JP2016516424A - デュアルａａｖベクターによる大型遺伝子の効果的送達 - Google Patents

Abstract

本発明は、特に5 Kbより大きい遺伝子の効果的な遺伝子治療を可能にするコンストラクト、ベクター、関連する宿主細胞及び医薬組成物に関する。

Description

本発明は、特に5Kbより大きい遺伝子の、効果的な遺伝子治療を可能にするコンストラクト、ベクター、関連する宿主細胞及び医薬組成物に関する。

資金提供の表示
本発明は、Italian Telethon Foundationの支援(助成金TGM11MT1及びヨーロッパ基金)を受けてなされたものである。Italian Telethon Foundationは本発明における権利を有する。

デュアルAAVトランス-スプライシング及びデュアルAAVハイブリッドAPストラテジーは、米国政府の支援を受け、National Eye Instituteにより与えられた契約番号R24RY019861においてなされたものである。米国政府は本発明における一定の権利を有する。

遺伝性網膜変性疾患(IRD)は、世界全体で1/2,000の有病率があり(1)、世界的に失明の主要な原因である。中でも最も頻繁に起こり、深刻なIRDは、網膜色素変性症、レーバー先天黒内障(LCA)、及びシュタルガルト病(STGD)であり、これらはほとんどの場合単一遺伝子の状態として遺伝する。IRDを引き起こす変異の大部分は、網膜のニューロン光受容体(PR)、杆体及び/又は錐体において発現される遺伝子中に起こる(2)。これらの失明に至る疾患に適用可能な治療は現在のところ無い。

遺伝子治療は、IRDの治療に大いに有望である。利用可能な遺伝子トランスファーベクターの中でも、小型アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するものが、単独網膜下投与を行う長期間の治療のためのPR及び網膜色素上皮(RPE)の両方のターゲティングに最も効率的である(3-4)。 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 最近、本願発明の発明者ら及び他の者は、AAVの網膜下投与が、忍容性良好であり、RPEで発現する遺伝子、RPE65の変異によって起こる、2型LCAに罹患した患者において視力を改善するのに効果的であることを実証している(5-9)。これらの結果は、他の型のLCA及びIRD一般の治療にとって良い前兆である。PR(10-14)及びRPEを効率的にターゲティングするAAV2/8等のAAVベクター血清型が利用可能であることから、このアプローチはさらに支持される。しかし、AAVの重大な制約は、その積荷容量(cargo capacity)であり、親ウイルスのゲノムのサイズである約5kbに制限されていると考えられている(15-19)。このため、コード配列(CDS)が5kbより大きい遺伝子(本願明細書において大型遺伝子と呼ぶ)の変異によって起こる、一般的なIRDへのAAV遺伝子治療アプローチの応用が制限される。これらのIRDには以下のものが含まれる。

シュタルガルト病(STGD；MIM番号248200)は、PR外節に位置する全トランスレチナールトランスポーターをコードするABCA4遺伝子(CDS: 6822 bp)の変異によって起こる、最も一般的な型の遺伝性黄斑変性症である(20)。アッシャー症候群IB型(USH1B；MIM番号276900)は、MYO7A遺伝子(CDS: 6648 bp)の変異によって起こる、最も重度の型のRP及び難聴であり(21)、MYO7A遺伝子は、網膜内のPR及びRPEの両方において発現する、アクチンに基づくモーターである特殊なMYO7Aをコードする(22-24)。

また、錐体-杆体ジストロフィー3型、黄色斑眼底、加齢黄斑変性症2型、早期発症重症網膜ジストロフィー、及び網膜色素変性症19型も、ABCA4変異に関連する(ABCA4関連疾患)。

AAV積荷容量の制約を克服するために、様々な方策が探究されてきた。発明者ら自身のグループを含む、複数のグループは、いわゆる特大(oversize)ベクターを開発することにより、利用可能な多数のAAVカプシドのひとつに、大型遺伝子を「押し込む」ことを試みていた(25-27)。特大AAVベクターを投与することにより、STGD及びUSH1BのAbca4-/-及びshaker 1 (sh1)マウスモデルの網膜を含む、ヒト遺伝性疾患のげっ歯類及びイヌのモデルにおける治療的に意義のある水準での導入遺伝子の発現を達成した(27-30)ものの、特大AAVが介在する形質導入の根本的な機構は分かり難いままである。発明者ら及び他の者が当初提唱していたもの(25-27)に反して、特大AAVベクターは、無傷(intact)な大型遺伝子の純粋な集団を含有しておらず、むしろ大部分は長さが5kb以下の欠損(truncated)したゲノムの異種混合物を含有している(15-18)。インフェクションの後に、これらの欠失したゲノムが標的細胞の核内で再構築されているということが、特大AAVベクターの形質導入機構として提唱されている(15-17, 31)。形質導入機構及びin vivoの有効性とは無関係に、特大AAVのゲノムサイズの不均一性(heterogeneity)はヒトの遺伝子治療への応用にとって主要な制約である。

その代わりとして、分子間のコンカテマー化(コンカテマー化)を受けるというAAVゲノムの固有の能力(32)を利用して、大型遺伝子発現カセットを半分(5kb未満のサイズ)に分割し、それぞれを2つの別個の(デュアル：dual)AAVベクターの1つに含めることにより、in vivoで大型遺伝子を移動させる(33-35)。デュアルAAVトランス-スプライシングストラテジーでは、スプライス供与(SD)シグナルが、5’-側ベクターの3’末端に位置しており、スプライス受容(SA)シグナルが、3'側ベクターの5’末端に位置している。同じ細胞をデュアルAAVベクターによりコ-インフェクションし、2つに分割したものを逆位末端反復(ITR)によってhead-to-tail型コンカテマー化すると、トランス-スプライシングにより成熟したmRNA及び全長のタンパク質が生産される(33)。トランス-スプライシングは、筋肉及び網膜における大型遺伝子の発現に成功裏に用いられてきた(36-37)。

特に、Reichら(37)は、AAV2及びAAV5のカプシドを用いたトランス-スプライシングストラテジーを使用し、どちらのベクターも網膜色素上皮及び光受容体の両方を形質導入することを、lacZ遺伝子をレポーター遺伝子として用い示した。このストラテジーは、治療的な及び/又は大型の遺伝子を用いては行われなかった。

その代わりに、デュアルAAVベクターに含まれる、導入遺伝子発現カセットを2つに分割したものは、相同な重複配列(5’-側ベクターの3’末端、3’-側ベクターの5’末端で、デュアルAAVは重複している)を含むことができ、この配列が媒介することによって、相同組換えによる単一の大型ゲノムの再構築が起こる(34)。このストラテジーは、導入遺伝子重複配列の組換えを誘導する性質に依存する(38)。第三のデュアルAAV ストラテジー(ハイブリッド)は、高い組換え誘導性を有する領域(すなわち、アルカリホスファターゼ、AP(35, 39))をトランス-スプライシングベクターに加えることに基づく。デュアルAAV間の組換えを向上させるために、加えられる領域は、5’-側ベクターのSDシグナルの下流及び3’-側ベクターのSAシグナルの上流に位置している。

米国特許出願公開第2010/003218号明細書の書類は、APに基づくハイブリッドデュアルベクター系に関する。この書類は、ミニジストロフィンを発現するAPに基づくハイブリッドデュアルベクター形質導入効率性を示しているが、有効性に関するデータは無い。

米国特許出願公開第2010/003218号明細書

M. M. Sohockiら、Hum. Mutat. 17, 42-51 (2001). T. Dryja, in The Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases C. Scriver, A. Beaudet, W. Sly, D. Valle, Eds. (McGraw-Hill, New York, NY, 2001), vol 4, pp. 5903-5933. P. Colellaら、Trends Mol. Med. 15, 23-31 (2009). L. H. Vandenberghe, A. Auricchio, Gene Ther. 19, 162-168 (2012). J. W. Bainbridgeら、N. Engl. J. Med. 358, 2231-2239 (2008). A. V. Cideciyanら、N. Engl. J. Med. 361, 725-727 (2009). A. M. Maguireら、N. Engl. J. Med. 358, 2240-2248 (2008). A. M. Maguireら、Lancet 374, 1597-1605 (2009). F. Simonelliら、Mol. Ther. 18, 643-650 (2010). M. Alloccaら、J. Virol. 81, 11372-11380 (2007). C. Mussolinoら、Gene Ther. 18, 637-645 (2011). L. H. Vandenbergheら、Sci. Transl. Med. 3, 88ra54 (2011). A. Auricchio, Hum. Gene Ther. 22, 1169-1170 (2011). M. Natkunarajahら、Gene Ther. 15, 463-467 (2008). B. Dongら、Mol. Ther. 18, 87-92 (2010). Y. Laiら、Mol. Ther. 18, 75-79 (2010). Z. Wuら、Mol. Ther. 18, 80-86 (2010). Y. Wangら、Hum. Gene Ther. Methods 23, 225-233 (2012). P. L. Hermonatら、FEBS Lett. 407, 78-84 (1997). R. Allikmets, Nat. Genet. 17, 122 (1997). J. M. Millanら、J. Ophthalmol. 2011, 417217 (2011). T. Hassonら、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92, 9815-9819 (1995). X. Liuら、Cell. Motil. Cytoskeleton 37, 240-252 (1997). D. Gibbsら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1130-1135 (2010). J. C. Griegerら、J. Virol. 79, 9933-9944 (2005). J. Wuら、Hum. Gene Ther. 18, 171-182 (2007). M. Alloccaら、J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008). P. E. Monahanら、Mol. Ther. 18, 1907-1916 (2010). W. E. Groseら、PLoS One 7, e39233 (2012). V. S. Lopesら、Gene Ther. (2013).

Lopesら(30)は、アデノ随伴ウイルスを用いた大型MYO7AのcDNAによる網膜の遺伝子治療を研究し、AAV2又はAAV5の単一ベクターによるMYO7A治療はある程度は有効であることがわかったが、一方でデュアルAAV2アプローチはより有効性が低いことが判明した。

従って、効果的な遺伝子治療のために大型遺伝子を再構成するために利用することができる、コンストラクト及びベクターへの必要性が依然として存在する。

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いる網膜の遺伝子治療はヒトにおいて安全かつ効果的である。しかし、AAV積荷容量が5kbに制限されていることにより、シュタルガルト病(STGD)又はアッシャー症候群IB型(USH1B)等の5kbを超える遺伝子の変異に起因する遺伝性網膜疾患の治療への応用が妨げられている。網膜において試験され、大型遺伝子をAAVカプシド(特大AAV)の中に「押し込んで」パッケージングさせることに基づく、大型遺伝子を移動させる以前の方法は、ベクターゲノムサイズの不均一性により安全性に対する懸念が生じるため、臨床分野へ容易には変換できない可能性がある。

分子内コンカテマー化を受けるAAVの能力の利点を利用し、発明者らは、スプライシング(トランス-スプライシング)、相同組換え(重複)、又はその2つの組み合わせ(ハイブリッド)のいずれかによって大型遺伝子を再構成するデュアルAAVベクターを作製した。

どのAAVに基づくストラテジーが最も効率的に大型遺伝子を網膜に形質導入するかを決定するために、発明者らはHEK293細胞並びにマウス及びブタの網膜において、EGFP、ABCA4又はMYO7Aを用いて複数のAAVに基づくストラテジーをin vivoで対照比較した。

発明者らは、デュアルトランス-スプライシングAAVベクター及びデュアルハイブリッドAAVベクターは効率的にマウス及びブタの光受容体を形質導入するが、デュアル重複AAVベクターはそうではないことを発見した。光受容体は、遺伝性網膜変性疾患の治療のための主要な細胞標的である。デュアルトランス-スプライシングAAV又はデュアルハイブリッドAAVによる網膜の形質導入のレベルは、STGD及びUSH1BAのbca4-/-及びsh1マウスモデルの表現型の有意な改善をもたらした。デュアルトランス-スプライシングAAV又はデュアルハイブリッドAAVは、大型遺伝子の送達を必要とする網膜疾患の遺伝子治療にとって魅力的なストラテジーである。

