JP2017512070A - 高等植物におけるｒｎａの生成 - Google Patents

Abstract

本発明は、高等植物のプラスチドにおけるＲＮＡの生成およびプロセシングに関する。

Description

本発明は、高等植物でのＲＮＡ干渉を含む、高等植物におけるＲＮＡの生成およびプロセシング、ならびに高等植物の葉緑体および関係するプラスチドにおける遺伝子の発現に関する。

本明細書でのいかなる先行技術への言及も、この先行技術がいかなる管轄範囲内の普通の一般知識の一部を形成することの、またはこの先行技術が当業者によって理解され、関連すると考えられ、および／もしくは他の先行技術と組み合わされると合理的に予想することができることの承認でも、提案でもない。

同族有害生物の必須の遺伝子を抑制するための宿主ＲＮＡの利用は、有害生物防除のための新興の手法である。この手法は、「トランスキングダムＲＮＡ干渉」または「トランスキングダムＲＮＡｉ」と呼ぶことができる。一般に、宿主によって生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が有害生物によって摂取されるとき、有害生物のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構は、摂取されたｄｓＲＮＡを有害生物の生存に影響を与える必須の遺伝子サイレンシングまたは関係する事象を有害生物で誘導することが可能であるｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡの形に変換するものと理解される。鱗翅類に適用可能であるこの手法の例については、Terenius O. et al. 2011 J. Insect Physiol. 57:231-245を参照する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子配列の全てまたは十分なサイズの任意の部分に特異的である干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）が、それによってコードされるｍＲＮＡの分解をもたらす、内因性細胞経路を利用するプロセスである。近年、いくつかの種および実験系、例えば、線虫（Caenorhabditis elegans）、植物、昆虫胚および組織培養細胞において、遺伝子「ノックダウン」を実行するためにＲＮＡｉが用いられている。例えば、Fire et al. (1998) Nature 391:806-811；Waterhouse et al (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-139；Wesley V et al (2001) Plant J. 27: 581-590；Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574；McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747を参照。

鱗翅類の遺伝子を含む有害生物遺伝子のサイレンシングを得るために、高レベルのｄｓＲＮＡが必要なことが立証されている（上記Terenius O；Mao Y. et al. 2007 Nat. Biotechnol. 25: 1307-1313；Kumar P. et al. 2012 PLoS ONE 7:e31347）。

国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットは、下等植物（クラミドモナス属（Chlamydomonas））の葉緑体および核を、カの生存のために必須の遺伝子を含有する構築物で形質転換する研究である。カ集団を防除するためにその餌を用いることができることを実証するために、次にこの形質転換クラミドモナス属（Chlamydomonas）をカに食べさせる。

国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットは、下等植物の葉緑体形質転換および核形質転換が両方ともカ集団の防除のための有益な餌を提供することを見出す。具体的には、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットによると、結果は、葉緑体または核ゲノムから発現される３ＨＫＴ逆方向反復を発現するトランスジェニッククラミドモナス属（Chlamydomonas）を食べさせることが、カ幼虫の増殖を阻害し、最終的にそれらの死を引き起こすことにおいて有効だったことを示す（国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットの［００２１９］）。

他の場所で、核形質転換体の研究から、トランスキングダムＲＮＡｉの誘導のために、宿主を食べるときにｄｓＲＮＡが昆虫に送達されなければならないと仮定されている。上記のMao and Kumarを参照する。これは、有害生物が特定の時間に宿主を食べるときにｄｓＲＮＡが有害生物に摂食可能であるように、有効な有害生物防除は、ｄｓＲＮＡの定常状態レベルを生成して維持する宿主を必要とすることを意味する。高等または下等植物でｄｓＲＮＡの定常状態レベルをどのように最適に生成し、維持するかは、不明なままである。

下等植物では、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットは、［００２２０］においてサイレンシングＲＮＡの葉緑体での発現がトランスキングダムＲＮＡｉの誘導にとって重要であると仮定する。しかし、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットは、この理由が葉緑体発現がサイレンシングＲＮＡの定常状態レベルを可能にするからであるかどうか、またはそれが摂取されるときにサイレンシングＲＮＡを保護するのが葉緑体のプラスチドパッケージングであるかどうかについて結論づけていない。プラスチドパッケージングの重要性は、他によって提案された。Bogarad L. 2000 TIBTECH 18: 257- 263；McBride K et al., 1995 Nature Biotechnology 13: 362-365；Verma D and Daniell H 2007 Am Soc Plant Biol. 145:1129-1143を参照する。

下等植物の葉緑体形質転換体によって発現されるＲＮＡがｄｓＲＮＡからなるかどうかは、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットからは不明なままである。具体的には、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットは、クラミドモナス属（Chlamydomonas）葉緑体形質転換体においても、形質転換体を摂取する昆虫においても、ｄｓＲＮＡもｓｉＲＮＡも測定しない。したがって、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットは、クラミドモナス属（Chlamydomonas）の葉緑体でも他の下等植物の葉緑体でも、トランスキングダムＲＮＡｉを促進するのに十分な量でｄｓＲＮＡを生成することができることを示していない。

さらに、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットから、この形質転換体は、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットによると、表面上葉緑体形質転換体と同じくらいトランスキングダムＲＮＡｉ誘導のために有益であったので、ｄｓＲＮＡがクラミドモナス属（Chlamydomonas）核形質転換体で生成されるようである。ｄｓＲＮＡがトランスキングダムＲＮＡｉのために必須であるので、１つの暗示は、ｄｓＲＮＡが高等植物の核より下等植物の核でより蓄積することができるということであり得る。これは、高等および下等植物のＲＮＡプロセシング経路の多様化を指すであろう。高等および下等植物でのＲＮＡプロセシングの間の差の、多くの例がある。特に、Casas-Mollano J. et al. 2008 Genetics 179: 69-81を参照する。葉緑体および核形質転換体がｄｓＲＮＡを等しく蓄積するという理解の下で、トランスキングダムＲＮＡｉの誘導のための葉緑体および核形質転換体の有効性のわずかな差が、プラスチドでのサイレンシングＲＮＡの優れた蓄積ではなく、葉緑体に特異なプラスチドパッケージングから生じることができるようである。これは、実際、国際公開第２０１２／０５４９１９号パンフレットの［００２２０］の仮説である。

重要なことに、プラスチドパッケージング自体は、定常状態レベルのｄｓＲＮＡの生成および維持を可能にする機構でない。パッケージングは、単に摂取の後に生成されたものを保護するだけである。したがって、プラスチドパッケージング自体は、トランスキングダムＲＮＡｉの誘導のために必要とされることが知られている高レベルのｄｓＲＮＡの生成に十分でないと理解される。

下等および高等植物の葉緑体ＲＮＡプロセシング経路の間のさらなる重要な差は、クラミドモナス属（Chlamydomonas）によって例示される下等植物はＲＮＡ編集システムを有しないが、このシステムは高等植物の葉緑体ＲＮＡプロセシング経路に存在する、ということである。Stern et al. 2010 Annu. Rev. Plant Biol. 61:125-55を参照する。したがって、下等植物の葉緑体で生成される同族有害生物の標的遺伝子に対応するＲＮＡは、関連する有害生物の標的遺伝子の同じ配列を有すると理解され、有害生物での適切に配列特異的なｓｉＲＮＡの形成の可能性およびトランスキングダムＲＮＡｉの誘導を増加させる。高等植物の葉緑体でのＲＮＡ編集システムの存在は、高等植物の葉緑体形質転換体を用いてそのような結果が可能であるかどうかの疑問を提議する。

論じられるように、ｄｓＲＮＡは速やかに分解されるので、高等生物体でｄｓＲＮＡの定常状態レベルを維持することは困難である。高等植物では、この分解にはｓｉＲＮＡが関与すると思われているが、まだ不確定の他のＲＮＡｉ関係の機構、または他の機構が関与していることもあり得る。

高等植物の葉緑体でのＲＮＡプロセシング経路に関する我々の理解に、多少の進歩があった。しかし、未知のままである多くのものがある。一般的な葉緑体ゲノム中の１００未満のわずかな遺伝子の発現がなぜそれほど複雑であるかについて、研究者はしばしば尋ねる。上記Sternを参照する。

高等植物葉緑体のＲＮＡプロセシング経路は、高等植物の細胞核およびサイトゾルでのそれらと異なるものと理解される。これは、プラスチドが原核生物起源であるのに対して、植物細胞核およびサイトゾルは真核生物性であるからである。ラン藻祖先に由来する葉緑体は、遺伝子発現の原核生物および真核生物の特徴を兼備し、核によってコードされる多くのタンパク質によって調節されると、何人かは考える。上記Sternを参照する。しかし、経路の差の程度およびＲＮＡプロセシングへのそれらの差の関連性は未知である。

原核生物と真核生物の間の差を考慮すると、真核細胞で作動し、原核細胞で作動しないと見られる機構は、葉緑体で作動しないはずであると、何人かは示唆している。ＲＮＡｉは、１つの特定の機構である。同時に、他の者は、葉緑体で蓄積するＲＮＡに由来するｓｉＲＮＡの存在を観察し、葉緑体で作動するＲＮＡｉ機構を指摘した。Martinez de Alba A.E. et al. 2002 Am. Soc Microbiol. 76: 13094-13096を参照する。さらに、ＲＮアーゼＩＩＩの葉緑体相同体も、ｍＲＮＡプロセシングに関与することができる。ＲＮアーゼＩＩＩは、ＤｉｃｅｒなどのＲＮＡサイレンシングに関係がある酵素を含む、ｄｓＲＮＡ依存性エンドリボヌクレアーゼの大きなファミリーのメンバーである。上記Sternを参照する。ＲＮＡ編集およびスプライシング因子を含む、葉緑体中の核によってコードされた多くのトランス作動因子の発見を考慮すると、葉緑体での核由来の因子の観察はおそらく驚くに足らない。

一般に、高等植物の葉緑体の内因性遺伝子のＲＮＡの定常状態レベルがどのように制御されるかは、わかっていない。関連する機構が高等植物の葉緑体の外因性遺伝子の発現に等しく適用されるかどうかも、わかっていない。さらに、ＲＮＡの定常状態レベルに及ぼす葉緑体での導入遺伝子の過剰発現の影響は、未知である。核のＲＮＡプロセシング機構は高等植物でより明らかに理解されていて、結果は予測可能であるので、多くの者が核形質転換に基づいて高等植物でトランスキングダムＲＮＡｉ手法に乗り出したのは、おそらくこれらの理由のためである。

これらの研究は、ｄｓＲＮＡプロセシング機構が欠如し、それによってｄｓＲＮＡの分解を回避する細胞の使用に最初に焦点を合わせた。１つの問題点は、ｄｓＲＮＡプロセシング機構が欠如している植物の生長能力への影響であった。この問題点は、高等植物の核でのｄｓＲＮＡの形成および保護を可能にする改変構築物の提供によって改善された。例えば、米国特許出願公開第２００９０２６３３６４号明細書、米国特許出願公開第２００７００１１７７５号明細書、米国特許出願公開第２００９０２６３３６４号明細書、米国特許出願公開第２００８０１９４５０４号明細書、米国特許出願公開第２００６００９５９８７号明細書、Fenner B. et al. 2006 J. Virol. 80: 6822-6833およびSalomon W. et al 2010 Nucl. Acids. Res. 38: 3771-3779を参照する。ＲＮＡｉ誘導構築物でのこれらの改善および開発は、トランスキングダムＲＮＡｉのためのｄｓＲＮＡ生成を達成するための好ましい手法として、表面上確立された核形質転換を有する。

高等植物におけるｄｓＲＮＡの生成および蓄積のための代わりの手法または改善された手法が依然として必要とされている。

本発明は上で指摘した必要性に対処しようと追求するものであり、一実施形態では、維管束植物のプラスチドであって、
− 以下を含む核酸構築物：
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
を含み、ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、プラスチドが提供される。

別の実施形態では、維管束植物のプラスチドであって、
− 以下を含む核酸構築物：
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
を含み、コード領域は、植物のゲノムで見出されないヌクレオチド配列を有する、プラスチドが提供される。

別の実施形態では、維管束植物のプラスチドであって、
− 以下を含む核酸構築物：
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
を含み、ｄｓＲＮＡの配列を含むｓｉＲＮＡ分子を含まないプラスチドが提供される。

別の実施形態では、維管束植物のプラスチドであって、
− 以下を含む核酸構築物：
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
− ｄｓＲＮＡ
を含み、ｄｓＲＮＡはコード領域によってコードされるヌクレオチド配列の実質的に全てを含有する、プラスチドが提供される。

さらなる実施形態では、維管束植物の形質転換のための核酸構築物であって、
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
− 維管束植物のプラスチドゲノムへの構築物の組込みに選択的である１つまたは複数の組込み部位
を含み、ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、核酸構築物が提供される。

さらなる実施形態では、維管束植物の形質転換のための核酸構築物であって、
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
− 維管束植物のプラスチドゲノムへの構築物の組込みに選択的である１つまたは複数の組込み部位
を含み、コード領域は、植物のゲノムで見出されないヌクレオチド配列を有する、核酸構築物が提供される。

さらなる実施形態では、上記のプラスチドまたは構築物を含有する、植物またはそれに由来する繁殖材料が提供される。

さらなる実施形態では、維管束植物の細胞においてｄｓＲＮＡを蓄積する方法であって、
− 維管束植物のプラスチドを上記の実施形態のいずれか１つの核酸構築物で形質転換することと；
− プラスチドにおける核酸構築物からのｄｓＲＮＡの生成のための条件を細胞に提供することと
を含み、それによって、維管束植物の細胞においてｄｓＲＮＡを蓄積する、方法が提供される。

