JP2016504337A - イオン交換クロマトグラフィーを使用して高マンノースグリコフォームのレベルを制御する方法 - Google Patents

Abstract

クロマトグラフィーベースのイオン交換を使用して、抗体サンプルなどの糖タンパク質サンプル中の高マンノースグリコフォームのレベルを調節する方法が提供される。高マンノースグリコフォームは、サンプルから除去または単離して濃縮し得る。抗体などの糖タンパク質を含んでなる組成物もまた提供され、イオン交換ベースのクロマトグラフィーステップを使用して、そこから高マンノースグリコフォームが低下または除去または単離または濃縮される。【選択図】なし

Description

細胞内で合成されたポリペプチドは、翻訳後修飾されることが多い。小胞体（ＥＲ）を標的とするポリペプチドの大部分は、グリコシル化され、すなわち、グリコシル化として知られている過程において、糖残基（またはオリゴ糖）が、ポリペプチドに酵素的に添加される。グリコシル化ポリペプチドはまた、糖タンパク質とも称される。真核生物細胞中では、（１４Ｎ−アセチル−グルコサミン、マンノース、およびグルコース残基を含んでなる）特定オリゴ糖が、ＥＲ管腔内のポリペプチドのアルギニン残基に付着する。オリゴ糖は、常に、アルギニン残基の側鎖上のＮＨ_２基に移転されるので、このオリゴ糖は、Ｎ結合またはアスパラギン結合オリゴ糖と称される。Ｎ結合オリゴ糖は、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン配列内に存在するアスパラギン残基に付加され、式中、Ｘは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸である。したがってこれらの２つの配列（Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ）は、Ｎ結合グリコシル化のシグナルとして機能する。さらに、ゴルジ装置内の一連のグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、ポリペプチド中のセリンまたはスレオニンアミノ酸のヒドロキシル側鎖（ＯＨ）に糖残基を付加し得て、この過程は、Ｏ結合グリコシル化として知られている。

Ｎ結合オリゴ糖の付加に続いて、ＥＲとゴルジ装置の双方に、糖残基のさらなる修飾が存在してもよい。ＥＲ中では、グルコース残基は、特定のマンノース残基と共に、オリゴ糖から裁断されてもよい。ゴルジ装置内では、多様な酵素が作用して、マンノース残基を除去し、および／またはＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、およびシアル酸をはじめとする、その他の糖残基を付加する。複合型オリゴ糖および高マンノースオリゴ糖のＮ結合オリゴ糖の２つの大まかなクラスが、成熟糖タンパク質に見られる。高マンノースオリゴ糖には、典型的に、ゴルジ装置内で新たな糖が添加されない。これらは、２つのＮ−アセチルグルコサミンと、往々にしてＥＲ内でポリペプチドに付着するオリゴ糖前駆体中に元来存在する数（９）に達する、複数のマンノース残基とを含有する。他方では、複合型オリゴ糖は、元の２つを超えるＮ−アセチルグルコサミン、ならびに変動する数のガラクトースおよびシアル酸残基および場合によってはフコースを含有し得る。シアル酸残基は、正味の負電荷を有する唯一の糖タンパク質の糖残基であることで、ユニークである。

ポリペプチドのグリコシル化は、それらの特性と機能に影響を及ぼし得る。例えば抗体分子のグリコシル化は、抗原上の補体活性化、身体からのクリアランス、および効力などの重要な免疫系機能に影響を及ぼし得る。ＩｇＧ分子中では、補体活性化の第１の成分であるＣ１ｑの結合部位は、Ｆｃ領域内のＣ_Ｈ２領域に局在化する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ．２，１１９−１２４）。抗体上の高マンノース５などの高マンノースオリゴ糖の存在は、通常は身体からのより迅速なクリアランスをもたらして、その効力を低下させる（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６０，３３９３−３４０２）。高レベルの高マンノース５グリコフォームは、クリアランス、免疫原性、および効能に対するこれらのグリコフォームの影響のために、治療用抗体に関わる懸念であり得る（Ｐａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１０８（１０）：２３４８−５８）。他方、その他の研究は、グリコシル化阻害剤の存在下で生成された高マンノース抗体が、より大きなＡＤＣＣ活性とより大きなＦｃγＲＩＩＩａ親和性とを有することを示した（Ｐａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１０８（１０）：２３４８−５８）。

抗体分子のグリコシル化は、典型的に、その中で抗体分子が培養される宿主細胞と、抗体型とをはじめとする、細胞培養条件に左右される（Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．（２００３）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．４，４４−５３）。治療的抗体の生産中に高マンノース５グリコフォームのレベルを制御する現在の努力は、精製工程でなく細胞培養工程を操作することを対象とする（Ｐａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１０８（１０）：２３４８−５８）。抗体のグリコフォームレベルは、典型的に、下流精製工程条件によって影響を受ける。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ．２，１１９−１２４ Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６０，３３９３−３４０２ Ｐａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１０８（１０）：２３４８−５８ Ｐａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１０８（１０）：２３４８−５８ Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．（２００３）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．４，４４−５３ Ｐａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１０８（１０）：２３４８−５８

治療用抗体中の不純物としての高マンノースグリコフォームの存在は、安全性または効力に影響を及ぼすこともある。しかしその中で、治療用抗体が、免疫系の治療薬に対する抗体産生を引き起こすことが計画的に意図される場合は、一貫してより大量の潜在的により高免疫原性の高マンノースグリコフォームが、好ましいこともある。したがって治療用抗体の生産中に、高マンノース５グリコフォームのレベルを制御して、製品品質（安全性および効能）を保証することに対する必要性が存在する。

本発明は、生産される治療用抗体の特定の要求に応じて、高マンノースグリコフォームレベルが制御されている治療用抗体を得るために使用してもよい、プロセスストラテジーを説明する。

本開示は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、抗体サンプルなどの糖タンパク質サンプル中の高マンノースグリコフォームの量を低下させる方法を提供する。これらの方法を使用して、非常に低レベルの高マンノースグリコフォームを有する糖タンパク質組成物を生産し得る。したがって別の態様は、モノクローナル抗体などの糖タンパク質を含んでなる組成物を対象とし、糖タンパク質は、少なくとも２つのＮ結合オリゴ糖を含んでなり、組成物中の糖タンパク質の２％未満が、高マンノースグリコフォームである。

