセマーゼが不活化されており、その染色体には、外因性Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子が既に組み込まれている。したがって、ＸＺ−Ａ２６株の染色体に、外因性アラニンラセマーゼ遺伝子を組み込み、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子をノックアウトするだけでよい。元の菌を用いて本発明のＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌を構築する場合、同じ効果を得るために、前記細菌自体の染色体における乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酢酸キナーゼ遺伝子、フマル酸レダクターゼ遺伝子、アラニンラセマーゼ遺伝子、及びメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子をノックアウトし、外因性のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子及びアラニンラセマーゼ遺伝子を組み込んでもよい。上記遺伝子のノックアウト及び組み込みの方法は、「一種高産Ｌ−丙気酸的ＸＺ−Ａ２６菌株及構建方法与応用」という名称の中国特許（中国特許出願公開第１０２３２９７６５号明細書）に記載されている技術的解決策に従って実施してよい。

本発明のＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌の構築方法は、具体的には、元の菌株として機能する大腸菌ＸＺ−Ａ２６ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０３６の染色体のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子座に外因性アラニンラセマーゼ遺伝子を組み込むことを含む。前記外因性アラニンラセマーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１４に記載の配列を有し、前記メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子は、配列表の配列番号１５の５’末端から数えて４９５番目〜９５３番目の位置のヌクレオチドの配列を有し、人工調節エレメントＭ１−９３は、配列表の配列番号１７に記載の配列を有する。

本発明のＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌は、下記の通り以下の工程によって構築される。
（ａ）アラニンラセマーゼ遺伝子のクローニング及び組み込み：
１）下記順序でタンデムに連結されているメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの上流アーム、クロラムフェニコール遺伝子、レバンスクラーゼ遺伝子、及びメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの下流アームからなるＤＮＡ断片Ｉを構築し、前記ＤＮＡ断片Ｉに電気ショックを与えて、ｐＫＤ４６プラスミドを有する大腸菌ＸＺ−Ａ２６ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０３６に形質転換し、配列番号３の配列を有するＤＮＡ断片及び配列番号４の配列を有するＤＮＡ断片からなる一対のプライマーを用いて同定したクロラムフェニコール耐性コロニーをスクリーニングして、４，１１１ｂｐの増幅産物を含む菌株（ＸＺ−Ａ２７と命名）を得る工程。
２）下記順序でタンデムに連結されているメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの上流アーム、ｌａｃＩ遺伝子、ｔｒｃプロモータ、枯草菌１６８のアラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲ、及びメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの下流アームからなるＤＮＡ断片ＩＩを構築し、前記ＤＮＡ断片ＩＩに電気ショックを与えて、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＸＺ−Ａ２７に形質転換し、スクロースを含有するが塩化ナトリウムは含有しないＬＢ培地で培養し、配列番号３の配列を有するＤＮＡ断片及び配列番号４の配列を有するＤＮＡ断片からなる一対のプライマーを用いて同定した４，２１０ｂｐの増幅産物を有する菌株をスクリーニングし、前記菌株をＸＺ−Ａ２８と命名する工程。
（ｂ）アラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲの調節：
３）ＤＮＡ断片ＩＩＩを構築し、前記ＤＮＡ断片ＩＩＩに電気ショックを与えて、ｐＫＤ４６を有するＸＺ−Ａ２８に形質転換し、配列番号１１の配列を有するＤＮＡ断片及び配列番号１３の配列を有するＤＮＡ断片からなる一対のプライマーで同定して、１，８９０ｂｐの増幅産物を含む菌株、即ち、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌を得る工程。
具体的には、前記ＤＮＡ断片Ｉは、配列番号３及び配列番号４に記載のプライマー対を用いてテンプレートとして機能する大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のゲノムＤＮＡを増幅して、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡ、並びにその上流断片及び下流断片を得、次いで、前記増幅産物をｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクターにクローニングして、カナマイシン耐性プラスミドｐＸＺ−Ａ１９を得、配列番号５及び配列番号６に記載のＤＮＡ断片をプライマーとして用いて前記ｐＸＺ−Ａ１９を増幅して生成物を得、これを、クロラムフェニコール遺伝子及びレバンスクラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片と連結してプラスミドｐＸＺ−Ａ２０を得、次いで、配列番号３及び配列番号４に記載のＤＮＡ断片をプライマーとして用い、前記ｐＸＺ−Ａ２０のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅させてＤＮＡ断片Ｉを得る方法によって得られ、前記クロラムフェニコール遺伝子及びレバンスクラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、配列番号７及び配列番号８に記載のプライマー対を用いてｐＬＯＩ４１６２プラスミドを増幅することによって得られるＤＮＡ断片である。
前記ＤＮＡ断片ＩＩは、配列番号１及び配列番号２に記載のプライマーを用いて枯草菌１６８のゲノムＤＮＡを増幅してアラニンラセマーゼ遺伝子の断片を得、次いで、これをｐＴｒｃ９９ＡプラスミドのＸｂａＩ制限酵素部位とＳａｌＩ制限酵素部位との間に挿入してプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ａｌａＲを得、配列番号５及び配列番号６に記載のＤＮＡ断片をプライマーとして用いてｐＸＺ−Ａ１９から増幅した生成物と配列番号９及び配列番号１０に記載のプライマーを用いてｐＴｒｃ９９Ａ−ａｌａＲから増幅した生成物とを連結してプラスミドｐＸＺ−Ａ２１を得た後、配列番号３及び配列番号４に記載のＤＮＡ断片をプライマーとして用いてｐＸＺ−Ａ２１のプラスミドＤＮＡを増幅してＤＮＡ断片ＩＩを得る方法によって得られる。
前記ＤＮＡ断片ＩＩＩは、配列番号１１及び配列番号１２のＤＮＡ断片によって示す配列をプライマーとして用いて組み換え大腸菌株Ｍ１−９３のゲノムＤＮＡを増幅して、ＤＮＡ断片ＩＩＩ（配列は、配列表の配列番号１６によって示す）を得る方法によって得られる。

より具体的な解決策では、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌は、２０１２年１０月１２日にアクセッション番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．６６６７で中国科学院微生物研究所の中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）（北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託された大腸菌ＸＺ−Ａ３０株である。この細菌は、発酵によって高濃度のＤＬ−アラニンを生産することができ、更に、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンとの光学純度の比が、５０：５０である。