本発明のさらなる態様および前の段落に記載される態様のさらなる実施形態は、例として与えられ、添付の図面を参照する以下の記載から明らかになる。

核または葉緑体ゲノムへの組込みからｄｓＲＮＡまたはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を生成する方法の概略図。 図１Ａ−１。１つがセンス転写産物を生成し、他がアンチセンス転写産物を生成する２つの独立した転写単位（Waterhouse PM et al. 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-139で最初に記載された）。転写単位は一緒にゲノムに（例えば、同じＴ−ＤＮＡに導入される単位によって生成される）、または無関係な位置に（例えば、異なる染色体上）配置することができる。合体し、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成するために、センスおよびアンチセンスＲＮＡが必要とされる。 図１Ａ−２。１つの「コード領域」配列が、２つの「内向き／収束性」プロモーターの間に置かれ（Timmons L and Fire A. 1998 Nature 395: 854によって最初に記載された）、その結果１つが１つのＤＮＡ鎖の転写を引き起こしてセンスＲＮＡを生成し、他のプロモーターは他のＤＮＡ鎖の転写を指示してアンチセンスＲＮＡを作製する。合体し、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成するために、２つのＲＮＡが必要とされる。 図１Ａ−３。折り返されて自己ハイブリダイズし、ｄｓＲＮＡに類似の二重構造化ステムとヘアピン（ｈｐ）ＲＮＡを作製する能力を有する単一のＲＮＡを生成する１つのプロモーターによって促進される１つの転写単位（Waterhouse et al. 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-139で最初に記載された）。転写産物の第１の領域は、転写産物の最後の領域に対してセンス配向であってもよい（または逆もまた同じ）。ＤＮＡ構築物を安定させるために、センスおよびアンチセンス領域を分離するための「スペーサー」領域を有することが重要である。この場合には、スペーサー領域は、ｈｐＲＮＡ転写産物の一部として転写されて、ループを形成する。 図１Ａ−４。折り返されて自己ハイブリダイズし、ｄｓＲＮＡに類似の二重構造化ステムとヘアピン（ｈｐ）ＲＮＡを作製する能力を有する単一のＲＮＡを生成する１つのプロモーターによって促進される１つの転写単位。転写産物の第１の領域は、転写産物の最後の領域に対してセンス配向であってもよい（または逆もまた同じ）。ＤＮＡ構築物を安定させるために、センスおよびアンチセンス領域を分離するための「スペーサー」領域を有することが重要である。この場合には、スペーサー領域は、転写されるがその後スプライスアウトされて非常に小さいループとｈｐＲＮＡ転写産物を生成するイントロンをコードする（Smith NA et al 2000 Nature 407: 319-320で最初に記載された）。 核ゲノムに組み込まれたときの核組込み構築物の概略図。ｖ１５３核形質転換構築物は、その組み込まれた形で表される。この構築物は、ＣａＭＶ ３５ｓプロモーターからＨａ−ＨｐＡｃｅ１２３６−１８９ヘアピンを発現するように設計されている。骨格は、標準の二元アグロバクテリウム形質転換ベクターｐＯＲＥ−０３の誘導体である。宿主核ゲノムの組込み部位は、アグロバクテリウム媒介形質転換の標準の組込み動態力学によって異なる。以降のｃＤＮＡ合成ステップ（３０１ｒ、２１６ｆ／ｒおよびオリゴｄＴ）およびＲＴ−ＰＣＲ検出ステップ（２１７ｆ／ｒ＋２１６ｆ／ｒおよび２５ｆ＋２１６ｆ／ｒ）のために用いられるプライマーは、後者のセットのために示した予想生成物サイズ（ｅ＝．．）で表される。続くイントロンスプライシングによって生成される種のそれらおよび標準の核／細胞質ＲＮＡに作動することが知られている標準のＲＮＡｉタイプの経路によるプロセシングの後のそれらを含む、予想されるＲＮＡ生成物および構造物を示す。 葉緑体ゲノムに組み込まれたときの葉緑体発現構築物（核イントロンと）の概略図。ｖ２０６葉緑体形質転換構築物は、その組み込まれた形で表される。この構築物は、ＰｒｒｎプロモーターからＨａ−ＨｐＡｃｅ１２３６−１８９ヘアピンを発現するように設計されている。骨格は、標準の葉緑体形質転換ベクターｐＰＲＶ３２３Ｃｌｏｘの誘導体である。宿主葉緑体ゲノムの組込み部位は正確であり、ｔｒｎＩ／ｔｒｎＡの含まれる組換え領域によって規定される。以降のｃＤＮＡ合成ステップ（３０１ｒ、２１６ｆ／ｒ、２７６ｒ、２８０ｒおよびオリゴｄＴ）およびＲＴ−ＰＣＲ検出ステップ（２１７ｆ／ｒ＋２１６ｆ／ｒおよび２５ｆ＋２１６ｆ／ｒ）のために用いられるプライマーは、後者のセットのために示した予想生成物サイズ（ｅ＝．．）で表される。生成される予想ＲＮＡ生成物を示す。標準のスプライシング機構は葉緑体で作動しないので、この場合には、含まれる核／細胞質イントロンはスプライシングされない。ＲＮＡｉプロセシング機構のさらなる不在下では、残りの生成物は、設計されたヘアピンで意図した標的を覆うために本来含まれる配列の実質的な部分または全てを含む。多くの葉緑体転写産物で普通に起こることが公知であるように、この場合には、転写が生来の上流の転写単位から連続すること（「リードスルー」）ができるならば、形成される追加のより長いＲＮＡ種があってもよい。 葉緑体ゲノムに組み込まれたときの葉緑体発現構築物（葉緑体イントロンと）の概略図。ｖ３０１葉緑体形質転換構築物は、その組み込まれた形で表される。この構築物は、ＰｒｒｎプロモーターからＨａ−ＨｐＡｃｅ１２３６−１８９ヘアピンを発現するように設計されている。骨格は、標準の葉緑体形質転換ベクターｐＰＲＶ３２３Ｃｌｏｘの誘導体である。宿主葉緑体ゲノムの組込み部位は正確であり、ｔｒｎＩ／ｔｒｎＡの含まれる組換え領域によって規定される。以降のｃＤＮＡ合成ステップ（３０１ｒ、２１６ｆ／ｒ、２７６ｒ、２８０ｒおよびオリゴｄＴ）およびＲＴ−ＰＣＲ検出ステップ（２１７ｆ／ｒ＋２１６ｆ／ｒおよび２５ｆ＋２１６ｆ／ｒ）のために用いられるプライマーは、後者のセットのために示した予想生成物サイズ（ｅ＝．．）で表される。生成される予想ＲＮＡ生成物および構造を示す。この場合には、含まれる葉緑体イントロンは、葉緑体中でスプライスアウトされる。ＲＮＡｉプロセシング機構の不在下では、残りの生成物は、設計されたヘアピンで意図した標的を覆うために本来含まれる配列の実質的な部分または全てを含むが、イントロン配列は含まない。スプライシングの結果、ＲＮＡ構造は、片方の末端で小さいループと一緒に桿状のＲＮＡ二重鎖をおそらく形成する。多くの葉緑体転写産物で普通に起こることが公知であるように、この場合には、転写が生来の上流の転写単位から連続すること（「リードスルー」）ができるならば、形成される追加のより長いＲＮＡ種があってもよい。 導入遺伝子の発現を実証する形質転換体からのＲＮＡ抽出物のＲＴ−ＰＣＲを示す図。ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana benthamiana）葉緑体形質転換植物組織（ｖ２０６試料＃１〜９）、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）核形質転換組織（ｖ１５３核対照試料＃１７）および非形質転換Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）組織（非形質転換対照試料＃２４）から抽出されたＲＮＡ試料を用いた、６つの異なる逆転写（ＲＴ）アッセイからの結果を示す。２つの異なる鋳型条件を用いて３つの異なるプライマーセットで各試料を増幅した；鋳型としてｃＤＮＡ合成前の抽出されたＲＮＡ（試料へのＤＮＡ汚染の可能性について試験するため）、および対応するｃＤＮＡ試料セット。予想された生成物サイズは、ｅ＝．．として示す。含まれたマーカーはＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ １００ｂｐマーカーであり、バンドは１００ｂｐから１ｋｂまで１００ｂｐ間隔である。（Ａ〜Ｂ）最初のＰＣＲプライマーセットは、アンチセンス（ＡＳ）ステムの両方のイントロンループを含有する大きなＲＮＡ種の存在について試験するために、イントロンおよび後部ステムの接合部越しに増幅するように設計した（プライマーｇ２５ｆおよびｇ２１６ｆ／ｒ）。四角で囲んだ領域は、特異的増幅があった場合に生成物が出現するだろう領域を示す。（Ｃ〜Ｄ）ループ配列とは無関係に完全長センス（ＳＥ）またはアンチセンス（ＡＳ）ステムの存在について試験するために、第２のセットはｄｓＲＮＡステム領域に対して内的であったがステムの末端で結合していた（プライマーｇ２１６ｆ／ｒおよびｇ２１７ｆ／ｒ）。（Ｅ〜Ｆ）第３のセットは、ｅＩＦ４Ｅのための遍在するハウスキーピング配列の存在について試験するための対照反応であった（プライマーｇ１６５ｆおよびｇ１６６ｒ）。 葉緑体試料＃９は、このセットでは分析しなかった。しかし、それは初期のＰＣＲアッセイで陽性であることが既に確認されていた。 葉緑体形質転換体および対照でのｄｓＲＮＡのノーザンベースの数量化を示す図。 葉緑体形質転換試料を、高分子量（ＭＷ）または「大ＲＮＡ」ノーザン分析にかけた。（Ａ）試料＃１〜９、１７および２４の各々のために、ＲＮＡ抽出物を再調製した（各試料を、ホルムアミドに再懸濁した）。１レーンあたり各試料のおよそ１０μｌ＋ホルムアミドＲＮＡ負荷色素の６μｌ（４μｌの試料だけが入手できた試料７を除いて）を１．４％ＴＢＥアガロースゲルに加え、２つのより低い色素前線が十分に分離するまで１００Ｖで流した。相対負荷量を測定するために、ゲルを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色して、可視化した。（Ｂ）ゲルを一晩キャピラリーでＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、試料を膜にＵＶ架橋させた。膜を前ハイブリダイズさせ、６５℃でＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂでハイブリダイズさせた。プローブ（全長５３８ｎｔで、約３５７ｎｔはＨａＡｃｅに隣接して一致する）は、逆挿入ＨａＡｃｅ１２３６ ｐＧＥＭベクター（ｖ１５８）からの部分長ＳＥ鎖ＵＴＰｐ３２リボプローブランオフＳＰ６であった。膜は、１時間曝露させた。（Ｃ）ＲＮＡ量はＩｍａｇｅＪを用いて数量化し、負荷量に標準化した（ＥｔＢｒ画像を用いた）。相対発現レベルは、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）非形質転換対照（１と設定）と比較したバンド強度の標準化変化倍率として計算した。 追加のＲＮＡ抽出のためには不十分な材料が残されていたので、試料＃６はこの例のセットで省略された。 葉緑体形質転換体および対照でのｓｉＲＮＡのノーザンベースの数量化を示す図。ｓｉＲＮＡサイズのプロセシングされた生成物の相対量を検出して数量化するために、葉緑体形質転換試料を低分子量（ＭＷ）または「小ＲＮＡ」ノーザン分析にかけた。例４で用いたのと同じＲＮＡ抽出物を、ここで用いた。（Ａ）１レーンにつきおよそ２５μｌの各試料＋２５μｌのホルムアミドＲＮＡ負荷色素を、１７％ＰＡＧＥゲルに加えた。これは、約１８〜４２μｇの負荷量の推定範囲になった。負荷前に、１５０Ｖ／４０分でＰＡＧＥゲルを予備的に流した。負荷すると、１５０Ｖ／約３０分＋２００Ｖ／約４〜５時間でゲルを流した（色素前線が十分に移動するまで）。相対負荷量を測定するために、ゲルを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色して、可視化した。（Ｂ）ゲルをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に４５Ｖ／６０分で電気的に移し、試料を膜にＵＶ架橋させた。膜を前ハイブリダイズさせ、４２℃でＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂでハイブリダイズさせた。約５０ｎｔ断片に分割するために標準の方法によって「炭酸化」したこと以外は、前に記載したのと同じようにプローブを調製した。膜を１時間および６０時間曝露させたが、２つの時点の間で検出限界の差はなかった（１時間の時点をここに示す）。（Ｃ）ＲＮＡ量はＩｍａｇｅＪを用いて数量化し、負荷量に標準化した（ＥｔＢｒ画像を用いた）。相対発現レベルは、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）非形質転換対照（１と設定）と比較したバンド強度の標準化変化倍率として計算した。 不十分な材料しか残っていなかったので、試料＃６および７はこの例のセットで省略された。 トランスジェニックおよび非トランスジェニック苗の上でのオオタバコガ（Helicoverpa armigera）幼虫の成長速度を示す図。 プラスチックペトリ皿中の洗浄した６〜１０日苗で４日間飼育した後の平均的オオタバコガ（Helicoverpa）幼虫の重量（ｎ＝４〜１３；元は実験開始時ｎ＝２０／処理）。幼虫の餌とした苗を含有するペトリ皿は、制御環境条件（２８℃、約６０％相対湿度、１６：８［明：暗］）の下に置いた。ｖ２０６で形質転換させた全４つの独立した系（葉緑体でｈｐＲＮＡを発現する）では、野生型Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）苗で飼育したものと比較して、幼虫は成長速度が有意に低減した（ｐ＜０．００５ ｎ＝７〜１３）ことをこのデータは示す。ｖ１５３で形質転換させた２つの系（核／細胞質でｈｐＲＮＡを発現する）で飼育した幼虫の成長速度は、野生型で飼育したものと有意差がなかった（ｐ＞０．９；ｎ＝４〜７）。 本明細書で参照するベクターの関係経路の概略図。例１で組み立てた葉緑体形質転換構築物は、いくつかの既存のベクター、ｐＰＲＶ３２３Ｃｌｏｘ、ｐＯＲＥ−０３およびｐＲＮＡｉ−ＧＧの誘導体であった。ｐＰＲＶ３２３Ｃｌｏｘは、誤ったＫｐｎＩ ＲＥ部位を除去するために、先ず改変された。ｐＲ１を作製するために、これに葉緑体プロモーター、５’ＵＴＲ、ＭＣＳおよび３’ＵＴＲを挿入した。ｐ３２ｃを作製するために、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターの挿入と骨格に存在するＢｓａ Ｉ部位の除去によって、ｐＯＲｅ−０３を先ず改変した。ｐＲＮＡｉ−ＧＧは、ゴールデンゲート（ＧＧ）クローニングカセットの供給源として用いた。ｐ３２ｃ−ＧＧを作製するために、ＧＧカセットをｐ３２ｃにコピーした。オオタバコガ（Helicoverpa armigera）アセチルコリンエステラーゼ標的遺伝子（Ｈａ−Ａｃｅ１２３６−１８９）に対するヘアピン構築物ｖ１５３を作製するために、次にｐ３２ｃ−ＧＧをＧＧ反応で用いた。ｖ１５３は、核形質転換例で用いた構築物であった。この構築物は、ＧＧ Ｈａ−ＨｐＡｃｅ１２３６−１８９エレメントをｐＲ１に移し、このようにｖ２０６を作製するためにさらに用いた。ｖ２０６は、葉緑体形質転換例で用いた構築物であった。 例示的な配列を示す図。（Ａ）Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６９７９３（標的遺伝子）に対応する、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）（Ｈａ）からのアセチルコリンエステラーゼ（Ａｃ）遺伝子のｍＲＮＡ配列。（Ｂ）ＨａからのＡｃ遺伝子の配列（標的配列）に由来するＨａ−Ａｃｅ１２３６−１８９。（Ｃ）Ｈａ−ＨｐＡｃｅ１２３６−１８９、ｐＲＮＡｉ−ＧＧに存在するようなイントロンスペーサー領域を用いた配列Ｈａ−Ａｃｅ１２３６−１８９のヘアピン。示す配列は、ＤＮＡ構築物（前スプライシングされた）に出現する、標的配列の末端からの配列である。 例示的な配列を示す図。（Ａ）Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６９７９３（標的遺伝子）に対応する、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）（Ｈａ）からのアセチルコリンエステラーゼ（Ａｃ）遺伝子のｍＲＮＡ配列。（Ｂ）ＨａからのＡｃ遺伝子の配列（標的配列）に由来するＨａ−Ａｃｅ１２３６−１８９。（Ｃ）Ｈａ−ＨｐＡｃｅ１２３６−１８９、ｐＲＮＡｉ−ＧＧに存在するようなイントロンスペーサー領域を用いた配列Ｈａ−Ａｃｅ１２３６−１８９のヘアピン。示す配列は、ＤＮＡ構築物（前スプライシングされた）に出現する、標的配列の末端からの配列である。 ｖ１５３のためのプラスミドマップ。 ｖ１５３のためのヌクレオチド配列を示す図。 ｖ１５３のためのヌクレオチド配列を示す図。 ｖ１５３のためのヌクレオチド配列を示す図。 ｖ１５３のためのヌクレオチド配列を示す図。 ｖ１５３のためのヌクレオチド配列を示す図。 ｖ１５３のためのヌクレオチド配列を示す図。 改変されたｖ２０６のためのプラスミドマップ。 改変されたｖ２０６のためのヌクレオチド配列を示す図。 改変されたｖ２０６のためのヌクレオチド配列を示す図。 改変されたｖ２０６のためのヌクレオチド配列を示す図。 改変されたｖ２０６のためのヌクレオチド配列を示す図。 改変されたｖ２０６のためのヌクレオチド配列を示す図。 改変されたｖ２０６のためのヌクレオチド配列を示す図。 ｖ３０１のためのプラスミドマップ。 ｖ３０１のためのヌクレオチド配列を示す図。 ｖ３０１のためのヌクレオチド配列を示す図。 ｖ３０１のためのヌクレオチド配列を示す図。

農業において植物の有害生物および病原体の増殖を阻害するための効率的な手段として、トランスキングダムＲＮＡｉが近年出てきた。この手法は、多くの真核生物体に存在するＲＮＡプロセシング経路を活用し、それにより、外因性ｄｓＲＮＡは、細胞性ＲＮアーゼＩＩＩ酵素（例えば、ＤｉｃｅｒまたはＤｉｃｅｒ様タンパク質、例えば、ＤＣＬ１、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３およびＤＣＬ４）によって小さい干渉（ｓｉＲＮＡ）分子にプロセシングされる。ＤＩＣＥＲは長いｄｓＲＮＡ分子を長さが一般に約１９〜２４ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡに切断し、それらは次にパッセンジャー鎖およびガイド鎖の２つの一本鎖ＲＮＡにほどける。パッセンジャー鎖は分解され、ガイド鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。ガイド鎖がｍＲＮＡ分子の相補配列に特異的に結合して、ＲＩＳＣ複合体の触媒構成要素であるＡｒｇｏｎａｕｔによる切断を誘導するとき、転写後遺伝子サイレンシングが起こる。

トランスキングダムＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡ分子を標的生物に提供することによってこの内因性ＲＮＡプロセシング経路を活用し、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は標的生物で生成されないが別の生物体、例えば、標的生物が消費する生物体で生成される。ｄｓＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子を生成する方法のいくつかを、図１Ａに表す。この手法の１つの例は、植物でのｄｓＲＮＡ分子の供給であり、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は標的生物中の特異的標的遺伝子に相同的である。植物によって生成されるｄｓＲＮＡが有害生物によって摂取されるときに、有害生物のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構は、摂取されたｄｓＲＮＡを、有害生物で有害生物の生存に影響を与える必須の遺伝子サイレンシングまたは関係する事象を誘導することが可能なｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ形に変換するものと理解される。この手法は、「非細胞自律ＲＮＡｉ」とも呼ばれ、ｄｓＲＮＡ分子が全て１つの細胞で生成され、プロセシングされ、そのサイレンシング効果を発揮する状況から区別される。

宿主細胞でｄｓＲＮＡ分子を提供する１つの手法は宿主の細胞核に構築物を導入することであり、それは、宿主ゲノムの核で発現されるときにｄｓＲＮＡ分子をコードする。宿主生物でｄｓＲＮＡ分子を提供することにおいて、宿主生物の自身のＲＮＡプロセシング機構はｄｓＲＮＡ分子をｓｉＲＮＡに分解することができることも認識されている。このように、有害生物で遺伝子サイレンシングを誘導することが可能であるｓｉＲＮＡは、植物で生成することができる。しかし、トランスキングダムＲＮＡｉが成功するためには、高レベルのｄｓＲＮＡが標的生物に提供されなければならないことが今ではよく認識されている。したがって、トランスキングダムＲＮＡｉ方法論における近年の努力は、ｓｉＲＮＡへのそのようなプロセシングを阻止するために、宿主細胞核で生成されたｄｓＲＮＡ分子を安定させる手段に焦点を合わせている。例えば、いくつかは、分解を阻止するためにＲＮＡ結合分子の供給を示唆した。他は、ｓｉＲＮＡへのプロセシングによる減少を補償するために、宿主細胞核でのｄｓＲＮＡ発現のレベルを増加させる必要性を示唆した。ｄｓＲＮＡ分子の化学的改変を示唆したものもあった。明らかなことは、この状況を是正するための全ての努力が、既存の核形質転換方法を改変することと関係しているということである。

発明者らはｄｓＲＮＡ分解の問題点を解決するための異なる手法をとったが、驚くべきことに、維管束植物のプラスチド、例えば葉緑体で生成されるｄｓＲＮＡが、同じ細胞の核で生成されるｄｓＲＮＡと同じ分解またはプロセシングに感受性でないことを見出した。重要なことに、維管束植物の葉緑体を選択的に形質転換することによって維管束植物でｄｓＲＮＡを蓄積することが可能であることを発明者らは見出した。さらに、本発明によって生成される葉緑体が実質的にｓｉＲＮＡを含有しないことを発明者らは見出し、そのことはトランスキングダムＲＮＡｉ用途への本発明の適用のために有利である。さらに、葉緑体で蓄積されるｄｓＲＮＡが別の方法で他の葉緑体ＲＮＡプロセシング経路によって実質的にプロセシングされないことを発明者らは見出した。さらに、必須の幼虫遺伝子を標的にしたｈｐＲＮＡを葉緑体で発現するトランスジェニック植物で幼虫を飼育することが、そのような幼虫の成長に対して強い阻害性の効果を及ぼすことを発明者らは見出した。

プラスチドがＤｉｃｅｒ様酵素を用いてｄｓＲＮＡ分子をｓｉＲＮＡに分解するかどうか今まで未知であったので、発明者らの知見は意外である。例えば、葉緑体複製ウイロイドに対応するｓｉＲＮＡの植物細胞での存在は、高等植物の葉緑体でのＤｉｃｅｒ様プロセシング機構を示すと何人かは推測した。しかし、本発明者らは、高等植物のプラスチドで生成されるｄｓＲＮＡ分子がプラスチド内でｓｉＲＮＡにプロセシングされないことを見出した。したがって、発明者らは、維管束植物のプラスチドが高レベルのｄｓＲＮＡの生成に適する環境を提供することを見出した。

したがって、第１の実施形態では、本発明は、維管束植物のプラスチドであって、
− 以下を含む核酸構築物：
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
を含み、ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、プラスチドを提供する。

一般に、ｓｉＲＮＡは、長いｄｓＲＮＡ分子を一般に約１９〜２４ヌクレオチドの長さであるｓｉＲＮＡに切断する細胞性ＲＮアーゼＩＩＩ酵素（例えば、Ｄｉｃｅｒ）によって、ｄｓＲＮＡ分子から生成される。一般に、長さが１９〜２４ヌクレオチド未満の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡ配列は、そこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にしない。

したがって、本発明によって生成されるｄｓＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡがｄｓＲＮＡから生成されるために一般に必要とされるそれらの発生期の特性のかなりの割合を保持する。言い換えると、このｄｓＲＮＡ分子は、標的生物のＲＮアーゼＩＩＩ機構がｄｓＲＮＡ分子に結合してそこからｓｉＲＮＡ分子を生成することを可能にする特性を保持する。本発明によって生成されるｄｓＲＮＡが、そこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有するのは、この文脈においてである。これは下でさらに説明されるが、これに移る前に、ｄｓＲＮＡの性質をさらに議論することが有益である。

具体的には、ｄｓＲＮＡは、第１および第２の鎖がワトソン−クリック型塩基対によって互いに結合して「ステム」を形成することを可能にするのに十分な配列相補性を鎖間で有する、第１および第２のＲＮＡ鎖を一般に含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのステムは、第１と第２の鎖の間の１００％の相補性からなる。一部の実施形態では、ステムを形成する第１および第２の鎖の間に１つまたは複数のミスマッチがあってもよく、そのため、ステムの鎖間の相補性は１００％未満であってもよい。一般に、ステムの第１および第２の鎖間の相補性レベルは８０％を超え、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５、９６、９７、９８または９９％である。一般に、ミスマッチは、約３ヌクレオチド以下、好ましくは約２ヌクレオチドの連続した配列にわたる。好ましくは、ミスマッチは、間隔をあけて離れた位置の、ステムの第１および第２の鎖の単一のヌクレオチドの間に限定される。

上のことから、規定の長さのｄｓＲＮＡのステムが、ミスマッチの１つまたは複数の領域または位置を実際含むことができることが理解されよう。例えば、第１および第２の鎖が３０ヌクレオチド領域内の１、２のミスマッチを除けば３０ヌクレオチドの領域にわたって完全な相補性を有する場合、第１および第２の鎖は３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡのステムを構成すると言われるだろう。

ｄｓＲＮＡは、１つまたは複数のステムを含むことができる。１を超えるステムがある場合、これらは直列またはクラスタに配置されて直列型のまたは重複する逆方向反復を形成することができ、それらは、例えば、「ハンマーヘッド」、「バーベル」もしくは「イヌの骨」に似ている２ステム構造、または「クローバー型」に似ている３つ以上のステムを含有する構造、または擬似ノット様形状を有する構造に類似したｄｓＲＮＡ構造を形成する。これらの構築物のいずれも、二本鎖ステムの中で見出される（例えば、複数のアンチセンスもしくはセンスヌクレオチド配列セグメント間のスペーサーとして、または塩基対合アンチセンスヌクレオチド配列セグメントとセンスヌクレオチド配列セグメントの間のスペーサーとして）、または二本鎖ステムの外で見出される（例えば、センスまたはアンチセンス、または逆方向反復の対を分離する無関係なＲＮＡ配列のループ領域として）スペーサーセグメントをさらに含むことができる。塩基対合アンチセンスおよびセンスヌクレオチド配列セグメントの長さが等しくない場合は、より長いセグメントがスペーサーの働きをすることができる。

ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡの単一の鎖がステム構造を形成することを可能にする逆方向反復配列を有するＲＮＡの単一の鎖から生じることができる。あるいは、ｄｓＲＮＡは、互いに整列して塩基対合してｄｓＲＮＡ分子のステムを形成する、２つ以上のＲＮＡ分子から生じることができる。

上記のように、一実施形態では、そこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にするのは、ｄｓＲＮＡの長さ、特にｄｓＲＮＡのステムの長さである。一般的に、ｄｓＲＮＡのステムは、少なくとも３０ヌクレオチドの長さを有する。３０ヌクレオチドより短い長さでは、有害生物体のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ系がｄｓＲＮＡからｓｉＲＮＡを生成することができる程度に限界がある場合がある。様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡのステムは、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、またはより多くの塩基対からさえなることができる。１つの好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡは少なくとも約１００塩基対を含む。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡのステムは、少なくとも約２５０塩基対、またはより多く、例えば、５００または１０００塩基対を含む。

ｄｓＲＮＡは、コード領域によってコードされる。コード領域は、外因性核酸配列である。一部の実施形態では、コード領域は導入遺伝子をコードすることができる。一部の例では、導入遺伝子は、標的遺伝子配列を含む生物体で見出される核酸分子に相補的であるヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子の片方または両方の鎖をコードする配列であってもよい。さらなる例では、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤耐性遺伝子）、疾患の作用機構に関連するバイオマーカーをコードする遺伝子、薬学的に有益な化合物、または望ましい農業形質をコードする遺伝子であってもよい。

これらおよび他の例では、導入遺伝子は、導入遺伝子のコード配列に作動可能に連結される調節配列（例えば、プロモーター）を含有することができる。例を、下でさらに記載する。

一部の実施形態では、コード領域は単一の二本鎖ＲＮＡを本質的にコードすることができ、標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにアンチセンスである複数の直列アンチセンスヌクレオチド配列セグメント、および標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにセンスである複数の直列センスヌクレオチド配列セグメントを含む。複数の直列アンチセンスおよび複数の直列センスセグメントは、単一の二本鎖ＲＮＡステムまたは複数の二本鎖ステムを直列配置で形成することができる（複数の二本鎖ステムを分離する非塩基対合スペーサーＤＮＡの有り無しで）。

別の実施形態では、コード領域はＲＮＡの複数のｄｓＲＮＡステムをコードし、標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにアンチセンスである複数のアンチセンスヌクレオチド配列セグメント、および標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントにセンスである複数のセンスヌクレオチド配列セグメントを含み、そこで、前記複数のアンチセンスヌクレオチド配列セグメントおよび複数のセンスヌクレオチド配列セグメントは、直列の二本鎖ステムで配置される。

ある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡおよびｈｐＲＮＡの一方または両方を指すことができる。

コード領域によってコードされるｄｓＲＮＡ分子は、維管束植物の特定の有害生物または病原体を標的にするｓｉＲＮＡ分子の生成を可能にする配列を有することができる。このように、コード領域のヌクレオチド配列は、標的生物の標的遺伝子に相補的であり、宿主植物のヌクレオチド配列に対応しない。

したがって、別の実施形態では、維管束植物のプラスチドであって、
− 以下を含む核酸構築物：
− ｄｓＲＮＡ分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
を含み、コード領域は、植物のゲノムで見出されないヌクレオチド配列を有する、プラスチドが提供される。

一般的に、コード領域は標的遺伝子のヌクレオチド配列を有する。好ましい標的遺伝子は、関連する有害生物の生存に必須である遺伝子である。有害生物は、植物、動物、細菌、ウイルスまたは真菌界のものであってもよい。これらの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断するかまたはその翻訳を抑制するｓｉＲＮＡ分子の生成を可能にする。有害生物および標的遺伝子の例は、以下の通りである：
・鞘翅類有害生物、例えば、ディアブロティカ・ビルギフェラ・ビルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）LeConte（ウェスタンコーンルートワーム、「ＷＣＲ」）、ディアブロティカ・バルベリ（Diabrotica barberi）Smith and Lawrence（ノーザンコーンルートワーム、「ＮＣＲ」）、ディアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルディ（Diabrotica undecimpunctata howardi）Barber（サザンコーンルートワーム、「ＳＣＲ」）、ディアブロティカ・ビルギフェラ・ゼアエ（Diabrotica virgifera zeae）Krysan and Smith（メキシカンコーンルートワーム、「ＭＣＲ」）、ディアブロティカ・バルテアタ（Diabrotica balteata）LeConte；ディアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・テネラ（Diabrotica undecimpunctata tenella）、Ｄ．スペシオサ（D. speciosa）Germarおよびディアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・ウンデシムプンクタタ（Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata）Mannerheim；
・半翅類有害生物、例えば、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）（Fabr.）（ネオトロピカルブラウンスティンクバグ、「ＢＳＢ」）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）（L.）（ミナミアオカメムシ）、ピエゾドルス・グイルジニイ（Piezodorus guildinii）（Westwood）（レッドバンディドスティンクバグ）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）（Stal）（クサギカメムシ）、キナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）（Say）（グリーンスティンクバグ）、エウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）（Say）（ブラウンスティンクバグ）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）（Dallas）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）（F.）、エデッサ・メディタブンダ（Edessa meditabunda）（F.）、チアンタ・ペルディトル（Thyanta perditor）（F.）（ネオトロピカルレッドショルダードスティンクバグ）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）（Palisot de Beauvois）、ホルシアス・ノビレッルス（Horcias nobilellus）（Berg）（コットンバグ）、タエディア・スティグモサ（Taedia stigmosa）（Berg）、ディスデルクス・ペルビアヌス（Dysdercus peruvianus）（Guerin-Meneville）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）（Westwood）、レプトグロッサス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）（Dallas）、ニエストレア・シデ（Niesthrea sidae）（F.）、リグス・ヘスペルス（Lygus hesperus）（Knight）（ウェスタンターニッシュトプラントバグ）およびリグス・リネオラリス（Lygus lineolaris）（Palisot de Beauvois）；
・鱗翅類の有害生物、例えば、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（ユーロピアンコーンボーラー）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（フォールアーミーワーム）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）（シロイチモジヨトウ）、スポドプテラ・オルニトガリイ（Spodoptera ornithogalli）（イエローストライプトアーミーワーム）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（コーンイアワーム）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）（タマナヤガ）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）（オオタバコガ）、ディアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケーンボーラー）、ディアトラエア・グランディオセラ（Diatraea grandiosella）（サウスウェスタンコーンボーラー）、エラスモパルプス・リグノセルス（Elasmopalpus lignosellus）（レッサーコーンストークボーラー）、パパイペマ・ネブリス（Papaipema nebris）（ストークボーラー）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）（ワタアカミムシ）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）（グリーンクローバーワーム）、コリアス・エウリテメ（Colias eurytheme）（アルファルファキャタピラー）、アンティカルシア・ゲンマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ベルベットビーンキャタピラー）、プセウドプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ソイビーンルーパ）、コナガ（Plutella xylostella）（コナガ）、アグロミザ・パルビコルニス（Agromyza parvicornis）（コーンブロットリーフマイナー）、アコロイア・グリセラ（Achoroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、リンゴコカクモンハマキ（Adoxophyes orana）、アラバマ・アルギラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アミエロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンテラエア・ペルニイ（Antheraea pernyi）、アルチプス属の種（Archips sp.）、アルギロタエニア属の種（Argyrotaenia sp.）、アテティス・ミンダラ（Athetis mindara）、カイコガ（Bombyx mori）、ブクラトリクス・スルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、スジマダラメイガ（Cadra cautella）、コリストネウラ属の種（Choristoneura sp.）、コキルス・ホスペス（Cochylls hospes）、ガイマイツヅリガ（Corcyra cephalonica）、シディア・ラティフェレアヌス（Cydia latiferreanus）、シディア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテゲリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリクス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フェネラリス（Desmia feneralis）、ディアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ディアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、エンノモス・スブシグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフティニ（Eoreuma loftini）、エスフェスティア・エルテラ（Esphestia elutella）、エラニス・ティラリア（Erannis tilaria）、エスティグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、エウリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、エウポコエリア・アンビグエラ（Eupocoellia ambiguella）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）、エウプロクティス・クリソレア（Euproctis chrysorrhoea）、エウキソア・メソリア（Euxoa messoria）、ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・スブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、ヘミレウカ・オリビエ（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）、ヒファンティア・クネア（Hyphantia cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ラムディナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ラムディナ・フィセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ヤナギドクガ（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロキソステゲ・スティクティカリス（Loxostege sticticalis）、マイマイガ（Lymantria dispar）、マカラ・チリサリス（Macalla thyrisalis）、マラコソマ属の種（Malacosoma sp.）、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）、マンヅカ・キンケマクラタ（Manduca quinquemaculata）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、オペロフテラ・ブルマタ（Operophtera brumata）、オルギア属の種（Orgyia sp.）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピリオ・クレスホンテス（Papilio cresphontes）、フリガニディア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、モンシロチョウ（Pieris rapae）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スツルタナ（Platynota stultana）、プラチプティリア・カルヅイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、ノシメマダラメイガ（Plodia interpunctella）、ポンティア・プロトディス（Pontia protodice）、プセウダレティア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、バクガ（Sitotroga cerealella）、リンゴシロヒメハマキ（Spilonta ocellana）、タウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、エンソラ・ビスセリエラ（Ensola bisselliella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia hi）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアイルス（Xylomyges curiails）、イポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）およびオオタバコガ（Heliothis virescens）（オオタバコガ）；ならびに
・有害線虫、例えば、アフェレンコイデス属の種（Aphelenchoides spp.）、ベロノライムス属の種（Belonolaimus spp.）、クリコネメラ属の種（Criconemella spp.）、ディティレンクス属の種（Ditylenchus spp.）、グロボデラ属の種（Globodera spp.）、ヘテロデラ属の種（Heterodera spp.）、ヒルシュマニエラ属の種（Hyrschmanniella spp.）、ホプロライムス属の種（Hoplolaimus spp.）、ネコブセンチュウ属の種（Meloidogyne spp.）、ネグサレセンチュウ属の種（Pratylenchus spp.）およびラドホルス属の種（Radopholus spp.）、特定の種の非網羅的リストには、限定されずに、イヌ糸状虫（Dirofilaria immitis）、グロボデラ・パリダ（Globodera pallida）、ダイズシストセンチュウ（Heterodera glycines）、ヘテロデラ・ゼアエ（Heterodera zeae）、サツマイモネコブセンチュウ（Meloidogyne incognita）、ジャワネコブセンチュウ（Meloidogyne javanica）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、キタネグサレセンチュウ（Pratylenchus penetrans）、ラドホルス・シミリス（Radopholus similis）およびニセフクロセンチュウ（Rotylenchulus reniformis）が含まれる。

特定の例では、鞘翅類、半翅類および／もしくは鱗翅類の有害生物、または有害昆虫以外の生物体（例えば、植物寄生性線虫）の１つまたは複数の天然の核酸配列の少なくとも一部に相同的であってもよい例示的な核酸分子が開示され、それらには、限定されずに、Ｃａｆ１−１８０（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５８号明細書）、ＶａｔｐａｓｅＣ（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５９号明細書）、Ｒｈｏ１（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２６０号明細書）、ＶａｔｐａｓｅＨ（米国特許出願公開第２０１２／０１９８５８６号明細書）、ＰＰＩ−８７Ｂ（米国特許出願公開第２０１３／００９１６００号明細書）、ＲＰＡ７０（米国特許出願公開第２０１３／００９１６０１号明細書）、ＲＰＳ６（米国特許出願公開第２０１３／００９７７３０号明細書）、ＲＯＰ（米国特許出願公開第１４／５７７８１１号明細書）、ＲＮＡＰＩＩ（米国特許出願公開第１４／５７７８５４号明細書）、ならびに／または米国特許出願公開第２０１２／０１６４２０５号明細書、同第２０１１／００５４００７号明細書および同第２００９／０２６５８１８号明細書、米国特許第６，３２６，１９３号明細書、欧州特許出願公開第１２１０８７５号明細書および同第２６３３０４８号明細書、およびＰＣＴ国際特許出願公開第２０１１１５３４１８号パンフレット、同第２００７０８０１２６号パンフレット、同第２０１２１４３５４２号パンフレット、同第２００５１１００６８号パンフレットおよび同第２００６０４７４９５号パンフレットで開示されるもの；あるいは、鞘翅類、半翅類および／または鱗翅類の有害生物または有害昆虫以外の生物体（例えば、植物寄生性線虫、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１８８４３８号明細書、同第２００６／００８０７４９号明細書、同第２００９／０３００７９６号明細書、およびＰＣＴ国際特許出願公開第２００３０５２１１０号パンフレット、同第２００４０６６１８３号パンフレット、同第２００４００５４８５号パンフレット、同第２００５０１９４０８号パンフレット、同第２００６０４６１４８号パンフレット、同第２００７０８７１５３号パンフレット、同第２００７０９５４９６号パンフレットおよび同第２００９１３３１２６号パンフレットで開示されるもの）の遺伝子を標的にするｄｓＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニック事象が含まれる。

ある特定の実施形態では、核酸構築物は、ｄｓＲＮＡをコードする１を超えるコード領域を含むことができる。例えば、核酸構築物は、第１の昆虫標的遺伝子のための第１のｄｓＲＮＡをコードする第１のコード領域、および昆虫標的遺伝子のためのさらなるｄｓＲＮＡをコードするさらなるコード領域を含むことができる。

さらなる実施形態では、本発明によるプラスチドまたは葉緑体は、１を超えるタイプの核酸構築物を含むことができる。例えば、本発明によるプラスチドまたは葉緑体は、
− 第１の昆虫標的遺伝子のための第１のｄｓＲＮＡをコードする第１のコード領域を含む第１の核酸構築物；
− 昆虫標的遺伝子のためのさらなるｄｓＲＮＡをコードするさらなるコード領域を含むさらなる核酸構築物
を含むことができる。

第１のおよびさらなるコード領域ならびに各々から生成されるｄｓＲＮＡは、同じであっても異なってもよい。

さらに、第１のおよびさらなるコード領域は、同じプロモーターもしくは調節配列、または異なるプロモーターもしくは調節配列の制御下にあってもよい。一実施形態では、第１のコード領域は構成的プロモーターの制御下にあってもよく、さらなるコード領域は誘導可能なプロモーターの制御下にあってもよい。

他の実施形態では、第１のおよびさらなるコード領域の両方は、構成的プロモーターの制御下にあるか、または誘導可能なプロモーターの制御下にある。葉緑体およびプラスチドでのｄｓＲＮＡの発現のために有益な特定のプロモーターの例は、下に記載される。

サイレンシング効果を有すると予想される認識の最小限の程度は、ヘアピンのステム中の配列と、１９ヌクレオチドの連続配列ブロック中で１６ヌクレオチド以上を超える完全な同一性の少なくとも１つのブロックを共有する標的ｍＲＮＡ中の配列の間にあるだろう。

他の実施形態では、標的遺伝子は、遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡｉが必要とされる遺伝子である。そのような遺伝子は、疾患の病状で発現される遺伝子であってもよい。別の例では、遺伝子は工業プロセスで発現されるものであってもよい。

維管束植物の細胞質でｄｓＲＮＡ分子が提供されるとき（核または他でのＤＮＡ構築物の発現を通してであるかどうかにかかわらず）、ｄｓＲＮＡ分子は細胞質中のＤｉｃｅｒ酵素によって認識されて、ｓｉＲＮＡにプロセシングされることが知られている。しかし、これらの同じ植物のプラスチドで提供されるｄｓＲＮＡは、同じプロセシングを受けないことを発明者らは見出した。したがって、本発明によって生成されるｄｓＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡにプロセシングされず、プラスチドはｄｓＲＮＡ分子配列に由来するｓｉＲＮＡ分子を含まない。

したがって、別の実施形態では、維管束植物のプラスチドであって、
− 以下を含む核酸構築物：
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
を含み、ｄｓＲＮＡの配列を含むｓｉＲＮＡ分子を実質的に含まないプラスチドが提供される。

一般に、プラスチドはｄｓＲＮＡの配列を含むｓｉＲＮＡ分子を含有しないが、一部の実施形態では、プラスチドはＲＮＡの分解または異化作用から生じる分解生成物を含有することができること、および、さもなければ、プラスチドでのｄｓＲＮＡの生成または蓄積に関係しない量である特定のｓｉＲＮＡを含有することができることが理解されよう。

維管束植物のプラスチドは、公知の細胞質ＲＮアーゼＩＩＩ（「Ｄｉｃｅｒ」）酵素の相同体を含むか場合があると推測されている。さらに、葉緑体ＲＮＡがかなりのＲＮＡ編集をしばしば受けることが知られている。したがって、維管束植物のプラスチドで提供されるｄｓＲＮＡが、ＤＮＡ構築物によってコードされる標的遺伝子のヌクレオチド配列の実質的に全てを保持するかどうかは、今まで未知であった。発明者らは、高等植物の葉緑体が標的遺伝子のコード領域から転写されるｄｓＲＮＡを実質的に編集しないこと、およびコード領域から転写されるｄｓＲＮＡの実質的なトランケーションもスプライシングもないことを驚くべきことに見出した。

したがって、別の実施形態では、維管束植物のプラスチドであって、
− 以下を含む核酸構築物：
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
− ｄｓＲＮＡ
を含み、ｄｓＲＮＡはコード領域によってコードされるヌクレオチド配列の実質的に全てを含有する、プラスチドが提供される。

一般に、ステム構造の形成に必要なｄｓＲＮＡの領域を除去する転写後修飾を受けていないという点で、ｄｓＲＮＡはプロセシングされていない。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、５’もしくは３’非翻訳領域またはポリＡテールを除去するために改変されている。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡヘアピンの場合のように、ループ構造を形成することが観察されているものなどの非相補性領域を除去するために改変されている。

本発明は、トランスキングダムＲＮＡｉ適用で用いるための高レベルのｄｓＲＮＡ分子を提供する点で、特定の有用性を有する。前述のように、トランスキングダムＲＮＡｉが成功するためには、大量のｄｓＲＮＡが標的生物に提供されなければならないことが今では認識されている。本発明の１つの特に重要な知見は、プラスチドで生成されるｄｓＲＮＡがプラスチドからサイトゾルに通過することができないということである。これは、２つの点で重要である。第１に、プラスチド中に残ることによって、ｄｓＲＮＡはプラスチド中で大量に蓄積することができる。第２には、プラスチドによりサイトゾルとの相互作用を阻止されることによって、ｄｓＲＮＡは、プラスチドで生成されるｄｓＲＮＡに最終的に影響を与えるかまたはさもなければ植物の生長および生産に影響を与える可能性があるサイトゾルＲＮＡｉを誘導することができない。実際、プラスチドは、さもなければＲＮＡｉを誘導する状況でのｄｓＲＮＡ生成を可能にする。

したがって、本発明により、ｄｓＲＮＡは維管束植物のプラスチド中で蓄積してプラスチドによって保持されると理解されるので、ｄｓＲＮＡはプラスチドからサイトゾルに浸出することが阻止され、したがってサイトゾルでＲＮＡｉを誘導することが阻止される。

上記の実施形態では、プラスチドは、葉緑体、有色体、白色体または原色素体であってもよい。一般的に、プラスチドは葉緑体である。ミトコンドリアは、本発明による核酸構築物を同様に含むことができる非プラスチドオルガネラである。

さらなる実施形態では、上記のようにプラスチドまたは葉緑体によって生成される場合のｄｓＲＮＡが提供される。

Ｂ．核酸構築物
一実施形態では、本発明は、維管束植物の形質転換のための核酸構築物であって、
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− プラスチドでのｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
− 維管束植物のプラスチドゲノムへの構築物の組込みに選択的である１つまたは複数の組込み部位
を含み、ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、核酸構築物が提供される。

具体的には、構築物は植物のプラスチドに形質転換することができる。構築物は、ＲＮＡへの発現の結果、別の生物体で標的遺伝子発現を阻害するために用いることができるｄｓＲＮＡ分子を形成または生成する、コード領域を含む。発現を開始するかまたは増強するために、そのような核酸構築物は１つまたは複数の調節配列を含むことができ、これらの調節配列は、ｄｓＲＮＡとして発現させることが可能な核酸配列に作動可能に連結することができる。