本発明は、糖タンパク質の高マンノースグリコフォームと、少なくとも１つのその他のグリコフォームとを含んでなるサンプル中で、糖タンパク質中の高マンノースグリコフォームの量を低下させる方法を開示する。方法は、イオン交換カラム上の糖タンパク質保持を可能にする条件下において、サンプルをイオン交換カラム上に装入するステップと；イオン交換カラムに溶出緩衝液を通過させ、イオン交換カラムから糖タンパク質を溶出させるステップと；イオン交換カラムから溶出して、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含んでなる、第１の１つまたは複数の画分を収集するステップと；第１の１つまたは複数の画分の前または後にイオン交換カラムから溶出して、高マンノースグリコフォームを含有する、第２の１つまたは複数の画分を、第１の１つまたは複数の画分から除外するステップを含んでなり、第１の１つまたは複数の画分中の高マンノースグリコフォームの量が、イオン交換カラム上への装入前のサンプル中の高マンノースグリコフォームの量と比較して、低下される。

いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、特に、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、アルギニン塩などの塩化学種を含有する、少なくとも１つの緩衝液を含んでなってもよい。溶出緩衝液は、特に、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸ナトリウム、トリス、またはグリシンなどの少なくとも１つの緩衝液化学種を含んでなってもよい。溶出緩衝液は、塩化学種を含有する少なくとも１つの緩衝液と、緩衝液化学種からの少なくとも１つの緩衝液との組み合わせであってもよい。３．５と８．０の間のｐＨ条件の変動を使用して、高マンノースグリコフォーム分離を達成することもまた可能であり得る。

別の態様では、本開示は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、抗体サンプルなどの糖タンパク質サンプル中の高マンノースグリコフォームを単離または濃縮する方法を提供する。これらの方法を使用して、非常に高濃度の高マンノースグリコフォームを有する糖タンパク質組成物を生産し得る。したがって別の態様は、モノクローナル抗体などの糖タンパク質を含んでなる組成物を対象とし、糖タンパク質は少なくとも２つのＮ結合オリゴ糖含んでなり、組成物中の糖タンパク質の少なくとも５０％が高マンノースグリコフォームである。

本明細書に組み込まれてその一部を構成する添付図面は、特定の実施形態を図示し、書面による記述と一緒に、本明細書で開示される抗体および方法の特定の原理を説明するのに役立つ。

Ｎ結合グリコシル化部位が、Ｆｃ領域のＣ_Ｈ２ドメインと、Ｆａｂ領域のＶ_Ｈドメインの上にある、ｍＡｂ ７．１５９．２（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−７４２４）抗体の簡略化された物理的構造を示す。 ｍＡｂ ７．１５９．２抗体のＦｃおよびＦａｂ領域上に存在する、主要なオリゴ糖を示す。Ｍａｎ＝マンノース；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｆｕｃ＝フコース；Ｇａｌ＝ガラクトース；ＮＡＮＡ＝Ｎ−アセチルノイラミン酸、シアル酸としてもまた知られている；および２ＡＢ＝２−アミノベンズアミド（グリカン分析のための蛍光標識）。 段階溶出による、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上のｍＡｂ ７．１５９．２抗体の対照試行のクロマトグラムと、生成物中の高マンノース５グリコフォーム（「Ｍａｎ５」）の濃度を示す。 直線濃度勾配溶出試行からのｍＡｂ ７．１５９．２生成物を示し、高マンノース５グリコフォーム（「Ｍ５」）溶出は、勾配の後期画分にある。 対照Ａｂ１抗体（ＩｇＧ１）の直線濃度勾配溶出試行が、その他のグリコフォームからの高マンノース５グリコフォーム分離をもたらさないことを示す。 対照Ａｂ３抗体（ＩｇＧ２）の直線濃度勾配溶出試行が、その他のグリコフォームからの高マンノース５グリコフォーム分離をもたらさないことを示す。 ｍＡｂ ７．１５９．２抗体の直線濃度勾配溶出試行の異なる画分について、滞留時間および吸光度値を示す。異なる画分中で電荷の差が見られ、初期画分はより酸性であり、後期画分はより塩基性である。 ｍＡｂ ７．１５９．２直線濃度勾配溶出画分中に存在するグリコフォームの相対比を示し、より成熟したグリコフォーム（例えばシアル化グリコフォーム）は、初期画分中に溶出し、より未熟なグリコフォーム（例えば高マンノース５グリコフォーム）は後期画分中に溶出する。 カチオン交換クロマトグラフィー中のグリコフォーム除去傾向のグラフ表示のオーバーレイと共に、ｍＡｂ ７．１５９．２直線濃度勾配溶出画分中に存在するシアル酸（ＮＡＮＡ）の量を示す。 ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）カラムを通過するｍＡｂ ７．１５９．２試行に続く、高マンノース５グリコフォームの分配を示す。 Ｎｕｖｉａ（商標）Ｓ（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）カラムを通過するｍＡｂ ７．１５９．２試行に続く、高マンノース５グリコフォームの分離を示す。 Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｓ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）カラムを通過するｍＡｂ ７．１５９．２試行に続く、高マンノース５グリコフォームの分離を示す。 Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムを通過するｍＡｂ ７．１５９．２試行に続く、高マンノース５グリコフォームの分離を示す。

ここで、その例が添付図面で図示される様々な例示的な実施形態に、詳細に言及する。本発明の態様の特定の実施形態、特性、および詳細のより完全な理解を読者に与えるために、以下の詳細な説明が提供されるが、本発明の範囲の制限として解釈されるべきではないものと理解される。

１．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。本明細書の用語および定義に包含される追加的な定義および実施形態は、詳細な説明全体を通じて記載される。

本出願における用法では、「高マンノースグリコフォーム」という用語は、Ｎ結合オリゴ糖を有する抗体などの糖タンパク質を指し、Ｎ結合オリゴ糖は、５〜９個のマンノース単位を有する高マンノースグリカンである。

本出願における用法では、「高マンノース５グリコフォーム」という用語は、Ｎ結合オリゴ糖を有する抗体などの糖タンパク質を指し、Ｎ結合オリゴ糖は、５個のマンノース単位を有する高マンノースグリカンである。

