JP2019162054A - Efficient method for establishing induced pluripotent stem cell - Google Patents
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Abstract
【課題】TRA-1-60よりもさらに早い時期に発現するマーカー遺伝子を同定し、該マーカー遺伝子を用いてリプログラミングの分子機構を理解する手段を提供すること。また、当該マーカー遺伝子の発現を指標とした効率的なiPS細胞の樹立方法を提供すること。【解決手段】以下の工程を含むiPS細胞の製造方法：(i) 初期化因子が導入された体細胞集団を培養する工程；(ii) 該培養された細胞集団からESRG遺伝子を発現する細胞を選別する工程；及び(iii) 該選別された細胞を培養し、iPS細胞を得る工程。【選択図】なし[PROBLEMS] To provide a means for identifying a marker gene that is expressed earlier than TRA-1-60, and using the marker gene to understand the molecular mechanism of reprogramming. Another object of the present invention is to provide a method for efficiently establishing iPS cells using the expression of the marker gene as an index. A method for producing iPS cells comprising the following steps: (i) culturing a somatic cell population into which a reprogramming factor has been introduced; (ii) transforming cells expressing an ESRG gene from the cultured cell population. Selecting; and (iii) culturing the selected cells to obtain iPS cells. [Selection diagram] None
Description
本発明は、人工多能性幹細胞（以下、「iPS細胞」ともいう。）の効率的な樹立方法、並びに当該方法に適したレポーター細胞等に関する。 The present invention relates to an efficient method for establishing induced pluripotent stem cells (hereinafter also referred to as “iPS cells”), reporter cells suitable for the method, and the like.
ヒト体細胞にリプログラミング因子 (例：OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC: OSKM) を導入することでiPS細胞を作製することができるが、その詳細な分子機構は不明な部分が多い。この分子機構を理解するにはリプログラミング途中の細胞を解析する必要があるが、OSKMが引き起こすリプログラミング効率が極めて低いことが種々の解析を困難にしている。一方で、裏を返せば、この効率の低さの原因を理解することがリプログラミングの分子機構を理解することにつながるとも考えられる。 IPS cells can be generated by introducing reprogramming factors (eg, OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC: OSKM) into human somatic cells, but the detailed molecular mechanism remains unclear. . To understand this molecular mechanism, it is necessary to analyze cells in the middle of reprogramming, but the reprogramming efficiency caused by OSKM makes various analyzes difficult. On the other hand, understanding the cause of this inefficiency may lead to understanding the molecular mechanism of reprogramming.
本発明者らは、TRA-1-60というヒト多能性細胞特異的表面抗原が初期化されている細胞で発現していることを見出した (特許文献１、非特許文献１、２)。TRA-1-60はリプログラミングされていない (され損なった) 細胞では発現しないことから、抗TRA-1-60抗体を用いて初期化されている細胞のみを純化することが可能となった。本発明者らは、この純化系を用いて、初期化途中で起こる複数の重要なイベントを明らかにしてきた。 The present inventors have found that a human pluripotent cell-specific surface antigen called TRA-1-60 is expressed in cells that have been initialized (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2). Since TRA-1-60 is not expressed in cells that have not been reprogrammed (failed), it has become possible to purify only those cells that have been initialized using anti-TRA-1-60 antibodies. The present inventors have clarified a plurality of important events that occur during the initialization using this purification system.
しかし、TRA-1-60陽性細胞は将来的にiPS細胞へと成熟していく細胞集団であるが、どのようにして体細胞がTRA-1-60陽性細胞へと変化するのかは明らかになっていない。この最も初期に起こる細胞の性質変化を捉えることが、リプログラミングの分子機構を理解するにあたって重要である。 However, TRA-1-60 positive cells are a cell population that matures into iPS cells in the future, but it has become clear how somatic cells change into TRA-1-60 positive cells. Not. Capturing this earliest change in cell properties is important in understanding the molecular mechanism of reprogramming.
TRA-1-60陽性細胞へと変化する過程を捉えるためには、将来TRA-1-60陽性細胞へと変化する細胞をあらかじめ予測することが重要である。従って、本発明の目的は、TRA-1-60よりもさらに早い時期に発現するマーカー遺伝子を同定し、該マーカー遺伝子を用いてリプログラミングの分子機構を理解する手段を提供することである。また、本発明の別の目的は、当該マーカー遺伝子の発現を指標とした効率的なiPS細胞の樹立方法を提供することである。 In order to capture the process of changing to TRA-1-60 positive cells, it is important to predict in advance the cells that will change to TRA-1-60 positive cells in the future. Therefore, an object of the present invention is to provide a means for identifying a marker gene that is expressed at an earlier stage than TRA-1-60 and understanding the molecular mechanism of reprogramming using the marker gene. Another object of the present invention is to provide an efficient method of establishing iPS cells using the expression of the marker gene as an index.
本発明者らは、上記の目的を達成するために、5種類のヒト体細胞にOSKMの4因子を導入し、導入前と導入7日後とで、それらの体細胞における遺伝子発現をマイクロアレイを用いて網羅的に解析し、すべての細胞種で5倍以上発現が変動していた遺伝子を抽出した。抽出された194種の上方制御遺伝子の中には、L1TD1、SALL4、NANOG等の早期リプログラミングマーカー遺伝子が含まれていたことから、本発明者らは、これらの上方制御された遺伝子の中に、TRA-1-60遺伝子より早期に発現するリプログラミングマーカー遺伝子があるのではないかと予測した。そこで、(1) 体細胞で発現が検出できない、(2) リプログラミング因子導入後3日目の細胞集団で不均一に発現する、及び(3) 導入後7日目の全てのTRA-1-60陽性細胞で発現している、との条件で、上記194遺伝子を選別したところ、ヒト内在性レトロウイルスH型（HERV-H）駆動性の長鎖非コーディングRNA（lncRNA）を産物とするESRG遺伝子のみが、上記の3条件を満たすことを見出した。
次いで、ESRGの遺伝子座にレポーター遺伝子を導入して、ESRGを発現する細胞を生きたまま識別できる系を作製した。ESRG-レポーター線維芽細胞にOSKMを導入したところ、導入後3日目において数%のレポーター陽性細胞が確認された。フローサイトメトリーを用いた継時的な解析により、ESRG-レポーター陽性細胞のみからTRA-1-60陽性細胞が出現してくることが分かった。OSKM導入から3日目に出現したESRG-レポーター陽性及び陰性細胞をそれぞれ純化し、各細胞集団からiPS細胞の樹立を行った結果、ESRG-レポーター陽性細胞から有意に多くのiPS細胞が樹立されることを見出した。
以上のように、本発明者らは、ESRG-レポーターは最初期のリプログラミングされた細胞を検出することができ、該レポーター陽性細胞を選別することでiPS細胞の樹立効率を顕著に改善し得ることを実証して、本発明を完成するに至った。
In order to achieve the above object, the present inventors introduced four factors of OSKM into five types of human somatic cells, and used a microarray to express gene expression in those somatic cells before and 7 days after the introduction. The genes that had been altered by more than 5 times in all cell types were extracted. Among the 194 upregulated genes extracted, early reprogramming marker genes such as L1TD1, SALL4, and NANOG were included, so the present inventors included among these upregulated genes. Therefore, it was predicted that there might be a reprogramming marker gene expressed earlier than the TRA-1-60 gene. Therefore, (1) expression is not detectable in somatic cells, (2) it is expressed heterogeneously in the cell population 3 days after reprogramming factor introduction, and (3) all TRA-1- When the above-mentioned 194 genes were selected under the condition that they were expressed in 60-positive cells, ESRG was produced from human endogenous retrovirus H type (HERV-H) -driven long non-coding RNA (lncRNA). Only the gene was found to satisfy the above three conditions.
Next, a reporter gene was introduced into the ESRG gene locus to create a system that can distinguish ESRG-expressing cells alive. When OSKM was introduced into ESRG-reporter fibroblasts, several percent of reporter positive cells were confirmed on the third day after introduction. Through sequential analysis using flow cytometry, it was found that TRA-1-60 positive cells appeared only from ESRG-reporter positive cells. The ESRG-reporter positive and negative cells that appeared on the 3rd day after OSKM introduction were purified, and iPS cells were established from each cell population. As a result, significantly more iPS cells were established from ESRG-reporter positive cells. I found out.
As described above, the present inventors are able to detect ESRG-reporter at the early stage of reprogrammed cells, and can significantly improve iPS cell establishment efficiency by selecting the reporter positive cells. As a result, the present invention has been completed.