具体的な実施形態では、本発明の核酸構築物は、ｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むことができる。多くの実施形態では、転写されたｄｓＲＮＡ分子を安定した形で、例えば、ヘアピンおよびステム・ループ構造として提供することができる。

ｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸構築物は、少なくとも１つのプロモーターに対して１つのヌクレオチド配列がセンス配向であり、他のヌクレオチド配列がアンチセンス配向であるように配置されるコード配列で少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、センスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列は、約五（約５）から約千（１０００）のヌクレオチドのスペーサー配列によって連結または接続される。スペーサー配列は、センスおよびアンチセンス配列の間でループを形成することができる。センスヌクレオチド配列またはアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその断片に実質的に相同的であってもよい。しかし一部の実施形態では、核酸構築物分子は、スペーサー配列のないｄｓＲＮＡ分子をコードすることができる。実施形態では、センスコード配列およびアンチセンスコード配列は、異なる長さであってもよい。

トランスキングダムＲＮＡｉを促進するために有益であると特定された配列は、本発明の核酸構築物での適当な発現カセットの形成を通して、発現されるｄｓＲＮＡ分子に容易に組み込むことができる。例えば、そのような配列は、第１のセグメントに相同的でも相補的でもない第２のセグメントスペーサー領域にこの配列を連結する、標的遺伝子配列に対応する第１のセグメントをとること；およびその少なくとも一部は第１のセグメントに実質的に相補的である第３のセグメントにこれを連結することによって、ステム・アンド・ループ構造のヘアピンとして発現させることができる。そのような構築物は、第１のセグメントと第３のセグメントとのハイブリダイゼーションによってステム・アンド・ループ構造を形成し、ループ構造は第２のセグメントを含んで形成される。例えば、米国特許出願公開第２００２／００４８８１４号明細書および米国特許出願公開第２００３／００１８９９３号明細書；ならびに国際公開第９４／０１５５０号パンフレットおよび国際公開第９８／０５７７０号パンフレットを参照する。

好ましい一実施形態では、上記スペーサー配列は、イントロンの配列、特に葉緑体またはプラスチドゲノムの遺伝子のイントロンの配列を有することができる。例を、表１に示す。

本発明のある特定の実施形態では、葉緑体またはプラスチドによってプロセシングされる葉緑体またはプラスチドのイントロンは、葉緑体またはプラスチドが、昆虫ＲＮＡｉと関連する昆虫DICERおよび関係する酵素のためのより優れた基質であり得るより小さいループを有するヘアピンＲＮＡを生成することを可能にすることができるので、特定の利点を有することができる。

別の好ましい実施形態では、スペーサー配列は、プラスチドの一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンのスプライスアウトのためのコンセンサススプライスシグナルの配列を有することができる。この実施形態では、コンセンサススプライスシグナルは、葉緑体イントロンの配列をそれ自体有しないスペーサー配列に連なってもよい。

本発明の実施形態は、１つまたは複数のｄｓＲＮＡ分子の定常状態レベルの発現を達成するために、プラスチドへの本発明の構築物の導入（すなわち、形質転換）を含む。核酸構築物は、例えば、線状または閉環状のプラスミドなどのベクターであってもよい。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主のプラスチドゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。さらに、ベクターは発現ベクターであってもよい。本発明のコード領域は、例えば、１つまたは複数の宿主で連結されたコード配列または他のＤＮＡ配列の発現を促進する働きをするのに適したプロモーターの制御下で、ベクターに好適に挿入することができる。この目的のために多くのベクターが利用でき、適当なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターで形質転換される特定のプラスチドに主に依存する。各ベクターは、その機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する特定の宿主細胞または細胞下オルガネラによって様々な構成要素を含有する。

ベクターは、例えば形質転換細胞を生成するために細胞に導入される核酸分子である。ベクターは、複製開始点などの、宿主細胞でのその複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターの例には、限定されずに、細胞に外因性ＤＮＡを運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスが含まれる。ベクターは、当技術分野で公知である１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス配列、および／または選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントを含むこともできる。ベクターは、細胞を転換、形質転換または感染させ、それによって、ベクターによってコードされる核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させることができる。ベクターは、細胞への核酸分子の侵入を達成することを助ける材料を任意選択で含む（例えば、リポソーム、タンパク質コーティングなど）。

ベクターは、宿主細胞のプラスチドでのその複製を可能にする核酸配列を含むことができる。好ましくは、これらの配列は、ベクターが宿主細胞のプラスチドで複製することを可能にするが、宿主細胞のサイトゾルでもまたは核でもそうしない。

一実施形態では、核酸構築物は、それが含む導入遺伝子の宿主細胞のプラスチドゲノムへの組込みを可能にする核酸配列を含む。好ましくは、導入遺伝子が核ゲノムよりもプラスチドゲノムに選択的に、または少なくとも優先的に組み込まれるように、核酸構築物は調整される。したがって一実施形態では、核酸構築物は、宿主細胞の核のゲノムにではなく、宿主細胞のプラスチドのゲノムへの組込みを可能にする配列を含有する。組込み領域の例は、ｔｒｎＶ−３’−ｒｐｓ１２、ｔｒｎＩ−ｔｒｎＡおよびｔｒｎｆＭ−ｔｒｎＧである。特異的組込み部位の例は、ｔｒｎＨ／ｐｂＡ、ｔｒｎＧ／ｔｒｎｆＭ、ｙｃｆ３／ｔｒｎＳ、ｒｂｃＬ／ａｃｃＤ、ｐｅｔＡ／ｐｓｂＪ、５’ｒｐｓ１２／ｃｌｐＰ、ｐｅｔＤ／ｒｐｏＡ、ｎｄｈＢ／ｒｐｓ７、３’ｒｐｓ１２／ｔｒｎＶ、ｔｒｎＶ／ｒｒｎ１６、ｒｒｎ１６／ｔｒｎＩ、ｔｒｎＩ／ｔｒｎＡ、ｔｒｎＮ／ｔｒｎＲおよびｒｐｌ３２／ｔｒｎＬである。

プラスチドでｄｓＲＮＡ分子の発現（すなわち、転写）を可能にするために、核酸構築物は、１つまたは複数の調節配列、例えば核酸構築物が発現されるプラスチドで機能する異種プロモーター配列に作動可能に連結されるｄｓＲＮＡ分子をコードする領域を含むことができる。

第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にあるとき、第１のヌクレオチド配列は第２の核酸配列と作動可能に連結している。組換えで生成される場合は、作動可能に連結する核酸配列は一般に連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、同じ読み枠（例えば、多シストロン性ＯＲＦ）中にある。しかし、核酸は、作動可能に連結するために連続している必要はない。

調節配列およびコード配列に関して用いられるとき、用語「作動可能に連結した」は、調節配列が連結されるコード配列の発現に影響することを意味する。「調節配列」または「制御エレメント」は、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステム−ループ構造、リプレッサー結合配列、終結配列、ポリアデニル化認識配列などを含むことができる。特定の調節配列は、それに作動可能に連結しているコード配列の上流および／または下流に位置することができる。また、コード配列に作動可能に連結している特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖に位置することができる。

本明細書で用いるように、用語「プロモーター」は、転写の開始の上流にあってもよく、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与することができるＤＮＡ領域を指す。プロモーターは細胞での発現のためにコード配列に作動可能に連結することができ、またはプロモーターは、細胞での発現のためにコード配列に作動可能に連結することができるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。「植物プロモーター」は、植物細胞で転写を開始することが可能なプロモーターであってもよい。発達制御下のプロモーターの例には、ある特定の組織、例えば、葉、根、種子、繊維、道管、仮導管または厚壁組織で転写を優先的に開始するプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、「組織選好」と呼ばれる。ある特定の組織だけで転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。

「細胞型特異的」プロモーターは、主に１つまたは複数の器官のある特定の細胞型、例えば、根または葉の維管束細胞で発現を促進する。ある特定の細胞下オルガネラ（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体または他のプラスチドなど）だけで転写を開始するプロモーターは、場合により「プラスチド特異的」、「葉緑体特異的」または「ミトコンドリア特異的」プロモーターと呼ばれる。一部のプロモーターは、１を超える細胞下位置で転写を開始することができることが理解されよう。

特に好ましい一実施形態では、核酸構築物は、プラスチドで作動可能であるプロモーターまたは調節エレメントを含有し、宿主細胞の核またはサイトゾルまたは他のオルガネラで作動可能であるプロモーターまたは調節エレメントを含有しない。

「誘導可能な」プロモーターは、環境制御下であってもよいプロモーターであってもよい。誘導可能なプロモーターによって転写を開始することができる環境条件の例には、嫌気条件および光の存在が含まれる。組織特異的、組織選好、細胞型特異的および誘導可能なプロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件の下で、またはほとんどの細胞もしくは組織型で作動可能であるプロモーターである。

本発明の一部の実施形態では、任意の誘導可能なプロモーターを用いることができる。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366を参照する。誘導可能なプロモーターでは、転写の速度は誘導剤に応じて増加する。例示的な誘導可能なプロモーターには、限定されずに、銅に応答するＡＣＥＩ系からのプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤薬害軽減剤に応答するトウモロコシからのＩｎ２遺伝子；ＴｎｌＯからのＴｅｔリプレッサー；および、その転写活性は糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導することができるステロイドホルモン遺伝子からの誘導可能なプロモーター（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）が含まれる。

例示的な構成的プロモーターには、限定されずに、植物ウイルスからのプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓプロモーター；イネアクチン遺伝子からのプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；および、ＡＬＳプロモーター、アブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’側のＸｂａｌ／Ｎｃｏｌ断片（または前記ＸｂａｌＮｃｏｌ断片類似のヌクレオチド配列）（国際公開第９６／３０５３０号パンフレット）が含まれる。

さらに、本発明の一部の実施形態では、任意の組織特異的または組織選好プロモーターを利用することができる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結されるコード配列を含む核酸分子で形質転換した植物は、特異的組織でコード配列の生成物を排他的または優先的に生成することができる。例示的な組織特異的または組織選好プロモーターには、限定されずに、根選好プロモーター、例えばファゼオリン遺伝子からのもの；葉特異的および光誘発プロモーター、例えばキャブ（cab）またはルビスコからのもの；葯特異的プロモーター、例えばＬＡＴ５２からのもの；花粉特異的プロモーター、例えばＺｍＪ３からのもの；および花粒粉選好プロモーター、例えばａｐｇからのものが含まれる。

本発明の構築物での使用に適するプロモーターには、誘導可能、ウイルス性、合成的または構成的であるものが含まれ、その全ては当技術分野で周知である。そのようなプロモーターを記載する非限定例には、米国特許第６，４３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；同第５，６４１，８７６号明細書（イネアクチンプロモーター）；同第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；同第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；同第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）；同第６，１７７，６１１号明細書（構成的トウモロコシプロモーター）；同第５，３２２，９３８号明細書、同第５，３５２，６０５号明細書、同第５，３５９，１４２号明細書および同第５，５３０，１９６号明細書（３５Ｓプロモーター）；同第６，４３３，２５２号明細書（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；同第６，４２９，３５７号（イネアクチン２プロモーターおよびイネアクチン２イントロン）；同第６，２９４，７１４号明細書（光誘導可能プロモーター）；同第６，１４０，０７８号明細書（塩誘導可能プロモーター）；同第６，２５２，１３８号明細書（病原体誘導可能プロモーター）；同第６，１７５，０６０号明細書（リン欠乏誘導可能プロモーター）；同第６，３８８，１７０号明細書（両方向プロモーター）；同第６，６３５，８０６号明細書（ガンマ−コイキシン（coixin）プロモーター）；ならびに、米国特許出願シリアル番号０９／７５７，０８９（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）が含まれる。追加のプロモーターには、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）、およびオクトピン合成酵素（ＯＣＳ）プロモーター（両方ともアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＴｉプラスミドで運ばれる）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24）；ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Odell et al.(1985) Nature 313: 810-2）；ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）；スクロース合成酵素プロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号明細書、同第５，３５２，６０５号明細書、同第５，３５９，１４２号明細書および同第５，５３０，１９６号明細書）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号明細書および同第５，３７８，６１９号明細書）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号明細書）；ならびに、ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０００８７；Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7）が含まれる。

特定の実施形態では、本発明の核酸構築物は、根特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターを含む。根特異的プロモーターは、根組織で作動可能に連結した配列の発現を排他的または優先的に促進する。根特異的プロモーターの例は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，１１０，７３２号明細書、同第５，４５９，２５２号明細書および同第５，８３７，８４８号明細書、ならびにOpperman et al. (1994) Science 263:221-3およびHirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18を参照する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子をコードする領域は、トランスジェニック植物細胞で作動可能であって、その中で発現してトランスジェニック植物細胞および／またはプラスチドでｄｓＲＮＡ分子を生成する、２つの根特異的プロモーターの間にクローニングすることができる。

目的の核酸分子に任意選択で作動可能に連結することができる追加の調節配列は、プロモーター配列と翻訳リーダー配列として作用するコード配列の間に位置する５’ＵＴＲを含む。翻訳リーダー配列は完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在し、それは一次転写産物のプロセシングおよび／またはＲＮＡ安定性に影響することができる。翻訳リーダー配列の例には、トウモロコシおよびツクバネアサガオの熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルスのコートタンパク質リーダー、植物のルビスコリーダーおよび他が含まれる。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照する。５’ＵＴＲの非限定例には、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）；ＡｔＡｎｔｌ；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）が含まれる。

一部の実施形態では、プロモーター領域は、葉緑体遺伝子、例えばホウレンソウまたはエンドウからのｐｓｂＡ遺伝子、トウモロコシからのｒｂｃＬおよびａｔｐＢプロモーター領域、ならびにｒＲＮＡプロモーター（プラスチドｒｒｎオペロンから）に由来する。プロモーターの例は、Verma & Daniell (2007) Plant Physiol. 145: 1129-43; Rasala et al. (2011) Plant Biotech. J. 9: 674-83, Hanley-Bowdoin and Chua, TIBS (1987) 12:67-70；Mullet et al., Plant Molec. Biol. (1985) 4:39-54；Hanley-Bowdoin (1986) PhD. Dissertation, The Rockefeller University；Krebbers et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10:4985-5002；Zurawski et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:3251-3270およびZurawski et al., Proc. Nat'l Acad Sci. U.S.A. (1982) 79:7699-7703に記載されている。他のプロモーターを特定することができ、そのように特定されるプロモーターの相対強度は、目的のプロモーターをプロモーターのないマーカー遺伝子の５’に置き、例えば、現在まで特定された最強の葉緑体プロモーターであるｐｓｂＡ遺伝子からのプロモーターから得られる転写と比較してその有効性を観察することによって評価することができる。コード領域発現の効率は、様々な技術によってさらに増強することができる。これらには、目的のＤＮＡ配列の５’に直列に挿入された複数のプロモーター、例えば二重ｐｓｂＡプロモーターの使用、エンハンサー配列の追加などが含まれる。一実施形態では、プロモーター領域は、下の表２に示す葉緑体遺伝子に由来する。

ほとんどの場合、葉緑体で機能的であるプロモーターは、誘導可能であるよりも構成的である。しかし、目的のｄｓＲＮＡ分子の誘導可能な発現を提供することが望ましい場合は、転写および／または翻訳のレベルでの調節（３’末端で）を提供する配列を含有する調節可能なプロモーターおよび／または５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を提供することができる。転写およびＲＮＡ安定性は、葉緑体遺伝子発現の重要な決定因子であるようである。例えば、光によって発現が調節可能である遺伝子からの、５’非翻訳領域を用いることができる。同様に、外来遺伝子のＲＮＡを安定させるために、３’逆方向反復領域を用いることもできる。調節可能な遺伝子は、目的の特定の刺激に応答して増強された発現および刺激不在下での低い発現または無発現によって特定することができる。例えば、光調節可能な遺伝子は、増強された発現が光照射の間に起こり、光が無視できるときに発現が実質的に低減されるかまたはない場合に、特定することができる。本発明により用いることができる５’ＵＴＲには、ＧＧＡＧＧ、ｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ、ａｔｐＢ、Ｃｒｙ２ＡおよびＴ７ｇｅｎｅ１０が含まれる。

目的の核酸分子に任意選択で作動可能に連結することができる追加の調節配列には、３’非翻訳領域、（３’ＵＴＲ）３’転写終結領域またはポリアデニル化領域も含まれる。これらはヌクレオチド配列の下流に位置する遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナルおよび／または転写もしくはｍＲＮＡプロセシングに影響することが可能な他の調節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物においてｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加をもたらす働きをする。ポリアデニル化配列は、様々な植物遺伝子から、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子から誘導することができる。３’転写終結領域の非限定例は、ノパリン合成酵素３’領域である（ｎｏｓ３’；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）。異なる３’非翻訳領域の使用例は、Ingelbrecht et al, (1989) Plant Cell 1:671-80で提供される。ポリアデニル化シグナルの非限定例には、エンドウ（Pisum sativum）のＲｂｃＳ２遺伝子（Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９；Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０１３１２）からのものが含まれる。本発明により用いることができる３’ＵＴＲには、ｒｐｓ１６、ｒｂｃＬ、ｐｓｂＡおよびｐｅｔＤが含まれる。

一部の実施形態では、形質転換ベクターは、１を超える標的配列に特異的に相補的な配列を含有することができ、したがって、標的生物の１つまたは複数の集団または種の細胞で２つ以上の遺伝子の発現を阻害するための、１を超えるｄｓＲＮＡの生成を可能にする。トランスジェニック植物での発現のために、異なる遺伝子に存在するヌクレオチド配列に特異的に相補的なヌクレオチド配列のセグメントを、単一の複合核酸分子に合併することができる。そのようなセグメントは連続していても、またはスペーサー配列によって分離されてもよい。

本発明の核酸構築物またはベクターは、形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含むことができる。マーカーは、殺生物剤耐性、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなど）、または除草剤耐性（例えば、グリホサートなど）をコードすることができる。

選択マーカーの例には、限定されずに、以下のものが含まれる：カナマイシン耐性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８などの使用について選択することができるネオ遺伝子；ビアラホス耐性をコードするバー遺伝子；グリホサート耐性をコードする突然変異ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子；ブロモキシニルへの耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を付与する突然変異アセトラクテート合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）；およびメトトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝子。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンなどへの耐性を付与する、複数の選択マーカーを利用できる。そのような選択マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、同第５，６３３，４３５号明細書、同第５，７８０，７０８号明細書および同第６，１１８，０４７号明細書で例示される。

本発明の組換え核酸構築物またはベクターは、スクリーニング可能なマーカーを含むこともできる。スクリーニング可能なマーカーは、発現を監視するために用いることができる。例示的なスクリーニング可能なマーカーには、様々な発色性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）；植物組織でアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する生成物をコードするγ座遺伝子（Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium. P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82）；βラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41）；様々な発色性基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al. (1986) Science 234:856-9）；発色性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al. (1990) Bio Technol. 8:241-2）；その後メラニンに縮合するドーパおよびドーパキノンにチロシンを酸化することが可能な酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14）；およびａ−ガラクトシダーゼが含まれる。

一実施形態では、核酸構築物は、殺虫性ポリペプチドの生成のためのコード領域を含むこともできる。

殺虫性ポリペプチドは、鞘翅類、鱗翅類または半翅類の有害生物に殺虫性であってもよい。

殺虫性ポリペプチドは、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）で見出されるポリペプチドの配列を有するものであってもよい。

殺虫性Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）ポリペプチドは、以下からなる群から選択することができる：Ｃｒｙ１（例えば、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａ）、Ｃｒｙ２（例えば、Ｃｒｙ２Ａｂ）、Ｃｒｙ３（例えば、Ｃｒｙ３Ｂｂ；Ｃｒｙ３Ａ）、Ｃｒｙ６、Ｖｉｐ３（例えば、Ｖｉｐ３Ａｂ１）、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、ならびに限定されずに付加および欠失を含むそれらの改変形。Ｂｔｓの広範なリストが、http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html.で維持され、定期的に更新される。７３主要群の「Ｃｒｙ」毒素（Ｃｒｙ１〜Ｃｒｙ７３）を超えて現在あり、さらなるＣｙｔ毒素および植物殺虫性タンパク質（ＶＩＰ）毒素などがある。数字で表した各群の多くは大文字のサブグループを有し、大文字のサブグループは小文字のサブサブグループを有する。（例えば、Ｃｒｙ１はＡ〜Ｌを有し、Ｃｒｙ１Ａはａ〜ｉを有する）。

