JP2017502959A

JP2017502959A - 生体内及び体外で核酸類薬物を送達するための新規な糖アルコール類組成物

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Publication number: JP2017502959A
Application number: JP2016543180A
Authority: JP
Inventors: リン、シー−ラン; リン、イー−ウェン
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Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2014-08-07
Publication date: 2017-01-26
Anticipated expiration: 2034-08-07
Also published as: CN106102777B; EP3086812B1; TW201628629A; CN106102777A; EP3086812A1; TWI702044B; WO2015099839A1; JP6521981B2

Abstract

本発明は組成物及び糖アルコール組成物とともに核酸類薬物／ワクチン複合体を調製し、生体外及び体内で送達する使用方法に関する。具体的に、本発明は治療と薬学に用いる核酸組成物を調製するための成分及び必要なステップを含み、そのうち、例えばマイクロリボ核酸、マイクロリボ核酸前駆体、小ヘアピンリボ核酸、低分子干渉リボ核酸、リボザイム、アンチセンスリボ核酸／デオキシリボ核酸、リボ核酸とデオキシリボ核酸とのヘテロ接合物及びデオキシリボ核酸担体／ワクチンは、グリシン化糖アルコール／糖と送達できる主動的なエンドサイトーシスによって生体内又は体外で細胞により吸収される複合体を構成する。また、本発明は糖アルコール構造及び／又は糖アルコール様の構造を含む化学化合物が核酸、特にマイクロリボ核酸、小ヘアピンリボ核酸、低分子干渉リボ核酸及びリボザイムの体内又は体外での分解を回避することができることを開示する。このため、本発明もこれらの核酸類薬物及び／又はワクチンの生体内、体外での構造完全性及び機能有効性を維持する処方及び方法である。

Description

本発明は新規な化学組成物、並びに体外又は生体内で送達するためにRNA-及び／又はDNA-類薬物／ワクチンと修飾された糖アルコール及び／又は糖を調製して安定した複合体を形成するための使用方法に関することです。具体的には、本発明は、治療的及び薬学的核酸組成物の調製に必要とされる重要な成分及び過程を開示し、例えばマイクロリボ核酸（miRNA）及びその前駆体／擬態、小ヘアピンリボ核酸（shRNA）、低分子干渉リボ核酸（siRNA）、リボザイム、アンチセンスリボ核酸／デオキシリボ核酸、リボ核酸-デオキシリボ核酸ヘテロ接合体及びデオキシリボ核酸担体／ワクチンは新規なグリシン化糖アルコールと、生体内又は体外でエンドサイトーシスのような能動機構によって細胞により吸収されて該核酸組成物による治療効果を放出することができる送達複合体に調製される。本発明の新規性は、正に帯電した糖アルコール／糖を含有する組成物を作製し、共有結合又は水素結合ではなく、イオン及び／又は静電親和力によって負に帯電した核酸組成物と相互作用させることにより、体内及び体外で良好な薬効を送達するように、該核酸組成物の構造的完全性を維持することにある。さらに、本発明は化学組成物、例えば糖アルコール及び糖が小機能性核酸、特にmiRNA、shRNA、siRNA及びリボザイム分子を体内又は体外での分解から保護することができることを初めて見出した。このため、本発明は組成物及び細胞へ核酸類薬物／ワクチンを送達する該組成物の使用方法だけでなく、生体内、体外でこれらの核酸類薬及び／又はワクチンの構造的完全性及び効果を保つ重要な処方である。

背景
RNA干渉技術による体内治療の発展では、リボザイム、マイクロリボ核酸（miRNA）、短ヘアピンリボ核酸（shRNA）及び低分子干渉リボ核酸（siRNA）のような機能性ノンコーディングリボ核酸（ncRNA）の送達は主な障害となる。これらのncRNAの低透過及び高分解率は送達に発生した問題である。これらの問題を克服するために、送達剤で機能性ncRNAを保護しなければならなく、構造的完全性を維持する一方で、生体内で細胞による摂取も促進する。しかしながら、従来のリポソーム又は糖類送達剤は両方の要求を同時に満たすことができない。

リボ核酸（RNA）及びデオキシリボ核酸（DNA）のような核酸組成物は負に帯電した分子であるため、正に帯電した物質を吸引する傾向がある。他方で、細胞膜には、豊かな脂肪酸を含有するため負に帯電したリン脂質二重層が含まれている。このため、裸のRNA／DNAは細胞膜に反発されて直接細胞内に送達されることができない。上記の問題を克服するために、脂質類リポソームでDNAs／RNAsを包み、リポフェクションにより細胞内送達を行うことは従来の好ましい送達方式の一つである。リポフェクションのメカニズムはリポソームが細胞膜のリン脂質二重層と融合することにより、リポソームで包まれたRNAs／DNAsが受動的に拡散して細胞に入ることである。更にその送達効率を促進するために、更に長炭素鎖（即ち糖エステル）又は正に帯電した化学基、又は両方、例えばポリエチレングリコール（PEG;H-（O-CH₂-CH₂）_n-OH（Immordino et al, 2006））、グリセリド（WO2011143237、Meyering）、モノオレイン（Pereira et al, 2002; Zhen et al, 2012）、及びアミノ化／アミノポリ（グリセロールメタクリレート）（aminated／amino poly（glycerol methacrylate）s、Gao et al, 2010 and 2011）を添加してこれらのリポソーム分子を修飾する場合が多い。しかしながら、受動拡散の制限によって、一般的にはリポソーム法の効率はエンドサイトーシスによる主動的送達方式と比べ物にならない。

リポソームによる送達系において、グリセリンはポリマーのリンカーとして、脂肪酸の長炭素鎖とリン酸エステル、例えばモノオレートとグリセリドを連結するために用いられる場合が多い。長炭素鎖は修飾によって帯電した化学基を形成してDNA／RNAと相互作用することができるが、これらの帯電した炭素鎖はDNA／RNAを分解から保護する能力（即ち極性）が全くない。一方、グリセリンはポリマー、例えばアミノ化／アミノポリ（グリセロールメタクリレート）の送達において側鎖として役立てる。これらのアミノ化グリセリン側鎖は、このようなアクリルポリマーにおいてDNA及びRNAと水素結合を形成する正に帯電した基を有する（Gao et al, 2010）。DNAとRNAの二本鎖及びヘアピン構造は水素結合から形成して維持されることが知られている。このように、アミノ化／アミノポリ（グリセロールメタクリレート）による水素結合は、例えばmiRNA、shRNA、siRNA、リボザイム及びDNAワクチンのような、現在既知の多くの核酸類薬剤の機能を維持するためのDNA／RNA二本鎖（duplex）及びヘアピン構造の完全性を妨げるようになる。また、これらのリポソームによる送達系にはDNAとRNAを分解から保護するものが全くないと考えられる。

糖類による送達は別の好ましいトランスフェクション方法であり、設計によって従来効率が低い脂質送達を促進する。糖で包まれたDNAs／RNAsは細胞により主動的なエンドサイトーシスメカニズムで吸収され、その細胞内での濃度及びその効果を向上させることができる。これらの糖類による送達系には、糖類界面活性剤（EP0535534, Nair; WO2009029046, Kim）、ポリ（糖アクリレート）ポリマー（US5,618,933, Dordick）、糖グラフトリポソーム（Banerjee et al, 1996）、脂質-タンパク質-糖粒子（WO2002032398, Kohane et al）、ポリ（糖化アミノ酸）（Davis et al, 2002）, リポアミノ酸-／糖ペプチド-及び／又はリポ多糖-接合体（Blanchfield et al, 2004）、ペクチン／キトサン／レシチンナノ粒子（Morris et al, 2010; Cuna et al, 2006; Graf et al, 2008）、糖-ポリエチレングリコール系ポリマー（Davis et al, 2010; Bhatia et al, 2011）、及びホウ素糖複合体（Ellis et al, 2012）を含み、多種の組成物が使用される。しかしながら、これらの糖類組成物がDNAとRNA構造の完全性を分解から保護することができることに関する報道がない。多糖類及び糖は一般的にいずれの電荷も帯電しないため、これらの方法の中の多くでは、またリポソームと結合してDNAs／RNAsを包むことが必要である。このため、調製し難いという他の問題があった。

要するに、現在では、RNAs／DNAsを細胞内に効果的に送達すると同時に、送達中でその鎖構造、特に二本鎖及びヘアピン構造の完全性を保護することができる送達試薬がない。また、従来開発した送達剤は既存の生物学的システムのいずれでは発見されたことがなく、且つ生体内で送達試験を行ったことがないため、その安全性及び生体内での効率は高度に不確定性がある。このため、安全に生命システムに存在することができるだけでなく、且つ体外、又は体内に関わらず、RNAs／DNAsを細胞内に効果的に送達すると同時に、その鎖構造、特に二本鎖及びヘアピン構造の完全性を保護することができる新たな送達システムが必要である。

発明の概要
幹細胞は宝箱のように、薬学及び治療的応用を設計及び発展するための各種の有効成分を含有する。前記応用は、細胞／組織／臓器の再生の促進、受傷／老化組織／臓器の修復及び／又は活性化、変性疾患（即ち糖尿病、骨粗鬆症、パーキンソン病及びアルツハイマー病……など）の処理、並びに腫瘍／癌の生成、発展及び転移の回避を含むが、これらに制限されない。このため、発明者は幹細胞を、新薬を選別、同定、分離及び生産するツールとして使用すると同時に、幹細胞によるこれらの（確認された）薬物成分の生産及び保存に関する機構（ChenとLin、（2013）Recent Patents on Regenerative Medicine 3, 5-16）を検討した。その結果、本発明は、糖アルコール-及び／又は糖アルコール様の構造を含有する化学化合物が、ヘアピン様のリボ核酸（RNA）分子、特にマイクロリボ核酸前駆体（即ち原始マイクロリボ核酸及び／又は前駆体マイクロリボ核酸）、小ヘアピンリボ核酸、低分子干渉リボ核酸及びリボザイムを人工誘導多能性幹細胞（iPSC）及びiPSCから誘導された胚様体での分解から保護することができることを初めて開示する。すべての胚細胞は構造上の類似性があるため、該糖アルコール／糖がその他の細胞型においても、機能性RNAの生体内と体外のいずれにおける分解に対して、同様な保護効果を提供する可能性がある。