図１に示す通り、本願では、遺伝子操作細菌の染色体に外因性Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を組み込むことによって、解糖系の中間体であるピルビン酸をＬ−アラニンに変換し、外因性アラニンラセマーゼ遺伝子を更に組み込むことによって、一部のＬ−アラニンをＤ−アラニンに変換して、原材料多糖類からＤＬ−アラニンを直接生産する。これにより、ＤＬ−アラニンの生産サイクルを短縮する。一方、原材料多糖類が規定の経路に従って代謝されてＤＬ−アラニンを合成して、ＤＬ−アラニンの収量が増加するように、遺伝子操作細菌自体の乳酸デヒドロゲナーゼ、メチルグリオキサールシンターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、及びフマル酸レダクターゼを不活化して、代謝中に乳酸、ギ酸、エタノール、酢酸、及びコハク酸等の副産物が合成されるのを防ぐ。本明細書では、ＤＬ−アラニンとは、Ｄ−アラニン及びＬ−アラニンを指す。外因性アラニンラセマーゼ遺伝子の導入は、主に、発酵から得られる生成物中のＬ−アラニンとＤ−アラニンとの光学純度の比が５０：５０になって、生成物の生産要件を満たすように、生産されるＬ−アラニンの半分をＤ−アラニンに変換する目的のために役立つ。

本発明の別の目的は、遺伝子操作細菌を用いてＤＬ−アラニンを生産する方法を提供することにあり、そのために以下の解決策を採用する：ＤＬ−アラニンを生産する方法であって、上で構築したＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌の菌株を、嫌気性／好気性培養条件下で、培養温度３０℃〜４２℃にて、６．５〜７．５に制御したｐＨ下で発酵及び培養し、ＤＬ−アラニンを分離及び抽出することを含む方法。

発酵及び培養用の培地は、原材料多糖類、窒素源、及び微量無機塩類からなる。前記原材料多糖類は、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、リグノセルロース、又はこれらの加水分解物及びシロップのうちの１つ又は２つ以上の任意の組み合わせから選択される。前記窒素源は、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びリン酸アンモニウムのうちの１つ又は２つ以上の任意の組み合わせから選択される無機窒素含有化合物である。前記微量無機塩類は、可溶性鉄塩、コバルト塩、銅塩、亜鉛塩、マンガン塩、及びモリブデン酸塩のうちの１つ又は２つ以上の任意の組み合わせから選択される。前記培地は、好ましくは、１２０ｇ／Ｌのグルコース、４ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、５ｇ／ＬのＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、及び４ｍＬ／Ｌの微量無機塩類からなり、ここで、前記微量無機塩類は、１．５ｍｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＺｎＣｌ_２、０．１ｍｇのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、及び０．２ｍｇのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２を含み、これらを蒸留水で希釈して体積を１Ｌにし、滅菌のために濾過する。

前記発酵及び培養の期間は、４０時間〜６０時間である。遺伝子操作細菌は、前記発酵及び培養前に、温度３０℃、振盪機の回転速度５０ｒ／分（５０回転／分）で１８時間シード培養する。

以下の実施例は、本発明を更に説明するために提示されるが、本発明の実体的要件を限定することを意図するものではない。以下の実施例で用いられる各実験方法は、特に指定しない限り、従来法である。特に指定しない限り、以下の実施例で用いる材料、試薬等は全て市販されている。実施例１は、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌を構築するための実施例であり、実施例２〜５は、実施例１で構築した遺伝子操作細菌を用いてＤＬ−アラニンを生産するための実施例である。実施例２〜５において、発酵ブロスの成分は、高速液体クロマトグラフィーＡｇｉｌｅｎｔ−１２００を用いて測定し、ＤＬ−アラニンの定量及びキラル性測定は、リガンド交換キラル異性体液体クロマトグラフィーカラム（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＭＡ（＋））（Ｄａｃｉｅｌ製）を用いて実施し、前記発酵ブロス中の残りのグルコース及び様々な酸は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ炭水化物分析カラム（Ｂｉｏｒａｄ製）を用いて測定した。高速液体クロマトグラフィーによって測定した実施例２〜５で得られた発酵ブロスの成分の含量を図５に示す。以下の実施例では、標準としてＤ−アラニン及びＬ−アラニンを用いて、外部標準法（標準曲線法）を用いて定量を行った。

実施例１． ＸＺ−Ａ３０株の構築
ＸＺ−Ａ３０株の構築は、２つの工程（ａ）及び（ｂ）を含んでおり、具体的には、以下の通りである。

（ａ）アラニンラセマーゼ遺伝子のクローニング及び組み込み
アラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲのクローニング及び組み込みは、以下の２つの工程で実施した：
（ａ１）ａｌａＲ遺伝子のクローニング
枯草菌１６８のゲノムＤＮＡ（Ｍｏｓｚｅｒ Ｉ，Ｊｏｎｅｓ ＬＭ，Ｍｏｒｅｉｒａ Ｓ，Ｆａｂｒｙ Ｃ，Ｄａｎｃｈｉｎ Ａ． ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ：ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２，３０（１）：６２−６５、安徽華恒生物工程有限公司から入手可能）をテンプレートとして用い、プライマーａｌａＲ ｕｐ−ＸｂａＩ／ａｌａＲ ｄｏｗｎ−ＳａｌＩを用いて、枯草菌（配列番号１４）のアラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲを増幅した。プライマー配列は、以下の通りであった：
ａｌａＲ ｕｐ−ＸｂａＩ：ＧＧＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴ（配列番号１）；
ａｌａＲ ｄｏｗｎ−ＳａｌＩ：ＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＴＡＣＣ（配列番号２）。

増幅系の合計体積は５０μＬであり、以下を含有していた：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＰｆｕＵｌｔｒａ１０×バッファ、５μＬ；ｄＮＴＰ（１０ｍＭ 各ｄＮＴＰ）、１μＬ；ＤＮＡテンプレート、２０ｎｇ；プライマー（１０μＭ）１μＬ；ＰｆｕＵｌｔｒａ（２．５Ｕ／μＬ）、１μＬ；及び蒸留水、４０μＬ。増幅プロトコールは、以下からなっていた：９５℃における初期変性２分間（１サイクル）；次いで、９５℃における変性３０秒間、５５℃におけるアニーリング３０秒間、７２℃における伸長２分間（３０サイクル）；及び７２℃における最終伸長１０分間（１サイクル）。ｐＴｒｃ９９Ａプラスミド（Ａｍａｎｎ，Ｅ．，Ｏｃｈｓ，Ｂ．ａｎｄ Ａｂｅｌ，Ｋ．Ｊ．Ｔｉｇｈｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｕｎｆｕｓｅｄ ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｇｅｎｅ．１９８８，６９：３０１−１５、安徽華恒生物工程有限公司から入手可能）のＸｂａＩ制限酵素部位及びＳａｌＩ制限酵素部位に増幅産物をクローニングして、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ａｌａＲを作製した。