ここで、本発明を、以下の図を参照しながら非限定的な例を用いて説明する。

図1は、大型遺伝子形質導入のためのAAVに基づくストラテジーの略図である。CDS：コード配列、pA：ポリアデニル化シグナル、SD：スプライス供与シグナル、SA：スプライス受容シグナル、AP：アルカリホスファターゼ組換え誘導領域(39)、AK：F1ファージ組換え誘導領域。点線(dotted line)はSDとSAとの間で起こるスプライシングを示し、細かい点線(pointed line)は相同組換えに利用可能な重複領域を示す。発明者らは、デュアルトランス-スプライシング及びハイブリッドAKを用いて大型遺伝子の再構成を成功させることができることを発見した。特にデュアルトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターが、効率的にマウス及びブタの光受容体を形質導入するが、重複及びハイブリッドAPベクターはそうではない。標準サイズのAAVベクタープラスミド及び特大AAVベクタープラスミドは、プロモーター、全長導入遺伝子CDS及びポリアデニル化シグナル(pA)を含む、全長の発現カセットを含んでいた（表1）。デュアルAAVベクターを生成するために必要な2つの別個のAAVベクタープラスミド(5’及び3’)は、プロモーターとそれに続く導入遺伝子CDSのN-末端部分(5’プラスミド)又は導入遺伝子CDSのC-末端部分とそれに続くpAシグナル(3’プラスミド、表1)のいずれかを含んでいた。全てのプラスミドの構造を、材料と方法の節に示す。 図2Aは、デュアルAAV重複、トランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターが、大型遺伝子をin vitroで効率的に形質導入したことを示す。EGFP (A及びD)、ABCA4 (B及びE)及びMYO7A (C及びF)をコードするAAV2/2ベクターでインフェクションしたHEK293細胞のウエスタンブロット。(AからC) 矢印は全長タンパク質を指し、ロードしたタンパク質の量(マイクログラム)を各レーンの下に示し、分子量ラダーを左側に示す。(A-C) ウエスタンブロット画像は代表的なものであり、定量はn=4 (A-B)又はn=3 (C)の独立した試験から行っている。OZ：AAV特大；OV：デュアルAAV重複；TS：デュアルAAVトランス-スプライシング；AP：デュアルAAVハイブリッドAP；AK：デュアルAAVハイブリッドAK；5’+3’：5’-側ベクター及び3’-側ベクターでコ-インフェクションした細胞；5’：5’-側ベクターのみでインフェクションした対照細胞；3’：3’-側ベクターのみでインフェクションした対照細胞；α-EGFP：抗-EGFP抗体；α-3xflag：抗-3xflag抗体；α-MYO7A：抗-MYO7A抗体；α-β-チューブリン：抗-β-チューブリン抗体；α-フィラミンA：抗-フィラミンA抗体。 図2Bは、デュアルAAV重複、トランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターが、大型遺伝子をin vitroで効率的に形質導入したことを示す。EGFP (A及びD)、ABCA4 (B及びE)及びMYO7A (C及びF)をコードするAAV2/2 ベクターでインフェクションしたHEK293細胞のウエスタンブロット。(DからF) EGFP (D)、ABCA4 (E)及びMYO7A (F)のタンパク質のバンドの定量。EGFP、ABCA4及びMYO7Aバンドの強度を、チューブリン(D)又はフィラミンA (E-F)バンドの強度で除した。柱状グラフは、タンパク質の発現をデュアルAAVトランス-スプライシング(TS)ベクターと比較した百分率として示す。平均値を対応するバーの上方に示す。エラーバー：平均値± s.e.m. (標準誤差)。* ANOVA p値<0.05；** ANOVA p値< 0.001。(F) パネルの下方に示したアスタリスクは、OZ及びAPの両方との有意差を示す。OZ：AAV特大；OV：デュアルAAV重複；TS：デュアルAAVトランス-スプライシング；AP：デュアルAAVハイブリッドAP；AK：デュアルAAVハイブリッドAK。 図3は、デュアルAAV重複ベクターがマウス及びブタ網膜のRPEを形質導入するが光受容体を形質導入しないことを示す。ユビキタスなサイトメガロウイルス (CMV)プロモーター、PR特異的ロドプシン(RHO)及びロドプシンキナーゼ(RHOK)プロモーター、若しくはRPE特異的卵黄様黄斑ジストロフィー2 (VMD2)プロモーターの制御下で、ABCA4-3xflag (OV)をコードするAAV2/8デュアルAAV重複ベクター又は標準サイズEGFP (EGFP)をコードするAAV2/8ベクターの注射後1ヶ月の、C57BL/6 (A)及び大ヨークシャー種のブタ(B)の網膜溶解物のウエスタンブロット解析。(A-B) 矢印は全長タンパク質を示し、分子量ラダーを左側に示し、150マイクログラムのタンパク質を各レーンにロードした。解析した全ての網膜中、ABCA4-陽性の網膜の数(n)及び百分率を示す；α-3xflag：抗-3xflag抗体；α-ジスフェリン：抗-ジスフェリン抗体。(C) ユビキタスなニワトリβ-アクチン(CBA)プロモーター又は光受容体特異的ロドプシン(RHO)プロモーターの制御下でMYO7A-HA (OV)をコードするAAV2/8重複ベクター注射3ヶ月後のC57/BL6の眼杯(左のパネル)及び網膜(右のパネル)のウエスタンブロット解析。矢印は全長タンパク質を指し、分子量ラダーを左側に示し、100マイクログラムのタンパク質を各レーンにロードした。解析した全ての網膜中、MYO7A-陽性の網膜の数(n)及び百分率を示す。α-HA：抗-ヘマグルチニン (HA)抗体。 図4は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターがRPE及び光受容体の両方を効率的に形質導入することを示す。ユビキタスなサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下でEGFPをコードするAAV2/8ベクターの網膜下注射一ヶ月後のC57BL/6マウス由来の網膜凍結切片の蛍光解析。スケールバー(20 μm)を図中に示す。NS：AAV標準サイズ；OZ：AAV特大；TS：デュアルAAVトランス-スプライシング；AP：デュアルAAVハイブリッドAP；AK：デュアルAAVハイブリッドAK；RPE：網膜有色素上皮；ONL：外核層。 図5は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKがマウス及びブタの光受容体を効率的に形質導入することを示す。(A) PR特異的ロドプシンプロモーター(RHO)の制御下でEGFPをコードするAAV2/8ベクターの網膜下注射一ヶ月後のC57BL/6マウス由来の網膜凍結切片の蛍光解析。スケールバー(50 μm)を図中に示す。(B) PR特異的ロドプシンプロモーター(RHO)の制御下でEGFPをコードするAAV2/8ベクターの網膜下注射一ヶ月後の大ヨークシャー種のブタ由来の網膜凍結切片の蛍光解析。スケールバー(50 μm)を図中に示す。NS：AAV標準サイズ；TS：デュアルAAVトランス-スプライシング；AK：デュアルAAVハイブリッドAK；RPE：網膜有色素上皮；NL：外核層。 図6は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターの網膜下投与が、マウス光受容体において強力だが変動するレベルのABCA4発現をもたらすことを示す。(A) PR特異的ロドプシンプロモーター(RHO)の制御下でABCA4をコードするデュアルAAVトランス-スプライシング(TS)及びデュアルAAVハイブリッドAK(AK)ベクターの注射一ヶ月後のC57BL/6の網膜溶解物のウエスタンブロット解析。矢印は全長タンパク質を指し、分子量ラダーを左側に示し、150マイクログラムのタンパク質を各レーンにロードした。解析した全ての網膜中、ABCA4-陽性の網膜の数(n)及び百分率を示す。5’+3’：5’-側ベクター及び3’-側ベクターを共注射した網膜；α-3xflag：抗-3xflag抗体；α-ジスフェリン：抗-ジスフェリン抗体。(B) 抗-HA抗体を用いた、野生型Balb/C (WT; n=3 眼)及びデュアルAAVハイブリッドAKベクター(AK-ABCA4; n=5 眼)又は対照としてAAV標準サイズEGFP (EGFP, n=3 眼)を注射したAbca4-/-マウス網膜由来の切片の免疫電子顕微鏡解析。黒い点はABCA4-HAタンパク質の免疫金標識を表す。スケールバー(200 nm)を図中に示す。 図7は、デュアルAAVハイブリッドAKベクターの網膜下注射によりAbca4-/-マウスでリポフスチン顆粒の蓄積が減少することを示す。(A) 抗-HA抗体を用いた、野生型Balb/C (WT)及びデュアルAAVハイブリッドAKベクターを注射したAbca4-/-マウス(Abca4-/- AK-ABCA4)又は対照としてAAV標準サイズEGFPを注射したAbca4-/-マウス(Abca4-/- EGFP)のいずれか由来の切片の透過型電子顕微鏡解析。黒い矢印はリポフスチン顆粒を表す。スケールバー(1.6 μm)を図中に示す。(B) 各サンプルにつき少なくとも30視野(25 μm²)で計数されたリポフスチン顆粒の平均数の定量。WT：Balb/cマウス；Abca4-/- EGFP/5’/3’：デュアルAAVハイブリッドAKベクター又は対照としてAAV標準サイズEGFP又はデュアルAAVハイブリッドAKの5’-側若しくは3’-側のベクターのいずれかを注射したAbca4-/-マウス；Abca4-/- AK-ABCA4：デュアルAAVハイブリッドAKベクターを注射したマウス；Abca4-/- TS-ABCA4：デュアルAAVトランス-スプライシングベクターを注射したマウス。解析した眼の数(n)を示す。平均値を対応するバーの上方に示す。エラーバー：平均値± s.e.m. (標準誤差)。* p ANOVA<0.05。 図8は、デュアルAAVハイブリッドAKベクター網膜下注射によりAbca4-/- RPEの厚みが減少することを示す。(A) 野生型Balb/c (WT)並びにデュアルAAVトランス-スプライシング(TS-ABCA4)及びハイブリッドAKベクター(AK-ABCA4)を注射したAbca4-/-マウス、又はAAV標準サイズEGFP (EGFP)及びデュアルハイブリッドAKベクターの5’-側若しくは3’-側(5’/3’)をコントロールとして注射したAbca4-/-マウス由来の網膜切片の透過型電子顕微鏡解析の代表的な写真。点線はRPE細胞の端を示す。スケールバー(3.8 μm)を図中に示す。(B) 各サンプルにつき少なくとも30視野で計測した平均RPE厚みの定量。解析した眼の数(n)を示す。平均値を対応するバーの上方に示す。エラーバー：平均値± s.e.m. (標準誤差)。s.d.m.：WT：± 716；TS-ABCA4： ± 698。 図9は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターの網膜下投与が、マウスで強力なMYO7A発現をもたらすことを示す。ユビキタスなニワトリβ-アクチン(CBA)プロモーターの制御下でMYO7A-HAをコードするデュアルAAVトランス-スプライシング(TS)及びハイブリッドAK (AK)ベクターの注射一ヶ月後のC57BL/6の眼杯のウエスタンブロット解析。矢印は全長タンパク質を指し、分子量ラダーを左側に示し、100マイクログラムのタンパク質を各レーンにロードした。解析した全ての網膜中、MYO7A-陽性の網膜の数(n)及び百分率を示す。5’+3’：5’-側ベクター及び3’-側ベクターを共注射した眼；5’：5’-側ベクターを注射した眼；3’：3’-側ベクターを注射した眼；α-HA：抗-ヘマグルチニン(HA)抗体；α-ジスフェリン：抗-ジスフェリン抗体。 図10は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターの網膜下投与がsh1-/-RPEでのメラノソーム局在をレスキューすることを示す。(A) Epoxy組織染色剤で染色した、AAV標準サイズEGFP (EGFP, n=4 眼)を注射したsh1+/+及びsh1+/-の眼、対照としてデュアルAAVトランス-スプライシング(TS-MYO7A, n=3 眼)、ハイブリッドAK (AK-MYO7A; n=3 眼)又は5’-側ベクター(5’TS/5’AK, n=4 眼)を注射したsh1-/-の眼の代表的な準薄網膜切片。スケールバー(10 μm)を図中に示す。(B) デュアルAAVベクターの網膜下送達の二ヶ月後のsh1マウスにおけるRPE絨毛中のメラノソーム局在の定量。定量は、先端のメラノソーム数/視野の平均として示す。平均値を対応するバーの上方に示す。エラーバー：平均値± s.e.m. (標準誤差)。* p ANOVA<0.05、** p ANOVA<0.001。 図11は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターの網膜下投与により、sh1-/-PR結合繊毛中のロドプシン蓄積が減少することを示す。デュアルAAVベクターの網膜下送達後2ヶ月後のsh1マウスのPR結合繊毛中のロドプシン金粒子数の定量。定量は、結合繊毛の長さ(mm)あたりの金粒子数の平均値として示す。平均値を対応するバーの上方に示す。エラーバー：平均値 ± s.e.m. (標準誤差)。 図12は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターがin vitroで大型遺伝子CEP290を効率的に形質導入することを示す。C-末端にヘマグルチニン(HA)タグでタグ付けされたCEP290をコードするAAV2/2ベクターでインフェクションしたHEK293細胞のウエスタンブロット(A-B)。(A) 矢印は全長タンパク質を指し、60マイクログラムのタンパク質を各レーンにロードし、分子量ラダーを左側に示した。(B) CEP290タンパク質のバンドの定量。CEP290バンドの強度を、フィラミンAバンドの強度で除した。柱状グラフは、タンパク質の発現をデュアルAAVトランス-スプライシング(TS)ベクターと比較した百分率として示す。平均値を対応するバーの上方に示す。エラーバー：平均値± s.e.m. (標準誤差)。ウエスタンブロット画像は代表的なものであり、定量はn=5の独立した試験から行っている。OV：デュアルAAV重複；TS：デュアルAAVトランス-スプライシング；AK：デュアルAAVハイブリッドAK；5’+3’：5’-側ベクター及び3’-側ベクターでコ-インフェクションした細胞；3’：3’-側のみでインフェクションした対照細胞；α-HA：抗-HA抗体；α-フィラミンA：抗-フィラミンA抗体。 図13は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターで処理した3月齢のAbca4-/-マウスにおいて、光脱感作からの回復が改善することを示す。Abca4-/-及びBalb/cマウスにおける注射後6週間での光脱感作からの回復。相対b波は、どちらも1 cd s/m²によって引き起こされた、脱感作前と脱感作後との間のb波の振幅(μV)の比である。時間(分)は脱感作後の時間を指す。60分での平均回復(%)を示す。p ANOVA［Abca4-/- AK-ABCA4］対［Abca4-/- 非注射/5’］：0.05；p ANOVA［Abca4-/- TS-ABCA4］対［Abca4-/- 非注射/5’］：0.009；p ANOVA［Abca4-/- AK-ABCA4］対「WT」：0.002；p ANOVA［Abca4-/- TS-ABCA4］対［WT］：0.02；p ANOVA［WT］対［Abca4-/- 非注射/5’］：0.00001。WT：Balb/cマウス (n=4)；Abca4-/- TS-ABCA4：デュアルAAVトランス-スプライシングベクターを注射したマウス (n=5)；Abca4-/- AK-ABCA4：デュアルAAVハイブリッドAKベクターを注射したマウス(n=5)；Abca4-/- 非注射/5’：注射されていない(n=2)か、又はデュアルAAV TS若しくはハイブリッドAKベクターを注射された(n=5)Abca4-/-マウス。データは平均値± s.e.m (平均値の標準誤差)として示す。* p ANOVA<0.05。 図14は、sh1-/-光受容体においてデュアルAAVハイブリッドAKベクターがデュアルAAVトランス-スプライシングベクターよりも強力なMYO7A発現を誘導することを示す。sh1+/+の眼における内在性Myo7a発現と比較した、sh1-/-の眼におけるデュアルAAVベクター由来のMYO7Aレベルの定量。sh1-/-の眼にCBA (左のパネル)又はRHO (右のパネル)のいずれかのプロモーターの制御下でMYO7AをコードするデュアルAAV TS及びハイブリッドAKベクターを注射した。柱状グラフは、MYO7Aタンパク質の発現をsh1+/+ Myo7aと比較した百分率として示す。平均値を対応するバーの上方に示す。The 定量は、抗-MYO7A抗体を用いたウエスタンブロット解析並びにジスフェリン(データは示していない)に標準化したMYO7A及びMyo7aのバンド強度測定により行った。エラーバー：平均値± s.d.m. (平均値の標準偏差)。定量は、i. 左のパネル：n=2 sh1+/+眼杯、及びTS-MYO7A又はAK-MYO7Aのいずれかで処理したそれぞれn=5又はn=1のsh1-/-眼杯；ii. 右のパネル：n=2 sh1+/+網膜、及びTS-MYO7A又はAK-MYO7Aのいずれかで処理したそれぞれn=1又はn=3のsh1-/-網膜を代表する。** p Studentのt検定 <0.001。 図15は、AAV標準サイズ、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターがマウスにおける網膜下送達後、最も強力な形質導入を与えることを示す。EGFPをコードするAAV2/8 ベクターの網膜下注射後1ヶ月のC57BL/6の眼のライブイメージング眼底蛍光。NZ：標準サイズ；OZ：AAV特大；TS：デュアルAAVトランス-スプライシング；AP：デュアルAAVハイブリッドAP；AK：デュアルAAVハイブリッドAK。各パネルは異なる眼を示す。 図16は、デュアルAAVトランス-スプライシング及びハイブリッドAKベクターのブタ網膜への送達後の強力なABCA4及びMYO7A発現を示す。(a) 光受容体特異的ロドプシン(RHO)プロモーターの制御下でABCA4-3xflagをコードするデュアルAAV2/8トランス-スプライシング(TS; n=2)及びハイブリッドAK (AK; n=3)ベクター又はネガティブコントロールとしてNS EGFP (neg)をコードするAAV2/8ベクターの注射1ヶ月後の大ヨークシャー種のブタ網膜溶解物のウエスタンブロット解析。(b) ユビキタスなニワトリベータ-アクチン(CBA)プロモーターの制御下でMYO7A-HAをコードするデュアルAAV2/8トランス-スプライシング(TS: n=5 RPE; n=3 網膜)及びハイブリッドAK (AK: n=5 RPE, n=5 網膜)ベクター、又はネガティブコントロールとしてデュアルAAV-MYO7A-HAの3’-側単独(neg)をコードするAAV2/8ベクターの注射1ヶ月後の大ヨークシャー種のブタ網膜溶解物のウエスタンブロット解析。(a-b) 矢印は全長タンパク質を示し、分子量ラダーを左側に示し、150 μg〜180 μgのタンパク質を各レーンにロードした。α-3xflag、抗-3xflag抗体；α-HA、抗-ヘマグルチニン抗体；α-ジスフェリン、抗-ジスフェリン抗体。 図17は、異種ITRを有するデュアルAAVハイブリッドAKベクターが、in vitroで大型遺伝子を形質導入することを示す。(a) 異種ITR2及びITR5を有するデュアルAAVハイブリッドAKベクターの設計図。(b) ABCA4(左のパネル)及びMYO7A(右のパネル)をコードする、異種ITRを有するデュアルAAVハイブリッドAKベクターでインフェクションしたHEK293細胞のウエスタンブロット解析。矢印は全長タンパク質を示し、50マイクログラムのタンパク質をロードし、分子量ラダーを左側に示した。5’+3’：5’-側ベクター及び3’-側ベクターでコ-インフェクションした細胞；5’：5’-側ベクターのみでインフェクションした対照細胞；3’：3’-側ベクターのみでインフェクションした対照細胞；neg：EGFPをコードするAAV2/8ベクターでインフェクションした細胞。α-3xflag：抗-3xflag抗体；α-MYO7A：抗-MYO7A抗体；α-フィラミン：抗-フィラミンA抗体。(a) Prom：プロモーター；CDS：コード配列；pA：ポリアデニル化シグナル；SD：スプライス供与シグナル；SA：スプライス受容シグナル；細かい点線(pointed line)は相同組換えに利用可能な重複領域を示し、点線(dotted line)はSDとSAとの間で起こるスプライシングを示す。異種ITR2及びITR5の位置を図示する。

従って、本発明の一つの実施態様は、宿主細胞で目的の遺伝子のコード配列を発現させるためのデュアルコンストラクト系であって、前記コード配列が5’末端部分及び3’末端部分から構成され、
a) 5’-3’方向に、
- 5’-逆位末端反復(5’-ITR)配列；
- プロモーター配列；
- 動作可能なように前記プロモーターに結合され、前記プロモーターの制御下にある、前記コード配列の5’末端部分；
- スプライス供与シグナルの核酸配列；及び、
- 3’-逆位末端反復(3’-ITR)配列；
を含む第一のプラスミド、並びに、
b)5’-3’方向に、
- 5’-逆位末端反復(5’-ITR)配列；
- スプライス受容シグナルの核酸配列；
- 前記コード配列の3’末端；
- ポリアデニル化シグナルの核酸配列；及び、
- 3’-逆位末端反復(3’-ITR)配列
を含む第二のプラスミド
を含む、デュアルコンストラクト系である。

本発明の好ましい実施態様は、宿主細胞で目的の遺伝子のコード配列を発現させるためのデュアルコンストラクト系であって、前記コード配列が5’末端部分及び3’末端部分から構成され、
a) 5’-3’方向に、
- 5’-逆位末端反復(5’-ITR)配列；
- プロモーター配列；
- 動作可能なように前記プロモーターに結合され、前記プロモーターの制御下にある、前記コード配列の5’末端部分；
- スプライス供与シグナルの核酸配列；及び、
- 3’-逆位末端反復(3’-ITR)配列；
を含む第一のプラスミド、並びに、
b)5’-3’方向に、
- 5’-逆位末端反復(5’-ITR)配列；
- スプライス受容シグナルの核酸配列；
- 前記コード配列の3’末端；
- ポリアデニル化シグナルの核酸配列；及び、
- 3’-逆位末端反復(3’-ITR)配列
を含む第二のプラスミド
を含み、前記第一のプラスミド及び第二のプラスミドを宿主細胞に導入すると、前記コード配列がスプライス供与シグナル及びスプライス受容シグナルによって再構成する、デュアルコンストラクト系である。本発明のデュアルコンストラクト系は有利には大型遺伝子の発現を再構成するために利用される。コード配列が再構成すると、遺伝子発現が起こる。

好ましくは、前記第一のプラスミド及び第二のプラスミドは、それぞれ3’-ITRの5’位置及び5’-ITRの3’位置に組換え誘導領域の核酸配列をさらに含む。

より好ましくは、組換え誘導領域はF1ファージ組換え誘導領域である。

さらに好ましくは、組換え誘導領域の核酸配列は、配列：GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT (配列番号3)から本質的に構成される。また、組換え誘導領域は、全長配列の組換え誘導特性を維持している配列番号3のフラグメントであってもよい。好ましくは、フラグメントは配列番号3と70%、75%、80%、85%、90%、95%又は99%の同一性(identity)を有する。

