JP2019094304A - オートファジー誘導剤 - Google Patents

Abstract

【課題】新たなオートファジー誘導剤及びパーキンソン病予防治療剤の提供。
【解決手段】メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー誘導剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、オートファジー誘導剤及びパーキンソン病予防治療剤に関する。

パーキンソン病（以下ＰＤ）は我が国で２番目に多い神経変性疾患で、進行性の運動障害に加え、非運動症状（認知機能低下、精神症状、自律神経症状）などが経年的に進行し、発症１５−２０年後には寝たきりとなるため、多大な医療・介護負担のため深刻な社会的資産の毀損を招来する。本疾患の根本治療を実現するためには、早期発見・早期治療介入が重要と考えられるが、運動症状が出現する時点で、すでに３０％以上の黒質神経細胞脱落を認め、発症５−１０年後には７０％程度の黒質神経細胞が脱落するため、発症前または発症超早期から５−１０年程度の中長期的な治療介入を行い、発症予防・進行抑制を図るような根本的治療が必要と考えられる。

ＰＤ発症メカニズムとして１９９７年頃より家族性ＰＤ原因遺伝子産物機能の解析が精力的に進められ、２０１６年１１月迄に同定された責任遺伝子２０の中で８個が、また孤発性ＰＤリスク遺伝子産物機能についてもその約５０％が広義のオートファジー・リソソーム系に関与するとされている。オートファジーとは、細胞内の粗面小胞体・ミトコンドリアコンタクトサイトから生じた隔離膜が基質を取り囲み、オートファゴソームとよばれる２重膜構造を形成し、リソソーム（内部に水解酵素を含む）と融合し、１重膜構造のオートリソソームとなり、内部基質が分解される一連の流れを指す。基質の一つとして、パーキンソン病等における神経変性の原因とされるα−シヌクレインが含まれることからオートファジー促進によるＰＤ治療薬開発には一定の期待が寄せられている（非特許文献１）。

J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 83, 430-436, doi: 10.1136/jnnp-2011-301205(2012)

本発明の課題は、新たなオートファジー誘導剤及びオートファジー誘導によるＰＤ予防治療剤を提供することにある。

そこで本発明者は、既に医薬として用いられている成分（５５７種）の中からオートファジー誘導効果を有し、パーキンソン病の予防治療に有効な成分を見出すべく検討した結果、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用に基づきアルツハイマー病の認知症状の進行抑制に用いられているメマンチン及び抗ヒスタミン剤として用いられているクレマスチンが優れたオートファジー誘導作用及びパーキンソン病予防治療作用を有することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔８〕を提供するものである。

〔１〕メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー誘導剤。
〔２〕メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするパーキンソン病予防治療剤。
〔３〕オートファジー誘導剤製造のための、メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分の使用。
〔４〕パーキンソン病予防治療剤製造のための、メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分の使用。
〔５〕オートファジー誘導に使用するための、メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる化合物。
〔６〕パーキンソン病の予防治療に使用するための、メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる化合物。
〔７〕メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分の有効量を投与することを特徴とするオートファジー誘導方法。
〔８〕メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分の有効量を投与することを特徴とするパーキンソン病予防治療方法。

本発明によれば、既に臨床で使用されている安全性が確立した成分を投与することにより、オートファジーが誘導され、パーキンソン病に深く関与しているパーキンソン病患者由来のドパミン神経細胞におけるオートファジーも強く誘導し、パーキンソン病の予防治療剤も提供できる。

メマンチンのオートファジー誘導効果（ＬＣ３−ＩＩ上昇）を示す。リソソーム阻害薬の併用によりＬＣ３−ＩＩ上昇に相加効果を認めることからオートファジー誘導が確認できる。 メマンチンのオートリソソームの産生促進効果を示す。 メマンチンの各濃度におけるオートファジー誘導効果のタイムコースを示す。 メマンチンのｍＴＯＲＣ１抑制作用がないことを示す。 メマンチンのｉＰＳ細胞由来神経細胞でのミトコンドリアオートファジー誘導効果を示す。 クレマスチンのオートファジー誘導効果を示す。 クレマスチンのオートリソソームの産生促進効果を示す。