クローニングは、以下の通り実施した：プライマーａｌａＲ ｕｐ−ＸｂａＩ／ａｌａＲ ｄｏｗｎ−ＳａｌＩを用いた増幅によって得られたａｌａＲ遺伝子のＰＣＲ断片を洗浄及び精製して、ａｌａＲ遺伝子含有ＤＮＡ断片（１，１９２ｂｐ、配列番号１４の配列とプライマー１及び２によって導入された配列とを含有）を作製した。酵素切断系は、以下を含んでいた：ａｌａＲ ＤＮＡ断片０．２μｇ、１０×ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ Ｇｒｅｅｎバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）２μＬ、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＸｂａＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）１μＬ、及びＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＳａｌＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）１μＬ。これらに蒸留水を添加して最終体積を２０μＬにした。前記系を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、切断されたａｌａＲ遺伝子含有ＤＮＡ断片（配列番号１４）をアガロースゲルから回収した。プラスミドｐＴｒｃ９９Ａの酵素切断系は、以下を含んでいた：プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ １μｇ、１０×ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ Ｇｒｅｅｎバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）２μＬ、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＸｂａＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）１μＬ、及びＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＳａｌＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）１μＬ。これに蒸留水を添加して、最終体積を２０μＬにした。前記系を３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、切断されたｐＴｒｃ９９Ａ含有ＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。ライゲーション系は、以下を含んでいた：酵素切断から回収したｐＴｒｃ９９Ａ断片１０ｎｇ、ａｌａＲ ＤＮＡ断片２０ｎｇ、及びＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファ２μＬ。これらに蒸留水を添加して、最終体積を１０μＬにした。次いで、Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５μＬを加えて、２５℃で１０分間放置し、次いで、そのうちの５μＬをＴｒａｎｓ１−Ｔ１コンピーテントセル（北京全式金生物技術有限公司から購入）５０μＬに添加した。混合物を３０分間氷浴に入れ、氷上で２分間放置した直後、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、次いで、ＬＢ培地２５０μＬを添加した後、２００ｒｐｍ、３７℃で１時間インキュベートした。細菌溶液２００μＬを、アンピシリン含有ＬＢプレート（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）上に広げ、一晩培養し、次いで、液体培養のために５つの陽性シングルコロニーを選択した。そこから、配列決定のために陽性クローンのプラスミド（ａｌａＲ ＤＮＡ断片がｐＴｒｃ９９Ａにクローニングされているプラスミド）を単離した。配列決定の結果、切断されたｐＴｒｃ９９ＡプラスミドがａｌａＲ含有ＤＮＡ断片とライゲーションしていたことが示されたので、プラスミドが正確に構築されたことが立証された。このプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−ａｌａＲと命名した。

（ａ２）Ｌ−アラニン生産細菌ＸＺ−Ａ２６の染色体におけるメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡへのａｌａＲ遺伝子の組み込み
Ｌ−アラニン生産細菌ＸＺ−Ａ２６ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０３６（中国特許出願公開第１０２３２９７６５号明細書、安徽華恒生物工程有限公司）の染色体におけるメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡへのａｌａＲ遺伝子の組み込みを、以下の６つの工程で実施した。

第１の工程では、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｊａｎｔａｍａ Ｋ，Ｓｈａｎｍｕｇａｍ ＫＴ，Ｉｎｇｒａｍ ＬＯ．Ｒｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｎｅｒａｌ ｓａｌｔｓ ｍｅｄｉｕｍ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００９，７５（２４）：７８０７−７８１３、安徽華恒生物工程有限公司から入手可能）のゲノムＤＮＡから、プライマーｍｇｓＡ−ｕｐ／ｍｇｓＡ−ｄｏｗｎを用いて、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡ（ＧｅｎｅＩＤ：６０６４５８５）並びにその上流及び下流約４００ｂｐを増幅した。プライマー配列は、以下の通りであった：
ｍｇｓＡ−ｕｐ：ＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡ ＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡ（配列番号３）；
ｍｇｓＡ−ｄｏｗｎ：ＡＡＡＡＧＣＣＧＴＣ ＡＣＧＴＴＡＴＴＧＧ（配列番号４）。

増幅系の合計体積は５０μＬであり、以下を含んでいた：ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ５×バッファ、１０μＬ；ｄＮＴＰｓ（各ｄＮＴＰ １０ｍＭ）、各１μＬ；ＤＮＡテンプレート、２０ｎｇ；プライマー（１０μＭ）、２μＬ；Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）、０．５μＬ；及び蒸留水、３３．５μＬ。増幅プロトコールは、以下からなっていた：９８℃における初期変性２分間（１サイクル）；次いで、９８℃における変性１０秒間、５９℃におけるアニーリング１０秒間、７２℃における伸長９０秒間（３０サイクル）；及び７２℃における最終伸長５分間（１サイクル）。ＰＣＲ増幅により、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子（配列表の配列番号１５の５’末端から数えて４９５番目〜９５３番目の位置のヌクレオチド）、この遺伝子の上流約４００ｂｐの断片（配列表の配列番号１５の５’末端から数えて１番目〜４９４番目の位置のヌクレオチド）、及びこの遺伝子の下流約４００ｂｐの断片（配列表の配列番号１５の５’末端から数えて９５４番目〜１，４３５番目の位置のヌクレオチド）を含有する配列番号１５に記載のＤＮＡ断片を作製した。増幅産物をｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（北京全式金生物技術有限公司から購入）にクローニングした。クローニング系は、以下を含んでいた：ＰＣＲ増幅産物１μＬ、及びｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター１μＬ。これらを穏やかに混合し、室温で５分間反応させ、Ｔｒａｎｓ１−Ｔ１コンピーテントセル（北京全式金生物技術有限公司から購入）５０μＬに添加した。混合物を３０分間氷浴に入れ、氷上で２分間放置した直後、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、次いで、それにＬＢ培地２５０μＬを添加した後、２００ｒｐｍ、３７℃で１時間インキュベートした。細菌溶液２００μＬを、カナマイシン含有ＬＢプレート（最終濃度１５μｇ／ｍＬ）上に広げ、一晩培養し、次いで、液体培養のために５つの陽性シングルコロニーを選択した。そこから、配列決定のために陽性クローンのプラスミドを単離した。配列決定の結果、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子並びにその上流及び下流約４００ｂｐの断片がベクターｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔに挿入されていたことが示されたので、プラスミドが正確に構築されたことが立証された。得られた組み換えプラスミドをｐＸＺ−Ａ１９と命名した（図２）。