本出願における用法では、「その他のグリコフォーム」という用語は、Ｎ結合オリゴ糖を有する抗体などの糖タンパク質を指し、Ｎ結合オリゴ糖は、５〜９個のマンノース単位を有する高マンノースグリカン以外のオリゴ糖である。

本出願における用法では、「マンノース５グリカン」という用語は、５マンノース単位を有するＮ結合オリゴ糖を指す。

本明細書および添付の特許請求範囲の用法では、文脈上例外が明記されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数指示対象を含むことに留意すべきである。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で同義的に使用され得る。

さらに本明細書で使用される「および／または」は、他方の有無にかかわらず、２つの指定された特徴または成分のそれぞれの特定の開示と見なされるべきである。したがって本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。

また本明細書で実施形態が、「含んでなる」という言葉を用いて記述される場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」によって記述される、その他の点では類似した実施形態もまた提供されるものと理解される。

２．糖タンパク質
本出願に記載される方法は、高マンノースグリコフォームを有するあらゆる糖タンパク質を使用して実施し得る。一実施形態では、糖タンパク質は治療用糖タンパク質であり、好ましくはヒトに投与されるものである。

これらの糖タンパク質としては、抗体、（インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、および顆粒球コロニー刺激因子をはじめとするが、これに限定されるものではない）サイトカイン、腫瘍壊死因子、形質転換成長因子β、インターロイキン２；（第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、およびヒトタンパク質Ｃをはじめとするが、これに限定されるものではない）凝固因子；エリスロポエチン、ＩＧＦ結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮成長因子−２、骨髄性原体阻害因子−１、およびオステオプロテゲリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、糖タンパク質は、ヒト糖タンパク質である。

特定の実施形態では、サンプル中の高マンノースグリコフォームまたはその他の複合型グリコフォームの量を検出または定量化することが望ましい。グリコフォームは、多様な従来のアッセイまたは検出法のいずれかを使用して、検出または定量化し得る。例えば所望のオリゴ糖と特異的に結合するレクチンまたは抗体を使用して、関心のある特定のグリコフォームを検出し得る。多種多様なオリゴ糖特異的レクチンが、市販される（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳａｎＭａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆ．）。代案としては、特定のＮ結合オリゴ糖に対する抗体が市販され、または標準的な技術を使用して生成されてもよい。適切なレクチンまたは抗体を、発色団；フルオロフォア；放射性同位体；または発色性基質を有する酵素などのレポーター分子と共役させて、分光光度法、蛍光定量法、蛍光活性化細胞分類、またはシンチレーション測定などの標準的スクリーニング技術を使用した検出を容易にしてもよい。代案としては、単離されたＮ結合オリゴ糖の分析が望ましいことがある。このような場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼなどの酵素を使用して、Ｎ結合オリゴ糖を糖タンパク質から切断してもよい。次に単離されたＮ結合オリゴ糖を、液体クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）、質量分光分析、またはその他の適切な手段によって分析してもよい。

３．抗体
特定の実施形態では、本出願に記載される方法を使用して、抗体サンプル中の高マンノースグリコフォームを除去し、または量を富化する。免疫グロブリンとしてもまた知られている抗体は、典型的に、それぞれおよそ２５ｋＤａの２本の軽（Ｌ）鎖と、それぞれおよそ５０ｋＤａの２本の重（Ｌ）鎖から構成される、四量体グリコシル化タンパク質である。λおよびκと称される２タイプの軽鎖が、抗体中に見られてもよい。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンをＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭの５つの主要クラスに割り当て得て、これらのいくつかは、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分割されてもよい。各軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）領域（ＶＬ）および定常（ｃ）領域（ＣＬ）を含む。各重鎖は、１つのＮ末端Ｖ領域（ＶＨ）、３または４つのＣ領域（ＣＨ）、およびヒンジ領域を含む。ＶＨの最も近位にあるＣＨ領域は、ＣＨ１と命名される。ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）の３つの領域のためのスキャフォールドを形成する、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と称される、比較的保存された配列の４つの領域からなる。ＣＤＲは、抗原と抗体の特異的相互作用に関与する残基の大部分を含有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される。したがって重鎖上のＣＤＲ構成物がＨ１、Ｈ２、およびＨ３と称される一方で、軽鎖上のＣＤＲ構成物はＬ１、Ｌ２、およびＬ３と称される。フレームワークおよびＣＤＲ残基の同定および番号付けは、その内容全体を参照によって援用する、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９８，２７８：４５７−７９によって記載されるようである。

「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、ヒト、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、グラフト、および試験管内作製抗体を含むが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、モノクローナル抗体はヒト抗体である。

抗体の三次元構造は、パパインをはじめとするタンパク質分解酵素の使用を通じて解明された。パパインによる制限消化は、抗体を３つの断片に切断する。断片の２つは同一であり、抗原結合部位を含有する。これらの断片は、断片抗原結合（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）を略して、Ｆａｂ断片と称される。３つ目の断片は抗原結合作用を有せず、容易に結晶化する。これは、結晶性断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）を略して、Ｆｃ断片と称される。２つの同一Ｆａｂ断片は、典型的に、完全な軽鎖と、重鎖Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１領域とを含有する抗体アームに相当する。Ｆｃ断片は、典型的に、重鎖Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域に相当する。

一実施形態では、抗体は、組換えモノクローナル抗体である。組換えモノクローナル抗体は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない、宿主細胞から調製される。好ましい実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。別の実施形態では、組換えモノクローナル抗体はヒト抗体である。さらに別の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ抗体である。好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＩｇＧ抗体である。

別の実施形態では、抗体は、抗体のＦｃ領域上の少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位と、抗体のＦａｂ領域上の少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位とを含んでなる。別の実施形態では、抗体は、抗体のＦｃ領域上の１つのＮ結合グリコシル化部位のみと、抗体のＦａｂ領域上の１つのＮ結合グリコシル化部位のみとを有する（すなわち合計３つのＮ結合グリコシル化部位）。