さらに好ましくは、ITRのヌクレオチド配列は、同一の又は異なるAAV血清型に由来する。

好ましくは、第一のプラスミドの3’-ITR及び第二のプラスミドの5’-ITRは、同一のAAV血清型由来である。

さらに好ましくは、第一のプラスミドの5’-ITR及び3’-ITR、並びに第二のプラスミドの5’-ITR及び3’-ITRはそれぞれ異なるAAV血清型由来である。

好ましくは、第一のプラスミドの5’-ITR及び第二のプラスミドの3’-ITRは異なるAAV血清型由来である。

さらに好ましくは、コード配列は天然のエキソン-エキソン接合部で5’末端部分と3’末端部分とに分割される。

好ましい実施態様において、スプライス供与シグナルの核酸配列は、配列：GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (配列番号1)から本質的に構成される。

好ましい実施態様において、スプライス受容シグナルの核酸配列は、配列：GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (配列番号2)から本質的に構成される。

また当業者は、スプライス受容シグナル及びスプライス供与シグナルを、周知の配列の中から選択してもよい。

スプライソソーム型イントロンは、真核生物のタンパク質をコードする遺伝子中に多くの場合存在する。イントロン中には、供与部位(イントロンの5’末端)、ブランチ部位(イントロンの3’末端の近傍)及び受容部位(イントロンの3’末端)がスプライシングのために必要とされる。スプライス供与部位には、イントロンの5’末端にほとんど不変の配列GUが含まれるが、この配列は、より大型でそれほど高度に保存されていない領域の中に存在する。イントロンの3'末端のスプライス受容部位は、ほとんど不変のAG配列によってイントロンを終結させている。AGの上流(5’-方向)には、ピリミジン(C及びU)が多い領域、つまりポリピリミジントラクトがある。ポリピリミジントラクトの上流には、分岐点があり、アデニンヌクレオチドが含まれる。

好ましい実施態様において、第一のプラスミドは、動作可能なようにコード配列に結合された少なくとも一つのエンハンサー配列をさらに含む。当業者は任意の既知の適切なエンハンサー配列を選択することができる。

好ましくは、コード配列は遺伝子疾患、特に遺伝性網膜変性疾患を是正することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。

さらに好ましくは、コード配列はABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、USH2a、GPR98又はALMS1から成る群より選択される。

本発明のさらなる実施態様は、
a) 5’-3’方向に：5’-逆位末端反復(5’-ITR)配列、プロモーター配列、動作可能なように前記プロモーターに結合され前記プロモーターの制御下にある前記コード配列の5’末端部分、スプライス供与シグナルの核酸配列、及び3’-逆位末端反復(3’-ITR)配列を含む第一のプラスミドを含む第一のウイルスベクター；並びに
b) 5’-3’方向に、5’-逆位末端反復(5’-ITR)配列、スプライス受容シグナルの核酸配列、前記コード配列の3’末端、ポリアデニル化シグナルの核酸配列、及び3’-逆位末端反復(3’-ITR)配列を含む第二のプラスミドを含む第二のウイルスベクター
を含むデュアルウイルスベクター系である。

好ましくは、ベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。

より好ましくは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは同一の又は異なるAAV血清型から選択される。

さらに好ましくは、アデノ随伴ウイルスは血清型2、血清型8、血清型5、血清型7又は血清型9から選択される。

本発明のさらなる実施態様は、本発明によるデュアルウイルスベクター系で形質転換された宿主細胞である。

好ましくは、宿主細胞は哺乳類細胞、ヒト細胞、網膜細胞、非胚性幹細胞である。

本発明のさらなる実施態様は、医療用途、好ましくは遺伝子治療用途、さらに好ましくは網膜変性を特徴とする病変又は疾患の治療及び/又は予防用途の、本発明のデュアルコンストラクト系、本発明のデュアルウイルスベクター系、又は本発明の宿主細胞である。好ましくは、網膜変性は遺伝性である。

さらに好ましくは、病変又は疾患は、網膜色素変性症、レーバー先天黒内障(LCA)、シュタルガルト病、アッシャー病、アルストレム症候群、ABCA4遺伝子の変異によって起こる疾患(ABCA4関連疾患とも呼ばれる)から成る群より選択される。錐体-杆体ジストロフィー3型、黄色斑眼底、加齢黄斑変性症2型、早期発症重症網膜ジストロフィー、及び網膜色素変性症19型が、ABCA4遺伝子の変異によって起こる疾患(ABCA4関連疾患)の例である。

本発明のさらなる実施態様は、本発明によるデュアルコンストラクト系、本発明によるデュアルウイルスベクター系又は本発明による宿主細胞、及び医薬的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物である。

本発明のさらなる実施態様は、それを必要とする対象への有効量の本願明細書に記載のデュアルコンストラクト系、本願明細書に記載のデュアルウイルスベクター系、又は本願明細書に記載の宿主細胞の投与を含む、網膜変性を特徴とする治療及び/又は予防する方法である。

本発明のさらなる実施態様は、組換え誘導領域として使用するための配列番号3から成る配列である。

本発明のさらなる実施態様は、配列番号3から成る配列を使用することを含む、遺伝子組換えを誘導する方法である。

本発明において、好ましくはプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質プロモーター、卵黄様黄斑ジストロフィー2プロモーターから成る群より選択される。しかし、任意の適切な周知のプロモーターを使用してもよい。

本発明において、コード配列は、天然のエキソン-エキソン接合部で第一の断片と第二の断片(5’末端部分及び3’末端部分)とに分割される。好ましくは、コード配列の各断片は10 kbを超えるべきではない。好ましくは、各5’末端部分及び3’末端部分は4.5Kb、5Kb、5.5 Kb、6 Kb、6.5 Kb、7 kb、7.5 Kb、8 Kb、8.5 Kb、9 Kb、9.5 Kb、又はより小さいサイズであってもよい。

過去10年間、遺伝子治療は臨床試験において数百もの疾患に対して応用されてきた。遺伝子をヒト細胞に送達するために、様々な手段が開発されてきた。中でも、アデノウイルスを含む、遺伝子操作されたウイルスが現在では最もよく用いられる遺伝子送達手段である。ほとんどの系は、目的の遺伝子を収容する能力があるベクター、ウイルスの構造タンパク質を与えることができるヘルパー細胞、及びベクターを含む感染性ウイルス粒子を生成させる酵素を含んでいる。アデノ随伴ウイルスは、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、ゲノム構造、病原性、並びに宿主範囲の点で異なる、ウイルスのファミリーである。この多様性により、異なる生物学的特徴を有するウイルスを用いて異なる治療用途を開発する機会が得られる。どんな送達手段でも同様だが、アデノウイルスに基づく系の効率、特定の組織又は細胞型をターゲティングする能力、目的の遺伝子の発現、及び安全性は、遺伝子治療の適用を成功させるために重要である。近年、これらの研究分野に顕著な労力が傾けられてきた。様々な遺伝子発現の変更、標的送達、ウイルス力価の改善、及び安全性の向上のために、アデノ随伴ウイルスに基づくベクター及びヘルパー細胞に様々な改変がなされてきた。本発明は、目的の遺伝子をそのようなウイルスベクターに効率的に送達するように作用するという点で、この設計過程の改善を表す。

ウイルスは遺伝子送達にとって合理的な手段である。ウイルスは細胞内で複製するので、細胞内に入って、細胞の機構を使用し自身の遺伝子を発現させる機構を発達させてきた。ウイルスに基づく遺伝子送達の概念は、目的の遺伝子を発現することができるようにウイルスを操作することである。特定の適用及びウイルスの種類によって、ウイルスベクターは、宿主において野生型ウイルスとして自由に複製する自身の能力を妨げる変異を含む。複数の異なるファミリー由来のウイルスが改変され、遺伝子送達用のウイルスベクターが作製されてきた。これらのウイルスには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、及びアルファウイルスが含まれる。本発明は好ましくはアデノ随伴ウイルスを用いる。

遺伝子送達のための理想的なアデノ随伴ウイルスに基づくベクターは、効率的で、細胞特異的で、調節されていて、安全でなければならない。治療の有効性を決定し得るので、送達の効率は重要である。現在、アデノ随伴ウイルスベクターを用いた細胞型特異的なインフェクション及び遺伝子発現を達成することに労力がかけられている。加えて、治療には長期持続性又は調節された発現が必要となる可能性があるので、目的の遺伝子の発現を調節するためにアデノ随伴ウイルスベクターが開発されている。ほとんどのウイルスは病原性であるか又は病原性の潜在力を有しているので、安全性はウイルス系遺伝子送達にとって主要な問題である。遺伝子送達中は、患者が完全な複製能力を有する病原性ウイルスまで不注意でもらわないことが重要である。

アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ヒト及びいくつかの他の霊長類の種に感染する小型のウイルスである。AAVは、現時点で疾患を引き起こさないと思われており、結果としてウイルスは非常に穏やかな免疫反応を引き起こす。AAVを用いる遺伝子治療ベクターは分裂細胞及び静止細胞の両方に感染し、染色体外の状態で宿主細胞のゲノムにインテグレーションすることなく存続する。これらの特徴により、AAVは遺伝子治療用ウイルスベクターを作製するため及び同系のヒト疾患モデルを作製するための非常に魅力的な候補である。

野生型AAVは、多くの特徴により、遺伝子治療の研究者らから相当の注目を集めてきた。中でも筆頭は、このウイルスが明らかに病原性を欠如していることである。また、このウイルスは非分裂細胞にも感染することができ、ヒト19番染色体中の特定の場所(AAVS1と呼ぶ)で宿主細胞ゲノムに安定にインテグレーションする能力を有している。この特徴により、野生型AAVはレトロウイルスよりもやや予測可能になるが、レトロウイルスはランダムに挿入されて突然変異を誘発する恐れがあり、場合によってはその後がんに発展する。AAVゲノムは言及した場所に最も頻繁にインテグレートされるが、一方でランダムなゲノムへの組み込みが無視できない頻度で起こる。しかし、遺伝子治療ベクターとしてのAAVの開発により、ベクターのDNAのrep及びcapを除去することでこのインテグレーション能力を取り除いた。遺伝の転写を推進するプロモーターと共に、所望の遺伝子を逆位末端反復(ITR)の間に挿入し、宿主細胞DNAポリメラーゼ複合体によって一本鎖のベクターDNAが二本鎖DNAに変換された後、ITRが核内でコンカテマー形成を補助する。AAVに基づく遺伝子治療ベクターは、宿主細胞の核内でエピソーム状のコンカテマーを形成する。非分裂細胞では、これらのコンカテマーは宿主細胞が生きている間無傷のまま維持される。分裂細胞では、AAVのDNAは細胞分裂を通して失われるが、これはエピソーム状のDNAは宿主細胞DNAと共に複製されないためである。AAVのDNAの宿主ゲノムへのランダムインテグレーションは検出可能だが非常に低い頻度で発生する。また、AAVは非常に低い免疫原性を呈し、一見したところ中和抗体の生成に限られているようであり、また明確に規定された細胞傷害反応を誘導しない。この特徴は、静止細胞に感染する能力と共に、ヒト遺伝子治療用ベクターとしてのアデノウイルスに対する優位性を表す。

AAVゲノム、トランスクリプトーム及びプロテオーム
AAVゲノムは、プラス鎖又はマイナス鎖のどちらかの、約4.7kbの長さの一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)からできている。ゲノムは逆位末端反復(ITR)をDNA鎖の両端に含み、2つのオープンリーディングフレーム(ORF)：rep及びcapを含む。前者はAAVの生活環に必要なRepタンパク質をコードする4つの重複する遺伝子から構成され、後者は重複するカプシドタンパク質のヌクレオチド配列：VP1、VP2及びVP3を含み、カプシドタンパク質の核酸配列は共に相互作用して正二十面体のカプシドを形成する。

ITR配列
逆位末端反復(ITR)配列は、それぞれ145塩基を含む。ITRは、その対称性によりそのように名付けられたが、その対称性はAAVゲノムの効率的な増殖に必要であることが示された。これらの配列の別の特性は、ヘアピンを形成する能力であり、これはプライマーゼ非依存的なもう一つのDNA鎖の合成を可能にする、いわゆるセルフプライミングに寄与する。また、ITRは、AAV DNAの宿主細胞ゲノム(ヒトでは19番染色体)へのインテグレーション、及びそこからの救出の両方、並びに完全に組み立てられたデオキシリボヌクレアーゼ耐性のAAV粒子の生成と同時に発生するAAV DNAのカプシド形成に必要であることが示された。

遺伝子治療に関しては、ITRは、治療的遺伝子の隣のcis中にある必要がある唯一の配列のようであり、構造遺伝子(cap)及びパッケージング(rep)遺伝子はtrans中にあってもよい。この仮定により、レポーター遺伝子又は治療的遺伝子を含む効率的な組換えAAV(rAAV)ベクター生産のための多くの方法が確立された。しかし、また、ITRは効果的な複製及びカプシド形成のためにcis中にある必要がある唯一のエレメントではないことも公開された。2、3組の研究グループが、rep遺伝子コード配列の内部にcis活性化Rep依存型エレメント(CARE)と呼ばれる配列を同定した。CAREは、cisにある場合、複製及びカプシド形成を増大させることが示された。

2006年時点において、11のAAV血清型が説明され、11番目は2004年に説明された。既知の血清型の全てが複数の多様な種類の組織由来の細胞に感染することができる。組織特異性はカプシド血清型により決定され、AAVベクターの親和性(tropism)範囲を変更するためのシュードタイピングが、治療での使用に重要になるであろう。本発明において、 AVV血清型2及び血清型5のITRが好ましい。

血清型2
血清型2(AAV2)は、これまで最も広範囲において試験されてきた。AAV2は、骨格筋、神経、血管平滑筋細胞および肝細胞に対して野生型の親和性を呈する。

AAV2に関して3種類の細胞受容体が説明されてきた：ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)、avβ5インテグリン及び線維芽細胞増殖因子受容体1(FGFR-1)である。最初のものは主受容体として機能するが、一方後の2つは副受容体活性を有し、受容体性エンドサイトーシスによりAAVを細胞内に進入させる。これらの試験結果に対し、Qiu、Handaらは意義を唱えている。HSPGは主受容体として機能するが、細胞外マトリックスに多量に存在するとAAV粒子を除去し、インフェクション効率を下げる可能性がある。

血清型2とがん
研究により、ウイルスの血清型2(AAV-2)が、一見したところ健康な細胞を害することなくがん細胞を殺していることが示された。PennsylvaniaのPenn State College of Medicineの免疫学及び微生物学の教授、Craig Meyersは、「我々の結果は、集団の大部分に感染するが既知の病的影響が無いアデノ随伴ウイルス2型が、多くの種類のがん細胞を殺し、なお健康な細胞に影響を与えないということを示唆している。」と述べている。これは新たな抗がん剤にはつながらなかった。

他の血清型
AAVに基づく様々な研究において、AAV2は最もよく用いられる血清型であるが、他の血清型の方が遺伝子送達ベクターとしてより効果的である可能性が示されている。例えばAAV6は気道上皮細胞への感染に関してはるかに優れているように思われ、AAV7はマウス骨格筋細胞の非常に高い形質導入率を呈し(AAV1及びAAV5に類似)、AAV8は幹細胞の形質導入において非常に優れており、AAV1及び5は血管内皮細胞への遺伝子送達において非常に効率的であることが示された。脳では、ほとんどのAAV血清型が神経親和性を示すが、さらにAAV5はアストロサイトをも形質導入する。AAV6は、AAV1とAAV2とのハイブリッドであるが、AAV2よりも低い免疫原性を示す。

血清型は、結合する受容体に関して異なる可能性がある。例えば、AAV4及びAAV5の形質導入は、(これらの血清型それぞれによって異なる形態の)可溶性シアル酸によって阻害される可能性があり、AAV5は血小板由来の成長因子受容体を介して細胞内に進入することが示された。

本発明において、本発明の送達ビヒクルを患者に投与してもよい。当業者は適切な用量比率を決定することができる。用語「投与する」には、ウイルス性及び非ウイルス性の技術による送達が含まれる。ウイルス性送達機構には、上述のアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクター等が含まれるが、これに限定されない。非ウイルス性送達機構には、脂質性トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性面状両親媒性(CFA)及びこれらの組み合わせが含まれる。

本発明のベクター系による一種以上の治療遺伝子の送達は、単独で用いてもよく、又は他の治療及び治療の組成物と組み合わせて用いてもよい。

また、本発明は、遺伝子治療により個体を治療するための医薬組成物も提供し、組成物は、一種以上の送達可能な治療用及び/又は診断用の導入遺伝子を含む、治療的有効量の本発明のベクター/コンストラクト又は宿主細胞、又は同様に作製された若しくは得られたウイルス粒子を含む。医薬組成物はヒト用であってもよいし、動物用であってもよい。典型的には、医師は個々の対象に最も適している実際の投与量を決定するが、その投与量は年齢、体重及び特定の個体の反応によって異なる。組成物は、医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを任意選択で含んでもよい。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的な医薬実務に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤及び希釈剤として、又はそれらに加えて、適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、及びウイルスの標的部位への侵入を補助する又は向上させる他の担体物質(例えば脂質送達系など)を含んでもよい。適切な場合には、医薬組成物は、吸入、座薬若しくはペッサリーの形態で、ローション、液剤、クリーム、軟膏若しくは散布剤の形態で局所的に、皮膚用パッチ剤の使用により、デンプン若しくは乳糖等の賦形剤を含む錠剤の形態、又はカプセル若しくはオビュール(ovule)を単体又は賦形剤との混合剤のいずれか、又は香味剤若しくは着色剤を含むエリキシル剤、液剤若しくは懸濁液の形態において経口で、の任意の一種以上により投与することができ、又は非経口、例えば海綿体内、静脈内、筋肉内又は皮下に注射することもできる。非経口投与の場合、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするために十分な量の塩又は単糖類を含有する滅菌水性溶液の形態で最もよく用いられてもよい。口腔内又は舌下投与の場合、組成物は従来の方法で調製することができる錠剤又はトローチの形態で投与されてもよい。