本発明のオートファジー誘導剤及びパーキンソン病予防治療剤の有効成分は、メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分（化合物）である。

メマンチンは、化学名１−アミノ−３，５−ジメチルアダマンタンである。メマンチンは、グルタミン酸受容体のサブタイプであるＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体チャネル阻害作用を有し、中等度及び高度アルツハイマー型認知症における認知症状の進行抑制に使用されている。しかしながら、メマンチンのオートファジーに対する作用やパーキンソン病に対する作用は知られていない。

クレマスチンは、化学名（２Ｒ）−２−｛２−［（１Ｒ）−１−（４−クロロフェニル）−１−フェニルエトキシ］エチル｝−１−メチルピロリジンである。クレマスチンは、Ｈ₁受容体拮抗作用を有する抗ヒスタミン剤であり、アレルギー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎、くしゃみ、鼻汁等の治療薬として用いられている。しかしながら、クレマスチンのオートファジーやパーキンソン病に対する作用は知られていない。

メマンチン及びクレマスチンの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の鉱酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩が挙げられる。このうち、メマンチンについては塩酸塩が好ましく、クレマスチンについてはフマル酸塩が好ましい。

後述の実施例に示すように、メマンチン及びクレマスチンは、オートファジーのマーカーであるＬＣ３−IIの発現量を上昇させ、Ｅ６４ｄとペプスタチンＡ存在下においては相加効果を認め、オートファジーを誘導する。また、免疫組織化学にて、ＬＣ３陽性顆粒（オートファゴソームまたはオートリソソーム）の増加を認め、共局圧も増加することからオートファジーフラックスも増加させる。さらに、メマンチン及びクレマスチンは、パーキンソン病患者由来のドパミン神経細胞において、ミトコンドリアオートファジー（マイトファジー）誘導効果を示し、パーキンソン病の予防治療剤として有用である。
本発明のパーキンソン病予防治療剤によれば、パーキンソン病の症状である、静止時の振戦、筋固縮、寡動・無動、姿勢反射障害、便秘などの自律神経障害、うつなどの神経症状の発生を抑制し、これらの症状を改善する。

メマンチン、クレマスチン又はそれらの塩を医薬として用いる場合、経口又は非経口的に投与することができる。メマンチン、クレマスチン又はそれらの塩は、薬学的に許容される担体と組み合わせることによって薬学組成物とすることができる。薬学的に許容される担体として、賦形剤、結合剤、緩衝剤、増粘剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等の公知のものを使用することができ、通常の方法により製剤化することができる。

経口投与用製剤としては、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。

この経口投与用製剤は製剤分野において通常用いられる添加剤を配合し、公知の方法に従って製造することができる。このような添加剤としては、例えば乳糖、マンニトール、無水リン酸水素カルシウム等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；でんぷん、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤等が挙げられる。非経口的には、注射剤、直腸投与製剤、局所投与剤等として投与することができ、なかでも注射剤が好ましい。

注射剤としては、例えば無菌の溶液又は懸濁液等が挙げられる。これらの注射剤は、例えば本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩を日局注射用水に溶解又は懸濁することにより製造される。必要により塩化ナトリウム等の等張化剤；リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム等の緩衝剤；溶解補助剤等を配合してもよい。また、用時溶解型（粉末充填、凍結乾燥）の注射剤とすることができ、この場合、マンニトール、乳糖等の賦形剤を添加して、通常の方法で製造することができる。

直腸投与製剤としては坐剤等が挙げられる。坐剤は例えば本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩をカカオ脂、マクロゴール等の基剤に溶解又は懸濁した後、鋳型に注いで成形して製造される。また、液又はクリームを注入用の容器に入れ、直腸投与製剤とすることもできる。