即ち、本発明は以下のものを提供する。
［１］以下の工程を含むiPS細胞の製造方法：
(i) 初期化因子が導入された体細胞集団を培養する工程；
(ii) 該培養された細胞集団からESRG遺伝子を発現する細胞を選別する工程；及び
(iii) 該選別された細胞を培養し、iPS細胞を得る工程。
［２］工程(i)の前に、体細胞に初期化因子を導入する工程を含む、［１］に記載の方法。
［３］工程(ii)を初期化因子の導入後3〜11日の間に行う、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］体細胞が、内因性ESRG遺伝子のプロモーターの制御下にレポータータンパク質をコードする核酸を含み、工程(ii)が該レポータータンパク質の発現を指標に行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、［４］に記載の方法。
［６］初期化因子が、Octファミリーメンバー又はそれをコードする核酸、Soxファミリーメンバー又はそれをコードする核酸、Klfファミリーメンバー又はそれをコードする核酸、Mycファミリーメンバー又はそれをコードする核酸、Lin28ファミリーメンバー又はそれをコードする核酸、及びNanog又はそれをコードする核酸からなる群より選択される1種以上を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］iPS細胞の樹立効率を改善する方法であって、初期化因子が導入された体細胞集団からESRG遺伝子を発現する細胞を選別することを含む、方法。
［８］該選別を初期化因子の導入後3〜11日の間に行う、［７］に記載の方法。
［９］内因性ESRG遺伝子のプロモーターの制御下にレポータータンパク質をコードする核酸を含む、哺乳動物由来の細胞。
［１０］レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、［９］に記載の細胞。
［１１］多能性幹細胞である、［９］又は［１０］に記載の細胞。
［１２］iPS細胞から分化誘導した分化細胞集団から、ESRG遺伝子を発現する細胞を除去することを含む、分化細胞の純化方法。
［１３］iPS細胞クローンの分化抵抗性の評価方法であって、被検iPS細胞クローンから分化誘導した分化細胞集団におけるESRG遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、方法。
That is, the present invention provides the following.
[1] A method for producing iPS cells including the following steps:
(i) culturing a somatic cell population into which the reprogramming factor has been introduced;
(ii) selecting cells expressing the ESRG gene from the cultured cell population; and
(iii) culturing the selected cells to obtain iPS cells.
[2] The method according to [1], comprising a step of introducing an reprogramming factor into somatic cells before step (i).
[3] The method according to [1] or [2], wherein step (ii) is performed between 3 and 11 days after introduction of the reprogramming factor.
[4] The cells of [1] to [3], wherein the somatic cell contains a nucleic acid encoding a reporter protein under the control of a promoter of an endogenous ESRG gene, and step (ii) is performed using expression of the reporter protein as an indicator. The method according to any one.
[5] The method according to [4], wherein the reporter protein is a fluorescent protein.
[6] The reprogramming factor is an Oct family member or a nucleic acid that encodes it, a Sox family member or a nucleic acid that encodes it, a Klf family member or a nucleic acid that encodes it, a Myc family member or a nucleic acid that encodes it, the Lin28 family The method according to any one of [1] to [5], comprising at least one member selected from the group consisting of a member or a nucleic acid encoding the member and Nanog or a nucleic acid encoding the member.
[7] A method for improving iPS cell establishment efficiency, comprising selecting a cell expressing an ESRG gene from a somatic cell population into which a reprogramming factor has been introduced.
[8] The method according to [7], wherein the selection is performed between 3 and 11 days after introduction of the reprogramming factor.
[9] A mammal-derived cell comprising a nucleic acid encoding a reporter protein under the control of a promoter of an endogenous ESRG gene.
[10] The cell according to [9], wherein the reporter protein is a fluorescent protein.
[11] The cell according to [9] or [10], which is a pluripotent stem cell.
[12] A method for purifying differentiated cells, comprising removing cells expressing ESRG gene from a differentiated cell population induced to differentiate from iPS cells.
[13] A method for evaluating differentiation resistance of an iPS cell clone, wherein the expression level of ESRG gene in a differentiated cell population induced to differentiate from a test iPS cell clone is used as an index.
ESRG遺伝子はリプログラミングの極めて初期の段階でその発現が活性化される。また、該遺伝子は、iPS細胞ではすべての細胞で均一に発現し、分化後は速やかに発現が消失する。従って、本発明によれば、ESRG遺伝子の発現を指標としてリプログラミングされた細胞の早期検出及び該細胞を選別することによるiPS細胞樹立化効率の改善、並びに、iPS細胞から分化誘導した分化細胞集団中に残存する未分化細胞の除去及びiPS細胞クローンの分化抵抗性の評価などに有用である。 ESRG gene is activated in the very early stages of reprogramming. In addition, the gene is uniformly expressed in all cells in iPS cells, and the expression is rapidly lost after differentiation. Therefore, according to the present invention, early detection of reprogrammed cells using ESRG gene expression as an indicator, improvement of iPS cell establishment efficiency by sorting the cells, and differentiated cell populations induced to differentiate from iPS cells This is useful for removing undifferentiated cells remaining therein and evaluating the differentiation resistance of iPS cell clones.
本発明は、初期化因子導入後の適切な時期に、初期化因子を導入された体細胞集団からESRG遺伝子を発現する細胞を選別することを特徴とする、iPS細胞の樹立効率改善方法、並びに当該方法を利用した効率的なiPS細胞の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）を提供する。本発明の製造方法は、以下の工程を含む。
(i) 初期化因子が導入された体細胞集団を培養する工程
(ii) 該培養された細胞集団からESRG遺伝子を発現する細胞を選別する工程
(iii) 該選別された細胞を培養し、iPS細胞を得る工程
The present invention comprises a method for improving the establishment efficiency of iPS cells, characterized by selecting cells expressing an ESRG gene from a somatic cell population into which an initialization factor has been introduced, at an appropriate time after introduction of the initialization factor, and An efficient method for producing iPS cells using the method (hereinafter also referred to as “the production method of the present invention”) is provided. The manufacturing method of the present invention includes the following steps.
(i) culturing the somatic cell population into which the reprogramming factor has been introduced
(ii) selecting a cell expressing the ESRG gene from the cultured cell population
(iii) culturing the selected cells to obtain iPS cells
工程(i)では、初期化因子が導入された体細胞集団を培養する。
「人工多能性幹（iPS）細胞」は、特定の初期化因子を、核酸（DNAもしくはRNA）またはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって製造することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Takahashi, K.及びS. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; Takahashi, K. et al. (2007) Cell, 131: 861-872; Yu, J. et al. (2007) Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M.et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 101-106; WO2007/069666）。
In step (i), the somatic cell population into which the reprogramming factor has been introduced is cultured.
“Artificial pluripotent stem (iPS) cells” are approximately equivalent to ES cells that can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of nucleic acids (DNA or RNA) or proteins. Artificial stem cells derived from somatic cells with characteristics such as differentiation pluripotency and proliferation ability by self-replication (Takahashi, K. and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; Takahashi, K. et al. (2007) Cell, 131: 861-872; Yu, J. et al. (2007) Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 101-106 ; WO2007 / 069666).
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞及び分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。 As used herein, the term “somatic cell” refers to any animal cell (preferably mammalian cells including humans) except germ line cells such as ova, oocytes, ES cells, and totipotent cells. Say. Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells. , Passage cells, and established cell lines. Specifically, the somatic cells are, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, dental pulp stem cells, (2) tissue precursor cells, (3) lymphocytes, epithelium Cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, intestinal cells, spleen cells, pancreatic cells (exocrine pancreas cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells Examples thereof include differentiated cells such as fat cells.
体細胞のソースとしての哺乳動物個体の選択は特に制限されない。しかしながら、iPS細胞を、ヒトにおける疾患の治療に使用する場合、移植片拒絶及び／又はGvHDを予防するという観点から、体細胞は、患者本人の細胞であるか、あるいは患者のHLA型と同一又は実質的に同一であるHLA型を有する他人から採取されることが好ましい。本明細書中で使用される「実質的に同一であるHLA型」とは、ドナーのHLA型が、免疫抑制剤等の使用を伴う患者に移植した場合に、ドナーの体細胞由来のiPS細胞からの分化誘導により得られた移植細胞が生着可能である程度に、患者のものと一致することを意味する。例えば、主たるHLA（HLA-A、HLA-B及びHLA-DRの主要な3遺伝子座、あるいはさらにHLA-Cwを含む4遺伝子座）が同一であるHLA型等が挙げられる。 The selection of a mammalian individual as a somatic cell source is not particularly limited. However, when iPS cells are used in the treatment of diseases in humans, somatic cells are the patient's own cells or are identical to the patient's HLA type from the perspective of preventing graft rejection and / or GvHD. Preferably, it is collected from another person who has a substantially identical HLA type. As used herein, “substantially identical HLA type” refers to iPS cells derived from donor somatic cells when the donor's HLA type is transplanted to a patient with use of an immunosuppressant or the like. This means that the transplanted cells obtained by induction of differentiation from the plant are consistent with those of the patient to the extent that they can be engrafted. For example, the HLA type | mold etc. with which main HLA (The 3 main loci of HLA-A, HLA-B, and HLA-DR, or 4 loci further including HLA-Cw) are the same.