糖アルコール（sugar alcohols）は糖から誘導したポリオール（polyol alcohols, polyhydric alcohol, polyalcohol, glycitol）の一般的な種類である。化学上でポリマーに対する定義に応じて、ポリオール（polyol）は有機反応に関与できる活性な複数の水酸基を有する化合物であり、重合したポリオール（polymeric polyols）はポリエーテル又はポリエステルの態様を有する場合が多い。ほとんどの糖アルコールは白く、水溶性の天然に存在する物質であり、且つ保湿剤、増粘剤及び甘味剤として、美容術、薬学及び食品工業によく使用される。糖アルコールは一般的に化学式H（HCHO）_n+1Hで示され、糖のH（HCHO）_nHCOとは異なる。更に、糖アルコールは、糖のように環状構造を形成する傾向があることはない。しかしながら、糖アルコールが脱水によって環状エーテルを形成でき、例えばソルビトールが脱水によってイソソルビド（isosorbide）を形成する。糖アルコールは異なる鎖長を有し、且つ鎖の炭素分子毎に1つの水酸基（OH）が結合されている。糖アルコールは更に水酸基の相対方位（立体化学）によって違っており、例えば、マンニトールとソルビトールとは異性体であり、同じ化学式C₆H₈（OH）₆を有するが、第2の炭素原子（C²）における水酸基の方位が互いに異なる。一般的な糖アルコールとしては、アルジトール（alditol）、アラビトール（arabitol）、エリトリトール（erythritol）、フシトール（fucitol）、ガラクチトール（galactitol）、グリセリン（グリセロール）（glycerol, glycerin）、イジトール（iditol）、イノシトール（inositol）、イソマルト（パラチニット）（isomalt）、ラクチトール（lactitol）、マルチトール（maltitol）、マンニトール（mannitol）、ポリグリシトール（水素化グルコース）（polyglycitol）、ソルビトール（sorbitol）、トレイトール（threitol）、ボレミトール（volemitol）、及びキシリトール（xylitol）を含むが、これらに制限されない。本発明において、糖アルコールの以外、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース及びラクトースのような糖を使用してもよい。また、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース及びラクトースのような糖は糖アルコールの代わりに用いられてもよい。

核酸分子、例えばデオキシリボ核酸（DNA）及びリボ核酸（RNA）は、連続するヌクレオチド分子間のリン酸ジエステル結合で負に帯電した物質になるため、正に帯電した化合物と相互作用する傾向がある。しかしながら、水におけるイオンは加水分解力によってDNA、特にRNAの結合構造を破壊し、分解が起こってしまう場合が多い。RNA／DNAの分解を防止するために、アルコール類は強極性を有し、水分子をRNA鎖及びDNA鎖から除去することができるため、RNA鎖及びDNA鎖構造の完全性を安定化させることが知られる。本発明において、発明者は修飾された糖アルコール及び多糖で機能性RNA／DNAsを包むことにより、生体外及び体内の送達を行う。しかしながら、pHが低い条件で、糖アルコール及び糖は一般的にいずれの電荷も帯電していない。微量の負電荷があっても、負に帯電した核酸と十分な交互作用を発生させることができない。人工誘導多能性幹細胞（iPSCs）から分離したマイクロリボ核酸miR-302を検討する時に、発明者はいくつかの新規な修飾された糖／糖アルコールが常にmiR-302とともに精製されてきたことを発見した。また、これらの修飾された糖／糖アルコールはmiR-302前駆体のヘアピン構造を安定化させて分解から保護するために用いられる。これらの糖／糖アルコールの特徴について、発明者は、続いた研究の結果ではグリシル化がこれらの糖／糖アルコールに対する修飾方式の1つであり、細胞内で糖／糖アルコールとRNAs／DNAsとの間、特にヘアピン様マイクロリボ核酸前駆体（即ちpri-／pre-miRNAs）との間の交互作用を促進及び向上させることを開示した。また、その他のある類似する修飾、例えばグリシン化アミノ酸によるグリシル化及びグルタミル化（glutamylation）も同じ又は近似する機能を提供する。

図1A及び1Bは糖アルコールのグリシル化を示し、該化学反応は正に帯電した糖／糖アルコールの生成に用いられ、それによって分離した又は組み換えたRNAs／DNAs及び／又はRNA／DNA様の合成分子と安定した送達複合体を形成することによって、藥及び治療方法を発展すると新たに発見された。従来では、グリシル化がアミノ酸の間に発生することのみが知られ、糖又は糖アルコールの間に発生するかどうかが未知である。しかしながら、ここで開示したように、グリシル化の化学反応はグリシンのグリシル基（NH₂CH₂COO-）で糖アルコール又は糖の水酸基（HO-）を置換し、糖／糖アルコールのOHが除去された各々の炭素とグリシル基の間にエーテル結合（R-O-R）を形成する。この反応は脱水による縮合過程も含む。例えば、該糖アルコールがグリセロール（グリセリン）である場合には、グリセロールのグリシル化によって3種類の反応生成物を生成し、一つは1-、2-、又は3-モノグリシルグリセロール（monoglycylglycerol, MGG）であり、もう一つは1,2-、2,3-、又は1,3-ジグリシルグリセリン（diglycylglycerin, DGG、図1A）であり、もう一つは1,2,3-トリグリシルグリセリド（triglycylglyceride, TGG、図1B）である。この例において、グリシル化は部分的又は完全な反応であってよく、例えば、MGGとDGGは部分的グリシン化の生成物であり、TGGは完全グリシン化の生成物である。MGG、DGG及びTGGはいずれも正に帯電した分子であり、負に帯電した物質、例えばRNA、DNA及びいずれの他の酸性物質と、イオン／静電親和力によって相互作用するため、細胞内の送達に用いられる。この電気親和力により、DNA／RNAとグリシン化糖／糖アルコールとの混合物は包まれた複合体又はポリマーを容易且つ直ちに形成する。天然糖のように、これらの修飾された（即ちグリシン化された）糖アルコールは細胞により受容体媒介の（receptor-mediated）エンドサイトーシスによって吸収されることができる。且つ、高い分子量を有する糖アルコール／糖は高次のグリシル化構造を形成することができるが、これらの修飾された糖／糖の基本機能及び摂取メカニズムは類似する可能性がある。

これまで、糖アルコール／糖のグリシル化反応を報道したことはない。本発明は初めてその存在、自然状態機能及び関連利用を開示する。グリシル化糖アルコール／糖は全種類の負に帯電した小物質（有機又は無機化学化合物及び薬物を含む）と交互作用して細胞内の送達を行うことができるため、これらのグリシル化糖アルコール／糖は各種の治療上、薬学上及び化粧用の製品、装置及び応用の発展に適用できる。例えば、ヒドロキシアパタイト（HA）、充填したナノ粒子、ヒアルロン酸／コウジ酸／アスコルビン酸、アルブチン及び／又は抗チロシナーゼのmiRNAs／shRNA／siRNA／DNAsを表皮細胞に形質導入することにより皮膚に対して増白などの美粧及び／又はしわ除去の効果を有する。その他の実施例において、グリシル化糖アルコール／糖は、機能性マイクロリボ核酸（即ちpre-miRNA／shRNA）及び／又はその低分子干渉リボ核酸（siRNA）擬態を包み、及び調製することに用いられ、疾患処理の治療藥／ワクチンとすることができる。この点で、マイクロリボ核酸、例えばmiR-34、miR-146a、miR-142-3p及びmiR-302は各種のヒト腫瘍／癌を治療する腫瘍抑制因子として使用されることができ、上述したヒト腫瘍／癌は肝、肺、骨、前立腺、乳の癌及び脳腫瘍、白血病[Lin et al．, （2008） RNA 14:417-424; （2008） RNA 14:2115-2124; （2010） Cancer Research 70:9473-9482]を含むが、これらに制限されない。更に、これらの糖アルコール／糖は、遺伝子治療及び抗ウイルス治療によく使用される担体系のDNA／RNA薬物及び／又はワクチンを保護及び送達することに用いられることができる。このため、本発明は各種の美粧、薬学及び治療の設計、装置及び応用に適用できる。

グリシル化糖アルコールによるリボ核酸の分解の防止
小非コードリボ核酸（small non-coding RNAs, ncRNA）は非常に不安定で、且つ体外、特に生体内で分解しやすいことが知られる。これらのncRNAの分解は人体内の体液を模擬するための生理食塩水（0．9％ w／v NaCl）で高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって測定することができる。例えば、図2Aに示すように、新鮮なmiR-302前駆体のサンプルと、高圧蒸気処理し溶解され、室温で3日間放置したmiR-302前駆体のサンプル（実施例1）とを比べると、前駆体miR-302（pre-miR-302のほとんどが単一ヘアピンループの前駆体である）及び原始miR-302（四重ヘアピンループクラスタのpri-miR-302）の中で、69％以上のものは3日内で高速に分解したことが分かっており、該時間が短過ぎて、RNA干渉に関する一切の遺伝子サイレンシング効果を引き出し難い。miR-302ファミリークラスタの遺伝子（図2、SEQ．ID．NO．1）の一次リボ核酸転写産物であるpri-miR-302は、Drosha／Pashaの消化（エクソンのpre-miRNAを形成する）、スプライセオソームによる接合／除去（イントロンのpre-miRNAを形成する）、又は加水分解によって、1つ又は複数の前駆体マイクロリボ核酸（即ちpre-miR-302）分子に処理されることができる。Pre-miR-302はmiR-302前駆体の機能的な形態であり、且つ更にリボヌクレアーゼIIIダイサー（（RNAse III） Dicer）により処理され、RNA誘導型サイレンシング複合体（RISC）を組み合わせることにより、その特定な遺伝子サイレンシング効果を引き出す。図2Cに示すように、処理後に得られたpre-miR-302の同型異性体はpre-miR-302a （SEQ．ID．NO．2）、pre-miR-302b （SEQ．ID．NO．3）、pre-miR-302c （SEQ．ID．NO．4）、及びpre-miR-302d （SEQ．ID．NO．5）を含む。しかしながら、miR-302前駆体の急速分解の特性のため、新鮮なサンプルにおけるこれらのpre-miR-302分子を明らかで確実に識別することができるが、3日放置したサンプルからマイクロリボ核酸をシークエンシングすることが困難である。