第２の工程では、プライマーｍｇｓＡ−１／ｍｇｓＡ−３を用いてｐＸＺ−Ａ１９プラスミドＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅した：
ｍｇｓＡ−１：ＡＧＣＧＴＴＡＴＣＴ ＣＧＣＧＧＡＣＣＧＴ（配列番号５）；
ｍｇｓＡ−３：ＧＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＡＴＣＧ（配列番号６）。

増幅系の合計体積は５０μＬであり、以下を含んでいた：ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ５×バッファ、１０μＬ；ｄＮＴＰｓ（各ｄＮＴＰ １０ｍＭ）、各１μＬ；ＤＮＡテンプレート、２０ｎｇ；プライマー（１０μＭ）、２μＬ；Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）、０．５μＬ；及び蒸留水、３３．５μＬ。増幅プロトコールは、以下からなっていた：９８℃における初期変性２分間（１サイクル）；次いで、９８℃における変性１０秒間、６０℃におけるアニーリング１０秒間、７２℃における伸長２分間（３０サイクル）；及び７２℃における最終伸長５分間（１サイクル）。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクターと、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子の上流及び下流約４００ｂｐとを含んでおり、即ち、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクターと、配列番号１５の５’末端から数えて９２５番目〜１，４３５番目の位置のヌクレオチド配列と、配列番号１５の５’末端から数えて１番目〜５７０番目の位置のヌクレオチド配列とを含んでいた。

第３の工程では、クロラムフェニコール遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有するＤＮＡ断片を、第２の工程のＰＣＲ増幅産物にライゲーションした。ｐＬＯＩ４１６２プラスミド（Ｊａｎｔａｍａ Ｋ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｍｏｏｒｅ ＪＣ，Ｓｈａｎｍｕｇａｍ ＫＴ，Ｓｖｏｒｏｎｏｓ ＳＡ，Ｉｎｇｒａｍ ＬＯ．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｙｉｅｌｄｓ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００８，１０１（５）：８８１−８９３、安徽華恒生物工程有限公司から入手可能）に対してＰＣＲ増幅を実施し、プライマーｃａｔ−ｓａｃＢ−ｕｐ／ｄｏｗｎ ｃａｔ−ｓａｃＢを用いてｃａｔ−ｓａｃＢ断片を増幅した。プライマー配列は、以下の通りであった：
ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｕｐ：ＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧ（配列番号７）；
ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｄｏｗｎ：ＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡ（配列番号８）。

増幅系は、第１の工程と同じものを用いた。クロラムフェニコール遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有するＤＮＡ断片（３，０３０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動から回収した。クロラムフェニコール遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有するＤＮＡ断片を、以下のライゲーション系を用いて第２の工程のＰＣＲ増幅産物とライゲーションした：第２の工程のＰＣＲ増幅産物１０ｎｇ、ｃａｔ−ｓａｃＢ ＤＮＡ断片３０ｎｇ、１０×Ｔ４ライゲーションバッファ（ＮＥＢ Ｃｏｍｐａｎｙ）２μＬ、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ Ｃｏｍｐａｎｙ、４００，０００付着末端ユニット／ｍＬ）１μＬ。これらに蒸留水を添加して最終体積を２０μＬにし、室温で２時間ライゲーションした。混合物５μＬを取り出してＴｒａｎｓ１−Ｔ１コンピーテントセル（北京全式金生物技術有限公司から購入）５０μＬに添加し、３０分間氷浴に入れ、氷上で２分間放置した直後、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、次いで、それにＬＢ培地２５０μＬを添加した後、２００ｒｐｍ、３７℃で１時間インキュベートした。細菌溶液２００μＬをクロラムフェニコール含有ＬＢプレート（最終濃度１７μｇ／ｍＬ）上に広げ、一晩培養し、次いで、液体培養のために５つの陽性シングルコロニーを選択した。そこから、配列決定のために陽性クローンのプラスミド（ｃａｔ−ｓａｃＢ ＤＮＡ断片をｐＸＺ−Ａ１９にクローニングしたプラスミド）を単離した。配列決定の結果、ｃａｔ−ｓａｃＢ ＤＮＡ断片が第２の工程のＰＣＲ増幅産物にライゲーションされていたことが示されたので、プラスミドが正確に構築されたことが立証された。得られた組み換えプラスミドをｐＸＺ−Ａ２０と命名した（図３）。

第４の工程では、プライマーｍｇｓＡ−ｕｐ／ｍｇｓＡ−ｄｏｗｎ（配列番号３／配列番号４）を用いてｐＸＺ−Ａ２０のプラスミドＤＮＡを増幅してＤＮＡ断片Ｉを作製した。これには、合計体積５０μＬの以下の増幅系を用いた：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ５×バッファ、１０μＬ；ｄＮＴＰｓ（各ｄＮＴＰ １０ｍＭ）、各１μＬ；ＤＮＡテンプレート２０ｎｇ；プライマー（１０μＭ）、２μＬ；Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）、１μＬ；及び蒸留水、３３．５μＬ。増幅プロトコールは、以下からなっていた：９８℃における初期変性２分間（１サイクル）；次いで、９８℃における変性１０秒間、５９℃におけるアニーリング１０秒間、７２℃における伸長１００秒間（３０サイクル）；及び７２℃における最終伸長５分間（１サイクル）。増幅から得られたＤＮＡ断片Ｉは、以下の順序で連結されているメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの上流約４００塩基対（配列番号１５の５’末端から数えて１番目〜５７０番目の位置のヌクレオチド配列）、ｃａｔ−ｓａｃＢ ＤＮＡ断片、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの下流約４００塩基対（配列番号１５の５’末端から数えて９２５番目〜１，４３５番目の位置のヌクレオチド配列）。