当業者は、ポリヌクレオチド又は核酸を宿主細胞内に組み込むための標準的な方法、例えばトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインシェクション、ウイルスインフェクション、熱ショック、膜の化学的透過処理後の形質転換、又は細胞融合を十分に認識している。

本願明細書で用いられる用語「宿主細胞又は遺伝子操作された宿主細胞」は、既に説明したコンストラクト若しくはベクターを用いて形質導入された、形質転換された、又はトランスフェクションされた宿主細胞に関する。

適切な宿主細胞の代表的な例として、大腸菌(E. coli)、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)等の細菌細胞、酵母等の真菌細胞、Sf9等の昆虫細胞、CHO又はCOS等の動物細胞、植物細胞等を挙げることができる。適切な宿主を選択することは、本願の教示から当業者の範囲内のものとみなされる。

好ましくは、前記宿主細胞は動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。

本発明は、本願明細書で説明される任意の組換え発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、培養細胞であってもよく、又は一次細胞、すなわち生物、例えばヒトから直接単離したものであってもよい。宿主細胞は、接着細胞であってもよく、又は浮遊細胞、すなわち懸濁液中で増殖する細胞であってもよい。適切な細胞は当該技術分野で周知であり、例えば、DH5α、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルVERO細胞、COS細胞、HEK293細胞等が含まれる。

「材料と方法」
AAVベクタープラスミドの作製
AAVベクター作製に用いられたプラスミドは、AAV血清型2の逆位末端反復(ITR)を含むpZac2.1 (52)又はpAAV2.1 (53)のいずれかのプラスミド由来であった(表1)。

注）CMV：サイトメガロウイルスプロモーター、CBA：ニワトリβ-アクチンプロモーター、RHO：ヒトロドプシンプロモーター、RHOK：ヒトロドプシンキナーゼプロモーター、Vmd2：卵黄様黄斑ジストロフィー2プロモーター、EGFP：強化緑色蛍光タンパク質、ABCA4：ヒトATP結合カセットサブファミリーA、メンバー4、MYO7A：ヒトミオシンVIIA、SV40：シミアンウイルス40ポリアデニル化シグナル、BGH：ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、3xflag：3xflagタグ、HA：ヘマグルチニンタグ、AP：アルカリホスファターゼ組換え領域、AK：F1ファージ組換え誘導領域、TS：トランス-スプライシング、ITR5:2：AAV血清型5由来の左ITR及びAAV血清型2由来の右ITRを有するプラスミド、ITR2:5：AAV血清型2由来の左ITR及びAAV血清型5由来の右ITRを有するプラスミド。特定されていない場合、左ITR及び右ITRはAAV血清型2由来である。

標準サイズ及び特大のAAVベクタープラスミドは、プロモーター、全長の導入遺伝子CDS及びポリアデニル化シグナル(pA)を含む全長の発現カセットを含んでいた(表1)。デュアルAAVベクターを生成するために必要な二つの別個のAAVベクタープラスミド(5’及び3’)は、プロモーター及びそれに続く導入遺伝子CDSのN-末端部分を含む(5’プラスミド)か、導入遺伝子CDSのC-末端部分及びそれに続くpAシグナルを含んでいた(3’プラスミド、表1)。標準サイズのEGFPプラスミドを、pAAV2.1-CMV-EGFPプラスミドのEGFP CDS(720 bp) (53)をpZac2.1 (52)にクローニングすることにより作製した。特大EGFPを、pAAV2.1-CMV-EGFP(53)を基に、ヒトABCA4 (NM_000350.2, bp 1960-5591)由来の3632 bpのDNAスタッファー配列をCMVプロモーターの上流に挿入し、マウスABCA4 (NM 007378.1, 1066-1 及び 7124-6046 bp; 計2145 bp)及びヒトHarmonin (NM153676.3 131-1606 bp; 計1476 bp)から構成される3621 bpの第二のDNAスタッファー配列をpAシグナルの下流に挿入することにより作製した(このコンストラクトを図1a、d、図4及び図15の試験に用いた)。デュアルAAVベクタープラスミドを生成するために、EGFP CDS (720 bp)を2つのコンストラクトに分割した：一方はN-末端CDS(PMID: 9759496, bp 1-393)を含み、他方はC-末端CDS (PMID: 9759496, bp 394-720)を含んでいる。

特大ABCA4プラスミドは、全長のヒトABCA4 CDS (GeneNM_000350.2, bp 105-6926)を含み、一方特大MYO7Aプラスミドは、全長のヒトMYO7A CDSアイソフォーム1由来(NM_000260.3, bp 273-6920)を含む。デュアルAAV OVベクター用プラスミドを作製するために、ABCA4及びMYO7A CDSを、一方はN-末端CDS (ABCA4: NM_000350.2, bp 105-3588; MYO7A: NM_000350.2, bp 273-3782)を含み、他方はC-末端CDS (ABCA4: NM_000350.2, bp 2819-6926; MYO7A: NM_000350.2, bp 2913-6920)を含む2つのコンストラクトに分割した。従って、重複ベクタープラスミドによって共有される相同領域は、ABCA4については770bp、及びMYO7Aについては870 bpであった。デュアルAAV OVベクター用のプラスミドを作製するために、ヒトCEP290 CDSを、一方はN-末端CDS (CEP290: NM_025114,bp 345-4076)を含み、他方はC-末端CDS (CEP290: NM_025114, bp 3575-7784)を含む2つのコンストラクトに分割した。従って、重複ベクタープラスミドによって共有される相同領域は、502 bpであった。

トランス-スプライシング及びハイブリッドのベクタープラスミドを作製するために、ABCA4及びMYO7A CDSを、天然のエキソン-エキソン接合部で分割した。ABCA4は、エキソン19-20の間で分割し(5’-側：NM_000350.2, 105-3022 bp；3’-側：NM_000350.2, bp 3023-6926)、MYO7Aは、エキソン24-25の間で分割した(5’-側：NM_000350.2, bp 273-3380；3’-側：NM_000350.2, bp 3381-6926)。ABCA4及びMYO7Aタンパク質に、どちらもC-末端でタグ付けした：ABCA4は3xflag (gactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaag)又はヘマグルチニン(HA)タグ (tatccgtatgatgtgccggattatgcg)のいずれか、MYO7AはHAタグのみを用いた。トランス-スプライシング及びハイブリッドのベクタープラスミドを作製するために、CEP290 CDSを、天然のエキソン-エキソン接合部でエキソン29-30の間で分割した(5’-側： NM_025114, 345-3805；3’-側： NM_025114, 3806-7784)。CEP290タンパク質を、C-末端で、ヘマグルチニン(HA)タグを用いてタグ付けした。トランス-スプライシング及びハイブリッドのデュアルAAVベクタープラスミドに含まれるスプライス供与(SD)及びスプライス受容(SA)シグナルは、以下の通りである：
5’GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT-3’ (SD) 配列番号1；
5’GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG-3’ (SA)、配列番号2。ハイブリッドAPベクタープラスミドに含まれる組換え誘導配列(第一のプラスミド及び第二のプラスミドの両方に存在する)は、上述した通り(39)、アルカリホスファターゼ(AP)遺伝子(NM_001632, bp 823-1100)由来であった。ハイブリッドAKベクタープラスミドに含まれる組換え誘導配列(第一のプラスミド及び第二のプラスミドの両方に存在する)は、ファージF1ゲノム(Gene Bankアクセッション番号: J02448.1; bp 5850-5926)由来であった。AK配列は、
5’GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT-3’、配列番号3である。

ユビキタスなCMVプロモーターは、pZac2.1 (52)、又はpAAV2.1-CMV-EGFP (53)に含まれるものである。ユビキタスなCBAプロモーターは、pAAV2.1-CBA-EGFP (11)由来であった。PR-特異的なヒトRHO及びRHOKプロモーターは、それぞれpAAV2.1-RHO-EGFP及びpAAV2.1RHOK-EGFP由来であった(10)。RPE-特異的なVmd2プロモーター(NG_009033.1, 4870-5470bp)は、上述のEcoRI-XcmIプロモーター断片(41)に対応し、ヒトゲノムDNAによって増幅された。

AAV血清型2及び5由来の異種ITRを有するデュアルAAVハイブリッドAKベクターを作製するために、5’-側プラスミドの左ITR2及び3’-側プラスミドの右ITR2を、ITR5と交換した(図17aに図示)。異種ITRを有するAAV2ベクター作製のためのプラスミドは以下の通りである：pZac5:2-CMV-5’ABCA4-SD-AK、pZac2:5-AK-SD-3’ABCA4-3xflag、pAAV5:2-CBA-5’MYO7A-SD-AK及びpAAV2:5-AK-SD-3’MYO7A-HA (表1)。

配列
ABCA4遺伝子
pZac2.1-CMV-ABCA4 _5’AK

左ITR2
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (配列番号4)

左ITR5
CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGCAGCTCAAAGAGCTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCAAGCAAGGGGGTTTTGTAAGCAGTGA (配列番号5)

CMVエンハンサー
TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGAC (配列番号6)

CMV プロモーター
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGT (配列番号7)

キメライントロン
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (配列番号8)

Abca4 5’
ATGGGCTTCGTGAGACAGATACAGCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAAGGCAAAAGATTCGCTTTGTGGTGGAACTCGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCTGGTTAAGGAATGCCAACCCGCTCTACAGCCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGCCCTCAGCAGGAATGCTGCCGTGGCTCCAGGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTCAAAGCCCCACCCCAGGAGAATCTCCTGGAATTGTGTCAAACTATAACAACTCCATCTTGGCAAGGGTATATCGAGATTTTCAAGAACTCCTCATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGTATTTGGACAGAGCTACACATCTTGTCCCAATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAGAATTGCAGGAAGAGGAATTCGAATAAGGGATATCTTGAAAGATGAAGAAACACTGACACTATTTCTCATTAAAAACATCGGCCTGTCTGACTCAGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTCCGTCCAGAGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGACCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGAGGCCCTCCTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCAGAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATGCCCTGTGCTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTGGATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTGGACTTCTTCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACTCCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAATCTGAGATCTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTCACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATCGGCCGAGTATGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCCCCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAGACCTTTACAAAGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCTGTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGGCTCTCGGGTGCTCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAACTATAAGGCCTTTCTGGGGATTGACTCCACAAGGAAGGATCCTATCTATTCTTATGACAGAAGAACAACATCCTTTTGTAATGCATTGATCCAGAGCCTGGAGTCAAATCCTTTAACCAAAATCGCTTGGAGGGCGGCAAAGCCTTTGCTGATGGGAAAAATCCTGTACACTCCTGATTCACCTGCAGCACGAAGGATACTGAAGAATGCCAACTCAACTTTTGAAGAACTGGAACACGTTAGGAAGTTGGTCAAAGCCTGGGAAGAAGTAGGGCCCCAGATCTGGTACTTCTTTGACAACAGCACACAGATGAACATGATCAGAGATACCCTGGGGAACCCAACAGTAAAAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGAAGAAGGTATTACTGCTGAAGCCATCCTAAACTTCCTCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGCTGACGACATGGCCAACTTCGACTGGAGGGACATATTTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCTTGTCAATCAATACCTGGAGTGCTTGGTCCTGGATAAGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCAGCTCACCCAACGTGCCCTCTCTCTACTGGAGGAAAACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCCTGACATGTATCCCTGGACCAGCTCTCTACCACCCCACGTGAAGTATAAGATCCGAATGGACATAGACGTGGTGGAGAAAACCAATAAGATTAAAGACAGGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGATCCCGTGGAAGATTTCCGGTACATCTGGGGCGGGTTTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACAGGGGATCACAAGGAGCCAGGTGCAGGCGGAGGCTCCAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCCCTACCCCTGCTTCGTGGACGATTCTTTCATGATCATCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCATGGTGCTGGCATGGATCTACTCTGTCTCCATGACTGTGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTTGCGACTGAAGGAGACCTTGAAAAATCAGGGTGTCTCCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTTCCTGGACAGCTTCTCCATCATGTCGATGAGCATCTTCCTCCTGACGATATTCATCATGCATGGAAGAATCCTACATTACAGCGACCCATTCATCCTCTTCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGCCACCATCATGCTGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCTTCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTGTAGTGGTGTCATCTATTTCACCCTCTACCTGCCACACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCGCATGACCGCTGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTACTGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCACTGAGTACCTGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGGGGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAGTCCCACGGAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGTCCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTGCTGTCTATGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGGTGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCACTTCCTTGGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGCTTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAGAGAAGAAAGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAGAGGAAACGGAGGATCCAGAGCACCCAGAAGGAATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATCCAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGCGTGAAGAATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGCCAGCTGTGGACCGTCTGAACATCACCTTCTACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACAATGGAGCTGGGAAAACCACCACCTT (配列番号9)

スプライス供与シグナル
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (配列番号1)

AK
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT (配列番号3)

右ITR2 (又は5’ ITR2)
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号10)

pZac2.1-CMV-ABCA4 _5’AKの全長配列
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGCCATGGGCTTCGTGAGACAGATACAGCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAAGGCAAAAGATTCGCTTTGTGGTGGAACTCGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCTGGTTAAGGAATGCCAACCCGCTCTACAGCCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGCCCTCAGCAGGAATGCTGCCGTGGCTCCAGGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTCAAAGCCCCACCCCAGGAGAATCTCCTGGAATTGTGTCAAACTATAACAACTCCATCTTGGCAAGGGTATATCGAGATTTTCAAGAACTCCTCATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGTATTTGGACAGAGCTACACATCTTGTCCCAATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAGAATTGCAGGAAGAGGAATTCGAATAAGGGATATCTTGAAAGATGAAGAAACACTGACACTATTTCTCATTAAAAACATCGGCCTGTCTGACTCAGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTCCGTCCAGAGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGACCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGAGGCCCTCCTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCAGAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATGCCCTGTGCTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTGGATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTGGACTTCTTCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACTCCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAATCTGAGATCTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTCACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATCGGCCGAGTATGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCCCCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAGACCTTTACAAAGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCTGTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGGCTCTCGGGTGCTCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAACTATAAGGCCTTTCTGGGGATTGACTCCACAAGGAAGGATCCTATCTATTCTTATGACAGAAGAACAACATCCTTTTGTAATGCATTGATCCAGAGCCTGGAGTCAAATCCTTTAACCAAAATCGCTTGGAGGGCGGCAAAGCCTTTGCTGATGGGAAAAATCCTGTACACTCCTGATTCACCTGCAGCACGAAGGATACTGAAGAATGCCAACTCAACTTTTGAAGAACTGGAACACGTTAGGAAGTTGGTCAAAGCCTGGGAAGAAGTAGGGCCCCAGATCTGGTACTTCTTTGACAACAGCACACAGATGAACATGATCAGAGATACCCTGGGGAACCCAACAGTAAAAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGAAGAAGGTATTACTGCTGAAGCCATCCTAAACTTCCTCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGCTGACGACATGGCCAACTTCGACTGGAGGGACATATTTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCTTGTCAATCAATACCTGGAGTGCTTGGTCCTGGATAAGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCAGCTCACCCAACGTGCCCTCTCTCTACTGGAGGAAAACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCCTGACATGTATCCCTGGACCAGCTCTCTACCACCCCACGTGAAGTATAAGATCCGAATGGACATAGACGTGGTGGAGAAAACCAATAAGATTAAAGACAGGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGATCCCGTGGAAGATTTCCGGTACATCTGGGGCGGGTTTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACAGGGGATCACAAGGAGCCAGGTGCAGGCGGAGGCTCCAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCCCTACCCCTGCTTCGTGGACGATTCTTTCATGATCATCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCATGGTGCTGGCATGGATCTACTCTGTCTCCATGACTGTGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTTGCGACTGAAGGAGACCTTGAAAAATCAGGGTGTCTCCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTTCCTGGACAGCTTCTCCATCATGTCGATGAGCATCTTCCTCCTGACGATATTCATCATGCATGGAAGAATCCTACATTACAGCGACCCATTCATCCTCTTCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGCCACCATCATGCTGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCTTCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTGTAGTGGTGTCATCTATTTCACCCTCTACCTGCCACACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCGCATGACCGCTGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTACTGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCACTGAGTACCTGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGGGGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAGTCCCACGGAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGTCCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTGCTGTCTATGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGGTGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCACTTCCTTGGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGCTTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAGAGAAGAAAGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAGAGGAAACGGAGGATCCAGAGCACCCAGAAGGAATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATCCAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGCGTGAAGAATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGCCAGCTGTGGACCGTCTGAACATCACCTTCTACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACAATGGAGCTGGGAAAACCACCACCTTGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCCAATTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号11)

pZac2.1-ABCA4 _3’AK_SV40

左ITR2
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (配列番号4)

AK
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT (配列番号3)

スプライス受容シグナル
GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (配列番号2)