新鮮なmiRNAの構造を維持するために、発明者はmiR-302の新鮮なマイクロリボ核酸のサンプル内に0．1Mのグリシル化糖アルコール（即ちMGG／DGG／TGG）を加えて混合し、次に、同様な実験ステップを実行し、且つHPLCによって前述した分析を行った。RNA／DNAを溶解するためのグリシル化糖アルコール溶液の最終濃度範囲が約0．1μM〜約10Mであってよく、最も好ましくは約0．05M〜1．5Mである。RNA／DNAはMGG／DGG／TGG溶液での最大溶解度が12〜15mg／mLに達することができる。図2Dに示すように、室温での生理食塩水では、これらの糖アルコールで処理されたサンプルは3日間後に分解がほとんど発生しない。この結果から明らかなように、グリシル化糖アルコールはヘアピン様RNA構造の完全性を維持することができ、それによりこれらのヘアピンRNAs、例えばマイクロリボ核酸前駆体（miRNA）、小ヘアピンマイクロリボ核酸（shRNA）、低分子干渉リボ核酸（siRNA）及びリボザイムの分解を防止することができる。RNA干渉に関する遺伝子サイレンシング効果は、完全に効果が出るために、少なくとも3日間の活化時間を必要とするため、本発明の新規な糖アルコール組成物はこれらのヘアピンRNAsの構造を十分に長い時間安定させ、その特定な遺伝子サイレンシング効果を引き出すために用いられる。このため、本発明は、例えば化粧品、薬学及び治療等の様々な製品及び応用で、これらの機能性ヘアピンRNAsの構造完全性及びその効果を両立させることができる。

トランスフェクションされた細胞内での糖アルコールにより送達されたマイクロリボ核酸の識別
糖アルコール処理による核酸組成物が哺乳類細胞に入る送達効率を測定するために、発明者はmiR-302ファミリークラスタ遺伝子トランスフェクションした（実施例1）コンピテント細胞からmiR-302前駆体（即ちpri-miR-302sとpre-miR-302s）を分離して精製し、次に、1．0MのDGG／TGGによって400μgの分離したmiR-302前駆体を2mlの細胞培養基で培養された約2〜4百万個のヒト角化細胞に送達することを試した（実施例3）。送達効率を向上させるために、HPLC（図8）を使用してMGG／DGG／TGGの混合溶液から濃縮されたDGG／TGGを精製する。図3Aと3Bに示すように、マイクロアレイの結果（実施例5）からこれらの分離したmiR-302前駆体が成功に標的細胞に送達され、更に成熟miR-302分子（例えばmiR-302a、b、c、d及びmiR-302a*、b*、c*、d*）に処理されたことを示した。これは、グリシル化糖アルコールはこれらのヘアピンRNAsをヒト細胞に効果的に送達するだけでなく、RISCsを形成させることを促進し、所期の効果を引き出すことができることを示す。角化細胞は一切のmiR-302を表現しない（図3A）ため、処理された角化細胞内で発見された豊かなmiR-302分子は必然的にすべてがグリシル化糖アルコールの送達効果及びそれにより送達したmiR-302前駆体に由来する。また、該発見は、主動的な輸送メカニズム、例えばエンドサイトーシスが、この高効な送達効果に寄与する可能性があることを示す。このように、修飾された糖アルコール及びその誘導体は自然に細胞により受容体を介したエンドサイトーシス機構によって吸収されることができる。

糖アルコールにより送達した抗癌マイクロリボ核酸の癌細胞の成長に対する効果
更に糖アルコールにより送達する薬の薬効を観察するために、発明者はMGG／DGG／TGGにより包んだmiR-302前駆体（pri-／pre-miR-302s）を用いて、最終濃度0、200、400μg／mlという異なる三種の最終濃度でそれぞれヒト肝癌細胞HepG2を処理する。MGG／DGG／TGGを介したmiR-302の送達を同時に表示するために、発明者は0、75、750及び1500mg／10mLという異なる四種のグリシル化程度のグリシン-グリシル化グリセリン（MGG／DGG／TGG）でこれらのpri-／pre-miR-302sを包む。発明者は先に体外に担体で表現する研究結果から、miR-302は95％以上の癌細胞の増殖を抑制できると共に、ただ5％-10％以下の正常細胞の成長に影響を及ぼすことを示す（Lin et al．, （2010） Cancer Research 70:9473-9482）。図4Aに示すように、本発明によって送達したグリシル化糖アルコールで包んだmiR-302はヒト癌細胞の成長上で用量依存に近接する抑制効果を示し、図4Bは同体積（コントロール群の体積とグループ35μl／70μlの体積がいずれも同じである）のグリシル化糖アルコールが単独で効果を全く果たしなく、毒性発生もないことを示す。言い換えると、観察したmiR-302の治療効果は確かにグリシル化糖アルコールにより包み処方で送達されたmiR-302（実施例2）に由来する。

MGG／DGG／TGGにより送達したmiR-302の腫瘍抑制効果は同様に体内で観察された。図4Cに示すように、発明者は250μgのMGG／DGG／TGGで包んだpri-／pre-miR-302s（濃度5μg／μL）をNOD SCIFヌードマウス（グループ当たりのn=6）に移植したHuh-7細胞異種移植腫瘍毎に注射した。9回の処理（2回あたりの処理の間隔が2〜4日間である）を経たところ、どんな処理もされていないコントロール群と比べて、処理されたすべてのヒト異種移植腫瘍は体積を73％より大きくて顕著に減少させるという治療効果に達したことを示す。注意すべきなのは、コントロール群の腫瘍は3週間の実験期間で11倍以上に成長したが、処理されたグループが3倍しか拡大しなく、癌の急速増殖の治療及び手術による腫瘍除去後の癌の再発の防止には非常に有益な腫瘍抑制効果を示す。このため、図4Cの結果はグリシル化糖／糖アルコールを介したmiRNA／shRNA／siRNAの体内送達の高効率を明らかに表す。腫瘍／癌細胞は正常細胞より糖物質に対する吸収が速いため、グリシル化糖／糖アルコールで包んだmiRNAs／shRNAs／siRNAsは生体内で腫瘍／癌により摂取されやすい。このため、これらのグリシル化糖／糖アルコールは包まれたRNAsを送達するだけでなく、送達されるRNAsの機能を標的細胞に導入することにも成功する。

マウス体内における糖アルコールにより送達したmiRNA／siRNA擬態の分布
糖アルコールで包んだ核酸組成物の体内送達効率と毒性を測定するために、発明者は各C57BL／6J系マウス（実施例6、n=6）に対して、200μl、濃度1．0MのDGG／TGGに溶けた、200μgの合成されたmiR-302擬態を静脈注射した。24時間の後、発明者は2匹のマウスの犠牲によってDGG／TGGにより送達したsiR-302の体内での分布の情報を取得し、他の4匹のマウスを保留して更に生存率の分析を行った。これらのsiR-302分子はいずれも赤外蛍光染料Cy5．5でマークされたため、バイオイメージングシステムを使用して体内組織におけるその分布を検出し、又は蛍光顕微鏡でマウス組織切片の蛍光信号を直接観察することができる。図5は注射処理されたマウスの各種の組織／臓器切片の顕微鏡下での画像であり、ほとんどのCy5．5でマークされたsiRNA分子が心臓、肝臓、脾臓及び血管内皮細胞内に送達され、且つ骨髄及び肺細胞にも散在しており、これにより、グリシル化糖／糖アルコールで包んだ核酸組成物の体内での送達効率を更に確定する。一方、他の4匹に同様な糖アルコールで包んだsiR-302を注射し、且つ2週間の実験期間（図6）で逆効果がなく、これにより、該新規な送達組成物と方法は体内で安全であることを示す。

要するに、発明者は、核酸組成物の構造完全性を維持する面だけではなく、且つ生体内又は体外でこれらの機能性核酸組成物を細胞に送達する面でも新規な糖アルコール組成物の使用が実現される。これらの機能性核酸組成物は、マイクロリボ核酸前駆体（miRNA）、小ヘアピンリボ核酸（shRNA）、低分子干渉リボ核酸（siRNA）、リボザイム、アンチセンスRNAs／DNAs、RNA-DNAヘテロ接合体及びDNA担体／ワクチンを含むが、これらに制限されない。安全性及び効率は薬物送達の2つの主要な考慮事項となり、本発明に係る糖アルコール組成物は無毒及び高い組織透過性という特性を有するため、上記の考慮事項及び生体内での有効送達を達せ、該送達によって多種の応用、例えば核酸類化粧、薬学及び治療応用を提供する。なお、本発明におけるこれらの修飾された（グリシル化）糖アルコール組成物を調製する全ての材料はFDA規定に合致する無毒成分である。