ＤＮＡ断片Ｉを第１の相同組み換えに付した。先ず、ｐＫＤ４６プラスミド（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｃ．Ｗ．１９８８．Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｈｉｇｈ ｖｏｌｔａｇｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５、安徽華恒生物工程有限公司から入手可能）を、塩化カルシウムを用いた形質転換によって大腸菌ＡＴＣＣ８７３９に形質転換した。次いで、ＤＮＡ断片Ｉに電気ショックを与え、ｐＫＤ４６を有する大腸菌ＡＴＣＣ８７３９に形質転換した。

電気ショックによる形質転換は、以下の条件を含んでいた。先ず、電気的に形質転換されたｐＫＤ４６プラスミドを有する大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のコンピーテントセルを調製し、前記コンピーテントセル５０μＬを氷上で放置し、それにＤＮＡ断片Ｉ ５０ｎｇを添加し、次いで、混合物を氷上で２分間放置し、０．２ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄキュベットに移した。電圧（電気ショックパラメータ）２．５ｋＶのＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）エレクトロポレーション装置を用いた。ＬＢ培地１ｍＬを前記キュベットに移した直後、電気ショックを与え、５回ピペッティングし、試験管に移し、７５ｒｐｍ、３０℃で２時間インキュベートした。細菌溶液２００μＬをクロラムフェニコール含有ＬＢプレート（最終濃度１７μｇ／ｍＬ）上に広げ、３７℃で一晩培養し、次いで、（プライマーｍｇｓＡ−ｕｐ／ｍｇｓＡ−ｄｏｗｎ（配列番号３／配列番号４）を用いて）ＰＣＲ増幅により検証するために、５つのシングルコロニーを選択した。回収したコロニーの増幅産物は、４，１１１ｂｐであった。１つの正確なシングルコロニーを選択し、ＸＺ−Ａ２７と命名した。ＸＺ−Ａ２７では、相同組み換えを介して染色体上のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子がｃａｔ−ｓａｃＢ ＤＮＡ断片に置き換わっていた。

第５の工程では、プライマーａｌａＲ−ｕｐ／ａｌａＲ−ｄｏｗｎを用いてプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ａｌａＲを増幅して、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクター上のｌａｃＩ遺伝子、ｔｒｃプロモータ、及びアラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲを作製した。これを第２の工程のＰＣＲ増幅産物とライゲーションした。プライマー配列は、以下の通りであった：
ａｌａＲ−ｕｐ：ＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＡ（配列番号９）；
ａｌａＲ−ｄｏｗｎ：ＡＧＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣ（配列番号１０）。

クローニング系は、第３の工程と同じものを用いた。細菌溶液２００μＬをカナマイシン含有ＬＢプレート（最終濃度１５μｇ／ｍＬ）上に広げ、一晩培養し、次いで、液体培養のために５つの陽性シングルコロニーを選択した。そこから、配列決定のために陽性クローンのプラスミドを単離した。配列決定の結果、アラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲがベクターｐＸＺ−Ａ１９に挿入されていたことが示されたので、プラスミドが正確に構築されたことが立証された。得られた組み換えプラスミドをｐＸＺ−Ａ２１と命名した（図４）。

第６の工程では、ｐＸＺ−Ａ２１プラスミドＤＮＡをプライマーｍｇｓＡ−ｕｐ／ｍｇｓＡ−ｄｏｗｎ（配列番号３／配列番号４）を用いて増幅して、ＤＮＡ断片ＩＩを作製した。ＤＮＡ断片ＩＩは、以下の順序で連結されているメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの上流約４００塩基（配列番号１５の５’末端から数えて１番目〜５７０番目の位置のヌクレオチド配列）、ｌａｃＩ遺伝子、ｔｒｃプロモータ、アラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲ、及びメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの下流約４００塩基（配列番号１５の５’末端から数えて９２５番目〜１，４３５番目の位置のヌクレオチド配列）からなっていた。ＤＮＡ断片ＩＩを第２の相同組み換えに付した。先ず、塩化カルシウムを用いた形質転換によってｐＫＤ４６プラスミドをＸＺ−Ａ２７に形質転換した。次いで、ＤＮＡ断片ＩＩに電気ショックを与え、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＸＺ−Ａ２７に形質転換した。

電気ショックによる形質転換は、以下の条件を含んでいた。先ず、電気的に形質転換されたｐＫＤ４６プラスミドを有するＸＺ−Ａ２７のコンピーテントセルを調製し、前記コンピーテントセル５０μＬを氷上で放置し、それにＤＮＡ断片ＩＩ ５０ｎｇを添加し、次いで、混合物を氷上で２分間放置し、０．２ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄキュベットに移した。電圧（電気ショックパラメータ）２．５ｋＶのＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）エレクトロポレーション装置を用いた。ＬＢ培地１ｍＬを前記キュベットに移した直後、電気ショックを与え、５回ピペッティングし、試験管に移し、７５ｒｐｍ、３０℃で４時間インキュベートした。１０％（質量％）スクロースを含むが塩化ナトリウムは含まないＬＢ液体培地に細菌溶液を移し（２５０ｍＬのフラスコに５０ｍＬの培地）、２４時間培養し、次いで、６％（質量％）スクロースを含むが塩化ナトリウムは含まないＬＢ固体培地で画線培養した。（プライマーｍｇｓＡ−ｕｐ／ｍｇｓＡ−ｄｏｗｎ（配列番号３／配列番号４）を用いて）ＰＣＲ増幅によって検証したところ、正確なコロニーの増幅産物は、４，２１０ｂｐであった。１つの正確なシングルコロニーを選択し、ＸＺ−Ａ２８と命名した。ＸＺ−Ａ２８では、相同組み換えを介して染色体上のｃａｔ−ｓａｃＢ ＤＮＡ断片がｌａｃＩ遺伝子、ｔｒｃプロモータ、及びアラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲに置き換わっていた。

（ｂ）アラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲの調節
アラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲの調節を以下の２つの工程で実施した。
第１の工程では、組み換え大腸菌株Ｍ１−９３のゲノムＤＮＡ（Ｌｕ Ｊ，Ｔａｎｇ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｘ． Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌＰ ａｎｄ ｇｌｋ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，９３：２４５５−２４６２、安徽華恒生物工程有限公司から入手可能）を、プライマーｍｇｓＡ−ｕｐ−ＦＲＴ／ｍｇｓＡ−ａｌａＲ−ＦＲＴ−ｄｏｗｎを用いて増幅して、ａｌａＲ遺伝子の発現調節において用いられるＤＮＡ断片ＩＩＩ（配列表の配列番号１６によって示す配列を有する）を作製した。プライマー配列は、以下の通りであった：
ｍｇｓＡ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＧＡＣＴＣＧＣＡＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴＧＣ ＧＣＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ （配列番号１１）；
ｍｇｓＡ−ａｌａＲ−ＦＲＴ−ｄｏｗｎ：ＧＡＣＡＡＧＴＣＡＡＴＴＴＣＣＧＣＣＣＡＣＧＴＡＴＣＴＣＴＧＴＡＡＡＡＡＧＧ ＴＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ （配列番号１２）。