殺虫性ポリペプチドは、ＰＩＰ−１ポリペプチドであってもよい。

一実施形態では、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）殺虫性ポリペプチドは、ＣＰＢ（コロラドハムシ）、コーンルートワームまたは他の有害昆虫の必須遺伝子に殺虫性であるｄｓＲＮＡを含有する構築物と一緒に用いることができる。そのような標的遺伝子には、例えば、ＣＰＢのＡＴＰアーゼコード遺伝子が含まれる。他のそのような標的遺伝子には、例えば、コーンルートワームの空胞ＡＴＰアーゼ、ＡＲＦ−１、Ａｃｔ４２Ａ、ＣＨＤ３、ＥＦ−１α、ＲＯＰ、ＲＮＡＰＩＩおよびＴＦＩＩＢが含まれる。適する標的遺伝子の例は、国際公開第２００７０３５６５０号パンフレットに開示される空胞ＡＴＰアーゼである。

一部の実施形態では、上記の組換え核酸構築物は、定常状態レベルのｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にするために、トランスジェニック植物の形成、および植物プラスチドでの異種核酸の特異的発現のための方法で用いることができる。植物形質転換ベクターは、例えば、ｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸構築物を植物形質転換ベクターに、特にプラスチド形質転換ベクターに挿入し、これらをプラスチド（例えば、葉緑体）に導入することによって調製することができる。

葉緑体に発現カセットを含有するプラスミドの複製を得ることを望む場合、発現構築物で任意の葉緑体複製開始点を用いることができる。

一実施形態では、核酸構築物は、そこから生成されるｄｓＲＮＡの宿主細胞核での、またはｄｓＲＮＡからｓｉＲＮＡを生成できる他の宿主細胞コンパートメントでの発現を阻止するように調整される。これは、植物由来のｓｉＲＮＡまたは関連するＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が混入していない殺虫性ｄｓＲＮＡを含有する植物材料の生成を可能にし、したがって増強した殺虫効力を有する。この実施形態により、維管束植物の形質転換のための核酸構築物であって、
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− 好ましくは表２に示すプロモーターまたは調節エレメントから選択される、プラスチドでのｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
− 好ましくは以下の組込み部位、ｔｒｎＨ／ｐｂＡ、ｔｒｎＧ／ｔｒｎｆＭ、ｙｃｆ３／ｔｒｎＳ、ｒｂｃＬ／ａｃｃＤ、ｐｅｔＡ／ｐｓｂＪ、５’ｒｐｓ１２／ｃｌｐＰ、ｐｅｔＤ／ｒｐｏＡ、ｎｄｈＢ／ｒｐｓ７、３’ｒｐｓ１２／ｔｒｎＶ、ｔｒｎＶ／ｒｒｎ１６、ｒｒｎ１６／ｔｒｎＩ、ｔｒｎＩ／ｔｒｎＡ、ｔｒｎＮ／ｔｒｎＲおよびｒｐｌ３２／ｔｒｎＬの群から選択される、維管束植物のプラスチドゲノムへの構築物の組込みに選択的である１つまたは複数の組込み部位
を含む核酸構築物が提供される。

この実施形態により、葉緑体だけで活性化されるプロモーターの使用、および葉緑体ゲノムだけへの組込みを可能にする組込み部位の使用は、葉緑体の外側で関連する導入遺伝子のｄｓＲＮＡを発現する植物の形成を阻止し、関連する導入遺伝子のｓｉＲＮＡを発現する植物の形成を阻止する。１つの利点は、プラスチドおよび核の両方の形質転換体である細胞集団が、構築物の使用によって形成されないので、その細胞についてさらに選択する必要なしに、葉緑体形質転換の存在に基づいて形質転換体について選択することができることである。

特に好ましい実施形態では、維管束植物の形質転換のための核酸構築物であって、
− スペーサー領域によって間隔が置かれた第１および第２の領域を有するＲＮＡ分子をコードするコード領域であって、第１の領域は第２の領域と部分的または完全な配列相補性を有し、スペーサーは表１に示すイントロンの配列と同一または相同的である、コード領域；
− 好ましくは表２に示すプロモーターまたは調節エレメントから選択される、プラスチドでのＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
− 好ましくは以下の組込み部位、ｔｒｎＨ／ｐｂＡ、ｔｒｎＧ／ｔｒｎｆＭ、ｙｃｆ３／ｔｒｎＳ、ｒｂｃＬ／ａｃｃＤ、ｐｅｔＡ／ｐｓｂＪ、５’ｒｐｓ１２／ｃｌｐＰ、ｐｅｔＤ／ｒｐｏＡ、ｎｄｈＢ／ｒｐｓ７、３’ｒｐｓ１２／ｔｒｎＶ、ｔｒｎＶ／ｒｒｎ１６、ｒｒｎ１６／ｔｒｎＩ、ｔｒｎＩ／ｔｒｎＡ、ｔｒｎＮ／ｔｒｎＲおよびｒｐｌ３２／ｔｒｎＬの群から選択される、維管束植物のプラスチドゲノムへの構築物の組込みに選択的である１つまたは複数の組込み部位
を含む核酸構築物が提供される。

Ｃ．プラスチド形質転換
本発明の核酸構築物は、いくつかの方法のいずれかによって目的の植物細胞に形質転換することができる。これらの方法には、例えば、微粒子銃装置（例えば、Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299-302；米国特許第４，９４５，０５０号明細書を参照）；エレクトロポレーション（Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824-5828）；葉緑体へのＤＮＡの導入が可能なレーザービーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたは任意の他の方法の使用が含まれる。これらの技術の使用は、単子葉および双子葉の両方の様々な植物細胞で本明細書に記載される本発明の適用を許す。

本明細書で用いるように、用語「形質転換」または「形質導入」は、細胞への１つまたは複数の核酸分子の移動を指す。細胞ゲノムへの核酸分子の組込みまたはエピソーム複製によって核酸分子が細胞によって安定して複製されるようになるとき、細胞は、細胞に形質導入される核酸分子によって「形質転換される」。本明細書で用いるように、用語「形質転換」は、核酸分子をそのような細胞に導入することができる全ての技術を包含する。例には、限定されずに、以下のものが含まれる：ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）；直接ＤＮＡ取込み；および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）。

銃撃形質転換技術で用いるために、核酸構築物は、約０．７μｍの平均粒径を有するタングステン粒子から一般的になる銃撃粒子に吸着させる。金、白金などの、タングステンに類似の密度を有する他の金属からなる粒子も、利用できる。一般的に、１μｇのタングステンにつき、約２〜５μｇのＤＮＡ、通常１μｇのタングステンにつき約２μｇのＤＮＡを吸着させる。粒子へのＤＮＡの吸着の後、例えば超音波処理によって、粒子のいかなる凝集塊も分散させる。金属銃撃粒子の外面にＤＮＡを固定するいかなる方法も許容され、当業者に公知である。（例えば、上記のSanford et al. (1988)および上記のKlein et al.を参照する）。送達のためにＤＮＡは粒子に固着されなければならないが、細胞へのＤＮＡの放出を妨害するような形で固定されてはならない。

形質転換のために、製造業者の指示に従って、発現カセットを吸着させた約１００〜５００μｇ、一般におよそ２００μｇの銃撃粒子を、パーティクルガン（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．およびＤｕＰｏｎｔから入手できるものなど）に充填する。ペトリプレート（直径５ｃｍ）につき一般に１００〜３００μｇの新鮮重量の単離細胞を、例えば細胞を固体表面に接着させるために増殖培地を含むＷｈａｔｍａｎ＃１濾紙を含有するペトリ皿または組織培養皿などの増殖表面に置く。細胞は単細胞層である必要がなく、２、３層の厚さであってもよい。固定化細胞をパーティクルガンの銃撃チャンバーに置き、一般に約０．０７から０．３気圧、好ましくは０．０７気圧の可能な限り高い真空下に置く。次に、銃撃の前に、試料チャンバー内の気圧を約０．０７気圧に低減する。好ましくは、細胞は、パーティクルガンの筒の末端から約１０ｃｍで銃撃される（ＤｕＰｏｎｔ遺伝子銃の第４レベル）。パーティクルガンの発砲機構が作動し、形質転換細胞の数を増加させるために、細胞は１〜３回、一般に２回銃撃される。真空を次に解放し、銃撃された細胞を、好ましくは増殖チャンバー内の光の中の、約２６℃の新鮮な増殖培地に置く。他の微粒子銃装置は、「空飛ぶ円盤」、例えばプラスチック膜から作製されたもの、または、例えばナイロンメッシュ（９４μｍ）（「ヘリウムエントレインメント」方法）で作製されたディスクの使用を含む。

トランスジェニックプラスチド（例えば、葉緑体）を含有する植物は、形質転換プロセスで用いられる宿主細胞が全能性を有する場合に生成することができる。形質転換細胞または組織からのトランスジェニック植物の再生の手順は、当業者の能力の範囲内にある適切な改変形に一般に類似している。サトウダイコン、Freytag et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:30-34；タバコ、Svab et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. (1990) 8526-8530などの双子葉植物またはコムギなどの単子葉植物の、葯または胚からの再生（下を参照する）は、通常良好だった。

他の植物材料、例えば葯培養由来の植物または胚由来のカルスでプラスチドを形質転換することが所望の場合は、植物材料を都合のよい容器、例えば単離細胞について上に記載したようなペトリ皿に置く。（米国特許第６，６８０，４２６号明細書；Hanson et al (2012) Journal of Experimental Botany, 64: 753-768およびGolds et al., (1993) Nature Biotechnology 11, 95-97も参照する）。

プラスチドが形質転換されたことがわかったならば、植物の細胞を組織培養のために、続いて所望の場合カルス組織の増殖または植物再生のために繰り返し用いることができる。したがって、細胞および組織の培養を用いて、改変された植物細胞を繰り返し再生することができる。一部の場合には、種子から適切な繁殖を維持することができる。形質転換細胞を特定する能力を向上させるために、前に示したように、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を採用することを望むことができ、形質転換体を生成するために形質転換ベクターが用いられる。選択マーカーが用いられる場合には、選択剤（複数可）に細胞を曝露させることによって、潜在的形質転換細胞集団の中で形質転換細胞が特定される。スクリーニング可能なマーカーが用いられる場合には、細胞を所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。

選択剤への曝露後に生存する細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性と評価された細胞は、植物の再生を支える培地で培養することができる。一部の実施形態では、任意の適する植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、成長調節剤などのさらなる物質を含ませることによって改変することができる。植物再生のための努力を開始するのに十分な組織が利用できるまで、または反復手動選択の後に、組織の形態が再生のために適するまで（例えば、少なくとも２週間）、組織を成長調節剤含有基本培地で維持し、その後シュート形成を助長する培地に移すことができる。十分なシュート形成が起こるまで、培養は周期的に移される。シュートが形成されると、それらは根形成を助長する培地に移される。十分な根が形成されると、さらなる増殖および成熟のために植物を土に移すことができる。

再生植物でｄｓＲＮＡ分子の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイには、例えば以下のものが含まれる：分子生物検定、例えばサザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲおよび核酸配列決定；植物器官アッセイ、例えば葉または根のアッセイ。

形質転換手法によっては、プラスチド形質転換に関連づけられたマーカーの選択がプラスチドおよび核の両方の形質転換体である細胞の選択ももたらすことができ、結果として葉緑体の外側でこれらの細胞によって生成される植物の殺虫効力に影響を与えるかもしれないｄｓＲＮＡを発現すること、および／またはｓｉＲＮＡを形成することができる細胞を潜在的にもたらすように、形質転換体は、プラスチドおよび核の両方の形質転換体である細胞を含むことができる。この問題点は、プラスチドゲノムでの組込みを可能にするが核ゲノムでは可能にしない相同組換え領域（本明細書で組込み部位とも記載される）を含有する、上記の本発明の好ましい構築物の利用、および葉緑体だけで作動するプロモーターの使用によって対処することができる。これは、プラスチドでｄｓＲＮＡを生成し、プラスチドの外側でｄｓＲＮＡもｓｉＲＮＡも生成しない細胞または植物を選択する選択方法を可能にする。

組込み事象は、例えば、目的の核酸分子またはｄｓＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを例えば用いるＰＣＲ増幅によって分析することができる。ＰＣＲ遺伝子タイピングは、限定されずに、ゲノムに組み込まれた目的の核酸分子を含有すると予測される単離された宿主植物カルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、続くＰＣＲ増幅生成物の標準のクローニングおよび配列分析を含むと理解される。ＰＣＲ遺伝子タイピングの方法はよく記載されており（例えば、Rios, Q. et al. (2002) Plant J. 32:243-53）、細胞培養を含む任意の植物種（例えば、トウモロコシ（Z. mays）またはダイズ（G. max））または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用することができる。

特定の実施形態では、植物細胞で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０またはそれ以上の異なるｄｓＲＮＡ分子が生成される。ｄｓＲＮＡ分子は、異なる形質転換事象で導入される複数の核酸構築物から、または単一の形質転換事象で導入される単一の核酸構築物から発現させることができる。一部の実施形態では、単一のプロモーターの制御下で複数のｄｓＲＮＡ分子が発現される。他の実施形態では、複数のプロモーターの制御下で複数のｄｓＲＮＡ分子が発現される。標的遺伝子配列を有する１つまたは複数の生物体の中の異なる遺伝子座に各々相同的である複数の核酸配列を含む、単一のｄｓＲＮＡ分子を発現させることができる。

核酸構築物による植物の直接的な形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェニック事象を有する第１の植物をそのような事象を欠く第２の植物と交配することによって、トランスジェニック植物を調製することができる。例えば、ｄｓＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を形質転換に適合する第１の植物系に導入してトランスジェニック植物を生成することができ、このトランスジェニック植物を第２の植物系と交配して、ｄｓＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を第２の植物系の遺伝的背景に遺伝子移入することができる。

いくつかの維管束植物のいずれも、上記の方法によって形質転換することができる。

本発明のプラスチドおよび核酸構築物によって生成されるｄｓＲＮＡとして、有害生物の同じか異なる生物学的作用経路を標的にする殺虫性構築物でプラスチドを形質転換することもできる。これらの構築物の例には、上で指摘した殺虫性タンパク質、特にＢ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）殺虫性タンパク質、好ましくはＣｒｙタンパク質をコードするものが含まれる。これらの構築物の関連するコード領域は、本発明の核酸構築物（すなわち、ｄｓＲＮＡを生成するもの）で提供することができるか、またはそれらは別々の構築物中にあってもよい。後者に関して、例えば一実施形態では、プラスチドは、第１の核酸構築物であって、
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− プラスチドでのｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
− 維管束植物のプラスチドゲノムへの構築物の組込みに選択的である１つまたは複数の組込み部位
を含み、ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、第１の核酸構築物；および
さらなる核酸構築物であって、
殺虫性薬剤、好ましくは殺虫性タンパク質をコードするコード領域を含む核酸構築物
を含むことができる。

一実施形態では、プラスチドは２つを超える異なる核酸構築物を有し、それの１つは本明細書に開示される殺虫性ｄｓＲＮＡをコードまたは生成するための核酸構築物である。他の実施形態では、プラスチドは３つを超える、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる構築物を有し、それの少なくとも１つは本明細書に開示される殺虫性ｄｓＲＮＡをコードまたは生成するための核酸である。

Ｄ．植物
維管束植物は管束植物としても、さらに高等植物としても知られる。維管束植物は、植物全体に水および無機物を導くための木化組織（木部）を有する陸生植物である。それらは、光合成生成物を導くための、専門化した非木化組織（師部）も有する。したがって、本発明の植物は、ヒカゲノカズラ、トクサ、シダ類、裸子植物（針葉樹を含む）および被子植物（顕花植物）からなる群、ならびに維管束植物門（Tracheophyta）およびトラケオビオンタ（Tracheobionta）の群からの植物から選択される植物であってもよい。

好ましい実施形態では、植物は、以下からなる群から選択される双子葉植物である：キャノーラ、ワタ、ジャガイモ、キノア、アマランス、ソバ、ベニバナ、ダイズ、サトウダイコン、ヒマワリ、セイヨウアブラナ、タバコ、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、アブラナ属の種（例えば、ナタネ（B. napus）、カブ（B. rapa）、カラシナ（B. juncea）、Ｂ．カリナータ（B. carinata）、クロガラシ（B. nigra）、キャベツ（B. oleracea）、シロガラシ（B. alba）など）、ワタ、アルファルファおよびクローバー。

好ましい実施形態では、植物は、以下からなる群から選択される単子葉植物である：トウモロコシ、イネ、ライムギ、ソルガム、アワ類、コムギ、サトウキビ、カラスムギ、オオムギ、パイナップル、バナナ、ヤシ、観賞植物およびイネ科草本（例えば、ブラキアリア（Brachiaria）、ライグラス（Lolium）およびウシノケグサ）。

したがって、さらなる実施形態では、本発明は、
− 核酸構築物であって、
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
を含み、ｄｓＲＮＡは、そこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、核酸構築物
を含むプラスチドを含有する植物を提供する。

またさらなる実施形態では、本発明は、維管束植物の形質転換のための核酸構築物を含有する植物であって、
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− プラスチドでのｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
− 維管束植物のプラスチドゲノムへの構築物の組込みに選択的である１つまたは複数の組込み部位；
を含み、ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、植物を提供する。

好ましい実施形態では、植物は、核酸構築物によってコードされるｄｓＲＮＡとハイブリダイズするためのｓｉＲＮＡを含有することができない。別の好ましい実施形態では、植物は、核酸構築物によってコードされるｄｓＲＮＡをプラスチド以外のコンパートメントで含有することができない。これらの実施形態では、植物は植物のプラスチドにｄｓＲＮＡを含有することができるが、別のオルガネラ、サイトゾル、核または植物の他の部分の核酸構築物によって生成されるｄｓＲＮＡに由来するかさもなければそれと配列相同性または相補性を有するｓｉＲＮＡを含有しない。

本発明の植物は、核酸構築物によって生成されるｄｓＲＮＡに由来するかさもなければそれと配列相同性または相補性を有するｓｉＲＮＡを一般に含有せず、葉緑体中の核酸構築物によって生成されるｄｓＲＮＡと配列相同性または相補性を有するｄｓＲＮＡも葉緑体の外側に含有しないが、一実施形態では、本発明の植物は、葉緑体中の核酸構築物によって生成されるｄｓＲＮＡと配列相同性も相補性も有しないｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを有することができることが理解されよう。この実施形態では、本発明による植物は、植物の核でのｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの生成または発現を可能にする核形質転換事象をさらに含むことができるが、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが葉緑体中で生成されるｄｓＲＮＡのそれと配列相同性も相補性も有しない場合に限る。１つの例では、遺伝子サイレンシングを提供するように植物をさらに操作し、それによって望ましい農業形質または殺虫特性を形成することができる。後者は、植物による殺虫性化合物の生成をもたらすｓｉＲＮＡの形成から生じることができる。

一実施形態では、植物は、ＲＮＡもしくはタンパク質などの殺虫性薬剤をコードする核酸構築物または殺虫性薬剤それ自体を含有する、葉緑体またはプラスチド以外の細胞性オルガネラを含むことができる。一実施形態では、核または細胞質は、ＲＮＡもしくはタンパク質などの殺虫性薬剤をコードする少なくとも１つの核酸構築物または殺虫性薬剤それ自体、好ましくは３つを超える、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる構築物または構築物によってコードされる遺伝子生成物を含有する。

本発明の植物は、本発明の実施形態の核酸構築物に関して、各細胞の葉緑体の総数の一部だけが形質転換されているヘテロプラスミーであってもよいか、各細胞の葉緑体のほとんどまたは全てが形質転換されているホモプラスミーであってもよい。好ましくは、植物はホモプラスミーである。より好ましくは、植物はＴ１後の世代で、ホモプラスミーである。