A．定義
本発明をより理解しやすくするために、幾つかの名詞を以下のように定義する。
ヌクレオチド（Nucleotide）：糖成分（ペントース、pentose）、リン酸基（phosphate）、及び窒素複素環塩基（nitrogenous heterocyclic base）を含むデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）のモノマーである。該塩基はグリコシド炭素（glycosidic carbon、該ペントースの一端（1’）炭素）によって該糖成分と結合し、且つ該塩基と糖との組合せがヌクレオシド（nucleoside）である。該ペントースの3’末端や5’末端の位置に少なくとも1つのリン酸基が結合しているヌクレオシドはヌクレオチド（nucleotide）である。デオキシリボ核酸（DNA）とリボ核酸（RNA）はそれぞれ異なるヌクレオチド単位、即ちデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドで構成される。

オリゴヌクレオチド（Oligonucleotide）：2個以上、好ましくは3個以上、通常は10個以上のデオキシリボ核酸（DNA）及び／又はリボ核酸（RNA）のモノマーを含む分子である。13個以上のモノマーを含有するオリゴヌクレオチドは一般的にポリヌクレオチド（polynucleotide）とも呼ばれる。オリゴヌクレオチドの正確な長さが多くの要因によって決まり、さらに該オリゴヌクレオチドの最優な機能又は用途によって決まる。オリゴヌクレオチドは、化学合成、DNA複製、RNA転写、逆転写、又はそれらの組合せを含むいかなる方法で生成することができる。

ヌクレオチド類似体（Nucleotide Analog）：プリン（purine）又はピリミジン（pyrimidine）ヌクレオチドであって、構造ではA（アデニン）、T（チミン）、G（グアニン）、C（シトシン）又はU（ウラシル）ヌクレオチドとは異なるが、十分に類似しているので、核酸分子における正常のヌクレオチドを置換することができる。

核酸組成物（Nucleic Acid Composition）：核酸組成物とは、一本鎖または二本鎖分子構造を有するDNA又はRNA配列、又はDNA／RNA配列の混合のような、天然又は合成のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、を指す。

遺伝子（Gene）：核酸組成物であって、そのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの配列がリボ核酸及び／又はポリペプチド（タンパク質）のコードである。遺伝子はリボ核酸又はデオキシリボ核酸のいずれであってもよい。遺伝子は非コードリボ核酸、例えば小ヘアピンリボ核酸（shRNA）、マイクロリボ核酸（microRNA、miRNA）、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、及びそのリボ核酸前駆体及び誘導体をコードすることができる。遺伝子はまた、タンパク質／ペプチド類の合成に必須のタンパク質コードリボ核酸（protein-coding RNA）、例えば伝令リボ核酸（mRNA）及びその前駆体と誘導体をコードすることができる。いくつかの場合において、遺伝子でコードするタンパク質コードリボ核酸（protein-coding RNA）は少なくとも1つのmicroRNA又はshRNAの配列を含有してもよい。

一次リボ核酸転写物（Primary RNA Transcript）：リボ核酸配列であって、直接遺伝子のDNAで転写され、RNA処理も修飾も施されておらず、hnRNA、pre-mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、pri-microRNA（pri-miRNA）、ウイルスRNA及びこれらの前駆体と誘導体からなる群から選ばれるものである。ウラシル（U）は転写された後チミン（T）に置換される。

前駆体伝令リボ核酸（Precursor messenger RNA、pre-mRNA）：タンパク質コード遺伝子は真核細胞のII型真核RNAポリメラーゼ（Pol-II）により、転写作用と呼ばれる細胞内メカニズムで生成された一次伝令リボ核酸転写分子である。前駆体伝令リボ核酸（pre-mRNA）の配列は、5’末端非翻訳領域（5’-untranslated region, UTR）、3’末端非翻訳領域（3’-UTR）、エクソン（exon）及びイントロン（intron）を含む。

伝令リボ核酸（Messenger RNA、mRNA）：前駆体伝令リボ核酸のエクソンの組合せである。伝令リボ核酸は、細胞内のRNAスプライシング機構（intracellular RNA splicing machineries）、例えばスプライソソーム（spliceosomes）によりイントロンを除去した後形成され、且つペプチド類／タンパク質の合成にはタンパク質コードリボ核酸である。該伝令リボ核酸がコードするペプチド類／タンパク質は酵素、増殖因子、インスリン、抗体及びこれらの類似物／相同体と誘導体を含むが、これらに限定されない。

相補的デオキシリボ核酸（Complementary DNA、cDNA）：mRNA配列と相補的な配列を有し、イントロン配列が全く含まれない一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸（DNA）である。

センス核酸（Sense）：配列順及び組成が相同なmRNAと同じ核酸分子である。符号「+」、「s」又は「sense」でこのセンス核酸構造形態を示す。
アンチセンス核酸（Antisense）：個々のmRNA分子と相補的な核酸分子である。符号「-」又は「*」でこのアンチセンス核酸構造形態を示し、又は、「aDNA」又は「aRNA」のように、DNA又はRNAの前に「a」又は「antisense」を付けて示す。

塩基対（Base Pair、bp）：二本鎖DNA分子に存在するアデニン（adenine、A）とチミン（thymine、T）、又はシトシン（cytosine、C）とグアニン（guanine、G）のマッチ（partnership）である。RNAにおいて、ウラシル（uracil、U）でチミン（thymine、T）を置換する。一般的には、該マッチは水素結合（hydrogen bonding）を介してなる。例えば、センスヌクレオチド配列の「5’-A-T-C-G-U-3’」とそのアンチセンス配列である「5’-A-C-G-A-T-3’」とは完全塩基対を形成することができる。

5’末端（5’-end）：連続したヌクレオチドの1つの末端であって、該末端は5’末端（5’）の位置にヌクレオチドを連結しない。該連続したヌクレオチドにおいて、1つのヌクレオチドの5’末端（5’）水酸基はリン酸ジエステル結合で次のヌクレオチドの3’末端（3’）水酸基に連結される。該末端には他の官能基、例えば1つ又は複数のリン酸基があってもよい。

3’末端（3’-end）：連続したヌクレオチドの1つの末端であって、該末端は3’末端（3’）の位置にヌクレオチドを連結しない。該連続したヌクレオチドにおいて、1つのヌクレオチドの5’末端（5’）水酸基はリン酸ジエステル結合で次のヌクレオチドの3’末端（3’）水酸基に連結される。該末端には他の官能基、一般的に水酸基があってもよい。

テンプレート（Template）：核酸ポリメラーゼで複製されることができる核酸分子である。異なるポリメラーゼによって、テンプレートは一本鎖、二本鎖又は、部分的な二本鎖であってもよい。合成後の複製物は該テンプレート、該二本鎖テンプレート又は部分的な二本鎖テンプレートの少なくとも1本鎖と相補する。RNAとDNAはいずれも5’末端（5’）から3’末端（3’）への方向に合成される。核酸二本鎖体（duplex）の二本鎖は常にアライメントしているので、これらの二本鎖の5’末端（5’）が該二本鎖体の反対端にある（これらの二本鎖の3’末端も同様である）。

核酸テンプレート（Nucleic Acid Template）：二本鎖DNA分子、二本鎖RNA分子、ヘテロ接合分子（例えばDNA-RNA又はRNA-DNAヘテロ接合物）、又は一本鎖DNA若しくはRNA分子である。

保存（Conserved）：ヌクレオチド配列が予め選択された（参照）配列の精確な相補物（complement）と非ランダムにヘテロ接合する場合、該ヌクレオチド配列が該予め選択された配列に対して保存配列である。

相同（Homologous又はHomology）：ポリヌクレオチド配列と遺伝子又は伝令リボ核酸（mRNA）配列が類似であることを指す。核酸配列が特定の遺伝子又はmRNA配列と部分的又は完全に相同であっても良い。相同は全ヌクレオチド数の類似ヌクレオチド数が占める比率で表すこともできる。

相補（Complementary又はComplementarity又はComplementation）：2つのポリヌクレオチドが前記塩基対規則（「base pair （bp）」 rule）に従って発生した塩基のマッチであり、例えばmRNAとcDNA配列である。例えば、配列「5’-A-G-T-3’」が配列「5’-A-C-T-3’」と「5’-A-C-U-3’」とそれぞれ相補している。相補は二本のDNA鎖間、一本のDNA鎖と一本のRNA鎖の間、又は二本のRNA鎖間で発生してよい。相補は「部分的（不完全）」又は「全部（完全）」又は「全体」のものであってよい。幾つかの核酸塩基のみがこれらの塩基対規則に従って互いにマッチした場合、部分的相補（partial complementarity／complementation）と呼ばれる。塩基はこれらの核酸鎖間で完全にマッチした場合、完全又は全体相補（complete or total complementarity／complementation）と呼ばれる。核酸鎖間の相補程度は核酸鎖間のヘテロ接合の効率及び強度に対して大きく影響を与える。これは核酸間の結合（binding）による増幅（amplification）反応と検出方法にも非常に重要である。相補率（percent complementarity／complementation）とは該核酸の一本鎖におけるミスマッチ（mismatch）の塩基数が全部塩基に占める割合である。このため、50％の相補率とは塩基の半分がミスマッチ（mismatched）で、他の半分がマッチしていることを意味する。核酸の二本鎖は塩基数が異なっても、核酸の二本鎖が相補することができる。この場合には、相補が長鎖の部分と短鎖との間に発生し、該長鎖の該部分の塩基と短鎖の塩基とはマッチする。

相補塩基（Complemetary base）：DNA又はRNAが二本鎖の構造を形成する場合に、正常にマッチしているヌクレオチドである。
相補ヌクレオチド配列（Complemetary Nucleotide Sequence）：一本鎖DNA又はRNA分子のヌクレオチド配列が、もう一方の一本鎖と十分に相補しており、二本鎖の間で水素結合により専一にヘテロ接合する。

ヘテロ接合（Hybridize及びHybridization）：核酸配列間の二本鎖体の形成であって、塩基マッチ及びヌクレオチド配列間の十分な相補により形成される。プライマー（又は連続テンプレート）が標的（テンプレート）と「ヘテロ接合」する場合、ヘテロ接合により形成された複合体（又はヘテロ接合物、hybrids）が十分に安定しているので、DNAポリメラーゼによりDNA合成を開始するために必要な開始機能を提供する。2つの相補ポリヌクレオチド間には競合的に阻害（competitively inhibited）される特異的な（即ち非ランダム）相互作用がある。