第２の工程では、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＸＺ−Ａ２８にＤＮＡ断片ＩＩＩを電気的に形質転換した。

電気的形質転換は、以下の条件を含んでいた。先ず、電気的に形質転換されたｐＫＤ４６プラスミドを有する大腸菌ＸＺ−Ａ２８のコンピーテントセルを調製し、前記コンピーテントセル５０μＬを氷上で放置し、それにＤＮＡ断片ＩＩＩ ５０ｎｇを添加し、次いで、混合物を氷上で２分間放置し、０．２ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄキュベットに移した。電圧（電気ショックパラメータ）２．５ｋＶのＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）エレクトロポレーション装置を用いた。ＬＢ培地１ｍＬを前記キュベットに移した直後、電気ショックを与え、５回ピペッティングし、試験管に移し、７５ｒｐｍ、３０℃で２時間インキュベートした。細菌溶液２００μＬをカナマイシン含有ＬＢプレート（最終濃度１５μｇ／ｍＬ）上に広げ、３７℃で一晩培養し、次いで、（プライマーｍｇｓＡ−ｕｐ−ＦＲＴ／ａｌａＲ−ＦＲＴ−ｃｅｘｕ（配列番号１１／配列番号１３）を用いて）ＰＣＲ増幅によって検証するために５つのシングルコロニーを選択した。プライマー配列は、以下の通りであった：
ａｌａＲ−ＦＲＴ−ｃｅｘｕ：ＧＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣ（配列番号１３）。

正確なコロニーの増幅産物は、１，８９０ｂｐであった。１つの正確なシングルコロニーを選択し、大腸菌ＸＺ−Ａ３０株と命名した。前記株では、人工調節エレメントＭ１−９３（配列番号１７）によってアラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲが調節されていた。

大腸菌ＸＺ−Ａ３０株は、２０１２年１０月１２日に、アクセッション番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．６６６７で中国科学院微生物研究所の中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託された。この株は、発酵によって高濃度のＤＬ−アラニンを生産することができ、更に、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンとの光学純度の比が５０：５０であった。

特に指定しない限り、上記ＸＺ−Ａ３０株の構築において用いられる材料、試薬等は、それぞれ市販されている。用いたプラスミド（図２、３、及び４に示す）及びその構築方法を表１に示す。

表１：本発明のＤＬ−アラニン遺伝子操作細菌の構築において用いたプラスミド

実施例２． ＸＺ−Ａ３０株を用いる嫌気性発酵によるＤＬ−アラニンの生産
シード培地及び発酵培地は、それぞれ、以下を含んでいた：グルコース、１２０ｇ／Ｌ；塩化アンモニウム、４ｇ／Ｌ；ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ；及び微量無機塩類、４ｍＬ／Ｌ。前記培地のｐＨは、６．５であった。前記微量無機塩類は、１．５ｍｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＺｎＣｌ_２、０．１ｍｇのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、及び０．２ｍｇのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２を含んでいた。これらを蒸留水で希釈して体積を１Ｌにし、滅菌のために濾過した。

シード培地１５０ｍＬを２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、冷却し、得られた培地中において培養温度３０℃で１８時間、振盪機の回転速度５０ｒ／分（５０回転／分）でＸＺ−Ａ３０を培養し、次いで、発酵培地の接種において用いた。

体積２．４Ｌの発酵培地を３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。接種した量は、０．１％（Ｖ／Ｖ）であり、発酵温度は３０℃であり、撹拌の回転速度は１００ｒｐｍ（１００回転／分）であった。発酵中、アンモニア液によってｐＨを６．５に制御した。発酵は、４８時間続けた。

分析方法：発酵ブロスの成分は、高速液体クロマトグラフィーＡｇｉｌｅｎｔ−１２００を用いて測定し、ＤＬ−アラニンの定量及びキラル性測定は、リガンド交換キラル異性体液体クロマトグラフィーカラム（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＭＡ（＋））（Ｄａｃｉｅｌ製）を用いて実施し、前記発酵ブロス中の残りのグルコース及び様々な酸は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ炭水化物分析カラム（Ｂｉｏｒａｄ製）を用いて測定した。

結果：発酵ブロス中のＤＬ−アラニン及び有機酸の含量：ＤＬ−アラニンの濃度は、１１４．６ｇ／Ｌであった。そのうち、Ｄ−アラニンは、５７．３ｇ／Ｌであり、Ｌ−アラニンは、５７．３ｇ／Ｌであり、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンとの光学純度の比は、５０：５０であった（図５に示す通り）。乳酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、酢酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、エタノールの含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、コハク酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であった。

実施例３． ＸＺ−Ａ３０株を用いる嫌気性発酵によるＤＬ−アラニンの生産
シード培地及び発酵培地は、それぞれ、以下を含んでいた：グルコース、１２０ｇ／Ｌ；塩化アンモニウム、４ｇ／Ｌ；ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ；及び微量無機塩類、４ｍＬ／Ｌ。前記培地のｐＨは、６．５であった。前記微量無機塩類は、１．５ｍｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＺｎＣｌ_２、０．１ｍｇのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、及び０．２ｍｇのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２を含んでいた。これらを蒸留水で希釈して体積を１Ｌにし、滅菌のために濾過した。

シード培地１５０ｍＬを２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、冷却し、得られた培地中において、培養温度３０℃で１８時間、振盪機の回転速度５０ｒ／分（５０回転／分）でＸＺ−Ａ３０を培養し、次いで、発酵培地の接種において用いた。

体積２．４Ｌの発酵培地を３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。接種した量は、０．１％（Ｖ／Ｖ）であり、発酵温度は４２℃であり、撹拌の回転速度は１００ｒｐｍ（１００回転／分）であった。発酵中、アンモニア液によってｐＨを７．５に制御した。発酵は、６０時間続けた。