Abca4_3’
GTCCATCCTGACGGGTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGGGACATTGAAACCAGCCTGGATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATCCTGTTCCACCACCTCACGGTGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCCCAGGAGGAGGCCCAGCTGGAGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGGAATGAAGAGGCTCAGGACCTATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTTGTGGGAGATGCCAAGGTGGTGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAGACGCTCAATCTGGGATCTGCTCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTCACCACATGGACGAGGCCGACCTCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTCTACTGCTCAGGCACCCCACTCTTCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTTGGTGCGCAAGATGAAAAACATCCAGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCTCGTCTAAGGGTTTCTCCACCACGTGTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTCCTGGATGGGGATGTAAATGAGCTGATGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCTGGTGGAGTGCATTGGTCAAGAACTTATCTTCCTTCTTCCAAATAAGAACTTCAAGCACAGAGCATATGCCAGCCTTTTCAGAGAGCTGGAGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTTGGAATTTCTGACACTCCCCTGGAAGAGATTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGGACCTCTGTTTGCGGGTGGCGCTCAGCAGAAAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCTTGGGTCCCAGAGAGAAGGCTGGACAGACACCCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCGCCGGCTGCTCACCCAGAGGGCCAGCCTCCCCCAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAACACGGGGACACAGCTGGTCCTCCAGCATGTGCAGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACACCATCCGCAGCCACAAGGACTTCCTGGCGCAGATCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTGGCTCTGATGCTTTCTATTGTTATCCCTCCTTTTGGCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCCCTGGATATATGGGCAGCAGTACACCTTCTTCAGCATGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCACGGTACTTGCAGACGTCCTCCTGAATAAGCCAGGCTTTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGGTGGCTTCCGGAGTACCCCTGTGGCAACTCAACACCCTGGAAGACTCCTTCTGTGTCCCCAAACATCACCCAGCTGTTCCAGAAGCAGAAATGGACACAGGTCAACCCTTCACCATCCTGCAGGTGCAGCACCAGGGAGAAGCTCACCATGCTGCCAGAGTGCCCCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCGCCCCCCCAGAGAACACAGCGCAGCACGGAAATTCTACAAGACCTGACGGACAGGAACATCTCCGACTTCTTGGTAAAAACGTATCCTGCTCTTATAAGAAGCAGCTTAAAGAGCAAATTCTGGGTCAATGAACAGAGGTATGGAGGAATTTCCATTGGAGGAAAGCTCCCAGTCGTCCCCATCACGGGGGAAGCACTTGTTGGGTTTTTAAGCGACCTTGGCCGGATCATGAATGTGAGCGGGGGCCCTATCACTAGAGAGGCCTCTAAAGAAATACCTGATTTCCTTAAACATCTAGAAACTGAAGACAACATTAAGGTGTGGTTTAATAACAAAGGCTGGCATGCCCTGGTCAGCTTTCTCAATGTGGCCCACAACGCCATCTTACGGGCCAGCCTGCCTAAGGACAGAAGCCCCGAGGAGTATGGAATCACCGTCATTAGCCAACCCCTGAACCTGACCAAGGAGCAGCTCTCAGAGATTACAGTGCTGACCACTTCAGTGGATGCTGTGGTTGCCATCTGCGTGATTTTCTCCATGTCCTTCGTCCCAGCCAGCTTTGTCCTTTATTTGATCCAGGAGCGGGTGAACAAATCCAAGCACCTCCAGTTTATCAGTGGAGTGAGCCCCACCACCTACTGGGTAACCAACTTCCTCTGGGACATCATGAATTATTCCGTGAGTGCTGGGCTGGTGGTGGGCATCTTCATCGGGTTTCAGAAGAAAGCCTACACTTCTCCAGAAAACCTTCCTGCCCTTGTGGCACTGCTCCTGCTGTATGGATGGGCGGTCATTCCCATGATGTACCCAGCATCCTTCCTGTTTGATGTCCCCAGCACAGCCTATGTGGCTTTATCTTGTGCTAATCTGTTCATCGGCATCAACAGCAGTGCTATTACCTTCATCTTGGAATTATTTGAGAATAACCGGACGCTGCTCAGGTTCAACGCCGTGCTGAGGAAGCTGCTCATTGTCTTCCCCCACTTCTGCCTGGGCCGGGGCCTCATTGACCTTGCACTGAGCCAGGCTGTGACAGATGTCTATGCCCGGTTTGGTGAGGAGCACTCTGCAAATCCGTTCCACTGGGACCTGATTGGGAAGAACCTGTTTGCCATGGTGGTGGAAGGGGTGGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTGGTCCAGCGCCACTTCTTCCTCTCCCAATGGATTGCCGAGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGATGAAGATGATGATGTGGCTGAAGAAAGACAAAGAATTATTACTGGTGGAAATAAAACTGACATCTTAAGGCTACATGAACTAACCAAGATTTATCCAGGCACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTGTGTGTCGGAGTTCGCCCTGGAGAGTGCTTTGGCCTCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACAACCACATTCAAGATGCTCACTGGGGACACCACAGTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGCAAGAGTATTTTAACCAATATTTCTGAAGTCCATCAAAATATGGGCTACTGTCCTCAGTTTGATGCAATCGATGAGCTGCTCACAGGACGAGAACATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTACCAGCAGAAGAAATCGAAAAGGTTGCAAACTGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTACGCCGACTGCCTGGCTGGCACGTACAGTGGGGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCACTCATTGGCTGCCCACCGCTGGTGCTGCTGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCACGCCGCATGCTGTGGAACGTCATCGTGAGCATCATCAGAGAAGGGAGGGCTGTGGTCCTCACATCCCACAGCATGGAAGAATGTGAGGCACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCCTTTCGATGTATGGGCACCATTCAGCATCTCAAGTCCAAATTTGGAGATGGCTATATCGTCACAATGAAGATCAAATCCCCGAAGGACGACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTCCAGGGGAACTTCCCAGGCAGTGTGCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTCTCCTCCTCCTCCCTGGCGAGGATCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATCGAGGAGTACTCAGTCACACAGACCACACTGGACCAGGTGTTTGTAAATTTTGCTAAACAGCAGACTGAAAGTCATGACCTCCCTCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGACGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTGAGCGGCCGC (配列番号12)

Sv40 polyA
TTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTAC (配列番号13)

右ITR2
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号10)

右ITR5
TCACTGCTTACAAAACCCCCTTGCTTGAGAGTGTGGCACTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGCGACGGCCAGAGGGCCGTCGTCTGGCAGCTCTTTGAGCTGCCACCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAG (配列番号14)

pZac2.1-ABCA4 _3’AK_SV40の全長配列
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGATCCGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTCCATCCTGACGGGTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGGGACATTGAAACCAGCCTGGATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATCCTGTTCCACCACCTCACGGTGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCCCAGGAGGAGGCCCAGCTGGAGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGGAATGAAGAGGCTCAGGACCTATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTTGTGGGAGATGCCAAGGTGGTGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAGACGCTCAATCTGGGATCTGCTCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTCACCACATGGACGAGGCCGACCTCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTCTACTGCTCAGGCACCCCACTCTTCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTTGGTGCGCAAGATGAAAAACATCCAGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCTCGTCTAAGGGTTTCTCCACCACGTGTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTCCTGGATGGGGATGTAAATGAGCTGATGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCTGGTGGAGTGCATTGGTCAAGAACTTATCTTCCTTCTTCCAAATAAGAACTTCAAGCACAGAGCATATGCCAGCCTTTTCAGAGAGCTGGAGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTTGGAATTTCTGACACTCCCCTGGAAGAGATTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGGACCTCTGTTTGCGGGTGGCGCTCAGCAGAAAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCTTGGGTCCCAGAGAGAAGGCTGGACAGACACCCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCGCCGGCTGCTCACCCAGAGGGCCAGCCTCCCCCAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAACACGGGGACACAGCTGGTCCTCCAGCATGTGCAGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACACCATCCGCAGCCACAAGGACTTCCTGGCGCAGATCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTGGCTCTGATGCTTTCTATTGTTATCCCTCCTTTTGGCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCCCTGGATATATGGGCAGCAGTACACCTTCTTCAGCATGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCACGGTACTTGCAGACGTCCTCCTGAATAAGCCAGGCTTTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGGTGGCTTCCGGAGTACCCCTGTGGCAACTCAACACCCTGGAAGACTCCTTCTGTGTCCCCAAACATCACCCAGCTGTTCCAGAAGCAGAAATGGACACAGGTCAACCCTTCACCATCCTGCAGGTGCAGCACCAGGGAGAAGCTCACCATGCTGCCAGAGTGCCCCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCGCCCCCCCAGAGAACACAGCGCAGCACGGAAATTCTACAAGACCTGACGGACAGGAACATCTCCGACTTCTTGGTAAAAACGTATCCTGCTCTTATAAGAAGCAGCTTAAAGAGCAAATTCTGGGTCAATGAACAGAGGTATGGAGGAATTTCCATTGGAGGAAAGCTCCCAGTCGTCCCCATCACGGGGGAAGCACTTGTTGGGTTTTTAAGCGACCTTGGCCGGATCATGAATGTGAGCGGGGGCCCTATCACTAGAGAGGCCTCTAAAGAAATACCTGATTTCCTTAAACATCTAGAAACTGAAGACAACATTAAGGTGTGGTTTAATAACAAAGGCTGGCATGCCCTGGTCAGCTTTCTCAATGTGGCCCACAACGCCATCTTACGGGCCAGCCTGCCTAAGGACAGAAGCCCCGAGGAGTATGGAATCACCGTCATTAGCCAACCCCTGAACCTGACCAAGGAGCAGCTCTCAGAGATTACAGTGCTGACCACTTCAGTGGATGCTGTGGTTGCCATCTGCGTGATTTTCTCCATGTCCTTCGTCCCAGCCAGCTTTGTCCTTTATTTGATCCAGGAGCGGGTGAACAAATCCAAGCACCTCCAGTTTATCAGTGGAGTGAGCCCCACCACCTACTGGGTAACCAACTTCCTCTGGGACATCATGAATTATTCCGTGAGTGCTGGGCTGGTGGTGGGCATCTTCATCGGGTTTCAGAAGAAAGCCTACACTTCTCCAGAAAACCTTCCTGCCCTTGTGGCACTGCTCCTGCTGTATGGATGGGCGGTCATTCCCATGATGTACCCAGCATCCTTCCTGTTTGATGTCCCCAGCACAGCCTATGTGGCTTTATCTTGTGCTAATCTGTTCATCGGCATCAACAGCAGTGCTATTACCTTCATCTTGGAATTATTTGAGAATAACCGGACGCTGCTCAGGTTCAACGCCGTGCTGAGGAAGCTGCTCATTGTCTTCCCCCACTTCTGCCTGGGCCGGGGCCTCATTGACCTTGCACTGAGCCAGGCTGTGACAGATGTCTATGCCCGGTTTGGTGAGGAGCACTCTGCAAATCCGTTCCACTGGGACCTGATTGGGAAGAACCTGTTTGCCATGGTGGTGGAAGGGGTGGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTGGTCCAGCGCCACTTCTTCCTCTCCCAATGGATTGCCGAGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGATGAAGATGATGATGTGGCTGAAGAAAGACAAAGAATTATTACTGGTGGAAATAAAACTGACATCTTAAGGCTACATGAACTAACCAAGATTTATCCAGGCACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTGTGTGTCGGAGTTCGCCCTGGAGAGTGCTTTGGCCTCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACAACCACATTCAAGATGCTCACTGGGGACACCACAGTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGCAAGAGTATTTTAACCAATATTTCTGAAGTCCATCAAAATATGGGCTACTGTCCTCAGTTTGATGCAATCGATGAGCTGCTCACAGGACGAGAACATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTACCAGCAGAAGAAATCGAAAAGGTTGCAAACTGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTACGCCGACTGCCTGGCTGGCACGTACAGTGGGGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCACTCATTGGCTGCCCACCGCTGGTGCTGCTGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCACGCCGCATGCTGTGGAACGTCATCGTGAGCATCATCAGAGAAGGGAGGGCTGTGGTCCTCACATCCCACAGCATGGAAGAATGTGAGGCACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCCTTTCGATGTATGGGCACCATTCAGCATCTCAAGTCCAAATTTGGAGATGGCTATATCGTCACAATGAAGATCAAATCCCCGAAGGACGACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTCCAGGGGAACTTCCCAGGCAGTGTGCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTCTCCTCCTCCTCCCTGGCGAGGATCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATCGAGGAGTACTCAGTCACACAGACCACACTGGACCAGGTGTTTGTAAATTTTGCTAAACAGCAGACTGAAAGTCATGACCTCCCTCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGACTGAGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号15)

pZac2.1-CMV-ABCA4 _5’TS
pZac2.1-CMV-ABCA4 _5’TSの全長配列
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGCCATGGGCTTCGTGAGACAGATACAGCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAAGGCAAAAGATTCGCTTTGTGGTGGAACTCGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCTGGTTAAGGAATGCCAACCCGCTCTACAGCCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGCCCTCAGCAGGAATGCTGCCGTGGCTCCAGGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTCAAAGCCCCACCCCAGGAGAATCTCCTGGAATTGTGTCAAACTATAACAACTCCATCTTGGCAAGGGTATATCGAGATTTTCAAGAACTCCTCATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGTATTTGGACAGAGCTACACATCTTGTCCCAATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAGAATTGCAGGAAGAGGAATTCGAATAAGGGATATCTTGAAAGATGAAGAAACACTGACACTATTTCTCATTAAAAACATCGGCCTGTCTGACTCAGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTCCGTCCAGAGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGACCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGAGGCCCTCCTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCAGAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATGCCCTGTGCTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTGGATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTGGACTTCTTCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACTCCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAATCTGAGATCTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTCACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATCGGCCGAGTATGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCCCCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAGACCTTTACAAAGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCTGTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGGCTCTCGGGTGCTCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAACTATAAGGCCTTTCTGGGGATTGACTCCACAAGGAAGGATCCTATCTATTCTTATGACAGAAGAACAACATCCTTTTGTAATGCATTGATCCAGAGCCTGGAGTCAAATCCTTTAACCAAAATCGCTTGGAGGGCGGCAAAGCCTTTGCTGATGGGAAAAATCCTGTACACTCCTGATTCACCTGCAGCACGAAGGATACTGAAGAATGCCAACTCAACTTTTGAAGAACTGGAACACGTTAGGAAGTTGGTCAAAGCCTGGGAAGAAGTAGGGCCCCAGATCTGGTACTTCTTTGACAACAGCACACAGATGAACATGATCAGAGATACCCTGGGGAACCCAACAGTAAAAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGAAGAAGGTATTACTGCTGAAGCCATCCTAAACTTCCTCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGCTGACGACATGGCCAACTTCGACTGGAGGGACATATTTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCTTGTCAATCAATACCTGGAGTGCTTGGTCCTGGATAAGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCAGCTCACCCAACGTGCCCTCTCTCTACTGGAGGAAAACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCCTGACATGTATCCCTGGACCAGCTCTCTACCACCCCACGTGAAGTATAAGATCCGAATGGACATAGACGTGGTGGAGAAAACCAATAAGATTAAAGACAGGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGATCCCGTGGAAGATTTCCGGTACATCTGGGGCGGGTTTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACAGGGGATCACAAGGAGCCAGGTGCAGGCGGAGGCTCCAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCCCTACCCCTGCTTCGTGGACGATTCTTTCATGATCATCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCATGGTGCTGGCATGGATCTACTCTGTCTCCATGACTGTGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTTGCGACTGAAGGAGACCTTGAAAAATCAGGGTGTCTCCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTTCCTGGACAGCTTCTCCATCATGTCGATGAGCATCTTCCTCCTGACGATATTCATCATGCATGGAAGAATCCTACATTACAGCGACCCATTCATCCTCTTCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGCCACCATCATGCTGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCTTCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTGTAGTGGTGTCATCTATTTCACCCTCTACCTGCCACACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCGCATGACCGCTGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTACTGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCACTGAGTACCTGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGGGGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAGTCCCACGGAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGTCCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTGCTGTCTATGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGGTGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCACTTCCTTGGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGCTTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAGAGAAGAAAGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAGAGGAAACGGAGGATCCAGAGCACCCAGAAGGAATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATCCAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGCGTGAAGAATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGCCAGCTGTGGACCGTCTGAACATCACCTTCTACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACAATGGAGCTGGGAAAACCACCACCTTGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTCAATTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号16)