本発明の植物は、ＲＮＡｉ経路の機能のために必要とされる遺伝子生成物をコードする遺伝子に、突然変異を含むことができる。そのような遺伝子生成物の１つの例は、ＤＩＣＥＲ様４である。他には、ＤＲＢ４およびそのオルソログが含まれる。これらの植物は、突然変異（例えば、ノックアウトまたは相同組換えからもたらされる突然変異）を含有する植物細胞または栄養組織を提供して、本明細書に記載される本発明の実施形態の核酸構築物でそれらの細胞を形質転換することによって生成することができる。あるいは、本明細書に記載される本発明の実施形態の核酸構築物で形質転換された植物は、ＲＮＡｉ経路の機能のために必要とされる遺伝子生成物をコードする遺伝子の突然変異を有する植物と交配することができる。

本発明の植物は、除草剤、例えばフェノキシオーキシンを含むカルボン酸含有除草剤への耐性をコードする遺伝子を含むこともできる。

一実施形態では、本発明は、本発明による植物、特に、
− 核酸構築物であって、
− 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
− ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター
を含み、ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、核酸構築物
を含むプラスチドを含有する植物に由来するか、さもなければそれから得られる種子、カッティングまたは他の栄養形材料を提供する。

上記の種子は殺虫性ｄｓＲＮＡを含有することができ、上記のコード領域およびプロモーターを含有する核酸構築物を含有することができる。あるいは、種子は殺虫性ｄｓＲＮＡを含有することができず（例えば、種子でプロモーターが活性化されないので）、上記のコード領域およびプロモーターを含有する核酸構築物を単に含有することができ、それはその後、例えば種子が発芽するときおよび／または茎葉を形成するときに、プラスチドまたは葉緑体において活性化されて殺虫性ｄｓＲＮＡを形成することができる。

種子はコーティングされてもよく、１つの形では、種子は、任意の形のサイレンシングＲＮＡ、好ましくはｄｓＲＮＡを含む殺虫性ＲＮＡでコーティングされてもよい。他のコーティングには、当技術分野で公知である殺虫性タンパク質または化学物質を含む他の殺虫剤を含めることができる。

他の実施形態では、上記の実施形態による植物によって生産される商品が提供される。

Ｅ．殺虫性組成物
本発明は、本発明による植物、好ましくは葉緑体または関係するプラスチドで殺虫性ｄｓＲＮＡの生成に関してホモプラスミーである植物に由来する材料の利用にさらに関する。これらの材料は、本発明の植物のプラスチドまたは葉緑体で生成される殺虫性ｄｓＲＮＡに関して、特定のグレード形の純度で提供することができる。

一部の実施形態では、材料は、化学的処理ではなく単純な物理的処理（例えば、細断、切断、磨砕）を受けている加工された植物材料であってもよい。

他の実施形態では、材料は、例えば、材料の１つまたは複数の構成要素を抽出および／または分離および／または保存するための化学的処理を受けていてもよい。

さらに、材料は生細胞培養の形で提供されてもよい。

ある特定の実施形態では、１つまたは複数の適用において、これらの材料は、殺虫性ｄｓＲＮＡで形質転換されていない種子を含む種子のコーティングのための種子コーティングを含む、殺虫性組成物として利用されてもよい。

別の実施形態では、材料は、殺虫性の餌として用いることができる。餌は有害生物を誘引することができるか、または特定の場所への有害生物の進入を阻止することができる。

殺虫性組成物は、種子、植物または作物、または粉末、顆粒、ペレットなどの固形物に噴霧するための噴霧液の形をとることができる。

Ｆ．方法
一実施形態では、有害昆虫を防除する方法であって、前記有害昆虫または前記有害昆虫の環境に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含む植物を提示または提供することを含む方法が提供される。一般的に、植物の葉緑体またはプラスチドに含有されるｄｓＲＮＡは、有害生物または昆虫との接触の後に、好ましくは有害生物または昆虫のＧＩ管と接触した後に、有害生物または昆虫の生物学的機能を阻害する働きをするか、または有害生物または昆虫でＲＮＡｉ経路を起動して、必須の昆虫または有害生物遺伝子の機能への干渉をもたらす働きをする。好ましくは、有害昆虫の防除が必要とされる環境は、作物または植物畑である。

一般的に、有害昆虫の防除は、本発明の核酸またはプラスチドを有する植物を含有しない環境での有害生物集団と比較して有害生物集団の低減をもたらす。

一実施形態では、有害生物の防除は、本発明の核酸構築物またはプラスチドを有する植物を消費していない有害生物集団と比較して、有害昆虫の増殖の阻害または最小化をもたらす。この実施形態では、有害昆虫は、本発明の核酸構築物またはプラスチドを有する植物の消費によって死滅させることができるかまたはできない。この実施形態では、有害昆虫の増殖の阻害または最小化は作物害の最小化をもたらすことができ、収量増をもたらすことができる。

ある特定の実施形態では、本発明の植物およびプラスチドならびにｄｓＲＮＡを含有するそれらは、それらが死を誘導し、および／または増殖率を低減し、および／または繁殖性を低減する限り殺虫性である。

作物または植物畑は、上記プラスチドまたは核酸構築物を含む植物からなってもよく、またはこれらの植物を含み、さらに、上記のプラスチドも核酸構築物も含有しない植物の形の非葉緑体形質転換避難植物を含有してもよい。作物または畑が非葉緑体形質転換避難植物を含有する場合は、好ましくは、作物または畑は、３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満の、非葉緑体形質転換避難植物である植物を含有する。

好ましくは、有害生物の防除は、植物の葉、根、生殖組織または茎葉への害の最小化または低減をもたらす。好ましくは、害の低減は、非形質転換対照で観察される害の少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９５％を超える。したがって、本発明は、作物または植物畑の収量を向上させるための方法であって、好ましくは有害生物または病原体による植物またはその一部の害を低減するために、作物または畑の中の有害生物または病原体に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含む植物を提示することを含む方法を提供する。

別の実施形態では、作物の収量を向上させるための方法であって、
本発明による核酸構築物またはプラスチドを含む植物またはそれからの繁殖材料を提供すること；
植物を栽培して栽培した植物での核酸構築物の発現を可能にすることを含み、核酸生成物の発現、それによるｄｓＲＮＡの形成は、植物の内部または表面の有害生物の生存または増殖を阻害する、方法が提供される。

一実施形態では、トウモロコシの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含むトウモロコシ植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

別の実施形態では、ソルガムの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含むソルガム植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

一実施形態では、ヒマワリの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含むヒマワリ植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

一実施形態では、イネの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含むイネ植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

一実施形態では、コムギの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含むコムギ植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

一実施形態では、ワタの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含むワタ植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

一実施形態では、オオムギの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含むオオムギ植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

一実施形態では、油料種子セイヨウアブラナの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含む油料種子植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

一実施形態では、ダイズの有害昆虫を防除するか、または有害昆虫によって引き起こされる発生もしくは害を阻止するか、または有害昆虫を死滅させる方法であって、前記有害昆虫に、上記のプラスチドまたは核酸構築物を含むダイズ植物を提示することを含む方法が提供される。好ましくは、有害昆虫は下の表から選択される。

本明細書に記載されるプラスチドまたは核酸構築物を含む植物は、昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）戦略で用いることができる。

ＩＲＭ戦略は、一般に形質転換されたものと、形質転換されていないもの（いわゆる「避難（refuge）」植物）とを特定の構造で植えることを含む。これらの構造では、避難植物は、殺虫圧の下になく、したがって、殺虫抵抗性対立遺伝子について選択されそうにない昆虫のための貯蔵所を提供する。これらの昆虫と、殺虫抵抗性対立遺伝子を形成する突然変異について選択された昆虫との畑での交配は、ヘテロ接合体遺伝子型を生み出す可能性がより高く、したがって殺虫抵抗性の発達の可能性、さもなければ抵抗性の発達までの時間を減少させる。ＩＲＭのための例示的な手法は、www.epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htmに示されている。

ＩＲＭ戦略は、昆虫の複数の経路を標的にし、それによって殺虫抵抗性ハプロタイプの継承の可能性をさらに減少させるために、植物への構築物の「スタッキング」によって増強することができる。例えば、Ｒｏｕｓｈらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のために、「ピラミッディング」または「スタッキング」とも呼ばれる２毒素戦略を概説している。（The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786）。具体的には、標的有害生物に対して各々有効であり、交差抵抗性がほとんどまたは全くない２つ以上の類似の（例えば、２つ以上の異なるｄｓＲＮＡ標的）または異なる殺虫活性物質（例えば、ＢｔまたはプラスチドＲＮＡｉ）のスタッキングまたはピラミッディングは、より小さい避難所の使用を可能にする。良好なスタックでは、１０％未満の避難所の避難所サイズが、単一（非ピラミッド化）形質のための約５０％の避難所と同等の抵抗性管理を提供することができることを、Ｒｏｕｓｈは示唆する。今日利用できるピラミッド化Ｂｔトウモロコシ製品については、米国環境保護庁は単一形質製品（一般に２０％）の場合よりもかなり低く（一般に５％）構造化された避難所の非Ｂｔトウモロコシを植えることを要求している。

Ｒｏｕｓｈら（前掲）および米国特許第６，５５１，９６２号明細書によってさらに論じられているように、畑での様々な幾何学的栽植様式（上記のような）および袋入種子混合物を含む、避難所のＩＲＭ効果を提供する様々な方法がある。

上記の百分率または類似した避難所比率は、２つ、３つまたはそれ以上の殺虫活性物質を含有する対象のスタックまたはピラミッドのために用いることができる。単一の標的有害生物に対して３つの作用部位を有する三重スタックについては、１つの目的は、感受性の個体の避難所、例えば５％の避難所を維持することであってもよい。これは、例えば１０エーカーを超える営利耕作地に特にあてはまる。

経時的に致死量が有害生物に有効であることを確実にする抵抗性管理のために、用量が有効性および信頼性に影響を与える。本発明の一実施形態では、標的有害生物に有効なより高い用量をもたらすプラスチドに位置するとき、有効なｄｓＲＮＡの発現はより多い。標的有害生物への用量の有効性を経時的に維持するトランスジェニック植物の生長および発達期間全体において、プラスチド中のｄｓＲＮＡは安定したままである。

本明細書に開示される組成物および方法は、有害生物による害を防除するための他の方法および組成物と組み合わせて一緒に用いることができる。例えば、本明細書に記載される植物、プラスチドおよび核酸構築物は、鞘翅類、鱗翅類および／または半翅類有害生物に対して有効な１つまたは複数の化学薬剤、鞘翅類、鱗翅類および／または半翅類有害生物に対して有効なバイオ農薬、輪作、または本発明のＲＮＡｉ媒介方法およびＲＮＡｉ組成物の特徴と異なる特徴を示す組換え遺伝子技術（例えば、鞘翅類、鱗翅類および／または半翅類有害生物（例えば、Ｂｔ毒素）に有害であるタンパク質の植物中での組換え生成）の追加的使用を含む方法で用いることができる。

文脈が別途定める場合以外は、本明細書で用いるように、用語「含む」ならびにその用語の変異形、例えば「含んでいる」、「含む」および「含まれる」は、さらなる付加物、構成要素、整数またはステップを排除するものではない。

具体的に示されるか含意されない限り、本明細書で用いるように、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は「少なくとも１つ」を表す。

この明細書で開示され、規定される発明は、指摘されるかまたは本文もしくは図面から明白な個々の特徴の２つ以上の全ての選択的組合せに及ぶことが理解されよう。これらの異なる組合せの全ては、本発明の様々な代替態様を構成する。

[実施例１］
核酸構築物
葉緑体形質転換ベクターｐＲ１の構築
葉緑体形質転換構築物は、葉緑体形質転換ベクターｐＰＲＶ３２３Ｃｌｏｘ（元はｐＰＲＶ３１２Ｌ；ＮＣＢＩ受託ＤＱ４８９７１５．１）の誘導体であった（Chakrabarti et al., 2006およびLutz et al., 2007）。このベクターは、タバコ（N. tabacum）葉緑体ゲノムのｔｒｎＩおよびｔｒｎＡ配列により組換えた、タバコ（N. tabacum）の形質転換のために設計された。タバコ（N. tabacum）およびＮ．ベンタミアナ（N. benthamiana）組換え領域は９９．５２％類似しているので（２０７６ｂｐ中のわずか１０個の差）、それは近縁のＮ．ベンタミアナ（N. benthamiana）をうまく形質転換するためにも用いられた（Davarpanah et al., 2009）。ベクターは、上流リボソームＲＮＡプロモーター（ｒｒｎ１６）からのリードスルー発現（目的の配列の）のために、または、ａａｄＡ選択マーカーの上流への完全発現カセットの挿入のために本来設計された。後者の場面が、本実施例で用いられた。

ｐＰＲＶ３２３Ｃｌｏｘは、下記の考案されたアセンブリー計画を妨害しただろう、３’相同組換えアームの５’側に隣接して誤って存在したマッピングされていないＫｐｎＩ制限酵素認識部位を修正するために、「突然変異ＰＣＲ」を用いて先ず改変した。ベクターｐＰＲＶ３２３Ｃｌｏｘ（ｋ−ｆｉｘ）を作製するために、以下に示すように配列を変更し：・・・ＡＴＧ（Ｇ＞Ｃ）（ＴＡＣＣｄｅｌ）ＧＣＴ・・・、ここで、ベクターの元の配列ＡＴＧＧＴＡＣＣＧＣＴは、ＡＴＧＣＧＣＴに改変された。Ａｓｃ Ｉ、ｒｒｎプロモーター（Ｐｒｒｎ）、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）葉緑体ルビスコのより大きなサブユニット遺伝子の転写産物の５’非翻訳領域（ｒｂｃＬ ５’ＵＴＲ）、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）およびｒｂｃＬ ３’ＵＴＲおよびＮｏｔ Ｉ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）をコードする配列を含むように、合成ｄｓＤＮＡ挿入断片を合成した。挿入断片をｐＵＣ５７ベクターで送達し、Ａｓｃ ＩおよびＮｏｔ Ｉで切除し、Ａｓｃ ＩおよびＮｏｔ Ｉで既に消化されていたｐＰＲＶ３２３Ｃｌｏｘ（ｋ−ｆｉｘ）にサブクローニングして、新しいベクターｐＲ１を作製した。

「ゴールデンゲート」ｄｓＲＮＡアセンブリーベクターｐ３２ｃ−ＧＧの構築
大きなｄｓＲＮＡ発現単位は、ｐＲ１に完全単位として移す前に、二次「アセンブリー」ベクターに先ず組み立てた。逆方向反復（別名ヘアピン）アセンブリーに以前に適合させた「ゴールデンゲート」（ＧＧ）方法のさらに改変されたバージョンによって、ｄｓＲＮＡ発現単位を作製した（Yan et al., 2012）。このアセンブリー方法のための構成要素を準備するために、プライマーｇ１８７ｆおよびｇ１８８ｒを用いてＧＧクローニングカセットをその元のベクターｐＲＮＡｉ−ＧＧ（ＮＣＢＩ受託ＪＱ０８５４２７．１；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＲＢＣ）から入手可能、＃ＣＤ３−１７８６）から増幅した（表３を参照する）。ＰＣＲ生成物をＸｈｏ ＩおよびＫｐｎ Ｉ制限酵素で消化し、既に同じように消化されていた二元ベクターｐ３２ｃに挿入した。ｐ３２ｃは、ＣａＭＶ ３５ｓプロモーター（−３４３〜＋１バージョン）および変更されたマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含むように前改変された、ｐＯＲＥ−０３二元ベクターの自家誘導バージョンである。さらに、そのＢｓａＩ部位は引き続いて起こるＧＧヘアピンアセンブリーを妨害しただろうから、配列を・・・ＧＡＧＡＧ（Ｇ＞Ａ）ＡＧ（Ａ＞Ｇ）ＣＣ・・・に示すように変換することによって、ＢｓａＩ ＲＥ認識部位ＧＧＴＣＴＣＮ｜ＮＮＮＮ（本来ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＩＩ、ＰＰＴ、選択マーカー遺伝子に存在する）を除去するために突然変異ＰＣＲによってｐ３２ｃを前改変した。言い換えると、ベクター中の配列ＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣをＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＣに改変した。これらの変化はサイレント突然変異をもたらし、そのため、ヌクレオチド配列は変更されたが、翻訳されたＰＰＴ配列は不変のままだろう。ＧＧ発現ベクターはさもなければ他の大腸菌（E. coli）ラボ株（例えばＤＨ５ａｌｐｈａ）で細菌細胞死を引き起こすｃｄｄＢ遺伝子をコードしているので、生じたＧＧベクターｐ３２ｃ−ＧＧは大腸菌（E. coli）ＤＢ３．１細胞で維持した。

ゴールデンゲート方法を用いたｐ３２ｃ−ＧＧベクターでの大きなｄｓＲＮＡ発現単位アセンブリー
以下の例外を除いては、それらの類似のベクターｐＲＮＡｉ−ＧＧのために元々Ｙａｎらによって記載された方法に従って、数百塩基対までのステム長のヘアピンを一般的にコードする大きなｄｓＲＮＡ発現単位をｐ３２ｃ−ＧＧアセンブリーベクターで作製した（Yan et al., 2012）。ライゲーションは、ＰＥＧ追加ライゲーション緩衝液（例えば、２×急速ライゲーション緩衝液）で２時間実施し、それに応じて総ライゲーション量を増加させ、最終８０℃のインキュベーションを省略し（それはＰＥＧを含むライゲーション緩衝液と相容れない）、ＤＨ５ａｌｐｈａの代わりにＧＴ１１６細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いた（ＤＨ５ａｌｐｈａ細胞は働いたが、ＧＴ１１６細胞と比較して回収されたコロニーが少なかった）。それなしではコロニーがほとんどまたは全く回収されなかったので、ＰＥＧをベースとした緩衝液が不可欠な改変であることがわかった。簡潔には、アセンブリープロセスは以下のステップを含んだ。製造業者のプロトコールに従ってＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてＰＣＲによって標的ステムを増幅し、プライマーは以下のレイアウトを有するように設計した：

フォワードプライマーレイアウト＝ＡＣＣＡ＿ＧＧＴＣＴＣＡ（ＧＧＡＧ）＿ｂｉｎｄ、式中、配列「ＡＣＣＡ」は５’末端の制限酵素結合シートである。（これは、隣接する下流位置で切断を試みるときに配列を「つかむ」ために制限酵素に多少の追加の「購入品」を提供するように終端の５’末端に加えられた、余分の４塩基である）；「＿」は、書き出すときに短縮形の配列において異なる機能単位を分離するための単なる仕切記号であり、実際の配列において物理的表示を有しない；「ＧＧＴＣＴＣＡ（ＧＧＡＧ）」は、Ｂｓａ Ｉ制限酵素（ＲＥ）部位である。ほとんどのＲＥ部位と異なり、それはＧＧＴＣＴＣＡを認識するが、これの外の３’に隣接した４ヌクレオチド（ＮＮＮＮ）で切断する。これらの４つのヌクレオチドは任意の配列であってもよく、この実施例では配列「（ＧＧＡＧ）」が用いられ、前のＢｓａ Ｉ認識配列と一緒に「ブルー」型Ｂｓａ Ｉ配列（例えば、ＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧ）と呼ばれる；「ｂｉｎｄ」は以降のＰＣＲで増幅される特異的標的配列に「バインド」するために各プライマーの３’末端に加える必要があるいかなる特異的配列も表すための、一般的なプレースホールダーであり、すなわち、この配列は標的ごとに異なる（例えば、表３の配列番号３を参照する）。

リバースプライマーレイアウト＝ＡＣＣＡ＿ＧＧＴＣＴＣＡ（ＴＣＧＴ）＿ｂｉｎｄ（例えば、表３の配列番号４を参照する）。

ＰＣＲの後に、反応をカラム精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、３０μｌの溶出緩衝液で溶出した。次に、５０ｎｇの精製ＰＣＲ反応体、２００ｎｇのベクター、５ＵのＢｓａ Ｉ、１０ＵのＴ４リガーゼ、２×急速ＬＩＧ．緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、およびＨ_２Ｏにより２０μｌでＧＧ反応を準備した。ＧＧ反応を、３７℃で２時間＋５０℃で５分間インキュベートした。反応の３μｌを、標準手順によって調製した約５０μｌのＧＴ１１６エレクトロコンピテント細胞混合物にエレクトロポレーションした。形質転換混合物全体を、カナマイシン（ベクターの選択のために）およびクロラムフェニコール（イントロン含有について選択するために）を含む適当な選択培地の上に広げた。一般的に、約５０〜１００代の数のコロニーを回収した。