初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディング（non-coding）RNA、またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディングRNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等が例示される。これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu, D. et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi, Y. et al. (2008) Cell Stem cell, 2: 525-528、Eminli, S. et al. (2008) Stem Cells, 26: 2467-2474、Huangfu, D. et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 1269-1275、Shi, Y. et al. (2008) Cell Stem Cell, 3: 568-574、Zhao, Y. et al. (2008) Cell Stem Cell, 3: 475-479、Marson, A. (2008) Cell Stem Cell, 3: 132-135、Feng, B. et al. (2009) Nat. Cell Biol., 11: 197-203、Judson, R.L. et al. (2009) Nat. Biotechnol., 27: 459-461、Lyssiotis, C.A. et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106: 8912-8917、Kim, J.B. et al. (2009) Nature, 461: 649-653、Ichida, J.K. et al. (2009) Cell Stem Cell, 5: 491-503、Heng, J.C. et al. (2010) Cell Stem Cell, 6: 167-74、Han, J. et al. (2010) Nature, 463: 1096-100、Mali, P. et al. (2010) Stem Cells, 28: 713-720及びMaekawa, M. et al. (2011) Nature, 474: 225-9に記載の組み合わせが例示される。 The reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-coding RNA, or a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non You may be comprised by coding RNA or a low molecular weight compound. Examples of genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc. are exemplified. These initialization factors may be used alone or in combination. As combinations of reprogramming factors, WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 / 050626, WO2010 / 056831, WO2010 / 068955, WO2010 / 098419, WO2010 / 102267, WO2010 / 111409, WO2010 / 111422, WO2010 / 115050, WO2010 / 124290, WO2010 / 147395, WO2010 / 147612, Huangfu, D. et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi, Y. et al. (2008) Cell Stem cell, 2: 525-528, Eminli, S. et al. (2008) Stem Cells, 26: 2467-2474, Huangfu, D. et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 1269-1275, Shi, Y. et al. (2008) Cell Stem Cell, 3: 568-574, Zhao, Y. et al. (2008 ) Cell Stem Cell, 3: 475-479, Marson, A. (2008) Cell Stem Cell, 3: 132-135, Feng, B. et al. (2009) Nat. Cell Biol., 11: 197-203 Judson, RL et al. (2009) Nat. Biotechnol., 27: 459-461, Lyssiotis, CA et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106: 8912-8917, Kim, JB et al (2009) Nature, 461: 649-653, Ichida, JK et al. (2009) Cell Stem Cell, 5: 491-503, Heng, JC et al. (2010) Cell Stem Cell, 6: 167-74, Han, J. et al. (2010) Nature, 463: 1096-100, Mali, P. et al. (2010) Stem Cells, 28: 713-720 and Maekawa, M. et al. (2011) Nature, 474 : The combination described in 225-9 is exemplified.
好ましい態様において、Oct3/4、Sox2及びKlf4（OSK）を初期化因子として用いることができる。より好ましくは、該3因子に加え、L-Myc、N-Myc及びc-Myc（T58A変異体を含む）から選択されるMycファミリーメンバー（M）を用いることができる。さらに、Lin28は、TRA-1-60陽性細胞の形成を促進し、TRA-1-60陰性細胞への逆戻り転換を阻害するので、3因子（OSK）又は4因子（OSKM）に加え、Lin28を初期化因子として使用することも好ましい。 In a preferred embodiment, Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 (OSK) can be used as reprogramming factors. More preferably, in addition to the three factors, a Myc family member (M) selected from L-Myc, N-Myc and c-Myc (including T58A mutant) can be used. Furthermore, since Lin28 promotes the formation of TRA-1-60 positive cells and inhibits the reverse conversion to TRA-1-60 negative cells, in addition to 3 factors (OSK) or 4 factors (OSKM), Lin28 It is also preferred to use it as an initialization factor.
上記初期化因子には、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸（VPA）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、MC1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標)(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1(OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327及びPD0325901）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-アザシチジン）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-チャネルカルシウムアゴニスト（例えばBayk8644）、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wntシグナリングアゴニスト（例えば可溶性Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLIS1、PITX2、DMRTB1等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれるが、それらに限定されない。本明細書においては、これらの樹立効率を高めることを目的として用いられる因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。 Examples of the reprogramming factor include histone deacetylase (HDAC) inhibitors [eg, small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC ( Examples, nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (registered trademark) (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.], MEK inhibitors (eg, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901) Glycogen synthase kinase-3 inhibitors (eg, Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (eg, 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (eg, small molecule inhibitors such as BIX-01294, Suv39hl, Suv39h2 , Nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and shRNA for SetDBl and G9a), L-channel calcium agonist (eg Bayk8644), butyric acid, TGFβ inhibitor Or ALK5 inhibitors (eg LY364947, SB431542, 616453 and A-83-01), p53 inhibitors (eg siRNA and shRNA against p53), ARID3A inhibitors (eg siRNA and shRNA against ARID3A), miR-291- MiRNAs such as 3p, miR-294, miR-295 and mir-302, Wnt signaling agonists (eg soluble Wnt3a), neuropeptide Y, prostaglandins (eg prostaglandin E2 and prostaglandin J2), hTERT, Factors used for the purpose of improving establishment efficiency such as SV40LT, UTF1, IRX6, GLIS1, PITX2, DMRTB1, etc. are included, but are not limited thereto. In the present specification, factors used for the purpose of improving the establishment efficiency are not distinguished from initialization factors.
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。 In the form of a protein, the reprogramming factor may be introduced into a somatic cell by a technique such as lipofection, fusion with a cell membrane-permeable peptide (for example, TAT and polyarginine derived from HIV), or microinjection.
初期化因子がDNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（Cell, 126: 663-676, 2006; Cell, 131: 861-872, 2007; Science, 318: 1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322: 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Hemagglutinating Virus of Japanのベクター）（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322: 949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができ、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。 When the reprogramming factor is in the form of DNA, it can be introduced into somatic cells by techniques such as vectors such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, lipofection, liposomes, and microinjection. As viral vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors (Cell, 126: 663-676, 2006; Cell, 131: 861-872, 2007; Science, 318: 1917-1920, 2007), adenoviral vectors (Science, 322: 945-949, 2008), adeno-associated virus vector, Sendai virus vector (vector of Hemagglutinating Virus of Japan) (WO 2010/008054) and the like. Examples of artificial chromosome vectors include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC). As a plasmid, a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008). The vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, and a polyadenylation site so that a nuclear reprogramming substance can be expressed. Selectable marker sequences such as thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), β-glucuronidase (GUS), FLAG, etc. Can be included. In addition, the above vector has a LoxP sequence before and after the introduction of the gene into a somatic cell in order to excise the gene or promoter encoding the reprogramming factor and the gene encoding the reprogramming factor that binds to it. May be.
また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびシュードウリジン（pseudouridine）（TriLink Biotechnologies）を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren, L. (2010) Cell Stem Cell, 7: 618-630)。 In the case of RNA, it may be introduced into somatic cells by, for example, lipofection or microinjection. In order to suppress degradation, 5-methylcytidine and pseudouridine (TriLink Biotechnologies) are incorporated. RNA may also be used (Warren, L. (2010) Cell Stem Cell, 7: 618-630).
工程(i)において、初期化因子が導入された体細胞集団を培養し、iPS細胞を誘導するための培養液としては、例えば、10〜15% FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる）または市販の培養液［例えば、マウスES細胞培養用培養液（TX-WES培養液、トロンボX社）、霊長類ES細胞用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）］などが含まれる。 In step (i), the somatic cell population into which the reprogramming factor has been introduced is cultured, and the culture solution for inducing iPS cells includes, for example, DMEM, DMEM / F12 or DME culture containing 10-15% FBS. Liquids (these cultures may further contain LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, β-mercaptoethanol, etc.) or commercially available cultures [eg, mouse ES Cell culture medium (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES cell culture (primate ES / iPS cell culture, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology)] Etc. are included.
工程(i)の培養の具体例としては、10% FBSを含有するDMEM又はDMEM/F12培養液中、5% CO2を含む雰囲気下、37℃で、初期化因子が導入された体細胞集団を培養することが挙げられる。無血清培地を用いる培養方法もまた例として挙げることができる（Sun, N. et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA, 106: 15720-15725）。さらに、樹立効率を増進させるため、低酸素条件（酸素濃度0.1〜15%、好ましくは1〜10%）で該体細胞集団を培養してもよい（Yoshida, Y. et al. (2009) Cell Stem Cell, 5: 237-241又はWO2010/013845）。 As a specific example of the culture in step (i), a somatic cell population into which a reprogramming factor has been introduced in an atmosphere containing 5% CO 2 in a DMEM or DMEM / F12 culture medium containing 10% FBS at 37 ° C. Is cultured. A culture method using a serum-free medium can also be mentioned as an example (Sun, N. et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA, 106: 15720-15725). Furthermore, the somatic cell population may be cultured under hypoxic conditions (oxygen concentration 0.1-15%, preferably 1-10%) in order to enhance establishment efficiency (Yoshida, Y. et al. (2009) Cell Stem Cell, 5: 237-241 or WO2010 / 013845).