別の実施形態では、抗体は、その内容全体を参照によって援用する、米国特出願公開第２００７／０１９６３７６号明細書で開示される抗体のように、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ Ｉ）に対する交差反応性をもって、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ ＩＩ）と結合する。特定の実施形態では、抗体はＩＧＦ Ｉとの交差反応性をもってＩＧＦ ＩＩと結合し、ｍＡｂ７．２５１．３（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−７４２２）、ｍＡｂ７．３４．１（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−７４２３）、およびｍＡｂ ７．１５９．２（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−７４２４）からなる群から選択される、モノクローナルヒト抗体である。

一実施形態では、抗体は、ＩＧＦ Ｉに対する交差反応性をもって、ＩＧＦ ＩＩと結合し、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドとを含んでなる、モノクローナルヒト抗体である。別の実施形態では、抗体は、ＩＧＦ Ｉに対する交差反応性をもってＩＧＦ ＩＩと結合し、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとを含んでなるモノクローナルヒト抗体であり、重鎖ポリペプチドは、「Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｓｅｒ」（配列番号７）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、「Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」（配列番号８）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および「Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｖａｌ」（配列番号９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含んでなり、軽鎖ポリペプチドは、「Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｈｉｓ」（配列番号１０）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、「Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ」（配列番号１１）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および「Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ」（配列番号１２）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる。

別の実施形態では、抗体は、ＩＧＦ Ｉに対する交差反応性をもって、ＩＧＦ ＩＩと結合し、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドとを含んでなる、モノクローナルヒト抗体である。別の実施形態では、抗体は、ＩＧＦ Ｉに対する交差反応性をもってＩＧＦ ＩＩと結合し、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとを含んでなるモノクローナルヒト抗体であり、重鎖ポリペプチドは、「Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｓｅｒ」（配列番号１３）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、「Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」（配列番号１４）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および「Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｖａｌ」（配列番号１５）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含んでなり、軽鎖ポリペプチドは、「Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｈｉｓ」（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、「Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ」（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および「Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ」（配列番号１８）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる。

なおも別の実施形態では、抗体は、ＩＧＦ Ｉに対する交差反応性をもって、ＩＧＦ ＩＩと結合し、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドと、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドとを含んでなる、モノクローナルヒト抗体である。別の実施形態では、抗体は、ＩＧＦ Ｉに対する交差反応性をもってＩＧＦ ＩＩと結合し、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとを含んでなるモノクローナルヒト抗体であり、重鎖ポリペプチドは、「Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ」（配列番号１９）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、「Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ」（配列番号２０）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および「Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｖａｌ」（配列番号２１）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含んでなり、軽鎖ポリペプチドは、「Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ」（配列番号２２）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、「Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ」（配列番号２３）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および「Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｖａｌ」（配列番号２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる。

治療用抗体中のより少ない量の高マンノースグリコフォームは、より良い効能をもたらす、より低い免疫原性をもたらしてもよい。これは治療用抗体に対する、より少ない自己抗体の生成によって引き起こされてもよい。そして特定抗原中和またはタンパク質置換を標的とする治療用抗体にとって好ましく、より良い投薬をもたらす。しかし免疫系の抗体産生を引き起こす治療用抗体では、より大量の高マンノースグリコフォームが好ましいこともある。

より低い高マンノースレベルを有する治療用抗体は、より長い半減期を有して、より効果的であってもよい。免疫系の抗体産生を引き起こす治療用抗体中の高マンノースグリコフォームレベルは、より強力であってもよい。

４．イオン交換クロマトグラフィー
本発明の方法は、イオン交換クロマトグラフィーに適用できる。

イオン交換クロマトグラフィーは、関心のある溶質が、混合物中の溶質不純物または汚染物質よりも強くまたは弱く、荷電化合物と非特異的に相互作用するように、関心のあるイオン化可能溶質（例えば混合物中の対象タンパク質）が、適切なｐＨおよび導電率の条件下で、（例えば共有結合によって）固相イオン交換材に結合する逆帯電したリガンドと相互作用する、クロマトグラフィー処理を指す。混合物中の汚染溶質は、関心のある溶質よりも迅速にまたは緩慢に、イオン交換材のカラムから洗浄され得て、または媒体と結合し、またはそれから排除される。イオン交換クロマトグラフィーとしては、具体的には、カチオン交換、アニオン交換、および混合様式クロマトグラフィーが挙げられる。

カチオン交換媒体は、負に帯電して、その上またはその中を通過する水溶液中のカチオンと交換するための遊離カチオンを有する、固相を指す。例えば、下述されるカルボキシレート、スルホネートなどの、カチオン交換媒体を形成するのに適した固相に付着する、あらゆる負に帯電したリガンドを使用し得る。市販のカチオン交換媒体としては、例えば、スルホネートベースのグループ（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓおよび３０Ｓ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０ＳおよびＳＰ−６５０Ｍ；ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ；Ｐａｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐｅｒ Ｄ５、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＭおよびＬＳ ＳＰ、およびＳｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＳＰ）；スルホエチルベースのグループ（例えば、ＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＥ；Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓ−およびＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓ−２０）；スルホプロピルベースのグループ（例えば、ＴｏｓｏｈからのＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ ５ＰＷおよびＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ；Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ−２０およびＨＳ−５０）；スルホイソブチルベースのグループ（例えばＥＭＤからの（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ．ｓｕｂ．３）；スルホキシエチルベースのグループ（例えばＷｈａｔｍａｎからのＳＥ５２、ＳＥ５３、およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ Ｓ）；カルボキシメチルベースのグループ（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＣＭ；ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐＣＭ；Ｐａｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＬＳ ＣＭ；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭａｔｒｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ５００およびＣ２００；ＷｈａｔｍａｎからのＣＭ５２、ＣＭ３２、ＣＭ２３、およびＥｘｐｒｅｓｓ Ｉｏｎ Ｃ；ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ−６５０Ｓ、ＣＭ−６５０Ｍ、およびＣＭ−６５０Ｃ）；スルホン酸およびカルボン酸ベースのグループ（例えばＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＢＡＫＥＲＢＯＮＤ Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｓｕｌｆｏｎ）；カルボン酸ベースのグループ（例えば、Ｊ．ＴＢａｋｅｒからのＷＰ ＣＢＸ；Ｄｏｗ Ｌｉｑｕｉｄ ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸＭＡＣ−３；Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ、およびＤｉａｉｏｎ Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ；およびＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ）；スルホン酸に基づくグループ（例えば、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＳＰ；Ｄｏｗ Ｌｉｑｕｉｄ ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ Ｓｔｒｏｎｇ Ａｃｉｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ；Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＵＮＯ ｓｐｈｅｒｅ ５、ＷＰ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓメンブレン；Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ、およびＤｉａｉｏｎ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）；およびオルトリン酸塩ベースのグループ（例えばＷｈａｔｍａｎからのＰ１１）を有するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。