核ｄｓＲＮＡ発現対照ベクターｖ１５３の構築
ｐ３２ｃ二元ベクターに由来した図１に示す核ｄｓＲＮＡ発現対照ベクターｖ１５３は、対応する葉緑体形質転換ベクターｖ２０６を組み立てる途中の中間体ベクターとして作製した。両ベクターは、ｄｓＲＮＡ発現単位Ｈａ−ＡｃｅＨｐ１２３６−１８９をコードしており、これは、自己相補的１８９ｎｔセンス（ＳＥ）／アンチセンス（ＡＳ）ステム構成を有するように設計され、ステムは約１５９９ｎｔの核／細胞質イントロンベースのスペーサーまたは「ループ」によって分離されている。１８９ｎｔステム配列は、ｎｔ位置１２３６（ＣＤＳの第１のｎｔに対して）から開始して５’方向に全長１８９ｎｔの間続く、鱗翅類のガであるオオタバコガ（Helicoverpa armigera）（Ｈａ；オオタバコガ）からのアセチルコリンエステラーゼ遺伝子（Ａｃｅ；ＮＣＢＩ受託ＡＦ３６９７９３）に相同的であるように選択された。アセンブリーの第１のステップは、既に記載されている方法を用いてベクターｐ３２ｃ−ＧＧでｈｐ１２３６−１８９のｄｓＲＮＡ発現単位を構築することであった。実施例１での特定のアセンブリーのために、オオタバコガ（H. armigera）のｃＤＮＡとプライマーｇ２１６ｆ／ｒおよびｇ２１７ｆ／ｒを用いるＰＣＲによって、Ａｃｅ１２３６−１８９に対応する配列を増幅した。結果として生じたベクターｐ３２ｃ−Ｈａ−ＡｃｅＨｐ１２３６−１８９はｖ１５３と変名され、核ｄｓＲＮＡ発現対照ベクターの役目をした。当業者に通常公知である標準のアグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換方法および選択プロセスを用いて、これをＮ．ベンタミアナ（N. benthamiana）に形質転換させた。ｖ１５３を図１Ａに表すが、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）の核ゲノムへの組込みの後にそれが形成されることが予想されるので、一般的な直線形で示す。このベクターからの予想されるｄｓＲＮＡ生成およびＲＮＡｉ型プロセシングの簡略図を、植物でのこのベクター構築物の組込みまたは発現を判定するための以降のＰＣＲアッセイで用いられたプライマーの概略図とともに示す。

ｄｓＲＮＡ葉緑体形質転換および発現ベクターｖ２０６の構築
上で概説した追加のベクターおよび方法を用いて、図１に示す葉緑体形質転換ベクターｖ２０６をｖ１５３から作製した。ｄｓＲＮＡ発現単位をｐＲ１に移動するドナーとしてｖ１５３を用いて、ｐＲ１−Ｈａ−ＡｃｅＨｐ１２３６−１８９とも呼ばれるｖ２０６をｖ１５３から組み立てた。Ｘｈｏ ＩおよびＫｐｎ ＩでｄｓＲＮＡ発現単位を切除し、Ｓａｌ Ｉ（Ｘｈｏ Ｉに適合する相補末端）およびＫｐｎ Ｉで既に消化済みのｐＲ１にそれをサブクローニングすることによって、この移動を達成した。結果として生じたベクターｖ２０６を、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）の葉緑体ゲノムへのその正確な組込みの後の、周囲の葉緑体ゲノム配列との関連で図１ＣＢに表す。このベクターからの予想されるｄｓＲＮＡ生成およびＲＮＡｉ型プロセシングの簡略図を、このベクターによる以降のＰＣＲアッセイで用いられたプライマーの概略図とともに示す。

ｄｓＲＮＡ葉緑体形質転換および発現ベクターｖ３０１の構築
上で概説した追加のベクターおよび方法を用いて、図１に示す葉緑体形質転換ベクターｖ３０１をｖ２０６から作製した。ＰＤＫイントロン＋ＣＭｒ領域を７９５ｂｐ葉緑体イントロン配列（ａｔｐＦイントロン）および小さい隣接領域で置き換えることによって、ｖ３０１をｖ２０６から組み立てた。プライマーＢＥＮ０００２ＦおよびＢＥＮ０００３Ｒを用いて、ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana benthamiana）から置換配列を増幅した。結果として生じたベクターｖ３０１を、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）の葉緑体ゲノムへのその正確な組込みの後の、周囲の葉緑体ゲノム配列との関連で図１Ｄに表す。このベクターからの予想されるｄｓＲＮＡ生成およびＲＮＡｉ型プロセシングの簡略図を、このベクターによる以降のＰＣＲアッセイで用いられたプライマーの概略図とともに示す。
[実施例２]

宿主細胞および葉緑体の形質転換
Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）組織培養法
最初に少量の種子（約５０μｌ量相当）をＣｌ−ガスで滅菌して、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）植物を組織培養に導入した。１００ｍｌの次亜塩素酸塩（４％有効）に加えた３ｍｌの１Ｎ ＨＣＬのオープンシャーレを有する密封ガラスチャンバー内で約１〜４時間、種子のオープンチューブを新たにガス処理した。３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび５％（ｗ／ｖ）不活性寒天（ＭＳＮ）を含むムラシゲ−スクーグ培地（Murashige et al., 1962）の上に、種子を広げた。１５×６ｃｍポットで植物を維持し、２〜３週おき、または必要に応じて新しい培地に移した。

金マイクロキャリア調製（銃撃のために）
Ｓａｎｆｏｒｄら（Sanford et al., 1993）の方法に従う、微粒子銃ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システムのための製造業者のプロトコールによって、０．６ミクロン金マイクロキャリア（Ｂｉｏｒａｄ）を調製した。簡潔には、３０ｍｇのマイクロキャリアを１．５ｍｌ微量遠心管に計り入れ、１ｍｌの７０％エタノールを加え、混合液を３〜５分の間撹拌した。１５分間金を放置して沈殿させ、その後５秒間、遠心分離した（約２０，０００ｒｃｆまで）。上清は捨てた。１ｍｌの滅菌水を金に加え、１分間撹拌し、１分間沈殿させた。５秒間遠心することによって金をペレットにし、上清を除去した。水洗ステップを合計３回、二回繰り返した。最終ペレットに５００μｌの無菌５０％グリセロールを加えた（調製物は４℃で保存したが、約２週間まで使用可能である）。この量で、１０個の標準調製物が作製された。

金マイクロキャリアのＤＮＡコーティング
銃撃の当日に、金マイクロキャリアをＤＮＡでコーティングした。上で調製したマイクロキャリアを≧５分間撹拌して、金を再懸濁した。各構築物について、沈殿を回避するために撹拌しながら、金懸濁液の５０μｌ（約３ｍｇ）を新しいチューブに取り出した。５μｌのＤＮＡ（理想的には１μｇ／μｌで）、５０μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ_２および２０μｌの０．１Ｍスペルマジンを金の各一定分量に加えた。ＤＮＡ濃度が十分に高くなかったならば、十分な量のＤＮＡ（＞５μｌ）を最高５μｇまで加え、残りの構成成分の量をそれに応じて増量した。各試料を３分の間撹拌し、１０分間（製造業者の定めた１分間より長く）沈殿させ、５秒間遠心分離した。上清を除去し、１４０μｌの７０％エタノールをペレットに加え、再懸濁するまで（約１分）混合液を撹拌した。マイクロキャリアを１分間放置して沈殿させ、さらなる５秒間遠心分離し、上清を捨てた。１４０μｌの１００％エタノールではあったが、このステップを繰り返した。マイクロキャリアの最終ペレットを４８μｌの１００％エタノールに再懸濁させ、銃撃（同じ日）まで氷上で保存した。この量で、葉緑体の形質転換で使用するための＞６「ショット」が作製された。

微粒子銃法を用いた葉緑体の形質転換
微粒子銃ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ機器（Ｂｉｏｒａｄ）を層流キャビネットに移動し、７０％エタノールで綿密に表面滅菌し、製造業者のプロトコールによって準備した。より劣るグレードは機器をブロックすること、および／または試料を汚染することがあるので、推奨に従ってヘリウムは「高グレード」（４．５；＞９９．９９５％純度）であった。阻止スクリーン、マクロキャリアホルダーおよびマクロキャリアディスクを１００％エタノールへの短時間浸漬によって滅菌した後、無菌濾紙を並べたシャーレの上で風乾させた。１１００ｐｓｉ破裂板を７０％イソプロパノールに浸し、湿っている間に（しかし、過度に湿っていない）発砲ノズルに充填した（適する密封のために多少のイソプロパノールが必要である）。各セッションの最初の「ショット」は、ラインから空気を追い出して、それらにＨｅを充填するように、破裂板だけ（すなわち試料なし）によるものであった。各金マイクロキャリア調製物を＞１分間超音波処理し、最初にマクロキャリアホルダーに置いて風乾させた（約１〜５分）マクロキャリアの中央に、１ショットにつき６μｌを均一に撒いた。銃撃は、約２５〜２８インチＨｇの真空圧中で６ｃｍの距離（ノズルから）であった。ＭＳＮプレートの上で、背軸側（底側）を上にして葉を銃撃した。標準の１００×２０ｍｍ培養皿の中央に置いた組織培養植物からの約２〜３ｃｍ^２の単一の葉（またはいくつかのより小さい葉）で、葉を２４時間まで前に調製した。

外植体、カルスおよび小植物の選択（ヘテロプラスミー）
銃撃の後、直ちに２巻きのミクロポアテープ（３Ｍ）でプレートを密封し、約４８〜７２時間暗所に保存した。この後に、各葉を約０．５〜１ｃｍ^２の小さいセグメントに切断し、５００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、２ｍｇ／Ｌ ＢＡＰおよび０．５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡを含有するＭＳＮ選択培地に向軸側を上に（上面を上に）して無菌的に移した（カルスおよびシュート形成を誘導するために）。２〜３週おきに、組織を新鮮な培地に移動した。約２〜４週間後に非形質転換組織は淡黄色になり、約４〜８週以後にカルスが出現し始める。約０．５〜１ｃｍ^３のときに外植体材料からカルスを切り離し、別の培地に移動した。現れ出たシュートをできる限り早期にカルスから切り離し、同じ培地で維持した。シュートが約０．５〜１ｃｍ^２の１〜２葉を出したとき、発根を誘導するために５００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含有する（しかし、ホルモンなしの）ＭＳＮ培地にそれらを移動した。適する発根の後、小植物を土に移動した。

形質転換細胞は、各細胞の葉緑体の総数の一部だけが形質転換されているヘテロプラスミーであってもよいか、各細胞の葉緑体のほとんどか全てが形質転換されているホモプラスミーであってもよい。１回の選択、例えばカルス形成、シュートの形成および分離、ならびに根誘導の後の、銃撃された葉から再生したタバコのシュートは、常にキメラ（ヘテロプラスミー）であると思われる（Maliga et al., 2012およびMaliga et al., 2004）。ホモプラスミー、または少なくとも遺伝子的に安定した植物は、新たに形成されたシュートを繰り返し小さい断片に分け、カルス形成を再誘導することにより、２回以上の連続した選択によって達成されると一般に考えられる。「プラスミー」レベルは、挿入接合部にわたった、適するＰＣＲ反応によって判定することができる。

カルスまたは小植物からのＤＮＡ抽出
約２〜３ｍｍ^３の小部分を取り出すことによって、ＤＮＡ抽出のために個々のカルスから試料を採取した。ＤＮＡ抽出を予定していた新生の小植物は、抽出のために単一の葉を収集する前に、各々約０．５〜１ｃｍ^２の少なくとも２枚の葉を有する段階まで増殖させた。ＤＮＡ抽出は、基本的な「塩析」方法で実施した。各組織試料を、無菌の小さいステンレス鋼球および約１８０〜２００μｌのＤＮＡ抽出緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌおよび１％ＳＤＳ）を含む２００μｌのＰＣＲストリップチューブ中に置いた。約３０回転／秒で約２分間、チューブをミキサー−ミル内で激しく振盪した。反転し、ひっくり返すことによって試料プレートを再設定し、プレートを再び振盪した。プレート遠心機を用いて３８００ｒｐｍで１時間、チューブを遠心分離した。上清の１００μｌを、２００μｌの１００％エタノールを含む新鮮なプレートに移した。前の通り、試料プレートを再遠心分離した。試料プレートを確実に逆にすることによって、上清を捨てた。試料プレートを逆さにして約３００ｒｐｍで約２０秒間、遠心分離した。２００μｌの７０％エタノールを各ウェルに加え（迅速な洗浄）、試料プレートを確実に逆にすることによって上清を再び捨てた。試料プレートを逆さにして約３００ｒｐｍで約２０秒間、再び遠心分離した。試料プレートを室温で約２０分間風乾させ、ペレットを１００μｌのＴ．Ｅ．緩衝液に再懸濁して４℃で保存した。

葉緑体の系の生成
ｖ２０６葉緑体形質転換を用いて、９つのＮ．ベンタミアナ（N. benthamiana）植物系を生成した（試料＃１〜９）。選択された各系は、独立した形質転換事象からのものであった。各系はスペクチノマイシン耐性であって、葉緑体ゲノムへのｖ２０６の組込みはＰＣＲによって確認した。非形質転換Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）は、負または非形質転換対照（試料＃２４）として維持し、ｖ１５３の核形質転換系を前の指示通りに作製し、正の核形質転換対照（試料＃１７）として維持した。
[実施例３]

ＲＴ−ＰＣＲを用いた導入遺伝子発現の確認
ＲＮＡ抽出およびＤＮアーゼ処理
製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出のための組織は、ＤＮＡ抽出のために前に記載したものと同じように収集した。組織を急速凍結し、液体Ｎ_２中で乳鉢および乳棒により磨砕した。微粉末組織の約０．５〜１ｍｌ相当量に、およそ１．５ｍｌのＴｒｉｚｏｌを加えた。標準方法の全ての他の量は、それに（用いた１．５ｍｌのＴｒｉｚｏｌに）応じて調整した。初期ホモジネート（ホモジナイゼーション直後）が約４℃で１０分間、１２，０００×ｇで遠心分離される、任意選択の分離ステップが含まれた。ペレットを捨て、透明になったホモジネートはプロトコールに従ってさらに処理した。約３０〜５０μｌのＲＮアーゼフリーの水（例えば、ＤＥＰＣ処理）に、各試料を再懸濁した。抽出の後、以降の逆転写試験で偽陽性増幅の可能性を低減するために、製造業者のプロトコール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に従ってＲＮＡ試料をＤＮアーゼ処理した。簡潔には、８μｌのＲＮＡ試料を、１μｌのＤＮアーゼ緩衝液および１μｌのＲＱ１ ＤＮアーゼ酵素（ＮＥＢ）と合わせた。３７℃で約３０分間、反応をインキュベートし、その時点で、１μｌの停止溶液を加え、混合液を６５℃で約１０分間さらにインキュベートしてＤＮアーゼを完全に不活性化した。

ＲＴ−ＰＣＲ
長いｄｓＲＮＡ種の存在について試験するために、各試料を逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）にかけた。用いたＲＴ−ＰＣＲは、単一のｃＤＮＡ合成ステップを先ず実行し、続いて異なるＲＮＡ種のために別個のＰＣＲ反応を実行した、２ステップＲＴ−ＰＣＲであった。各ｃＤＮＡ合成反応は、製造業者のプロトコールに従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実行した。特定のユーザーが含めた構成成分は、５μｌの混合プライマー（各々１μｌのｇ２８０ｒ、ｇ２７６ｒ、ｇ２１６ｆ／ｒ、ｇ３０１ｒおよびオリゴｄＴ）、１μｌのｄＮＴＰおよび７μｌのＤＮアーゼ処理ＲＮＡ試料であり、合計１３μｌのユーザー投入量であった。ｃＤＮＡ合成の後、各試料の１μｌを、標準の２０μｌ ＰＣＲ反応で鋳型として用いた。ＰＣＲは、試料ｖ２０６葉緑体試料＃１〜９、ｖ１５３核対照＃１７および非形質転換Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）対照＃２４で実行した。各試料は、以下の２つの異なる鋳型条件を用いて３つの異なるプライマーセットで増幅した：１）鋳型としてｃＤＮＡ合成前の抽出されたＲＮＡ（試料中のＤＮＡ汚染の可能性について試験するため）、および２）対応するｃＤＮＡ試料セット。最初のＰＣＲプライマーセットは、ＡＳステムの両方のイントロンループを含有する大きなＲＮＡ種の存在について試験するために、イントロンおよび後部ステムの接合部越しに増幅するように設計した（プライマーｇ２５ｆおよびｇ２１６ｆ／ｒ）。ループ配列とは無関係に完全長ＳＥまたはＡＳステムの存在について試験するために、第２のセットはｄｓＲＮＡステム領域に対して内的であったがステムの末端で結合していた（プライマーｇ２１６ｆ／ｒおよびｇ２１７ｆ／ｒ）。第３のセットは、ｅＩＦ４Ｅのための遍在するハウスキーピング配列の存在について試験するための対照反応であった（プライマーｇ１６５ｆおよびｇ１６６ｒ）。

図２に示すように、全ての９つの葉緑体ｃＤＮＡ試料はイントロンから後部ステムＰＣＲに陽性であって、少なくとも両部分を含有するＲＮＡ種の発現を確認した（図２ＡおよびＢ）。イントロンからＡＳステム部分はＳＥステムの下流にあるので、この結果は完全長ｄｓＲＮＡ形成領域の存在を示す。ｖ１５３核発現対照ベクターで形質転換したＮ．ベンタミアナ（N. benthamiana）からのｃＤＮＡを含有するＰＣＲ反応から、アンプリコンはなかった。植物での転写の間かまたは直後に、イントロンがＲＮＡから効率的にスプライスアウトされるならば、これは予想されるだろう。対照の、非形質転換Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）からのｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応から、アンプリコンはなかった。Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）はＨａ−ＡｃｅＨｐ１２３６−１８９ ｄｓＲＮＡ配列を発現しないので、これも予想通りだった。「非ＲＴ」ＰＣＲ反応（すなわち、ｃＤＮＡ合成の前にＲＮＡだけが鋳型として用いられた反応）は、アンプリコンを示さず、ｃＤＮＡ試料セットで見られる特異的生成物の形成に影響するＤＮＡ汚染の検出可能なレベルがなかったことを確認した。

全ての９つの葉緑体ｃＤＮＡ試料は、ステム領域（図２ＣおよびＤ）に特異的なｄｓＲＮＡ／ｈｐ ＰＣＲにも陽性であって、少なくともＳＥおよび／またはＡＳステムが各試料で完全に存在することをさらに確認した。葉緑体形質転換試料ｖ２０６＃８は非ＲＴ対照反応で少量の生成物を示したが、これは、対応するｃＤＮＡ反応で見られるものより大幅に少なかった。植物での転写直後に核発現ｄｓＲＮＡ領域／ヘアピンが約１９〜２４ｂｐのより小さいｓｉＲＮＡサイズの種に効率的にプロセシングされ、そうすることで、発現される長いｄｓＲＮＡの量を検出可能なレベル未満に低減するならば予想されたように、ｖ１５３核発現対照からのｃＤＮＡを含有するＰＣＲ反応から、アンプリコンはなかった。予想通り、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）非形質転換対照からのｃＤＮＡを含有するＰＣＲ反応から、アンプリコンはなかった。

葉緑体ｃＤＮＡ試料および２つの対照ｃＤＮＡ試料は、ｅＩＦ４Ｅハウスキーピング配列に関して全て陽性であった（図２ＥおよびＦ）。この結果は、全てのｃＤＮＡ試料がＰＣＲに適する鋳型であることを確認し、したがって予想通り、ｖ１５３試料はＲＮＡｉ経路によって効率的にプロセシングされる可能性がかなり高いので検出可能な長いｄｓＲＮＡを有しないとの解釈を裏づけた。「非ＲＴ」対照反応はいずれの試料でも検出可能な生成物を有さず、試料が有意なＤＮＡ汚染を含まないことをさらに示した。
[実施例４]