結果：発酵ブロス中のＤＬ−アラニン及び有機酸の含量：ＤＬ−アラニンの濃度は、８３．２ｇ／Ｌであった。そのうち、Ｄ−アラニンは、４１．６ｇ／Ｌであり、Ｌ−アラニンは、４１．６ｇ／Ｌであり、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンとの光学純度の比は、５０：５０であった。乳酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、酢酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、エタノールの含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、コハク酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であった。

実施例４． ＸＺ−Ａ３０株を用いる好気性発酵によるＤＬ−アラニンの生産
シード培地及び発酵培地は、それぞれ、以下を含んでいた：グルコース、１２０ｇ／Ｌ；塩化アンモニウム、４ｇ／Ｌ；ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ；及び微量無機塩類、４ｍＬ／Ｌ。前記培地のｐＨは、６．５であった。前記微量無機塩類は、１．５ｍｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＺｎＣｌ_２、０．１ｍｇのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、及び０．２ｍｇのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２を含んでいた。これらを蒸留水で希釈して体積を１Ｌにし、滅菌のために濾過した。

シード培地１５０ｍＬを２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、冷却し、得られた培地中において、培養温度３０℃で１８時間、振盪機の回転速度５０ｒ／分（５０回転／分）でＸＺ−Ａ３０を培養し、次いで、発酵培地の接種において用いた。

体積２．４Ｌの発酵培地を３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。接種した量は、０．１％（Ｖ／Ｖ）であり、発酵温度は３０℃であり、撹拌の回転速度は１００ｒｐｍ（１００回転／分）であり、０．１Ｌ／分・Ｌで通気（空気）を行った。発酵中、アンモニア液によってｐＨを６．５に制御した。発酵は、４０時間続けた。

結果：発酵ブロス中のＤＬ−アラニン及び有機酸の含量：ＤＬ−アラニンの濃度は、１１０．８ｇ／Ｌであった。そのうち、Ｄ−アラニンは、５５．４ｇ／Ｌであり、Ｌ−アラニンは、５５．４ｇ／Ｌであり、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンとの光学純度の比は、５０：５０であった。乳酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、酢酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、エタノールの含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、コハク酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であった。

実施例５． ＸＺ−Ａ３０株を用いる好気性発酵によるＤＬ−アラニンの生産
シード培地及び発酵培地は、それぞれ、以下を含んでいた：グルコース、１２０ｇ／Ｌ；塩化アンモニウム、４ｇ／Ｌ；ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ；及び微量無機塩類、４ｍＬ／Ｌ。前記培地のｐＨは、６．５であった。前記微量無機塩類は、１．５ｍｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＺｎＣｌ_２、０．１ｍｇのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、及び０．２ｍｇのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２を含んでいた。これらを蒸留水で希釈して体積を１Ｌにし、滅菌のために濾過した。

シード培地１５０ｍＬを２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、冷却し、得られた培地中において、培養温度３０℃で１８時間、振盪機の回転速度５０ｒ／分（５０回転／分）でＸＺ−Ａ３０を培養し、次いで、発酵培地の接種において用いた。

体積２．４Ｌの発酵培地を３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。接種した量は、０．１％（Ｖ／Ｖ）であり、発酵温度は４２℃であり、撹拌の回転速度は１００ｒｐｍ（１００回転／分）であり、０．１Ｌ／分・Ｌで通気（空気）を行った。発酵中、アンモニア液によってｐＨを７．５に制御した。発酵は、５４時間続けた。

結果：発酵ブロス中のＤＬ−アラニン及び有機酸の含量：ＤＬ−アラニンの濃度は、８０．４ｇ／Ｌであった。そのうち、Ｄ−アラニンは、４０．２ｇ／Ｌであり、Ｌ−アラニンは、４０．２ｇ／Ｌであり、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンとの光学純度の比は、５０：５０であった。乳酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、酢酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、エタノールの含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であり、コハク酸の含量は、０．１ｇ／Ｌ未満であった。

本発明の遺伝子操作細菌を用いてＤＬ−アラニンを生産する方法は、簡略であり、初期段階でグルコース等の原材料多糖類及び無機塩類を発酵槽に添加し、少量の前記遺伝子操作細菌を発酵物に接種し、ＤＬ−アラニンを生産させるだけでよい。本願では、嫌気性培養条件下で発酵を実施することが好ましかった。前記条件下では、ＤＬ−アラニンの発酵により、最高１１４．６ｇ／Ｌの収量を得ることができ、ＤＬ−アラニンの収量が増加し、エネルギー消費が減少した。更に、発酵中に抗生物質を添加しないので、生産物の品質を改善すると同時に原材料のコストを節減することができた。

Claims (13)