アニオン交換媒体は、正に帯電して、その上またはその中を通過する水溶液中のアニオンを交換するための遊離ア二オンを有する固相を指す。アニオン交換媒体の官能基は、典型的に第三級または第四級アミノ基であり、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、第四級アミノエチル基、および第四級アンモニウム基が挙げられる。マトリックスとしては、アガロースビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンビーズ、およびその他のマトリックスが挙げられる。市販の（例えば現在はＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅであるＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからの）アニオン交換媒体の例としては、ＤＥＡＥ−セファロース、Ｑセファロースなどが挙げられる。その他の適切なアニオン交換クロマトグラフィー材料、ならびに本出願のためのこれらの材料の選択および使用は、当該技術分野で慣習的である。

混合様式媒体は、典型的に、イオン交換、水素結合、および疎水性相互作用などの複数の結合様式の組み合わせを含有する、固相材料を指す。市販の（例えばＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、およびＢｉｏ−Ｒａｄからの）混合様式媒体の例としては、ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ、およびＮｕｖｉａｃ Ｐｒｉｍｅが挙げられる。混合様式媒体が、それらのイオン交換特性のみを使用して操作される場合、それらはｍａｎ５グリコフォームの分離を達成することが期待できる。

いくつかの実施形態では、本発明のクロマトグラフィー法で使用される溶出緩衝液は、特に、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、アルギニンなどの塩化学種を含有する、少なくとも１つの緩衝液を含んでなってもよい。溶出緩衝液は、特に、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸ナトリウム、トリス、またはグリシンなどの少なくとも１つの緩衝液化学種を含んでなってもよい。溶出緩衝液は、塩化学種を含有する少なくとも１つの緩衝液と、緩衝液化学種からの少なくとも１つの緩衝液との組み合わせであってもよい。３．５と８．０の間のｐＨ条件の変動を使用して、高マンノースグリコフォーム分離を達成することもまた可能であり得る。

５．サンプルから高マンノースグリコフォームを除去する方法
本出願に記載される方法を使用して、糖タンパク質を含有するサンプルの高マンノースグリコフォームを低下させ、またはそれから除去し得る。一実施形態では、糖タンパク質は抗体である。

方法は、例えばモノクローナル抗体の生産における、最終精製ステップとして使用し得る。抗体は、典型的に、培養哺乳類宿主細胞を使用して、抗体の適切な折り畳みおよびグリコシル化を促進して生産される。近年、細胞培養技術において、細胞培養液と給餌ストラテジーの進歩をはじめとする顕著な改善がなされており、２ｇ／Ｌを上回る高い細胞培養物力価がもたらされている。細胞培養物力価は、２ｇ／Ｌを超え、３ｇ／Ｌを超え、４ｇ／Ｌを超え、５ｇ／Ｌを超え、またはそのあらゆる部分であってもよい。細胞培養液からの抗体の効率的な回収および精製は、抗体生産工程の重要な部分である。バルク培地から抗体を精製するための一般的技術は、複雑な細胞培養液から出発して、９５％を超える純度をもたらし得る、非常に選択的な工程である、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用する初期精製ステップを伴う。捕捉ステップ（例えばプロテインＡ）に続いて、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、溶脱プロテインＡ、内毒素、およびいくつかの細胞培養液添加剤、ならびにより高分子量の凝集体およびより低分子量の分解産物のような生成物関連不純物などのトレースレベルの工程関連汚染物質が、抗体と共に残留する。これらの汚染物質および不純物は、追加的なクロマトグラフィー技術を通じて除去し得て、これらはトレースレベルの汚染物質および不純物を治療的投与にとって安全と見なされるレベルに低下させることから、一般に最終精製ステップと称される。しかし出願人の発見に先だって、最終精製ステップが、モノクローナル抗体サンプル中に存在するその他のグリコフォームからの高マンノースグリコフォームを分離する手段と見なされ、または使用されたことはなかった。

したがって一実施形態は、糖タンパク質の高マンノースグリコフォームと、少なくとも１つのその他のグリコフォームとを含んでなる、サンプル中の糖タンパク質の高マンノースグリコフォームの量を低下させる方法であって、（ａ）イオン交換カラム上の糖タンパク質保持を可能にする条件下において、サンプルをイオン交換カラム上に装入するステップと；（ｂ）イオン交換カラムに溶出緩衝液を通過させ、イオン交換カラムから糖タンパク質を溶出させるステップと；（ｃ）イオン交換カラムから溶出して少なくとも１つのその他のグリコフォームを含んでなる、第１の１つまたは複数の画分を収集するステップと；および（ｄ）第１の１つまたは複数の画分から、第２の１つまたは複数の画分を除外するステップとを含んでなり、第２の１つまたは複数の画分が、第１の１つまたは複数の画分の前または後にイオン交換カラムから溶出して、高マンノースグリコフォームを含有し、第１の１つまたは複数の画分中の高マンノースグリコフォームの量が、イオン交換カラム上への装入前のサンプル中の高マンノースグリコフォームの量と比較して低下される、方法を対象とする。

一実施形態では、イオン交換カラムはカチオン交換カラムであり、高マンノースグリコフォームを含有する第２の１つまたは複数の画分が、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する第１の１つまたは複数の画分の後に、カチオン交換カラムから溶出する。

別の実施形態では、イオン交換カラムがアニオン交換カラムであり、高マンノースグリコフォームを含有する第２の１つまたは複数の画分が、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する第１の１つまたは複数の画分の前に、アニオン交換カラムから溶出する。

さらに別の実施形態では、方法は、第１の１つまたは複数の画分または第２の１つまたは複数の画分中の高マンノースグリコフォームの量を測定するステップをさらに含んでなる。別の実施形態では、方法は、サンプルを装入した後、溶出緩衝液をイオン交換カラムに通過させる前に、イオン交換カラムを洗浄するステップをさらに含んでなる。