上記培養の間、培養開始2日目以降から、培養液を1日1回新鮮な培養液と交換することが望ましい。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞である。 During the culture, it is desirable to replace the culture medium with a fresh culture medium once a day from the second day after the start of the culture. The number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but is about 5 × 10 3 to about 5 × 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
工程(ii)では、工程(i)で培養した細胞集団からESRG遺伝子を発現する細胞を選別する。本発明は、少なくとも部分的には、TRA-1-60よりもさらに早いリプログラミングの最初期の段階で、リプログラミングのプロセスに入った体細胞が、細胞種に関係なくESRG遺伝子を発現すること、即ち、ESRG遺伝子がユニバーサルな初期リプログラミングマーカー遺伝子であることを、本発明者らが初めて見出したことに基づく。これまで初期リプログラミングマーカーとして知られていたTRA-1-60の場合、初期化因子導入後11日目までに選別を行っても、いったんTRA-1-60陽性となった初期化途中の細胞の半数以上が、その後の培養の間にTRA-1-60陰性に戻るため、最終的にiPS細胞とならず、選別しない場合とiPS細胞の樹立効率は変わらないのに対し、ESRG陽性細胞を選別した場合、初期化因子導入後3日目に選別しても、高い効率でiPS細胞を樹立することができる。 In step (ii), cells expressing the ESRG gene are selected from the cell population cultured in step (i). The present invention is that, at least in part, at the earliest stages of reprogramming earlier than TRA-1-60, somatic cells that have entered the reprogramming process express the ESRG gene regardless of cell type. That is, based on the first discovery by the present inventors that the ESRG gene is a universal early reprogramming marker gene. In the case of TRA-1-60, which has been known as an early reprogramming marker so far, cells that have been positive for TRA-1-60 once became positive even after selection by the 11th day after introduction of the reprogramming factor Since more than half of the cells return to TRA-1-60 negative during the subsequent culture, they do not eventually become iPS cells. When sorted, iPS cells can be established with high efficiency even if sorted on the third day after introduction of the reprogramming factor.
後述の実施例で示されるとおり、ESRG遺伝子の発現は、リプログラミングの成熟プロセスの間上昇し、完全に初期化されたiPS細胞でも高発現が維持されるので、工程(ii)における選別は、少なくとも体細胞集団の一部の体細胞がESRG遺伝子を発現し始めた後であれば、いかなるタイミングで実施してもよい。例えば、初期化因子導入後1日目以降に選別を行うことができるが、好ましくは2日目以降、より好ましくは3日目以降である。選別実施時期の上限は特に制限されないが、初期化因子導入後11日を超えると、TRA-1-60陽性細胞を選別するのと同等の効果を奏することとなるので、本発明の優位性が顕著な選別実施時期としては、初期化因子導入後11日目までが挙げられる。従って、工程(ii)における選別は、初期化因子導入後3〜11日の間に行うことが好ましい。 As shown in the examples below, ESRG gene expression is elevated during the reprogramming maturation process and remains highly expressed in fully reprogrammed iPS cells, so the selection in step (ii) It may be performed at any timing as long as at least a part of somatic cells of the somatic cell population starts to express the ESRG gene. For example, the screening can be carried out on the first day after the introduction of the reprogramming factor, but is preferably the second day or later, more preferably the third day or later. The upper limit of the selection execution time is not particularly limited, but if it exceeds 11 days after the introduction of the reprogramming factor, it will have the same effect as selecting TRA-1-60 positive cells. A remarkable screening period is the 11th day after the introduction of the initialization factor. Therefore, the selection in step (ii) is preferably performed within 3 to 11 days after introduction of the reprogramming factor.
ESRG遺伝子は非翻訳性のlncRNAをコードするので、該遺伝子を発現する細胞（ESRG陽性細胞）の選別は、該RNAの発現を指標として行われる。細胞表面の糖鎖抗原であるTRA-1-60と異なり、ESRG RNAは細胞内に局在するので、抗体を用いたフローサイトメトリーによりESRG陽性細胞を選別することはできない。そこで、例えば、体細胞の内因性ESRG遺伝子のプロモーターの制御下に置かれるように、レポータータンパク質をコードする核酸をESRG遺伝子座に導入し、ESRG遺伝子の発現を、該レポータータンパク質の発現により可視化することで、ESRG陽性細胞の選別が可能となる。特に、レポータータンパク質として、蛍光タンパク質を用いることにより、フローサイトメーターを用いてFACSによりESRG陽性細胞を選別することができる。ここで蛍光タンパク質として、例えば、GFP、EGFP、Clover、TurboGFP、Azami-Green等の緑色蛍光タンパク質、Sirius、EBFP等の青色蛍光タンパク質、CFP、ECFP、AmCyan等のシアン色蛍光タンパク質、YFP、EYFP、Venus等の黄色蛍光タンパク質、mOrange、KusabiraOrange等の橙色蛍光タンパク質、RFP、DsRed、mStrawberry、mCherry等の赤色蛍光タンパク質などから適宜選択して用いることができる。 Since the ESRG gene encodes an untranslatable lncRNA, selection of cells (ESRG positive cells) that express the gene is performed using the expression of the RNA as an index. Unlike TRA-1-60, which is a sugar antigen on the cell surface, ESRG RNA is localized in cells, so ESRG positive cells cannot be selected by flow cytometry using antibodies. Therefore, for example, a nucleic acid encoding a reporter protein is introduced into the ESRG locus so that it is placed under the control of the promoter of the endogenous ESRG gene in somatic cells, and the expression of the ESRG gene is visualized by the expression of the reporter protein. Thus, selection of ESRG positive cells becomes possible. In particular, by using a fluorescent protein as a reporter protein, ESRG positive cells can be selected by FACS using a flow cytometer. Here, as fluorescent protein, for example, green fluorescent protein such as GFP, EGFP, Clover, TurboGFP, Azami-Green, blue fluorescent protein such as Sirius, EBFP, cyan fluorescent protein such as CFP, ECFP, AmCyan, YFP, EYFP, Yellow fluorescent proteins such as Venus, orange fluorescent proteins such as mOrange and KusabiraOrange, red fluorescent proteins such as RFP, DsRed, mStrawberry, and mCherry can be appropriately selected and used.
ESRG遺伝子座へのレポータータンパク質をコードする核酸の導入は、自体公知の相同組換え法により行うことができる。ESRG遺伝子座にレポータータンパク質をコードする核酸が導入された細胞（ESRG-レポーター細胞）は、レポーターを用いたESRG陽性細胞の選別が可能である限り、ヘテロ接合性にレポーターを有していても、ホモ接合性にレポーターを有していてもよいが、好ましくはホモ接合性である。本発明の製造方法を、再生医療用のヒトiPS細胞の樹立のために利用する場合、体細胞として、移植を受ける患者本人又は実質的にHLA型が同一の他人から採取した細胞（例：皮膚線維芽細胞、末梢血もしくは臍帯血単核球等）を用いることから、相同組換え法としては、高頻度にかつ同時に相同染色体の両方の遺伝子座にレポーターを導入することができる、CRISPR/Cas9、TALEN、ZFNを用いたゲノム編集により、ESRG遺伝子配列とターゲッティングベクターとの相同組換えを生じさせることが望ましい。一方、リサーチツールとして、マウスやラット等由来のESRG-レポーター細胞を作製する場合には、ES細胞等の多能性幹細胞にレポーターを含むターゲッティングベクターを導入し、常法によりキメラ動物を作製し、生殖系列に多能性幹細胞が寄与したマウスを交配して、ホモ接合性のESRG-レポーター動物を作製しておき、該動物から線維芽細胞等を単離してESRG-レポーター細胞として用いてもよいが、やはり簡便さの面から、ゲノム編集を用いることが好ましい。 Introduction of a nucleic acid encoding a reporter protein into the ESRG locus can be carried out by a homologous recombination method known per se. Cells introduced with a nucleic acid encoding a reporter protein at the ESRG locus (ESRG-reporter cell) may have a heterozygous reporter as long as ESRG-positive cells can be selected using the reporter. Although it may have a reporter in homozygosity, it is preferably homozygous. When the production method of the present invention is used for the establishment of human iPS cells for regenerative medicine, somatic cells collected from the patient who receives the transplant or from another person who has substantially the same HLA type (eg, skin) As a homologous recombination method, reporters can be introduced at both loci of homologous chromosomes at a high frequency and simultaneously as CRISPR / Cas9, using fibroblasts, peripheral blood or cord blood mononuclear cells, etc.) It is desirable to generate homologous recombination between the ESRG gene sequence and the targeting vector by genome editing using TALEN and ZFN. On the other hand, when producing ESRG-reporter cells derived from mice, rats, etc. as a research tool, a targeting vector containing a reporter is introduced into pluripotent stem cells such as ES cells, and a chimeric animal is produced by a conventional method. Mice with pluripotent stem cells contributed to the germline may be bred to produce a homozygous ESRG-reporter animal, and fibroblasts and the like may be isolated from the animal and used as ESRG-reporter cells. However, it is preferable to use genome editing from the viewpoint of simplicity.