1. 元の細菌の染色体における乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酢酸キナーゼ遺伝子、フマル酸レダクターゼ遺伝子、アラニンラセマーゼ遺伝子、及びメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子をそれぞれ不活化し、前記染色体に外因性Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子及び外因性アラニンラセマーゼ遺伝子を組み込み、次いで、スクリーニングすることによって得られることを特徴とするＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌。
2. 元の細菌が、大腸菌であり、不活化の方法が、ノックアウト、挿入突然変異、又はスモールＲＮＡを用いて遺伝子の発現に干渉することを含む請求項１に記載の遺伝子操作細菌。
3. 外因性Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来し、外因性アラニンラセマーゼ遺伝子が、枯草菌に由来する請求項１から２のいずれかに記載の遺伝子操作細菌。
4. 外因性アラニンラセマーゼ遺伝子が、枯草菌１６８に由来する請求項３に記載の遺伝子操作細菌。
5. ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌を構築する方法が、元の菌株として機能する大腸菌ＸＺ−Ａ２６ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０３６の染色体のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子座に外因性アラニンラセマーゼ遺伝子を組み込み、人工調節エレメントＭ１−９３を用いて前記外因性アラニンラセマーゼ遺伝子の発現を調節することを含み、前記外因性アラニンラセマーゼ遺伝子が、配列表の配列番号１４に記載の配列を有し、前記メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子が、配列表の配列番号１５の５’末端から数えて４９５番目〜９５３番目の位置のヌクレオチドの配列を有し、前記人工調節エレメントＭ１−９３が、配列表の配列番号１７に記載の配列を有する請求項４に記載の遺伝子操作細菌。
6. 下記工程に従って構築される請求項５に記載の遺伝子操作細菌：
   １）下記順序でタンデムに連結されているメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの上流断片、クロラムフェニコール遺伝子、レバンスクラーゼ遺伝子、及び前記メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの下流断片からなるＤＮＡ断片Ｉを構築し、前記ＤＮＡ断片Ｉに電気ショックを与え、ｐＫＤ４６プラスミドを有する大腸菌ＸＺ−Ａ２６ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０３６に形質転換し、配列番号３に記載の配列を有するＤＮＡ断片及び配列番号４に記載の配列を有するＤＮＡ断片からなる一対のプライマーを用いて同定されたクロラムフェニコール耐性コロニーをスクリーニングして、４，１１１ｂｐの増幅産物を含む菌株（ＸＺ−Ａ２７と命名）を得る工程であって；前記ＤＮＡ断片Ｉが、配列番号３及び配列番号４に記載のプライマー対を用いてテンプレートとして機能する大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のゲノム遺伝子を増幅して、前記メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡ、並びにその上流断片及び下流断片を得、次いで、前記増幅産物をｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクターにクローニングして、カナマイシン耐性プラスミドｐＸＺ−Ａ１９を得；配列番号５及び配列番号６に記載のＤＮＡ断片をプライマーとして用いて前記ｐＸＺ−Ａ１９を増幅して生成物を得、前記生成物を、前記クロラムフェニコール遺伝子及び前記レバンスクラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片と連結してプラスミドｐＸＺ−Ａ２０を得、次いで、配列番号３及び配列番号４に記載のＤＮＡ断片をプライマーとして用い、前記ｐＸＺ−Ａ２０のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いて前記ＤＮＡ断片Ｉを増幅させる方法によって得られ；前記クロラムフェニコール遺伝子及び前記レバンスクラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が、配列番号７及び配列番号８に記載のプライマー対を用い、ｐＬＯＩ４１６２プラスミドをテンプレートとして増幅することによって得られるＤＮＡ断片である工程と；
   ２）下記順序でタンデムに連結されている前記メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの上流アーム、ｌａｃＩ遺伝子、ｔｒｃプロモータ、枯草菌１６８のアラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲ、及び前記メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの下流アームからなるＤＮＡ断片ＩＩを構築し、前記ＤＮＡ断片ＩＩに電気ショックを与えて、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＸＺ−Ａ２７に形質転換し、スクロースを含有するが塩化ナトリウムは含有しないＬＢ培地で培養し、配列番号３に記載の配列を有するＤＮＡ断片及び配列番号４に記載の配列を有するＤＮＡ断片からなるプライマー対を用いて同定された４，２１０ｂｐの増幅産物を有する菌株をスクリーニングし、前記菌株をＸＺ−Ａ２８と命名する工程であって；前記ＤＮＡ断片ＩＩが、配列番号１及び配列番号２に記載のプライマーを用いて枯草菌１６８のゲノムＤＮＡを増幅して前記アラニンラセマーゼ遺伝子の断片を得、次いで、前記断片をｐＴｒｃ９９ＡプラスミドのＸｂａＩ制限酵素部位とＳａｌＩ制限酵素部位との間に挿入してプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ａｌａＲを得、配列番号５及び配列番号６に記載のＤＮＡ断片をプライマーとして用い、ｐＸＺ−Ａ１９をテンプレートとして増幅した生成物と、前記ｌａｃＩ遺伝子、前記ｔｒｃプロモータ、並びに配列番号９及び配列番号１０に記載のプライマー対などの増幅配列を用いてプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ａｌａＲから増幅したアラニンラセマーゼ遺伝子ａｌａＲとを連結してプラスミドｐＸＺ−Ａ２１を得、次いで、配列番号３及び配列番号４に記載のＤＮＡ断片をプライマーとして用いて前記ｐＸＺ−Ａ２１のプラスミドＤＮＡを増幅して前記ＤＮＡ断片ＩＩを得る方法によって得られる工程と；
   ３）ＤＮＡ断片ＩＩＩを構築し、前記ＤＮＡ断片ＩＩＩに電気ショックを与えて、前記ｐＫＤ４６を有するＸＺ−Ａ２８に形質転換し、配列番号１１の配列を有するＤＮＡ断片及び配列番号１３の配列を有するＤＮＡ断片からなる一対のプライマーで同定して、１，８９０ｂｐの増幅産物を含む菌株、即ち、ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌を得る工程であって、前記ＤＮＡ断片ＩＩＩが、配列表の配列番号１６に記載の配列を有する工程。
7. ＤＬ−アラニン生産遺伝子操作細菌が、アクセッション番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．６６６７で中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている大腸菌ＸＺ−Ａ３０である請求項６に記載の遺伝子操作細菌。
8. ＤＬ−アラニンの生産における請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子操作細菌の使用。
9. 嫌気性又は好気性の培養条件下で、培養温度３０℃〜４２℃、ｐＨ６．５〜７．５にて請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子操作細菌を発酵及び培養する工程と、ＤＬ−アラニンを分離及び抽出する工程とを含むことを特徴とするＤＬ−アラニンを生産する方法。
10. 発酵及び培養用の培地が、原材料多糖類、窒素源、及び微量無機塩類からなり、前記原材料多糖類が、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、リグノセルロース、又はこれらの加水分解物及びシロップのうちの１つ又は２つ以上の任意の組み合わせから選択され、前記窒素源が、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びリン酸アンモニウムのうちの１つ又は２つ以上の任意の組み合わせから選択される窒素含有化合物であり、前記微量無機塩類が、可溶性の鉄塩、コバルト塩、銅塩、亜鉛塩、マンガン塩、及びモリブデン酸塩のうちの１つ又は２つ以上の任意の組み合わせから選択される請求項９に記載の方法。
11. 培地が、好ましくは、グルコース、１２０ｇ／Ｌ；塩化アンモニウム、４ｇ／Ｌ；ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ；及び微量無機塩類、４ｍＬ／Ｌからなり、前記微量無機塩類が、１．５ｍｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｍｇのＺｎＣｌ_２、０．１ｍｇのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、及び０．２ｍｇのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ_２を含み、これらを蒸留水で希釈して体積を１Ｌにし、滅菌のために濾過する請求項１０に記載の方法。
12. 発酵及び培養を４０時間〜６０時間続ける請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
13. 発酵及び培養の前に、遺伝子操作細菌を１８時間、温度３０℃及び振盪機の回転速度５０回転／分でシード培養する工程を更に含む請求項１２に記載の方法。