pZac2.1-ABCA4 _3’TS_SV40
pZac2.1-ABCA4 _3’TS_SV40の全長配列
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTCCATCCTGACGGGTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGGGACATTGAAACCAGCCTGGATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATCCTGTTCCACCACCTCACGGTGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCCCAGGAGGAGGCCCAGCTGGAGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGGAATGAAGAGGCTCAGGACCTATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTTGTGGGAGATGCCAAGGTGGTGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAGACGCTCAATCTGGGATCTGCTCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTCACCACATGGACGAGGCCGACCTCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTCTACTGCTCAGGCACCCCACTCTTCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTTGGTGCGCAAGATGAAAAACATCCAGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCTCGTCTAAGGGTTTCTCCACCACGTGTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTCCTGGATGGGGATGTAAATGAGCTGATGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCTGGTGGAGTGCATTGGTCAAGAACTTATCTTCCTTCTTCCAAATAAGAACTTCAAGCACAGAGCATATGCCAGCCTTTTCAGAGAGCTGGAGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTTGGAATTTCTGACACTCCCCTGGAAGAGATTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGGACCTCTGTTTGCGGGTGGCGCTCAGCAGAAAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCTTGGGTCCCAGAGAGAAGGCTGGACAGACACCCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCGCCGGCTGCTCACCCAGAGGGCCAGCCTCCCCCAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAACACGGGGACACAGCTGGTCCTCCAGCATGTGCAGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACACCATCCGCAGCCACAAGGACTTCCTGGCGCAGATCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTGGCTCTGATGCTTTCTATTGTTATCCCTCCTTTTGGCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCCCTGGATATATGGGCAGCAGTACACCTTCTTCAGCATGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCACGGTACTTGCAGACGTCCTCCTGAATAAGCCAGGCTTTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGGTGGCTTCCGGAGTACCCCTGTGGCAACTCAACACCCTGGAAGACTCCTTCTGTGTCCCCAAACATCACCCAGCTGTTCCAGAAGCAGAAATGGACACAGGTCAACCCTTCACCATCCTGCAGGTGCAGCACCAGGGAGAAGCTCACCATGCTGCCAGAGTGCCCCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCGCCCCCCCAGAGAACACAGCGCAGCACGGAAATTCTACAAGACCTGACGGACAGGAACATCTCCGACTTCTTGGTAAAAACGTATCCTGCTCTTATAAGAAGCAGCTTAAAGAGCAAATTCTGGGTCAATGAACAGAGGTATGGAGGAATTTCCATTGGAGGAAAGCTCCCAGTCGTCCCCATCACGGGGGAAGCACTTGTTGGGTTTTTAAGCGACCTTGGCCGGATCATGAATGTGAGCGGGGGCCCTATCACTAGAGAGGCCTCTAAAGAAATACCTGATTTCCTTAAACATCTAGAAACTGAAGACAACATTAAGGTGTGGTTTAATAACAAAGGCTGGCATGCCCTGGTCAGCTTTCTCAATGTGGCCCACAACGCCATCTTACGGGCCAGCCTGCCTAAGGACAGAAGCCCCGAGGAGTATGGAATCACCGTCATTAGCCAACCCCTGAACCTGACCAAGGAGCAGCTCTCAGAGATTACAGTGCTGACCACTTCAGTGGATGCTGTGGTTGCCATCTGCGTGATTTTCTCCATGTCCTTCGTCCCAGCCAGCTTTGTCCTTTATTTGATCCAGGAGCGGGTGAACAAATCCAAGCACCTCCAGTTTATCAGTGGAGTGAGCCCCACCACCTACTGGGTAACCAACTTCCTCTGGGACATCATGAATTATTCCGTGAGTGCTGGGCTGGTGGTGGGCATCTTCATCGGGTTTCAGAAGAAAGCCTACACTTCTCCAGAAAACCTTCCTGCCCTTGTGGCACTGCTCCTGCTGTATGGATGGGCGGTCATTCCCATGATGTACCCAGCATCCTTCCTGTTTGATGTCCCCAGCACAGCCTATGTGGCTTTATCTTGTGCTAATCTGTTCATCGGCATCAACAGCAGTGCTATTACCTTCATCTTGGAATTATTTGAGAATAACCGGACGCTGCTCAGGTTCAACGCCGTGCTGAGGAAGCTGCTCATTGTCTTCCCCCACTTCTGCCTGGGCCGGGGCCTCATTGACCTTGCACTGAGCCAGGCTGTGACAGATGTCTATGCCCGGTTTGGTGAGGAGCACTCTGCAAATCCGTTCCACTGGGACCTGATTGGGAAGAACCTGTTTGCCATGGTGGTGGAAGGGGTGGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTGGTCCAGCGCCACTTCTTCCTCTCCCAATGGATTGCCGAGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGATGAAGATGATGATGTGGCTGAAGAAAGACAAAGAATTATTACTGGTGGAAATAAAACTGACATCTTAAGGCTACATGAACTAACCAAGATTTATCCAGGCACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTGTGTGTCGGAGTTCGCCCTGGAGAGTGCTTTGGCCTCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACAACCACATTCAAGATGCTCACTGGGGACACCACAGTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGCAAGAGTATTTTAACCAATATTTCTGAAGTCCATCAAAATATGGGCTACTGTCCTCAGTTTGATGCAATCGATGAGCTGCTCACAGGACGAGAACATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTACCAGCAGAAGAAATCGAAAAGGTTGCAAACTGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTACGCCGACTGCCTGGCTGGCACGTACAGTGGGGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCACTCATTGGCTGCCCACCGCTGGTGCTGCTGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCACGCCGCATGCTGTGGAACGTCATCGTGAGCATCATCAGAGAAGGGAGGGCTGTGGTCCTCACATCCCACAGCATGGAAGAATGTGAGGCACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCCTTTCGATGTATGGGCACCATTCAGCATCTCAAGTCCAAATTTGGAGATGGCTATATCGTCACAATGAAGATCAAATCCCCGAAGGACGACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTCCAGGGGAACTTCCCAGGCAGTGTGCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTCTCCTCCTCCTCCCTGGCGAGGATCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATCGAGGAGTACTCAGTCACACAGACCACACTGGACCAGGTGTTTGTAAATTTTGCTAAACAGCAGACTGAAAGTCATGACCTCCCTCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGACTGAGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号17)

MYO7A
pAAV2.1-CBA-MYO7A_5’AK

5’ ITR2
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号10)

左ITR5
CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGCAGCTCAAAGAGCTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCAAGCAAGGGGGTTTTGTAAGCAGTGA (配列番号18)

CMVエンハンサー
GCTAGCGTGCCACCTGGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG (配列番号19)

CBAプロモーター
TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG (配列番号20)

SV40イントロン
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (配列番号21)

5’hMYO7A CDS
ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGCATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACTACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTG (配列番号22)

スプライス供与シグナル
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (配列番号1)

AK
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT (配列番号3)

3’ITR2
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (配列番号4)

pAAV2.1-CBA-MYO7A_5’AKの全長配列
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCCTAATCGGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGTGCCACCTGGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCAGGCGGCCGCCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGCATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACTACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCCAATTGAAGGGCGAATTCCGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号23)

pAAV2.1-MYO7A_3’AK_BGH

5’ ITR2
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号10)

AK
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT (配列番号3)

スプライス受容シグナル
GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (配列番号1)

3’hMYO7A CDS
GCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCTCTGATCTTGGCTGTGCTGCGCCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGTTCTCCGTGTTGGTCCTGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCTCGTGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAATGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAGGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTGA (配列番号24)

BGH poly A
GCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA (配列番号25)

3’ITR2
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (配列番号4)

右ITR5
TCACTGCTTACAAAACCCCCTTGCTTGAGAGTGTGGCACTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGCGACGGCCAGAGGGCCGTCGTCTGGCAGCTCTTTGAGCTGCCACCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAG (配列番号14)

pAAV2.1-MYO7A_3’AK_BGHの全長配列
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTTGATCAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCTCTGATCTTGGCTGTGCTGCGCCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGTTCTCCGTGTTGGTCCTGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCTCGTGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAATGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAGGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTGACCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGCAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号26)

pAAV2.1-CBA-MYO7A _5’TS
全長配列
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCCTAATCGGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGTGCCACCTGGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCAGGCGGCCGCCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGCATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAACTACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTCAATTGAAGGGCGAATTCCGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号27)

pAAV2.1-MYO7A_3’TS_BGH
全長配列
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCTCTGATCTTGGCTGTGCTGCGCCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGTTCTCCGTGTTGGTCCTGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCTCGTGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAATGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAGGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGTGACCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGCAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (配列番号28)

AP:
GTGATCCTAGGTGGAGGCCGAAAGTACATGTTTCGCATGGGAACCCCAGACCCTGAGTACCCAGATGACTACAGCCAAGGTGGGACCAGGCTGGACGGGAAGAATCTGGTGCAGGAATGGCTGGCGAAGCGCCAGGGTGCCCGGTACGTGTGGAACCGCACTGAGCTCATGCAGGCTTCCCTGGACCCGTCTGTGACCCATCTCATGGGTCTCTTTGAGCCTGGAGACATGAAATACGAGATCCACCGAGACTCCACACTGGACCCCTCCCTGATGGA (配列番号29)

3XFLAGタグ:
GACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAG (配列番号30)

HA: ATGTATGATGTTCCTGATTATGCTAGCCTC (配列番号31)

本発明の目的のために、好ましくはそれぞれ本願明細書に含まれる配列か、遺伝コードの縮重のために同一のアミノ酸配列をコードする配列から選択されるABCA4、MYO7A及びCEP290のコード配列は、哺乳類の網膜細胞、特に光受容体細胞においてその発現を調節することのできるプロモーター配列と機能的に結合している。本発明に用いることのできる適切なプロモーターには、サイトメガロウイルスプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質プロモーター、卵黄様黄斑ジストロフィー2プロモーター、転写プロモーター活性を保っているそれらの断片及びバリアントが含まれる。

ウイルス送達系には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、シュードタイピングされたAAVベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが含まれるが、これに限定されない。シュードタイピングされたAAVベクターとは、あるAAV血清型のゲノムをもう一つのAAV血清型のカプシド中に含むものであり、例えば、AAV2/8ベクターは、AAV8カプシド及びAAV2ゲノムを含んでいる(Auricchioら(2001) Hum. Mol. Genet. 10(26):3075-81)。このようなベクターは、キメラベクターとしても知られている。送達系の他の例には、ex vivo送達系が含まれるが、これにはエレクトロポレーション、DNAパーティクルガン(biolistic)、脂質性トランスフェクション、圧縮DNA(compacted DNA)性トランスフェクション等のDNAトランスフェクション法が含まれるが、これに限定されない。

AAVベクターの構築は、以下の手順で、当業者に周知の技術を用いて行うことができる。アデノ随伴ウイルスベクター構築の理論及び実践、並びに治療への使用は、複数の科学出版物及び特許公報に例示されている(以下の文献目録は、参照により本願明細書に組み込まれる：Flotte TR. Adeno-associated virus-based gene therapy for inherited disorders. Pediatr Res. 2005 Dec;58(6):1143-7; Goncalves MA. Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector, Virol J. 2005 May 6;2:43; Surace EM, Auricchio A. Adeno-associated viral vectors for retinal gene transfer. Prog Retin Eye Res. 2003 Nov;22(6):705-19; Mandel RJ, Manfredsson FP, Foust KD, Rising A, Reimsnider S, Nash K, Burger C. Recombinant adeno-associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurological disorders. Mol Ther. 2006 Mar;13(3):463-83)。

AAVベクターを含む医薬組成物の適切な投与形態は、注射用溶液又は懸濁液、点眼薬及び眼軟膏を含むが、これに限定されない。好ましい実施態様において、AAVベクターは、網膜下注射によって、例えば網膜下腔内、前眼房内、又は眼球後方の空間(retrobulbar space)内への注射によって、投与される。好ましくは、ウイルスベクターは網膜下アプローチを介して送達される(Bennicelli Jら、Mol Ther. 2008 Jan 22; Reversal of Blindness in Animal Models of Leber Congenital Amaurosis Using Optimized AAV2-mediated Gene Transferに記述される通り)。

治療に用いるウイルスの投与量は投与経路、疾患の重篤度、患者の全体的状態、及び臨床パラメーターにより、ケース・バイ・ケースで決定されるべきである。一般的には、適切な投与量は、10⁸〜10¹³ vg (ベクターゲノム)／眼で変動する。

AAVベクターの作製
AAVベクターは、TIGEM AAV Vector Coreより、HEK293細胞の三重トランスフェクション、及びその後2回のCsCl2精製を行うことによって作製した(54)。各ウイルスインフェクションについて、物理的力価[ゲノムコピー数(GC)/ml]を、ドットプロット解析(55)によって得られた力価、及びTaqManを用いたPCR定量法(54) (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)によって得られた力価を平均することにより決定した。

HEK293細胞のAAVインフェクション
HEK293細胞は、10%ウシ胎児血清及び2 mM L-グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (GIBCO, Invitrogen S.R.L., Milan, Italy)中で維持された。細胞を6ウェルプレートに2×10⁶細胞/ウェルの密度でプレーティングし、16時間後にリン酸カルシウム法を用いて、Adヘルパー遺伝子(56)を含むpDeltaF6ヘルパープラスミド1.3 μgでトランスフェクションした。5時間後、細胞をDMEMで洗浄し、AAV2/2ベクターと共に(m.o.i：10⁵ GC/細胞の各ベクター；1:1のデュアルAAVベクターでコ-インフェクションするため、合計2x10⁵ GC/細胞)、最終容積700 μLの血清を含まないDMEM中でインキュベートした。2時間後、2 mlの完全DMEMを細胞に加えた。細胞をインフェクション後72時間に採取し、ウエスタンブロット解析に用いた。

動物モデル
本試験は、NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals、the Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research、及びthe Italian Ministry of Healthの動物処置のための法規に従って実行した。マウスは、the Institute of Genetics and Biophysicsの動物舎 (Naples, Italy)にて飼育し、12時間の明／暗サイクル下(明期中は10-50ルクスの露光量)で維持した。C57BL/6及びBALB/cマウスは、Harlan Italy SRL (Udine, Italy)より購入した。アルビノAbca4-/-マウスは、BALB/cマウス(Rpe65 Leu450についてホモ接合型)(57)との連続的な交雑及び戻し交雑によって作製し、同系交配を維持した。繁殖は、ホモ接合型のマウスを交雑させることにより行った。有色素sh14626SB/4626SB (sh1-/-と称される)マウスは、Wellcome Trust Sanger Institute (Cambridge, UK、Karen Steel博士より親切に贈呈頂いた)より輸入し、Harlan Italy SRL (Udine, Italy)より購入したCBA/Caマウスと2回戻し交雑し、集団を拡大するためのヘテロ接合型のsh1+/4626SB (sh1+/-と称される)マウスを得た。このマウスの交雑を維持した：繁殖は、ヘテロ接合型の雌をヘテロ接合型の雄と交雑させて行った。本試験で用いた有色素sh1マウスは、アッシャー1B罹患(sh1-/-)又は非罹患(sh1+/-及びsh1+/+)のいずれかであった。MYO7A^4626SBアリールの遺伝子型は、ゲノムDNA(マウス尾端から抽出)のPCR解析、及びその後のDNAシーケンシングによって行われた。PCR増幅に用いられたプライマーは以下の通りである：Fw1 (GTGGAGCTTGACATCTACTTGACC)及びRev3 (AGCTGACCCTCATGACTCTGC)、これらは712 bpの産物を生成し、これをFw1プライマーを用いてシーケンシングした。本試験に用いた大ヨークシャー種(Large White)のメスブタは、LWHerd Book of the Italian National Pig Breeders’ Association (Azienda Agricola Pasotti, Imola, Italy)において純血種として登録された。

マウス及びブタにおけるAAVベクターの網膜下注射
マウス(4〜5週齢)を、体重100 g当たり2 mlのavertin [1.25% w/vの2,2,2-トリブロモエタノール及び2.5% v/vの2-メチル-2-ブタノール (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)] の腹腔内注射により麻酔し(58)、その後AAV2/8ベクターをLiangらによって説明された経強膜的・経脈絡膜的アプローチ(59)を介して網膜下に送達した。全ての眼を1 μLのベクター溶液で処理した。送達されたAAV2/8投与量(GC/眼)は、「結果」の節で説明されるように、種々のマウス試験にわたって変動した。AAV2/1-CMV-ヒトチロシナーゼ(60) (投与量：2x10⁸ GC/眼)又はAAV2/5-CMV-EGFP (標準サイズのEGFPをコードする、投与量：4x10⁸ GC/眼)を、AAV2/8ベクター溶液に加え、アルビノ(Abca4-/-及びBALB/c)マウス(図6B, 7-8)又は有色素sh1マウス(図10-11)の網膜下にそれぞれ送達した。これにより、眼杯の形質導入された部分内のRPEに標識を付けることができ、これをこの後詳細に分析及び解析した(図6B、7-8、10-11)。ブタ網膜へのAAVベクターの網膜下送達は、上述の通り(11)行った。全ての眼を100 μLのAAV2/8ベクター溶液で処理した。AAV2/8の投与量は、1x10¹⁰ (図3B)又は1x10¹¹ GCの各ベクター/眼(図5B及び16)であり、デュアルAAVベクターとの共注射により、合計投与量はそれぞれ2x10¹⁰ GC/眼又は2x10¹¹ GC/眼となった。

ウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析用のサンプル(HEK293細胞、網膜又は眼杯)は、RIPA緩衝液(50 mM Tris-Hcl pH 8.0, 150mM NaCl, 1% NP40, 0.5% デオキシコール酸ナトリウム, 1mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS)中で溶解させてEGFP及びMYO7Aタンパク質を抽出したか、又はSIE緩衝液(250 mM スクロース, 3 mM イミダゾール pH 7.4, 1% エタノール及び1% NP-40)中で溶解させてABCA4タンパク質を抽出した。

ブタのサンプル(網膜の処置した領域、及び全RPEシート)を、RIPA緩衝液中で溶解させてRPEシートからMYO7Aを抽出したか、又はSIE緩衝液中で溶解させて網膜からMYO7A及びABCA4を抽出した。

溶解緩衝液には、タンパク質分解酵素阻害剤(Complete Protease inhibitor cocktail tablets, Roche, Milan, Italy)及び1 mMフェニルメチルスルホニルを補った。溶解後、EGFP及びMYO7Aのサンプルを99°Cで5分間、1X Laemliサンプル緩衝液中で変性させた；ABCA4のサンプルは37°Cで15分間、4M尿素を補った1X Laemliサンプル緩衝液で変性させた。溶解物を7% (ABCA4及びMYO7Aのサンプル)又は12% (EGFPのサンプル)のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。免疫ブロッティングに用いた抗体は以下の通りである：抗EGFP (sc-8334, Santa Cruz, Dallas, Texas, USA, 1:500)；抗-3xflag (A8592, Sigma-Aldrich, 1:1000)；抗-Myo7a (ポリクローナル, Primm Srl, Milan, Italy, 1:500)、ヒトMYO7Aタンパク質の941-1070アミノ酸に対応するペプチドを用いて作製したもの；抗-HA抗体(PRB-101P-200, HA.11, Covance, Princeton, NJ, USA, 1:2000)；抗-βチューブリン(T5201,Sigma Aldrich, 1:10000)；抗-フィラミンA (カタログ番号4762,細胞 Signaling Technology, Danvers, MA, USA, 1:1000)；抗-ジスフェリン (ジスフェリン, クローンHam1/7B6, MONX10795, Tebu-bio, Le Perray-en-Yveline, France, 1:500)。ウエスタンブロットで検出されたEGFP、ABCA4及びMYO7Aのバンドの定量は、ImageJソフトウェア(http://rsbweb.nih.gov/ij/で無料ダウンロードが可能)を用いて行った。ABCA4及びMYO7Aの発現を、in vitro及びin vivoの試験について、それぞれフィラミンA又はジスフェリンに標準化した。EGFPの発現は、in vitro及びin vivoの試験について、それぞれβ-チューブリン又はタンパク質量(μg)に標準化した。種々の導入遺伝子産物の分子量との類似性に基づいて、種々のタンパク質を標準化のために使用した。