一実施形態では、糖タンパク質は、上の「抗体」セクション、または本出願の他の箇所に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、抗体である。

別の実施形態では、第１の１つまたは複数の画分中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量は、モノクローナル抗体の総量の２％未満である。別の実施形態では、第１の１つまたは複数の画分中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量は、モノクローナル抗体の総量の１％未満である。さらに別の実施形態では、第１の１つまたは複数の画分中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量は、イオン交換カラムに装入する前のサンプル中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量と比較して、少なくとも１００、５０、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２倍低下する。

６．サンプルから高マンノースグリコフォームを単離する方法
本出願に記載される方法はまた、糖タンパク質を含有するサンプル中の高マンノースグリコフォームを単離または濃縮するのに使用し得る。一実施形態では、糖タンパク質は抗体である。

したがって一実施形態は、糖タンパク質の高マンノースグリコフォームと、少なくとも１つのその他のグリコフォームとを含んでなるサンプル中の糖タンパク質の高マンノースグリコフォームを単離する方法であって、（ａ）イオン交換カラム上の糖タンパク質保持を可能にする条件下において、サンプルをイオン交換カラム上に装入するステップと；（ｂ）イオン交換カラムに溶出緩衝液を通過させ、イオン交換カラムから糖タンパク質を溶出させるステップと；（ｃ）イオン交換カラムから溶出して、高マンノースグリコフォームを含有する、第１の１つまたは複数の画分を収集するステップと；および（ｄ）第１の１つまたは複数の画分から、第２の１つまたは複数の画分を除外するステップであって、それによってサンプル中の高マンノースグリコフォームを単離する、ステップとを含んでなり、第２の１つまたは複数の画分が、第１の１つまたは複数の画分の前または後にイオン交換カラムから溶出して、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する、方法を対象とする。

一実施形態では、イオン交換カラムはカチオン交換カラムであり、高マンノースグリコフォームを含有する第１の１つまたは複数の画分が、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する第２の１つまたは複数の画分の後に、カチオン交換カラムから溶出する。

別の実施形態では、イオン交換カラムがアニオン交換カラムであり、高マンノースグリコフォームを含有する第１の１つまたは複数の画分が、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する第２の１つまたは複数の画分の前に、アニオン交換カラムから溶出する。

さらに別の実施形態では、方法は、第１の１つまたは複数の画分または第２の１つまたは複数の画分中の高マンノースグリコフォームの量を測定するステップをさらに含んでなる。別の実施形態では、方法は、サンプルを装入した後、溶出緩衝液をイオン交換カラムに通過させる前に、イオン交換カラムを洗浄するステップをさらに含んでなる。

一実施形態では、糖タンパク質は、上の「抗体」セクション、または本出願の他の箇所に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、抗体である。

さらに別の実施形態では、第１の１つまたは複数の画分中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量は、イオン交換カラムに装入する前のサンプル中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または２００倍を超えて増大する。

７．組成物
本出願に記載される方法は、糖タンパク質サンプルからの高マンノースグリコフォームを低下させまたは除去して、非常に低いレベルの高マンノースグリコフォームを有する組成物をもたらす機序を提供する。

したがって別の態様は、モノクローナル抗体などの糖タンパク質を含んでなる組成物を対象とし、糖タンパク質は少なくとも２つのＮ結合オリゴ糖含んでなり、組成物中の糖タンパク質の２％未満が高マンノースグリコフォームである。一実施形態では、組成物中の糖タンパク質の１％未満は、高マンノースグリコフォームである。一実施形態では、糖タンパク質は、上の「抗体」セクション、または本出願の他の箇所に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、抗体である。

本出願に記載される方法はまた、糖タンパク質サンプルからの高マンノースグリコフォームを単離または濃縮して、非常に濃縮されたレベルの高マンノースグリコフォームを有する組成物をもたらす機序を提供する。

したがって別の態様は、モノクローナル抗体などの糖タンパク質を含んでなる組成物を対象として、糖タンパク質は、少なくとも２つのＮ結合オリゴ糖を含んでなり、組成物中の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の糖タンパク質は、高マンノースグリコフォームである。一実施形態では、糖タンパク質は、上の「抗体」セクション、または本出願の他の箇所に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、抗体である。

本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および公開された参考文献は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。本発明が、特に、その好ましい実施形態に言及して示され説明される一方で、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、その形態および詳細に様々な変更を加えてもよいことが、当業者によって理解される。

実施例１
ｍＡｂ ７．１５９．２（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−７４２４）は、２本の同一重鎖と２本の同一軽鎖から構成される、完全ヒトＩｇＧ２λモノクローナル抗体分子であり、総分子量はおよそ１５１ｋＤａである。吸光係数は１．５４（ｍｇ／ｍＬ） ^−１ｃｍ^−１であり、ｐＩは７．８〜８．８である。２つのＮ結合オリゴ糖グリコシル化部位があり、１つは残基Ａｓｎ−７３にあるＦａｂ領域の重鎖内、もう１つは残基Ａｓｎ−２９６のＦｃ領域内にある（図１）。双方の部位のオリゴ糖は、大部分が複合型である。細胞クローンおよびバイオリアクター条件次第で、ｍＡｂ ７．１５９．２の高マンノース５グリコフォームは、約３〜１１％で変動し得る（データ示さず）。Ｆｃ領域内のＣＨ_２領域上、およびＦａｂ領域のＶ_Ｈ領域上に存在するグリカンは、図２で示される。Ｆａｂ領域は、ＦｃおよびＦａｂ領域の双方に存在するその他のグリカンに加えて、本質的に酸性である成熟したシアル化グリカンの高い割合を有する。Ｆｃ領域は、高マンノース５グリコフォームなどの成熟度がより低いグリコフォームのより高い割合を有する。

ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）カチオン交換クロマトグラフィーを最終精製ステップとして使用して、ｍＡｂ ７．１５９．２精製工程において、工程および生成物関連不純物を除去した。クロマトグラフィー装入物および生成物の分析は、カラムが、抗体の凝集体および高マンノース５グリコフォーム（「Ｍ５」）の双方を、効果的に除去したことを示した（表１）。そのため高マンノース５グリコフォームの除去の背後にある機序をさらに理解するために、実験を実施した。