局所投与製剤は液剤、点眼剤、クリーム、軟膏、ゲル製剤、スプレー剤、粉剤等が挙げられる。液剤は、本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩を水に加え、安定化剤、溶解剤、増粘剤、分散剤、懸濁化剤等を必要に応じて加えて製造することができる。この増粘剤としては、ゼラチン、ヒアルロン酸ナトリウム、高分子デキストラン、アルギン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム等を用いることができる。点眼剤は、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤のほかに防腐剤を加えて製造することができる。クリーム及び軟膏は、水性又は油性の基剤、例えば水、流動パラフィン、植物油（ピーナッツ油、ひまし油等）、マクロゴール等を用いて製造することができる。ゲル製剤は、公知の方法により、ゼラチン、ペクチン、カラゲナン、寒天、トラガント、アルギン酸塩、セルロースエーテル（メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース等）、ペクチン誘導体、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン等を用いて製造することができる。スプレー剤は本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩を水等に溶解又は懸濁した後、スプレー容器に入れて製造することができる。粉剤とする場合は、本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩をそのまま使用することもできるが、適当な賦形剤と混合して製造することができる。

メマンチン、クレマスチン又はそれらの塩の投与量は対象とする疾患や症状、投与対象の年齢、体重、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。通常、経口投与の場合、成人（体重約６０ｋｇ）１日当たりのメマンチン、クレマスチン又はそれらの塩の投与量は、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜３０ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜１０ｍｇであり、これを１回で、あるいは２〜４回に分けて投与する。また、静脈内投与される場合は、通常、成人１日の投与量は体重１ｋｇあたり０．０３〜３０００μｇ、好ましくは０．０３〜３００μｇ、より好ましくは０．０３〜３０μｇであり、１日１回〜複数回に分けて投与する。

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

実施例１
既に臨床応用されている化合物ライブラリー（以下既存薬ライブラリー）は発明者佐谷秀行が独自に収集した化合物群で約１２００種からなる。同化合物のオートファジー誘導効果を順に、５５７種について検討を行った。ＧＦＰ（緑色蛍光を発するタグ）−ＬＣ３（オートファジーの指標となる蛋白質）安定発現ＨｅＬａ細胞（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ７：１７６−１８７, ２０１１参照）を９６穴プレートに０．１×１０⁵／穴で播種した。既に既存薬ライブラリーの薬剤（それぞれ１０μＭ）を上記細胞に添加し、２４時間後に蛍光顕微鏡でＧＦＰ発色をＦｌｏｉｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて観察した。ポジティブコントロール（オートファジーを誘導することでＧＦＰ−ＬＣ３陽性顆粒増加を呈する）としてＴｏｒｉｎ１（５μＭ）、ネガティブコントロール（オートファジーの最終段階をブロックし、ＧＦＰ−ＬＣ３陽性顆粒の分解を阻害することで同陽性顆粒を増加させる）としてＢａｆＡ１ （１００ｎＭ）を用いた。ＬＣ３ ｄｏｔ陽性細胞（ＧＦＰ陽性細胞１００個のうちＬＣ３ ｄｏｔが５個以上に増加している細胞数）が３０％以上のものを１次ヒット化合物と判定（基準はＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：５６４１，２００７）した。１次ヒット化合物群から、文献的にオートファジー誘導効果が報告されていないもの（６９種）について、オートファジー誘導効果の有無をそれぞれの１次ヒット化合物と共にＥ６４ｄ（１０μＭ）＋ｐｅｐＡ（１０μＭ）を加える条件／加えない条件を設定し、２４時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファーを用いて蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティングによってＬＣ３−II、ａｃｔｉｎの発現を評価し、オートファジー誘導効果が確認されたものを２次ヒット化合物とした。
２次ヒット化合物は、クロミフェン塩酸塩、メマンチン塩酸塩及びクレマスチンフマル酸塩であった。

実施例２
メマンチンについてオートファジー誘導効果について検討した。図１に示すようにメマンチンは１０μＭ〜４０μＭにおいてＬＣ３−IIの発現量を上昇させ、各濃度においてＥ６４ｄとｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ存在下においてはＬＣ３−II発現量に相加効果を認めることから、オートファジーを誘導すると考えられた。さらにＨｅＬａ細胞にＧＦＰ−ＲＦＰ−ＬＣ３プラスミドをリポフェクションで一過性に強制発現した状態で、メマンチンを加えた。ポジティブコントロールとして飢餓状態（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）により黄色のオートファゴソーム・赤色のオートリソソーム両者の増加を確認し、かつネガティブコントロールとしてＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１の４時間添加により黄色のオートファゴソームのみが蓄積することを確認した。本実験条件においてメマンチン（１００μＭ）により黄色・赤色のＬＣ３陽性顆粒（オートファゴソームまたはオートリソソーム）の増加を認めることからオートファジーフラックスが増加していると考えられた（図２）。