例えば、ESRG-レポーター細胞を作製するためのターゲッティングベクターとして、図２Ａに記載のコンストラクトを用いることができるが、これに限定されない。図２Ａでは、ESRG遺伝子の第4エクソン及びその近傍と相同な配列を用い、第4エクソンの内部にレポーター（Clover）を挿入するように設計されている。この場合、レポータータンパク質の翻訳を可能とするために、該タンパク質をコードする核酸の上流にポリシストロニックな発現を可能にする配列（例：IRES、2A配列）を挿入しておけばよい。また、レポータータンパク質をコードする核酸の下流には、転写終結シグナルであるポリアデニル化シグナルや、ポリA部位のリードスルーを防ぎ、RNAのプロセッシングと成熟の促進、RNAの核外への輸送促進に寄与するWPRE配列等を付加してもよい。さらに、選択マーカーとして、カナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挿入してもよい。該選択マーカー遺伝子の両端にloxPやFrt配列を導入しておけば、ESRG-レポーター細胞の選択後にCre又はFlpリコンビナーゼを作用させることにより、該選択マーカー遺伝子を除去することができる。さらに、本発明の製造方法により得られたiPS細胞を分化誘導してヒトへの移植細胞として用いる場合、残存する未分化細胞をレポーターの発現を指標として除去した後に、不要となったレポーターを含む挿入配列を除くために、該配列の両端にFrtやloxP配列を配置しておけば、Flp又はCreリコンビナーゼを作用させることにより、挿入配列全体を除去することもできる。もちろん、移植部位がレポーターの発現を検出可能な部位であれば、レポーター発現カセットを保持しておくことで、移植後の細胞の脱分化（腫瘍化）をモニタリングすることもできる。 For example, the construct described in FIG. 2A can be used as a targeting vector for producing ESRG-reporter cells, but is not limited thereto. In FIG. 2A, a sequence homologous to the fourth exon of the ESRG gene and its vicinity is used, and a reporter (Clover) is designed to be inserted inside the fourth exon. In this case, in order to enable translation of the reporter protein, a sequence (eg, IRES, 2A sequence) enabling polycistronic expression may be inserted upstream of the nucleic acid encoding the protein. In addition, downstream of the nucleic acid encoding the reporter protein, it prevents polyadenylation signal, which is a transcription termination signal, and read-through of the poly A site, contributing to the promotion of RNA processing and maturation, and the promotion of RNA export to the nucleus. A WPRE sequence or the like may be added. Furthermore, a drug resistance gene such as a kanamycin resistance gene may be inserted as a selection marker. If loxP or Frt sequences are introduced at both ends of the selectable marker gene, the selectable marker gene can be removed by allowing Cre or Flp recombinase to act after selection of ESRG-reporter cells. Furthermore, when iPS cells obtained by the production method of the present invention are induced to be differentiated and used as transplanted cells to humans, the remaining undifferentiated cells are removed using the reporter expression as an indicator, and then an unnecessary reporter is included. In order to remove the inserted sequence, if the Frt or loxP sequence is arranged at both ends of the sequence, the entire inserted sequence can be removed by acting Flp or Cre recombinase. Of course, if the transplantation site is a site where reporter expression can be detected, the dedifferentiation (tumorization) of the cells after transplantation can be monitored by holding the reporter expression cassette.
工程(iii)においては、工程(ii)で選別されたESRG陽性細胞を、フィーダー細胞（例：マイトマイシンCで処理したSTO細胞、SNL細胞等）上に再播種し、bFGFを含有する霊長類ES細胞用培養液中で培養することができる。細胞は、10% FBSを含有するDMEM培養液（さらにLIF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含有むことができる）中で、フィーダー細胞上、5% CO2を含む雰囲気下、37℃で培養することもできる。 In step (iii), ESRG positive cells selected in step (ii) are replated on feeder cells (eg, STO cells treated with mitomycin C, SNL cells, etc.) and primate ES containing bFGF It can be cultured in a cell culture medium. Cells are feeder cells in DMEM medium containing 10% FBS (and can contain LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, β-mercaptoethanol, etc. as appropriate) Furthermore, it can also be cultured at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% CO 2 .
あるいは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞自体又は細胞外基質（例：ラミニン-5 (WO2009/123349)及びマトリゲル (BD)）を用いる方法（Takahashi, K. et al. (2009) PLoS One, 4: e8067又はWO 2010/137746）を挙げることができる。 Alternatively, instead of feeder cells, a method using somatic cells to be initialized or extracellular matrix (eg, laminin-5 (WO2009 / 123349) and matrigel (BD)) (Takahashi, K. et al. (2009) PLoS One, 4: e8067 or WO 2010/137746).
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。 iPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies. On the other hand, when a drug resistance gene that is expressed in conjunction with a gene that is expressed when somatic cells are initialized (for example, Oct3 / 4, Nanog) is introduced as a marker gene, a culture solution containing the corresponding drug (selection The established iPS cells can be selected by culturing with the culture medium. In addition, if the marker gene is a fluorescent protein gene, iPS cells are selected by observing with a fluorescence microscope, in the case of a luminescent enzyme gene, by adding a luminescent substrate, and in the case of a chromogenic enzyme gene, by adding a chromogenic substrate can do.
上述のように、ESRG遺伝子は、iPS細胞ではすべての細胞で均一に発現し、分化後は速やかに発現が消失する。従って、ESRG遺伝子の発現を指標として、iPS細胞から分化誘導した分化細胞集団中に残存する未分化細胞を除去することが可能である。即ち、本発明はまた、iPS細胞から分化誘導した分化細胞集団から、ESRG遺伝子を発現する細胞を除去することを含む、分化細胞の純化方法（残存する未分化細胞の除去方法）（以下、「本発明の純化方法」ともいう。）を提供する。 As described above, the ESRG gene is uniformly expressed in all cells in iPS cells, and the expression is rapidly lost after differentiation. Therefore, it is possible to remove undifferentiated cells remaining in the differentiated cell population induced to differentiate from iPS cells using ESRG gene expression as an index. That is, the present invention also includes a method for purifying differentiated cells (a method for removing remaining undifferentiated cells) (hereinafter referred to as “removal of undifferentiated cells”), which comprises removing cells expressing ESRG gene from a differentiated cell population induced to differentiate from iPS cells. Also referred to as a “purification method of the present invention”).
本発明の純化方法に用いられるiPS細胞集団は、好ましくは、上記ESRG-レポーター細胞から誘導されたiPS細胞の集団である。該iPS細胞集団はすべての細胞でESRG-レポーターを発現しており、該レポーターの発現により可視化されている。 The iPS cell population used in the purification method of the present invention is preferably a population of iPS cells derived from the ESRG-reporter cells. The iPS cell population expresses ESRG-reporter in all cells and is visualized by expression of the reporter.
iPS細胞から所望の分化細胞への分化誘導法としては、目的の分化細胞の種類に応じて、自体公知の方法を用いることができる。分化誘導後に細胞集団を回収し、レポータータンパク質を発現する細胞を選択除去する。該選択除去方法としては、例えば、該レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合、フローサイトメーターを用いて、該蛍光タンパク質に特有の波長の励起光を照射し、該蛍光タンパク質に特有の波長の蛍光を発する細胞を分離除去して、蛍光を発しない細胞集団を純化して回収する方法が挙げられる。 As a method for inducing differentiation from an iPS cell to a desired differentiated cell, a method known per se can be used depending on the type of the differentiated cell of interest. The cell population is collected after differentiation induction, and cells expressing the reporter protein are selectively removed. As the selective removal method, for example, when the reporter protein is a fluorescent protein, a flow cytometer is used to irradiate excitation light having a wavelength specific to the fluorescent protein, and to emit fluorescence having a wavelength specific to the fluorescent protein. There is a method in which cells that emit light are separated and removed, and a cell population that does not emit fluorescence is purified and recovered.
本発明の純化方法により得られた分化細胞集団は、未分化細胞の混入がないので、移植用細胞として、ヒトの再生医療に好ましく使用することができる。 Since the differentiated cell population obtained by the purification method of the present invention does not contain undifferentiated cells, it can be preferably used as a transplant cell for human regenerative medicine.