ノーザンブロッティングを用いた葉緑体形質転換体および対照でのｄｓＲＮＡの数量化
対応する核発現対照試料（および非形質転換対照）と比較した、葉緑体形質転換試料に存在する大きなｄｓＲＮＡの相対量を検出し、数量化するために、葉緑体形質転換試料を高分子量（ＭＷ）または「大ＲＮＡ」ノーザンブロット分析にさらにかけた。各試料をＲＮアーゼフリーの水ではなくホルムアミドに再懸濁したこと以外は前に記載した方法に従って、試料＃１〜９、１７および２４の各々のためにＲＮＡ抽出を再準備した。（追加のＲＮＡ抽出のためには不十分な材料が残されていたので、試料＃６はこの例のセットで省略された。）１レーンあたり各試料のおよそ１０μｌ＋ホルムアミドＲＮＡ負荷色素の６μｌ（４μｌの試料だけが入手できた試料７を除いて）を１．４％ＴＢＥアガロースゲルに加え、２つのより低い色素前線が十分に分離するまで１００Ｖで動かした。相対負荷量を測定するために、ゲルを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色して、可視化した（図３Ａ）。ゲルを一晩キャピラリーでＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、試料を膜にＵＶ架橋させた。膜を前ハイブリダイズさせ、６５℃でＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂでハイブリダイズさせた。プローブは、逆挿入ＨａＡｃｅ１２３６ ｐＧＥＭベクター（ｖ１５８）からの部分長ＳＥ鎖ＵＴＰｐ３２リボプローブランオフＳＰ６であった。換言すると、プローブは、標的配列のアンチセンス、またはｄｓＲＮＡのＡＳステムを検出するためのものであった。プローブ長は５３８ｎｔであって、約３５７ｎｔはＨａＡｃｅに相同的で、葉緑体および核形質転換植物に組み込まれた標的の全１８９ｎｔにわたっていた。膜は、１時間曝露させた。

図３Ｂでわかるように、葉緑体形質転換試料の多くは、ＲＮＡｉ型の機構によってプロセシングされないままであったときにＨａＡｃｅ１２３６−１８９ ｄｓＲＮＡ配列で予想されるものにサイズが対応する特異的高分子量ＲＮＡを多量に保有していた。対応する核発現対照試料＃１７は、プロセシングされていない長いｄｓＲＮＡの証拠を示さず、バックグラウンドシグナルレベルは非形質転換対照に類似していた。ＲＮＡ量はＩｍａｇｅＪを用いて数量化し、負荷量に標準化した（ＥｔＢｒ画像を用いた）。相対発現レベルは、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）非形質転換対照（１と設定）と比較したバンド強度の標準化変化倍率として計算した。図３Ｃでわかるように、全てのｖ２０６葉緑体試料は、特異的ｄｓＲＮＡの検出可能な量を有した。系の間に多少の変動があったが、それは各系の独立した性質を考慮すると予想外でなかった。この実施例での多くの独立した系、特に１、２、４、５、８および９は、かなり高いレベルのｄｓＲＮＡ生成および蓄積を示した。標準化したとき、ｖ１５３核発現対照試料はｄｓＲＮＡの検出可能な量を保持しなかったことが明らかで、以前のＲＴ−ＰＣＲデータと同様の結果であった。
[実施例５]

ノーザンブロッティングを用いた葉緑体形質転換体および対照でのｓｉＲＮＡの数量化
試料中のｄｓＲＮＡをＲＮＡｉ型のプロセシング機構に曝露させたならば存在することが予想されるだろうｓｉＲＮＡサイズのプロセシングされた生成物の相対量を検出して数量化するために、葉緑体形質転換試料を低分子量（ＭＷ）または「小ＲＮＡ」ノーザン分析にさらにかけた。実施例４で用いたのと同じＲＮＡ抽出物を用いた（不十分な材料しか残っていなかったので、試料＃６および７はこの例のセットで省略された。）。１レーンにつきおよそ２５μｌの各試料＋２５μｌのホルムアミドＲＮＡ負荷色素を、１７％ＰＡＧＥゲルに加えた。これは、約１８〜４２μｇの負荷量の推定範囲になった。負荷前に、１５０Ｖ／４０分でＰＡＧＥゲルを予備的に流した。負荷すると、１５０Ｖ／約３０分＋２００Ｖ／約４〜５時間でゲルを流した（色素前線が十分に移動するまで）。相対負荷量を測定するために、ゲルを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色して、可視化した（図４Ａ）。ゲルをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に４５Ｖ／６０分で電気的に移し、試料を膜にＵＶ架橋させた。膜を前ハイブリダイズさせ、４２℃でＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂでハイブリダイズさせた。約５０ｎｔ断片に分割するために標準の方法によってさらに「炭酸化」したこと以外は、前に記載したのと同じようにプローブを調製した。膜を１時間および６０時間曝露させたが、２つの時点の間で検出限界の差はなかった（１時間の時点をここに示す）。

図４Ｂは、葉緑体形質転換試料のいずれもプローブに特異的である小さいＲＮＡ種のいかなる徴候も示さなかったことを示す。しかし、ｖ１５３核発現対照試料（＃１７）は、約１９〜２４ｎｔの予想サイズ範囲に対応する強力で明らかな生成物を示した。予想通り、非形質転換Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）対照は、小さいＲＮＡサイズ範囲内で特異的結合を示さなかった。ＲＮＡ量はＩｍａｇｅＪを用いて数量化し、図４Ｃ、負荷量に標準化した（ＥｔＢｒ画像を用いた）。相対発現レベルは、Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）非形質転換対照（１と設定）と比較したバンド強度の標準化変化倍率として計算した。数量化は、ノーザン像の解釈が、葉緑体試料は小さいＲＮＡ種が生成されることの証拠を示さないが、ｖ１５３核発現対照試料は高レベルの小ＲＮＡを保有することを示すことをさらに確認する。
[実施例６]

作物種の葉緑体形質転換
実質的に本明細書および米国特許出願公開第２００８０２８９０６３号明細書に一般に記載される通りに、トウモロコシを形質転換する。本明細書およびVerma and Danielle (2007) Plant Physiol. 145(4): 1129-1143に一般に記載される通りに、タバコ、ニンジン、ワタ、ダイズおよび食用の葉菜作物（例えばレタス）の形質転換を実行する。Maliga (2014) Chloroplast Biotechnology, Humana Pressで見出されるプロトコールに従って、イネ、コムギ、ソルガム、ヒマワリ、キャノーラ、サトウダイコンおよびオオムギを形質転換することができる。植物形質転換の分野の当業者は、作物種に基づいてプロトコールに改変を加えることができる。
[実施例７_ａ]

殺虫活性
トランスジェニックおよび野生型ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana benthamiana）の苗の上の新生子オオタバコガ（Helicoverpa armigera）幼虫で実行したバイオアッセイにおいて、ｄｓＲＮＡを発現する葉緑体を有するトランスプラストーム植物を殺虫活性について試験した。Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ幼虫を、人工食餌の卵（民間の昆虫飼育場によって維持されたコロニーから得た；ＡｇＢｉＴｅｃｈ、Ｔｏｏｗｏｏｍｂａ、ＱＬＤ）から孵化させ、孵化の数時間以内に、個々の幼虫を湿らせたラクダヘアブラシで拾い上げて、プラスチックペトリ皿中の洗浄した６日苗の上に置く（２０個体／ペトリ皿）。幼虫加害苗を含有するペトリ皿を、次にガス交換を可能にするふたで密封した。ペトリ皿を制御環境条件（２８℃、約６０％相対湿度、１６：８［明：暗］）の下に４日間置き、その後生存幼虫の重量を記録した（図５Ａ）。４日間の給餌期間中、適当な遺伝子型の新鮮な苗を毎日ペトリ皿に加えた。ｖ２０６で形質転換させた全４つの独立した系（葉緑体でｈｐＲＮＡを発現する）では、野生型Ｎ．ベンタミアナ（N. benthamiana）苗で飼育したものと比較して、幼虫は成長速度が有意に低減した（ｐ＜０．００５ ｎ＝７〜１３）ことをこのデータは示す。ｖ１５３で形質転換した２つの系（核／細胞質でｈｐＲＮＡを発現する）で飼育した幼虫の成長速度は、ｗｔで飼育したものに対して有意差がなかった（ｐ＞０．９；ｎ＝４〜７）。
[実施例７_ｂ]

殺虫活性
殺虫活性は、限定されずに下記のものを含む、当業者に公知である様々なバイオアッセイによって測定することができる。鱗翅類の有害昆虫には、限定されずに以下のものが含まれる：ヘリコベルパ属の種（Helicoverpa sp.）、アグロミザ・パルビコルニス（Agromyza parvicornis）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、ダイアトレア属の種（Diatraea sp.）、エラスモパルプス・リグノセルス（Elasmopalpus lignosellus）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、スポドプテラ属の種（Spodoptera sp.）、パパイペマ・ネブリス（Papaipema nebris）、ヘリオチス属の種（Heliothis sp.）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、コナガ（Plutella xylostella）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）、プセウドプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、アンティカルシア・ゲンマタリス（Anticarsia gemmatalis）、コリアス・エウリテメ（Colias eurytheme）、アコロイア・グリセラ（Achoroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、リンゴコカクモンハマキ（Adoxophyes orana）、アラバマ・アルギラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アミエロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンテラエア・ペルニイ（Antheraea pernyi）、アルチプス属の種（Archips sp.）、アルギロタエニア属の種（Argyrotaenia sp.）、アテティス・ミンダラ（Athetis mindara）、カイコガ（Bombyx mori）、ブクラトリクス・スルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、スジマダラメイガ（Cadra cautella）、コリストネウラ属の種（Choristoneura sp.）、コキルス・ホスペス（Cochylls hospes）、ガイマイツヅリガ（Corcyra cephalonica）、シディア・ラティフェレアヌス（Cydia latiferreanus）、シディア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテゲリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリクス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フェネラリス（Desmia feneralis）、ディアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ディアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、エンノモス・スブシグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフティニ（Eoreuma loftini）、エスフェスティア・エルテラ（Esphestia elutella）、エラニス・ティラリア（Erannis tilaria）、エスティグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、エウリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、エウポコエリア・アンビグエラ（Eupocoellia ambiguella）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）、エウプロクティス・クリソレア（Euproctis chrysorrhoea）、エウキソア・メソリア（Euxoa messoria）、ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘミレウカ・オリビエ（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）、ヒファンティア・クネア（Hyphantia cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ラムディナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ラムディナ・フィセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ヤナギドクガ（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロキソステゲ・スティクティカリス（Loxostege sticticalis）、マイマイガ（Lymantria dispar）、マカラ・チリサリス（Macalla thyrisalis）、マラコソマ属の種（Malacosoma sp.）、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、マンヅカ・キンケマクラタ（Manduca quinquemaculata）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、オペロフテラ・ブルマタ（Operophtera brumata）、オルギア属の種（Orgyia sp.）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピリオ・クレスホンテス（Papilio cresphontes）、フリガニディア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、モンシロチョウ（Pieris rapae）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スツルタナ（Platynota stultana）、プラチプティリア・カルヅイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、ノシメマダラメイガ（Plodia interpunctella）、ポンティア・プロトディス（Pontia protodice）、プセウダレティア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、バクガ（Sitotroga cerealella）、リンゴシロヒメハマキ（Spilonta ocellana）、タウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、エンソラ・ビスセリエラ（Ensola bisselliella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia hi）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアイルス（Xylomyges curiails）およびイポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）。

人工昆虫食の新生子鱗翅類幼虫で実行したバイオアッセイにおいて、ｄｓＲＮＡを発現する葉緑体を有するトランスプラストーム植物を殺虫活性について試験する。民間の昆虫飼育場（Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ＰＡ）によって維持されたコロニーから得られる卵から、鱗翅類の幼虫を孵化させる。

これらのバイオアッセイは、昆虫バイオアッセイのために特に設計された１２８ウェルプラスチックトレイ（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）で行う。各ウェルは、多種鱗翅類食（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ、ＡＲ）を含有する。トランスプラストーム事象からの細断した植物材料を、食餌に組み込む。

孵化から数時間以内に、個々の幼虫を湿ったラクダヘアブラシで拾い上げ、１ウェルにつき１匹の幼虫を処理食餌の上に置く。次に、寄生させたウェルを、ガス交換をさせるためにベントのついた透明プラスチックの粘着シート（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）で密封する。バイオアッセイトレイを制御環境条件（２８℃、約６０％相対湿度、１６：８［明：暗］）の下に５日間置き、その後に、各試料に曝露させた昆虫の総数、死んだ昆虫の数および生存昆虫の重量を記録する。死亡率パーセントおよび成長阻害パーセントを、各処理について計算する。成長阻害（ＧＩ）は以下の通りに計算する：
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
式中、ＴＷＩＴは、処理での昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＴは、処理での昆虫の総数であり、
ＴＷＩＢＣは、バックグラウンドチェック（緩衝液対照）での昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＢＣは、バックグラウンドチェック（緩衝液対照）での昆虫の総数である。

ＧＩ_５０（成長阻害）は、試験昆虫の平均成長（例えば、生重量）がバックグラウンドチェック試料で見られる平均値の５０％である投薬量と規定される。ＪＭＰ（商標）ソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて、統計分析を行う。ＬＣ_５０（致死濃度）は、試験昆虫の５０％が死滅する投薬量と規定される。

一部の種については、バイオアッセイは３２ウェル試験トレイで実行される。およそ５ｍＬの２％素寒天溶液を各ウェルに加え、寒天を完全に凝固させる。

植物はおよそ３週間経たものであり、Ｔ１世代で試験する。３反復のＴ１葉材料を完成する。１枚の葉を切断し（２．５４ｃｍ×１．２７ｃｍの長方形）、トレイの単一のウェルに置く。各ウェルに、１０匹の個々の昆虫幼虫を寄生させる。

寄生させたウェルを、ガス交換をさせるためにベントのついた透明プラスチックの粘着シート（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）で密封する。トレイをｃｏｎｖｉｒｏｎインキュベーターに置き、３日間２８℃に維持し（１６：８時間 明：暗、６０％Ｒｈ）、その後、各葉片への害の合計量（０、５、１０、１５、２５、５０、７５％の害など、最高１００％）を記録する。
[実施例８]

トランスジェニック植物のバイオアッセイ。
トランスプラストーム植物細胞で生成されるｄｓＲＮＡの生物活性は、当業者に公知である方法によって実証される（例えば、Huang et al., 2006 Econ. Entomol. 99: 194-202を参照する）。有効性は、ｄｓＲＮＡを生成する植物に由来する様々な植物組織または組織片を、制御された給餌環境中の標的昆虫に給餌することによって実証することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡを生成する植物に由来する様々な植物組織からｄｓＲＮＡ抽出物を調製し、本明細書で前に記載した人工食バイオアッセイに組み込むことができる。そのような給餌アッセイの結果は、ｄｓＲＮＡを生成しない宿主植物からの適当な対照組織を採用する、同じように実行したバイオアッセイと、または他の対照試料と比較するべきであることを理解すべきである。

植物において構築物からもたらされる様々な事象の生物学的活性を、鱗翅類昆虫の摂食活動によって引き起こされる葉への害の阻止について試験する。

Ｖ５（トウモロコシの場合）Ｔ_０トランスジェニック植物のＶ３またはＶ４葉から、１．０×０．５インチの四角葉片を２反復でとる。各試験のために、葉端での相互汚染を防止するために先ず野生型植物葉組織を採取し、続いて形質転換植物から採取する。各バイオアッセイトレイウェル（３２ウェルトレイおよびふた、ＣＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）で、１枚の葉片を２％素寒天（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）に置き、これを昆虫種、事象および構築物につき２回繰り返す。各ウェルに１０匹の鱗翅類新生子を寄生させ、空気交換を可能にするプラスチック製の有孔ふたで密封する。トレイを２８℃に置き（１６：８時間の明：暗、４０％Ｒｈ）、３日後に、それらを葉の害のパーセントについてグレード分けする。ＪＭＰ（商標）Ｐｒｏ９．０．１（２０１０ ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いることによって、葉の害のパーセントデータはＡＮＯＶＡで、分散が均一であるときには平均分離をチューキー−クレイマー検定で分析する。

Claims (26)

1. 維管束植物のプラスチドであって、
   − 以下を含む核酸構築物：
   − 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
   − 前記ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、前記プラスチドで作動可能なプロモーター
   を含み、前記ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、プラスチド。
2. そこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有するｄｓＲＮＡをさらに含み、前記ｄｓＲＮＡは前記コード領域によってコードされる、請求項１に記載のプラスチド。
3. 前記コード領域が、前記植物のゲノムで見出されないヌクレオチド配列を有する、請求項１または２に記載のプラスチド。
4. 前記コード領域が前記植物の有害生物または病原体のヌクレオチド配列を有する、請求項３に記載のプラスチド。
5. ｓｉＲＮＡ分子が前記プラスチドの中に形成されない、請求項１に記載のプラスチド。
6. 前記ｄｓＲＮＡが前記コード領域によってコードされるヌクレオチド配列の実質的に全てを含有する、請求項１に記載のプラスチド。
7. 前記ｄｓＲＮＡが前記プラスチドによる編集、スプライシングまたはキャップ形成を受けている、請求項６に記載のプラスチド。
8. 少なくとも１つの殺虫性薬剤をコードする少なくとも１つのさらなるコード領域をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスチド。
9. 前記殺虫性薬剤が殺虫性ポリペプチドである、請求項８に記載のプラスチド。
10. 維管束植物の形質転換のための核酸構築物であって、
    − 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をコードするコード領域；
    − 前記ｄｓＲＮＡ分子の生成を可能にする、プラスチドで作動可能なプロモーター；
    − 維管束植物のプラスチドゲノムへの前記構築物の組込みに選択的である１つまたは複数の組込み部位
    を含み、前記ｄｓＲＮＡはそこからのｓｉＲＮＡの生成を可能にする配列を有する、核酸構築物。
11. 前記コード領域が、前記植物のゲノムで見出されないヌクレオチド配列を有する、請求項１０に記載の構築物。
12. 前記コード領域が前記植物の有害生物または病原体のヌクレオチド配列を有する、請求項１０に記載の構築物。
13. 少なくとも１つの殺虫性薬剤をコードする少なくとも１つのさらなるコード領域を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の構築物。
14. 前記殺虫性薬剤が殺虫性ポリペプチドである、請求項１３に記載の構築物。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプラスチドまたは構築物を含有する植物。
16. 前記植物が請求項１のプラスチドに関して実質的にホモプラスミーである、請求項１５に記載の植物。
17. − 殺虫性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのさらなる核酸構築物；および／または
    − 殺虫性ＲＮＡをコードする少なくとも１つのさらなる核酸構築物
    をさらに含む、請求項１５または１６に記載の植物。
18. 前記少なくとも１つのさらなる核酸構築物が前記植物の細胞の核に位置する、請求項１７に記載の植物。
19. 請求項１８の植物に由来する繁殖材料。
20. 維管束植物の細胞においてｄｓＲＮＡを蓄積する方法であって、
    − 維管束植物のプラスチドを請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸構築物で形質転換することと；
    − 前記プラスチドにおける前記核酸構築物からのｄｓＲＮＡの生成のための条件を前記細胞に提供することと
    を含む方法。
21. 前記ｄｓＲＮＡ分子が前記植物細胞の葉緑体のゲノムに安定して組み込まれる、請求項２０に記載の方法。
22. 前記核酸構築物が選択マーカーを含む、請求項２０に記載の方法。
23. 前記核酸構築物の前記選択マーカーを使用して、ｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸構築物に関して実質的にホモプラスミーである植物細胞または植物について選択することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
24. 有害昆虫を防除する方法であって、前記有害昆虫または前記有害昆虫の環境に、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のプラスチドまたは核酸構築物を含む植物を提示することを含む方法。
25. 有害昆虫の防除が必要とされる前記環境が、植物の作物または畑である、請求項２４に記載の方法。
26. − 請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプラスチドもしくは核酸構築物を含む植物；または
    − 請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプラスチドもしくは核酸構築物を含む植物、および、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプラスチドも核酸構築物も含まない植物の形の非葉緑体形質転換避難植物
    を含む作物または畑。