転写後遺伝子サイレンシング（Posttranscriptional Gene Silencing）：標的遺伝子のノックアウト（knockout）又はノックダウン（knockdown）であって、mRNA分解又は翻訳阻害（translational inhibition）階段の結果であり、且つ一般的に外来／ウイルスDNA又はRNA導入遺伝子又は小型阻害性RNAsのいずれかによって引き起こされる。

リボ核酸干渉（RNA interference、RNAi）：真核細胞内の転写後遺伝子サイレンシングメカニズムであって、マイクロリボ核酸（microRNA、miRNA）、小ヘアピンリボ核酸（shRNA）及び低分子干渉リボ核酸（siRNA）のような小型阻害性RNA分子によって誘発することができる。これらの小型RNA分子は一般的に遺伝子サイレンサーとして、細胞内のこれらの小型RNAと完全又は部分的に相補する遺伝子の発現、該遺伝子転写物の翻訳又は両方を干渉することができる。

遺伝子サイレンシング効果（Gene silencing effect）：遺伝子機能が阻害された後の細胞反応であって、発癌遺伝子の発現の阻害、細胞増殖の阻害、細胞周期停止、腫瘍阻害、癌の退縮、癌の回避、癌細胞のアポトーシス、細胞回復／再生、細胞再プログラム、疾患細胞の相対的正常な状態への再プログラム（自発的治療）及びこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。

非コードリボ核酸（Non-coding RNA）：細胞内翻訳メカニズムによりペプチド類又はタンパク質を合成することができないRNA転写物である。非コードリボ核酸には、長い及び短い調節性RNA分子、例えばマイクロリボ核酸、小ヘアピンリボ核酸、低分子干渉リボ核酸、及び二本鎖リボ核酸を含む。これらの調節性RNA分子は一般的に遺伝子サイレンサーとしての機能を有し、細胞内におけるこれらの非コードリボ核酸と完全又は部分的に相補する遺伝子の発現を干渉する。

マイクロリボ核酸（MicroRNA、miRNA）：一本鎖リボ核酸であって、該マイクロリボ核酸（miRNA）と部分的に相補する標的遺伝子の転写物に結合することができる。成熟したmiRNAは一般的に長さが約17〜27個のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドであり、且つ該miRNAとその標的mRNAと間の相補程度により細胞内のmRNA標的物を直接分解し、又はその標的mRNAのタンパク質翻訳を阻害することができる。天然のmiRNAはほとんどすべての真核細胞内では発見され、例えばウイルス感染に対抗する防御能力を有すると共に、動植物の発育期間で特定の遺伝子発現を調節することができる。一般的には、miRNAは常に複数のmRNA標的物を有し、それによりその機能を完全に実現する一方で、多数のmiRNAは同様な遺伝子転写物を標的として遺伝子サイレンシング効果を強化する。

マイクロリボ核酸前駆体（pri-／pre-miRNA）：ヘアピン様一本鎖リボ核酸であって、リボヌクレアーゼIII―ダイサーエンドリボヌクレアーゼ（（RNAse III） Dicer endoribonucleases）と作用し、1つ又は複数の成熟したマイクロリボ核酸（miRNAs）を生成するステムアーム（stem-arm）及びステムループ（stem-loop）領域を含み、これらのマイクロリボ核酸はその標的遺伝子、又は配列が該（これら）マイクロリボ核酸の配列と完全又は部分的に相補する遺伝子をサイレンシングすることができる。マイクロリボ核酸前駆体のステムアーム領域は完全（100％）又は部分的（ミスマッチ（mis-matched））にヘテロ接合した二本鎖体を形成し、そのステムループ領域は該ステムアーム二本鎖体の一端と連結して円状又はヘアピン環状の構造を形成することにより、一部のargonauteタンパク質（AGO）とともにRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を組み合わせる。

低分子干渉リボ核酸（small interfering RNA、siRNA）：短鎖の二本鎖リボ核酸であって、長さが約18〜27個のリボヌクレオチドである完全な塩基のマッチするリボ核酸二本鎖体であり、且つそれにほぼ完全に相補する標的遺伝子の転写物を分解することができる。

小ヘアピン又は短ヘアピンリボ核酸（small hairpin又はshort hairpin RNA、shRNA）：一本鎖リボ核酸であり、部分的又は完全にマッチする一対のステムアームヌクレオチド配列を含み、該一対の配列はアンマッチ（unmatched）オリゴヌクレオチド環により分けられ、ヘアピン樣構造を形成する。多くの天然マイクロリボ核酸（miRNAs）はヘアピン樣リボ核酸前駆体、即ち前駆体マイクロリボ核酸（pre-miRNA）から誘導される。

担体（Vector）：組み換えDNA （recombinant DNA、rDNA）のような組み換え核酸組成物であって、異なる遺伝子環境で移動又は定着することができる。一般的には、それは操作可能に他の核酸分子に連結される。該担体は細胞内で自己複製が可能であり、該担体及びその連結した断片も複製される。好ましい担体はエピソーム（episome）、即ち染色体外（extrachromosomal）で複製可能な核酸分子である。好ましい担体は自己複製および発現が可能な核酸である。1つ又は複数のポリペプチド及び／又は非コード（non-coding）リボ核酸をコードする遺伝子の発現を誘導できる担体は、ここで「発現ベクター（expression vector）」又は「発現コンピテントベクター（expression-competent vector）」と呼ばれる。特に重要な担体は逆転写酵素（reverse transcriptase）を使用してmRNAsからcDNAをクローニング（cloning）することができる。担体の成分は、ウイルスプロモーター、II型（type-II）RNAポリメラーゼ（Pol-II又はpol-2）プロモーター又はこれらの両方、Kozak翻訳開始共通配列（Kozak consensus translation initiation site）、ポリアデニル化シグナル（polyadenylation signals）、複数の制限／クローニングサイト（restriction／cloning site）、pUC複製起点（pUC origin of replication）、複製コンピテント（replication-competent）原核細胞で少なくとも1つの抗生物質耐性遺伝子を発現させるためのSV40早期プロモーター（SV40 early promoter）、哺乳動物細胞内の複製に用いる選択的SV40複製起点（SV40 origin）、及び／又はテトラサイクリン応答エレメントを含むことができる。担体の構造は直鎖状又は環状の一本鎖又は二本鎖DNAであってよく、且つプラスミド、ウイルス担体、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、DNA導入遺伝子、ジャンピング遺伝子、及びこれらの組合せからなる群から選ばれる。

プロモーター（Promoter）：ポリメラーゼ分子により識別される（又はそれに結合される）核酸であり、それによりリボ核酸転写を開始させる。本発明により、プロモーターは、既知のポリメラーゼ又はその補因子（cofactor）の結合位置、エンハンサー又は類似物、又は必要なポリメラーゼを使用してRNA転写分子の合成を開始することができるいずれかの配列であっても良い。

RNA処理（RNA processing）：RNAの成熟、修飾、及び分解に関する細胞内メカニズムであって、RNAスプライシング、イントロン除去、エキソソーム消化（exosome digestion）、ナンセンス仲介減衰（nonsense-mediated decay、NMD）、RNAエディティング、RNA処理及びそれらの組合せを含む。

標的細胞（Targeted Cell）：体細胞、組織、幹細胞、生殖細胞、奇形腫細胞、腫瘍細胞、癌細胞、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる1個又は複数個のヒト細胞である。

癌組織（Cancerous Tissue）：皮膚癌、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍／癌、リンパ癌、白血病、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる腫瘍組織である。
遺伝子送達（Gene Delivery）：遺伝子工学方法であって、ポリソーム（polysomal）トランスフェクション、リポソーム（liposomal）トランスフェクション、化学的トランスフェクション、電気穿孔、ウイルス感染、DNA組み換え、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、マイクロインジェクション、遺伝子銃による貫入、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる。

遺伝子工学（Genetic Engineering）：DNA組み換え方法であって、DNA制限酵素反応およびライゲーション反応、相同的組み換え、導入遺伝子組み込み、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、レトロウイルス感染、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる。

腫瘍の阻害効果（Tumor Suppression Effect）：細胞の抗腫瘍及び抗癌のメカニズム及び反応であって、細胞周期の減衰、細胞周期の停止（arrest）、腫瘍細胞成長の阻害、細胞の腫瘍発生の抑制、腫瘍／癌細胞の形質転換の阻害、腫瘍／癌細胞のアポトーシスの誘導、正常細胞への回復の誘導、高度悪性の癌細胞の比較的良性の低段階状態への再プログラム（腫瘍の退縮）、及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。

癌の治療効果（Cancer Therapy Effect）：薬物処理による細胞反応及び／又は細胞メカニズムであって、発癌遺伝子の発現の阻害、癌細胞増殖の阻害、癌細胞の侵入及び／又は移動の阻害、癌細胞転移の阻害、癌細胞死亡の誘発、腫瘍／癌の発生の回避、癌再発の回避、癌進行の阻害、損傷組織細胞の回復、高度悪性腫瘍の比較的良性の低段階の状態への再プログラム（癌の退縮／寛解）、及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。

癌の逆転（Cancer Reversion）：体外、離体又は生体内の再プログラムメカニズムであって、高段階の癌細胞を相対的に正常に近接する、低段階の状態に調整する。
標的細胞（Targeted Cell）：体細胞、組織、幹細胞、生殖腺細胞、腫瘍細胞、癌細胞及びそれらの組合せからなる群から選ばれる1個又は複数個のヒト細胞である。