WO 2010/137348に記載されるように、iPS細胞から分化誘導した細胞の生体への移植後の腫瘍形成は、iPS細胞から分化細胞への分化誘導工程に依存して起きるのではなく、元のiPS細胞クローンが固有に有していた特徴であることを、本発明者らは以前に見出している。さらに、iPS細胞クローンから誘導したニューロスフェアにおける未分化細胞の含有率を、対照含有率（即ち、ES細胞や腫瘍形成リスクがないことが既に知られているiPS細胞から誘導したニューロスフェアにおける未分化細胞の含有率）と比較することで、予め腫瘍形成リスクの低いiPS細胞クローンを選別することができることを見出し、該iPS細胞クローンから分化誘導した移植用細胞における腫瘍形成リスクをその都度確認せずとも、安全な移植用細胞を提供することを可能にした。WO 2010/137348では、Nanog等の未分化細胞特異的遺伝子を指標として腫瘍形成リスクの少ないiPS細胞クローンを選択していたが、未分化細胞特異的遺伝子としてESRG遺伝子を用いることによっても、iPS細胞クローンの分化抵抗性（腫瘍形成リスク）を評価することができる。従って、本発明はまた、被検iPS細胞クローンから分化誘導した分化細胞集団におけるESRG遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、iPS細胞クローンの分化抵抗性の評価方法（本発明の評価方法）を提供する。 As described in WO 2010/137348, tumor formation after transplantation of iPS cell-differentiated cells into a living body does not occur depending on the differentiation-inducing process from iPS cells to differentiated cells. The inventors have previously found that iPS cell clones are inherently unique features. In addition, the content of undifferentiated cells in neurospheres derived from iPS cell clones is determined by the control content (ie, undifferentiated in neurospheres derived from iPS cells that are already known to be free of ES cells or tumor formation risk. It was found that iPS cell clones with low tumor formation risk can be selected in advance by comparing with the cell content), and the tumor formation risk in transplanted cells induced to differentiate from the iPS cell clones was not confirmed each time. Both have made it possible to provide safe cells for transplantation. In WO 2010/137348, an iPS cell clone with a low tumor formation risk was selected using an undifferentiated cell-specific gene such as Nanog as an index, but iPS cells can also be obtained by using the ESRG gene as an undifferentiated cell-specific gene. The differentiation resistance (tumor formation risk) of a clone can be evaluated. Therefore, the present invention also provides an evaluation method for differentiation resistance of an iPS cell clone, characterized by using the expression level of ESRG gene in a differentiated cell population induced to differentiate from a test iPS cell clone as an index (evaluation of the present invention). Method).
本発明の評価方法は、WO 2010/137348の実施例に記載される方法を、未分化細胞特異的遺伝子をESRG遺伝子に代えて実施することにより行うことができる。 The evaluation method of the present invention can be performed by carrying out the method described in the examples of WO 2010/137348 by replacing the undifferentiated cell-specific gene with the ESRG gene.
本発明の評価方法により、腫瘍形成リスクがES細胞や腫瘍形成リスクがないことが既知のiPS細胞と同等以下であると判定されたiPS細胞クローンから分化誘導された分化細胞集団は、移植用細胞として、ヒトの再生医療に好ましく使用することができる。 According to the evaluation method of the present invention, a differentiated cell population induced to differentiate from an iPS cell clone determined to have a tumor formation risk equal to or less than that of an ES cell or a known iPS cell having no tumor formation risk is a cell for transplantation. Can be preferably used in human regenerative medicine.
以下に、実施例によって本発明を更に説明するが、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be further described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
１．材料及び方法
（マイクロアレイによる遺伝子発現解析）
細胞をTrizol試薬 (Thermo Fisher Scientific) を用いて溶解し、全RNAをmiReasy Mini Kit (QIAGEN) を用いて精製した。全RNA 50 ngをシアニン3-CTPでラベルし、SuperPrint G3 Human GE 8x60K (G4851A, Agilent Technologies) を用いてワンカラープロトコルによりハイブリダゼーションを行った。Microarray Scanner System (G2565BA, Agilent Technologies) を用いてアレイをスキャンし、GeneSpring version 12.6 (Agilent Technologies) を用いて、抽出されたシグナルを解析した。
（プラスミド）
ESRG遺伝子座に挿入するレポーター遺伝子を作製すべく、以下の手順で蛍光遺伝子を含むターゲッティングベクターを構築した。pCXLE由来のウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）-ウサギβ-グロビンポリAシグナル配列（RbgpA）フラグメントを、プライマーセット（WPRE-EcoR1-BamH1-IF-S/RbgpA-Hind3-IF-AS）を用いてPCR増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit（639648; Clontech）を用いてpBS-PMAのEcoRI/HindIIIサイトに挿入し、pBS-WPRE-RbgpAを得た。FRTでフランキングしたPGK-Neo-pAカセット(PNF, Gene Bridges) をプライマーセット(PNF-IF-S2/PNF-Hind3-IF-AS2) を用いてPCR増幅し、In-Fusion HD Cloning Kitを用いてpBS-WPRE-RbgpAのHindIIIサイトに挿入し、pBS-WPRE-RbgpA-PNFを得た。pcDNA3-Clover (Addgene #40259) 由来のCloverフラグメントをプライマーセット (Clover-IF-BstX1-S3/Clover-IF-Not1-AS4) を用いてPCR増幅し、In-Fusion HD Cloning Kitを用いてpIRES2-ZsGreen1 (Clontech) のBstXI/NotIサイトにサブクローニングし、pIRES2-Cloverを得た。pIRES2-CloverのBamHIフラグメントをpBS-WPRE-RbgpA-PNFのBamHIサイトに挿入し、pBS-IRES-Clover-WPRE-RbgpA-PNFを得た。Rosa26 TVベクターのスプライシングアクセプター配列 (SA) をプライマーセット(Ad-SA-IF-Mfe1-S/Ad-SA-IF-Mfe1-AS) を用いてPCR増幅し、In-Fusion HD Cloning Kitを用いてpBS-IRES-Clover-WPRE-RbgpA-PNFのMfeIサイトにサブクローニングし、pBS-SA-IRES-Clover-WPRE-RbgpA-PNFを得た。最後に、5’及び3’ホモロガスアームをプライマーセット (ESRG-5HA-Pac1 -S/ESRG-5HA-Pac1-AS及びESRG-3HA-Asc1-S/ESRG-3HA-Asc1-AS) を用いてPCR増幅し、In-Fusion HD Cloning Kitを用いてpBS-SA-IRES-Clover-WPRE-RbgpA-PNF のPacIサイト及びAscIサイトにそれぞれ挿入した。
CRIPR/Cas9による遺伝子編集のために、ESRGの第4エクソンに対するガイドＲＮＡ (gRNA-ESRG-Ex4-1) を設計した。gRNAオリゴとユニバーサルプライマー (gRNA-universal-rev) とを用いてプライマー伸長法を実施した。得られたフラグメントをIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてpHL-H1-ccdB-EF1a-RiHのBamHI/EcoRIにサブクローニングした。EcoRI及びNotI認識配列でフランキングしたESRG配列 (NR_027122.1) をLife Technologiesにより合成し、pMXのEcoRI/NotIサイトに挿入した。RT-PCRで増幅するか、DNAFORMから入手した他の遺伝子は、既報のとおりpMXにクローニングした。
FLPoのORFを、pPGKFLPobpA (Addgene #13793) から、プライマーセット (FLPo-S/FLPo-AS) を用いてPCR増幅し、pENTR-D-TOPO (Thermo Fisher Scientific; K240020) にサブクローニングした。次いで、該フラグメントをGateway LR反応を用いてpPyCAG-gw-IP (Mitsui et al., 2003) に移し、pPyCAG-FLPo-IPを得た。
1. Materials and methods (gene expression analysis by microarray)
Cells were lysed using Trizol reagent (Thermo Fisher Scientific) and total RNA was purified using miReasy Mini Kit (QIAGEN). 50 ng of total RNA was labeled with cyanine 3-CTP, and hybridization was performed using SuperPrint G3 Human GE 8x60K (G4851A, Agilent Technologies) using a one-color protocol. The array was scanned using a Microarray Scanner System (G2565BA, Agilent Technologies) and the extracted signal was analyzed using GeneSpring version 12.6 (Agilent Technologies).