眼底撮影
トロピカミド1%(Visufarma, Rome, Italy)の滴下によってC57BL/6の眼を拡張させ、その後300Wのフラッシュを用いて眼を刺激することにより眼底のライブイメージングを行った。眼底写真は、電荷結合素子Nikon D1Hデジタルカメラに接続されたTopcon TRC-50IX網膜カメラ(Topcon Medical System, Oakland, NJ, USA)を用いて撮影した。

組織、光学及び蛍光顕微鏡観察
組織切片でのEGFPの発現を評価するために、C57BL/6マウス又は大ヨークシャー種のブタ由来の眼(11)をAAV2/8注射後1ヶ月で摘出した。マウスの眼は4%パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、30%スクロースを一晩染み込ませた；その後角膜及び水晶体を切断し、眼杯を最適切削温度化合物(O.C.T. matrix, Kaltek, Padua, Italy)に包埋した。ブタの眼は、4%パラホルムアルデヒド中で48時間固定し、10%スクロースを4時間染み込ませ、20%スクロースを4時間染み込ませ、最後に30%スクロースを一晩染み込ませた。その後、角膜、水晶体、及び硝子体を切断し、眼杯のEGFP-陽性部分を最適切削温度化合物(O.C.T. matrix, Kaltek)に包埋した。連続凍結切片(10 μm厚)を水平軸に沿って切り出し、漸次スライド上に広げた。網膜組織写真は、Zeiss Axiocam (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)を用いて撮影した。有色素sh1マウスのRPEにおけるメラノソーム局在を解析するために、AAV注射後2ヶ月で眼を摘出し、0.1Mリン酸緩衝液中2%グルタルアルデヒド-2%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、0.1Mリン酸緩衝液ですすぎ、蛍光顕微鏡下で切断した。眼杯のEGFP-陽性部分をAraldite 502/EMbed 812 (カタログ番号13940, Araldite 502/EMbed 812 KIT, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)に包埋した。準薄(0.5μm)切片をLeica Ultratome RM2235 (Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA)上で横方向に切り、スライド上で標本にし、Epoxy組織染色剤(カタログ番号14950, Electron Microscopy Sciences)を用いて染色した。マスクを着けた作業者によりメラノソームを計数し、100Xの倍率の光学顕微鏡下で10の異なる視野/眼を解析した。網膜写真を、Zeiss Axiocam (Carl Zeiss)を用いて撮影した。

電子顕微鏡観察及び免疫金標識
電子顕微鏡解析に関して、Abca4-/-又はsh1マウスから、AAV注射後それぞれ3ヶ月及び2ヶ月後に眼を採取した。眼を、0.1M PHEM緩衝液、pH 6.9 (240 mM PIPES, 100 mM HEPES, 8mM MgCl₂, 40 mM EGTA)中、0.2%グルタルアルデヒド-2%パラホルムアルデヒドで2時間固定し、その後0.1 M PHEM緩衝液ですすいだ。その後、眼を光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡下で切断し、アルビノ(Abca4-/-及びBALB/c)及び有色素sh1マウスの眼杯のチロシナーゼ又はEGFP-陽性部分をそれぞれ選択した。続いて、眼杯の形質導入された部分を12%ゼラチン中に包埋し、2.3Mスクロースを注入し、液体窒素中で凍結した。Leica Ultramicrotome EM FC7 (Leica Microsystems)を用いて凍結切片(50 nm)を切り取り、細心の注意を払ってPR結合繊毛を縦方向に並べた。Abca4-/-におけるRPEの厚みの測定及びリポフスチン顆粒の計数を、iTEMソフトウェア(Olympus SYS, Hamburg, Germany)を用いて、マスクを着けた作業者(Roman Polishchuk氏)により行った。簡潔に言うと、RPEの厚みは、iTEMソフトウェアの「Arbitrary Line」ツールを用いて、標本の長さ方向に沿って少なくとも30の異なる領域において測定した。iTEMソフトウェアの「Touch count」モジュールを利用して、RPE層中に無作為に割り当てた25 μm²の領域内のリポフスチン顆粒の数を計数した。顆粒の密度は、25 μm²当たりの顆粒の数として表された。AAVベクター送達後のAbca4-/-中のABCA4-HAの発現を試験することを目的とした免疫金解析を、凍結切片を引き続き抗-HA抗体(MMS-101P-50, Covance, 1:50)、ウサギ抗-マウスIgG、及び10 nmの金粒子コンジュゲートプロテインAと共にインキュベートすることにより行った。sh1 PR結合繊毛へのロドプシン局在を定量化するために、sh1マウスの凍結切片を引き続き抗-ロドプシン抗体(1D4, ab5417, Abcam, Cambridge, UK, 1:100)、ウサギ抗-マウスIgG、及び10 nm金粒子コンジュゲートプロテインAと共にインキュベートした。結合繊毛中のロドプシンの金密度の定量は、iTEMソフトウェア(Olympus SYS)を用いて、マスクを着けた作業者により行った。簡潔に言うと、iTEMソフトウェアの「Touch count」モジュールを用いて、繊毛あたりの金粒子の数を計数し、「Closed polygon tool」を用いて測定した繊毛の外周(nm)に標準化した。金密度は、金粒子/nmで表した。免疫金標識した凍結切片を、デジタル画像取得用のVeletta CCDカメラを搭載したFEI Tecnai-12 (FEI, Eindhoven, The Netherlands)電子顕微鏡下で解析した。

電気生理学的解析
光脱感作からの回復を評価するために、眼を3回の1 cd s/m² のフラッシュを用いて刺激し、その後一定の光(300 cd/m²)に3分間露光することにより脱感作した。その後、脱感作前フラッシュ(1 cd s/m²)を用いて、眼を脱感作後0分、5分、15分、30分、45分及び60分間、経時的に刺激した。杆体活性の回復を、脱感作後(各時点で)発生したb波と、脱感作前に発生したb波との比率を出すことによって評価した。光脱感作からの回復は、処理後6週間の2月齢のAbca4-/-マウスで評価した(図13)。

統計学的解析
データは、平均値±平均値の標準誤差(s.e.m.)として表示した。統計的p値 <0.05を、有意であるとみなした。post-hoc多重比較法を伴うOne-way ANOVA(一元配置分散分析)を用いて、以下に図示されたデータを比較した：図2 (p ANOVA: A. 0.0002; B. 0.0015; C. 2x10^-7)；図8B (p ANOVA: 0.076)；図11B (p ANOVA: 0.5)。リポフスチン顆粒(図7B)及びメラノソーム(図10B)を計数したときは、負の二項一般化線形モデルからの逸脱度により解析した(61) (図7B：逸脱度のp値解析 0.03794；図10B：逸脱度のp値解析<<2x10^-10)。post-hoc多重比較法により決定された群間の統計学的有意差を、図中にアスタリスクにより示した。

「結果」
「標準サイズ、 特大及びデュアルAAVベクターの作製」
発明者らは、レポーターEGFP、治療的ABCA4-3xflag又はMYO7A-HAコード配列のいずれかを含む特大(OZ)、デュアルAAVトランス-スプライシング(TS)、及びハイブリッドベクターを作製した。また、発明者らは、C-末端にHAタグでタグ付けされた治療用CEP290を含む、デュアルAAVトランス-スプライシング(TS)及びハイブリッドベクターも作製した。デュアルAAVハイブリッドベクターに含まれる組換え誘導配列は、アルカリホスファターゼ導入遺伝子の以前に報告された領域(AP、デュアルAAVハイブリッドAP) (39)か、又は、発明者らが以前の試験において組換え誘導性であることを発見した(Colella及びAuricchio、未発表データ)F1ファージゲノム由来の77 bpの配列(AK、デュアルAAVハイブリッドAK)のいずれかに基づいていた。また発明者らは、ABCA4、MYO7A及びCEP290についてもデュアルAAV重複(OV)ベクターを作製した。発明者らは、EGFPについてはデュアルAAV OVベクターを作製しなかったが、それはこのアプローチの効率が再構成のための導入遺伝子特異的な重複に依存しており(38)、そのためある遺伝子の結果から他の遺伝子の結果を推定することができないためである。その代わり、EGFPに関しては、発明者らは単一の標準サイズAAVベクター(NS)を作製し、様々なストラテジーの導入遺伝子発現のレベルを比較した。本試験に用いられた全てのAAVベクターを生産するために作製されたコンストラクトを、表1に一覧にし、様々なアプローチの略図を図1に図示する。

発明者らは、in vitro試験にユビキタスなサイトメガロウイルス(CMV)又はニワトリベータ-アクチン(CBA)プロモーターを有するAAV2/2ベクターを使用し、これらはHEK293細胞を効率的に形質導入した(40)。加えて、AAV血清型2及び5由来の異種ITRを使用することにより、デュアルAAVベクターの生産的再構築を向上させることができる(51)ため、発明者らはABCA4及びMYO7Aをコードする、異種ITRを有するデュアルAAV AKベクターも作製した(図17a)。異種ITRを有するベクターを、血清型2由来のAAVカプシド内にパッケージングし、in vitroで試験した。

網膜においてin vivoで行われた試験において、発明者らは、RPE及びPRを効率的に形質導入する(10-12)がHEK293細胞にインフェクションし難いAAV2/8ベクター、並びにユビキタスなCBA及びCMVプロモーター(11)、又はRPE特異的な卵黄様黄斑ジストロフィー2(VMD2) (41)若しくはPR特異的ロドプシン(RHO)及びロドプシンキナーゼ(RHOK)プロモーター(10)のいずれかを使用した(表1)。

「デュアルAAVベクターはin vitroで高レベルの形質導入を可能にする」
まず発明者らは、in vitroでのAAV性の大型遺伝子の形質導入効率に関して、様々なOZ、デュアルAAV OV、TS並びにハイブリッドAP及びAKストラテジーを、HEK293細胞をユビキタスなプロモーター (EGFP、ABCA4-3xflag及びCEP290-HAについてはCMV、 MYO7A-HAについてはCBA)を有するAAV2/2ベクターでインフェクションすることにより比較した[細胞１個に対するウイルスの数 m.o.i.：10⁵ ゲノムコピー数(GC)/細胞 のベクター]。

細胞溶解物を、抗-EGFP(図2A)、-3xflag (ABCA4-3xflag検出用、図2B)、-MYO7A(図2C)及び-HA (CEP290-HA検出用) (図12A)抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した。代表的なウエスタンブロットを、図2A-C及び12Aに示す。全てのストラテジーが、予想されたサイズのタンパク質を発現するという結果になった。予測していたように、デュアルAAVベクターのうちの一種のみを用いてインフェクションした場合は、予想されたサイズのバンドが観察されなかった(図2A-C及び12A)。導入遺伝子発現の定量(図2D-F)は、デュアルAAVハイブリッドAPアプローチが最も低い導入遺伝子発現を示すという結果になり、一方デュアルAAV OV、TS及びハイブリッドAKアプローチはAAV OZアプローチよりも効率的であったことを示している。デュアルAAV TS及びハイブリッドAKアプローチは、CEP29の場合においても効率的に大型遺伝子を発現する能力が確認された(図12B)。さらに、異種ITRを有するデュアルAAV AKベクターの使用により、全長ABCA4及びMYO7Aタンパク質がin vitroで発現した(図17)。

「デュアルAAV TS及びハイブリッドAKはマウス及びブタの光受容体を形質導入するが、OVベクターはしない」
次に発明者らは、マウス網膜において、大型遺伝子の形質導入のための各AAVに基づく系を評価した。導入遺伝子特異的であるデュアルAAV OVを試験するために、発明者らは、治療用ABCA4及びMYO7A遺伝子を用いた(図3)。発明者らは、EGFPを用いてAAV OZ並びにデュアルAAV TS、ハイブリッドAP及びAKアプローチを評価した(図4)。C57BL/6マウスにおいてユビキタスなCMVプロモーターからABCA4-3xflagをコードするデュアルAAV OVベクター(各ベクターの投与量/眼：1.3x10⁹ GC)を網膜下送達した1ヶ月後の網膜溶解物のウエスタンブロット解析により、強力なタンパク質発現が示された(図3A)。網膜中のどの細胞型がABCA4を発現しているか決定するために、発明者らは、PR特異的RHO及びRHOK、又はRPE特異的VMD2 (各ベクターの投与量/眼：1x10⁹ GC)プロモーターのいずれかを含むデュアルAAV OVベクターを用いた。発明者らは、VMD2を注射した網膜におけるABCA4タンパク質発現を検出したが、RHO及びRHOKプロモーターを含むものは検出しなかった(図3A)。これらの結果は、大ヨークシャー種のブタ網膜においても確認された。ブタ網膜は、ベクター効率を評価するための優れたモデルであるが、それはそのサイズがヒト網膜と類似しており、また筋様領域(streak-like region)に集中した錐体が豊富に存在し、その錐体密度が霊長類の黄斑と同等であるためである(11)。発明者らは、大ヨークシャー種のブタ網膜下にABCA4-3xflagをコードするデュアルAAV OVベクターを注射し(各ベクターの投与量/眼：1x10¹⁰ GC)、CMVプロモーターについてABCA4タンパク質発現を観察したが、RHOプロモーターについてはしなかった(図3B)。同様に、MYO7A-HAをコードするデュアルAAV 0OVベクターの網膜下投与は、ユビキタスなCBAプロモーター(各ベクターの投与量/眼：2.5x10⁹ GC)についてはマウス網膜における弱いMYO7Aタンパク質発現をもたらしたが、RHOプロモーター(各ベクターの投与量/眼：3.2x10⁹ GC)については検出可能な発現は無かった(図3C)。全般的に、これらのデータは、デュアルAAV OVアプローチが、PRよりもRPEへの大型遺伝子の移送により効率的であることを示唆しており、RPEは、STGD及びUSH1B等のIRDの遺伝子治療の主要な標的である。

PRにおいて効率的に大型遺伝子を形質導入するAAVに基づくストラテジーを見つけるために、発明者らは、AAV OZ並びにデュアルAAV TS、ハイブリッドAP及びAKアプローチの網膜形質導入特性を評価した。まず発明者らは、EGFPを用いたが、これにより、PRを含む様々な網膜細胞型で導入遺伝子発現を容易に局在させることが可能となり、また、AAVに基づく大型導入遺伝子の形質導入のレベルを、単一AAV NSベクターのレベルと適切に比較することが可能となった。C57BL/6マウスにAAV NS、OZ、並びにデュアルAAV TS及びハイブリッドAP及びAKベクターを網膜下注射し(各ベクターの投与量/眼：1.7x10⁹ GC)、これらは全てCMVプロモーター転写調節下にEGFPをコードしていた。一ヶ月後、眼底写真は、最も高いレベルの蛍光が、AAV NS、並びにデュアルAAV TS及びハイブリッドAKアプローチで得られたことを示している(図15)。網膜の凍結切片の蛍光顕微鏡解析は、検出可能なレベルのRPE又はPRへの形質導入が、AAV NS及びOZベクターを注射した77% (10/13)の網膜、デュアルAAV TS、ハイブリッドAP及びAKベクターを注射した92% (12/13)の網膜で観察されたことを示している。図4は、これらの各群の中で最も良好に形質導入された網膜を示す。最も強力なレベルのPR形質導入は、AAV NS並びにデュアルAAV TS及びハイブリッドAKアプローチについて得られた。

次に発明者らは、PRでの大型遺伝子再構築のために最も有望と思われるデュアルAAV TS及びハイブリッドAKベクター、並びに比較用のAAV NSベクターの網膜投与後の、C57BL/6マウスにおけるPR特異的な形質導入レベルを調査した(各ベクターの投与量/眼：2.4x10⁹ GC)。全てのベクターが、PR特異的RHOプロモーターの転写調節下にEGFPをコードしていた。ベクター投与1ヶ月後、網膜を凍結切片化し、蛍光顕微鏡下で解析した(図5A)。全てのアプローチが、高いレベルのPR形質導入を示すという結果になり、単一AAV NSベクターについてより一貫しているように思われた。発明者らは、AAV NSを注射した100% (6/6)の網膜、デュアルAAV TSを注射した60% (9/15)の網膜、デュアルAAVハイブリッドAKを注射した71% (10/14)の網膜において、形質導入を見出した。図5Aは、これらの各群の中で最も良好に形質導入された網膜を示す。従って、発明者らは、デュアルAAV TS及びハイブリッドAKストラテジーにより、NS AAVについて得られるレベルよりは低いレベルではあるが、効率的なマウスPR形質導入が可能であるとであると結論付けた。そして発明者らは、デュアルAAV TS及びハイブリッドAKベクターの網膜下投与により、大ヨークシャー種のブタのPRが形質導入されたことを確認した(各ベクターの投与量/眼：1x10¹¹ GC；全ての注射された網膜中、EGFP-陽性の網膜：2/2 デュアルAAV TS；2/2 デュアルAAVハイブリッドAK) (図5B)。