グリシン化（グリシル化）（Glycylation）：化学反応であって、糖アルコール又は糖の水酸基（-OH）がグリシン又はグリシルアミノ酸のグリシル基（NH₂CH₂COO-）で置換され、且つ該糖アルコール／糖の水酸基を脱去した炭素原子と該グリシン及び／又はグリシルアミノ酸のグリシル基（glycyl group）との間でエーテル結合（R-O-R）を形成する。

薬学上及び治療上の応用：生物医学的使用であり、診断の処理方法、装置及び／又は設備、幹細胞の生成、幹細胞研究及び／又は治療開発、組織／臓器の回復及び／又は再生、傷口の治癒処理、腫瘍抑制、癌の治療及び／又は予防、疾患処理、薬物の生産、及びこれらの組合せに用いられる。

原核細胞：単細胞生物であり、該単細胞生物は明らかな膜結合（membrane-bound）の細胞核が欠如しており、且つその遺伝物質はDNAの連続鎖（continuous strand）として存在する。

B．組成物及び応用
（a）少なくとも1つの負電荷を帯びた少なくとも1つの核酸組成物と、（b）グリシル化で修飾された少なくとも1つの糖又は糖アルコール組合物と、を含み、（a）と（b）がある条件で混合して少なくとも1つの送達複合体を形成する組合物、及びその糖、糖アルコールとともに核酸組成物を調製して安定した複合体を形成して生体外及び体内で哺乳細胞に送達する使用方法である。前記核酸組成物はマイクロリボ核酸（miRNA）及びその前駆体、小ヘアピンRNA（shRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、リボザイム、アンチセンスRNAs／DNAs、RNA-DNAヘテロ接合物、DNA担体／ワクチン、及びそれらの組合せであってもよい。送達複合体を形成する条件は、pHが8．0よりも小さく、且つ好ましくは約2．5〜約7．0である。

一般的には、本発明は新規なグリシル化方法及びその正に帯電した糖アルコール及び／又は糖化合物を生成する使用方法を開示し、該正に帯電した糖アルコール及び／又は糖化合物は負に帯電した核酸組成物と共有結合又は水素結合ではなく、イオン結合及び／又は静電気親和力により相互作用することができる（図7）。このイオン／静電気親和力は修飾された糖／糖アルコールのグリシル基及びRNA／DNAsのリン酸ジエステル結合で形成された骨格間に形成されるので、その上に結合された糖／糖アルコールにより水分子をRNA／DNA骨格から排除し、それにより加水分解を回避するとともにこれらの核酸組成物構造の完全性を保護し、且つこれにより、生体内又は体外に関わらず、薬効を細胞に送達する収率を向上させることができる。

なお、本発明は糖アルコール及び／又は糖を含有する化学組成物は核酸組成物、例えばmiRNA、shRNA、siRNA、リボザイム及びDNAの完全性を保護するとともにその分解を防止することができることを最初に発見した。このため、本発明は組成物及びその核酸類薬物／ワクチンを細胞に送達する使用方法だけでなく、生体内、体外でこれらの核酸類藥及び／又はワクチンの構造的完全性及び効果を維持する重要な処方である。これらの新規な特徴により、本発明は多種の核酸類の化粧、薬学及び治療への応用の開発及び／又は促進に適用される。

図面及び実施例を特に参照するが、制限するものではなく、説明するためだけのものである。

国際公開第２０１１／１４３２３７号欧州特許出願公開第０５３５５３４号明細書国際公開第２００９／０２９０４６号米国特許第５６１８９３３号明細書国際公開第２００２／０３２３９８号

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図1A及び1Bはグリシン化の化学反応及び該反応で生成したグリシン化（グリシル化）糖アルコールを示す。例えば、グリセリン（グリセロール）はこの例において該糖アルコールであると、核酸送達に使用することができる2つの主要な反応生成物は1,3,-ジグリシルグリセリン（1A；DGG）及び1,2,3-トリグリシルグリセリド（1B；TGG）である。そのうち、DGGは部分的グリシン化の生成物（1A）であり、TGGは完全グリシン化の生成物（1B）である。図2A-2DはmiR-302前駆体（即ちpri-とpre-miR-302）の分解前と分解後の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析結果を示す。図2Aは新鮮なmiR-302前駆体及び分解したmiR-302前駆体のHPLCピーク形状態様を示す。新鮮なサンプルの分析結果（2A上）において、4．25分での小さなピーク（単一ヌクレオチド）、9．50分での主ピーク（単一ヘアピンループの前駆miR-302s（pre-miR-302））、10．4分での他の小さなピーク（二重ヘアピンループの前駆miR-302s）、及び12．5分での他の主ピーク（四重ヘアピンループの原始マイクロリボ核酸（pri-miRNA）クラスタ）という計4つのピークを含む。これに対して、分解したサンプル（生理食塩水に3日保存した）が不明確なピーク形態（2A下）を呈する。図2BはmiR-302ファミリークラスター遺伝子の配列を示し、miR-302前駆体の転写産物はこの配列に由来するものであり、また、転写されたmiR-302が処理された。図2Cは単一ヘアピンループの前駆miR-302sの同型異性体に関する個別な配列、即ちpre-miR-302a （SEQ．ID．NO．2）、pre-miR-302b （SEQ．ID．NO．3）、pre-miR-302c （SEQ．ID．NO．4）、及びpre-miR-302d （SEQ．ID．NO．5）を示す。図2Dは新鮮なmiR-302前駆体及び糖アルコールにより保護したmiR-302前駆体のHPLCピーク形状態様を示し、生理食塩水に3日保存した後に分解しないことを示す。図3Aと3Bはマイクロリボ核酸（miRNA）のマイクロアレイ分析の結果を示す。そのうち、該小リボ核酸は処理されていないブランクの角化細胞から、又は糖アルコールを介した（DGG／TGG-mediated）miR-302によりトランスフェクションされた角化細胞からのものである。図3Aはブランクの角化細胞内でmiR-302の表現がないことを示す。これに対して、図3Bは糖アルコールを介したmiR-302によりトランスフェクションを行った後に、豊かなmiR-302分子を検出したことを示す。これは、糖アルコール類（組成物）は小リボ核酸を送達することに成功したことを示す。図4A-4Bは糖アルコールを介して送達する抗癌薬物（即ちmiR-302）の治療効果を示す。最終濃度が0（コントロール群）、200μg／ml、及び400μg／mlである単離されたmiR-302前駆体（pre-／pre-miR-302s）でヒト肝癌細胞HepG2を処理する。また、修飾された糖アルコールの送達効果を示すために、発明者は4種類の異なるグリシル化修飾程度の糖アルコールでpri-／pre-miR-302を包んだ。そのうち、それぞれ0（コントロール群）、75mg、750mg及び1500mgのグリシンでグリセリンを修飾し、且つ最終濃度がそれぞれ0、0．1M以下、0．5M以下及び1．0M以下のMGG／DGG／TGGを生成する。図4Aに示す結果から分かるように、送達するためのMGG／DGG／TGG（即ち処方5）のグリシルレベルの向上に伴うmiR-302によるヒト癌細胞の成長の腫瘍抑制効果の向上は顕著な用量依存性を示した。一方、図4Bは単にMGG／DGG／TGG（即ちmiR-302を含まない）で細胞を処理することは一切の毒性効果を有しないことを示す。図4Cはグリシル化糖／糖アルコールによる生体内でのmiR-302の送達をさらに評価する結果を示す。そのうち、MGG／DGG／TGGで包んだpri-pre-miR-302による処理を経た後に、ヒトHuh-7腫瘍異種移植NOD SCIDヌードマウス（n=6）で腫瘍の大きさを平均71％以上減少させた治療効果を得た。図5は青色色素5．5（Cy5．5）でマークされたmiR-302類似体（siR-302）のマウス体内での分布状況を示し、該siR-302はsiRNAを合成する二本鎖（duplex）を含む。該二本鎖は5’-Cy5．5-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’ （SEQ．ID．NO．6）及び5’-Cy5．5-ACACUAAAAC AUGGAAGCAC UUA-3’ （SEQ．ID．NO．7）をヘテロ接合してなり、且つpre-miR-302a／cのステムアーム部分を模擬する。図6はマウスの生存率を示す。これらのマウスはグリシル化糖アルコールのみを静脈注射され（200μl、1．0MのDGG／TGG；n=4）、又はグリシル化糖アルコールで包んだsiR-302を静脈注射される（200μgのsiR-302は200μl、1．0MのDGG／TGGで包まれ、マウス6匹の中の2匹が犠牲し、毒性検出及び体内siR-302分布の分析（6-2）に用いられる）。図7はsiRNA／shRNA／miRNA／microRNA前駆体／リボザイム／DNA及びグリシル化糖／糖アルコール（例えば、DGGとTGG）の間の静電親合性の交互作用を示す。作用が発生した領域は緑の影でマークされており、DGG／TGGとRNA／DNA骨格のリン酸基と結合することを示す。RNA／DNAのリン酸基は核酸鎖の副溝に存在している。複数のグリシル化糖／糖アルコールがRNA／DNA鎖に付着した際に、糖／糖アルコールで包んだRNA／DNAを形成し、それによりRNA／DNAの構造を保護して体外及び生体内での送達を促進する。図8はHPLC精製法によってDGG／TGGとMGGを分離することを示す。