(Plasmid)
In order to produce a reporter gene to be inserted into the ESRG locus, a targeting vector containing a fluorescent gene was constructed according to the following procedure. pCXLE-derived woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE) -rabbit β-globin poly A signal sequence (RbgpA) fragment, primer set (WPRE-EcoR1-BamH1-IF-S / RbgpA-Hind3-IF-AS) PCR amplification was performed, and the product was inserted into the EcoRI / HindIII site of pBS-PMA using In-Fusion HD Cloning Kit (639648; Clontech) to obtain pBS-WPRE-RbgpA. PGK-Neo-pA cassette (PNF, Gene Bridges) flanked by FRT is PCR amplified using the primer set (PNF-IF-S2 / PNF-Hind3-IF-AS2) and using In-Fusion HD Cloning Kit Was inserted into the HindIII site of pBS-WPRE-RbgpA to obtain pBS-WPRE-RbgpA-PNF. pcDNA3-Clover (Addgene # 40259) derived Clover fragment was PCR amplified using primer set (Clover-IF-BstX1-S3 / Clover-IF-Not1-AS4) and pIRES2- using In-Fusion HD Cloning Kit Subcloning into the BstXI / NotI site of ZsGreen1 (Clontech) gave pIRES2-Clover. The BamHI fragment of pIRES2-Clover was inserted into the BamHI site of pBS-WPRE-RbgpA-PNF to obtain pBS-IRES-Clover-WPRE-RbgpA-PNF. PCR amplification of the splicing acceptor sequence (SA) of Rosa26 TV vector using primer set (Ad-SA-IF-Mfe1-S / Ad-SA-IF-Mfe1-AS) and using In-Fusion HD Cloning Kit Was subcloned into the MfeI site of pBS-IRES-Clover-WPRE-RbgpA-PNF to obtain pBS-SA-IRES-Clover-WPRE-RbgpA-PNF. Finally, PCR using 5 'and 3' homologous arms using primer sets (ESRG-5HA-Pac1-S / ESRG-5HA-Pac1-AS and ESRG-3HA-Asc1-S / ESRG-3HA-Asc1-AS) Amplified and inserted into the PacI site and AscI site of pBS-SA-IRES-Clover-WPRE-RbgpA-PNF using In-Fusion HD Cloning Kit, respectively.
A guide RNA (gRNA-ESRG-Ex4-1) for ESRG exon 4 was designed for gene editing by CRIPR / Cas9. Primer extension was performed using gRNA oligos and universal primers (gRNA-universal-rev). The obtained fragment was subcloned into BamHI / EcoRI of pHL-H1-ccdB-EF1a-RiH using In-Fusion HD Cloning Kit. An ESRG sequence flanked by EcoRI and NotI recognition sequences (NR — 027122.1) was synthesized by Life Technologies and inserted into the EcoRI / NotI site of pMX. Other genes amplified by RT-PCR or obtained from DNAFORM were cloned into pMX as previously reported.
The FLPo ORF was PCR amplified from pPGKFLPobpA (Addgene # 13793) using the primer set (FLPo-S / FLPo-AS) and subcloned into pENTR-D-TOPO (Thermo Fisher Scientific; K240020). The fragment was then transferred to pPyCAG-gw-IP (Mitsui et al., 2003) using Gateway LR reaction to obtain pPyCAG-FLPo-IP.
（遺伝子編集）
Cas9をコードするプラスミド (pHL-EF1a-SphcCas9-iC-A; Addgene #60599)、gRNAベクター及びターゲッティングベクター各5 μgを、NEPA21 electroporator (NEPAGENE) を用いたエレクトロポーレーションにより975E4 iPS細胞に導入した。その後、4 ng/ml bFGF及び10 μM Y-27632 (Wako) を添加した霊長類ES細胞培地中のマイトマイシンC処理したSNLフィーダー上に細胞を播種した。3日後に、250 μg/ml ジェネティシン (Life Technologies) を用いて細胞を選択した。次いで、単離したiPSCクローンに、エレクトロポーレーションによりpPyCAG-FLPo-IPを導入し、PNFカセットを除去した。翌日、細胞を1 μg/ml ピューロマイシン (Life Technologies) により2日間選択した。細胞を回収し、マイトマイシンC処理したSNLフィーダー上に再播種し、コロニーを形成するまで維持した。サンガーシーケンシングにより、CRISPRの標的部位の周辺領域に予期せぬ挿入・欠失がないことを確認し、PCRとサザンブロッティングにより相同組換えとカセット除去が正しく行われていることを確認した。
(Gene editing)
Plasmids encoding Cas9 (pHL-EF1a-SphcCas9-iC-A; Addgene # 60599), gRNA vector and targeting vector 5 μg each were introduced into 975E4 iPS cells by electroporation using NEPA21 electroporator (NEPAGENE). The cells were then seeded on mitomycin C-treated SNL feeders in primate ES cell medium supplemented with 4 ng / ml bFGF and 10 μM Y-27632 (Wako). Three days later, cells were selected using 250 μg / ml Geneticin (Life Technologies). Subsequently, pPyCAG-FLPo-IP was introduced into the isolated iPSC clone by electroporation to remove the PNF cassette. The next day, cells were selected with 1 μg / ml puromycin (Life Technologies) for 2 days. Cells were harvested and replated on mitomycin C-treated SNL feeders and maintained until colonies formed. Sanger sequencing confirmed that there were no unexpected insertions / deletions in the region surrounding the CRISPR target site, and confirmed that homologous recombination and cassette removal were performed correctly by PCR and Southern blotting.
（サザンブロット）
細胞を細胞溶解液 (QIAGEN 158906) で溶解し、DNeasy blood and tissue kit (QIAGEN 69504) を用い、製造者のプロトコルに従ってゲノムDNAを精製した。ゲノムDNA 10 μgをBamHI-HF (New England Biolabs) 又はEcoRV-HF (New England Biolabs) で一晩消化し、0.8% アガロースゲル電気泳動により分離し、ナイロンメンブレン (Amersham) に転写した。メンブレンをDIG Easy Hyb buffer (Roche) 中でジゴキシゲニン (DIG) 標識したDNAプローブと、常時回転させながら42℃で一晩インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗DIG抗体 (1:10,000, Roche) をメンブレンに添加した。CDP-star reagent (Roche) でシグナルを生成させ、LAS3000イメージングシステム (FUJI FILM) を用いて検出した。相同組換えの確認のための外部プローブをプライマーセット (ESRG-southern-probe-S/ESRG-southern-probe-AS) を用いてPCRにより作製した。予期せぬランダムインテグレーションがないことを確認するための内部プローブをプライマーセット (Clover-BamH1-S/Clover-AS) を用いてPCR増幅した。
(Southern blot)
Cells were lysed with cell lysate (QIAGEN 158906) and genomic DNA was purified using DNeasy blood and tissue kit (QIAGEN 69504) according to the manufacturer's protocol. Ten μg of genomic DNA was digested overnight with BamHI-HF (New England Biolabs) or EcoRV-HF (New England Biolabs), separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and transferred to a nylon membrane (Amersham). The membrane was incubated overnight at 42 ° C with a DNA probe labeled with digoxigenin (DIG) in DIG Easy Hyb buffer (Roche) with constant rotation. After washing, an anti-DIG antibody (1: 10,000, Roche) conjugated with alkaline phosphatase was added to the membrane. Signals were generated with CDP-star reagent (Roche) and detected using a LAS3000 imaging system (FUJI FILM). An external probe for confirmation of homologous recombination was prepared by PCR using a primer set (ESRG-southern-probe-S / ESRG-southern-probe-AS). An internal probe for confirming the absence of unexpected random integration was PCR amplified using a primer set (Clover-BamH1-S / Clover-AS).
プラスミド構築、遺伝子編集及びサザンブロットのために用いたオリゴ核酸を表１に示す。 The oligonucleic acids used for plasmid construction, gene editing and Southern blot are shown in Table 1.