１．１ｃｍ×１７．３ｃｍ（直径×高さ）ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、下の表１Ｂに列挙するカラム条件下で、直線濃度勾配溶出（ＬＧＥ）試験を実施した。

ｍＡｂ ７．１５９．２およびその他のＩｇＧ抗体（対照Ａｂ１、対照Ａｂ２、および対照Ａｂ３）のＬＧＥ試験中、０．５ＣＶ画分を収集し、Ａ２８０ｎｍ、高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）およびオリゴ糖プロファイル分析を使用して分析し、画分全体にわたる単量体、凝集体、および高マンノース５グリコフォーム濃度の変化を測定した。対照試行として、装入物としてｍＡｂ ７．１５９．２を用いて、段階溶出試行を実施し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３９ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４を使用して、生成物を溶出した。

ｍＡｂ ７．１５９．２を使用して、分取規模サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施し、オリゴ糖分析によって凝集体および単量体を単離し特性分析した。ｍＡｂ ７．１５９．２ ＬＧＥ実験からの画分はまた、分析的イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）およびシアル酸アッセイを用いて分析した。

段階溶出を用いた対照試行からのＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）画分の分析は、ストリップ中の高マンノース５グリコフォームの濃度が、溶出中よりも約５倍大きいことを示し（図３）、ストリップ中に、高マンノース５グリコフォームが、除去されたことが示された。ＬＧＥ試行からのｍＡｂ ７．１５９．２画分のＨＰＳＥＣおよびオリゴ糖プロファイル分析は、高マンノース５グリコフォームが、勾配の後期画分中に溶出することを確認した（図４）。

ＬＧＥ実験は、それぞれ３３％および２％の高マンノースグリコフォームを含有する、対照Ａｂ１（ＩｇＧ１）および対照Ａｂ２（ＩｇＧ１）を用いて実施した。図５に示されるように、対照Ａｂ１のオリゴ糖プロファイル解析は、高マンノース５グリコフォームの分離がないことを示唆する。対照Ａｂ２もまた同様のプロファイル（データ示さず）を示し、したがって最初の高マンノース５グリコフォーム含量が、イオン交換クロマトグラフィーステップにおける、その除去に影響を及ぼさないことが示唆された。

高マンノース５グリコフォームの除去が、ＩｇＧ２抗体でのみ観察されるかどうかを試験するために、対照Ａｂ３（ＩｇＧ２）を用いてＬＧＥ試行を実施した。図６に示されるように、対照Ａｂ３を用いた試行は高マンノース５グリコフォームの除去をもたらさず、この挙動がＩｇＧ２抗体の特異的性質でないことが示唆された。

ｍＡｂ ７．１５９．２ ＬＧＥ画分分析は、凝集体に、高マンノース５グリコフォームの増大に対応する増大があったことを示し、高マンノース５グリコフォームの除去が、凝集体の除去と関連があるかもしれないことが示唆された。ＳＥＣを実施して、凝集体および単量体を単離した。オリゴ糖分析は、単量体および凝集体中の高マンノース５グリコフォームレベルがそれぞれ２．９％および２．３％であることを示し、凝集体および高マンノース５グリコフォームの除去は関連しないことが示唆された。

いかなる理論による制限も意図しないが、イオン交換クロマトグラフィー中のｍＡｂ ７．１５９．２高マンノース５グリコフォームの除去は、抗体分子上の電荷の差に起因するようである（図７）。Ｆａｂ領域中にシアル酸を含有するより成熟したグリコフォームは、比較的より酸性であり、溶出の初期画分中に除去される。Ｆａｂ−シアル化がより少ない、したがってより未熟でより塩基性のグリコフォームは、溶出の後期画分中に除去される。対照Ａｂ１、対照Ａｂ２、および対照Ａｂ３抗体分子は、Ｆａｂ領域上にグリコシル化部位を有せず、Ｆａｂ−シアル化されていないので、この挙動は見られない。ｍＡｂ ７．１５９．２の場合、おそらく後期画分中に溶出する、Ｆａｂ−シアル化が少ない（より未熟な）グリコフォームはまた、Ｆｃ領域中に、より高い割合の高マンノース５グリコフォームも含有する。

図８は、ＬＧＥ画分全体にわたるグリコフォーム分離の理解を助けるために、オリゴ糖データの解析を提供する。結果は、シアル化グリコフォームなどのよりプロセシングされたグリコフォームの割合が、溶出のより初期の画分中でより高く、プロセシングがより少ないグリコフォームの割合が、後期画分中で増大することを示す。Ｇ２ｆ＋２ＮＡｃ、Ｇ２ｆ＋ＮＡｃ、およびＧ２ｆグリコフォームは、溶出プロファイル全体にわたり別個のピークを有し、より酸性のグリコフォームはより初期に溶出し、酸性のより少ないグリコフォームは後期に溶出する。高マンノース５グリコフォームの割合は、Ｇ２ｆ＋２ＮＡｃ、Ｇ２ｆ＋ＮＡｃ、およびＧ２ｆの割合の低下と共に増大する。その他のより未熟なグリコフォームＧ０＋Ｇ０ｆ（図８）の割合はまた、Ｇ２ｆ＋２ＮＡｃ、Ｇ２ｆ＋ＮＡｃ、およびＧ２ｆの割合の低下と共に増大する。

シアル酸アッセイを実施して、ｍＡｂ ７．１５９．２画分中のシアル酸変化をモニターした。シアル酸アッセイからの結果は、分子あたりのシアル酸の数が、初期画分中でより高いことを示し、より多くのＦａｂ−シアル化グリコフォームがより初期の画分中に溶出し、より未熟なグリコフォームが後期画分中に溶出することを示す、オリゴ糖データに一致する（図９）。

研究結果は、高マンノースグリコフォームが、Ｆａｂ−シアル化グリコフォームによって生じる電荷分離のために、ｍＡｂ ７．１５９．２カチオン交換クロマトグラフィーステップで、除去されることを示唆する。結果はまた、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、シアル化グリコフォーム、高マンノースグリコフォーム、およびその他のより未熟なグリコフォームを分離し得ることも示唆する。