実施例
以下の実験説明において、次の略語が使用されている。M（モラー、molar）、mM（ミリモラー、millimolar）、μm（マイクロモラー、micromolar）、mol（モル、moles）、pmol（ピコモル、picomole）、gm（グラム、grams）、mg（ミリグラム、milligrams）、μg（マイクログラム、micrograms）、ng（ナノグラム、nanograms）、L（リットル、liters）、ml（ミリリットル、milliliters）、μl（マイクロリットル、microliters）、℃（摂氏温度、degrees Centigrade）、RNA（リボ核酸、ribonucleic acid）、DNA（デオキシリボ核酸、deoxyribonucleic acid）、dNTP（デオキシリボヌクレオチド-3リン酸、deoxyribonucleotide triphosphate）、PBS（リン酸緩衝生理食塩水、phosphate buffered saline）、NaCl（塩化ナトリウム、sodium chloride）、HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸、N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid）、HBS（HEPES緩衝生理食塩水、HEPES buffered saline）、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム、sodium dodecylsulfate）、Tris-HCl（トリスヒドロキシメチルアミノメタン-塩酸塩、tris-hydroxymethylaminomethane-hydrochloride）、ATCC（アメリカンタイプカルチャーコレクション、American Type Culture Collection、Rockville、MD）、hESC（ヒト胚性幹細胞、human embryonic stem cells）、及びiPSC（誘導多能性幹細胞、induced pluripotent stem cells）。

1．マイクロリボ核酸（miRNA）の製造及び分離、並びに低分子干渉リボ核酸の合成
予め製造されたmiR-302を表現するレトロウイルス担体であるpLenti-EF1alpha-RGFP-miR302（メロバイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタフェスプリングス）をZymo Research（カリフォルニア州アーバイン）から入手されたダイサー陰性細胞内に導入し、メーカーの提案に従って培養した。ただし、mirVana^TMマイクロリボ核酸分離キット（mirVana^TM miRNA isolation kit、Ambion、テキサス州オースティン）を使用し、メーカーの提案に従ってマイクロリボ核酸を分離した。分離したRNAs（pri-／pre-miR-302）は高圧蒸気滅菌された1倍TE緩衝液に溶解され、使用されるまで−80℃で保存された。HPLCの安定性試験において、分離されたRNAからAmicon Ultra-0．5mL 30K濾過カラム（Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ）で必要な量を再収集し、そして、高圧蒸気滅菌された生理食塩水に溶解した。siR-302の製造では、Sigma-Genosys（ミズーリ州セントルイス）から合成されたmiR-302擬態を購入し、それは、2つのCy5．5でマークされたRNA配列：5’-Cy5．5-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’（SEQ．ID．NO．6）及び5’-Cy5．5-ACACUAAAAC AUGGAAGCAC UUA-3’（SEQ．ID．NO．7）を含有する。実験に際しては、SEQ．ID．NO．6とSEQ．ID．NO．7のRNAをヘテロ接合し、siR-302を形成した。

2．糖アルコールのグリシル化及びmiRNA／shRNA／siRNAの調製
糖／糖アルコールのグリシル化の天然メカニズムはまだ明らかではないが、発明者は既にグリシル化糖アルコール及びグリシル化糖を人工で生成する化学ステップ及び方法を開発した。まず、使用される糖アルコールの由来により、濃度1．0Mグリセリン、0．3Mフルクトース、及び0．9％（w／v）水酸化ナトリウムを含有するpH2．5〜8．0基礎液を予め調製した。注意すべきなのは、アルカリ性物質で汚染されたいかなる糖アルコールを成功にグリシル化できない可能性がある。次に、グリシン化糖アルコール／糖の期待される最終濃度に基づいて、最終濃度が0．05〜3．0Mに達したグリシンをこの予め調製された基礎液に添加して混合した。次に、該グリシンを添加した溶液を、中性ないし弱酸性、及び45℃よりも高い条件で、好ましくは、75℃〜175℃で少なくとも30分間よりも多い時間、好ましくは、約12〜24時間で厳格に保存した。その後、選択的に0．1 Mマンニトールを添加することにより、任意の余分なグリシンを吸収した。溶液を更に少なくとも45℃よりも高い温度で12〜24時間保存した。最終溶液のpHが約6．0〜7．0に達すると、糖アルコール／糖のグリシル化が完成し、且つ該最終溶液は負に帯電した物質の調製及び送達に用いることができる。該調製は、グリシル化糖／糖アルコールと所望の核酸組成物とを混合することにより完成した。グリシル化糖アルコール／糖と核酸組成物の間では、静電気／電荷親和力により細胞が主動的なエンドサイトーシスにより吸収できる送達複合体を包んで形成した（図7）。図1Aと図1Bはグリシル化反応の模式図であり、グリセリンを使用した。

3．ヒト細胞培養及びトランスフェクション
Invitrogenから購買したヒト角化細胞を、ヒト角化細胞増殖サプリメント（HKGS, Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を添加したEpiLife無血清培地で、抗生物質を添加せずに継代培養した。細胞は、37℃で5％のCO₂の環境で培養された。細胞が50％〜70％の密集度（confluency）までに成長した時、細胞をtrypsin／EDTA溶液で1分間暴露し、更にトリプシン阻害剤を含有するHBSSで2回洗浄した。分離した細胞を1：5で希釈した後、HKGSサプリメントを含有するEpiLife培養液で継代培養した。一方、ヒト肝癌細胞株HepG2はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手し、メーカーが提案した条件に従って培養した。miRNAトランスフェクションでは、実施例1で調製されたpri-／pre-miR-302を多くとも5〜10mg／mLの所望濃度となるように0．1〜1．0 MのMGG／DGG／TGG溶液に溶解し、更に必要なmiRNA量に基づいて細胞培地に加えた。例えば、200μg pri-／pre-miR-302を送達しようとすると、MGG／DGG／TGGに溶解されたpri-／pre-miR-302（5mg／ml）40μlを細胞培地に添加して細胞と混合する必要がある。MGG／DGG／TGGが非常に安全で非毒性であるので、濃度0．1MのMGG／DGG／TGGを使用すると同時に、必要なすべてのサプリメントも存在することができる。また、多くとも48時間の培養時間では、いずれかのの逆効果が表さなかった。このため、2-mlの培養皿内の細胞について、0．1M MGG／DGG／TGGでトランスフェクションされたmiRNA／shRNA／siRNAの最大量が約10 mgであると推定した。これは、本発明により、従来報道されたリポソーム系及び糖類による送達が達することができない効果的な送達レベルに達することができると示した。

4．高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析
本発明は逆相HPLC（reverse-phase HPLC）法を採用してmiR-302及びその前駆体（即ちpri-／pre-miR-302s）の純度及び構造完全性を分析した。Ultimate 3000高速液体クロマトグラフィー（HPLC）装置（Thermo Scientific）及びDNA Pac PA-100カラム（BioLC Semi-Prep 9×250 mm）を使用し、3．6 ml／minの流速でHPLCのプログラムを実行した。出発緩衝液（starting buffer）が50mMのTris-HCl（pH 7．6）であり、移動緩衝液（mobile buffer）が50mMのTris-HCl（pH 7．6）及び500mMの過塩素酸ナトリウムである。UV検出器にて260 nmの波長でRNA及びDNA信号を測定した。結果を図2A、図2D及び図8に示す。

5．マイクロリボ核酸（miRNA）のマイクロアレイ分析
細胞密集度70％で、mirVana^TM マイクロリボ核酸分離キット（mirVana^TM miRNA isolation kit、Ambion）を使用して各細胞培養物から小型RNAsを分離した。1％ホルムアルデヒド-アガロースゲル電気泳動及びスペクトロメータ測定（Bio-Rad）を使用してこれらの分離した小型RNAsの純度及び量を評価した後、直ちにドライアイスで凍結させてLC Sciences（カリフォルニア州サンディエゴ）に送ってマイクロリボ核酸のマイクロアレイ分析を行った。各マイクロアレイチップはそれぞれCy3若しくはCy5でマークされた単一のサンプルとヘテロ接合されたか、又はCy3とCy5でマークされた一対のサンプルとヘテロ接合された。次にバックグラウンド除去（background subtraction）と正規化（normalization）を行った。二重サンプルテストでは、p値計算を実行し、3倍より大きな差で発現した（黄-赤信号）転写分子を表に示した。最後のマイクロアレイ分析結果を図3Aと図3Bに示し、処理なしの角化細胞ブランク（3A）から取り出したRNAと、DGG／TGGを介したmiR-302トランスフェクションされた角化細胞グループ（3B）から取り出したRNAとの比較結果を示す。

6．生体内での糖アルコールにより送達した低分子干渉リボ核酸分布のバイオイメージング
グリシル（グリシン）化糖アルコールで包まれた核酸組成物の送達効率及び毒性を測定するために、各C57BL／6J系マウスに、200μlの濃度1M DGG／TGG溶液（実施例1を参照）に溶解した合成siR-302を200μg静脈注射した。注射後、約24時間の後、2匹のマウスを犠牲してDGG／TGGで送達されたsiR-302の生体内での分布状況を観察した。siR-302分子が赤外蛍光染料Cy5．5でマークされたので、直接にバイオイメージングシステム及び／又は蛍光顕微鏡でマウスの組織切片の蛍光信号を観察し、その生体内での分布状況を観察した。結果を図5に示す。

7．統計分析
75％を超える信号強度の変化はいずれも陽性結果と見なされ、これらの結果は分析された後、平均値±標準差（mean ± SE）で表された。データの統計分析は一元配置分散分析（one-way ANOVA）で計算された。主効果が有意な場合、ダネットのポストホック検定（Dunnett’s post-hoc test）でコントロール群と有意に差異がある群を判定した。2つの処理群間でマッチして比較を行う場合、両側スチューデントt検定（two-tailed student t test）を使用した。2群以上の処理群を含む実験に対して、ANOVA後にポストホック多重範囲検定（post-hoc multiple range test）を行った。確率p<0．05は統計的に有意と認められた。すべてのp値は両側検定で決定された。