次にオートファジーを誘導するのに必要な時間を検討した。図３に示すようにメマンチンを１−１００μＭの濃度で添加し、４時間後、８時間後、２４時間後にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を回収しウェスタンブロッティングによりＬＣ３−II上昇を検討したところ、少なくとも８時間の３μＭメマンチン添加によりＬＣ３−IIの上昇効果を認めた。８時間、２４時間では何れも用量依存的にオートファジー誘導効果が認められた。

さらにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲＣ１経路との関与を検討したところ、特にｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ−Ｓ６Ｋの変化を認めなかったため、同経路とは別機序にてオートファジーを誘導すると考えられた（図４）。

さらにドパミン神経細胞におけるミトコンドリアオートファジー（マイトファジー）誘導効果を確認するため、遺伝性パーキンソン病（ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ６）患者由来ｉＰＳ細胞から分化誘導したドパミン神経細胞を用いた。本細胞ラインでは、それぞれがｐａｒｋｉｎおよびＰＩＮＫ１という蛋白質の発現を欠くことからＰＩＮＫ１／ｐａｒｋｉｎ介在性マイトファジーを誘導することが出来ない（Imaizumi Y, Okada Y, Akamatsu W, Koike M, Kuzumaki N, Hayakawa H, Nihira T, Kobayashi T, Ohyama M, Sato S, Takanashi M, Funayama M, Hirayama A, Soga T, Hishiki T, Suematsu M, Yagi T, Ito D, Kosakai A, Hayashi K, Shouji M, Nakanishi A, Suzuki N, Mizuno Y, Mizushima N, Amagai M, Uchiyama Y, Mochizuki H, Hattori N, Okano H. Mitochondrial dysfunction associated with increased oxidative stress and s synuclein accumulation in PARK2 iPSC-derived neurons and postmortem brain tissue. Mol Brain. 6;5:35 (2012)、Shiba-Fukushima K, Ishikawa KI, Inoshita T, Izawa N, Takanashi M, Sato S, Onodera O, Akamatsu W, Okano H, Imai Y, Hattori N. Evidence that phosphorylated ubiquitin signaling is involved in the etiology of Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 26:3172-3185 (2017)）。ｉＰＳ細胞をドパミン神経に誘導し、神経誘導１０日後にマイトファジーを誘導するため３０μＭＣＣＣＰ（ミトコンドリア脱共役剤）を添加し、４８時間後に固定してβ−III−ｔｕｂｕｌｉｎ（神経マーカー）とＣｏｍｐｌｅｘ III−ｃｏｒｅ１（ミトコンドリアマーカー）で免疫染色を行い、神経細胞内のミトコンドリア面積を定量することでマイトファジーを評価した。各細胞にそれぞれＣＣＣＰとともに１０μＭメマンチンを添加し４８時間後に観察したところ、ミトコンドリア面積（Ｉｎｎｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅを示す抗体にて染色された部分の総面積）が減少したことから、メマンチンはＰＩＮＫ１／ｐａｒｋｉｎが関与しない、ＰＩＮＫ１／ｐａｒｋｉｎ非介在性マイトファジーを誘導することが確認された（図５）。以上からメマンチンは培養系神経細胞・ｉＰＳ細胞由来神経細胞にてオートファジーを誘導するが証明された。

実施例３
次にクレマスチン１０μＭについてもＥ６４ｄとｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ存在下においてはＬＣ３−IIの発現量について相加効果を認め（図６）、免疫細胞染色により内因性ＬＣ３陽性顆粒（オートファゴソームまたはオートリソソーム）が増加し、内因性ＬＣ３陽性顆粒とＬＡＭＰ２陽性顆粒（リソソームまたはオートリソソーム）との共局在が増加することから（図７）、オートファジーフラックスを促進することを確認した。

Claims (2)

1. メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー誘導剤。
2. メマンチン、クレマスチン及びそれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするパーキンソン病予防治療剤。