２．結果
（初期リプログラミングマーカーとしてのESRGの同定）
TRA-1-60陽性細胞へと変化する過程を捉えるためには、将来TRA-1-60陽性細胞へと変化する細胞をあらかじめ予測することが重要である。そこで、TRA-1-60よりもさらに早い時期に発現するマーカー遺伝子の同定を試みた。5種類のヒト体細胞（皮膚線維芽細胞(HDF；中胚葉系列)、脂肪由来間葉系肝細胞(HAdMSC；中胚葉系列)、アストロサイト(HA；外胚葉系列)、気管支上皮細胞(HBEC；内胚葉系列)、前立腺上皮細胞(HPrEC；内胚葉系列)）に、OSKMの4因子を導入し、導入前と導入7日後とで、それらの体細胞における遺伝子発現をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。すべての細胞種で5倍以上発現が変動していた遺伝子（false discovery rate (FDR)<0.05）を抽出した結果、発現が上昇する遺伝子として194遺伝子、発現が低下する遺伝子として74遺伝子が抽出された（図１Ａ）。上方制御された遺伝子の中には、L1TD1、SALL4、NANOG等の早期リプログラミングマーカー遺伝子が含まれていたことから、これらの上方制御された遺伝子の中に、TRA-1-60遺伝子より早期に発現するリプログラミングマーカー遺伝子が存在する可能性が示唆された。
そこで、(1) 体細胞で発現が検出できない、(2) リプログラミング因子導入後3日目の細胞集団で不均一に発現する、及び(3) 導入後7日目の全てのTRA-1-60陽性細胞で発現している、との条件で、上記194遺伝子を選別した。シングルセルRNAシーケンシング（RNA-Seq）を用い、親のHDF、導入後3日目のOSKM発現細胞、並びに導入後7〜28日目のTRA-1-60陽性細胞について調べた。その結果、ヒト内在性レトロウイルスH型（HERV-H）駆動性の長鎖非コーディングRNA（lncRNA）を産物とするESRG遺伝子のみが、上記の3条件を満たすことを見出した（図１Ａ、Ｂ）。
次に、上記5種の体細胞からiPS細胞樹立の過程でのESRGの発現を調べたところ、すべての細胞種で類似の発現パターンを示すことが確認された（図１Ｃ）。これらの結果は、ESRGが、出発材料となる体細胞の種類に関係なくリプログラミングの初期マーカー遺伝子として機能することを示している。
2. Results (identification of ESRG as initial reprogramming marker)
In order to capture the process of changing to TRA-1-60 positive cells, it is important to predict in advance the cells that will change to TRA-1-60 positive cells in the future. Thus, an attempt was made to identify a marker gene that was expressed earlier than TRA-1-60. 5 types of human somatic cells (dermal fibroblasts (HDF; mesodermal lineage), adipose-derived mesenchymal hepatocytes (HAdMSC; mesodermal lineage), astrocytes (HA; ectoderm lineage), bronchial epithelial cells (HBEC; Endoderm lineage), prostate epithelial cells (HPrEC; endoderm lineage)), 4 factors of OSKM were introduced, and gene expression in those somatic cells before and after introduction was comprehensively covered using microarray Analyzed. As a result of extracting genes (false discovery rate (FDR) <0.05) whose expression was fluctuated by more than 5 times in all cell types, 194 genes with increased expression and 74 genes with decreased expression were extracted. (FIG. 1A). Among the up-regulated genes, early reprogramming marker genes such as L1TD1, SALL4, NANOG were included, so these up-regulated genes were earlier than the TRA-1-60 gene. It was suggested that there was a reprogramming marker gene to be expressed.
Therefore, (1) expression is not detectable in somatic cells, (2) it is expressed heterogeneously in the cell population 3 days after reprogramming factor introduction, and (3) all TRA-1- The 194 genes were selected under the condition that they were expressed in 60-positive cells. Using single-cell RNA sequencing (RNA-Seq), the parent HDF, OSKM-expressing cells 3 days after introduction, and TRA-1-60 positive cells 7-28 days after introduction were examined. As a result, it was found that only the ESRG gene that produces human endogenous retrovirus type H (HERV-H) -driven long non-coding RNA (lncRNA) satisfies the above three conditions (FIGS. 1A and B). ).
Next, when the expression of ESRG in the process of iPS cell establishment was examined from the above 5 types of somatic cells, it was confirmed that all cell types showed similar expression patterns (FIG. 1C). These results indicate that ESRG functions as an early marker gene for reprogramming regardless of the type of somatic cell that is the starting material.
（ESRG-レポーター細胞を用いた解析）
ESRGの発現を指標としたリプログラミング機構の解析を行うために、CRISPR/Cas9システムを用いた相同組換えにより、iPS細胞にESRG遺伝子座に緑色蛍光遺伝子Cloverを導入し、ESRGが発現する細胞を生きたまま識別できる系を作製した (図２Ａ〜Ｅ)。得られたESRG-Clover iPS細胞はすべての細胞で均一にCloverを発現していた (図２Ｆ〜Ｈ)。一方で、既報の方法（Park et al., Nature, 451: 141-146 (2008)；図３）に従い、試験管内分化誘導により線維芽細胞へと分化させると、Cloverの発現は完全に消失した (図２Ｆ〜Ｈ)。
ESRG-Clover iPS細胞由来の線維芽細胞に、既報のとおりOSK又はOSKMをレトロウイルスを用いて導入し（Tanabe, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110(30):12172-12179 (2013)、Takahashi, K. et al., Nat. Commun., 5: 3678 (2014)）、ESRG-Clover及びTRA-1-60の発現を調べた。初期化因子導入前の線維芽細胞はESRG及びTRA-1-60のいずれも発現していなかった（図１Ｄ、図２Ｆ〜Ｈ）。導入後3日目に、OSK導入では2.39±0.56%、OSKM導入では2.13±0.54%のESRG-Clover陽性細胞がそれぞれ検出されたが、TRA-1-60陽性細胞は検出されなかった（図１Ｄ）。このことは、ESRGがリプログラミングのプロセスにおいてTRA-1-60よりも早期に活性化されることを示している。導入後4日目には少数のESRG陽性/TRA-1-60陽性細胞が出現した（図１Ｄ）。一方で、ESRG陽性細胞の割合は増加しなかった。導入後3日目に出現したESRG-Clover陽性細胞と陰性細胞とを選別し、それぞれを再播種してiPS細胞を誘導したところ、ESRG-Clover陽性細胞からは多くのiPS細胞クローンが得られたのに対し、陰性細胞からは極めて少数のiPS細胞クローンしか生成しなかった（図１Ｅ）。これらのデータは、ESRG-Clover陽性細胞のみからTRA-1-60陽性細胞が出現してくることを示している。
(Analysis using ESRG-reporter cells)
In order to analyze the reprogramming mechanism using ESRG expression as an indicator, cells that express ESRG by introducing the green fluorescent gene Clover at the ESRG locus into iPS cells by homologous recombination using the CRISPR / Cas9 system. A system was identified that could be discriminated alive (FIGS. 2A-E). The obtained ESRG-Clover iPS cells uniformly expressed Clover in all cells (FIGS. 2F to H). On the other hand, Clover expression disappeared completely when differentiated into fibroblasts by induction of differentiation in vitro according to a previously reported method (Park et al., Nature, 451: 141-146 (2008); FIG. 3). (FIGS. 2F-H).
As previously reported, OSK or OSKM was introduced into ESRG-Clover iPS cell-derived fibroblasts using retrovirus (Tanabe, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110 (30): 12172-12179 (2013), Takahashi, K. et al., Nat. Commun., 5: 3678 (2014)), the expression of ESRG-Clover and TRA-1-60 was examined. Neither ESRG nor TRA-1-60 was expressed in the fibroblasts before introduction of the reprogramming factor (FIG. 1D, FIGS. 2F to H). On the third day after the introduction, 2.39 ± 0.56% ESRG-Clover positive cells were detected in OSK introduction and 2.13 ± 0.54% in OSKM introduction, but TRA-1-60 positive cells were not detected (FIG. 1D). ). This indicates that ESRG is activated earlier than TRA-1-60 in the reprogramming process. On the 4th day after introduction, a small number of ESRG positive / TRA-1-60 positive cells appeared (FIG. 1D). On the other hand, the proportion of ESRG positive cells did not increase. When ESRG-Clover positive cells and negative cells that appeared on the third day after introduction were selected and re-seeded to induce iPS cells, many iPS cell clones were obtained from ESRG-Clover positive cells. In contrast, only a very small number of iPS cell clones were generated from negative cells (FIG. 1E). These data indicate that TRA-1-60 positive cells appear only from ESRG-Clover positive cells.
本発明によれば、ESRG遺伝子の発現を指標としてリプログラミングされた細胞の早期検出及び該細胞を選別することによるiPS細胞樹立化効率の改善、並びに、iPS細胞から分化誘導した分化細胞集団中に残存する未分化細胞の除去及びiPS細胞クローンの分化抵抗性の評価などが可能となる。従って、本発明はiPS細胞のリプログラミング機構の解明のためのリサーチツールとして、あるいは、再生医療に利用可能な安全なiPS細胞由来の移植細胞を作製するのに、きわめて有用である。 According to the present invention, early detection of reprogrammed cells using ESRG gene expression as an indicator, improvement of iPS cell establishment efficiency by sorting the cells, and differentiation cell populations induced to differentiate from iPS cells. It is possible to remove remaining undifferentiated cells and to evaluate differentiation resistance of iPS cell clones. Therefore, the present invention is extremely useful as a research tool for elucidating the reprogramming mechanism of iPS cells, or for producing safe iPS cell-derived transplanted cells that can be used in regenerative medicine.
Claims (13)
(i) 初期化因子が導入された体細胞集団を培養する工程；
(ii) 該培養された細胞集団からESRG遺伝子を発現する細胞を選別する工程；及び
(iii) 該選別された細胞を培養し、iPS細胞を得る工程。 A method for producing iPS cells comprising the following steps:
(i) culturing a somatic cell population into which the reprogramming factor has been introduced;
(ii) selecting cells expressing the ESRG gene from the cultured cell population; and
(iii) culturing the selected cells to obtain iPS cells.
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- 2018-03-19 JP JP2018051203A patent/JP7097050B2/en active Active
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