参考文献
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配列表
（1）一般情報:
（iii）配列数:7
（2） SEQ ID NO:1の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 720 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖型: 二本鎖
（D）トポロジー: 多重ヘアピン
（ii）分子の型: デオキシリボ核酸
（A）記載: ／desc = "天然"
（iii）ハイポセティカル: NO
（iv）アンチセンス: NO
（xi）配列記載: SEQ ID NO:1:
AATTTTTTTC TTCTAAAGTT ATGCCATTTT GTTTTCTTTC TCCTCAGCTC TAAATACTCT GAAGTCCAAA GAAGTTGTAT GTTGGGTGGG CTCCCTTCAA CTTTAACATG GAAGTGCTTT CTGTGACTTT AAAAGTAAGT GCTTCCATGT TTTAGTAGGA GTGAATCCAA TTTACTTCTC CAAAATAGAA CACGCTAACC TCATTTGAAG GGATCCCCTT TGCTTTAACA TGGGGGTACC TGCTGTGTGA AACAAAAGTA AGTGCTTCCA TGTTTCAGTG GAGGTGTCTC CAAGCCAGCA CACCTTTTGT TACAAAATTT TTTTGTTATT GTGTTTTAAG GTTACTAAGC TTGTTACAGG TTAAAGGATT CTAACTTTTT CCAAGACTGG GCTCCCCACC ACTTAAACGT GGATGTACTT GCTTTGAAAC TAAAGAAGTA AGTGCTTCCA TGTTTTGGTG ATGGTAAGTC TTCTTTTTAC ATTTTTATTA TTTTTTTAGA AAATAACTTT ATTGTATTGA CCGCAGCTCA TATATTTAAG CTTTATTTTG TATTTTTACA TCTGTTAAGG GGCCCCCTCT ACTTTAACAT GGAGGCACTT GCTGTGACAT GACAAAAATA AGTGCTTCCA TGTTTGAGTG TGGTGGTTCC TACCTAATCA GCAATTGAGT TAACGCCCAC ACTGTGTGCA GTTCTTGGCT ACAGGCCATT ACTGTTGCTA 720
（2） SEQ ID NO:2の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 69 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖型: 一本鎖
（D）トポロジー: ヘアピン様
（ii）分子の型: リボ核酸
（A）記載: ／desc = "天然"
（iii）ハイポセティカル: NO
（iv）アンチセンス: NO
（xi）配列記載: SEQ ID NO:2:
CCACCACUUA AACGUGGAUG UACUUGCUUU GAAACUAAAG AAGUAAGUGC UUCCAUGUUU UGGUGAUGG 69
（2） SEQ ID NO:3の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 73 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖型: 一本鎖
（D）トポロジー: ヘアピン様
（ii）分子の型: リボ核酸
（A）記載: ／desc = "天然"
（iii）ハイポセティカル: NO
（iv）アンチセンス: NO
（xi）配列記載: SEQ ID NO:3:
GCUCCCUUCA ACUUUAACAU GGAAGUGCUU UCUGUGACUU UAAAAGUAAG UGCUUCCAUG UUUUAGUAGG AGU 73
（2） SEQ ID NO:4の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 68 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖型: 一本鎖
（D）トポロジー: ヘアピン様
（ii）分子の型: リボ核酸
（A）記載: ／desc = "天然"
（iii）ハイポセティカル: NO
（iv）アンチセンス: NO
（xi）配列記載: SEQ ID NO:4:
CCUUUGCUUU AACAUGGGGG UACCUGCUGU GUGAAACAAA AGUAAGUGCU UCCAUGUUUC AGUGGAGG 68
（2） SEQ ID NO:5の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 68 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖型: 一本鎖
（D）トポロジー: ヘアピン様
（ii）分子の型: リボ核酸
（A）記載: ／desc = "天然"
（iii）ハイポセティカル: NO
（iv）アンチセンス: NO
（xi）配列記載: SEQ ID NO:5:
CCUCUACUUU AACAUGGAGG CACUUGCUGU GACAUGACAA AAAUAAGUGC UUCCAUGUUU GAGUGUGG 68
（2） SEQ ID NO:6の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 23 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖型: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）分子の型: リボ核酸
（A）記載: ／desc = "合成"
（iii）ハイポセティカル: YES
（iv）アンチセンス: NO
（xi）配列記載: SEQ ID NO:6:
UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU 23
（2） SEQ ID NO:7の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ: 23 塩基対
（B）型: 核酸
（C）鎖型: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）分子の型: リボ核酸
（A）記載: ／desc = "合成"
（iii）ハイポセティカル: YES
（iv）アンチセンス: NO
（xi）配列記載: SEQ ID NO:7:
ACACUAAAAC AUGGAAGCAC UUA 23

Claims

（a）少なくとも1つの負電荷を帯びた少なくとも1つの核酸組成物と、
（b）グリシル化で修飾された少なくとも1つのH（HCHO）_nHCOの化学式を有する糖又はH（HCHO）_n+1Hの化学式を有する糖アルコール組成物と、を含み、
（a）と（b）がある条件で混合して少なくとも1つの送達複合体を形成する
組成物、並びに糖、糖アルコールとともに核酸組成物を調製して安定した複合体を形成して生体外及び体内で哺乳細胞に送達するその使用方法。
該核酸組成物はリボ核酸又はデオキシリボ核酸である、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該核酸組成物は、マイクロリボ核酸、マイクロリボ核酸前駆体、小ヘアピンリボ核酸、低分子干渉リボ核酸、リボザイム、アンチセンスリボ核酸／デオキシリボ核酸、リボ核酸とデオキシリボ核酸とのヘテロ接合体、デオキシリボ核酸担体／ワクチン及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項2に記載の組成物及びその使用方法。
該糖又は該糖アルコールは、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、アルジトール、アラビトール、エリトリトール、フシトール、ガラクチトール、グリセリン（グリセロール）、イジトール、イノシトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ポリグリシトール、ソルビトール、トレイトール、ボレミトール、キシリトール及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該グリシル化で修飾された少なくとも1つの糖又は糖アルコール組成物はジグリシルグリセリンとトリグリシルグリセリドの混合物を含む、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該グリシル化で修飾された糖又は糖アルコール組成物は正に帯電した、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該修飾された糖又は糖アルコール組成物は更に溶液に存在し、且つ約0．1 μM〜約10 Mの濃度範囲を有する、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該修飾された糖又は糖アルコール組成物における該核酸組成物が溶液への最大溶解度が15 mg／mLに達する、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該修飾された糖又は糖アルコール組成物は該核酸組成物を分解から保護する、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該修飾された糖又は糖アルコール組成物は該核酸組成物を生体外又は体内で哺乳細胞に送達する効率を向上させる、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該条件はpHが8．0より小さい、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該条件はpHが約2．5〜約7．0である、請求項11に記載の組成物及びその使用方法。
該送達複合体は該修飾された糖又は糖アルコールと該核酸組成物との間のイオン親和力又は静電親和力によって形成される、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該送達複合体は化粧品、薬学上及び治療上の応用に適用できる、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
該グリシル化は、該糖又は該糖アルコールの少なくとも1つの炭化水素基がグリシン又はグリシルアミノ酸に由来する少なくとも1つのグリシル基で置換される化学反応である、請求項1に記載の組成物及びその使用方法。
生体外及び体内で核酸を送達する処方組成物であって、炭化水素基を有する少なくとも1つの糖又は糖アルコールと、グリシル基構造を有する少なくとも1つのアミノ酸と、少なくとも1つの核酸組成物との混合を含み、該混合が該核酸組成物とイオン又は静電親和力によって相互作用して8．0より小さいpHで送達複合体を形成する少なくとも1つのグリシル化糖又はグリシル化糖アルコールを更に含む、生体外及び体内で核酸を送達する処方組成物。
該糖又は該糖アルコールは、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、アルジトール、アラビトール、エリトリトール、フシトール、ガラクチトール、グリセリン（グリセロール）、イジトール、イノシトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ポリグリシトール、ソルビトール、トレイトール、ボレミトール、キシリトール及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項16に記載の組成物。
該グリシル基構造はグリシン又はグリシルアミノ酸のグリシル基である、請求項16に記載の組成物。
該核酸組成物はリボ核酸又はデオキシリボ核酸である、請求項16に記載の組成物。
該核酸組成物は、マイクロリボ核酸、マイクロリボ核酸前駆体、小ヘアピンリボ核酸、低分子干渉リボ核酸、リボザイム、アンチセンスリボ核酸／デオキシリボ核酸、リボ核酸とデオキシリボ核酸とのヘテロ接合体、デオキシリボ核酸担体／ワクチン及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項19に記載の組成物。
更に溶液として存在し、且つ濃度が0．3Mのフルクトース及び0．9％（w／v）の塩化ナトリウムを含む、請求項16に記載の組成物。
該混合は更に溶液として存在し、且つpHが8．0より小さい、請求項16に記載の組成物。
該pHが6．0〜7．0である、請求項22に記載の組成物。
該グリシン化糖又はグリシン化糖アルコールはグリシル化反応によって形成される、請求項16に記載の組成物。
該グリシル化反応が発生すると、該糖又は該糖アルコールの少なくとも1つの炭化水素基はグリシン又はグリシルアミノ酸に由来する少なくとも1つのグリシル基で置換される、請求項24に記載の組成物。
該少なくとも1つのグリシン化糖又はグリシン化糖アルコールはモノグリシルグリセロール、ジグリシルグリセリン、及びトリグリシルグリセリドからなる群から選ばれる、請求項16に記載の組成物。
該グリシン化糖又は該グリシン化糖アルコールの濃度は約0．1 μM〜約10 Mの範囲にある、請求項16に記載の組成物。
該グリシン化糖又は該グリシン化糖アルコールは正に帯電した、請求項16に記載の組成物。
該核酸組成物は負に帯電した、請求項16に記載の組成物。
該核酸組成物は該混合を含有する溶液への最大溶解度が15 mg／mLに達する、請求項16に記載の組成物。
該グリシン化糖又は該グリシン化糖アルコールは該核酸組成物を分解から保護する、請求項16に記載の組成物。
該グリシン化糖又は該グリシン化糖アルコールは該核酸組成物を生体外又は体内で哺乳細胞に送達する効率を向上させる、請求項16に記載の組成物。
該送達複合体が化粧品、薬学上及び治療上の応用に適用できる、請求項16に記載の組成物。