加えて、ブタ網膜へのデュアルAAV TS及びハイブリッドAKベクターの網膜下送達(各ベクターの投与量/眼：1x10¹¹)は、PR特異的な全長ABCA4-3xflag(図16a)及びRPE及びPRにおける全長MYO7A-HA(図16b)の両方の効率的な発現をもたらした。興味深いことに、デュアルAAVハイブリッドAKベクターは、デュアルAAV TSベクターと比較して、PRにおける大型のABCA4及びMYO7Aタンパク質のより一貫した発現をもたらした(図16)。

「デュアルAAVベクターはSTGD及びUSH1Bマウスモデルの網膜表現型を改善する」
デュアルAAV TS及びハイブリッドAKアプローチについて得られたPR形質導入レベルが治療的に意義のあるものであるか理解するために、発明者らは、大型のABCA4及びMYO7A遺伝子の変異によってそれぞれ引き起こされるIRDであるSTGD及びUSH1Bの二種類のマウスモデルの網膜において、これらのアプローチを調査した。

Abca4-/-マウスモデルは重篤なPR変性を受けなかった(42)が、ABCA4にコードされたPR外節の全トランスレチナールトランスポーターが存在しない(43-44)ことにより、RPEによるPRの結果としてPRおよびRPEにおけるリポフスチンの蓄積が起こった(45)。結果として、RPE中のリポフスチン顆粒の数及びRPE細胞の厚みの両方が、Abca4-/-マウスにおいて対照マウスより大きくなった(45)。さらに、Abca4-/-マウスモデルは、暗順応が遅延するという特徴を示した(57、62)。ABCA4はPRで特異的に発現するので、発明者らはRHOプロモーターの転写調節下でABCA4-3xflagをコードするデュアルAAV TS及びハイブリッドAKベクターを作製した。これらのベクターを、野生型C57BL/6マウスに網膜下注射し(各ベクターの投与量/眼：3-5x10⁹ GC)、一ヶ月後、網膜を溶解し抗-3xflagを用いたウエスタンブロットにより解析した。どちらのアプローチも、強力だが変動するレベルのABCA4-3xflag発現をもたらした。ABCA4-3xflag発現レベルは、デュアルAAVハイブリッドAKベクターで処理した網膜においてより一貫していた(図6A)。これらの結果は、大ヨークシャー種のブタにおいて確認された(データは示していない)。加えて、1月齢のアルビノAbca4-/-マウスに、デュアルAAVハイブリッドAK RHO-ABCA4-HAベクターを網膜下注射した(各ベクターの投与量/眼：1-3x10⁹ GC)。3ヶ月後、眼を採取し、網膜切片を抗-ヘマグルチニン(HA)抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析し、5’及び3’デュアルAAVハイブリッドAKベクターの組み合わせを注射した動物においてのみ、免疫金粒子がPR外節に正確に局在していることを確認した(図6B)。デュアルベクターによって発現したABCA4タンパク質の機能性を評価するため、発明者らは透過型電子顕微鏡観察も行い、RPEリポフスチン顆粒(図7)及びRPE厚み(図8)の存在及びその数を評価した。どちらも、コントロールベクターを注射したAbca4-/-マウスの網膜において、年齢を適合させた野生型のBalb/C対照より大きく、治療的デュアルAAV TS又はハイブリッドAKベクターを注射された眼において減少または標準化されていた(図7B及び8B)。加えて、Abca4-/-光受容体が光脱感作から回復する能力は、対照の網膜と比較した場合、治療的ベクターで処理した網膜において有意に改善された(図13)。

次に、発明者らは、最も一般的に用いられる(23-24、46-48)USH1Bのモデルであるsh1マウスの網膜におけるPR形質導入レベル及びデュアルAAV性MYO7A遺伝子移動の有効性を試験した。sh1マウスでは、モーターMyo7aの欠損によりRPEメラノソームの誤った局在が引き起こされ(47)、このためRPE微絨毛へ侵入せず、ロドプシンがPR結合繊毛に蓄積する(48)。MYO7Aが、RPE及びPRの両方で発現するので(22-23)、発明者らは次にユビキタスなCBAプロモーターの転写制御下でMYO7A-HAを発現するデュアルAAV TS及びハイブリッドAKベクターを用いた。1月齢の野生型C57BL/6マウスに、デュアルAAVベクターを注射し(各ベクターの投与量/眼：1.7x10⁹ GC)、眼杯溶解物を1ヶ月後抗-HA抗体を用いたウエスタンブロット解析を用いて評価した。結果は、両方のアプローチで処理した網膜において、同様に強力かつ一貫したレベルのMYO7A発現を示した(図9)。発明者らの抗-MYO7A抗体はマウスとヒト両方のMYO7Aを認識することができるため、それを利用し、sh1-/-の眼へのデュアルAAVベクターの送達の結果得られたMYO7Aのレベルを、sh1+/+の眼で内在的に発現しているレベルと比較した(図14)。CBAプロモーター(図14、左のパネル、各ベクターの投与量/眼：1-6x10⁹GC)及びRHOプロモーター(図14、右のパネル、各ベクターの投与量/眼：2x10⁹GC)の両方を用い、PR及びRPEの両方において得られたMYO7A発現と、PRにおいてのみ得られた発現を区別した。前者は約20% (図14、左のパネル)、後者は最大約50%の内在性Myo7a (図14、右のパネル)であった。解析により、形質導入された網膜の数は同様であるにも関わらず、PRにおいてデュアルAAVハイブリッドAKにより得られたMYO7A発現のレベルが、デュアルAAV TSベクターについて得られたものよりも高いことをさらに示す(TS-MYO7A：注射した8つ中3つの網膜が陽性；AK-MYO7A：処理した8つ中4つの網膜が陽性；図14右のパネル)。

デュアルAAVベクターから発現されたMYO7Aがsh1-/-網膜の欠陥をレスキューする能力を試験するために、次に発明者らは、1月齢のsh1マウスにおいてデュアルAAV TS及びハイブリッドAKベクターのCBAセットを網膜下注射した(各ベクターの投与量/眼：2.5x10⁹ GC)。発明者らは、RPEメラノソーム(図10)及びロドプシン局在(図11)を、それぞれ準薄網膜切片の解析及び免疫電子顕微鏡観察により評価した。影響を受けていないsh1+/-と異なり、sh1-/-のメラノソームはコントロールベクターの送達(それぞれデュアルAAVストラテジーの5’-側単独、図10)後、RPE微絨毛に進入しない。先端に正確に局在したRPEメラノソームの数は、MYO7AをコードするデュアルAAV TS又はハイブリッドAKベクターのいずれかの送達後、有意に改善された(図10B)。意外なことに、発明者らは、デュアルAAV TS及びハイブリッドAKベクターにより媒介されるMYO7A発現により、sh1-/- PRの結合繊毛へのロドプシンの蓄積が減少することも見出した(図11)。

「考察」
AAV性遺伝子治療は動物モデル、及び遺伝的な失明条件において効果的である(5-9、49)一方で、網膜に罹患し、5kbより大きい遺伝子(大型遺伝子と呼ばれる)の移動を必要とする疾患への適用は、AAVの制限された積荷容量によって妨げられている。これを克服するために、発明者らは、AAV OZ並びにデュアルAAV OV、TS及びハイブリッドアプローチを含む、様々なAAVに基づくストラテジーについて、大型遺伝子の形質導入効率を、in vitroで、並びにマウス及びブタ網膜において、比較した。様々な試験で、発明者らは、発明者らがその組換え誘導性特性を確認したF1ファージゲノム由来の77 bp配列を選択し、デュアルハイブリッドアプローチ(AK、デュアルAAVハイブリッドAK)に使用した。

発明者らによるin vitro及びin vivoの結果は、デュアルAAVハイブリッドAKが驚くべきことにデュアルAAVハイブリッドAPより優れており、発明者らが試験した全てのデュアルAAVストラテジー(デュアルAAVハイブリッドAPを除く)が、形質導入レベルについてAAV OZベクターよりも優れていたことを示す。これは、OZゲノムと比較した場合のデュアルAAVゲノムの集団の均一なサイズによって説明することができ、この均一なサイズは転写活性のある大型の導入遺伝子発現カセットの生成に有利にはたらく。

デュアルAAV OVアプローチは、デュアルAAV OV ベクターが治療用導入遺伝子の発現カセットに属する配列のみを含むので、TS又はハイブリッドAKアプローチと比較した場合、特に興味深く思われる。しかし、デュアルAAV OVベクターを成体マウス及びブタの網膜下腔に投与すると、ユビキタスなプロモーター又はRPE特異的プロモーターを用いた場合のみ、大型のABCA4タンパク質の発現を検出することができたが、PR特異的プロモーターを用いた場合は検出できなかった。これは、デュアルAAV OVの再構成にに必要な相同組換えが、PRよりもRPEにおいてより効率的であることを示唆する可能性がある。これは、有糸分裂終了後のニューロンにおいて報告された低い相同組換えレベルと一貫しており(50)、他のグループによって最近報告されたデュアルAAV OV性MYO7A形質導入の不足(30)を部分的に説明し得る。発明者らは、発明者らによるデュアルAAV OV ABCA4及びMYO7Aベクターに含まれる配列よりも組換え誘導性が高い配列が、PRにおける効率的な相同組換えを可能にするかもしれないということを除外することはできないが、デュアルAAV OVベクターの網膜下投与は大型遺伝子のPRへの移動には使用すべきではないと結論付けている。

デュアルAAV TS及びハイブリッドAKアプローチは、デュアルAAV OVについて観察したものと異なり、マウス及びブタのPRを効率的に形質導入する。これは、デュアルAAV TS及びハイブリッドAKアプローチによる大型遺伝子の再構成機構が、相同組換えではなく、ITR性のhead-to-tail型再結合を介しているという知見(32、35、51)と一貫している。

発明者らがデュアルAAV TS及びハイブリッドAKを用いて達成したマウスPR形質導入のレベルは、単一のNSベクターを用いたものよりも低く、より一貫していない。しかし、デュアルAAVは、比較的低いレベルの導入遺伝子発現を必要とする遺伝的な失明条件、すなわち常染色体劣性として遺伝する疾患の治療に効果的である可能性がある。実際に、発明者らは、デュアルAAV TS及びハイブリッドAKの網膜下送達により、大型遺伝子の変異に起因し、遺伝子治療の魅力的な標的である遺伝性網膜疾患、STGD及びUSH1Bの二種類の動物モデルの網膜の欠陥が改善し、さらには標準化することを示している。

デュアルAAVベクターのゲノムサイズは均一であり、これは使用に関する同一性及び安全性の問題が、不均一なゲノムサイズを有するAAV OZベクターに関するものよりも大きくないことを意味している。対照的に、発明者らは、デュアルAAVベクター送達後最大1〜2ヶ月間追跡したマウスにおいて、ERGにも網膜にも組織学的異常は検出しなかった(データは示していない)。

結論として、発明者らは、AAVデュアルハイブリッドベクター系の性能を著しく改善する、新たな組換え誘導配列(AK)を同定した。実際に、発明者らはデュアルAAVベクターがin vitro及び網膜におけるin vivoの両方で効率的であることを見出した。デュアルAAV OVベクターはRPEを効率的に形質導入するが、PRを形質導入せず、一方でデュアルAAV TS及びハイブリッドAKアプローチは両方の細胞型で効率的な大型遺伝子の再構成を推進する。デュアルAAV TS及びハイブリッドAKアプローチの投与により、マウスのSTGD及びUSH1Bモデルの網膜の表現型が改善し、網膜のPR及びRPEへの大型遺伝子の移動を必要とするこれら及び他の失明条件のための遺伝子治療に対するこれらのストラテジーの有効性のエビデンスが与えられた。これらの知見は、眼だけでなく、筋肉及び他の臓器及び組織への遺伝子治療のためのAAVベクターの適用を大いに拡大するであろう。5 kbより大きい、欠陥のある遺伝子によって起こるIRD以外の疾患には、筋ジストロフィー、ジスフェリン欠損(肢帯型筋ジストロフィー2B型及び三好ミオパチー)、嚢胞性線維症、血友病という非限定的な例が含まれる。

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Claims (29)

1. 宿主細胞で目的の遺伝子のコード配列を発現させるためのデュアルコンストラクト系であって、前記コード配列が5’末端部分及び3’末端部分から構成され、
   a) 5’-3’方向に、
   - 5’-逆位末端反復(5’-ITR)の配列；
   - プロモーター配列；
   - 動作可能なように前記プロモーターに結合され、前記プロモーターの制御下にある、前記コード配列の5’末端部分；
   - スプライス供与シグナルの核酸配列；及び、
   - 3’-逆位末端反復(3’-ITR)の配列；
   を含む第一のプラスミド、並びに、
   b)5’-3’方向に、
   - 5’-逆位末端反復(5’-ITR)の配列；
   - スプライス受容シグナルの核酸配列；
   - 前記コード配列の3’末端；
   - ポリアデニル化シグナルの核酸配列；及び、
   - 3’-逆位末端反復(3’-ITR)の配列
   を含む第二のプラスミド
   を含むデュアルコンストラクト系。
2. 前記第一のプラスミド及び前記第二のプラスミドを宿主細胞へ導入すると、前記コード配列がスプライス供与シグナル及びスプライス受容シグナルによって再構成する、請求項1に記載のデュアルコンストラクト系。
3. 前記第一のプラスミドが3’-ITRの5’位置に組換え誘導領域の核酸配列をさらに含み、前記第二のプラスミドが5’-ITRの3’位置に組換え誘導領域の核酸配列をさらに含む、請求項1又は2に記載のデュアルコンストラクト系。
4. 組換え誘導領域がF1ファージ組換え誘導領域である、請求項3に記載のデュアルコンストラクト系。
5. 前記組換え誘導領域の核酸配列が配列：GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT (配列番号3)から本質的に構成される、請求項3又は4に記載のデュアルコンストラクト系。
6. ITRのヌクレオチド配列が同一のAAV血清型又は異なるAAV血清型に由来する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系。
7. 第一のプラスミドの3’-ITR及び第二のプラスミドの5’-ITRが同一のAAV血清型由来である、請求項6に記載のデュアルコンストラクト系。
8. 第一のプラスミドの5’-ITR及び3’-ITR並びに第二のプラスミドの5’-ITR及び3’-ITRがそれぞれ異なるAAV血清型由来である、請求項6に記載のデュアルコンストラクト系。
9. 第一のプラスミドの5’-ITR及び第二のプラスミドの3’-ITRが異なるAAV血清型由来である、請求項6に記載のデュアルコンストラクト系。
10. コード配列が天然のエキソン-エキソン接合部で5’末端部分と3’末端部分とに分割される、請求項1〜9のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系。
11. スプライス供与シグナルの核酸配列が配列：GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (配列番号1)から本質的に構成される、請求項1〜10のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系。
12. スプライス受容シグナルの核酸配列が配列：GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (配列番号2)から本質的に構成される、請求項1〜11のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系。
13. 第一のプラスミドが動作可能なようにコード配列に結合された少なくとも一種のエンハンサー配列をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系。
14. コード配列が遺伝性網膜変性疾患を是正することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項1〜13のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系。
15. コード配列がABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、USH2a、GPR98又はALMS1から成る群より選択される、請求項14に記載のデュアルコンストラクト系。
16. a) 請求項1〜15のいずれか一項に規定する第一のプラスミドを含む第一のウイルスベクター、及び
    b)請求項1〜15のいずれか一項に規定する第二のプラスミドを含む第二のウイルスベクター、
    を含むデュアルウイルスベクター系。
17. ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項16に記載のデュアルウイルスベクター系。
18. アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが同一の又は異なるAAV血清型から選択される、請求項17に記載のデュアルウイルスベクター系。
19. アデノ随伴ウイルスが血清型2、血清型8、血清型5、血清型7又は血清型9から選択される、請求項17又は18に記載のデュアルウイルスベクター系。
20. 請求項16〜19のいずれか一項に記載のデュアルウイルスベクター系で形質転換した宿主細胞。
21. 医薬的使用のための、請求項1〜15のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系、請求項16〜19のいずれか一項に記載のデュアルウイルスベクター系又は請求項20に記載の宿主細胞。
22. 遺伝子治療に使用するための、請求項21に記載のデュアルコンストラクト系、デュアルウイルスベクター系又は宿主細胞。
23. 網膜変性を特徴とする病変又は疾患の治療及び/又は予防に使用するための、請求項21又は22に記載のデュアルコンストラクト系、デュアルウイルスベクター系又は宿主細胞。
24. 網膜変性が遺伝性である、請求項23に記載のデュアルコンストラクト系、デュアルウイルスベクター系又は宿主細胞。
25. 病変又は疾患が、網膜色素変性症、レーバー先天黒内障(LCA)、シュタルガルト病、アッシャー病、アルストレム症候群、ABCA4遺伝子の変異によって起こる疾患から成る群より選択される、請求項24に記載のデュアルコンストラクト系、デュアルウイルスベクター系又は宿主細胞。
26. 請求項1〜15のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系、請求項16〜19のいずれか一項に記載のデュアルウイルスベクター系又は請求項20に記載の宿主細胞、及び医薬的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
27. 必要とする対象に有効量の請求項1〜15のいずれか一項に記載のデュアルコンストラクト系、請求項16〜19のいずれか一項に記載のデュアルウイルスベクター系、請求項20に記載の宿主細胞又は請求項26に記載の医薬組成物を投与することを含む、網膜変性を特徴とする病変又は疾患を治療及び/又は予防する方法。
28. 組換え誘導領域としての使用のための配列番号3から構成される、核酸。
29. 配列番号3から構成される配列を使用することを含む、遺伝子組換えを誘導する方法。