実施例２
複数の規模にわたる高マンノース５除去
ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）装入物（ｍＡｂ ７．１５９．２）および溶出生成物のオリゴ糖分析は、複数の規模（２０Ｌロット、１００Ｌロット、５００Ｌロット、および２０００Ｌロット）にわたって、高マンノース５グリコフォームが、４．２〜６．０％から０．７〜２．１％に低下したことを示した。ペプチドマッピング分析もまた、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）カラムステップによって、高マンノース５グリコフォームが、４．７〜４．９％から０．６〜１．１％に低下したことを示した。

実施例３
その他のイオン交換カラムを用いた高マンノース５除去
ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｎｕｖｉａ（商標）Ｓ（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｓ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＣａｐｔｏ（商標）Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）をはじめとするその他のカチオン交換クロマトグラフィー樹脂が試験され、これらもまた異なる程度の高マンノース５グリコフォームの分離を示した（図１０〜１３）。試験した追加的カラムの内、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、最も少ない高マンノース５グリコフォームの分離を示した。

Claims (24)

1. 糖タンパク質の高マンノースグリコフォームと、少なくとも１つのその他のグリコフォームとを含んでなるサンプル中の糖タンパク質の高マンノースグリコフォームの量を低下させる方法であって、
   （ａ）イオン交換カラム上の糖タンパク質保持を可能にする条件下において、サンプルを前記イオン交換カラム上に装入するステップと；
   （ｂ）前記イオン交換カラムに溶出緩衝液を通過させ、前記イオン交換カラムから前記糖タンパク質を溶出させるステップと；
   （ｃ）前記イオン交換カラムから溶出して少なくとも１つのその他のグリコフォームを含んでなる、第１の１つまたは複数の画分を収集するステップと；
   （ｄ）前記第１の１つまたは複数の画分から、第２の１つまたは複数の画分を除外するステップと
   を含み、前記第２の１つまたは複数の画分が、前記第１の１つまたは複数の画分の前または後に前記イオン交換カラムから溶出して、高マンノースグリコフォームを含有し、
   前記第１の１つまたは複数の画分中の高マンノースグリコフォームの量が、前記イオン交換カラム上への装入前の前記サンプル中の高マンノースグリコフォームの量と比較して低下される、方法。
2. 前記イオン交換カラムがカチオン交換カラムであり、高マンノースグリコフォームを含有する前記第２の１つまたは複数の画分が、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する前記第１の１つまたは複数の画分の後に、前記カチオン交換カラムから溶出する、請求項１に記載の方法。
3. 前記イオン交換カラムがアニオン交換カラムであり、高マンノースグリコフォームを含有する前記第２の１つまたは複数の画分が、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する前記第１の１つまたは複数の画分の前に、前記アニオン交換カラムから溶出する、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１の１つまたは複数の画分または前記第２の１つまたは複数の画分中の高マンノースグリコフォームの量を測定するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
5. 前記糖タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記モノクローナル抗体がＩｇＧ抗体である、請求項５に記載の方法。
7. 前記モノクローナル抗体がＩｇＧ２抗体である、請求項５に記載の方法。
8. 前記モノクローナル抗体が組換えモノクローナル抗体である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記組換えモノクローナル抗体が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である宿主細胞から調製される、請求項８に記載の方法。
10. 前記モノクローナル抗体が、ヒト抗体である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記モノクローナル抗体が、Ｆｃ領域上の少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位と、Ｆａｂ領域上の少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位とを含んでなる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記モノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームが、前記モノクローナル抗体の高マンノース５グリコフォームである、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記モノクローナル抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドと、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドとを含んでなる、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記モノクローナル抗体が、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含んでなり、前記重鎖ポリペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含んでなり、前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記第１の１つまたは複数の画分中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量が、前記モノクローナル抗体総量の２％未満である、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第１の１つまたは複数の画分中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量が、前記イオン交換カラム上に装入する前の前記サンプル中のモノクローナル抗体の高マンノースグリコフォームの量と比較して１０倍低下される、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記サンプルを装入した後、前記イオン交換カラムに前記溶出緩衝液を通過させる前に、前記イオン交換カラムを洗浄するステップをさらに含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. モノクローナル抗体を含んでなる組成物であって、前記モノクローナル抗体が少なくとも２つのＮ結合オリゴ糖を含んでなり、前記組成物中の前記モノクローナル抗体の２％未満が高マンノースグリコフォームである、組成物。
19. 前記組成物中の前記モノクローナル抗体の１％未満が、高マンノースグリコフォームである、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記モノクローナル抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドと、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドを含んでなる、請求項１８または１９に記載の組成物。
21. 前記モノクローナル抗体が、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含んでなり、前記重鎖ポリペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含んでなり、前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる、請求項１８または１９に記載の組成物。
22. 糖タンパク質の高マンノースグリコフォームと、少なくとも１つのその他のグリコフォームとを含んでなるサンプル中の糖タンパク質の高マンノースグリコフォームを単離する方法であって、
    （ａ）イオン交換カラム上の糖タンパク質保持を可能にする条件下において、サンプルをイオン交換カラム上に装入するステップと；
    （ｂ）前記イオン交換カラムに溶出緩衝液を通過させ、前記イオン交換カラムから前記糖タンパク質を溶出させるステップと；
    （ｃ）前記イオン交換カラムから溶出して、高マンノースグリコフォームを含有する、第１の１つまたは複数の画分を収集するステップと；
    （ｄ）前記第１の１つまたは複数の画分から、第２の１つまたは複数の画分を除外するステップであって、それによってサンプル中の高マンノースグリコフォームを単離する、ステップと
    を含み、前記第２の１つまたは複数の画分が、前記第１の１つまたは複数の画分の前または後に前記イオン交換カラムから溶出して、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する、方法。
23. 前記イオン交換カラムがカチオン交換カラムであり、高マンノースグリコフォームを含有する前記第１の１つまたは複数の画分が、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する前記第２の１つまたは複数の画分の後に、前記カチオン交換カラムから溶出する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記イオン交換カラムがアニオン交換カラムであり、高マンノースグリコフォームを含有する前記第１の１つまたは複数の画分が、少なくとも１つのその他のグリコフォームを含有する前記第２の１つまたは複数の画分の前に、前記アニオン交換カラムから溶出する、請求項２２に記載の方法。

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